Universit dEl-Oued

Dpartement de biologie cellulaire et

molculaire

Cours de techniques danalyses biologiques

Support pdagogique pour les tudiants de 3me anne biochimie
et toxicologie, licence LMD

Elabor par lenseignant Abdelhak MEDJOUR

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Cours de T.A.B.

Anne 2016/2017
3me Anne Biochimie et toxicologie, licence LMD

Chapitre 3 : Mthodes physicochimiques

3.1. Mthodes chromatographiques
3.1.1. Dfinition et principe
3.1.1.1. Dfinition
La chromatographie, mthode danalyse immdiate, spare les constituants dun
mlange par entranement au moyen dune phase mobile, liquide ou gaz, le long dune phase
stationnaire (solide ou liquide fix).
La premire chromatographie a t ralise par le botaniste russe TSWETT, en 1905.
Pour reproduire une exprience inspire de celle quil avait effectue, on utilise le montage dans
la figure ci-dessous qui permet de sparer les pigments dune feuille dpinard.

Exprience inspire de celle de TSWETT.

Le dpt est obtenu en crasant, sur lemplacement prvu cet effet, un disque de 0,5
cm de diamtre dcoup dans la feuille, laide dun agitateur en verre. Le chromatogramme
est mis en place dans la cuve pralablement sature pendant 30 minutes, le solvant monte le
long de la feuille de papier par capillarit. Le solvant est la phase mobile, la feuille de papier
constitue la phase fixe ou stationnaire. Les diffrents pigments migrent des vitesses diffrentes
et lorsque le front du solvant atteint la partie suprieure du chromatogramme, on note la position
des spots (figure ci-dessous).

Chromatogramme des pigments

dune feuille dpinard.

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3.1.1.2. Principe
Le principe de la chromatographie est bas sur la migration diffrentielle des divers
soluts contenus dans lchantillon analys et obtenue par la partition des soluts entre les
phases fixe et mobile. Chaque molcule du mlange sparer est soumise une force de
rtention, affinit du solut pour la phase fixe, et une force de mobilit, entranement du solut
par la phase mobile (entranement qui dpend essentiellement de la solubilit de la molcule
dans la phase mobile). La rsultante de ces deux forces tant variable selon la molcule, chacune
delle migrera une vitesse qui lui est propre.
La chromatographie est galement une mthode danalyse quantitative permettant le
dosage des constituants dun mlange analys.
3.2. Diffrents types de chromatographie et leurs applications en biologie
3.2.1. Chromatographie de partage
3.2.1.1. Principe
Cette chromatographie liquide-liquide est appele chromatographie de partage, parce
que fonde sur la partition diffrentielle de chacun des soluts entre deux liquides non
miscibles, lun constituant la phase stationnaire, lautre la phase mobile.
3.2.1.1.1. Le coefficient de partage
Lorsquun solut A est distribu entre deux liquides non miscibles (S et S), il stablit
un quilibre :

On appelle coefficient de partage le rapport des

concentrations de solut dans les deux phases lquilibre,
une temprature donne :

[]
[]

La transposition de cette partition entre deux phases

liquides dans un systme chromatographique est rendue possible
par la fixation de lun des solvants sur un support inerte, lautre
constituant la phase mobile.
Un solut trs soluble dans la phase fixe migrera lentement, la force de rtention
prdominant la force dentranement. A linverse un solut soluble dans la phase mobile migrera
rapidement.

distance parcourue par le solut

=
On appelle rapport frontal Rf. (ou rfrence front) le rapport :
distance parcourue par le solvant
Un solut trs soluble dans la phase fixe aura un Rf faible ; trs soluble dans la phase
mobile son Rf sera lev et proche de 1.

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3.2.1.2. Technologie de la chromatographie de partage

3.2.1.2.1. Appareillage
La chromatographie de partage liquide-liquide peut tre ralise :
Sur colonne : la colonne est remplie dun support imprgn dun solvant fixe.
Lensemble constitue la phase stationnaire. Le solvant fixe doit tre adsorb sur le support, en
une couche suffisamment paisse pour exercer son rle de solvant lgard des soluts entrans
par le solvant mobile de dveloppement. Il est naturellement impossible dobtenir des supports
totalement inertes, donc il est pratiquement impossible de dterminer, dans ce type de
chromatographie, ce qui relve du partage ou de ladsorption :
Sur papier : la feuille de papier, sur laquelle le dpt a t fait, est introduite dans la
cuve contenant la phase fixe, le plus souvent aqueuse. La cellulose du papier, trs hydrophile
se sature en eau, qui constitue la phase fixe ; cette opration ncessite plusieurs heures. Ensuite,
la phase mobile est introduite dans laugette situe la partie suprieure de la cuve. La phase
mobile migre par capillarit, la sparation des soluts seffectue par partage entre les deux
solvants.
Remarque :
Dans cette technique de chromatographie descendante, lintervention du papier comme
phase stationnaire ne peut tre nglige. En revanche, la chromatographie ascendante ou radiale
sur papier et la chromatographie sur couche mince sont des chromatographies dadsorption.
Mais il est certain que dans les mcanismes de sparation, le partage intervient pour une part
plus ou moins importante, compte tenu de leau adsorbe par la phase stationnaire solide et
polaire.
3.2.1.2.2. Solvants
Un partage est caractris par ses deux solvants de dveloppement, lun fixe, lautre
mobile. Les deux solvants sont caractriss par leur diffrence de polarit et leur nonmiscibilit. Gnralement, le solvant fixe est polaire ; cest dailleurs trs souvent leau. Le
solvant mobile, non polaire, est constitu frquemment dun mlange de solvants plus ou moins
apolaires, selon les ncessits de la sparation.
En chromatographie descendante sur papier, on utilise gnralement un solvant
diphasique o phases polaire et non polaire non miscibles sont prpares dans une ampoule, ce
qui permet la phase mobile dtre sature en phase stationnaire et rciproquement.
Pour la sparation de substances trs hydrophobes, donc trs solubles dans la phase
organique, il est prfrable de procder une chromatographie en phases inverses ; la phase
mobile est polaire, la phase fixe apolaire.
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Cuve de chromatographie descendante.

3.2.1.2.3. Support
Le support est le solide poreux imprgn de liquide, son intervention en tant
quadsorbant est invitable et peut quelquefois tre prpondrante sur leffet de partage.
Le papier est choisi en fonction de critres exprimentaux (paisseur, texture). Les
supports pour colonne sont trs variables : cellulose, gel de silice. etc.
3.2.1.3. Analyse des fractions
Lanalyse des fractions est presque toujours qualitative, la chromatographie de partage
est essentiellement une mthode danalyse immdiate. Elle est quelquefois quantitative.
3.2.1.3.1. Analyse qualitative
Les dpts ne sont pas quantitatifs. Lidentification des composs du mlange peut se
faire selon plusieurs procds :
Par utilisation de tmoins : ce sont des composs supposs du mlange dont on dpose
des solutions pures sur le mme chromatogramme. On compare la migration des tmoins celle
des spots de lchantillon analys ;
En caractrisant la migration dun solut du mlange par son Rf : une temprature
donne, pour un systme chromatographique dfini (support, solvants de dveloppement), le Rf
est caractristique dun solut :

distance parcourue par le compos

distance parcourue par le solvant mobile

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Si la chromatographie dure trop longtemps, au point de ne plus pouvoir mesurer la

distance parcourue par le front du solvant, on dtermine le Rf (par rapport un tmoin) :

distance parcourue par le compos

distance parcourue par le tmoin

Remarque :
Dans le cas o lon chromatographie des substances incolores, il est ncessaire de
visualiser les spots : plusieurs procds peuvent tre utiliss :
Par fluorescence ;
Par une raction chimique colore appele rvlation
Les unes gnrales, utilises pour un groupe de composs, comme la raction
la ninhydrine pour les acides amms et la raction de Molisch pour les sucres ;
Les autres spcifiques, employes pour une seule substance, comme la raction
de Millon pour la tyrosine par exemple.
3.2.1.3.1. Analyse quantitative
La chromatographie de partage peut quelquefois donner lieu au dosage des soluts
spars.
Dans ce cas, les dpts sont quantitatifs. Les procds consistent en :
Une planimtrie des spots. Cette mthode, assez grossire, utilise la proportionnalit qui
existe entre le logarithme de la surface du spot et la concentration du solut ;
Une lu1ion : les spots sont dcoups, lus dans un solvant convenable, doss par
absorptiomtrie molculaire ;
Une densitomtrie, directe sur chromatoplaque. Ce procd courant mesure la densit
optique du spot, grandeur proportionnelle 1a concentration.
3.2. Chromatographie dadsorption
3.2.1. Principe
La chromatographie dadsorption est base sur le partage des soluts entre ladsorbant
fixe et la phase liquide, mobile. Chacun des soluts est soumis une force de rtention par
adsorption et une force dentranement par la phase mobile. Lquilibre qui en rsulte aboutit
une migration diffrentielle des soluts de lchantillon analyser, ce qui permet leur
sparation.
L'adsorption est la fixation des molcules dissoutes par la phase fixe solide. Cette
fixation est due ltablissement de liaisons secondaires de surface entre ladsorbant et la
molcule adsorbe : liaisons diple-ion, ou diple-diple ou liaisons de Van der Waals.
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