Escolar Documentos
Profissional Documentos
Cultura Documentos
Prueba de la
Catalasa
Fundamento
Material
reactivos
Mtodo
sobre
un
2. Suspender la bacteria
3.Detectar la formacin de burbujas
Prueba
Oxidasa
de
Fundamento
Material
reactivos
Mtodo
la
Determina la presencia del citocromo C, El citocromo C
oxida al NNN'N',tetrametil,1-4,fenilendiamina (solucin
acuosa al 1% (p/v). La oxidacin se detecta como color
azul.
y Papel de filtro cortado (trozos de 3x 1 cm) ;Placas de
Petri ;Reactivo de oxidasa: Solucin al 1% de NNN'N',
tetrametil, 1-4 fenilendiamina en agua destilada. El
reactivo de oxidasa es bastante txico, manejar con
precaucin. Se altera por la luz y el oxgeno, por lo que
debe ser de preparacin extempornea y protegerse
envolvindolo con papel negro
1-Poner un trozo de papel de filtro sobre una de las
tapaderas de una placa de Petri. 2-Aadir una gota del
reactivo de oxidasa.
3-. Depositar sobre el reactivo masa bacteriana (actuar de
forma rpida y con un asa de platino nueva o con un palillo
de dientes)
Resultado
Safranina.
Frotis bacteriano.
1.
Con la ayuda de un mechero, flamear un asa bacteriolgica hasta el rojo vivo y esperar a que enfre un poco.
2.
3.
4.
Tomar con el asa un poco de muestra bacteriana a partir de una colonia aislada.
5.
Despus agregar la muestra en la gota de agua que esta en el portaobjetos y homogeneizar suavemente con
movimientos circulares.
6.
Esperar que seque al aire libre o poner durante uno o dos segundos con la llama de un mechero para fijar la
muestra, teniendo en cuenta que el calor no debe ser directo (slo se pasa por la llama), puesto que el calor
excesivo puede cambiar la morfologa celular de las bacterias a observar.
Tincin.
1.
Agregar
cristal
violeta,
solo
el
suficiente
para
que
se
cubra
el
extendido
bacteriano.
3.
4.
Agregar una o dos gotas de alcohol-acetona e inmediatamente enjuagar con agua corriente.
5.
6.
7.
8.
**El colorante cristal violeta es de naturaleza bsica y por lo tanto tiene afinidad por sustancias cargadas
negativamente como la pared celular de cualquier bacteria.por lo que bacterias Gram positivas y Gram negativas son
teidas de color violeta.
**Un mordiente es una sustancia que aumenta la fijacin de algn colorante sobre una superficie determinada, en
este caso el cristal violeta aumenta su fijacin a la pared clular bacteriana usando de mordiente al lugol, en la pared
bacteriana el lugol forma un complejo con el cristal violeta insoluble en agua lo que evita que se disuelva y se pierda el
colorante durante el enjuague.
Ya sabemos que la pared de los Gram positivos son ricos en cidos teicoicos no saturados estos muestran gran
afinidad por los agentes oxidantes, todos los mordientes por ejemplo el lugol son agentes oxidantes y su efecto en
general consiste en dar un caracter mas cidez de los cidos teicoicos lo que aumenta la afinidad de estos por el
colorante bsico cristal violeta.
**La mezcla de alcohol-acetona es un disolvente orgnico que decolora la pared bacteriana disolviendo el complejo
cristal violeta-lugol, esta decoloracin no afecta a las bacterias Gram positivas, hay varias explicaciones al respecto,
les
menciono
las
dos
ms
aceptadas.
-Una teora dice: El alcohol-acetona, deshidrata la pared rica en peptidoglicano de los microorganismos
grampositivos lo cual cierra los poros de la pared, propiciando una barrera que no permite la salida del complejo
cristal violeta-lugol.
En la pared de las bacterias gramnegativas hay poco pptido glicano y una gran cantidad de lpidos estos
ltimos son disueltos por el alcohol-acetona, lo que permite el escape del complejo cristal violeta-lugol.
-Otra teora dice: Las bacterias Gram positivas tienen una capa muy gruesa de peptidoglicano con gran
cantidad de enlaces entrecruzados de cidos teicoicos los cuales son poco solubles en alcohol-acetona formando una
especie de barrera en la pared bacteriana que no permite la slida del complejo cristal violeta-lugol por ende se
retiene el cristal violeta-lugol en la pared en el proceso de decoloracin.
**La safranina es un colorante catinico que tie las paredes bacterianas ya que estas tienen compuestos
cargados negativamente, por consiguiente las bacterias Gram negativas se tien de color rosa, sin embargo las
bacterias Gram positivas no se tien debido a que su pared clular esta saturada del colorante cristal violeta y esto no
permite la entrada de la safranina.
se
debe
sobrepasar
los
tiempos
de
tincin
decoloracin.
Los cultivos viejos hacen que las bacterias Gram positivas se tian parcial o totalmente de color rosa.
Hay que tomar en cuenta que el agua usada en el frotis se encuentre en el rango de Ph 7-7.8 ya que:
Los
grampositivos
pueden
hacerse
gramnegativos
al
aumentar
la
acidez.
Prueba de la oxidasa.
Esta prueba esta basada en la identificacin de una enzima bacteriana llamada citocromoC oxidasa y para
reducir el nombre se le dice oxidasa.
Todas las bacterias aerobias obtienen su energa en forma de ATP a partir del proceso de respiracin tambin llamado
cadena respiratoria, este se lleva a cabo en la membrana celular bacteriana, en las siguientes lineas se dara una breve
explicacin de la cadena respiratoria solo con la finalidad de entender de donde proviene y que realiza la enzima
citocromoC oxidasa, entiendase que todo este proceso tiene la finalidad de producir ATP.
En la respiracin hay una secuencia de enzimas y transportadores que pasan los electrones desde sus sustratos hasta
llegar al citocromoC, la enzima llamada citocromoC oxidasale quita electrones al citocromoC, estos electrones son
transferidos por la enzima al oxgeno siendo este el ltimo aceptor de electrones en la cadena respiratoria, finalmente
debido a que el oxgeno tiene un exceso de electrones puede atraer tomos de Hidrgeno formando dos posibles
productos: Agua o perxido de hidrgeno.
Tetrametil-p-fenilendiamina.
Dimetil-p-fenilendiamina.
Indofenol.
El reactivo basado en una disolucin acuosa de tetrametil-p-fenilendiamina al 1%, es el ms comn y recibe el nombre
de reactivo de Kovacs. Este reactivo se puede impregnar en discos o fragmentos de papel filtro grueso. En el comercio
ya se venden tiras o discos impregnados con el reactivo.
Fundamento bsico: El reactivo de Kovacs es incoloro pero al ponerlo en contacto con la enzima citocromoC
oxidasa cambia a un color morado debido a que el tetrametil-p-fenilendiamina es una amina aromtica y la oxidacin
de esta produce quinolonas de color morado-azulado. Para mayores detalles checa la bibliogrfia en especial el libro
de Mac Fadin.
Se toma con un palillo grueso de madera una muestra bacteriana a partir de una colonia aislada proveniente
de un cultivo de 24h.
La muestra se pone en contacto con la tira o disco impregnado.
Se debe observar una coloracin morada en un lapso no mayor a 30segundos para que sea positivo, de lo
contrario el resultado es negativo.
No considerar un resultado positivo despus de 30 seg ya que el oxigeno molecular del ambiente oxida al
reactivo.
No usar asa bacteriolgica metlica ya que la mayora de estas con tienen hierro y este es capaz de
Realiza de forma interactiva la prueba de oxidasa. La prueba interactiva pertenece y se obtuvo del: Virtual
Iteractive Bacteriology Laboratory. Michigan State
University. http://learn.chm.msu.edu/vibl/content/oxidase/oxidase_test/index.html
Prueba de la catalasa.
Prueba de catalasa Realiza la prueba de catalasa de forma interactiva. La prueba interactiva pertenece y se
obtuvo del: Virtual Iteractive Bacteriology Laboratory. Michigan State University.
Reaccin de la catalsa.
2g
NaCl.
5g
D-glucosa.
10g
Azul de bromotimol.
0.03g
Agar.
3g
Fosfato dipotasico.
0.3g
Agua.
1000m
Ingredientes del medio OF.
En el tubo con aceite: La fermentacin de la glucosa produce cidos fuertes respecto a los que produce la va
oxidativa, ejemplo de estos cidos son el cido lctico, cido frmico, cido actico, entre otros. El medio se acidifica y
el vire del indicador da como resultado una coloracin amarilla intensa en la totalidad del tubo.
Tcnica de la prueba.
Se van a usar dos tubos, utilizando un asa recta la cual se flamea en el mechero, se puede enfriar en agar estril,
despus se toma un poco de bacteria a partir de una colonia aislada posteriormente se inoculan ambos tubos por el
mtodo de picadura y finalmente se preparan las condiciones de los tubos;
Un tubo se cerrara su tapa de tal forma que quede floja con la intencin de que entre algo de oxigeno, al segundo tubo
se le agregara 1.5-2ml de aceite mineral estril y la tapa se cerrara completamente, se incubarn durante 24h.
Control positivo oxidativo: Pseudomonas aeruginosa
Control positvo fermentador: Escherichia coli
Control sin cambios, no consume glucosa: Moraxella sp
Prueba de motilidad.
La motilidad se puede observar por un crecimiento turbio lejos de la picadura realizada en la inoculacin de los
medios OF o en un medio SIM, este mtodo es de confianza variable ya que la picadura se pudo haber hecho
chueca o irregular lo que nos darian falso positivo. Para evitar este factor se realiza la tcnica de gota suspendida
bacteriana.
Tcnica de gota suspendida: Agregar sobre un portaobjetos una gota de solucin fisiolgica salina estril, ponerle
un poco de muestra bacteriana, homogeneizar de tal forma que la gota no se extienda mucho, ponerle encima un
cubreobjetos al que previamente se le a puesto una base de 4 bolitas pequeas de plastilina con el objetivo de evitar
que aplaste totalmente la gota con bacteria, finalmente observar al microscopio con un objetivo de 40X.
Se alcanzan haber bacterias muy pequeas y casi translcidas moverse a velocidad variable, observar al menos de 510 bacterias recorrer todo el campo de visin para declarase una motilidad positiva. La mayora de las bacterias
motiles son de morfologa bacilar o sea Bacilos., Pero no todos los bacilos son motiles.
Introduccin | Caractersticas
microscpicas | Esporulacin | Induccin | Propiedades| Germinacin |
bilidad | Enlaces
Via
Barra de exploracin
[ Principal ] [ Arriba ] [ Procariotas ] [ Ncleo bacteriano ][ Citoplasma bacteriano ] [
La pared bacteriana ] [ Flagelos y pili ][ Sustancias de reserva ] [ Endsporas ] [ Cps
ulas y Limos ] [ Pigmentos ][ Nutricin ]
Introduccin | Contenidos
de Son
cuatro
pruebas
bioqumicas.Se
emplean
y fundamentalmente
para
la
identificacin
de
las Enterobacterias (bacilos
Gram
negativos,
anaerobios
facultativos
con
metabolismo
fermentador). Dependiendo de las condiciones, las
enterobacterias, pueden realizar un metabolismo
aerobio (si disponen de oxgeno), realizar una
respiracin anaerobia (si hay nitratos u otro aceptor
de electrones) y distintas fermentaciones.
Escherichia coli : Indol + ;Rojo de metilo +; VogesProskauer ;Citratos -
5.1.c- Mtodo:
cMtodo:
Inocular
el
medio de cultivo (agua de
peptona). Incubar a 37 oC
durante 48 horas
5.1.d-Resultado:
Produccin de Indol
5.2.c. Mtodo
5.3.
(V)
Voges-Proskauer
Fundamento
Detecta la fermentacin butanodilica. En esta
fermentacin se producen menor cantidad de cidos
que en la fermentacin cido-mixta, y una gran
cantidad de butanodiol. Mediante un reactivo, (alfanaftol y KOH al 40%), se detecta la presencia de un
precursor del butanodiol (acetilmetilcarbinol o
acetona). La acetoina en presencia de oxgeno se
oxida a diacetilo. El diacetilo oriigina una coloracin
roja al reaccionar con los restos guanidnicos de
algunos aminocidos de la peptona del medio (Ej.
Arginina).
b. Materiales y reactivos: El medio de cultivo, es el
mismo que en la prueba del rojo de metilo. Reactivos
:alfa-naftol
5.3.c. Mtodo
5.3.d.Resultado:
Proskauer
Voges- origina
A
la
izquierda
cultivo
de Serratia spp. Y a la derecha
de E. coli
5.4.
Consumo
citratos (C)
Fundamento:
5.4.c. Mtodo
5.4.d.
Resultado: turbidez. En el medio de Simmons por alcalinizacin
Crecimiento sobre citrato del cultivo (el indicador toma color azul)
como unica fuente de
carbono
Crecimiento en el medio de
Simmons:
a
la
izquierda
cultivo de Salmonella spp. y a
la derecha de E. coli. *Dado
que la lectura del medio de
Koser se hace detectando la
turbidez
del
medio,
es
necesario inocular con una
pequea cantidad de bacterias
y comprobar que el tubo
permanece casi transparente
tras la inoculacin.
E.M.B. Agar.
Este medio (tambin denominado E.A.M.) es utilizado para el aislamiento
selectivo de bacilos Gram negativos de rpido desarrollo y escasas exigencias
nutricionales. Permite el desarrollo de todas las especies de la familia
Enterobacteriaceae.
Este medio combina las frmulas de Holt-Harris y Teague con la de Levine,
para obtener un mejor rendimiento en el aislamiento selectivo de
enterobacterias y otras especies de bacilos Gram negativos. La diferenciacin
entre organismos capaces de utilizar la lactosa y/o sacarosa, y aquellos que
son incapaces de hacerlo, est dada por los indicadores eosina y azul de
metileno; stos ejercen un efecto inhibitorio sobre muchas bacterias Gram
positivas. Muchas cepas de Escherichia coli y Citrobacter spp. presentan un
caracterstico brillo metlico. Las cepas que utilizan la lactosa poseen centro
oscuro con periferia azulada o rosada, mientras que las que no lo hacen son
incoloras. Este medio permite el crecimiento de Candida spp. como colonias
rosadas y puntiformes; la siembra en profundidad permite el desarrollo de
clamidosporas en C. albicans. Enterococcus spp. crece en este medio como
colonias puntiformes y transparentes, mientras que Acinetobacter spp. y otras
bacterias oxidativas pueden dar colonias de color azul lavanda; esto puede
ocurrir aunque las cepas no sean capaces de acidificar a partir de lactosa al
0.5% y ello se debe a la incorporacin de azul de metileno a sus membranas.
En este medio se obtiene adems, un buen desarrollo de especies de
Salmonella y Shigella.
Resultados
Microorganismos
Tipo de Colonia
Incoloras
Incoloras
Incoloras
Para la realizacin de esta prueba la bacteria se cultiva durante 24-48 horas en un caldo de triptona con NaCl al 0,5% (la triptona presenta
abundante triptfano). Para la posterior deteccin del indol se usa el reactivo de Kovacs.
Para el control de calidad del reactivo se pueden utilizar cultivos conocidos. Las ms convenientes son Escherichia coli (indol+) y todas las
especies de Klebsiella (indol-).
Se genera el indol por una desaminacin reductiva del triptfano via la molcula intermediaria
cido indolpirvico. Las triptofanasas catalizan la reaccin de desaminacin, durante el cual se
remueve el grupo amino (NH2) de la molcula de triptfano. Los productos finales de la
reaccin son el indol, cido pirvico, amonaco (NH3) y energa. Comocoenzima de la reaccin
se requiere al fosfato de piridoxal.
ndice
[ocultar]
1Procedimiento
4Referencias
Procedimiento[editar]
Tal como ocurre con muchas pruebas bioqumicas, los resultados de una prueba de indol se
indican con el cambio de color que sigue a la reaccin. El cultivo bacteriano puro debe ser
sembrado en un caldo con triptofano o peptona estriles o ambos por 24 a 48 horas antes de
realizar la prueba. Luego de la incubacin, se aaden cinco gotas de reactivo Kovac (alcohol
isoamilo, p-dimetilaminobenzaldehdo y cido clorhdrico concentrado) al caldo del cultivo.
Una variante de la prueba se realiza usando el reactivo de Ehrlich (usando alcohol etlico en
lugar del alcohol isoamilo, desarrollado por Paul Ehrlich), en especial si se tiene un organismo
que no sea fermentador y en organismo anaerbico.
Los resultados positivos se muestran por la presencia de un color rojo o rojo-violeta en la
superficie de la capa de alcohol en el cultivo. Un resultado negativo se muestra amarillo. Un
resultado variable puede ocurrir cuando se muestra un color anaranjado. Ello es debido a la
presencia de escatol, tambin conocido como metil-indol o indol metilado, otro posible
producto de la degradacin del triptfano.
O.N.P.G.
Prueba rpida, utilizada para diferenciar los microorganismos fermentadores lentos de
lactosa, de los no fermentadores.
Su uso es muy difundido para confirmar o descartar especies de Salmonella.
Fundamento
La lactosa puede ser fermentada de manera rpida (18-24 horas), en forma lenta, o
puede no ser fermentada.
Los microorganismos que la fermentan rpidamente poseen 2 enzimas: b-galactsido
permeasa, la cual est localizada en membrana celular y est involucrada en el
transporte de la lactosa, y la b-D-galactosidasa, que es intracelular y est involucrada
enla hidrlisis dela lactosa agalactosa y glucosa.
Los microorganismos fermentadores lentos de lactosa, son deficientes en b-galactsido
permeasa pero no en b-D-galactosidasa, y los microorganismos no fermentadores no
poseen ninguna de las 2 enzimas.
Los discos contienen O.N.P.G. (orto-nitrofenilgalactopiranosido), el cual tiene la
caracterstica entrar rpidamente al interior de la clula bacteriana, sin la necesidad de
utilizar la b-galactsido permeasa, y all es metabolizado por la b-D-galactosidasa,
liberndose o-nitro-fenol, compuesto de color amarillo.
Resultados
Positivo: observacin de color amarillo en la suspensin.
Negativo: la suspensin permanece sin cambio de color.
Microorganismo
ONPG
Citrobacter freundii
Segn una definicin reciente de Pitt (1996), las micotoxinas son "metabolitos fngicos cuya ingestin,
inhalacin o absorcin cutnea reduce la actividad, hace enfermar o causa la muerte de animales (sin excluir
las aves) y personas."
Las micotoxinas se encuentran en diversos alimentos y piensos y se han relacionado (Mayer, 1953; Coker, 1997) con diversas
enfermedades de animales y personas. La exposicin a micotoxinas puede producir toxicidad tanto aguda como crnica, con resultados
que van desde la muerte a efectos nocivos en los sistemas nervioso central, cardiovascular y respiratorio y en el aparato digestivo. Las
micotoxinas pueden tambin ser agentes cancergenos, mutgenos, teratgenos e inmunodepresores. Actualmente est muy extendida la
opinin de que el efecto ms importante de las micotoxinas, particularmente en los pases en desarrollo, es la capacidad de algunas
micotoxinas de obstaculizar la respuesta inmunitaria y, por consiguiente, de reducir la resistencia a enfermedades infecciosas.
Las micotoxinas son objeto de inters mundial debido a las importantes prdidas econmicas que acarrean sus efectos sobre la salud de
las personas, la productividad de los animales y el comercio nacional e internacional. Por ejemplo, se ha calculado (Miller, comunicacin
personal), que en los Estados Unidos de Amrica y el Canad, las prdidas anuales debidas a los efectos de las micotoxinas en las
industrias forrajeras y ganaderas son del orden de 5 000 millones de dlares. En los pases en desarrollo, donde los alimentos bsicos
(como el maz y el man) son susceptibles de contaminacin, la poblacin se ver tambin probablemente afectada de forma significativa
por la morbilidad y las muertes prematuras relacionadas con las micotoxinas.