Universidad de Chile

Facultad de Ciencias
Departamento de Biologa

Laboratorio n 2
La estructura celular al microscopio ptico

Integrantes:
Rodrigo Donoso
Brbara Gonzlez
Camila Mrquez
Fecha: 12 de Abril 2016

Introduccin
El microscopio es una herramienta muy importante en el estudio de la Biologa, pues nos
permite observar pequeas estructuras que sirven de ejemplo para comprender distintos
niveles de organizacin de la materia a nivel general, pudiendo as relacionar la teora
aprendida en las clases con observaciones de objetos y organismos que se encuentran en
ese mismo momento bajo sus lentes.
Su importancia no es slo didctica, sino tambin histrica y de carcter investigativo, pues
la microscopa, tanto ptica como electrnica, ha sido la piedra angular de muchos
descubrimientos biolgicos tanto en el pasado como en el presente y sus tcnicas han ido
progresando hacindose cada vez ms exactas en el sentido de entregar una mayor
resolucin en muestras varios rdenes de magnitud ms pequeas de lo que podemos
observar a simple vista, permitindonos indagar en lugares imposibles de alcanzar de otra
manera.
En la actividad realizada en este laboratorio utilizamos un microscopio ptico con cuatro
diferentes lentes objetivo de los cuales slo ocupamos tres. Adems preparamos cinco
muestras para observar, cuatro de las cuales fueron sometidas a tincin para mejorar el
contraste. Tambin observamos una preparacin disponible en el laboratorio para ilustrar
otros contenidos relacionados con propiedades del microscopio ptico, como dimetro de
campo y calibracin.
El principal objetivo de la actividad era aprender a manejar el microscopio, conocer sus
partes y las respectivas funciones de estas, modular los distintos factores (optimizacin de
la iluminacin, modificacin de la apertura del diafragma, eleccin de los distintos
aumentos, uso correcto de micrmetro y macrmetro, enfoque de la lente del condensador,
etc.) para as obtener imgenes ms ntidas que permitan la realizacin de mejores
observaciones.

Descripcin y Mtodos
Se dispuso de un microscopio ptico por persona, el que deba ser manipulado por cada
integrante de forma de conocer su correcto uso. Se procedi a optimizar la iluminacin,
ajustando el lente condensador, observando una punta de lpiz con un hoja blanca en la
platina para una mejor observacin.
Luego de haber optimizado la iluminacin, teniendo muestras en suspensin de bacterias
(Escherichia coli, Frankia sp.), un hongo filamentoso, levadura (Saccharomyces cerevisiae) y
una muestra de agua chacra, se prepararon muestras poniendo una gota de agua en un
portaobjetos con azul de metileno (0,1%) para luego ser observadas. En el caso del agua chacra
slo se coloc la muestra en el portaobjetos, sin azul de metileno. Cada muestra fue
observada en cada uno de los aumentos del microscopio (4x, 10x y 40x) para identificar en
cul eran distinguibles; luego se registraron los resultados obtenidos. Adems se realizaron
esquemas de lo observado en cada ocasin.
Posteriormente se procedi a hacer mediciones de las clulas en una muestra de frotis de
sangre, para ello, en primer lugar, se calibr el microscopio de modo que las unidades de
medida fueran acordes. El microscopio posea un micrmetro (reglilla) en el ocular derecho,
en donde tenamos las medidas como unidades arbitrarias. En la platina poseamos otra
reglilla cuya medida era 1 cm (10 nm). En cada uno de los aumentos del microscopio se
estim a cuantos micrmetros corresponda una unidad arbitraria, segn el criterio de cada
uno de los integrantes. Adems se determin el dimetro del campo visual en el caso de
cada objetivo. Luego de tener calibrado el microscopio, se observ el frotis de sangre, para
hacer diez mediciones de las clulas encontradas.

Resultados
A continuacin se presenta una tabla resumen con las distintas muestras que fueron
observadas bajo el microscopio ptico, ocupando todos los aumentos para observar todas
las preparaciones. A travs de una simbologa simple, se distingue qu preparaciones
fueron observables bajo los distintos objetivos.
X es observable en ese aumento
O no es observable en ese aumento
Tabla 1. Preparaciones*
4x

10x

40x

E. coli

Frankia sp.

Hongo filamentoso

S. cerevisiae

Agua Charca

Frotis de sangre

* Se utiliz azul de metileno (0,1%) para teir todas las muestras menos Agua Charca y
Frotis de sangre

Figura 1. E. coli 40X

Figura 2. Frankia sp. 10X

Figura 3. Frankia sp. 40X

Figura 5. Hongo Filamentoso 10X

Figura 4. Hongo Filamentoso 4X

Figura 6. Hongo Filamentoso 40X

Figura 7. S. cerevisiae 4X

Figura 8. S. cerevisiae 10X

Figura 9. S. cerevisiae 40X

Figura 10. Agua Chacra 4X

Figura 11. Agua Charca 10X

Figura 12. Agua Charca 40X

Figura 13. Agua Charca 4X

Figura 14. Agua Charca 40X

Figura 15. Frotis de Sangre 40X

Tabla 2.1. Calibracin de Micrmetro ocular y dimetro de campo.

4X

10X

40X

Dimetro campo (m)

5000

2000

500

Micrmetro objetivo
(m)

1000

1000

200

Micrmetro ocular
(UA)

40

90

60

Tabla 2.2. Calibracin de Micrmetro ocular y dimetro de campo.

4X

10X

40X

Dimetro campo (m)

5000

1900

450

Micrmetro objetivo

2500

1000

200

(m)

100

Micrmetro ocular
(UA)

100

80

Tabla 2.3. Calibracin de Micrmetro ocular y dimetro de campo.

4X

10X

40X

Dimetro campo (m)

5100

2050

500

Micrmetro objetivo
(m)

2650

1000

250

Micrmetro ocular
(UA)

100

100

100

Las distintas mediciones del dimetro de Glbulos blancos y rojos son presentadas en una
tabla que recopila todos los datos obtenidos (tabla 3.1). Para facilitar la comprensin y el
anlisis de los datos se presenta una tabla (tabla 3.2) con los promedios de cada medicin
tanto para Glbulos blancos como rojos.
Tabla 3.1. Medicin de glbulos blancos y rojos
Medicin n

Glbulo
blanco 1
(UA)

Glbulo
blanco 2
(UA)

Glbulo
blanco 3
(UA)

Glbulo
rojo 1
(UA)

Glbulo
rojo 2
(UA)

Glbulo
rojo 3
(UA)

5,0

5,0

5,0

3,0

4,0

3,0

6,0

5,0

5,0

2,0

3,0

3,0

5,0

5,0

3,0

2,0

2,5

3,0

6,0

5,0

5,0

2,5

5,0

5,0

4,0

4,0

3,0

3,0

3,5

4,0

5,0

3,0

3,0

2,5

3,0

3,0

5,0

2,5

2,0

3,0

4,0

Promedio
4,0
Glbulo
blanco
4,0

3,5

2,0

3,0

4,0

1 4,0

5,0 3,0

3,3 3,0

3,0

3,0

10

5,0

2 5,0

5,3 4,0

2,7 3,0

3,5

3,0

4,3

2,5

5,3

4,2

3,7

3,5

3,7

2,8

4,7

2,8

4,4

2,8

3,7

3,0

4,4
4,7

3,1
3,2

Glbulos blancos y

Medicin
5,0n

Promedio
10

Promedio
4,0
Glbulo rojo

Tabla 3.2. Promedio de

rojos

Grfico 1. Promedio de Glbulos blancos de cada medicin

Grfico 2. Promedio de Glbulos rojos de cada medicin

Preguntas propuestas.

1.- Estime el tamao del campo y la calibracin para el aumento 1000X en su microscopio.
Describa el mtodo de estimacin que utiliz.

Grfico n3. Estimacin dimetro de campo para 1000X

daba 19,27 (m)

Grfico n4. Calibracin Micrmetro objetivo para 1000X

daba 12,75 (m)

2.- Cuando se desea medir el dimetro de una clula en un tejido se debe sacar un
promedio de varias mediciones. Por qu?
Al momento de realizar las mediciones se est expuesto a una serie de posibles errores
tanto sistemticos como experimentales, desde defectos del instrumento que se utiliza, la
habilidad del observador hasta descuidos y causas fortuitas al momento de observar, para
disminuir los errores de este tipo y hacer la medida ms precisa se realiza un gran nmero
de mediciones para luego realizar algn tratamiento estadstico, como el clculo de
promedio
3.- De qu tamao son las clulas que observ en el trabajo prctico?
El tamao promedio de las clulas de glbulos blancos y rojos fue de 4,4 (UA) y de 3,1 (UA)
respectivamente. (Tabla 3)
4.- Pudo observar detalles en su estructura? Por qu?
S, ya que las muestras se encontraban teidas con azul de metileno 0,1%, lo que es
esencial para que sea observable en un microscopio ptico con sus determinados
aumentos.
5.- Cul es el lmite de resolucin de su microscopio? Describa el mtodo de clculo.
La apertura numrica (AN) depender de cada objetivo y microscopio.
Para calcular la resolucin del microscopio, utilizamos el criterio de Rayleigh:

0,61
AN
En donde:
Longitud de onda de la luz amarilla: 0,59 m (Jenkins, F & White, H. 2002)
AN: apertura numrica del objetivo
Existir una resolucin distinta para cada aumento del microscopio:
4x

AN = 0,10

0,61 x 0,59 / 0,10 = 3,59

10x

AN = 0,25

0,61 x 0,59 / 0,25 = 1,44

40x

AN = 0,65

0,61 x 0,59 / 0,65 = 0,55

6.- Averige en qu consisten las tcnicas de fijacin, inclusin y tincin y para que se usan.

La fijacin es utilizada para evitar la desintegracin del tejido, endurecer el material para
obtener mejores cortes y agentes etiolgicos. Se utiliza en clulas muertas.
Existen muchos medios de fijacin como: solucin de formaldehdo, el cido pcrico,
sublimado corrosivo y el alcohol. Estos son precipitantes de las protenas y formadores de
redes proteicas. Mediante la alteracin de la estructura de las protenas se produce una
modificacin del estado inicial de la clula, producindose una transformacin de la
estructura natural. El procedimiento consiste en sumergir la muestra en las soluciones
fijadoras. (Welsch, U. 2009, p.4)
El mtodo de la inclusin es utilizado en la preparacin de cortes finos, en donde existe la
posibilidad de que aparezcan retracciones y desgarros del tejido preparado. Como medio de
inclusin en la microscopia ptica se utiliza habitualmente la parafina. (Megas et al. 2015,
p.9) Para que la parafina penetre en el tejido este es sometido generalmente a un proceso
de deshidratacin en alcohol, para luego pasar a una sustancia intermediaria que es
miscible tanto en alcohol como en parafina, finalmente se pasa la muestra por la parafina
previamente licuada. (Welsch, U. 2009, p.5)
Las muestras son teidas para lograr un contraste mejor de los componentes celulares ya
que estas son incoloras. Los elementos celulares captan los diversos colorantes por
afinidad, por ejemplo, componentes con cargas elctricas negativas captan colorantes
bsicos como la hematoxilina (azul violeta). Los componentes con cargas elctricas
positivas captan colorantes cidos como eosina que tie de color (rojo), los cuales tien
clulas como los eritrocitos. (Welsch, U. 2009, p.5)
7.- Cmo procedera para observar clulas vivas?
Con un microscopio de contraste de fases, ya que este aumenta el contraste de las
estructuras celulares, que con el microscopio ptico es muy difcil lograr. As se pueden
distinguir mejor las clulas sin tener que teirlas, lo que slo puede lograrse si estn
muertas.

Discusin
Luego de hacer las observaciones de las distintas preparaciones, nos dimos cuenta que
existen diferencias al momento de determinar en qu aumento estas son observables (Tabla
1). Sin embargo, el aumento de 40X es capaz de visualizar todas las muestras. Estas
diferencias se deben al tamao de la clula y sus componentes, que las hacen observables
con ciertos aumentos o no, ya que en la mayora debamos aumentar el contraste de la
muestra aadiendo azul de metileno, excepto en la preparacin de agua charca, ya que
existan organismos vivos que podran resultar daados al momento de la tincin. Adems,
esta muestra cuenta con un contraste y tamao suficiente de sus componentes para su
correcta visualizacin sin necesidad de tincin y en todos los objetivos.
Para el siguiente ejercicio, en donde realizamos la calibracin del micrmetro ocular y las
mediciones del dimetro de campo, encontramos que nuestras mediciones individuales
eran diferentes ya que cada uno us un criterio distinto para realizar la calibracin del
microscopio, por lo tanto la medicin del dimetro de campo tambin variara.

Al comparar ambos grficos (Grficos 1 y 2) se puede observar que los Glbulos blancos
tienden a ser de un mayor dimetro y con presencia de ncleo, generalmente 5,0 (UA). Sin
embargo, tambin existen mediciones ms alejadas de este valor como 3,0 (UA). Los
Glbulos rojos tienden a ser de un dimetro menor, rodeando los 3,0 (UA) aunque tambin
existen valores que sobrepasan el promedio, llegando a los 5,0 (UA). La desviacin
estndar corresponde a 0,70 (UA) y 0,49 (UA) de Glbulos blancos y rojos respectivamente,
esto quiere decir que las mediciones de glbulos blancos se alejan ms del promedio que
los Glbulos rojos, por lo que sus tamaos varan ms.

Conclusiones
Luego del trabajo prctico con el microscopio, pudimos comprender de mejor manera cmo
manipularlo y manejarlo correctamente con los diferentes tipos de muestras, cumpliendo
nuestro principal objetivo propuesto. Con las observaciones obtenidas, vimos que la
diversidad de tamaos y formas de las clulas se puede apreciar a travs de la observacin
de distintas preparaciones. An en muestras del mismo dominio (bacterias) existen
diferencias notables entre ellas. Frankia sp. se caracteriza por su forma filamentosa que se
dispone en diversos cmulos, a diferencia de E. coli, donde las pequeas formas circulares
se encuentran dispersas uniformemente por toda la preparacin. La muestra de agua
charca se pudo observar correctamente ya que el contraste y el tamao de los organismos
era muy diferente a las bacterias y hongos observados anteriormente.
Para utilizar un criterio correcto de medicin de clulas, no basta con tener slo mediciones
arbitrarias de una persona, sino que es necesario tener una medicin estndar que permita
tener claridad de los datos obtenidos sin importar la persona que haga las mediciones.
Adems, nos dimos cuenta que no basta con realizar pocas mediciones de clulas, ya que
los tamaos pueden variar mucho entre una clula y otra, como los glbulos rojos en donde
obtuvimos una desviacin estndar alta.
El proceso de observar clulas depender mucho de qu tipo de clulas u organismos
queramos ver, ya que no todos los microscopios funcionarn ptimamente para todos los
tipos celulares o estructuras celulares que quieran observarse.

Bibliografa
Covadonga, A. (2010), Tecnicas bsicas de Microbiologia. Observacin de bacterias.
Facultad de Ciencias Biolgicas. Universidad Complutense. Madrid, Espaa.
Jenkins, F & White, H. (2002), Fundaments of optics international student. Editorial McGrawHill. Estados Unidos.
Welsch, U. (2009), Histologia. Editorial Mdica Panamericana. Madrid, Espaa.