Mtodos De Conteo Bacteriano

Jeisson Steven Hernandez Bedoya

Corporacin Universitaria Minuto de Dios

Ingeniera Agroecolgica IV
Microbiologa
Zipaquir, Colombia
2016

Justificacin

El presente documento tiene como fin realizar una investigacin terica sobre los mtodos de
conteo bacterianos existentes, ya que es fundamental tener conocimiento previo sobre el tema
para que al momento de su ejecucin practica se posea conocimiento del que hacer, como
hacerlo y analizar su resultado, esto nos permitir reducir el margen de error de los datos
arrojados en las prcticas de siembra de cultivos bacterianos, lo cual nos llevara un anlisis
preciso de lo que se est investigando.

Objetivo General
Dar a conocer los diferentes mtodos tericos de conteo microbiano que existen, para
aplicarlo a la prctica en el laboratorio donde se estudiaran diferentes microorganismos,
utilizando los mtodos investigados, obtenidos de varias fuentes.

Objetivos Especficos

En qu casos se aplican

Como debe ser el procedimiento

Anlisis e interpretacin de datos

Marco Terico
El crecimiento de poblaciones se mide estimando los cambios en el nmero de las clulas, en
la cantidad de algn componente de las mismas (por ejemplo, protena) o en el peso total de las
clulas. Existen varios mtodos de contar el nmero de clulas o de determinar la masa celular,
adecuados para diferentes organismos o diferentes situaciones (Madigan, Martinko, & Parker,
2004, pg. 145)

1. Mtodos Rpidos para Conteo de Microorganismos

Alonso Nore & Poveda Sanches (2008) afirman que realizar un anlisis microbiolgico
suele ser una tarea que consume gran cantidad de tiempo y trabajo, se ha presentado la necesidad
de desarrollar mtodos rpidos y fciles para cuantificar y detectar microorganismos. Los
mtodos rpidos ofrecen la posibilidad de evitar algunos pasos; pero no siempre se dispone de
estos mtodos y a veces demandan altos costos. Se puede decir que un mtodo rpido es aquel
que proporciona resultados de un tiempo menor al mtodo convencional y que adems es
sencillo y confiable (pp. 44-45).

1.1 Placas Petrifilm

Estn diseas por una pelcula rehidratable cubierta con nutrientes y agentes gelificantes.
Proporciona resultados en tres pasos: inoculacin, incubacin y recuento. Estn disponibles para
la mayora de las necesidades de pruebas microbiolgicas incluyendo: recuento de aerobios,
coliformes, E.coli, coliformes, Enterobacterias, alta sensibilidad de coliformes, rpido de
coliformes, Staphylococcus aureus, mohos, levaduras y Listeria (Alonso & Poveda, 2008, p.45).

Figura 1. Placa Petrifilm.

Fuente: 3M Colombia

1.2 Ridacount
Es una prueba de lmina con medio de listas para usar, diseadas para la deteccin
cuantitativa de microorganismos en alimentos y ambientes que consiste en una pelcula
deshidratada de medios generales o selectivos en las cuales se deposita 1 ml de muestra, la cual
rehidrata el medio, posee una cubierta transparente que evita la contaminacin indeseada. Este
producto est

diseado para el recuento de Mesofilos Arobios, coliformes totales,

Enterobacterias, Staphylococcus aureus, Ecoli, Salmonella, hongos y levaduras. (Corporacin

Chisso, 2003).

Figura 2. Rida Count

Fuente: rapidmicrobiology

1.3 Medios Cromogenicos

Son medios diseados a partir de sustratos cromgenos para la identificacin de diferentes
microorganismos en alimentos. Estos medios estn fundamentados en la actividad enzimtica
sobre los sustratos, los cuales al ser degradados generan una coloracin especial en la colonia
(Alonso Nore & Poveda Sanches , 2008, pg. 54)

Figura 3. Medios Cromogenicos

Fuente: Rubilabor

2. Mtodos de Conteo Directos Al Microscopio

2.1 Mtodo de Breed
Se extiende un volumen determinado de la muestra (generalmente 0.01 ml) sobre un
portaobjetos normal en una superficie conocida. Se examina en un microscopio calibrado, donde
se conoce el dimetro del campo microscpico. Se cuentan las clulas en diversos campos. Se
obtiene el valor medido de clulas por campo y se multiplica por el nmero de campos
microscpicos comprendidos en la preparacin. El resultado corresponde al nmero de clulas en
el volumen extendido (0.01 ml). Multiplicando este valor por 100 se obtiene el nmero total de
organismos por ml o por gramo de muestra (Olivas E. & Alarcon, 2004, pg. 30)

2.2 Cmara de Petroff-Hausser

Es una placa de vidrio con una cuadricula en depresin donde se deposita la muestra medida.
Es posible relacionar el nmero de clulas observadas en la superficie de un cuadro, con el
volumen de esa rea, considerando estos volmenes se puede calcular la concentracin de
microorganismos por ml (Olivas E. & Alarcon, 2004, pg. 30)

Figura 4. Recuento microscpico directo de bacterias con una cmara Petroff-Hausser

Fuente: Introduccin a la microbiologa

3. Contadores Electrnicos
Se hace pasar un volumen conocido de la muestra con microorganismos a travs de un orificio
de 5 a 10 mm de dimetro, mediante manipulacin con una micropipeta de mercurio. La
resistencia elctrica a travs del orificio est normalizada y se altera cada vez que un
microorganismo pasa a travs de l. La modificacin de la resistencia se amplifica y se registra
electrnicamente (Olivas E. & Alarcon, 2004, pg. 30)

4. Mtodos Directos
4.1 Recuentos en Placa
El mtodo utilizado con ms frecuencia para la medicin de poblaciones bacterianas es el
recuento en placa, se basa en la suposicin de que cada bacteria crece y se divide para producir
una sola colonia. Esto no siempre es cierto porque las bacterias con frecuencia crecen unidas en
cadenas o como grumos. Por consiguiente, a menudo una colonia no se produce como resultado
de una nica bacteria sino de segmentos cortos de una cadena o de un agregado bacteriano. Para
reflejar esta realidad los recuentos en placa suelen informarse como unidades formadoras de
colonias (UFC). Cuando se realiza el recuento en placa es importante que crezca solo un nmero
limitado de colonias en la placa. Cuando hay demasiadas colonias algunas clulas se encuentran
apiadas y no pueden desarrollarse; esta situacin es causa de inexactitudes en el recuento. Para
asegurar que algunos recuentos estn dentro de estos lmites el inoculo original se diluye varias
veces en un proceso denominado dilucin seriada (fig. 5) (Tortora, Funke, & Case, 2007, pg.
178)

Figura 5. Recuentos en placa y diluciones seriadas

Fuente: Introduccin a la microbiologa

4.1.1 Diluciones Seriadas

Ejemplo, una muestra de leche contiene 10 000 bacterias por mililitro. Si se sembrara 1 ml de
esta muestra se formaran en teora 10 000 colonias sobre el medio de la placa de Petri.
Obviamente, sera imposible contarlas en la placa. Si se transfiriera 1 ml de la muestra a un tubo
que contuviera 9 ml de agua estril cada mililitro del lquido resultante tendra 1 000 bacterias. Si
el nmero de colonias potenciales todava es excesivo, se podra realizar otra dilucin seriada
(Tortora, Funke, & Case, 2007, pg. 178)

4.1.2 Placa Vertida y Diseminacin en Placa

El recuento en placa se efecta con el mtodo de la placa vertida o con el mtodo de
diseminacin en placa. Se inocula 1.0 ml o 0.1 ml de disoluciones de la suspensin bacteriana en
una placa de Petri. El medio nutritivo, en el que el agar se mantiene lquido en un bao de agua a

cerca de 50C, se vierte sobre la muestra, que luego se mezcla en el medio con una agitacin
suave de la placa. Cuando el agar se solidifica la placa se incuba. Con esta tcnica las colonias
crecern dentro del agar nutritivo as como en la superficie del agar (Tortora, Funke, & Case,
2007, pg. 178)

Figura 6. Mtodos para la preparacin de placas para el recuento. (a) Mtodo de placa vertida. (b) Mtodo
de la diseminacin en placa.
Fuente: Introduccin a la microbiologa

4.2 Filtracin
Cuando la cantidad de bacterias es muy baja, como en lagos y ros con corrientes
relativamente limpias, las bacterias se pueden contar con mtodos de filtracin. En esta tcnica
se hacen pasar al menos 100 ml de agua a travs de un filtro consistente en una membrana
delgada cuyos poros son demasiados pequeos como para permitir el paso de las bacterias
entonces son tamizadas y retenidas en la superficie del filtro. Este filtro se transfiere despus a
una placa de Petri que contiene una almohadilla embebida en un medio nutritivo lquido, donde
las colonias surgen de las bacterias presentes en la superficie del filtro. Este mtodo se aplica con
frecuencia para la deteccin y cuantificacin de bacterias coliformes, que son indicadoras de la
contaminacin fecal de los alimentos o el agua (Tortora, Funke, & Case, 2007, pg. 179)

Figura 7. Recuento de bacterias por filtracin.

Fuente: Introduccin a la microbiologa

6. Mtodo del Nmero Ms Probable (NMP)

Esta estimacin estadstica se basa en el hecho de que en cuanto mayor sea el nmero de
bacterias en una muestra mayor ser la dilucin necesaria para reducir la densidad hasta el punto
en el cual no se desarrolle ninguna bacteria en los tubos de una serie de disoluciones. El mtodo
del NMP es el ms til cuando los microorganismos por contar no crecen en medios slidos.
Tambin es til cuando se utiliza el crecimiento en un medio lquido diferencial para identificar
el microorganismo. El NMP es solo un informe de que existe un 95% de probabilidades de que la
poblacin bacteriana disminuya dentro de ciertos lmites y de que el nmero NMP es el numero
estadsticamente ms probable (Tortora, Funke, & Case, 2007, pg. 179)

Figura 7. Mtodo del Nmero ms Probable.

Fuente: Introduccin a la microbiologa

5. Mtodos Indirectos
5.1 Conteo Turbidimetrico
En una suspensin microbiana la cantidad de clulas est directamente relacionada con la
turbiedad o densidad ptica de la misma e inversamente relacionada con la cantidad de luz que
pasa a travs de ella. Esto permite determinar con bastante exactitud la cantidad de
microorganismos en la suspensin mediante la determinacin de la turbiedad mediante un
nefelmetro o un espectrofotmetro (Olivas E. & Alarcon, 2004, pg. 30).
Tortora, Funke, & Case (2007) dicen que la absorbancia se utiliza para graficar el crecimiento
bacteriano. Cuando las bacterias estan en fase logaritmica de crecimiento o de declinacion la
representacion de la absorbancia frente al tiempo forma una linea recta. Para que puedan
visualizarse las primeras trazas de turbidez debe haber mas de un millon de celulas por mililitro y
se precisan de 10 a 100 millones por mililitro para que la sunpension se vuelva lo baste turbia
como para ser medida en un espectrofotometro (p.182).

Figura 8. Espectrofotmetro
Fuente: Wikipedia

Figura 9. Turbidez (turbidimetra)

Fuente: Introduccin a la microbiologa

5.2 Actividad Metablica

En este mtodo supone que la cantidad de cierto producto metablico, como el cido o el CO2
es directamente proporcional a la cantidad de bacterias presentes. Un ejemplo de aplicacin
prctica de la prueba metablica es el ensayo microbiolgico en el que se utiliza la produccin de
cido para determinar la cantidad de vitaminas (Tortora, Funke, & Case, 2007, pg. 182).
5.3 Peso Seco
En el caso de las bacterias filamentosas y los mohos los mtodos habituales de medicin son
menos satisfactorios. En los recuentos en placa de los actinomicetos y los hongos filamentosos se
cuenta el nmero de esporas asexuales. Esta no es una buena medida del crecimiento. Una de las
mejores formas de medir el crecimiento de los organismos filamentosos es por el peso seco. En
este procedimiento se extraen los hongos del medio de crecimiento, se los filtra para eliminar el
material extrao y se los seca en un desecador para luego pesarlos. En el caso de las bacterias se
sigue el mismo procedimiento bsico (Tortora, Funke, & Case, 2007, pgs. 182-183)

Conclusiones
Actualmente se encuentran varios mtodos de conteo para cultivos de microorganismos,
puesto que sean venido requiriendo anlisis microbianos con el fin avanzar en temas como, la
inocuidad de los alimentos, la salud pblica, la industria y desde un tiempo para ac el manejo en
agricultura. En los mtodos de conteo se encuentran varias clasificaciones, segn, el tipo de
microorganismo, estructura, metabolismo, sntesis qumica, tamaos, crecimiento entre otras ms
y tambin se puede clasificar segn los mtodos, directos, indirectos, rpidos,

equipos,

fluorescencia y otros. Aunque todos pueden variar en las unidades medida tienen el mismo fin de
conocer la cantidad en unidades o en masa del microorganismo.

Bibliografa
Alonso Nore, L. X., & Poveda Sanches , J. A. (2008). ESTUDIO COMPARATIVO EN
TECNICAS DE RECUENTO RAPIDO EN EL MERCADO Y PLACAS PETRIFILM
3M PARA EL ANALISIS DE ALIMENTOS. BOGOTA, BOGOTA D.C, COLOMBIA.
Madigan, M., Martinko, J., & Parker, J. (2004). Brock: Biologia de los Microorganismos (10
ed.). Madrir, Espaa: Pearson .
Olivas E., E., & Alarcon, L. R. (2004). Manual de Practicas de Microbiologia Basica y
Microbiologia de Alimentos: Programa de Nutricion. Jurez, Chihuahua, Mexico:
Universidad Autnoma de Ciudad Jurez.
Olivas, E. (2004). Manual de Practicas de Microbiologia I, II y Parasitologia: Programa de
Medicina. Jurez, Chihuahua, Mexico: Universidad Autonoma de Ciudad Jurez .
Tortora, G., Funke, B., & Case, C. (2007). Introduccin a la Microbiologa (9 ed.). Buenos
Aires, Argentina: Panamericana.