Trabajo Practico N3:

MANEJO DE MICROSCOPIO COLORACIONES

Objetivos.
Conocer el manejo del microscopio ptico, sus partes y utilidad en el laboratorio de
microbiologa.
Realizar coloraciones ms utilizadas en el laboratorio de microbiologa a partir de materiales
biolgicos y explicar sus fundamentos.
Reconocer a travs de la observacin microscpica la existencia de microorganismos en
diversos materiales biolgicos.
Aprender el manejo del ansa y las distintas tcnicas de cultivo en medios slidos en placa y
medios de identificacin en tubo.
Contenidos previos que el alumno deber conocer:
Microscopa: tipos de microscopio.
Morfologa y estructura bacteriana.
Fundamento de las coloraciones de Gram y Ziehl-Neelsen.
Conocer la clasificacin y utilidad de los diferentes medios de cultivo.
FUNDAMENTOS TEORICOS
Tamao y formas bacterianas.
Existen tres formas bsicas de bacterias:
Esfricas (cocos)
Bastoncitos o cilndricas (bacilos)
Helicoidales (espirilos)
Segn el plano de divisin de la clula, los cocos pueden aparecer: de a pares (diplococos), en
cadena (estreptococos), en ttradas y racimos (estafilococos).
Los bacilos pueden ser muy cortos (cocobacilos) o tener una longitud de 2 a 10 veces su
dimetro. Sus extremos pueden ser redondeados, cuadrados o agudizados.
Los bastones bacterianos curvos pueden ser pequeos microorganismos en forma de coma
(vibrios) o levemente helicoidales en una sola curvatura, o espiroquetas largas y sinuosas.
La mayor parte de las bacterias tienen una longitud media de 1 a 5 m. La longitud de una
bacteria puede variar considerablemente segn el estadio de crecimiento y el medio de cultivo
utilizado.
Tcnicas de tincin.
La morfologa bacteriana se puede observar de dos maneras:
En estado vivo
Muertas y coloreadas.
Las bacterias en estado vivo son, en general, incoloras y carentes de suficiente contraste con
el agua en la que se encuentran en suspensin como para ser claramente vistas.
Por lo tanto se hace necesario el uso de sustancias qumicas coloreadas, llamadas
colorantes, que poseen afinidad por algn componente celular, dando su color a las clulas. Al teir

el microorganismo con los colorantes se aumenta el contraste y se hacen ms visibles, En

bacteriologa, la mayora de los colorantes son sales en las que uno de los iones es coloreado.
Los colorantes se clasifican en:
Bsicos o catinicos: el in coloreado es el positivo (catin). Estos colorantes se
combinan con los constituyentes celulares cargados negativamente (cidos
nucleicos, polisacridos). Ejemplos: azul de metileno, cristal violeta, safranina.
cidos o aninicos: el in coloreado es el negativo (anin). Estos colorantes se
combinan con los constituyentes celulares cargados positivamente (protenas).
Ejemplos: eosina, fucsina cida, rojo Congo.
Sustancias liposolubles: estos colorantes se combinan con los materiales lipdicos
de la clula, se usan para revelar la localizacin de gotas o depsitos de grasa.
Ejemplo: negro Sudn.
Algunos colorantes tien mejor slo despus de que la clula haya sido tratada con otra
sustancia qumica, que no es un colorante por s misma. Esta sustancia se denomina
mordiente. Ejemplo: cido tnico.
Clasificacin de las tinciones.
Existen dos tipos de tinciones:
1. Positivas: Cuando lo que se colorea es el microorganismo a observar. A su vez pueden
ser:
Simples: cuando se utiliza un nico colorante para incrementar el contraste de las clulas
para la microscopa. Ejemplo: azul de metileno, especialmente til para detectar bacterias en
muestras naturales, ya que la mayor parte del material no celular no se tie.
Diferenciales: cundo se utilizan dos o ms colorantes y sirve para diferenciar a las
bacterias entre s por alguna propiedad particular, es decir no todas las clulas se tien igual.
Ejemplo: tincin de Gram. tincin de Acido-alcohol resistencia.
Estructurales: cuando se utilizan dos o ms colorantes para poner de manifiesto una
determinada estructura de la bacteria. Ejemplo: cpsulas, esporas, flagelos.
2. Negativas: Cuando lo que se colorea es el fondo y queda el microorganismo sin teir.
Se observa el perfil de la clula. La sustancia utilizada es un material opaco que no tiene
afinidad por los constituyentes celulares y que simplemente rodea las clulas, ejemplo la
tinta china (suspensin de carbono coloidal).En el microscopio aparecen las clulas
(bacterias, hongos) transparentes y perfiladas sobre fondo oscuro. La ventaja de este tipo de
tincin, es que la clula no recibe tratamiento fsico o qumico. Es muy apropiada para
organismos capsulados.
La fijacin del extendido antes del teido y la subsiguiente exposicin a una serie de
reactivos, como en las tinciones positivas, ocasiona alguna deformacin en la clula, lo que
es menos probable que ocurra en una tincin negativa.
Fijacin.
Las clulas generalmente son tratadas para coagular el citoplasma antes de teirlas
(fijacin). Para bacterias la fijacin por calor es lo ms corriente, aunque tambin pueden fijarse
con sustancias qumicas como formaldehdo, cidos y alcoholes.
ACTIVIDADES A REALIZAR POR EL ALUMNO
1. Observacin microscpica:

Reconocimiento de las partes del Microscopio ptico (MO).

Manejo del MO utilizando una muestra sin colorear.
Manejo del MO utilizando una muestra previa coloracin.
2. Tcnica de examen microscpico directo de muestra sin colorear (en fresco).

Utilidad: Se realiza para la observacin de bacterias, hongos y parsitos (morfologa y movilidad)

y clulas (epiteliales, leucocitos y hemates), de manera de evaluar la calidad de la muestra.
Tcnica: Sobre un portaobjetos suspender, en una gota de solucin salina, una pequea cantidad de
la muestra. Colocar un cubreobjetos y examinar al MO con objetivos de 10x y 40x.
3. Coloracin de Gram:
Utilidad: Es una tincin diferencial usada para demostrar las propiedades tintoriales de las bacterias,
lo cual depende de la naturaleza qumica de la pared celular. Tiene importancia taxonmica. El
anlisis de los extendidos coloreados revela al mismo tiempo morfologa y la reaccin al Gram de
las bacterias.
Colorantes: Cristal violeta
Yodo de Gram: cristales de yodo-yoduro de potasio
Decolorante: Acetona-Alcohol etlico
Safranina.
Tcnica: *Se hace un frotis delgado del material a estudiar y se deja secar al aire.
*Se fija el material en el portaobjeto pasndolo 3 o 4 veces a travs de la llama de un
mechero, de modo que el material no sea lavado durante el procedimiento de tincin.
*Se coloca el frotis sobre un soporte para tincin y se cubre la superficie con solucin de
cristal violeta.
*Despus de un minuto de exposicin al cristal violeta, se lava totalmente con agua
destilada.
*Se cubre el frotis con solucin de yodo de gram durante un minuto. Se lava nuevamente
con agua.
*Se sostiene el frotis entre los dedos pulgar e ndice y se cubre la superficie con unas
gotas de decolorante de alcohol y acetona hasta que no se desprenda ms color violeta.
Habitualmente esto tarda 10 segundos ms o menos.
*Se lava con agua corriente y se coloca otra vez el preparado sobre el soporte para
tincin. Se cubre la superficie con la safranina durante un minuto. Se lava con agua corriente.
*Se deja secar al aire en posicin vertical.
* Se examina el frotis teido con aceite de inmersin con objetivo de 100x del MO. Las
bacterias grampositivas se tien de color azul oscuro y las gramnegativas se ven de color rojorosado.
4. Coloracin de Ziehl-Neelsen.
Utilidad: esta coloracin se usa para colorear a las bacterias llamadas cido-alcohol resistentes, ya
que por la naturaleza qumica de su pared necesitan de calor o detergentes para que el primer
colorante penetre, como as tambin resisten la decoloracin con solventes orgnicos fuertes.
Colorantes: Carbolfucsina: cristales de fenol, alcohol, fucsina bsica.

Decolorante: alcohol-cido (HCl cc+ alcohol)

Azul de metileno.
Tcnica: * Cubrir un frotis seco, fijado por calor, con un pequeo rectngulo de papel de filtro.
*Aplicar 5-7 gotas de carbolfucsina para mojar completamente el papel de filtro.
*Calentar el portaobjeto cubierto con la coloracin hasta que se evapore, pero sin dejar
secar. Puede calentarse con un mechero o un hisopo de algodn embebido en alcohol.
*Quitar el papel con una pinza, enjuagar y dejar secar.
*Decolorar con cido-alcohol hasta que no aparezca colorante en el lavado
(Aproximadamente 2 minutos).
*Agregar el azul de metileno (1 a 2 minutos).
*Enjuagar, escurrir y secar al aire.
* Examinar con objetivo de inmersim en aceite de 100x en MO. Los bacilos cido
alcohol resistentes (BAAR) se tien de rojo y el fondo de celeste.
Existen tambin otras coloraciones para los BAAR que las mencionaremos, ellas son: la tcnica en
fro de Kinyoun y la del fluorocromo.
Otras tinciones usadas en bacteriologa son:
Azul de metileno: positiva simple
Giemsa
tincin de endosporas: positiva estructural
tincin de cpsulas: negativa

Bibliografa:

Vullo D, Waschman M, Alche L. Microbiologa en prctica. Manual de tcnicas de

laboratorio para la enseanza de la microbiologa bsica y aplicada. Ed. Atlante. 2000.
Cap. 5, 25-32.
Koneman y col. Diagnstico microbiologco. Ed. Panamericana