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Tripsinizao

Tripsinizao e extrao de amostras de gel de poliacrilamida para


MS
Propsito: Este procedimento descreve os passos que devem ser seguidos
para a digesto em gel de uma protena para anlise por espectrometria de
massas.
Antes de comear, leia atentamente e siga estas instrues.
Resumo: Pedaos de gel so lavados e desidratados em tubos de
microcentrfuga limpos. As amostras so re-hidratadas com soluo de
tripsina e incubados por 16-24 horas a 37 C. Os peptdeos so extrados e
concentrados por liofilizao.
Para este protocolo, voc necessitar:
Equipamentos e materiais:

Reagentes:

Microcentrfuga

gua Milli-Q

Tubos de microcentrfuga
pr-lavados

Tripsina (10 ug/ml) em 25mM bicarbonato de


amnio, pH 8,0

Micropipetas

Sol. 50% acetonitrila, 5% cido


trifluoroactico

Ponteiras

Sol. 50% acetonitrila, 0,1% cido


trifluoroactico

Liofilizador

Sol. 25mM bicarbonato de amnio pH 8,0,


50% acetonitrila

Banho trmico ou estufa a


37 oC

Metanol
acetonitrila 100%

Procedimento
OBS: todos os equipamentos e materiais que possam vir a entrar em
contato com as amostras de gel devem ser limpos e livres de contaminao
por queratina. Minimize a manipulao dos gis.
1. Lave dois tubos de microcentrfuga antes do uso com 2 x 500 ul de
metanol e depois com 500 ul de gua Milli-Q.
2. Corte a banda de gel com uma lmina limpa. Trabalhe em uma
superfcie limpa. Corte os excessos de gel no corado e corte a
poro corada em pedaos com cerca de 1 mm cbico (1x1x1 mm)
ou menores.

3. Transfira os pedaos de gel para um tubo de microcentrfuga e


adicione 400 uL de 50% acetonitrila em 25mM de bicarbonato de
amnio pH 8,0. Deixe o gel em contato com essa soluo por 15 min
e remova o excesso de lquido.
4. Lave o gel mais duas vezes com 400 uL da mesma soluo,
totalizando 3 lavagens.
5. Acrescente 100% acetonitrila suficiente para cobrir os pedaos de gel
e deixe por 5 min.
6. Seque o gel por 20-30 minutos em um Speed-Vac.
7. Re-hidrate os gis com o mnimo volume possvel de uma soluo de
tripsina (grau MS, 10ug/ml em 25mM bicarbonato de amnio, pH 8,0).
Adicione 15 ul para pequenos pedaos de gel ou mais, se necessrio,
para cobrir toda a superfcie do gel.
8. Incubar a 37 oC por 16-24 horas
9. Ao final da digesto, prepare mais um tubo de microcentrfuga lavado
conforme passo 1.
10.Transfira a soluo de tripsina remanescente (caso exista) para o
segundo tubo de microcentrfuga.
11.Adicione 25-50 uL de sol. 50% acetonitrila, 5% TFA para cada gel.
Deixe por 30-60 min.
12.Retire a soluo e junte ao segundo tubo de microcentrfuga,
contendo a soluo de tripsina remanescente (passo 10).
13.Repita os passo 11 e 12 mais uma vez, totalizando duas extraes.
14.Seque o extrato em um Speed-vac at a completa secagem.
15.Uma vez secas, as amostras esto prontas para o protocolo de ZipTip.