Efeito dos reguladores de crescimento (BA e

NAA) na proliferao de meristemas em Vitis

vinifera e Boussingaultia sp.
Beatriz Pina; Bibiana Silva; Ins Toms; Ricardo Matias. PL2. Biotecnologia Vegetal.
Edifcio So Bento, Departamento Cincias da Vida, Faculdade de Cincias e
Tecnologias da Universidade de Coimbra. Calada Martim de Freitas, 3000-456
Coimbra, Portugal.
Resumo (150-200 palavras)

Palavras chave (4-6)

Biotecnologia; Proliferao de Meristemas; Vitis vinifera; Boussingaultia sp; Auxinas;
Citocininas.
Introduo
Desde os anos 50 do sculo passado, a clonagem de plantas passou tambm a
poder ser realizada em condies laboratoriais atravs de um processo conhecido como
micropropagao. Os mtodos de micropropagao de plantas podem dividir-se em trs
tipos diferentes, consoante o material inicial e o tipo de resposta obtida. Esses tipos so
a proliferao de meristemas, a induo de organognese e a formao de embries
somticos [Canhoto J. M., 2010].No nosso trabalho recorremos utilizao de
proliferao de meristemas caulinares. Esta tcnica a tcnica mais simples de
micropropagao pois no ocorre induo de novos meristemas mas apenas o
desenvolvimento de meristemas j existentes no explante. Esta foi a primeira tcnica a
ser usada e ainda usada actualmente aplicada propagao de espcies com elevado
valor comercial. Embora a cultura de meristemas seja vulgarmente utilizada para a
propagao de plantas em larga escala, ela pode tambm ser utilizada para o estudo do
funcionamento do meristema, a conservao de germoplasma e a obteno de plantas
isentes de vrus a partir de material vegetal contaminado [Canhoto J. M., 2010].
Desde a cultura do meristema (isolado ou inserido no segmento nodal ou no
pice) at regenerao completa de plantas existem vrios procedimentos que devem

ser adoptados e que se podem dividir em 3 fases de acordo com o proposto inicialmente
por Murashige (1974): estabelecimento dos explantes in vitro, multiplicao e
enraizamento. No entanto, e uma vez que a obteno do material vegetal um passo
crtico neste tipo de micropropagao, e que a transferncia das plantas da cultura in
vitro para solo tambm um processo problemtico, acrescentam-se s trs fases anteriormente referidas uma fase inicial de preparao da planta me e uma fase final de
aclimatizao [Canhoto J. M., 2010].
Na primeira fase ou preparao da planta me seleccionam-se as plantas com as
quais vamos trabalhar, evitar futuras contaminaes das culturas por fungos e/ou
bactrias. Portanto a planta me deve ser mantida em estufa sob condies de
crescimento controlado; na segunda fase a iniciao e estabelecimento das culturas
consiste na obteno de um nmero considervel de explantes no contaminados e em
condies de iniciarem a fase seguinte de multiplicao; a fase de multiplicao est
muito dependente da forma como os explantes so inoculados in vitro e se comportam
na fase de estabelecimento; na fase de alongamento e enraizamento dos rebentos
procede-se ao enraizamento dos rebentos caulinares formados nas fases anteriores de
forma a obter plntulas que possam ser transferidas para solo; a ltima fase a
aclimatizao e durante esta fase as plantas produzidas in vitro passam de condies
heterotrficas para condies autotrficas ficando sujeitas a condies de stress muito
severas, nomeadamente no que diz respeito humidade, temperatura, luz e
contaminaes, sendo frequente a ocorrncia de taxas de mortalidade elevadas. A
micropropagao afectada por inmeros factores como o caso das hormonas
aplicadas e as concentraes em que so aplicadas, os nutrientes disponveis, a
temperatura, o gentipo da planta, o pH e a luz. Para tal comeamos por explicar o que
uma hormona e quais os comportamentos esperados.
A designao de hormona normalmente aplicada a 5 tipos diferentes de
compostos qumicos designados por auxinas, citocininas, giberelinas, etileno e cido
abscsico. Destes 5 grupos mais estudados de hormonas vegetais, as auxinas e as
citocininas so aquelas mais vulgarmente utilizadas em culturas in vitro. Uma hormona
uma substncia orgnica (mensageiros qumicos), sintetizados pelas plantas que tm a
capacidade de afetar processos fisiolgicos a concentraes muito baixas (< 1mM,
frequentemente < 1 M)

As auxinas controlam vrios aspectos do desenvolvimento das plantas,

normalmente em interaco com outras hormonas como o etileno ou as citocininas. Em
termos de cultura in vitro as auxinas so utilizadas com diferentes objectivos. Entre eles
destacam-se a formao e manuteno de calos ou suspenses celulares, a induo de
enraizamento, a formao de embries somticos e a formao de meristemas caulinares
adventcios nos processos de organognese [Canhoto J. M., 2010]. Com frequncia as
hormonas vegetais so substitudas por compostos que, embora no existindo nos
tecidos, quando aplicados s plantas, induzem respostas anlogas s induzidas pelas
hormonas. Para distinguir estes compostos das hormonas eles so normalmente
designados como reguladores de crescimento [Canhoto J. M., 2010]. Foi isso que
fizemos no nosso trabalho usamos o cido 1-naftalenoactico que uma auxina sinttica
muito utilizada pois assemelha-se com a aco de uma auxina natural, o IAA (cido
indoleactico), mas resistente degradao das enzimas das plantas. A benziladenina
uma citocinina sinttica, um composto de sntese que promove o crescimento vegetal e
estimula a germinao, muito usada em micropropagao. Esperamos que as nossas
plantas se comportem segundo as seguintes indicaes: quando h uma elevada relao
auxina/citocinina ocorre o elevado crescimento de razes, no entanto, se ocorrer o
inverso, ou seja elevada relao citocinina/auxina h preferencialmente formao de
gemas caulinares. No caso de s haver auxina no meio d-se a formao de calos e na
presena de apenas citocininas desenvolvem-se meristemas e h uma quebra na
dominncia apical Nesta experincia usamos diferentes meios com diferentes
concentraes de NAA, BA e MS (meio universalmente usado especialmente para
morfognese, cultura de meristemas e regenerao de plantas. Este meio caracteriza-se
pela sua elevada concentrao em sais minerais). Usamos 4 meios diferentes: o meio C
tinha o meio MS e 0,5mg/l de BA, o meio B tem o meio MS e 0,2 mg/l de BA, o meio
D tem meio MS, 0,2 mg/l BA e 0,1 mg/l NAA e o meio A s tinha meio MS
(funcionando como controlo). j no me lembro da ordem ou digam ou mudem KISS
and sorry
Assim, no presente estudo investigmos a influncia das hormonas auxina e
citocinina cujo objectivo era apurar qual o meio mais adequado para a formao e
obteno de caules adventcios a partir de fitmeros para as espcies de Vitis vinifera e
Boussingaultia sp.

Vitis vinifera uma espcie do gnero Vitis, nativa da zona do Mediterrneo,

Europa Central Sudoeste da sia e Egipto. uma planta trepadeira (liana) podendo
trepar at rvores de 35 metros. Como usada, normalmente, em cultura o seu tamanho
mantido por podas anuais entre 1 a 3 metros. Apresenta caules flexveis e
relativamente finos com cascas facilmente destacveis. D flores na altura de Junho e a
sua frutificao ocorre entre Setembro e Outubro. Tem vrios nomes Comuns entre eles
destacam-se: parreira, videira-europeia, vinha, vinha-brava. Os frutos de Vitis vinfera
so desde muito tempo aproveitados pelos Homem de diversas maneiras. Como tal,
existem j vrias tentativas para conseguir melhorar a sua produo e benefcio. O vinho
um dos produtos que obtido a partir da uva. Devido a este mercado estar em
expanso, tambm em Portugal, existe a unio da biotecnologia com a melhor produo
de vinho [Borneman et al, 2013]. Isto atravs da criao de variantes resistentes a fungo
e bactrias que podero prejudicar a produo de vinho, mas mantendo as qualidades
gustativas. O melhoramento da produo das vinhas tambm um dos factores que se
tenta melhorar atravs da associao com a biotecnologia. O fruto em si , tambm,
bastante apetecvel e apreciado pelos animais em geral, especialmente o Homem, sendo
por isso que sofreu melhoramentos atravs de cruzamentos de modo a aumentar o
tamanho do bago e prevalecer a ausncia da grainha (semente). Boussingaultia sp. tratase de uma planta trepadeira, com interesse ornamental, com grande vigor vegetativo
pelo que em algumas regies tropicais e subtropicais, onde foi introduzida, ela seja
considerada como planta invasora. Em Portugal continental, no , no entanto, muito
vulgar. As flores possuem rgos sexuais femininos e masculinos, mas a planta
raramente se reproduz sexualmente ou produz sementes (uma primeira singularidade)
pelo que a reproduo assegurada atravs dos tubrculos areos e de fragmentos dos
seus rizomas.
Materiais e Mtodos
Para realizar esta experincia comeamos por produzir os meios de cultura em
que os fitmeros iriam ser expostos. Utilizamos como meio base o meio MS. Este meio
constitudo pelos componentes disponveis na tabela x.
Tabela x Componentes do meio MS
Macronutrientes
CaCl2.2H2O
(440

mg/l),

Micronutrientes
CoCl2.6H2O (0,025

mg/l),

Compostos Orgnicos
cido nicotnico (0,5 mg/l),

KH2PO4 (170 mg/l), KNO3

CuSO4.5H2O (0,025 mg/l),

Glicina (2 mg/l), Mesoinositol

(1900 mg/l), MgSO4.7H2O (370

FeSO4.7H2O

(100 mg/l), Piridoxina - HCl (0,5

mg/l), NH4NO3 (1650 mg/l)

H3BO3 (6,2), KI (0,83 mg/l),

mg/l), Tiamina - HCl (0,1 mg/l),

MnSO4.4H2O

Sacarose (30000 mg/l), Agar

(27,8
(22,3

mg/l),
mg/l),

Na2EDTA.2H2O (37,3 mg/l),

(8000 mg/l).

Na2MoO4.2H2O (0,25 mg/l),

ZnSO4.7H2O (8,6 mg/l)

De modo a podermos observar e diferenciar o comportamento dos fitmeros

com diferentes compostos adicionmos diferentes concentraes de reguladores de
crescimento. Ao meio A no foi acrescentado nenhuma substncia extra uma vez que
este conjunto ser o controlo da experincia. Ao meio B adicionamos 0.2 mg/l de
benziladenina (BA) (citocinina) e ao meio C 0.5 mg/l sendo que o BA estava dissolvido
em hidrxido de potssio. J ao meio D acrescentmos 0.2 mg/l de benziladenina e 0.1
de cido 1-anftaleno actico (NAA) (auxina) este dissolvido em etanol. Seguidamente
procedeu-se adio da sacarose, correco do Ph para 5.7 com recurso a hidrxido de
sdio e cido clordrico e por fim acrescentmos o agar, derretemos os meios e
distribumos pelos tubos de ensaio que foram posteriormente autoclavados de modo a
garantir a esterilizao.
Depois de solidificados os meios, procedemos adio dos shots. Com recurso a
uma cmara de fluxo e exclusivamente material esterilizado, inserimos 8 fitmeros de
Vitis vinfera e 8 Boussingaultia sp. em cada conjunto de tubos de ensaio dos meios
anteriormente confeccionados, com se pode observar na figura a, e enrolhados de modo
a reduzir a possibilidade de contaminao por fungos ou bactrias indesejveis.
Depois as culturas foram resguardadas e observadas por 7 semanas.
Figura a Esquema da distribuio dos fitmeros de Vitis vinfera
A

e Boussingualtia sp.
B

nos tubos de ensaio com

C

Resultados
Aps toda a fase experimental acabar, os dados das duas espcies foram tratados
com o programa Statistica por meio de ANOVAS de uma via e discutidos. Os dados

recolhidos dizem respeito ao nmero de razes formadas, nmero de estruturas

caulinares formadas e nmero de fitmeros totais formados em cada meio.
Nmero de razes formadas em Vitis vinfera
Para sabermos qual o efeito
dos

diferentes

reguladores/concentraes

dos

diferentes meios na formao de

razes contamos o nmero total
destas formadas em cada meio e
que

est

representado

graficamente na figura x.
No meio A, onde no h
Figura X: Representao da frequncia de razes nos
diferentes meios A (meio MS), B (meio MS + 0,2 mg/L
BA), C (meio MS + 0,5 mg/L BA) e D (0,2 mg/L BA, 0,1
mg/L NAA) na espcie Vitis vinifera. Verificam-se
diferenas significativas entre os vrios meios (Anova 1via:
F=7,13725; p=0,0010471,083333; gl=3). As diferenas
encontram-se no meio D quando comparado com o meio B
(Teste Tukey: p=0,0166560,15179) e com o meio C (Teste
Tukey: p=0,0007390,15179).

presena de qualquer regulador

de crescimento, h presena de
razes que pode ser explicada
pela ao de auxinas endgenas
presentes quando se procedeu ao
estabelecimento

das

culturas,

uma vez que o SAM (meristema apical do caule) produz auxinas que mantm a
dormncia das gemas, que foi o explante usado (Referncia)
O aparecimento de razes no meio B, no qual est presente BA (0,2 mg/L),
indica-nos que a presena desta citocinina, nesta concentrao, nesta espcie, no tem
um efeito inibitrio total do enraizamento uma vez que a uma concentrao mais
elevada (meio C- 0,5 mg/L BA) a inibio mais forte sendo total.
O meio D teve uma maior proporo de desenvolvimento de razes em relao
ao meio B e C (p=0,0166560,15179 e p=0,0007390,15179, respectivamente). Esta
maior proporo deve-se ao facto de o meio D ter NAA que um regulador de
crescimento com efeito no desenvolvimento de razes (Referncia).
Nmero de caules e nmero de fitmeros formados em Vitis vinifera

Relativamente a estruturas caulinares analisamos, no s, a formao destas

Figura X- A - Representao da proporo de desenvolvimento da parte area nos diferentes meios A (meio MS), B (m

estruturas, mas tambm o nmero total de fitmeros formados em cada meio e tambm
representamos graficamente na figura X.
Quanto formao de estruturas caulinares, todos os meios testados
proporcionaram a formao destas estruturas excepto o controlo (meio A- MS) onde no
existiam reguladores de crescimento.
No meio C, que tem maior concentrao de citocininas (0,5 mg/L BA) observa-se maior
proporo de desenvolvimento da parte area em relao aos outros meios o que vai de
encontro bibliografia, pois as citocininas quebram a dominncia(ou ser dormncia?)
apical devido ao efeito inibitrio que tm nas auxinas, proporcionando, portanto, o
desenvolvimento de estruturas caulinas a partir das gemas (REFERENCIA). Isto no
quer dizer que uma maior concentrao de BA proporcione a formao de maior
nmero de fitmeros, pois foi no meio D- (0,2 mg/L BA, 0,1 mg/L NAA) que se

observou tal fenmeno. Obtiveram-se diferenas significativas no nmero de fitmeros

em relao ao meio A (Teste Tukey: p=0,0029061,3214) e ao meio B (Teste Tukey:
p=0,0845371,3214), ou seja, a combinao dos dois reguladores de crescimento tem
mais impacto se o objectivo for a formao de gemas.

Desta forma ao combinar os dois reguladores de crescimento, - citocininas e auxinasnas concentraes a que esto no meio D, nesta espcie obteve-se maior n de fitmeros
o que interessante no ponto de vista da propagao, uma vez que cada fitmero pode
dar origem a uma nova planta, aumentando exponencialmente o nmero de plantas
obtidas a partir de uma nica planta (REFERNCIA).
Com uma concentrao mais baixa de citocininas (meio B), suficiente para a
formao de estruturas caulinares e para no inibir a formao de razes sendo um bom
meio para, aps propagao, se estabelecerem culturas e para posterior aclimatizao e
venda.
Nmero de razes formadas em Boussingaultia sp.
Todo o processo de recolha de dados e respectivo tratamento foi semelhante nas duas
espcies pelo que o nmero de razes formadas diz respeito ao nmero total de razes
formadas em cada meio e representadas graficamente (figura x).

Figura X- Representao da frequncia de razes nos diferentes meios A (meio MS), B (meio MS + 0,2 mg/L BA), C (me

No que toca formao de razes em Boussingaultia sp. podemos observar que os

resultados foram bastante homogneos, verificando-se em todos os meios o
desenvolvimento de estruturas caulinares para esta espcie.
No meio A, tal como para a Vitis vinifera, ocorreu a formao de razes que pode ser
explicada pela aco de auxinas endgenas presentes.
Tambm houve formao de razes no meio B (0,2 mg/L BA), o que permite-nos
concluir que tambm para esta espcie, a concentrao de citocininas do meio no
obteve um efeito inibitrio total do enraizamento. de notar que, apesar de no ter
existido diferenas significativas nos dados, a formao de razes com o meio B foi
ligeiramente superior formao de razes nos outros meios tornando, a influncia de
citocininas a vrias concentraes na formao das razes em Boussingaultia sp. numa
hiptese de estudo a considerar futuramente.
Podemos ento concluir com base nestes resultados de que o desenvolvimento de
estruturas radiculares para esta espcie, foi consistente para os 4 meios utilizados apesar
das ligeiras diferenas no meio B e D onde houve maior enraizamento, apesar de estas
diferenas no resultarem em dados significativos para que a hiptese fosse rejeitada
Nmero de caules e nmero de fitmeros formados em Boussingaultia sp.
Para a anlise da capacidade de formao e de crescimento das estruturas caulinares m,
contabilizamos ento a quantidade de estruturas formadas e a quantidade de fitmeros
que cada estrutura possua.

Figura 17: A - Representao da proporo de desenvolvimento da parte area nos diferente meios A (meio MS), B (m

No que diz respeito formao do desenvolvimento de estruturas caulinares

observamos que para todos os meios existiu formao destas estruturas, no havendo
diferenas significativas entre meios relativamente proporo de desenvolvimento
caulinar (Figura 17A).
Relativamente ao nmero de fitmeros podemos ento notar que existiram diferenas
significativas entre o meio C e D (Teste Tukey: p=0,0238256,0179). No meio C (0,5
mg/L BA), observou-se o maior nmero de fitmeros por estrutura caulinar formada,
este resultado ento suportado pela informao acerca da funo das citocininas em
inibir as auxinas que causam dormncia apical. (REFERNCIA)

Contrariamente ao que foi verificado em Vitis vinfera, para Boussingaultia sp., o meio
D (0,2 mg/L BA, 0,1 mg/L NAA) gerou um nmero inferior de fitmeros em relao ao
meio C, colocando-nos a dvida se este resultado foi devido ou a uma concentrao
inferior de BA ou presena de NAA no meio D (Teste Tukey: p=0,0238256,0179).

Discusso

Referncias Bibliogrficas
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http://jb.utad.pt/especie/vitis_vinifera
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http://www.floraiberica.es/floraiberica/texto/pdfs/02_051_01_Boussingaultia.pdf
Wikipedia Vitis vinifera. https://en.wikipedia.org/wiki/Vitis_vinifera
Plantas

Medicinais

&

Fisioterapia.

Uvas

Vitis

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http://www.plantasmedicinaisefitoterapia.com/plantas-medicinais-uva-videira.html
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