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UNIVERSIDADE FEDERAL DOS VALES DO JEQUITINHONHA E MUCURI

BIOQUMICA DOS ALIMENTOS

AULA PRTICA II PRODUO DE INVERTASE DE ASPERGILLUS NIGER POR


FERMENTAO SLIDA

Lvia Alves Barroso

Larissa de Oliveira Ferreira Rocha

DIAMANTINA
MINAS GERAIS BRASIL
2015

1. INTRODUO
Um mtodo utilizado para a produo de enzimas a fermentao slida, neste
processo, as enzimas so produzidas pelos fungos diretamente sobre substratos insolveis em
gua, como cereais ou derivados de cereais, na presena de quantidades variveis de gua
livre. Nesta fermentao, o substrato slido no apenas fornece os nutrientes para os microorganismos, mas tambm serve de suporte para o crescimento destes.
Com isso a fermentao em estado slido consiste em uma tcnica de crescimento de
micro-organismos sobre e no interior de partculas porosas midas na qual o contedo de
lquido contido na matriz slida deve ser mantido em valores de atividade de gua que
assegure o conveniente crescimento e metabolismo celular, mas que no exceda a capacidade
mxima de reteno de gua na matriz.
A escolha do meio de cultura to essencial para o sucesso do processo fermentativo
quanto escolha do microrganismo. Nem sempre o meio que permite o melhor
desenvolvimento do micro-organismo favorece a formao da enzima. A produo otimizada
e os parmetros que afetam a sntese enzimtica devem ser investigados sempre, pois as
condies timas variam entre os diferentes micro-organismos, assim como para diferentes
enzimas.
O gnero do Aspergillus trata-se do gnero mais comum dos fungos filamentosos,
alm de ser um dos mais bem estudados. As espcies que compe este gnero tm ampla
distribuio mundial estando presente na superfcie, no ar e na gua, tanto em organismos
vegetais bem como em animais, alm de estarem associadas com a deteriorao de materiais
vegetais e alimentos, principalmente em regies de clima tropical e sub-tropical.
Muitas das espcies de Aspergillus so utilizadas para a obteno de enzimas, na
biossntese qumica e na transformao de compostos. As colnia s

geralmente

tm

crescimento rpido e exuberante, inicialmente so brancas, amarelas, passando para marrom


ou para o negro. A colnia composta por miclio areo com conidiforos eretos, densamente
distribudos sobre a superfcie do meio e farta produo de condeos.
A invertase (nome sistemtico: beta-frutofuranosidase), ou sacarase, a enzima
responsvel pela liberao do resduo L-Dfructofuranosidio no-redutor, a partir da molcula
de dissacardeo. Seu substrato preferencial a sacarose. A enzima utilizada na produo de
acar invertido que apresenta menor capacidade de cristalizao que a sacarose. A enzima
encontrada no trato intestinal de organismos superiores e produzida por micro-organismos.

Um meio de produzir a invertase atravs do micro-organismo Aspergillus niger. Que


exatamente o micro-organismo utilizado nesta prtica. A invertase uma enzima que pode
ser aplicada no setor de panificao para a produo de acar invertido, dentro outras
aplicaes.
2. OBJETIVO
Verificar a produo de invertase de Aspergillus niger por fermentao em meio de
trigo
3. MATERIAL E MTODOS
3.1 MATERIAIS
Frasco Erlenmeyer de 250mL;
10g de meio Farelo de Trigo;
Cultura de Aspergillus niger;
Algodo Hidrfilo;
Reagente Somogy-Nelson I;
Reagente Somogy-Nelson II;
Tubo de Ensaio;
Suporte de Tubo de Ensaio;
Espectrofotmetro;
gua destilada.
3.2 MTODOS
Primeiramente, foi feito a preparao do inoculo contendo a fermentao do
Aspergillus niger em farelo de trigo durante 7 dias.
Passado os dias necessrios para a fermentao, acrescentou-se 50mL de gua
destilada no frasco contendo o meio de farelo de trigo inoculado com o fungo Aspergillus
niger, ento por meio de um basto de vidro triturou-se o contedo atque o meio apresentasse
desintegrado. Aps a triturao, agitou-se o frasco que foi deixado em espera por 10 minutos.
Passado os 10 minutos, com o auxilio de um algodo hidroflico, o contedo do frasco
foi filtrado, e o resultado obtido da filtrao foi utilizado como extrato enzimtico. Aps a
obteno do extrato, em trs tubos numerados realizou-se a diluio do extrato em propores
de 1:50,1:70 e 1:100 com gua destilada.
Realizada a devida diluio, foram numerados quatro tubos de ensaio vazios
(1:50,1:70,1:100 e branco), e ento pipetou-se 4mL de soluo de sacarose nesses quatro

tubos. Os tubos ento foram incubados em banho maria 40C durante 5 minutos para
equilibrar a temperatura. Aps esse processo, adicionou-se 1mL do extrato enzimtico diludo
1:50,1:70 e 1:100 cada um no respectivo tubo numerado, sendo que no tubo branco pipetouse 1 mL de gua destilada.
Ento agitou-se os tubos que foram deixados incubados por 20 minutos, aps a
incubao, os tubos foram transferidos para um banho de gelo, para paralisar a reao. Com
isso pode determinar a concentrao de acar redutores formados atravs do mtodo de
Somogyi-Nelson, alm de determinar tambm a atividade enzimtica da invertase no extrato
enzimtico. Sedo que uma unidade de atividade definida como micromol de aucares
redutores expressos como glicose formados por minuto por mL de enzima.
3.2.1

MTODO DE SOMOGYI-NELSON

Para este mtodo foram numerados outros seis tubos de ensaio, e em cada um deles
foram pipetados 0,5mL de amostra + 1mL de reagente SNI, agitados e colocados em banho
maria durante 6 minutos. Aps este perodo os tubos foram retirados e colocados em banho de
gelo at que resfriassem temperatura ambiente. Quando resfriados, os tubos foram retirados
do banho, e a cada um deles foi adicionado 1mL de reagente SNII, sob agitao, e
permaneceram em repouso por 5 minutos. Ao fim do repouso adicionou-se 10mL de gua
destilada e misturou-se por inverso.
O espectrofotmetro foi calibrado com a soluo do tubo de ensaio que no possua o
substrato, e ento mediu-se a absorbncia a 540nm contra o tubo de ensaio branco.
4

RESULTADOS E DISCUSSO
Aps realizar os procedimentos descritos, coletou-se valores atravs do qual possvel

analisar a atividade enzimtica da invertase. Devido ao mtodo de Somogyi-Nelson que


capaz de determinar a quantidade de acar presente.
Ento ao colocar a amostra dos tubos de ensaios em uma cubeta e levar ao espectrofotmetro,
atravs do qual obteve o valor da absorbncia que esta representada na tabela a seguir.

Tubo
1
2
3

Tabela 1: Valores de Absorbncia


Diluio
Abs (540 nm)
1:30
0,124
1:50
0,113
1:70
0,101

Para calcular a atividade enzimtica das reaes necessrio utilizar a curva padro de
glicose que est na representada na tabela abaixo, onde obtm-se a equao da reta presente
no grfico 1.
Tabela 2 - Curva Padro de Glicose
Soluo de Glicose
[ ] Glicose
0,02
0,11
0,04
0,22
0,06
0,33
0,08
0,44
0,10
0,55
0,12
0,66
0,14
0,77
0,16
0,88
0,18
0,99
0,20
1,11

Tubo
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10

Abs (540nm)
0,0470
0,1128
0,1698
0,2164
0,2848
0,3427
0,4191
0,4624
0,5319
0,5902

Atravs da
equao
abaixo possvel colocar os valores da absorbncia e encontrar a atividade enzimtica,
y = 0,5456x 0,0129

(1)

Onde,
y = representa o valor da absorbncia;
x = concentrao de glicose.
Ento faz para cada diluio presente nos tubos numerados um clculo para encontrar o valor
da atividade enzimtica. O clculo realizado est presente nas equaes abaixo. Calculando a
velocidade para o tubo 1 utilizando a tabela 1 e a equao da reta presente no grfico 1,
Para y = 0,398 e y=0,5456x 0,0129 temos,

0,124 = 0,5456x 0,0129


x = 0,25 mol de glicose
Para velocidade de 0,25 mol de glicose temos,
0,25 mol de glicose ---- 20 min
x

---- 1 min

x = 0,0125 [mol/min] ou [U]


Onde,
1 mL de enzima ---- 30 mL de Soluo
x

---- 1 mL

x = 0,033 mL de enzima ativa


Ento atividade da enzima ,
0,0125 mol/min ---- 0,033 mL de enzima
x

---- 1 mL de enzima

x = 0,378 [mol/min/mL] ou [U/mL]


Este clculo foi realizado para os outros 3 tubos e est presente na tabela 3, abaixo.
Tubo
1
2
3

Tabela 3 Atividade Enzimtica


Diluio
Abs (540 nm)
Atividade Enzimtica
1:30
0,124
0,378 U/mL
1:50
0,113
0,349 U/mL
1:70
1,101
0,316 U/mL

5. CONCLUSO
possvel observar uma eficincia cataltica admirvel das enzimas devido ao seu alto
grau de especificidade por seus substratos, acelerando reaes qumicas especficas. Pode-se
verificar tambm que a velocidade da reao enzimtica est relacionada com a concentrao
do substrato.
Por meio dos clculos realizados possvel observar uma atividade enzimtica maior
no tubo de diluio 1:30 em comparao com os tubos de 1:50 e 1:70. Como o tubo de
diluio 1:30 est mais concentrado, ento neste tubo est presente um numero maior de
enzimas e com isso houve uma quebra maior de acar, resultando com isso em um nmero
maior de absorbncia e atividade enzimtica maior.

6. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
MARZZOCO, A.; TORRES, B.B. Bioqumica Bsica, 3. Edio. Rio de Janeiro, 2007.
MARIOTTO, J. R.; Cintica Enzimtica, Julho 2006.