CULTIVO DE CHLAMYD!

A EM DIFERENTES SISTEMAS CELULARES

UM ESTUDO COMPARATIVO'
PHYLLIS CATHARINA ROMIJN eMARA HALFEN TEIXEIRA LIBERAL 2

RESUMO - Tentou-se o cultivo de Chlamydia sp, atravs de trs mtodos,utilizando macerados de pulmes e traquia de animais necropsiados suspeitos. Suspenses foram inoculadas
em ovos embrionados, em camundongos e em cultivo celular. A tcnica do cultivo celular em
monocamada se apresentou como a mais satisfatria, principalmente pela maior rapidez no
diagnstico.
Termos para indexao: clamidiose, bovinos, pneumonia, camundongos, ovo embrionado,
monocamada de clulas McCoy, diagnstico.
CULTIVATION OF CHLAMYDIA IN DIFFERENT CELL SYSTEMS:
A COMPARATIVE STUDY
ABSTRACT - The culture of Chlanzydia sp. was tried by three cultivation methods,
triturating the lungs and trachea of necropsied animaIs, and inoculating this suspension in
embrionated eggs, mice and cell culture. The technique in which mnolayers of ceil culture
were utilized presented the best results, being most practical and swift in diagnosing the
disease.
Index terms: chlamydiosis, bovines, pneumonia, mice, embryonated eggs, McCoy ceil
monolayers.
INTRODUO
Pesquisas realizadas com material de bovinos (rgos diversos) necropsiados no estado do Rio de Janeiro durante o perodo de 1977 a 1984 pelo Laboratrio de Biologia Animal (LBA) permitiram elucidar diversos problemas zoossanitrios com que os
criadores vinham se defrontando. Dentre eles, chamou a ateno a existncia de broncopneumonias em
animais jovens (de at um ano de idade), que levavam morte por outras causas que no as provocadas por agentes bacterianos e/ou parasitrios. Os
exames anatomopatolgicos sugeriram a presena de
outros microorganismos, como C/zlamydiaceae, no
caso da identificao de leses pulmonares tpicas ou
indicativas (Lennette & Schmidt (1979) e Shewen
(1980).
Baseando- se nesses achados, foi elaborado um
projeto de pesquisa visando o isolamento de Chla,nydia sp. o que, como trabalho pioneiro em bovinos no
Brasil, exigiu que fossem testadas as diversas formas
de cultivo possveis (World Health Organization
2

Aceito para publicao cm 28 de maro dc 1989.

M6d.-Vet., PESAGRO-Rio, Lab. de Biol. Animal,
Alameda So Boaventura, 770, Fonseca, CEP 24123
Niteri, RI.

1975), a fim de se eleger a mais adequada s condies existents no LBA.

O presente trabalho tem como objetivo apresentar tcnicas de cultivo de Chlamydia sp. utilizadas
em nosso Laboratrio de Biologia Animal da
PESAGRO-Rio, assim como as dificuldades e solues encontradas durante o processo de utilizao
delas para o diagnstico do microorganismo, detamando o mtodo que melhor se adequou rotina de
trabalho.
MATERIAL E MTODOS
O material utilizado para exame consistiu principalmente de pulmes e traquias de bezerros de at
um ano de idade, necropsiados no municpio de
Cantagalo, RJ, e remetidos ao laboratrio para verificao da causa mortis.
As amostras foram transportadas em recipientes
com temperatura entre - 4 0C e 0C, por perodo
nunca superior a 24 horas. Assim que chegavam ao
laboratrio, as amostras eram imediatamente processadas.
O material era triturado e homogeneizado em
meio-de-Earle ou caldo-infuso-corao (BHI)
Pesq.agropec.bras.,Brasflia,25(1):15-18,jan. 1990

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(Lennette & Schmidt 1979), e conservado a - 20 0C

at ser inoculado.
Para o preparo do inculo, utilizou-se o homogeneizado, j preparado, a 20% em meio-de-Earle.
O inculo era centrifugado trs vezes, aps adio
de antibiticos, retirando-se sempre o sobrenadante
para nova centrifugao. Do sobrenadante final era
retirada a quantidade necessria para inoculao nos
sistemas celulares estudados.
Ovos embrionados
As aves poedeiras receberam rao isenta de antibiticos, preparada especialmente para o trabalho.
Foram utilizados somente os ovos de casca clara, ntegra e lisa.
Do sobrenadante j descrito eram inoculados 0,2
ml no saco da gema, em um mnimo de trs ovos com
embries de seis dias. Os ovos eram incubados a
36,50C e virados diariamente. Embries cuja morte
ocorria dentro de quatro dias aps a inoculao eram
dispensados, s se utilizando aqueles cuja morte
ocorria aps esse perodo. Logo que era verificada a
morte do embrio ou perda de sua motilidade, os
ovos eram abertos assepticamente. A gema era removida para uma placa-de-Petri, onde o seu excesso
era retirado da membrana com salina esterilizada.
Atravs de esfregaos e impresses, eram feiras lminas da membrana do saco da gema para identificao de partculas de incluso caractersticas de
C/ilwnydia sp. em microscpio tico com lente de
imerso lOOx e objetiva lOx.
Os embries que sobreviviam aps doze dias de
inoculao eram sacrificados, e lminas eram feitas
da membrana do saco da gema, da mesma forma
descrita anteriormente.
De todos os materiais de primeira passagem negativos, isto , em cujas lminas no foram verificadas incluses semelhantes s caractersticas para
Chkzmydia sp., eram feitas duas subpassagens, aps
as quais eram considerados negativos se suas lminas
no apresentassem as referidas incluses.
As subpassagens (estoque de material para referncias futuras) eram realizadas a partir da membrana restante.
Esta membrana era macerada em volume igual de
meio-de-Earle. Em centrfuga refrigerada (0C), o
material era diferenciado por 30 a 60 minutos, a
500 r.p.m.. Sua esterilidade era testada em seguida,
semeando-se em meio semi-slido (Tioglicolato).
O inculo constitua o sobrenadante do centrifugado.
Pesq. agropec. bras., Braslia, 25(l):l5- 18, jan. 1990

Camundongos
Camundongos albinos, da criao do prprio laboratrio e sem linhagem defmida, foram controlados anteriormente ao experimento, verificando-se se
no eram portadores do agente em estudo. Animais
geneticamente resistentes infeco (Lennette &
Schmidt 1979) por Chtamydia sp. eram detectados e
eliminados do plantel.
A verificao de existncia de animais resistentes
infeco ou portadores de Chlamydia sp. realizou-se atravs da inoculao de suspenses de pulmes e baos de camundongos do plantel, infectados
ou no, em monocamadas de clulas McCoy, conforme descrito mais adiante.
A presena de infeco latente era verificada periodicamente por trs a cinco passagens cegas de
suspenses dos pulmes e bao de camundongos,
tomados ao acaso, de vrias faixas etrias, da linhagem a ser utilizada. Dessa suspenso, 0,025 mi eram
inoculados, por insUlao nasal, em camundongos de
trs semanas de idade, sob narcose de ter. Os camundongos inoculados eram mantidos em quarentena e sacrificados aps sete dias de observao. Do
ltimo lote de camundongos, a suspenso pulmonar
era inoculada no saco vifelino de ovos embrionados
de seis dias.
A rao recebida pelos animais em experimento
era isenta de antibiticos que inibissem o crescimento do microorganismo, sendo fornecida sempre
fresca. A gua era abundante e renovada a cada dia.
A maravalha utilizada como cama era nova e seca, sem resina, e renovada no mnimo trs vezes na
semana.
A. Camundongos recm-natos: inoculao intracerebral
Quantidades entre 20 e 30 isl de uma suspenso a
1017c do homogeneizado de pulmes e traquia, preparadas conforme j descrito, eram inoculadas em
camundongos recm-natos, em qualquer rea do
hemisfrio esquerdo do crebro, utilizando-se seringa de 100 pil e agulha hipodrmica 13 x 3,8.
Animais cuja morte ocorria dentro das primeiras
24 horas eram dispensados. Sintomas como sonolncia e paralisia, considerados indicativos, geralmente
se desenvolviam em 48 horas, com morte em trs a
cinco dias. Destes animais, era retirada a dura-mter
assepticamente, sendo feitas impresses em lminas,
as quais eram observadas de forma idntica des-

CULTIVO DE CJJLAMYLJJA EM DIFERENTES SISTEMAS

crita para a membrana da gema de ovos embrionados.

Nos casos negativos, o pulmo e o bao do animal
eram retirados, macerados, centrifugados e reinoculados em outra srie de camundongos recm-natos.
Essas passagens cegas eram realizadas de 15 em 15
dias aproximadamente, por quatro vezes, fmdo o
que, os materiais eram considerados negativos, de
acordo com os resultados das impresses das lminas.
B. Camundongos jovens: inoculao intra-peritonial
Esta tcnica consistiu na introduo de 0,5 ml de
suspenso (J descrita) na cavidade peritonial de camundongos de trs a cinco semanas de idade, num
total de cinco animais por amostra.
No trabalho de pesquisa realizado, os animais
eram observados durante 21 dias, dispensando-se
aqueles cuja morte ocorria dentro de 48 horas. Os
animais que apresentavam sintomas indicativos ou
no morriam dentro de 21 dias eram sacrificados e
necropsiados; suas vsceras eram expostas assepticamente, e, aps verificada a presena de leses, o
bao, os rins e o fgado eram retirados e com eles
feitos esfregaos, que, aps corados e fixados, eram
observados ao microscpio tico, com objetiva de
imerso, para verificar a presena dos corpsculos
caractersticos.
Eram feitas trs passagens cegas antes de se considerar as amostras negativas, fazendo-se uma suspenso a 20% com caldo nutriente estril a partir do
macerado de rgos, e injetando-se 0,5 ml deste, intraperitonialmente, em outro grupo de camundongos.
Isolamento em cultivo celular
Clulas de linhagem contnua em monocamada
McCoy, tratadas com Iodo-desoxi-uridina, foram
utilizadas como terceiro sistema para isolamento de
Chlamydia sp. a partir de material suspeito.
As clulas eram cultivadas e passadas em garrafas
tipo xarope, sendo utilizados pequenos tubos de fundo chato, preparadas para este cultivo, para exames
do material suspeito, vedados com rolha de borracha,
sendo as clulas (125.000ftubo) cultivados em lamnula redonda, que permanecia no fundo do tubo.
Aps 48 horas, as clulas confluentes j podiam ser
inoculadas com o material suspeito a partir da suspenso j descrita, diluda a lO_l. O meio para dilui-

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o do material era o mesmo utilizado para o cultivo

celular, adicionado de glicose (0,54 g/ml soluo),
fungizon (250 mg/ml soluo) e vancomiciaa
(10 mg/ml soluo). Dessa forma, a inoculao das
clulas era realizada dispensando-se o meio velho e
colocando-se 1 ml do material diludo nos tubor com
monocamadas de clulas confluentes, utilizando-se
dois tubos para cada material. Os tubos eram ento
centrifugados a 3.000 x g, a 30C, por uma hora,
para melhor associao microrganismo - clula, e em
seguida incubados a 37 0C, por 48 horas. Ao tina], as
clulas nas lamnulas eram fixadas e coradas no prprio tubo, deixando um tubo de cada material para
controle. A observao ao microscpio tico para
identificao de incluses era realizada montando-se
a lamnula, com a camada celular para baixo, em lmina com uma gota de glicerol, e utilizando-se objetiva de imerso.
Materiais negativos eram dispensados, os positivos ou suspeitos eram novamente inoculados em novas clulas e, caso confirmada a sua positividade,
estocados para pesquisas futuras.
A fixao e colorao das lminas dos trs mtodos de cultivo foram realizadas pela tcnica de
Giemsa.
RESULTADOS
Dentre as tcnicas realizadas, o cultivo celular em
monocamada apresentou-se como sendo a melhor
para ser utilizada em nosso laboratrio, por sua rapidez e especificidade, detectando 100% dos animais
sabidamente infectados.
As outras tcnicas, alm de serem mais trabalhosas, forneciam resultados duvidosos nas leituras das
lminas preparadas, ou causavam a morte, por infeco inespecfica, dos sistemas inoculados.
DISCUSSO
O cultivo celular permite resultados rpidos, em
48 horas, desde que haja toda a infra-estrutura
montada. O espao fsico requerido pequeno, devendo-se contar apenas com uma capela de fluxo
laminar e ambiente onde preparar e filtrar os meios.
Uma das poucas desvantagens reside na dificuldade
de aquisio de material de consumo de boa qualidade, e a preos acessveis.
Quando os exames a serem realizados so em pequeno nmero, ou enviados ao laboratrio com
grandes intervalos de tempo, a clula McCoy pode
ser congelada em pequenas alquotas em N lquido, e
utilizada rapidamente. A inoculao de dois tubos
Pesq. agmpec. bras., Brasilia, 25W: 15-18, jan. 1990

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P.C. ROMIJN e MJ-l.T. LIBERAL

com cultivo celular para cada material suspeito permite manter a amostra continuamente, ou utiliz-la
como controle, bastando, para tanto, inocular a monocamada infectada, em neva passagem, em outro
tubo com clulas.
A utilizao de camundongos como substrato celular foi a tcnica nrnis laboriosa, requerendo uma
infra-estrutura mais sofisticada, sendo, porm, a
mais acurada por permitir a reproduo de um quadro clnico e histopatolgico caracterstico, mesmo
quando o agente infeccioso se encontra em quantidades mnimas na suspenso utilizada como inculo.
Devido manipulao da Ch/ainydia sp. em rea
vizinha da criao dos animais, o risco de contaminao atravs de roupas, instrumental e outros no
pode ser desprezado. Um biotrio de criao dos
animais necessrio para eliminar esta possibilidade.
A inoculao do material suspeito um processo
relativamente rpido, quer seja intraperitonial ou intracerebral, porm o perodo de observao, de at
21 dias para cada grupo de animais por material, requer espao tsico razovel e um acompanhamento
dirio. Como alguns materiais so ressemeados at
trs vezes, deve-se calcular um perodo de 90 dias
para cada exame. Tal perodo excessivamente longo para qualquer diagnstim de rotina, sendo que os
resultados talvez no sejam nrnis significativos depois de decorrido todo este tempo.
A identificao de Clilamydia sp pode ocorrer em
qualquer etapa, mesmo sem sintomas clnicos pneumnicos, aps a primeira, segunda, ou terceira inoculao, pela deteco dos corpsculos elementares
em esfregaos de alguns pulmes processados. Nas
passagens pulmonares, ainda possvel detectar pequenas leses, ras de consolidao e hiperemia nos
pulmes dos animais necropsiados.
Os camundongos infectados geralmente possuam
o bao aumentado, com fibrina na superfcie e lquido asctico abundante, alm de focos de necrose no
fgado. Impresses dos rgos afetados apresentavam-se ricas em corpsculos elementares.
Durante o experimento utilizando ovos ernbrionados como substrato celular para o cultivo de
Ch/arnydia sp., muitas das dificuldades foram semelhantes s da utilizao de camundongos.
Geralmente, apenas 60 a 70% dos ovos so frteis, devendo-se calcular l% a mais do que a
quantidade necessria.
Ovos embrionados so extremamente sensveis
contaminao, e todos os cuidados foram tomados
no sentido de realizar os trabalhos em condies de
assepsia.
Pcsq. agropec. bras., Braslia, 25(l):15-18, jan. 1990

Para uma correta execuo dessa tcnica, miprescindvel a disponibilidade de uma incubadeira, de
preferncia automtica, que evite a influncia de fa-.
tores externos.
A retirada assptica da membrana da gema para
preparo de esfregao em lmina e suspenso para
novas passagens ou estoque tambm apresenta dificuldades de assepsia, devendo ser realizada, de preferncia, em um ambiente com fluxo laminar.
O preparo de lminas a partir da membrana da
gema requer certa prtica, pois poucas clulas por
campo so obtidas, alm de apresentarem visualizao pouco ntida.
Os pulmes dos embries de galinha inoculados
com a suspenso de pulmo do material de primeira,
segunda ou terceira passagem costumavam se apresentar hipermicos, congestos, de parede fina, e com
as extremidades cianticas.
CONCLUSES
A tcnica de cultivo celular em monocamada,
como utilizada no presente estudo, recomendada
para o diagnstico de Chlamidiose em material fecal
em laboratrios pequenos e com poucos recursos. Os
resultados obtidos foram considerados confiveis,
permitindo estudos epidemiolgicos extensivos.
AGRADECIMENTOS
Ao Dr. Marcelo Magalhes, da Universidade Federal dc Pernambuco, pelas clulas de monocultivo
McCoy cedidas para os testes.
REFERNCIAS
CARTER, G.R. Diagnostic procedures ia
vcterivary bacteriology and mycology. 3.
ed. Springfield, Charles C. Thomas Publisher,
1979. 484p.
LENNETTE, E.H. & SCHMIDT, N.J. Diagnostie
procedures for vital, rickettsial and
chlamydial infections. S. ed. Washington,
American Public Health Association, 1979.
1138p.
SHEWEN, P.E. Chlamydial infection in animaIs. A
review. Can. Vet. J., 2I(1):2-11, 1980.
WORLD HEALTH ORGANIZATION, Geneva.
Guide to the laboratory diagnosis of
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