SUBIECTE

1. ANALIZA

COMPOZITIEI ALIMENTELOR PRIN CROMATOGRAFIA DE

LICHIDE
2. ANALIZE MULTI-RESIDUU PENTRU CONTAMINANTII ALIMENTELOR
3. SPECTROSCOPIA DE MASA- AVANTAJELE SISTEMELOR DE INALTA
REZOLUTIE

ANALIZA

COMPOZITIONALA A PRODUSELOR ALIMENTARE

Cromatografia lichida (LC) a devenit un important instrument in analiza

produselor alimentare pentru a cosntata calitatea alimentelor, pentru a pune
in aplicare normele de reglementare, sa pentru a confirma standardele
alimentare nationale si internationale. LC este ales pentru multiplele
apicaari, datorita faptului ca poate fi utilizat la o gama larga pentru diferite
probe, pentru ca permite separarea compusilor care variaza de la ioni la
biopolimeri, i pentru conditiile usoare de separare, ca temperatura mica,
impiedicand astfel descompunerea termica a unor compusi instabili, precum:
vitaminele sau polifenolii. De asemenea LC ofer o buna sensibilitate,
rezolutie i selectivitatea.
LC este utilizat n analiza alimentelor pentru a masura principalele
componente din aliment, precum carbohidratii, proteinele si lipidele (precum
trigliceridele), dar de asemenea componentele minore ca: vitaminele, aditivii
artificiali (indulcitori, antioxidanti, coloranti, conservanti, etc.) micotoxine,
amino acizi, peptide, pigmenti, carotenoide i polifenoli. Avnd n vedere
gama

larg

de

aplicaii

observate

pentru

LC,

alte

tehnici,

precum

cromatografia de gaze (GC) i elecrofereza capilar (CE), ocup un loc

important n analiza compoziiei alimentelor; de exemplu, GC este tehnica
de alegere pentru arome i alti compui volatili i, pentru aceste tipuri de
compui, ofer o mai mare eficien i o mai rapida separare. Pe de alt
parte, CE este deosebit de important atunci cnd se lucreaz cu compui
1

care conin ncarcare ionic n soluie, de vrece ce principiul su de separare

se bazeaz pe migrarea lor relativ ntr-un cmp electric. In tabelul de mai
jos se realizeaza o prezentare general a compuilor care pot fi gsiti n
produsele alimentare, cu tehnica aferenta pentru fiecare caz n parte.

Alimentele sunt matrici complexe, si in mod frecvent, componentele

care prezinta interes sunt in cantitati mici in comparatie cu macronutrientii
(proteinem carbohidrati sau lipide); acesti compusi, cand sunt prezenti in
cantitati mari, pot interfera la determinarea componentelor minore. Sunt o
serie de cai pentru a evita aceasta problema in LC: a) de a creste
specificitatea metodei de separare sau detectare; b) de a imbunatati
senlectivitatea la momentul prepararii probei inante de LC; sau c) ambele.

Alaturi de tehnicile de preaparare a probei anterior LC, extractia fazei

solide (SPE) a fost des utilizate pentru a indeparta interferentele din matricea
alimentara si de a concentra analitii de interes. SPE se bazeaz pe reinerea
selectiv a compuilor pe un sorbent gzduit ntr-o minicoloan extracie de
unic folosin (sau cartu). Pentru a acoperi o gam larg de polariti, mai
multi adsorbani din material

polare, nepolare, ionice i polimerice, pot fi

utilizati.
Avand in vedere preocuparile fata de utilizarea solventilor organici
toxici in chimia aliementara o serie de noi tehnici au fost dezvoltate pentru a
depasi sau minimiza aceasta problema. De exemplu, tehnicile ecologic pure
de extracie, precum cele bazate pe utilizarea fluidelor comprimate (lichide
sub

presiune,

PLE;

fluide

supercritice,

SFE;

SWE

sau

PHWE),

sunt

intrebuintate pe scar larg ca alternative la procedeele convenionale, cum

ar fi tehnica de extracie solid-lichid (LES), extracia liquid-liquid (LLE), i
altele asemenea.
Aceste procese alternative au n comun utilizarea unei cantiti mai
mici de solveni (de la sute de mililitri la civa mililitri), lipsa de reziduuri
toxice, extracie cu eficien mai ridicat (n ceea ce privete randamentele
i energia utilizata), precum i selectivitatea mbuntit a procesului. SFE a
fost utilizat n analiza alimentelor ca tehnic de preparare a probei, n special
pentru compuii lipofili, n timp ce PLE a fost folosit pe scar larg pentru
multe

aplicatii

selectivitatea

in

industria

alimentara

acestei tehnici poate

compoziionala,

fi adaptat

deoarece

de ctre solvent

temperatura utilizat n timpul procesului de extracie.

La aplicarea tehnicilor analitice, se efectueaza de asemenea si o serie
de etape pregatitoare pentru o mai buna determinarea a compusilor de
interes din alimente, dup cum urmeaza:

pentru analiza carbohidratilor, tehnica GC a fost utilizata in mod

deosebit pentru analiza acestora (in principal a zaharurilor), cu toate
acestea analiza LC prezinta o serie de avantaje, precum: rapiditate,
posibilitatea de a evita derivatizarea probei, analiza carbohidratilor cu
greutate moleculara mare, precum si o crestere a versalitatii utilizarii unor
diferite metode de separare si detectare; alaturi de diferitele moduri de

separare sunt si: ion-exchnge chromatography , SEC (size-exclusion

chromatography), partition (reversed- or normal-phase) chromatography;
datorita caracteristicilor lor structurale, ei nu poseda proprietati puternice
de absortie UV-Vis, astfel, inainte de detectia fotometrica carbohidratii
trebuie derivati pentru a creste raspunsul lor; o mare diversitate de
reagenti sunt angajati in acest scop, introducandu-se cromofori prin
reactia cu hidraxl sau grupele de carbonil. Alti detectori pot fi utilizati,

precum IR, ELSD sau PAD.

inainte de analiza LC, pentru vitaminele liposolubile, se aplica operatia

de saponificarea, pentru a elibera retinolul legat.

daca aminoacizii liberi pot fi directi extrasi din matricea alimentara,
pentru eliberarea legaturii a aminoacizilor i proteinelor este necesara o
operatia de hidroliza; dupa aceasta, o curire a probei utiliznd un agent
de precipitare, ultrafiltrare sau SPE pe cartue C18 se efectueaz pentru a

elimina interferenele i se concentreaz aceti compui.

cu privire la analiza peptidelor, ultrafiltrarea este des utilizata pentru
indepartarea proteinelor si pentru a fractiona peptidele. SPE cu cartuse
C18 este de asemenea o procedura comuna, care faciliteaza fractionarea
peptidelor si purificarea; cuplarea LC-ESI-MS si utilizarea MALDI-TOF/MS au
prezenta un avantaj semnificativ in caracterizarea directa si secventierea

peptidelor din alimentele ce urmeaza a fi obtinute.

UV este utilizat pentru a compara profilele peptidelor, in timp ce MS la
identificarea proteinelor; cuplarea LC-MS este adesea utilizata pentru
analiza proteinelor alergene, detectarea modificarilor proteinelor, a

variatiilor genetice si informarea cu privire la interactiunile dintre proteine.

caracterizarea lipidelor a fost efectuata prin intermediul GC, astazi insa
LC a devenit una din tehnicile de separare uzuala pentru analiza acestora,
principala aplicare fiind axata pe determinarea componentelor cu masa
moleculara ridicata, precum trigliceridele sau a unor compusi inruditi.
Inainte de analiza, lipidele din alimentele solide sunt extrase fie printr-un
singur, nonpolar solvent sau printr-un amestec de solveni organici,
precum hexane/2-propanol sau cloroform/metanol, urmate de proceduri de
curatare a probei. In cazul alimentelor lichide (ca uleiuri) etapa de
extractie de obicei nu este necesara, astfel proba poate fi injectata direct
in sistemul LC. Atat NPLC si RPLC pot fi folosite in analiza lipidelor prin
4

intermediul LC. Alta tehnica fiind Ag+ LC. Deoarece multe molecule grase
nu contin cromofor, detectarea prin UV-Vis nu poate fi utilizata. In acest
caz, o etapa de derivatizare este necesata pentru detectare, Alte metode

de detectare LC includ IR sau ELS.

din categoria componentelor minore din alimente, precizam compusii
fenolici, care au atras atentia ca urmare a influentei lor asupra
parametrilor

organoleptici,

precum

culoarea

sau

gust.

In

general,

separarea RP este necesara, prin utilizarea coloanei C18, iar solventii

imlpicati sunt apa, metanol si acetonitril, de obicei cu un pH mic prin

adaugarea unui acid pentru imbunatatirea separarii

in cazul aditivilor alimentari, cu referire la determinarea conservantilor
se tine cont in principal de matrice; astfel, la matricile lichide (bauturi
racoritoare) este necesara o filtrare inainte de injectarea probei in sistemul
LC, in timp ce pentru matricile solide sunt necesare o distilare cu abur si o
extractie solid- lichid cu ajutorul unui solvent ca metanol, etanol sau
amestec de acetonitril, 2-propanol i etanol, tehnicile cele mai comune
pentru a imbunatati sensibilitatea si a reduce interferentele prezente in
matrice. Analiza LC este de obicei efectuata prin intermediul RPLC
implicand atat elutia isocratica sau gradienta cat si detectarea cu UV la o

lungime de unda specifica, variind intre 230-275 nm.

cat privesc colorantii alimentari, acestia sunt extrasi prin utilizarea de
adsorbani, cum ar fi fibra de lana, poliamid sub form de pulbere, sau
cartue RP (Sep-pak C18), fiind o alternativa pentru o curatare rapida si
usoara. Dupa desorbtia coloratilor si a filtrarii, solutia poate fi analizata fie
prin ion-pair sau reversed-phased LC.
Aplicarea tehncii LC au permis determinarea unei game largi de

compusi alimentari. n plus, cuplarea LC cu metode de determinare avansate

de spectrometrie de masa face posibil determinarea unui numr ct mai
larg de compui cu sensibilitate, selectivitate i specificitate ridicate.
Dezvoltarea unor etape de preparare a probelor on-line n sistemele LC i LCMS este, de asemenea, de ateptat s devin metode de rutin n analiza
alimentelor.
In zilele noastre, tendina modern de a aplica foodomics- disciplina
de a studia domeniile alimentare si de nutritie prin aplicarea i integrarea

tehnologiilor avansate pentru a mbunti bunstarea, sntatea i

cunoatere consumatorilor, bazat pe puternice abordri n domeniul tiinei
produselor alimentare, este, de asemenea, n cretere, n scopul de a obine
profiluri sau amprente digitale alimentare care pot asigura trasabilitatea
acestora, autenticitatea, i calitate, precum i efectele acestora asupra
sntii umane la nivel molecular. n acest nou domeniu, tehnici precum
LC, UPLC, sau de nano-LC cu precizie ridicat i spectrometre de mas
rapide, cum ar fi QTOF sau Orbitrap, este de ateptat s ofere rezultate
imbatabile.

ANALIZE

MULTI-RESIDUU PENTRU CONTAMINANTII ALIMENTELOR

Analiza reziduurilor de pesticide (PRA) este unul din cele mai studiate
subiecte in laboratoarele analitice care lucreaza in domeniul sigurantei
alimentare. PRA a fost intrebuintata mai mult de 30 de ani in numeroase
laboratoare din intreaga lume datorita necesitatii unui control strict a
prezentei acestor componente in produsele alimentare. Tendinta observata in
ultimii ani se ndreapt spre o scdere a limitelor maxime de reziduuri de
(MRLs), care, n unele cazuri, sunt constituite la nivelul ppb (de exemplu,
0.01-0.05 mg /kg, sau chiar mai mici atunci cnd se ocup cu alimente
destinate bebelusilor,

0,005 mg / kg). Acest fapt, mpreun cu diferite

caracteristici fizico-chimice ale pesticidelor, precum i marea diversitate de

matrici de eantionare, face PRA un domeniu foarte specializat in cadrul
chimiei analitice. n ciuda unei vaste experiene i a numeroaselor lucrri
publicate, cercetri viitoare sunt nc necesare, datorita unor reglementri
din cele mai restrictive, a apariiei continuue de noi ingrediente active pe
pia, precum i a creteriicomplexitii definiiilor reziduurilor, incluzand mai
muli metabolii i compui nrudii cu pesticide avand ca punct comun
prezenta unei grupari functionale chimice.
n jur de 1000 de substane active au fost sau sunt nc utilizate n
intreaga lume, cu toate c aproape 50% din vechile pesticide nu mai sunt
autorizate n UE, ca urmare a cerinelor Directivei 91/414. Aceste substane
active sunt baza a mii de produse confectionate spre a fi utilizate n principal
n agricultur, cum ar fi erbicide, insecticide, fungicide precum i familiile de
pesticide dintre cele mai reprezentative. Aceti compui aparin mai multor
familii chimice, cu polaritate sau volatilitate destul de distincte i trebuie s
fie determinate ntr-o varietate de matrici alimentare din compoziie diferit
(ap, aciditate, zahr i coninutul de grsime). Aa cum era de ateptat, nu
exist metode universale care urmeaz s fie aplicate tuturor pesticidelor.
Cea mai apropiat abordare pentru o metoda universala, ideala este
aplicarea metodelor multireziduu (MRMs), care, n prezent, pot include
cteva sute de compui. n ciuda creterii rapide i a mbuntirilor recente
n tehnici analitice, metode specifice, individuale sunt nc necesare pentru
7

unii compui. Fr ndoial, cromatografia (ata de gaz, cat i de lichide), cu

spectrometrie de mas (MS) este optiunea n acest domeniu. Utilizarea
complementar a GC-MS i LC-MS i dezvoltarea unor serii de MRMs i a
metodelor individuale este necesar n laboratoarele analitice moderne
dedicate PRA.
A existat o tendin clar n metodologia analitic aplicat, de la GC-MS
cu un singur cvadrupol i LC cu UV (sau matrice de fotodiode) sau detectoare
de fluorescen n perioada 1970-1980, fata de GC-MS/MS i LC-MS/MS, care
sunt principalele tehnici aplicate n prezent. LC-MS/MS este n prezent
tehnica optata pentru cele mai multe combinaii de matrici analitice n
domeniul PRA. Cu excepia pesticidelor organoclorurate, piretroide, i a mai
multor

compui,

LC-MS/MS

un

rspuns

analitic

adecvat

pentru

determinarea pesticidelor n produsele alimentare la nivelul reziduurilor. n

plus, este potrivit pentru metabolii, de vreme ce acestia sunt cele mai multe
ori mai polari dect pesticidele-sursa. Avantajele unui triplu cvadrupol n
modul de monitorizare a reaciei selectate (SRM), adic, achiziionarea de
tranziii MS / MS, sunt recunoscute pe scar larg. LC-MS/MS QqQ (triplu
cvadrupol) este calul de btaie n laboratoare PRA datorit robusteei sale,
a sensibilitatii excelente, a selectivitatii i a capabilitii de confirmare.
Este necesar s se acorde o oarecare atenie la diferena dintre int i
analiza nontarget. Marea majoritate a metodelor aplicate pn n prezent
sunt metode int, unde n o list mai mare sau mai scurt a pesticidelor
este inclus n domeniul de aplicare a metodei. In ultimii ani, numrul de
analii a crescut considerabil, cu toate c nu au fost raportate multe metode
pentru aproximativ sau mai mult de 200 de pesticide. Metode LC-MS/MS sunt
dezvoltate, optimizate i validate in mod specific pentru acele tipuri de
analii inclusi n domeniul de aplicare a metodei. n mod normal, informaia
obinuta

este cu privire la analitul specific, dar care poate nseamna si

prezenta altor pesticide ignorate n probele de

analizat. Tendina actual

este utilizarea unui eantion de extractie- tratament urmat de analiza atat a

tehnicii GC-MS/MS i respectiv LC-MS/MS, pentru a determina analii polari si
nepolari.

Instrumentele de Rezoluie nalt (HR) a tehnicii MS (de exemplu TOF,

QTOF, Orbitrap) ctig popularitate n analiza reziduurilor de pesticide,
datorit mbuntirilor instrumentale i de costurilor reduse. Caracteristicile
favorabile ale HR MS provin din posibilitatea achiziionrii unui spectru intreg
fata de masa exacta cu o sensibilitate satisfctoare, fapt ce permite
investigarea mai multor analii care nu necesita o selectare anterioara MS.
Spre deosebire de analiza tinta, foarte putine au fost publicate cu
privire la analize nontarget, n cazul n care nu se facuta o selecie a
compuilor;

acestea

fiind,

analistul

trebuie

caute

orice

potenial

contaminant care ar putea fi prezent n probe. HR MS face, de asemenea,

fezabil analiza nontarget, cu toate c posibilitile de reuit sunt limitate
n acest moment. Aici, sistemul trebuie s detecteze componentele
relevante i sa le identifice, o sarcin dificil datorit, printre ali factori,
lipsei bibliotecilor standardizate. Screening-ul unui numr mare de pesticide
din produsele alimentare care utilizeaz HR MS (fie cu LC sau GC), va fi cu
siguran unul dintre subiectele cele mai relevante ale cercetrii n urmtorii
civa ani, din cauza necesitatii informaiilor ct mai mult posibile cu privire
la prezena pesticidelor n produsele alimentare ntr-o singur analiz.
Prezena metaboliilor de pesticide din produsele alimentare este, de
asemenea, o problema de ngrijorare, deoarece acestea pot fi gsite la
niveluri mai mari dect compusii sursa. Metaboliii cei mai relevani sunt
inclusi n mod normal n definiia reziduurilor i ar trebui s formeze o parte a
analiilor int a metodei de analizat. Cu toate acestea, nu se acord o
atenie deosebita si la ali metabolii, care de asemenea, ar putea fi prezenti
n probele alimentare. Investigarea metabolitilor pesticidelor este o noua
provocare.
Tratamentul probei n PRA include o serie de etape, cum ar fi: extracia
pesticidelro, curarea probelor obtinute dupa extractie, evaporare, i
schimbul de solvent, n mod obinuit sunt cele mai aplicate etape. n unele
cazuri, o reacie de derivatizare este necesar pentru a face compatibili
analiii cu determinarea lor cromatografic. Aceste etape sunt consumatoare
de timp i implic manevrarea probei, care la randul lor pot fi sursa unor
erori analitice importante. Tratarea eantionului depinde de matrice i de

analitii urmariti n studiu, precum si de tehnica analitic aplicat pentru

msurarea final.
Extracia n faz solid (SPE) se aplic pe scar larg pentru probe
lichide (de exemplu, ap, suc de fructe, vin), n timp ce extracia cu solvent
(n mod tipic folosind aceton, acetat de etil, metanol sau acetonitril) este
tehnica cea mai universala pentru probele solide. Eficiena extraciei
eantionului poate fi mbuntit folosind extracie accelerat cu solvent
(ASE) sau extracie asistat de und micro- solvent (MASE).
O abordare popular pentru tratarea eantionului este metoda
QuEChERS, care s obin o recunoatere tot mai mare n laboratoare PRA.
Se bazeaz pe utilizarea de acetonitril (ACN) i MgSO4 pentru proba solida,
urmat de extracia liquid-solid (SPE dispersiv, d-SPE) pentru a elimina
interferenele matricei. Extractul probei curate este apoi analizat prin
intermediul uneia sau mai multor tehnici MS, avnd ca avantaj domeniul de
aplicare, de selectivitate i sensibilitate furnizate prin GC i LC cuplate
tandem cu MS pentru detectare. Metoda original, datat din 2003, a fost
modificata pentru a lrgi domeniul de aplicare i de a mbunti rezultatele
pentru mai multe pesticide, care au artat dependena fata de pH n
recuperarea lor, n funcie de matrice. Utilizarea unor condiii tampon de
acetat relativ puternice sau a unor condiii slabe de tampon de citrat
constituie baza metodei oficiale a AOAC i respectiv a metodei standard
european.
n cazul n care se ar de a face cu probe ce precinta matrice complexe,
n mod normal o curire a extractului este aplicata, nainte de analiza
cromatografic, cu toate ca aceasta etapa poate fi sursa pierderii unor analiti
si poate diminua aplicabilitatea metodei.
Efectul matricei constituie una dintre principalele dezavantaje ale
metodei LC-MS/MS, conform literaturii de specialitate.
Reglementarile Direciei Generale Europeane pentru Sntate i
Protecia Consumatorului (SANCO) ofer ndrumri utile pentru validarea
metodelor pentru reziduurile de pesticid. Principalii parametri de evaluat
sunt acurateea i precizia, selectivitatea, liniaritatea i limita de cuantificare

10

(LOQ). Acurateea i precizia sunt n mod normal, estimate prin analiza

probelor martor la diferite concentraii.
Unul dintre criteriile cele mai detaliate pentru confirmarea contaminrii
este dat de Decizia Comisiei Europene 2002/657/CE.
Ca adaos fa de validarea metodei analitice, metodele de rutin ar
trebui sa includa o serie de controale pentru a asigura calitatea datelor
raportate. Abordarea cea mai uzual const n injectarea de probe martor la
LOQ i 10 x niveluri LOQ, adic, controale de calitate (QC), n fiecare lot de
probe analizate.
Mai mult, datorita numarului mare de pesticide care pot fi prezente in
produsele alimentare este necesate existenta unor metode individuale, dupa
cum

urmeaza:

ion-pair

chromatography,

ion-pairing

reagent

tetrabutylammonium acetate (TBA). O tehnica excelenta pentru identificarea

pesticidelor in legume este LC-TOF.

11