Centro de Cincias Agrrias, Ambientais e Biolgicas

Curso de Engenharia de Pesca

Relatrio Final de Estgio Supervisionado - CCA 507GRA

TREINAMENTO DE TCNICAS EM MICROBIOLOGIA DE

ALIMENTOS

DISCENTE: LISCIARA LOPES SILVA

ORIENTADORA: NORMA SUELY EVANGELISTA-BARRETO

Cruz das Almas Ba

2016

Colegiado de Engenharia de Pesca

INTRODUO
A Microbiologia uma cincia derivada da Biologia cujo principal objetivo
estudar todos os aspectos que envolvem o mundo microbiano, constitudo
pelos procariotos (bactrias e arqueobactrias), fungos, protozorios, vrus e
algas microscpicas (SILVA; SOUZA, 2013).
A grande diversidade de microrganismos permite que participem de
processos ecolgicos importantes para a manuteno da vida no planeta, tais
como fotossntese e gerao de oxignio, ciclos biogeoqumicos (carbono,
nitrognio), reciclagem de elementos (fsforo, enxofre, entre outros),
manuteno da fertilidade e da estrutura de solos. No entanto, a elevada
capacidade de biodegradao de alguns microrganismos, tambm apresenta
aspectos negativos, quando provoca a deteriorao em alimentos (SILVA;
SOUZA, 2013).
As bactrias e fungos so os microrganismos de maior destaque como
causadores de deteriorao e como potenciais patgenos ao homem. Dentre
os microrganismos, as bactrias so as de maior participao nos processos
de contaminao de alimentos, pois so capazes de utilizar uma variedade de
substratos sob diferentes faixas de temperatura e pH (FIGUEIREDO, 2001).
A contaminao dos alimentos pode levar a problemas de Sade Pblica,
prejudicando a populao e o comrcio, levando a perdas econmicas e
afetando a confiana do consumidor. Por este motivo, torna-se necessria a
busca por alimentos livre de contaminantes, papel desenvolvido pela
microbiologia, que tem por objetivo fornecer alimentos seguros do ponto de
vista higinico-sanitrio (SOUSA, 2006).
de grande significncia a prtica de analisar nos alimentos a existncia
de determinadas bactrias, cuja presena utilizada na avaliao da qualidade
e segurana microbiolgica do alimento. Estas bactrias so denominadas
microrganismos indicadores, que segundo Franco e Landgraf (2004), quando
presentes em um alimento, podem fornecer informaes sobre a deteriorao
do alimento, a provvel presena de patgenos e indicar condies sanitrias
inadequadas durante a produo, o processamento, ou armazenamento.

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A contaminao de alimentos por microrganismos, a sua proliferao em
termos de sade pblica e a preocupao em desenvolver mtodos de
controles em empresas alimentcias vem crescendo no mundo todo (CUNHA,
2006). Assim, o estgio supervisionado em microbiologia se faz importante,
principalmente porque na rea de Engenharia de Pesca, o controle de
sanidade do pescado ao longo da cadeia de produo essencial para que se
produza e obtenha um alimento incuo e seguro.
OBJETIVO GERAL
Acompanhar e aprender tcnicas e procedimentos adotados no
laboratrio de microbiologia de alimentos.
OBJETIVOS ESPECFICOS

Conhecer os principais equipamentos utilizados no laboratrio de

microbiologia.

Conhecer os procedimentos de limpeza e esterilizao usados no

laboratrio de microbiologia.

Aprender a preparar materiais e meios de cultura necessrios para a

realizao de uma anlise microbiolgica.

Conhecer as normas de trabalho e biossegurana adotados no

laboratrio de microbiologia.

Conhecer o protocolo de colimetria usado para quantificar o grupo dos

coliformes.

REVISO DE LITERATURA
A Organizao Mundial de Sade (OMS) define as doenas veiculadas
por alimentos (DVAs) como "uma doena de natureza infecciosa ou txica
causada por ou atravs do consumo de alimentos ou gua contaminados"
(FIGUEIREDO et al., 2007), por agentes biolgicos, qumicos e fsicos.

Colegiado de Engenharia de Pesca

Dentre os vrios fatores que contribuem para a ocorrncia de surtos de
origem alimentar, pode-se citar a utilizao de matria prima de m qualidade,
equipamentos e utenslios contaminados, ausncia de tratamento trmico
adequado, armazenamento em condies inadequadas, falta de higiene dos
manipuladores e condies insatisfatrias nos pontos de distribuio e
comercializao (SENA, 2000).
Os principais grupos, gneros e espcies bacterianas indicadoras da
qualidade microbiolgica do alimento e envolvidas em infeces alimentares
so:

coliformes

totais,

coliformes

termotolerantes,

Escherichia

coli,

Staphylococcus aureus, Salmonella spp., Vibrio parahaemolyticus e V.

cholerae (SILVA; SOUZA, 2013).
Os

coliformes

totais

so

compostos

por

bactrias

da

famlia

Enterobacteriaceae, capazes de fermentar a lactose com produo de gs,

quando incubados a 35-37C, por 48 horas. So bacilos Gram negativos e no
formadores de esporos, anaerbios facultativos (FRANCO; LANDGRAF, 2004).
Fazem partes desse grupo predominantemente bactrias pertencentes aos
gneros Escherichia, Enterobacter, Citrobacter e Klebsiella. Destes, apenas
Escherichia coli tem como hbitat primrio o trato intestinal do homem e
animais homeotrmicos. Os demais gneros (Citrobacter, Enterobacter e
Klebsiella), alm de serem encontrados nas fezes, tambm esto presentes em
outros ambientes como a vegetao e o solo (CUNHA, 2006).
Os coliformes termotolerantes e Escherichia coli so as bactrias
correspondentes aos coliformes totais que apresentam a capacidade de
continuar fermentando a lactose com produo de gs, quando incubadas a
temperaturas de 44-45C. Os critrios microbiolgicos que envolvem E. coli so
teis quando se deseja determinar se houve contaminao de origem fecal
(FRANCO; LANDGRAF, 2004).
O gnero Salmonella compreende bacilos no esporulados, Gram
negativos, anaerbicos facultativos, sendo a maioria mvel. Seu principal
reservatrio o trato gastrintestinal do homem e animais, principalmente aves
e sunos. Dentre as de maior importncia para a sade humana, destacam-se

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Salmonella Typhi que causa a febre tifide, S. Paratyphi (A, B e C), causadora
da febre entrica e as demais salmonelas (S. Typhimurium, S. Enteritidis, S.
Bongori, S. Choleraesuis, S. Nyanza, S. Paratyphi e S. Virginia) responsveis
pela salmonelose (FRANCO; LANDGRAF, 2004).
O gnero Staphylococcus corresponde a bactrias Gram positivas,
esfricas,

imveis, no

esporulados e

anaerbios facultativos. Esto

distribudos, principalmente na pele e mucosas de vertebrados de sangue

quente, mas isolados de produtos alimentares, p e gua. Staphylococcus
aureus podem ser produtores de enterotoxinas nos alimentos, causando
intoxicao quando consumidos (GOMES, 2015). Logo, a sua presena nos
alimentos um indicador de deficincias higinicas nas operaes de
manipulao (CORRA, 2008).
O gnero Vibrio corresponde a bactrias pertencentes famlia
Vibrionaceae, com a caracterstica de serem bacilos pequenos, retos ou
curvados

mveis.

As

espcies

V.

cholerae,

V.

vulnificus

V.

parahaemolyticus so patgenos importantes em alimentos. Vibrio cholerae

encontrado no trato gastrintestinal de humanos, na gua e, ocasionalmente, em
alimentos. Vibrio parahaemolyticus e V. vulnificus so encontrados na gua do
mar e em alimentos marinhos (FRANCO; LANDGRAF, 2004).
Inmeros mtodos laboratoriais podem ser utilizados para investigar a
ausncia ou presena de microrganismos, dentre eles destaca-se a tcnica do
Nmero Mais Provvel (NMP). Este permite estimar a densidade de
microrganismos viveis presentes em uma amostra sob anlise. Neste mtodo,
se utiliza tabelas de probabilidade estatstica na qual relaciona a frequncia de
resultados positivos em diluies decimais da amostra com o nmero de
microrganismos presentes (MAPA, 2003).

A tcnica do NMP bastante

verstil, permitindo a enumerao de diferentes grupos ou espcies de

microrganismos, variando-se o meio de cultura e as condies de incubao.
Suas principais aplicaes so a contagem de coliformes totais, coliformes
termotolerantes e E. coli em gua e alimentos (SILVA et al., 2007).

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Na anlise microbiolgica de alimentos, a obteno correta das amostras,
seu transporte para o laboratrio, sua preparao para anlise, o isolamento e
a identificao de microrganismos, so etapas importantes na qual depende a
garantia de um resultado preciso e confivel (CUNHA, 2006).
MATERIAL E MTODOS
O estgio foi desenvolvido no Laboratrio de Microbiologia de Alimentos e
Ambiental (LABMAA) do Ncleo de Estudos em Pesca e Aquicultura (NEPA) na
Universidade Federal do Recncavo da Bahia, durante o perodo de junho a
setembro de 2015.
Inicialmente, foi realizado o estudo das normas e procedimentos de
biossegurana, bem como a utilizao de equipamentos de proteo individual
(EPIs). Posteriormente, foi realizado um chek list dos equipamentos e vidrarias
utilizados no laboratrio, como por exemplo, autoclave, capela de fluxo laminar,
balana analtica e semi-analtica, incubadora do tipo B.O.D (Biochemical
Oxygen Demand), placas de Petri, tubos de ensaios, Erlenmeyer, pipetas,
alas bacteriolgicas, bico de Bunsen, tubos de Durham, entre outros, de modo
a entender o funcionamento e a utilizao de cada um. Alm da relao dos
principais microrganismos estudados pela equipe do laboratrio, para melhor
compreenso de sua importncia na rea de alimentos (tecnologia do pescado
e qualidade dos alimentos).
Para apreender o protocolo de colimetria foi feito o acompanhamento dos
trabalhos que estavam em andamento no laboratrio pelos discentes de
iniciao cientfica e mestrado. Assim, foi desenvolvida a quantificao do
grupo dos coliformes, o isolamento e a identificao de Escherichia coli em
amostras de ostras cultivadas e obtidas em bancos naturais na localidade de
Torrinhas, municpio de Cairu e Tapero, no Baixo Sul. Paralelo a isso foram
acompanhados a preparao e esterilizao dos materiais necessrios para a
execuo das anlises, bem como a realizao dos descartes dos materiais
contaminados.

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CRONOGRAMA DE ATIVIDADES DESENVOLVIDAS

Metas

Atividades

Aprender e conhecer as Estudo das normas e realizao

prticas
dirias
do dos
procedimentos
de
laboratrio.
biossegurana, como o uso de
EPI.
Chek list dos equipamentos
Reviso de Literatura

Perodo
(ms/ano)
Junho/2015

Aprender a utilizar meios Preparao dos meios de cultura

de cultura de acordo para anlise de amostras de
com a sua finalidade.
alimentos.

Junho/2015

Compreender
a Autoclavagem
de
vidraria,
importncia da utilizao utenslios e meios de cultura.
de
medidas
de
esterilizao

Julho/2015

Aprender
a
obter
crescimento microbiano
a partir de amostras de
alimento.
Apreender a estimar a
quantidade
de
coliformes presentes em
uma
amostra
de
alimento.

Diluio de amostras de ostras e

inoculao nos meios de cultura.

Julho/2015

Identificao dos tubos positivos

e determinao do NMP a partir
da Tabela de Hoskins.

Julho/2015

Aprender a isolar e Utilizao

da
tcnica
de
identificar
colnias esgotamento em estrias em
caractersticas de E. placas de Petri contendo meio de
coli.
cultura seletivo e identificao de
colnias caractersticas de E.
coli.

Agosto/2015

Aprender a tcnica de Efetuao da colorao de Gram

colorao de Gram e em cepas de E. coli.
sua
aplicao
para
identificar bactrias.

Agosto/2015

Colegiado de Engenharia de Pesca

Executar e interpretar os
resultados
das
transformaes
metablicas
ocorridas
no teste do IMViC
empregadas
para
identificao
de
bactrias.

Preparao
dos
meios
especficos para as provas
bioqumicas e inoculao com
culturas de E. coli.

Encerramento das
atividades

Reviso
de
Literatura
elaborao do relatrio final

Agosto/2015

Setembro/2015

RESULTADOS E DISCUSSO
No incio do estgio foi realizado um check list dos equipamentos
utilizados no laboratrio com suas respectivas funes e aplicaes, e tambm
o treinamento para os seus manuseios corretos e com segurana. Todos os
materiais para uso em anlises microbiolgicas so preparados de forma a
garantir que estes se encontrem totalmente limpos, estreis e isentos de
resduos qumicos e orgnicos no momento das anlises. As bancadas de
trabalho so limpas com lcool a 70% antes e depois do trabalho prtico.
Antes das anlises, as vidrarias e demais utenslios so embrulhados em
papel kraft, devidamente identificados e submetidos esterilizao em
autoclave a 121C por 30 minutos e os meios de cultura por 15 minutos. Aps
estril,

todo

material

deve

ser

devidamente

acondicionado.

autoclave esteriliza os materiais empregando vapor de gua sob presso,

permitindo

que

atinja

altas

temperaturas.

calor

mido

inativa

microrganismo por desnaturao das protenas das clulas microbianas

(TORTORA et al., 2012).

Realizada as anlises feito o descarte por 30

minutos em autoclave.
A estufa, por ao do calor seco, utilizada para esterilizao de vidraria
e secagem de material previamente embalado com papel kraft e levado a
170C por 1 hora. O calor seco elimina os microrganismos por oxidao
protica dos componentes celulares (TORTORA et al., 2012).

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Para preservao e incubao dos micro-organismos so utilizados
refrigeradores, freezers, B.O.D (Biochemical Oxygen Demand) e banho-maria.
Nestes as temperaturas so controladas de acordo com a espcie trabalhada.
Para a manipulao dos microrganismos, um importante equipamento no
laboratrio a cmara de fluxo laminar. Este remove as impurezas do ar por
meio de um filtro absoluto, criando uma rea de transferncia estril para a
manipulao de materiais biolgicos que no podem sofrer contaminao do
meio ambiente, garantindo a segurana da manipulao. Antes de iniciar os
trabalhos, feito a desinfeco com lcool 70% de toda a parte interna da
cmara de fluxo laminar e ligada a lmpada de luz ultravioleta (UV) por 15
minutos. A radiao UV causa leso celular, introduzindo modificaes ou
quebras no DNA, interferindo na replicao do DNA e a morte do organismo
exposto (TORTORA et al., 2012).
Para a transferncia de microrganismos e solues so utilizadas alas e
agulhas, pipetas de vidro e de Pasteur e micropipetas automticas. As alas e
agulhas so esterilizadas pela ao da chama do bico de Bunsen, onde so
flambadas antes e aps qualquer cultivo.
No acompanhamento de coletas de alimentos, foi observada a utilizao
de embalagens individuais estreis para acondicionamento das amostras e
encaminhadas ao laboratrio para as anlises. Recomenda-se que o transporte
seja feito em caixas de isopor com gelo, sendo indicado o uso de sachs de
gelo reutilizvel em gel ou, na indisponibilidade deste, gelo comum
acondicionado em bolsas plsticas, para evitar o acmulo de lquido nas caixas
(MIDURA; BRYANT, 2001 apud SILVA et al., 2007). No momento da anlise,
deve-se juntar o contedo dessas diversas embalagens em um nico frasco
estril, misturando-se bem e retirar a quantidade de material da mistura a ser
utilizada (SILVA et al., 2007).
Foi acompanhada no laboratrio a anlise de amostras de alimentos, de
acordo com a metodologia do Bacteriological Analytical Manual- BAM descrita
no manual de Manual de Mtodos de Anlise Microbiolgica de Alimentos e
gua (SILVA et al., 2010).

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Para a quantificao do grupo dos coliformes nas ostras, inicialmente, foi
pesada 25 g da amostra e homogeneizada em 225 mL de soluo salina 0,85%
correspondendo a diluio 101 e transferidas para diluies subsequentes de
102, 103, 104 utilizando tubos com 9 mL de soluo salina 0,85% (Figura 1). A
diluio tem como objetivo a obteno de menos densidade celular por unidade
de volume, de forma que, aps semeadura, pelo menos algumas clulas
fiquem isoladas originando colnias.

Figura 1. Esquema de diluio seriada.

O teste era realizado em trs etapas distintas: prova presuntiva, prova
confirmativa e prova bioqumica (Figura 2).
Na prova presuntiva 1 mL de cada diluio foi inoculada em uma srie de
cinco tubos contendo Caldo Lauril Sulfato Triptose (LST), com tubos de
Durham invertidos e incubados na BOD a 35C por 48h. Aps este perodo a
positividade do teste foi verificada pela turvao do meio com formao de gs
nos tubos de Durham produzido pela fermentao da lactose contida no meio.
Para a prova confirmativa, os tubos que apresentaram reao positiva na
prova presuntiva foram inoculados em Caldo Bile Verde Brilhante (VB) e Caldo
Escherichia coli (EC), contendo tubos de Durham invertidos e incubados em
BOD a 35C/48h e em banho-maria a 44,5C/24h, respectivamente. O caldo
VB um meio seletivo para coliformes totais, apresentando em sua
composio a lactose como fonte de carboidrato a ser fermentada, a bile
bovina e um corante derivado do trifenilmetano (verde brilhante), responsveis
pela inibio de microrganismos Gram positivos (MAPA, 2003). J o caldo EC
um meio seletivo para coliformes termotolerantes e apresenta em sua
composio alm da lactose, uma mistura de fosfatos que lhe confere um

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poder tamponante, impedindo a sua acidificao. A seletividade do meio se
deve presena de sais biliares, responsveis pela inibio de microrganismos
Gram positivos (MAPA, 2003). A prova considerada positiva quando os tubos
apresentam turvao do meio e produo de gs (Figura 3).
Figura 2. Fluxograma para identificao de coliformes totais e termotolerantes.

Figura 3. Tubos em duplicata contendo caldos LST, VB e EC, respectivamente.

Os tubos identificados com (A) so negativos, e os tubos (B) so positivos.
Fonte: Acervo prprio.

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A partir da combinao de tubos positivos de VB e de EC, foi possvel
determinar o

Nmero

Mais Provvel

(NMP)

de

coliformes totais e

termotolerantes presentes na amostra. O resultado expresso NMP/g para

uma sequncia de cinco tubos, consultando a Tabela de Hoskins da tcnica
dos tubos mltiplos, segundo a metodologia do Bacteriological Analytical
Manual- BAM descrito em Silva et al. (2010) (Figura 4).

Figura 4. Tabela de Hoskins, para o clculo do NMP em uma srie de trs

tubos. Fonte: FDA. Bacteriological Analytical Manual Online (2001).
Os tubos de EC positivos so suspeitos da presena de E. coli. Desta
forma, uma alada de cada tubo foi estriada em placa de Petri contendo o meio
seletivo Agar Eosina Azul de Metileno (EMB) e incubada a 35C por 24h. O azul
de metileno e a eosina tornam o meio levemente seletivo inibindo o
crescimento de algumas bactrias Gram positivas. Esses corantes servem

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como indicadores de diferenciao em resposta fermentao da lactose e/ou
sacarose, formando um precipitado de cor preto-prpura em pH baixo. As
colnias que apresentaram caractersticas de E. coli, isto , centro negro, com
ou sem brilho metlico esverdeado, foram isoladas em tubos de ensaio
contendo Agar Triptona Soja (TSA) inclinados e incubados a 35C por 24h
(Figura 5). A partir das culturas puras em agar TSA, foi feita a colorao de
Gram e inoculados nos meios testes para realizao das provas bioqumicas
de Indol, Vermelho de Metila (VM), Voges Proskauer (VP) e Citrato de
Simmons (IMViC).

Figura 5. Placa contendo colnias tpicas caractersticas de E. coli. Fonte:

American Society for Microbiology.
A colorao de Gram um mtodo que permite classificar as bactrias
em Gram positivas ou Gram negativas. Estas podem ser diferenciadas por
variaes na estrutura da parede celular, baseada nas diferenas de
permeabilidade destas membranas aos reagentes qumicos (VIEIRA, 2012).
Para efetuar o procedimento, inicialmente preparado um esfregao, na
qual uma pequena poro da cultura espalhada sobre uma lmina e fixada
pelo calor no Bico de Bunsen. Depois inicia-se a colorao, na qual a lmina
coberta com o corante roxo cristal violeta por cerca de um minuto, este penetra
a parede de ambos os tipos de clulas. O excesso removido, lavando a

Colegiado de Engenharia de Pesca

lmina em gua corrente e recoberto com soluo de lugol por um minuto. Este
funciona como mordente, fixando o corante na parede da clula.
Aps, o esfregao novamente lavado com gua corrente, e ento feita a
descolorizao com lcool absoluto at que no haja mais corante sendo
removido, durante 15 segundos. O lcool lavado, e a lmina corada com o
corante rosa safranina, durante um minuto e depois lavada com gua corrente.
A capacidade de reter ou no o corante pelas bactrias deve-se a
diferena na espessura da camada de peptideoglicano existente nas paredes
bacterianas. O cristal violeta e o lugol penetram tanto nas bactrias Gram
positivas quanto nas Gram negativas, formando um complexo de cor roxa. O
tratamento com lcool a etapa diferencial. Nas Gram positivas, o lcool no
retira o complexo cristal violeta-lugol, pois a sua ao desidratante faz com que
a espessa camada de peptideoglicano torne-se menos permevel, retendo o
corante. Nas Gram negativas, devido pequena espessura da camada de
peptideoglicano, o lcool rompe a camada externa de lipopolissacarideo e o
complexo corado extrado, deixando as clulas descoradas. O tratamento
com safranina no altera a cor roxa das Gram positivas, ao passo que as Gram
negativas descoradas pelo lcool tornam-se rosas (VIEIRA, 2012).
Aps a secagem natural, as lminas so analisadas microscopicamente
pela objetiva de imerso, podendo assim identificar as bactrias de acordo com
a sua morfologia celular e comportamento diante dos corantes. Escherichia coli
Gram negativa em forma de bastonete. Se durante a anlise no microscpio
for observado algumas clulas que no possuam tais caractersticas,
indicativo de que as cepas esto contaminadas e, portanto estas devem ser
purificadas antes de se efetuar as provas bioqumicas.
Depois de verificada a pureza das cepas, foi realizada as provas
bioqumicas (Figura 6). O teste do IMViC permite diferenciar os principais
grupos de Enterobacteriaceae atravs da verificao das transformaes
qumicas que ocorrem em substratos especficos pela efeito do metabolismo de
um dado microrganismo (VIEIRA, 2012).

Colegiado de Engenharia de Pesca

Figura

6.

Teste

do

IMViC. (A) Teste do Indol (B) Teste de Vermelho de Metila (C) Teste de Voges
Proskauer (D) Teste de Citrato de Simmons. Fonte: American Society for
Microbiology.
Para o teste do Indol, as culturas de E. coli foram inoculadas em tubos
contendo gar semi-slido SIM e incubadas a 35C/24h. O crescimento
deslocando-se da linha de inoculao indica motilidade. O meio rico em
triptofano permite verificar a capacidade da bactria em desaminar este
aminocido (VERISSIMO, 2006). A produo de indol, a partir de triptofano,
pde ser detectada adicionando cinco gotas do reagente de Kovacs na cultura,
que reagindo com o indol forma na superfcie do meio um anel vermelho (teste
positivo). Se o anel permanecer na cor amarelada do reagente o teste
negativo. As cepas de E. coli podem ser indol positivas ou negativas.
No teste de Vermelho de Metila (VM) foi transferido um inculo da cultura
de E. coli para tubos contendo caldo VM-VP e incubados a 35C/96h. Este
teste permitir verificar a formao de metabolitos cidos a partir da fermentao
da glicose (ou outros hidratos de carbono) pelas bactrias, abaixando o pH do
meio (VERISSIMO, 2006). Aps o perodo de incubao, a adio de cinco
gotas do indicador vermelho de metila permite detectar o abaixamento do pH,
observando se h o aparecimento de um anel vermelho (positivo) ou amarelo
(negativo). As cepas de E. coli so VM positivas.

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Para o teste Voges Proskauer (VP), cada cultura de E. coli foi inoculada
em tubos contendo caldo VM-VP e incubados a 35C/48h. Este teste permite
identificar bactrias que utilizam a fermentao butilenogliclica, tendo, a partir
da glicose, como produto intermedirio a acetona (acetil-metil-carbinol)
(VIEIRA, 2012). Aps o perodo de incubao, foi adicionada ao tubo 0,6 mL de
soluo de alfa-naftol 5% e agitado cuidadosamente. Em seguida, adicionou-se
0,2 mL de soluo de KOH 40% e deixado descansar por uma hora. A acetona
na presena de oxignio atmosfrico e de KOH a 40% convertida diacetila
(VIEIRA, 2012). O alfa-naftol acelera esta reao, produzindo um anel de cor
avermelhada ou rsea (teste positivo). A permanncia do meio na cor do
reagente (amarela ou ligeiramente esverdeada) indica teste negativo. As cepas
de E. coli so VP negativas.
Para o teste de Citrato de Simmons foram inoculadas culturas de E. coli
em tubos de ensaio contendo gar Citrato de Simmons inclinado, e incubados
a 35C/96h. Este teste permite determinar a capacidade das bactrias em
utilizar citrato como nica fonte de carbono. O meio contm citrato de sdio e o
microrganismo ao utilizar o citrato, alcaliniza o meio de cultura, devido
formao de carbonato de sdio (VIEIRA, 2012). O pH bsico faz o meio ficar
azul, devido ao indicador azul de bromotimol (teste positivo). A permanncia da
cor verde do meio indica teste negativo. As cepas de E. coli so citrato
negativas.
Aps as provas bioqumicas, as culturas de E. coli so criopreservadas.
As culturas so inoculadas em placas de Petri contendo agar TSA e incubadas
a 35C por 24h. Posteriormente, um disco (um pedao do meio contendo o
crescimento microbiano) inserido em tubos de Eppendorf e preenchido com
glicerol a 20% at cobrir o disco. Os tubos so vedados com plstico aderente
tipo parafilm e armazenados no freezer a -80C. A baixa temperatura reduz
substancialmente as reaes qumicas no interior da cultura e o glicerol
bioquimicamente compatvel com as estruturas celulares e, portanto,
frequentemente usado para preservao. Desta forma as clulas podem ser

Colegiado de Engenharia de Pesca

preservadas por um longo perodo e recuperar suas funes normais quando
forem devidamente descongeladas (ABREU; TUTUNJI, 2004).
CONCLUSO
O estgio proporcionou um aprimoramento dos meus conhecimentos
sobre a rea microbiolgica, sobretudo das tcnicas que avaliam a
contaminao em alimentos.
Foi possvel acompanhar a rotina do laboratrio de microbiologia e
aprender tcnicas e procedimentos, tais como o preparo de materiais e meios
de cultura; coleta e anlise de amostras; quantificao da carga microbiana em
alimentos usando o mtodo do Nmero Mais Provvel (NMP), identificao,
isolamento e conservao de cepas de Escherichia coli. Alm de efetuar o
controle de qualidade das atividades, desinfeco, lavagem de vidrarias e
processos de esterilizao, tudo isso aliado as normas de biossegurana.
CONSIDERAES FINAIS
O estgio foi essencial para minha formao, servindo como uma
experincia positiva para a determinao dos meus objetivos e futuros
projetos. Com ele foi despertado um interesse nas reas de microbiologia e
tecnologia do pescado.
DIFICULDADES ENCONTRADAS
No houve grandes dificuldades durante o treinamento, contudo vlido
ressaltar que a microbiologia requer muita responsabilidade e abdicaes.
AGRADECIMENTOS
Gostaria de agradecer a minha orientadora Prof. Norma Suely
Evangelista-Barreto, por ter me proporcionado a oportunidade de estagiar em
seu laboratrio e ter fornecido suporte e acompanhamento nas atividades
desenvolvidas, ao professor Thiago Alves Santos de Oliveira por auxiliar e

Colegiado de Engenharia de Pesca

prestar apoio e a todos os colegas do laboratrio que foram bastante receptivos
e sempre disponveis a ajudar.
REFERNCIAS
ABREU, M. M. V. de; TUTUNJI, V. L. Implantao e manuteno da coleo de
culturas de microorganismos do UniCEUB. Universitas Cincias da Sade,
vol.02, n.02, p. 236-251, 2004.
ASM.

American

Society

for

Microbiology.

Disponvel

em:

<http://www.microbelibrary.org/>. Acesso em 11 de fevereiro, 2016.

CORRA, J. G. de F. A importncia da higiene de manipuladores para a
qualidade dos alimentos. Monografia de Concluso de Especializao Latu
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