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As autoras deste livro e a EDITORA GUANABARA KOOGAN LTDA.

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conta a evoluo das cincias da sade, as mudanas regulamentares governamentais e o
constante fluxo de novas informaes sobre teraputica medicamentosa e reaes adversas a
frmacos, recomendamos enfaticamente que os leitores consultem sempre outras fontes
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Ficha catalogrfica

S233v
3.ed.
Santos, Norma Suely de O. (Norma Suely de Oliveira), 1964Virologia humana/Norma Suely de Oliveira Santos, Maria Teresa Villela Romanos, Marcia
Dutra Wigg. 3. ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2015.
il.
ISBN 978-85-277-2736-5
1. Virologia. I. Romanos, Maria Teresa V. (Maria Teresa Villela), 1959-. II. Wigg, Marcia
Dutra. III. Ttulo.
15-19781

CDD: 616
CDU: 578.7

Colaboradores

Carolina Gonalves de Oliveira Lucas, M.Sc.


Mestre em Cincias Biolgicas (Microbiologia)
Departamento de Virologia
Universidade Federal do Rio de Janeiro
Caroline Cordeiro Soares, D.Sc.
Assistente de Pesquisa
Departamento de Virologia
Fundao Oswaldo Cruz do Rio de Janeiro
Christian Maurice Gabriel Niel, D.Sc.
Pesquisador Titular
Departamento de Virologia
Fundao Oswaldo Cruz do Rio de Janeiro
Davis Fernandes Ferreira, D.Sc.
Professor Associado
Departamento de Virologia
Universidade Federal do Rio de Janeiro
Fernando Portela Cmara, D.Sc.
Professor Associado
Departamento de Virologia
Universidade Federal do Rio de Janeiro
Flvio Guimares da Fonseca, D.Sc.
Professor Adjunto
Universidade Federal de Minas Gerais
Francisco Campello do Amaral Mello, D.Sc.

Assistente de Pesquisa
Departamento de Virologia
Fundao Oswaldo Cruz do Rio de Janeiro
Gabriella da Silva Mendes, D.Sc.
Doutora em Cincias (Microbiologia)
Departamento de Virologia
Universidade Federal do Rio de Janeiro
Giselle Priscila dos Anjos Pena, M.Sc.
Mestre em Cincias Biolgicas (Microbiologia)
Departamento de Virologia
Universidade Federal do Rio de Janeiro
Jssica Figueiredo Cavalcanti, M.Sc.
Mestre em Cincias Biolgicas (Microbiologia)
Departamento de Virologia
Universidade Federal do Rio de Janeiro
Jorge Luiz dos Santos Gonalves, D.Sc.
Doutor em Cincias (Microbiologia)
Departamento de Imunologia
Universidade Federal do Rio de Janeiro
Jos Nelson dos Santos Silva Couceiro, D.Sc.
Professor Associado
Departamento de Virologia
Universidade Federal do Rio de Janeiro
Luciana Barros de Arruda, D.Sc.
Professora Adjunta
Departamento de Virologia
Universidade Federal do Rio de Janeiro
Luciana Jesus da Costa, D.Sc.
Professora Adjunta
Departamento de Virologia

Universidade Federal do Rio de Janeiro


Luz Alba Maria Garcete Fornells Arentz, D.Sc.
Doutora em Qumica Biolgica
Departamento de Virologia
Universidade Federal do Rio de Janeiro
Luiz Max Fagundes de Carvalho, B.Sc.
Microbiologista
Departamento de Virologia
Universidade Federal do Rio de Janeiro
Luiza Montenegro Mendona, M.Sc.
Mestre em Cincias Biolgicas (Microbiologia)
Departamento de Virologia
Universidade Federal do Rio de Janeiro
Maria Genoveva von Hubinger, D.Sc. (in memoriam)
Professora Adjunta
Departamento de Virologia
Universidade Federal do Rio de Janeiro
Raquel Cirlene da Silva, D.Sc.
Doutora em Cincias (Microbiologia)
Departamento de Virologia
Universidade Federal do Rio de Janeiro
Selma de Andrade Gomes, D.Sc.
Pesquisadora Titular
Departamento de Virologia
Fundao Oswaldo Cruz do Rio de Janeiro
Tatiana Ferreira Robaina, D.Sc.
Ps-doutora
Departamento de Virologia
Fundao Oswaldo Cruz do Mato Grosso do Sul

Prlogo

A ideia deste livro emergiu a partir de nossas longas conversas no Departamento de Virologia
(DV) do Instituto de Microbiologia Paulo de Ges (IMPPG) da Universidade Federal do Rio de
Janeiro (UFRJ), onde constantemente discutamos nossa frustrao (compartilhada por nossos
alunos) com relao carncia de material didtico, em portugus, na rea especfica da Virologia.
Decidimos ento, que poderamos tentar amenizar esse problema produzindo uma apostila para ser
utilizada pelos estudantes de graduao do IMPPG. No era nossa pretenso escrever um livro,
mas somente um material de apoio para nossos alunos. Para nossa surpresa os alunos passaram a ver
a apostila como uma ferramenta valiosa para seus estudos, a ponto da nossa modesta produo
amadora no atender demanda. Veio ento a incrvel sugesto de nosso caro amigo, o livreiro
Nilson Sadek: por que no transformar a apostila em um livro? Da nasceu a primeira edio da obra
Introduo Virologia Humana. O livro, lanado em 2002, contou com a colaborao de nossos
colegas Professores e Pesquisadores do DV/IMPPG. Mais uma vez fomos surpreendidas pelo
entusiasmo com que a obra foi recebida. Animou-nos particularmente a opinio unnime de
Estudantes e Professores de que o material foi produzido de forma didtica sendo assim de fcil
assimilao. Para ns, isso um ponto fundamental, afinal, somos Professoras e esta obra reflete
tambm nossas experincias em sala de aula, alm do conhecimento cientfico. Os comentrios
positivos e entusisticos recebidos nos motivaram a continuar o trabalho. Uma segunda edio,
revisada e ampliada, foi lanada em 2008, consolidando este trabalho como um instrumento didtico
profcuo.
Agora, depois de mais de quatro mil exemplares vendidos ao longo destes treze anos desde a
primeira edio, estamos lanando a terceira edio da obra. Muito tempo se passou, muita coisa
mudou na cincia e na vida. Alguns partiram para sempre, outros partiram para uma nova carreira
profissional, outros se juntaram a ns. Considerando a riqueza e o aprofundamento dos temas
apresentados, atrevemo-nos a mudar o ttulo da obra para Virologia Humana por entender que o
termo Introduo j no fazia jus ao seu contedo. Esta nova edio traz no apenas reviso e
atualizao dos temas abordados nas verses anteriores, como tambm novos temas. Foi includo um
captulo de Introduo Virologia (Captulo 1), no qual apresentada uma reviso da histria da
criao da apaixonante cincia da Virologia. Novos vrus respiratrios emergentes como o
coronavrus MERS, os vrus da influenza H1N1 e H7N9, e os poliomavrus KIPyV e WUPyV; vrus
entricos como salivrus, cosavrus e vrus Saffold foram includos nos respectivos captulos. O

Captulo 14, Viroses Respiratrias, traz ainda uma abordagem sobre o papel dos vrus nos quadros
de exacerbao da asma. Novas descobertas sobre os poliomavrus humanos foram apresentadas nos
Captulos 15 (Viroses Multissistmicas), 17 (Viroses do Sistema Nervoso Central) e 20
(Viroses Oncognicas). O papel da metagenmica na descoberta de novos vrus foi abordado no
Captulo 8 (Diagnstico Laboratorial das Viroses). As novas teorias sobre origem e evoluo dos
vrus podem ser consultadas no Captulo 2.
Indiscutivelmente, nada disto seria possvel sem o esforo e a dedicao dos nossos
Colaboradores, que, durante meses, no pouparam esforos para que o resultado final desta obra
pudesse atender s expectativas de todos. queles que de alguma forma contriburam para a
realizao deste empreendimento, os nossos mais sinceros agradecimentos. Destacamos ainda a
contribuio da Profa Maria Evangelina Ferreira Fonseca e do tcnico em microscopia Vencio Feo
pela cesso de algumas imagens de microscopia eletrnica.
Desejamos expressar tambm nossos agradecimentos a todos os colegas do IMPPG/UFRJ que
sempre acreditaram nesta iniciativa, dando-nos seu apoio e incentivo.
Finalmente, gostaramos de dedicar esta obra aos nossos alunos, razo maior deste trabalho.
Durante a fase de edio do livro, fomos surpreendidas pela triste notcia de que a Profa Maria
Genoveva von Hubinger havia nos deixado (*1935- 2013). Nessa obra, prestamos nossa homenagem
incansvel docente e pesquisadora, sempre empenhada em disseminar o conhecimento da
Virologia. Era notvel o seu entusiasmo, tanto nos cursos de graduao, quanto nos de psgraduao, tendo sido coordenadora, por muitos anos, do Curso de Especializao em Virologia
(CEV). A Profa Maria Genoveva fez parte da Histria da Virologia no pas, participando ativamente
da implantao de cursos e na formao acadmica de muitos Virologistas brasileiros, e ser sempre
lembrada por sua dedicao ao ensino da Virologia. Tambm no ser esquecida pelo legado
deixado nas pesquisas com poliovrus e parvovrus.
Norma Suely de Oliveira Santos
Maria Teresa Villela Romanos
Marcia Dutra Wigg

Prefcio Terceira Edio

A constante evoluo das pesquisas na rea da sade, especialmente com a utilizao de


ferramentas modernas da biologia molecular e da microscopia, bem como os avanos nas tcnicas de
cultivo de clulas e tcnicas de diagnstico laboratorial refletem no desenvolvimento da Virologia
como uma das reas mais importantes da biologia e da sade humana.
H mais de um sculo, os vrus tm despertado debates apaixonados com questes, muitas vezes
quase filosficas, sobre o que vida. Alm disso, os vrus so de grande importncia para a sade
humana e, na verdade, pesquisas recentes apontam para o que pode ser considerado um paradoxo:
eles podem causar doenas e at levar morte, mas tambm podem ser fundamentais para o
funcionamento das cadeias biolgicas de nosso planeta, incluindo, em ltima anlise, a prpria
sobrevivncia do homem na Terra.
Para fazer frente a todos esses avanos necessrio tambm no perder de vista a qualidade da
formao do profissional das reas Biomdicas e de Cincias Biolgicas e, ainda, de profissionais
envolvidos com a Virologia.
Este livro, escrito por Professoras/Pesquisadoras com profundo conhecimento e reconhecida
projeo nacional e internacional, mostra ao leitor os diversos aspectos da Virologia Humana.
Na ocasio do lanamento dessa nova edio, a direo do Instituto de Microbiologia Paulo de
Ges parabeniza as autoras dessa obra importante para alunos, Professores e Pesquisadores,
reconhecendo-a como uma consequncia do esforo e da dedicao ao longo de vrios anos.
Alexandre Soares Rosado, D.Sc.
Professor Associado e ex-Diretor
Instituto de Microbiologia Paulo de Ges
Universidade Federal do Rio de Janeiro

Prefcio Segunda Edio

Prefaciar um livro uma tarefa extremamente agradvel para mim como Professora. Porm, no
caso desta obra, em particular, meu prazer torna-se honra pelo fato de as Doutoras Norma Suely de
Oliveira Santos e Maria Teresa Villela Romanos serem Professoras do Instituto de Microbiologia
Paulo de Ges, da Universidade Federal do Rio de Janeiro, do qual atualmente estou como Diretora.
Do mesmo modo, a Doutora Marcia Dutra Wigg tambm pertenceu, durante anos, ao nosso corpo
docente, com o qual continua ativamente colaborando por meio de projetos de pesquisa.
Este trabalho generalista, visando atender s expectativas dos alunos dos mais diversos cursos
das reas Mdicas e de Cincias Biolgicas e, ainda, de profissionais da Virologia, coroado pela
vasta experincia e atuao dessas doutoras na rea.
Nas ltimas dcadas essa especialidade experimentou um desenvolvimento excepcional devido,
principalmente, aos avanos nos conhecimentos e nas tcnicas moleculares. Alm disso, a Virologia
uma das reas das Cincias Biolgicas que mais tem atrado novos profissionais e pesquisadores.
Este renovado interesse se deu pela emergncia de novas viroses, incluindo o HIV/a AIDS, e ainda
pela reemergncia de outras antigas, haja vista a epidemia de Dengue no Brasil, inclusive em sua
forma hemorrgica.
Ao nos referirmos a essa especialidade to diversa e extensa, no podemos deixar de destacar o
papel do Instituto de Microbiologia Paulo de Ges no desenvolvimento da Virologia em nosso pas,
exercendo um efeito multiplicador por demais importante nesta rea.
Estas trs Professoras/Pesquisadoras foram sensveis s dificuldades de nossos Estudantes, pois
apesar de existirem bons livros abordando importantes temas da Virologia, estes foram escritos em
outras lnguas e, desta forma, sob realidades epidemiolgicas frequentemente diversas. Alm disso, o
custo elevado de tais publicaes as torna inacessveis a vrios de nossos Estudantes.
Esta segunda edio do livro Introduo Virologia Humana foi atualizada, ampliada e
totalmente ilustrada com figuras e grficos coloridos. Uma anlise mais atenta de seu contedo
evidencia o cuidado, a competncia e a dedicao com que gentilmente essas Professoras
compartilham seus conhecimentos com os leitores.
As autoras conseguiram reunir assuntos bastante atuais em seus 19 captulos, os quais abrangem
temas bsicos como as estruturas e as propriedades virais, a patognese das infeces virais, a
resposta do hospedeiro s viroses e outros mais especficos, incluindo as viroses multissistmicas,
respiratrias e oncognicas.

Para mim , portanto, uma grande satisfao estar assinando o prefcio de um livro que
possibilitar aos alunos e profissionais da Virologia a leitura de uma obra repleta de informaes,
atualizada e escrita na lngua portuguesa. Esto de parabns as autoras por esta importante
contribuio ao ensino da Virologia.
Agnes Marie S Figueiredo, D.Sc.
Professora Titular e ex-Diretora
Instituto de Microbiologia Paulo de Ges
Universidade Federal do Rio de Janeiro

Prefcio Primeira Edio

Em comparao com outras reas da Microbiologia, o estudo dos vrus tem sido menos difundido
nas Universidades Brasileiras, sendo poucas as instituies que possuem Professores com formao
especfica em Virologia. Com o recente avano da Biologia Molecular, a estrutura e a propriedade
dos vrus tm sido determinadas com maior preciso, levando, consequentemente, a um melhor
conhecimento da patogenia e da epidemiologia das infeces virais. Alm disso, nos ltimos anos, a
nomenclatura e a classificao dos vrus tm sofrido diversas modificaes, difceis de serem
acompanhadas por profissionais no especialistas que atuam no ensino da Microbiologia.
Esta obra, escrita por Professores que se dedicam ao ensino e pesquisa em Virologia, aborda,
de forma sucinta e objetiva, os diversos aspectos da estrutura e das propriedades virais, a patogenia,
o diagnstico, a epidemiologia e o tratamento das infeces provocadas pelos principais vrus
humanos, incluindo tanto aqueles associados a patologias clssicas quanto alguns atualmente
considerados como emergentes.
Acreditamos que esta obra trar uma importante contribuio ao ensino da Virologia nas diversas
carreiras da rea da sade, servindo como uma fonte de reviso e atualizao para os profissionais
que atuam nessa rea.
Jos Mauro Peralta, D.Sc.
Professor Titular e ex-Diretor
Instituto de Microbiologia Paulo de Ges
Universidade Federal do Rio de Janeiro

Sumrio

PARTE 1

Virologia Geral

Introduo Virologia
Histria da Virologia
Bibliografia

Origem, Evoluo e Emergncia dos Vrus


Origem dos vrus
Evoluo das populaes virais
Emergncia de vrus e viroses
Bibliografia

Propriedades Gerais dos Vrus


Fundamentos da Virologia
Classificao internacional dos vrus
Taxonomia dos vrus
Infeces subvirais
Bibliografia

Estratgias de Replicao dos Vrus


Introduo
Organizao dos genomas virais
Estratgias de replicao e expresso dos vrus contendo genoma de DNA
Estratgias de replicao e expresso dos vrus contendo genoma de RNA
Estratgias virais de interferncia com a sntese proteica celular
Bibliografia

Bases Fsicas e Geomtricas da Arquitetura do Capsdeo Viral


Conceito e propriedades elementares dos vrus

Elementos da organizao viral


Arquitetura do capsdeo viral | Lei geral da organizao baseada em protenas
Princpio da economia gentica e correo automtica de erros
Princpio do arranjo por eixos de simetria rotacional
Simetria helicoidal
Simetria cbica
Bibliografia
6

Patognese das Infeces Virais


Introduo
Transmisso dos vrus na natureza
Estabelecimento da infeco
Rotas de entrada dos vrus no organismo
Tropismo
Mecanismos de disseminao dos vrus pelo organismo
Danos teciduais induzidos por vrus
Determinantes genticos de virulncia viral
Evaso das defesas do hospedeiro
Padres de infeco
Perodos de infeco
Excreo do vrus pelo organismo
Bibliografia

Resposta do Hospedeiro s Viroses


Introduo
Mecanismos de resposta inespecfica
Papel da imunidade inata no controle das infeces virais
Papel da resposta imunolgica humoral nas infeces virais
Papel da resposta imunolgica celular nas infeces virais
Mecanismos de escape do sistema imunolgico
Vacinas antivirais
Bibliografia

Diagnstico Laboratorial das Viroses


Introduo

Histria do diagnstico virolgico


Espcimes clnicos para o diagnstico virolgico
Significado da deteco de vrus
Mtodos utilizados no diagnstico virolgico
Isolamento e identificao de vrus
Diagnstico sorolgico das infeces virais
Diagnstico molecular das infeces virais
Metagenmica e descobrimento de novos vrus
Bibliografia
9

10

Antivirais
Introduo
Breve reviso sobre a sntese de cidos nucleicos
Stios de atuao de um antiviral
Etapas de desenvolvimento de um antiviral
Drogas antivirais disponveis para uso clnico
Consideraes sobre a terapia antirretroviral no Brasil
Associao de drogas anti-HIV-1
Perspectivas de novos antivirais
Bibliografia
Dinmica das Infeces Virais
Introduo
Invaso e persistncia de patgenos infecciosos | Teoria do Limiar Epidmico
Coevoluo e virulncia
Dinmica da diversidade genotpica
Bibliografia

PARTE 2
11

Virologia Clnica

Viroses Entricas
Introduo
Diarreia infantil
Rotavrus e Adenovrus
Calicivrus e Astrovrus

Vrus entricos emergentes


Bibliografia
12

Viroses Dermotrpicas
Introduo
Herpesvrus de origem humana
Vrus herpes simplex 1 e 2
Vrus da varicela-zoster
Molusco contagioso
Bibliografia

13

Viroses Congnitas
Introduo
Vrus da rubola
Citomegalovrus humano
Parvovrus B19
Bibliografia

14

Viroses Respiratrias
Introduo
Vrus da influenza, Vrus da parainfluenza, Rinovrus, Reovrus e Adenovrus
Vrus respiratrio sincicial humano, Metapneumovrus humano, Coronavrus humano,
Bocavrus humano e poliomavrus humano
O papel dos vrus na exacerbao da asma
Bibliografia

15

Viroses Multissistmicas
Vrus do sarampo e Vrus da caxumba
Vrus chikungunya
Poliomavrus humanos
Herpesvrus humanos 6 e 7
Bibliografia

16

Hepatites Virais
Introduo

Vrus de hepatite de transmisso entrica


Vrus de hepatite de transmisso sangunea e sexual
Bibliografia
17

Viroses do Sistema Nervoso Central


Introduo
Vrus da raiva
Enterovrus
Henipavrus
Vrus do Oeste do Nilo
Vrus da encefalite japonesa
Vrus Chandipura
Poliomavrus
Bibliografia

18

Febre Amarela e Dengue


Introduo
Histrico
Classificao e caractersticas
Biossntese viral
Patognese
Manifestaes clnicas
Diagnstico laboratorial
Epidemiologia
Preveno, controle e tratamento
Bibliografia

19

Sndrome da Imunodeficincia Adquirida/AIDS


Histrico
Classificao e variabilidade gentica
Morfologia e caractersticas
Organizao genmica do HIV e SIV
Biossntese viral
Patognese da infeco pelo HIV
Histria natural da infeco pelo HIV

Resposta imunolgica
Diagnstico laboratorial
Epidemiologia das infeces por HIV e da AIDS
Preveno e controle
Tratamento da infeco por HIV-1
Bibliografia
20

Viroses Oncognicas
Introduo
Vrus oncognicos
Vrus linfotrpicos para clulas T de humanos
Vrus do papiloma humano
Herpesvrus humano 8
Vrus Epstein-Barr
Poliomavrus de clulas de Merkel
Bibliografia

21

Febres Hemorrgicas Virais


Introduo
Classificao e caractersticas
Caractersticas clnicas
Tratamento
Febres hemorrgicas por hantavrus
Febres hemorrgicas causadas por outros membros da famlia Bunyaviridae
Febres hemorrgicas causadas por flavivrus
Febres hemorrgicas por arenavrus
Febres hemorrgicas causadas pelos Ebolavrus e Marburgvrus
Bibliografia

22

Viroses Oculares
Introduo
Conjuntivite
Ceratite
Esclerite e epiesclerite
Uvete

Retinite
Sndrome da necrose aguda da retina
Doena adnexal
Vrus associados a doena ocular congnita
HIV e doenas oculares
Doenas oculares associadas a viroses sistmicas
Bibliografia

PARTE 1
Virologia Geral
1

Introduo Virologia

Origem, Evoluo e Emergncia dos Vrus

Propriedades Gerais dos Vrus

Estratgias de Replicao dos Vrus

Bases Fsicas e Geomtricas da Arquitetura do Capsdeo Viral

Patognese das Infeces Virais

Resposta do Hospedeiro s Viroses

Diagnstico Laboratorial das Viroses

Antivirais

10

Dinmica das Infeces Virais

Histria da Virologia
Surtos abruptos, muitas vezes de propores epidmicas, marcaram o incio da histria das
doenas infecciosas. Os avanos cientficos no final do sculo XIX e incio do sculo XX resultaram
no sucesso da preveno e do controle de muitas doenas infecciosas, particularmente nas naes
industrializadas. Apesar dessa melhoria na sade, surtos de doenas infecciosas continuam a ocorrer
e novas enfermidades surgem.
De acordo com a Organizao Mundial da Sade (OMS), dentre as doenas infecciosas que
afligem o ser humano, cerca de 60% so de etiologia viral. A dimenso desse problema tem sido
exaustivamente discutida no meio cientfico e foi brilhantemente sintetizada pelo mdico e bilogo
molecular americano Joshua Ledeberg, laureado com o Prmio Nobel de Fisiologia ou Medicina em
1958, que disse:
Os nicos reais competidores da humanidade pelo domnio do planeta so os vrus, os quais podem servir como parasitas e
elementos genticos nos seus hospedeiros. Os vrus no s apresentam uma plasticidade gentica que os capacita a evoluir em
novas direes, como tambm mostram a capacidade de interao gentica e metablica com as clulas infectadas, que os
coloca em posio de mediar alteraes evolucionrias cumulativas nas clulas hospedeiras. Contudo, o efeito das infeces
virais no sempre sutil; os vrus podem tambm dizimar uma populao.

Pr-histria | Primeiros indcios da existncia dos vrus


As evidncias sobre as infeces virais surgiram desde os primeiros registros de atividades
humanas, sendo empregados vrios mtodos para combat-las, mesmo antes do conhecimento da
existncia da partcula viral como agente etiolgico de doenas. possvel afirmar que a Virologia
desempenha um importante papel na histria da evoluo humana devido ao carter predatrio dos
vrus, o que contribui para a seleo natural das espcies. As implicaes mdicas das infeces
virais demandaram esforos extraordinrios por parte dos pesquisadores, culminando com o
desenvolvimento da Biologia Molecular, erradicao de vrias doenas e elucidao dos processos
celulares, vitais para o funcionamento do organismo vivo.
Desde que os primeiros seres humanos deixaram de ser nmades, domesticando animais e

invadindo terras, os variados contatos intra e interespcies tornaram-se mais frequentes,


possibilitando que diversos tipos de patgenos, dentre eles os vrus, fossem transmitidos e mantidos
nas populaes. Nesse tempo, os vrus extremamente virulentos, como os vrus do sarampo e da
varola, responsveis por epidemias que dizimavam rapidamente as comunidades no imunes,
provavelmente no seriam capazes de permanecer infecciosos por um longo perodo. Nesse caso,
somente quando a densidade demogrfica tornou-se mais consistente, esses vrus foram capazes de
subsistir. Consequentemente, os vrus que apresentavam uma relao mais benigna e que puderam
manter um contato mais intenso com o hospedeiro foram os primeiros a se adaptar no incio da
civilizao, tais como os vrus do papiloma, os herpesvrus e os retrovrus.
As doenas virais comearam a ser registradas nas civilizaes egpcias e greco-romanas. Na
Mesopotmia, no ano 1000 a.C., j existiam leis que descreviam a responsabilidade dos donos de
animais domsticos e suas consequentes obrigaes, caso esses animais ficassem raivosos. As leis
estabeleciam, para os donos displicentes, pesadas multas ou at mesmo morte. O poeta grego
Homero, no sculo XX a.C., em sua obra Ilada, descreve a personalidade raivosa do personagem
Heitor e o cuidado necessrio em lidar com ele, referindo-se conduta dos donos de animais
daquela poca. Esses fatos demonstram o conhecimento da natureza contagiosa das doenas e o medo
do contato com animais doentes para a sua propagao.
Foi encontrada uma tbua com origem na civilizao egpcia, datada do sculo XIV a.C., que
mostra o desenho de um cidado com deformidade anatmica semelhante quela causada pelo vrus
da poliomielite, e a mmia do fara Ramss V, falecido no sculo XII a.C., apresentando sequelas de
varola na face, alm de hierglifos relatando sua morte em virtude dessa doena. Outras doenas
virais, conhecidas desde os tempos remotos, so a caxumba, a influenza e a febre amarela, esta
ltima descrita desde a descoberta da frica pelos europeus. possvel que o vrus da febre amarela
(que provoca febre elevada e delrios, podendo levar morte) tenha sido o responsvel por dizimar
as tripulaes dos grandes barcos comerciais, sendo provavelmente o verdadeiro responsvel pela
lenda do navio fantasma O Holands Voador, que, naquela poca, assustava as tripulaes dos navios
em alto-mar.
Os seres humanos no foram apenas acometidos por doenas virais durante a maior parte da sua
histria, eles tambm manipularam esses agentes, ainda que no soubessem disso. Um exemplo
clssico o cultivo de tulipas com diferentes padres, as quais eram extremamente valiosas na
Holanda do sculo XVII. Esse cultivo inclua a disseminao deliberada de um vrus (vrus do
mosaico da tulipa) que, agora se sabe, causa o padro listrado nas ptalas das tulipas to cobiadas
naquela poca.
Os esforos para controlar as doenas virais tm uma histria ainda mais impressionante.
provvel que a varola j fosse endmica na sia e Europa no sculo V e tenha tido um papel
importante na histria humana. Os colonizadores do Velho Mundo, no sculo XV, disseminaram o
vrus da varola entre os povos das Amricas Central e do Sul, o que provocou uma epidemia letal,

considerada um fator importante nas conquistas realizadas por um pequeno nmero de soldados
europeus. A primeira medida de controle utilizada contra essa doena foi a variolao, que consistia
na inoculao de material coletado de pstulas de varola em uma escarificao realizada no brao
de indivduos saudveis. No sculo XI, a prtica era comum na China e ndia e baseava-se no fato de
que os sobreviventes da varola eram protegidos contra infeces subsequentes (boxe Histria da
varola). Este procedimento foi introduzida na Inglaterra em 1721 por Lady Mary Montague, esposa
do embaixador britnico no Imprio Otomano. Em 1776, George Washington introduziu a variolao
entre soldados do exrcito americano. As consequncias da variolao eram imprevisveis e podiam
levar a bito 1 a 2% dos indivduos submetidos ao procedimento, porm os riscos eram aceitveis
no sculo XVIII quando 1 em cada 10 pessoas (10%) morria de varola.
Edward Jenner, mdico ingls, observou que ordenhadores que eram expostos a cowpox (varola
de bovinos, branda em humanos) passavam a ser protegidos contra a varola humana. Ele demonstrou
que a inoculao de um garoto com extrato de leses de cowpox induzia apenas leses brandas e o
protegia contra a varola humana. Desses experimentos com cowpox, surgiu o termo vacinao
(vacca = vaca em latim).

Desenvolvimento do conceito de vrus


Na segunda metade do sculo XIX, j era conhecida a existncia de bactrias, fungos e
protozorios, e a comunidade cientfica debatia a questo da origem desses microrganismos. Alguns
acreditavam que os microrganismos surgiam espontaneamente (p. ex., em virtude de matria em
decomposio); outros acreditavam que os microrganismos eram gerados por reproduo, a exemplo
do que ocorre com os organismos macroscpicos. A teoria da gerao espontnea foi desconsiderada
quando o mdico francs Louis Pasteur demonstrou que o meio de cultura esterilizado permanecia
livre de microrganismos enquanto fosse mantido em um recipiente especial com pescoo longo e
curvo, projetado para impedir a entrada de ar contendo micrbios.
Em 1840, o mdico alemo Jacob Henle sugeriu a hiptese da existncia de agentes infecciosos
capazes de causar doenas, mas muito pequenos para serem observados ao microscpio ptico. Na
ausncia de evidncias diretas desses agentes, suas ideias no foram aceitas.
Na segunda metade do sculo XIX, trs importantes avanos da Microbiologia levaram
aceitao da teoria dos germes como causadores de doena. O primeiro foi protagonizado por
Louis Pasteur, em 1867, que estudou o fenmeno da fermentao e demonstrou que diferentes tipos de
microrganismos estavam associados a diferentes tipos de processos, tais como a produo de lcool,
cido lctico ou cido actico. Essa ideia foi fundamental para a concepo das teorias sobre o
desenvolvimento das doenas.
No segundo evento, Joseph Lister, cirurgio ingls, admirador do trabalho de Pasteur, teorizou
que as infeces de feridas abertas eram causadas por microrganismos presentes no ambiente. Lister

introduziu as tcnicas asspticas, tendo realizado a primeira cirurgia nesse contexto e demonstrado a
importncia da antissepsia para reduzir as infeces durante cirurgias; alm disso, ainda contribuiu
para o estabelecimento da tcnica de diluio para obter culturas puras de bactrias.
O terceiro evento foi protagonizado por Robert Koch, mdico alemo e estudante de Jacob
Henle. Koch desenvolveu a metodologia de isolamento de colnias bacterianas em meio slido e
demonstrou que o bacilo antraz (Bacillus anthracis) era o causador do carbnculo (ou antraz) em
bovinos. Ele usou essa metodologia para estabelecer culturas puras de uma nica espcie de bactria
a partir de material de uma vaca infectada. Posteriormente, injetou uma amostra da cultura pura em
animais saudveis, os quais desenvolveram a doena; finalmente, isolou a mesma bactria a partir
dos animais inoculados. Koch tambm demonstrou que um bacilo era o causador da tuberculose em
humanos.
Embora vrios cientistas tenham contribudo para os conceitos anteriormente mencionados, foram
basicamente os estudos de Pasteur, Lister e Koch que criaram uma nova abordagem experimental
para a cincia mdica e deram origem aos quatro postulados de Koch, para definir se um
microrganismo o causador de uma doena. Os postulados de Koch so:

O organismo deve ser regularmente associado doena e a suas leses caractersticas


O organismo deve ser isolado do indivduo doente em cultura pura
A inoculao da cultura pura do organismo em um hospedeiro saudvel deve reproduzir a doena
O mesmo organismo deve ser isolado da leso desse novo hospedeiro.

Ao final do sculo XIX, esses conceitos se tornaram um paradigma na comunidade mdica e


delinearam um mtodo experimental para ser utilizado em todas as situaes. O no preenchimento
de todos os postulados de Koch na identificao do agente causal de diversas doenas culminou com
o desenvolvimento do conceito de uma nova classe de agentes infecciosos submicroscpicos os
vrus.

Descobertas pioneiras
Em 1876, Adolf Mayer, qumico alemo, verificou que uma das doenas que acometia o tabaco
apresentava natureza infecciosa e podia ser transmitida de uma planta para outra por inoculao de
plantas saudveis com o sumo extrado de plantas doentes. Alm disso, ele observou que o agente
infeccioso era inativado quando aquecido a 80C. Essa foi a primeira transmisso experimental de
uma doena de planta. Embora a natureza infecciosa da doena tivesse sido estabelecida, no foi
possvel isolar bactria ou fungo desse extrato e os postulados de Koch no puderam ser cumpridos.
Em um comunicado preliminar de seus achados, publicado em 1882, Mayer especulou que a causa da
doena poderia ser solvel, possivelmente uma enzima. Contudo, em 1886, quando publicou as

concluses finais do estudo e denominou a infeco descrita por ele de doena do mosaico do tabaco
(devido ao aspecto das leses presentes nas folhas doentes), concluiu que essa doena era causada
por uma bactria que ele no havia conseguido isolar.
Histria da varola
Da varola primeira vacina
Atravs dos sculos, a varola foi uma doena muito conhecida pela populao mundial. Houve relato do primeiro caso
identificado em 2000 a.C., na China e leste da sia. No Egito, hierglifos relatam que o fara Ramss V morreu em decorrncia de
varola, em 1157 a.C. Esse vrus chegou Europa em 710 d.C. por meio das batalhas das antigas Cruzadas e de migraes
populacionais. A varola veio para as Amricas em 1519, quando Hernan Cortz foi nomeado para conquistar o imprio Asteca;
alcanou a proporo de praga epidmica nas cidades europeias, durante o sculo XVIII, e permaneceu amedrontando a populao
com o passar dos sculos, at ser considerada erradicada. O ltimo caso da doena foi relatado na Somlia, em 26 de outubro de
1977.
Preveno
Na tentativa de evitar e curar a varola, curandeiros chineses inventaram um mtodo, denominado variolao, que envolvia a
tcnica de coletar crostas das leses de vtimas da doena, transformar em p e fazer com que os pacientes o inalassem.
Eventualmente, esse procedimento apresentava resultado satisfatrio; outras vezes, no, principalmente devido s diferenas entre
estirpes que eram divididas em virulentas (25 a 30% de mortes) e menos virulentas (menos que 1% de mortes). A tcnica de
variolao era amplamente praticada na China e espalhou-se para muitos pases do Oriente Mdio. Durante muitos sculos, a
variolao foi realizada por inoculao de fluido preparado de crostas da varola nos braos dos pacientes, fazendo arranhes
pequenos com uma agulha.
Lady Mary Wortley Montague, esposa do embaixador britnico no Imprio Otomano, contraiu varola em 1715, sofrendo de
intensa escarificao facial e perda dos clios, ficando quase cega. Em 1718, enquanto vivia na Turquia, ela permitiu que seu filho de 6
anos fosse variolado, mesmo sob rigorosos protestos do corpo diplomtico da embaixada inglesa em Constantinopla. Contudo, as
consequncias da variolao eram imprevisveis e desagradveis, pois leses srias se desenvolviam, invariavelmente, nos stios de
inoculao, sempre acompanhadas de febre e exantema generalizado, com ndice de mortalidade em torno de 1 a 2%.
Em 1776, em Boston (EUA), a variolao foi colocada em prtica nos soldados do exrcito americano pelo Reverendo Cotton
Mather, com o consentimento de George Washington. No entanto, assim como na Inglaterra, esse mtodo tambm encontrava
resistncia da classe mdica.
Edward Jenner (1749-1823) foi variolado em 1756 uma experincia que nunca pde esquecer. Por volta dos 13 anos, tornouse aprendiz de cirurgia e estendeu seus estudos por 7 anos, continuando a trabalhar em Londres at a idade de 23 anos, quando se
transferiu para Berkeley (Inglaterra). Jenner teve a ideia da vacinao quando um antigo professor de cirurgia, ao visit-lo em sua
pequena quinta, lhe disse que uma ordenhadora de vacas tornara-se protegida da infeco por varola aps ter contrado leso
branda nas mos adquirida por contato direto com vacas portadoras de cowpox (varola bovina). Alm disso, em 1774, o fazendeiro
Benjamin Jesty relatou sua experincia de inocular sua esposa e filhos com as leses de vaca infectada com cowpox, do mesmo modo
que era feito no Oriente Mdio, por escarificao com agulhas nos braos. No se sabe se Jenner tomou conhecimento daquele fato,
mas em 14 de maio de 1796, ele vacinou um menino de 8 anos de idade, chamado James Phipps, com material de leses de cowpox
originadas das mos de uma ordenhadora de vacas, Sarah Nelmes. Esse menino nunca adquiriu varola, mas desenvolveu uma
pequena leso no local de inoculao, que regrediu em 2 semanas. Em 1o de julho de 1796, o menino foi submetido a uma segunda

inoculao, dessa vez com material de leses de varola de pessoas infectadas, e ele no ficou doente. Tal fato deu origem ao nome
vacinao.
Muitas pessoas influentes ficaram contra Jenner, inclusive Sir Joseph Banks, presidente da Real Sociedade Britnica, que se
recusou a aceitar o seu manuscrito para publicao; alm disso, Jenner era considerado uma fraude. Contudo, a vacinao tornou-se
uma prtica amplamente utilizada por dois motivos: devido aos benefcios bvios e ao fato de que Jenner gastou o resto de seus dias
promovendo as vantagens da vacinao por todo o mundo. No momento de sua morte, em 25 de janeiro de 1823, a vacinao estava
aceita e amplamente praticada por todo o mundo, incluindo EUA e Inglaterra.
Erradicao
Jenner foi a primeira pessoa a propor a erradicao da varola por meio da vacinao, em 1801. Em 1950, a Organizao Mundial
da Sade (OMS) adotou como meta a erradicao da varola nas Amricas; fato que, pelas projees da Organizao, levaria em torno
de 8 anos. Em 1958, a OMS lanou o programa mundial, mas tornou-se real somente em 1965. Entre 200 e 300 milhes de doses da
vacina antivarilica foram produzidas e aplicadas anualmente, e a vacinao alcanou o sucesso esperado pelo desenvolvimento do
mtodo por agulhas bifurcadas, em 1968, que tornou mais fcil e efetiva a administrao das doses. O ltimo caso natural relatado foi
em 26 de outubro de 1977.
Inicialmente, a nica maneira de se conseguir manter e propagar o vrus cowpox para obteno da vacina era por propagao
seriada de um brao a outro, mantendo o vrus circulante. Mas esse mtodo era associado tambm transmisso de outras doenas,
tais como sfilis e hepatite. Em 1845, descobriu-se que o vrus para produo de vacinas poderia ser conseguido em larga escala, por
inoculao por escarificao dos flancos de bovinos, com a estirpe original retirada da mo das ordenhadoras; posteriormente, em
ovelhas e bfalos (no sculo XIX). Posteriormente, a vacina passou a ser produzida, em larga escala, em cultura de clulas. Em um
dado momento, o vrus isolado por Jenner foi inexplicavelmente substitudo pelo vrus da vaccnia, relacionado com o camelpox
(varola do camelo), fato elucidado recentemente pela determinao de sua sequncia genmica. Trata-se de um fato interessante a
ser relatado, pois, mesmo aps bilhes de doses de vacina terem sido aplicadas, ainda no se sabe o que ou como isso aconteceu.
Certamente, a vacina original utilizada por Jenner era derivada do cowpox, mas o vrus utilizado posteriormente para a produo de
vacinas, ainda um mistrio da cincia.
Situao atual da varola no mundo
A varola est considerada erradicada, e j conhecida a sequncia genmica do vrus desta doena, do vrus cowpox e do vrus
da vaccnia. Alguns segmentos das comunidades cientficas e governamentais propuseram que todo o estoque de vrus da varola
fosse eliminado com segurana. Entretanto, essa proposta intensamente debatida, pois ainda h quem considere prudente a
manuteno do vrus para estudos futuros.
Desde a dcada de 1980, aps a declarao de erradicao da doena, foram destrudas as culturas do vrus da varola existentes
em vrios laboratrios do mundo. Somente dois laboratrios receberam permisso para manter suas amostras um nos EUA e outro
na Rssia. A data de 30 de junho de 1999, para alguns, seria o ltimo prazo para destruio dos estoques de varola; no entanto, em
abril de 1999, o presidente americano Bill Clinton decidiu manter os estoques nos Centers for Disease Control and Prevention (CDC),
sob o argumento de que isso seria essencial para o desenvolvimento de novos frmacos antivirais e vacinas.
Em 1885, quase uma dcada antes do reconhecimento da existncia dos vrus, Louis Pasteur
desenvolveu uma vacina contra a raiva a segunda desenvolvida para uso em seres humanos e a
primeira produzida aps a atenuao da patogenicidade do agente infeccioso. Tal atenuao foi
obtida pela inoculao seriada do patgeno em coelhos. Em seguida, o material retirado de coelhos

infectados foi envelhecido em frascos de vidro. Posteriormente, Pasteur mediu o grau de atenuao
inoculando o material envelhecido em coelhos saudveis. Aps 2 semanas, a capacidade de o
agente matar os animais foi completamente eliminada; entretanto, Pasteur nunca investigou a natureza
do agente infeccioso.
Em 1892, Dimitri Ivanovsky, bilogo russo-ucraniano, repetiu o experimento de Mayer com
tabaco e confirmou que o sumo das folhas doentes continha um agente que podia transmitir a doena
para plantas saudveis. Ivanovsky demonstrou ainda que o agente infeccioso era capaz de passar pelo
filtro de Chamberlain, filtro de porcelana que contm poros muito pequenos que impedem a
passagem de bactrias. Assim como Mayer, ele no conseguiu cultivar o microrganismo e atribuiu o
fato a alguma falha da sua metodologia, sugerindo at a possibilidade de uma toxina ser a causadora
da doena. Entretanto, mais tarde, seu experimento tornou possvel uma definio de vrus agente
filtrvel e uma tcnica experimental pela qual um agente poderia ser definido como vrus.
Em 1898, Martinus Beijerinck, um microbiologista holands que trabalhou com Adolf Mayer e
desconhecia o trabalho de Ivanovsky, tambm demonstrou a filtrabilidade do agente do mosaico do
tabaco. Ele confirmou os experimentos de Mayer de que o agente poderia ser inativado pelo calor,
aquecendo-o a 90C, excluindo assim a possibilidade de ser um esporo. Contudo, Beijerinck deu um
passo adiante e demonstrou que o extrato infeccioso poderia ser diludo e ento readquirir sua
potncia aps a inoculao em folhas saudveis; ou seja, o agente era replicado (o que significava
que no era uma toxina), mas precisava ser em tecido vivo. Isso explicava a falha de Meyer em
cultivar o patgeno fora do hospedeiro. Beijerinck criou as bases para a descoberta de um
microrganismo menor que uma bactria, filtrvel, no observado ao microscpio ptico e replicado
apenas em clulas ou tecidos vivos. Denominou esse agente de contagium vivum fluidum,
enfatizando sua natureza infecciosa e suas propriedades fsicas e reprodutivas peculiares.
Nesse ponto, duas propriedades fundamentais das caractersticas dessa nova classe de patgenos
j estavam estabelecidas: eles eram menores que as bactrias, uma vez que conseguiam atravessar os
poros de filtros que retinham bactrias, e precisavam de clulas vivas para a sua propagao. Esses
patgenos passaram a ser chamados de agentes filtrveis. Mais tarde, o termo virus, do latim, que
significa veneno, passou a ser utilizado para denominar os patgenos que se enquadravam nos
critrios estabelecidos por Mayer, Ivanovsky e Beijerinck, com base na descoberta do agente da
doena do mosaico do tabaco, que foi o primeiro patgeno que no cumpria os postulados de Koch
naquela poca.
No mesmo ano de 1898, os cientistas alemes Friedrich Loeffler e Paul Frosch, ambos estudantes
e assistentes de Robert Koch, demonstraram a filtrabilidade do agente causador da febre aftosa, uma
doena de bovinos.
Em 1901, em Cuba, Walter Reed, mdico militar americano, isolou pela primeira vez um vrus
patognico para seres humanos: o vrus da febre amarela, cuja identificao propiciou uma nova e

importante descoberta era um vrus transmitido por mosquitos. De fato, a hiptese de transmisso
da doena por artrpode j havia sido levantada em 1881 pelo mdico cubano Carlos Juan Finlay de
Barres. Esse mesmo pesquisador, em 1882, identificou o mosquito do gnero Aedes como o agente
transmissor da febre amarela, mas somente 20 anos mais tarde os estudos de Walter Reed
confirmaram essa teoria.
Em 1908, os cientistas dinamarqueses Vilhelm Ellerman e Oluf Bang descobriram que era
possvel transmitir leucemia de uma galinha para outra por meio da inoculao de extrato de clulas
sanguneas. Na ocasio, no foi dada a devida importncia ao trabalho, pois, naquela poca, a
leucemia no era considerada uma doena maligna e, alm disso, o estudo com galinhas no era
interessante.
Em 1911, Francis Payton Rous, mdico americano, demonstrou que o sarcoma de galinhas
poderia ser transmitido pela inoculao de um extrato do tumor e, portanto, deveria ser causado por
um agente transmissvel, provavelmente um vrus. Como cncer no contagioso, a descoberta da
etiologia viral de cncer de galinha foi rapidamente relegada condio de curiosidade cientfica.
Assim, Rous desistiu de seus estudos sobre vrus oncognicos e, nos quase 20 anos subsequentes,
houve pouco progresso na rea de oncovirologia. Em 1966, Rous foi laureado com o Prmio Nobel
de Fisiologia ou Medicina por seus estudos sobre cncer.
A descoberta de uma categoria de agentes diferentes de todos os microrganismos conhecidos foi
revolucionria. Essa ideia enfrentou uma oposio forte, e no foi aceita rapidamente, dando origem
a um ciclo de 25 anos de debate sobre a natureza desses agentes (os vrus so slidos ou lquidos?),
que s terminou aps a descoberta dos bacterifagos e da primeira observao por microscopia
eletrnica do vrus do mosaico do tabaco (TMV).

Era dos bacterifagos


Em 1915, Frederick Twort, mdico e bacteriologista ingls, ao tentar isolar o vrus de uma
amostra de vacina da varola, inoculou o material em gar nutritivo; ele no conseguiu isolar o vrus,
mas bactrias contaminantes cresceram rapidamente no meio. Twort notou que algumas colnias
bacterianas sofreram alterao, tornando-se mais transparentes. Essas colnias no mais podiam ser
cultivadas, indicando que as bactrias estavam mortas. Twort denominou o fenmeno de
vitrificao; ele ainda demonstrou que a infeco de uma colnia normal de bactrias com esse
material transparente poderia mat-las. Essa entidade era filtrvel, poderia ser diluda e readquirir a
potncia ao ser novamente inoculada em bactrias. Twort publicou uma nota descrevendo o fenmeno
e sugerindo que se tratava de um vrus de bactria. Seu trabalho foi interrompido pela I Guerra
Mundial, na qual ele serviu; ao retornar a Londres, no retomou a pesquisa sobre o assunto.
Nesse mesmo tempo, Felix dHerelle, mdico e bacteriologista franco-canadense, estava
trabalhando no Instituto Pasteur em Paris (Frana). Em 1915, ocorreu um surto de disenteria causado

por Shigella em um esquadro da cavalaria do exrcito francs, em Maisons-Lafitte, nos arredores


de Paris. Felix dHerelle isolou a bactria que estava causando a doena e observou reas circulares
translcidas nas quais no havia crescimento bacteriano, denominando esse fenmeno de plaque (ou
placa); ele tambm observou que, quando as placas apareciam, as bactrias morriam. Uma emulso
filtrada das fezes dos pacientes foi misturada cultura da bactria e inoculada em placas de gar e,
novamente, as reas translcidas apareceram.
No hospital do Instituto Pasteur, ocorreram diversos casos de disenteria e dHerelle acompanhou
o caso de um paciente, desde a admisso at a convalescena, a fim de determinar em que momento
da doena ocorria o surgimento das placas, notando que o tempo de aparecimento das placas era o
mesmo que o paciente levava para ficar curado. Felix dHerelle atribuiu a cura atividade dos vrus
de bactrias e denominou-os de bacterifagos ou fagos (phagos, em grego, significa ato de comer).
Em 1918, dHerelle realizou o primeiro experimento com fagos em seres humanos sofrendo de
disenteria, com sucesso, dando origem ao que posteriormente passou a ser denominado de
fagoterapia (boxe Fagoterapia | Passado e presente). Entretanto, somente a minoria dos
pesquisadores da poca reconheceu a importncia dos bacterifagos. Outros interpretaram os
resultados de dHerelle de forma distinta; alguns achavam que as placas eram produzidas pelas
prprias bactrias, enquanto outros consideravam a possibilidade de ser alguma substncia
produzida pelo corpo em virtude da infeco bacteriana.
Em 1919, ocorreu uma epidemia de tifo avirio na Frana; assim, Felix dHerelle teve a
oportunidade de estudar o comportamento dos fagos em animais. Na tentativa de comprovar sua
hiptese de que os fagos eram responsveis pela cura da doena, dHerelle tratou inicialmente os
animais infectados e, posteriormente, utilizou uma mistura de culturas de bacterifagos ativos contra
Salmonella na gua das aves em que a epidemia estava em curso. As aves infectadas foram curadas e
a epidemia foi extinta. Em 1920, durante uma epidemia de clera, dHerelle observou que caso no
fosse detectado um bacterifago ativo contra o Vibrio cholerae nas primeiras 48 h da doena, os
pacientes sucumbiam. Por outro lado, ao ser detectado um fago ativo contra a bactria, o paciente se
recuperava rapidamente, independentemente da intensidade dos sintomas. Novamente, dHerelle
atribuiu a cura atividade dos fagos.
Fagoterapia | Passado e presente
O franco-canadense Felix dHerelle desenvolveu a ideia da fagoterapia, ou tratamento e preveno de doenas utilizando
bacterifagos (ou fagos). Os bacterifagos so vrus que infectam e lisam bactrias e, consequentemente, apresentam caractersticas
distintas relevantes e adequadas paro o uso em biocontrole. A utilizao dos fagos considerada segura, visto que no prejudicial
para as clulas de mamferos.
Em 1917, alguns microbiologistas j haviam isolado fagos capazes de infectar e matar diversas bactrias patognicas, tais como
Shigella dysenteriae, Salmonella typhi, Escherichia coli, Pasteurella multocida, Vibrio cholerae, Yersinia pestis, Streptococcus spp.,

Pseudomonas aeruginosa e Neisseria meningitidis. Esses achados serviram de base para o desenvolvimento de tratamentos especficos
contra uma ampla variedade de doenas em todo o mundo. Entre 1918 e 1919, dHerelle utilizou a fagoterapia no tratamento do tifo
de galinhas e no de disenteria de 5 seres humanos. Posteriormente, suspenses de fagos foram administradas por via sistmica (oral
ou injetvel) ou por via tpica, para o tratamento de infeces causadas por Staphylococcus, infeces intestinais (p. ex., tifo,
disenteria e clera) e infeces sistmicas (p. ex., septicemias). A fagoterapia tambm foi utilizada como medida preventiva em
reservatrios de gua em reas epidmicas; a partir da, diversas preparaes base de fagos foram produzidas e comercializadas na
Europa e nos EUA, e a fagoterapia tornou-se um sucesso comercial.
Sua repercusso foi tanta que o escritor americano Sinclair Lewis, vencedor do Prmio Nobel de Literatura, em 1939, escreveu o
romance Arrowsmith (1925), inspirado nos eventos cientficos que levaram aplicao da fagoterapia. O livro recebeu o Prmio
Pulitzer de Jornalismo.
Entre as dcadas de 1920 e 1930, houve grande suporte poltico e cientfico ao trabalho de Felix dHerelle, nos EUA e na Unio
Sovitica. Contudo, durante a dcada de 1940, as pesquisas focadas na aplicao mdica dos fagos foram abandonadas na Amrica
do Norte e na maioria dos pases europeus, mas alguns pases do leste da Europa continuaram utilizando e desenvolvendo os fagos na
terapia e na preveno de doenas, particularmente a Gergia (na poca, o pas era integrante da Unio Sovitica). Em menor
escala, alguns pases da Europa Ocidental tambm continuaram o uso da fagoterapia e fagoprofilaxia Frana, at a dcada de
1960, e Sucia, at a dcada de 1980.
Em 1934, o Journal of the American Medical Association (JAMA) publicou os resultados de um estudo realizado nos EUA pelo
Conselho Americano de Farmcia e Qumica. A pesquisa concluiu que, com poucas excees, no havia evidncias palpveis da
eficincia da fagoterapia. Alm disso, houve denncias de que os testes teraputicos realizados por dHerelle e seus seguidores no
estavam de acordo com os padres cientficos exigidos; dessa maneira, no produziram evidncias confiveis para a utilizao da
fagoterapia e fagoprofilaxia.
importante atentar para o fato de que, na poca, a natureza dos bacterifagos no era completamente conhecida. Somente
em 1939, por meio do uso de microscopia eletrnica, foi possvel demonstrar que os bacterifagos eram vrus, e no toxinas.
Consequentemente, muitas pesquisas iniciais utilizaram os fagos de maneira inapropriada os bacterifagos foram usados no
tratamento de doenas no bacterianas, as condies de preparo e preservao dos fagos nem sempre eram adequadas, etc.
Com a introduo dos antibiticos, a popularidade da fagoterapia decaiu. Ao final da dcada de 1960, o xito dos antibiticos
levou a comunidade mdica a pressupor que a guerra contra as doenas infecciosas estava vencida. Infelizmente, essa suposio no
se concretizou e, j nesse perodo, a resistncia de algumas estirpes de bactrias aos antibiticos j era um problema significativo,
embora fosse subestimado pela comunidade mdica. Durante a dcada de 1990, o nmero de casos de resistncia a antibiticos
continuou a aumentar. Diversas bactrias patognicas j apresentavam resistncia a todos os antibiticos disponveis na poca,
incluindo Staphylococcus aureus, resistente meticilina (MRSA, methicillin-resistant Staphylococcus aureus), Enterococcus resistente
vancomicina (VRE, vancomycin-resistant Enteroccocus) e outros.
A ameaa atual das bactrias resistentes a antibiticos renovou o interesse na explorao dos bacterifagos. De fato, alguns
produtos originados a partir de bacterifagos j esto disponveis comercialmente e existem centros de tratamento especializados em
fagoterapia. Os bacterifagos so tambm utilizados como agentes antimicrobianos e so ferramenta para a deteco de patgenos
em alimentos, em que as reas de aplicao compreendem controle de gua e alimentos, agricultura e sade animal.
Os estudos de Felix dHerelle levaram ao desenvolvimento da metodologia de titulao viral por
placas, o primeiro mtodo de quantificao de vrus. Ele tambm argumentou que o surgimento das
placas evidenciava que os vrus eram partculas em vez de lquidos. Alm disso, dHerelle
demonstrou, por meio de experimentos de cossedimentao de vrus e clulas bacterianas, que a

primeira etapa da infeco viral era a adsoro do agente clula hospedeira e que esse processo
somente ocorria se a bactria fosse suscetvel ao vrus demonstrando assim a especificidade do
hospedeiro ao vrus. Devido importncia dos seus achados, Felix dHerelle considerado o Pai da
Virologia.

Contribuies da qumica e da bioqumica para a elucidao da natureza dos vrus


No incio da dcada de 1920, comearam as pesquisas com enzimas (protenas) e mtodos para
sua purificao. A noo de que os agentes filtrveis eram constitudos por protenas comeou a se
intensificar entre 1927 e 1931; em 1929, C. G. Vinson e A. W. Petre, do Boyce Thompson Institute for
Plant Research, em Nova York (EUA), aplicaram o processo de separao de protenas ao sumo de
folhas do tabaco que apresentavam a doena do mosaico. Eles observaram que, aps tratamento
prvio com etanol, acetona e sais, as partculas precipitadas migravam em um gel de eletroforese
submetido a um campo magntico, de modo semelhante ao que acontece a uma protena. Esse foi
outro passo importante na Virologia, pois provou a existncia de protenas nos agentes filtrveis. No
mesmo ano, Helen Purdy, tambm do Boyce Thompson Institute, realizando anlises de precipitao,
demonstrou que o antissoro produzido em coelhos contra o sumo das plantas infectadas com TMV
apresentava comportamento diferente do antissoro contra o sumo de plantas saudveis. Purdy tambm
demonstrou que o antissoro contra o sumo de planta infectada era capaz de neutralizar 90% da
infecciosidade do TMV; seus experimentos reforaram a teoria de que os vrus eram constitudos por
protenas.
Aps a purificao do TMV, foi possvel estudar suas propriedades fsico-qumicas. Em 1933, o
bioqumico alemo Max Schlesinger, trabalhando com preparaes de bacterifagos em Frankfurt
(Alemanha), demonstrou que eles eram formados por protenas e tambm continham fosfato e cido
desoxirribonucleico (DNA). Em 1935, Wendell Meredith Stanley, bioqumico americano, do
Rockefeller Institute em Nova Jersey (EUA), purificou o TMV, o que resultou em uma preparao
infecciosa formada por cristais em formato de agulhas, cuja anlise qumica mostrou a existncia de
protena. Essa realizao rendeu a Stanley o Prmio Nobel de Qumica, em 1946; 1 ano depois,
Frederick C. Bawden e Norman W. Pirie, trabalhando na Rothamsted Experimental Station, em
Londres (Inglaterra), mostraram que os cristais de TMV tambm continham fsforo e cido
ribonucleico (RNA). Em 1939, os alemes G. A. Kauche, E. Pfankuch e H. Ruska obtiveram a
primeira micrografia eletrnica de um vrus o TMV.
Os achados de Stanley trouxeram uma nova perspectiva no somente para a Virologia, mas
tambm para a Biologia. Uma vez que os vrus podiam ser cristalizados e manter sua capacidade
replicativa, talvez a natureza biolgica da replicao pudesse, ento, ser explicada em termos
qumicos. Independentemente da natureza do material gentico, este tinha que conter informaes,
alm de apresentar a capacidade de ser copiado com preciso. At a descoberta de Stanley, a

estrutura das macromolculas celulares ainda no era conhecida e muitos acreditavam que o material
gentico fosse composto de protenas e que, portanto, no seria possvel compreender a
hereditariedade em termos qumicos. Os achados de Stanley colocaram fim a esse pensamento e
marcaram o incio da Biologia Molecular.

Nova era dos bacterifagos | Escola de Fagos e suas contribuies para as Cincias
Biolgicas
No final da dcada de 1930, os fagos receberam grande ateno devido controvrsia sobre a
maneira como eles eram formados. John Northrup, bioqumico americano do Rockefeller Institute,
advogava a teoria de que os bacterifagos eram produtos do metabolismo bacteriano. Ele teorizava
que os fagos eram formados por um processo autocataltico semelhante a enzimas, a partir de
precursores inativos. Por outro lado, Max Delbrck, Emory Ellis e Salvador Luria defendiam a ideia
de que o processo replicativo dos fagos era essencialmente o mesmo dos vrus e da reproduo dos
genes. De acordo com esse paradigma, os fagos eram vistos como uma ferramenta ideal para a
compreenso dos genes e da hereditariedade.
Em 1937, o fsico alemo Max Delbrck foi para o California Institute of Technology (Caltech),
onde conheceu o bilogo americano Emory Ellis, que trabalhava com bacterifagos. Ellis achava que
o estudo com fagos contribuiria para a compreenso do papel dos vrus no cncer. Delbrck, por sua
vez, acreditava que os fagos poderiam ser um sistema ideal para testar a natureza e a funo dos
genes. A contribuio mais significativa de Delbrck e Ellis foi o aprimoramento da tcnica de
cultivo para sincronizar a replicao dos fagos (one-step growth curve experiment), que possibilitou
a anlise de um nico ciclo de crescimento dos fagos em uma populao de bactria, levando
caracterizao dos parmetros da replicao dos bacterifagos. Essa metodologia introduziu os
mtodos quantitativos na Virologia e mostrou que os fagos so replicados pelas bactrias e liberados
por lise celular.
Em 1940, Delbrck conheceu Salvador Luria, mdico italiano, que estava entusiasmado com a
ideia de os genes serem molculas e buscava um sistema para estud-los; na poca, Luria trabalhava
com bacterifagos na Columbia University. Ambos tinham interesses comuns e, por esse motivo,
passaram a trabalhar em colaborao no Cold Spring Harbor Laboratory, em Long Island (EUA),
pesquisando mutaes em bactrias que produziam resistncia aos fagos. Eles demonstraram as
primeiras evidncias de que a hereditariedade bacteriana controlada por genes; esse trabalho deu
incio aos estudos de gentica bacteriana e biologia molecular. Esses dois cientistas recrutaram
muitos profissionais talentosos para trabalhar na sua equipe, a qual foi denominada Escola de Fagos.
A Escola fundada por Delbrck e Luria treinou uma segunda gerao de pesquisadores brilhantes; o
que os distinguia dos demais era a sua determinao em compreender as bases da hereditariedade,

analisando a replicao dos fagos. Muitos desses cientistas foram posteriormente laureados com o
Prmio Nobel.
As pesquisas desenvolvidas com bacterifagos resultaram em descobertas que se tornaram
marcos na Biologia Molecular; alguns exemplos: a elucidao dos mecanismos de mutao e reparo
do DNA; traduo da informao gentica; demonstrao de que o DNA (e no as protenas) forma o
material gentico; definio de gene e vetores para a tecnologia de DNA recombinante.

Estabelecimento das culturas de clulas e os avanos da virologia humana e


veterinria
A descoberta dos agentes infecciosos filtrveis de plantas no final do sculo XIX desencadeou a
busca por agentes etiolgicos de doenas humanas, de animais e de plantas, cuja etiologia era
desconhecida. Muitas descobertas foram feitas, como a transmisso do vrus da febre amarela por um
vetor artrpode, a observao de corpsculos de incluso e a associao desses a patologias
especficas, alm da associao de vrus e cncer. Ao longo desse perodo, muitos vrus foram
descobertos e caracterizados de acordo com o seu tamanho (demonstrado por filtros com diferentes
tamanhos de poro), resistncia a agentes qumicos e fsicos e patogenicidade. Com base apenas
nessas propriedades, ficou claro que os vrus eram um grupo diverso de agentes; no entanto, os
progressos na compreenso da natureza dos vrus eram, at ento, oriundos dos estudos com
bacterifagos, decorrentes do desejo dos pesquisadores dos fagos de entender as bases fsicas da
hereditariedade.
O progresso nos estudos envolvendo os fagos foi possvel principalmente devido ao
desenvolvimento dos ensaios de placas, que tornava possvel aos pesquisadores a aplicao de
estudos quantitativos em um sistema simples e de fcil manipulao. O grande desafio para o avano
da Virologia com relao ao estudo de vrus de animais era a dificuldade de cultivo em laboratrio.
Enquanto os virologistas de planta apenas precisavam de uma estufa e os estudiosos dos
bacterifagos precisavam de placas de Petri, os estudos com vrus de animais exigiam um biotrio.
Os progressos para a simplificao dos estudos vieram lentamente com a introduo dos animais de
laboratrio, tais como camundongos e ovos embrionados de galinha.
Entre 1948 e 1955, diversas descobertas cientficas importantes produziram uma mudana
dramtica nesse cenrio. Essas descobertas incluem o desenvolvimento de meios nutrientes para
cultura de clulas de mamferos, a utilizao de antibiticos nos meios de cultura de clulas e o
estabelecimento de linhagens celulares imortalizadas. Esses avanos possibilitaram que o
crescimento e a manuteno de clulas de mamferos em culturas in vitro se tornassem rotineiros. Em
1949, os americanos John Franklin Enders, Thomas Huckle Weller e Frederick Chapman Robbins
demonstraram que o poliovrus poderia ser propagado em vrios tipos de culturas celulares. Esse

estudo lhes rendeu o Prmio Nobel em Fisiologia ou Medicina em 1954. Em 1952, Renato Dulbecco,
virologista italiano, desenvolveu um ensaio de placas usando cultura de clulas para quantificar o
vrus da encefalite equina do oeste (WEEV, Western equine encephalitis virus) e o poliovrus.
A propagao de vrus em culturas de clulas resultou em consequncias importantes para a
Virologia. Possibilitou a descoberta de novos vrus que infectam seres humanos, para os quais no
existia um hospedeiro animal disponvel, tais como o vrus do sarampo, o vrus da rubola e os
adenovrus, alm do desenvolvimento da vacina contra a poliomielite primeira vacina produzida
em cultura de clulas. A tecnologia de cultivo celular revolucionou os estudos de replicao de
vrus, uma vez que o ciclo infeccioso viral passou a ser estudado em condies controladas, a
exemplo dos ensaios utilizados para os bacterifagos.

Virologia moderna
Como os vrus so dependentes da clula hospedeira, eles devem usar as mesmas regras,
sinalizaes e vias regulatrias do hospedeiro. Essa ideia comeou com o grupo dos fagos e
continuou com o grupo de Virologia animal; em pouco tempo, os virologistas comearam a fazer
grandes contribuies para todas as reas da Biologia. Mecanismos importantes da maquinaria de
transcrio eucaritica foram elucidados pelos estudos com vrus; a maioria dos dados experimentais
sobre fatores de transcrio foi obtida a partir de estudos in vitro, com o vrus de smios SV40 e com
os adenovrus. O conhecimento atual dos mecanismos de reconhecimento dos promotores da RNA
polimerase III foi obtido, em parte, por meio de estudos com adenovrus. Quase todo o conhecimento
sobre as etapas de processamento do RNA mensageiro comeou com observaes feitas em vrus. Os
estudos sobre a regulao da traduo utilizando poliovrus e TMV foram bastante produtivos. Os
vrus de animal tambm tiveram papel central no desenvolvimento da tecnologia de DNA
recombinante. A descoberta da enzima transcriptase reversa nos retrovrus ajudou a explicar o
processo de replicao desse vrus e disponibilizou uma ferramenta essencial na produo do DNA
complementar (DNAc). O primeiro mapa de enzima de restrio de um cromossoma, Hind III, foi
produzido com DNA do SV40; alguns dos primeiros experimentos de clonagem de DNA foram feitos
com o DNA do SV40 inserido em fago (lambda) ou o gene da -hemoglobulina humana inserido no
DNA do SV40 para a construo do primeiro vetor de expresso de mamferos.
Grande parte do conhecimento sobre as origens dos cnceres provm de dois grandes grupos de
vrus de animal: os retrovrus e os vrus tumorignicos de DNA. Os oncogenes foram descritos
inicialmente em vrus e, posteriormente, no genoma da clula hospedeira, usando o vrus do sarcoma
de Rous. Foi tambm demonstrada associao entre vrus tumorignicos de DNA e genes supressores
de tumor; a protena p53 foi descrita pela primeira vez em associao ao LT-Ag do SV40. Alm
disso, por meio de estudos com o SV40, adenovrus e poliomavrus humanos, observou-se que eles
codificam oncogenes que produzem protenas que interagem e inativam as funes dos produtos de

dois genes supressores de tumor, Rb e p53.

Prmio Nobel e Virologia


Um nmero significativo de Prmios Nobel foi conquistado devido a descobertas realizadas
diretamente no campo da Virologia ou em reas relacionadas. Foram concedidos Prmios nas reas
de Qumica e Fisiologia ou Medicina (Quadro 1.1). Alguns desses Prmios foram concedidos por
descobertas sobre vrus de animais, outros foram concedidos por estudos com bacterifagos e h
aqueles que foram concedidos por estudos em Biologia Molecular envolvendo vrios vrus de
animais e de plantas.
Quadro 1.1 Prmio Nobel e Virologia.
Ano

Pesquisador(es)

Motivao

1946

John H. Northrop, Wendell M. Stanley

Prmio Nobel em Qumica pela obteno de preparaes de enzimas e


protenas virais em estado puro

1951

Max Theiler

Prmio Nobel em Fisiologia ou Medicina por suas descobertas sobre a febre


amarela e as maneiras de combat-la

1954

John F. Enders, Thomas H. Weller,


Frederick C. Robbins

Prmio Nobel em Fisiologia ou Medicina pela propagao de poliovrus em


diferentes tipos celulares

1958

Joshua Lederberg

Prmio Nobel em Fisiologia ou Medicina por suas descobertas sobre


recombinao gentica e a organizao do material gentico de bactrias

1965

Franois Jacob, Andr Lwoff, Jacques


Monod

Prmio Nobel em Fisiologia ou Medicina por suas descobertas sobre controle


gentico de enzima e sntese viral

1966

Peyton Rous

Prmio Nobel em Fisiologia ou Medicina pela descoberta dos vrus indutores de


tumor

1969

Max Delbrck, Alfred D. Hershey,


Salvador E. Luria

Prmio Nobel em Fisiologia ou Medicina por suas descobertas sobre mecanismos


de replicao e estrutura gentica dos vrus

1975

David Baltimore, Renato Dulbecco,


Howard Temin

Prmio Nobel em Fisiologia ou Medicina por suas descobertas sobre a interao


entre os vrus indutores de tumor e o material gentico das clulas

1976

Baruch S. Blumberg, Daniel C.


Gajdusek

Prmio Nobel em Fisiologia ou Medicina por suas descobertas sobre novos


mecanismos de origem e disseminao de doenas infecciosas

1978

Werner Arber, Daniel Nathans,


Hamilton O. Smith

Prmio Nobel em Fisiologia ou Medicina pela descoberta das enzimas de


restrio e sua aplicao na soluo de problemas de gentica molecular

Aaron Klug

Prmio Nobel em Qumica pelo desenvolvimento da microscopia eletrnica de


cristalografia e pela elucidao estrutural de complexos biologicamente
importantes de cido nucleico protenas

1982

1989

John M. Bishop, Harold E. Varmus

Prmio Nobel em Fisiologia ou Medicina pela descoberta da origem celular dos


oncogenes dos retrovrus

1993

Richard J. Roberts, Phillip A. Sharp

Prmio Nobel em Fisiologia ou Medicina pela descoberta dos genes


descontnuos

1996

Peter C. Doherty, Rolf M. Zinkernagel

Prmio Nobel em Fisiologia ou Medicina pela descoberta da especificidade da


defesa imunolgica mediada por clulas

2006

Andrew Z. Fire, Craig C. Mello

Prmio Nobel em Fisiologia ou Medicina pela descoberta do RNA interferente


(RNAi) silenciamento gnico por RNA de fita dupla

2008

Harald zur Hausen

Prmio Nobel em Fisiologia ou Medicina pela descoberta da associao entre


vrus do papiloma e cncer cervical

2008

Franoise Barr-Sinoussi, Luc


Montagnier

Prmio Nobel em Fisiologia ou Medicina pela descoberta do vrus da


imunodeficincia humana (HIV)

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Origem dos vrus


Por muito tempo, o difcil problema de elucidar a origem dos vrus foi negligenciado. Aps
serem considerados no vivos e deixados margem dos estudos da evoluo da vida por muitos
bilogos, os vrus esto agora no centro do palco podem ter atuado na origem do DNA, ter tido um
papel central na emergncia das clulas eucariotas e ter sido a causa da separao dos organismos
biolgicos nos trs domnios: bactrias, arqueias e eucariotos.
At a metade do sculo XX, os organismos eram divididos em dois grupos: bactrias
(procariotos) e eucariotos; ao final deste sculo, as modernas ferramentas de Biologia Molecular
tornaram possvel uma nova classificao dos organismos celulares. Em 1990, Carl Woese,
microbiologista norte-americano, descobriu a existncia de trs diferentes ribossomas no mundo
celular, substituindo assim a antiga dicotomia procarioto-eucarioto pela trade arqueia-procariotoeucarioto. Nos ltimos 30 anos, o desenvolvimento de estratgias de sequenciamento mais eficientes
permitiu a criao de uma rvore universal da vida (TOL, tree of life), com base na sequncia do
RNA ribossomal (RNAr). Dessa maneira, todos os organismos celulares puderam ser agrupados em
uma rvore universal da vida. Os vrus, contudo, por no possurem ribossoma, no foram
incorporados nessa rvore (boxe Os vrus e a rvore universal da vida).
A origem das clulas clara no sentido de que todas elas descendem de um nico ancestral. Os
registros fsseis indicam que a vida celular se iniciou com os procariotos 4 bilhes de anos antes do
tempo atual (ybp, years before present). frequentemente sugerido que o primeiro tipo de vida
celular foi o ancestral comum de toda a vida, o LUCA (last universal common ancestor). Este j era
um organismo complexo, uma vez que o conjunto de protenas universais contm 33 a 34 protenas.
Isso significa que, alm das trs molculas de RNAr, o ribossoma de LUCA j continha pelo menos
33 protenas. Em concordncia com a ideia de que LUCA j era um organismo sofisticado,
provvel que o moderno cdigo gentico otimizado j fosse operacional em LUCA. Como todas as
clulas modernas descendem de LUCA, teoricamente possvel (embora seja difcil na prtica)
construir uma rvore universal da vida conectando todos os organismos que contm ribossomas. Por

outro lado, no existe uma nica molcula comum a todos os vrus. Desse modo, no possvel
construir uma rvore universal dos vrus, anloga rvore de LUCA (Figura 2.1). Portanto, a
compreenso da origem dos vrus modernos parece ser um problema mais complexo do que a
compreenso da evoluo das clulas.
Os vrus e a rvore universal da vida
A incluso ou no dos vrus na rvore da vida objeto de forte controvrsia. Alguns cientistas argumentam que os vrus no
devem ser includos na rvore da vida e listam diversos motivos para sustentar esse argumento, tais como: (1) os vrus no so vivos;
(2) os vrus so polifilticos; (3) no existe uma linhagem viral ancestral; (4) a simplicidade e a capacidade de infectar hospedeiros
filogeneticamente distintos no significam ancestralidade; (5) ausncia de genes com funes metablicas; (6) ausncia de aparato
para sntese de protena; (7) os vrus so ladres de genes celulares; (8) os vrus evoluem a partir das clulas. Essa viso contestada
por outros cientistas, os quais acreditam que, com a descoberta dos vrus gigantes de DNA, necessrio reavaliar o conceito de vrus e
o seu possvel papel nos estgios iniciais da evoluo dos eucariotos. Esse ltimo grupo contra-argumenta que: (1) se os vrus so vivos
ou no, trata-se de uma questo mais metafsica que cientfica vrus so objetos da Biologia, e muitas descobertas fundamentais da
Biologia Molecular foram feitas usando vrus como modelo; (2) os vrus so entidades genticas distintas, capazes de evoluir e que,
coletivamente, formam o mundo dos vrus ou virosfera o qual representa uma parte crucial do bioma do nosso planeta; (3) a
existncia de genes marcadores virais (viral hallmark genes) presentes em diversos vrus que dispem de diferentes estratgias de
replicao, tais como os grandes vrus de DNAfd e vrus de RNAfs+, que apresentam homlogos distantes nas formas celulares,
sugere que eles representam relquias da evoluo pr-celular. Outros argumentam que a rvore da vida simplesmente no existe.
Com base nesse argumento, a ideia de uma rvore da vida, a qual segue estritamente a teoria de Darwin, no pertinente na era da
genmica. Devido ocorrncia de transferncia lateral de genes, os organismos modernos so quimricos e formados por um mosaico
de sequncias de diferentes organismos, o que torna a rvore da vida obsoleta.

Figura 2.1 rvore da vida. Modelo especulativo da rvore da vida mostrando os trs domnios: bactrias, eucariotos e
arqueias. A rvore parte de LUCA (last universal common ancestor), o qual deu origem aos trs domnios.

Diversidade da virosfera
Diferentemente dos outros organismos, os vrus so estruturas intracelulares obrigatrias que no
se replicam individualmente. Eles so ubquos e infectam todas as formas de vida nos trs domnios
e podem parasitar outros vrus (p. ex., HBV/HDV; HAdV/TMV, Sputinik/Mimivrus, etc.).
Aparentemente, todos os organismos celulares estudados possuem seus prprios vrus ou, pelo
menos, elementos genticos virus-like. Estudos recentes demonstraram que os vrus, primariamente
os bacterifagos, so a entidade biolgica mais abundante do planeta. Os vrus se movem ativamente
entre biomassas e so os principais agentes de evoluo em virtude de sua capacidade de funcionar
como veculos de transferncia horizontal de genes (HGT, horizontal gene transfer).
Tendo em vista a variedade de estratgias genticas, a complexidade genmica e a ecologia
global dos vrus, a questo da evoluo dos vrus invariavelmente divaga por uma rede de perguntas,
tais como: o que um vrus? Os vrus so monofilticos (descendem de um nico ancestral) ou
polifilticos (tm mltiplas origens)? Em virtude das diferenas fundamentais no seu material
gentico (e, consequentemente, nos seus mecanismos de replicao, tamanho do genoma,
complexidade gentica, espectro de hospedeiro e outras caractersticas), tentador descartar
imediatamente a ideia de que os vrus so monofilticos. Embora haja muitos argumentos em favor da
ideia de que os vrus de RNA e de DNA foram gerados independentemente, suas origens podem ter
sido sobrepostas, proporcionando um nvel considervel de mistura entre estes. Talvez a questo
mais fundamental seja: qual a origem dos vrus e qual a relao entre a evoluo dos vrus e a
evoluo das formas de vida celulares?

Categorias de genes virais


A anlise das sequncias das protenas virais revelou a existncia de vrias categorias de genes
virais que diferem marcadamente em sua origem. Existem pelo menos 5 classes de genes que podem
ser agrupados em trs categorias:
A. Genes que contm homlogos facilmente identificados em formas de vida celulares
A1. Genes que apresentam relao prxima com homlogos em organismos celulares (em
geral, o hospedeiro do vrus em questo) presentes em um pequeno grupo de vrus. Exemplo:
protenas envolvidas na interao vrusclula do vrus da vaccnia
A2. Genes que so conservados dentro de um ou vrios grupos de vrus que contm homlogos
celulares relativamente distantes. Exemplo: as proteases 3C e 2A dos poliovrus
B. Genes virais especficos
B1. Genes ORFan, ou seja, sem genes homlogos detectveis exceto, possivelmente em vrus
intimamente relacionados. Exemplo: a protena 3A dos poliovrus

B2. Genes virais especficos que so conservados em um grupo de vrus relativamente grande,
mas no so detectados homlogos em formas celulares. Exemplo: a protena VPg associada
ao genoma dos poliovrus
C. Genes marcadores virais (VHG, viral hallmark genes)
C1. Genes comuns a muitos grupos distintos de vrus, com homlogos distantes nas formas
celulares e com forte indicao de monofilia em todos os membros de uma dada famlia de
genes virais. Ex.: JRC (jelly-roll-capsid), protena de capsdeo; S3H: superfamlia helicase
III; RdRp: RNA polimerase-RNA dependente; RCRE: endonuclease iniciadora da replicao
do crculo rolante; RT: transcriptase reversa.
As 5 classes de genes virais, provavelmente, apresentam origens distintas. possvel que as 2
classes de genes com homlogos facilmente demonstrveis em formas de vida celular possam
representar aquisies relativamente recentes (classe A1) e antigas (classe A2) do genoma de
hospedeiros celulares.
Trata-se de uma questo mais difcil a identificao de onde vieram os genes virais especficos.
No havendo evidncia direta, uma hiptese possvel seria a de que esses genes evoluram de genes
celulares, como resultado de uma acelerao dramtica do processo evolutivo, associado
emergncia de uma nova funo vrus-especfica, de modo que todos os traos de uma relao com
os genes ancestrais foram eliminados.
A contribuio de cada uma dessas classes de genes para a formao do genoma de diferentes
vrus depende principalmente do tamanho do genoma. Vrus com genomas pequenos, como a maioria
dos vrus de RNA, costumam apresentar apenas um pequeno nmero de genes, e a maioria deles
pertence classe dos VHG. Diferentemente, nos vrus de genomas grandes (p. ex., poxvrus e outros
vrus complexos de DNA de fita dupla [DNAfd]), todas as 5 classes de genes esto amplamente
representadas.
Embora no haja qualquer correlao vertical entre os diferentes grupos de vrus de RNA e de
DNA, um nmero considervel de genes que codificam protenas com papis fundamentais na
replicao, expresso e empacotamento do genoma comum a uma gama de grupos de vrus
aparentemente no relacionados. Muitos desses genes so VHG, os quais so encontrados em uma
ampla variedade de vrus (embora no em todos), mas no so encontrados em formas de vida
celulares.
As caractersticas das protenas codificadas pelos VHG so bastante incomuns e demandam uma
explicao evolutiva. De fato, todos os VHG so responsveis por aspectos centrais e essenciais do
ciclo replicativo dos vrus. Esses genes esto presentes em um grupo extremamente diverso, os quais
frequentemente apresentam estratgias de replicao diferentes e tamanhos de genomas distintos.
Finalmente, todos os VHG contm homlogos distantes nas formas celulares, mas so aparentemente
monofilticos nos vrus.

As duas protenas mais amplamente dispersas entre os vrus so a JRC e a S3H. Cada uma delas
cruzou a barreira entre vrus de RNA e de DNA e est presente em um enorme grupo de vrus
pequenos de RNA de fita simples (RNAfs) at vrus complexos de DNAfd. A JRC uma protena
que representa a principal subunidade do capsdeo de um vrion com estrutura icosadrica.
altamente conservada e est presente em vrus de RNAfs e de RNA de fita dupla (RNAfd) e de
DNAfd, reforando o argumento da existncia de um ancestral comum.
Um caso interessante a protena RCRE que est presente em grande variedade de replicons de
DNA de fita simples (DNAfs) e de DNAfd, incluindo vrus, plasmdeos e transposons que infectam
animais, plantas, bactrias e arqueias. As enzimas RdRp e RT catalisam a replicao dos vrus de
RNAfs positivos (RNAfs+), RNAfs negativos (RNAfs), de RNAfd e retrovrus.
Em virtude da significativa conservao dessas estruturas, tem sido considerada a hiptese de
que essas estruturas conservadas significam a existncia de linhagens distintas de arquitetura viral
com ancestralidade no mundo pr-celular, embora no esteja clara a relao evolutiva entre essas
linhagens.
A princpio, 3 hipteses poderiam ser sugeridas para a origem dos VHG:
A primeira possibilidade a de que a noo dos VHG teria como base um artefato. O argumento
comumente invocado o de que ortlogos genunos desses genes (contraparte evolutiva direta,
geralmente com a mesma funo), na verdade, existem nas formas de vida celulares, mas no so
detectados devido rpida divergncia da sequncia entre as protenas virais e celulares.
Contudo, esse argumento no se sustenta. Primeiramente, a conservao das protenas VHG em
classes de vrus extremamente diversas, com estratgias de replicao e expresso diferentes,
mas a sua no conservao em formas celulares, incompatvel com a ideia de divergncia
rpida. Para isso ser verdade, a acelerao da evoluo dos VHG nas diversas classes de vrus
deveria ter acontecido de tal maneira que a similaridade entre as protenas virais se manteve,
enquanto a similaridade entre as protenas virais e seus hipotticos ortlogos celulares
desapareceu.
As outras duas hipteses aceitam as protenas VHG como realidade, mas oferecem cenrios
evolucionrios contrastantes para explicar sua existncia e disseminao
Uma hiptese prope que os VHG representam a herana de um LUCA vrus (LUCAV). Esse
cenrio implica que apesar de todas as evidncias do contrrio, todos os vrus existentes so
monofilticos, embora sua evoluo subsequente tenha envolvido uma perda massiva de genes em
algumas linhagens, assim como uma extensiva aquisio de novos genes do hospedeiro em outras
linhagens
Em outra hipstese, contrariamente, considerando uma origem polifiltica dos vrus, a
disseminao dos VHG pode ser explicada pelo fenmeno de HGT.

Sob um rigoroso escrutnio, nenhuma dessas hipteses parece ser uma explicao vivel da
existncia e distribuio desses genes virais. De fato, o nmero relativamente pequeno e a
disseminao dos VHG parecem no concordar com a noo do LUCAV, embora parea que um
grande nmero de vrus distintos, se no todos, tenham alguma histria em comum. Por outro lado, a
similaridade extremamente distante entre as protenas VHG de grupos de vrus com diferenas
dramticas na estratgia de replicao no exatamente compatvel com o cenrio HGT.
Uma hiptese alternativa seria a de que os VHG antecederam as clulas e so descendentes
diretos do pool gentico primordial (ver Boxe Pool gentico primordial | Hiptese de OparinHaldane). A ideia de que, no pool primordial, a seleo agiria primariamente em funes
envolvidas em replicao, o que compatvel com as propriedades dos VHG.
Considerando o espalhamento dos VHG entre numerosos grupos de vrus distintos, uma
consequncia crucial que as principais linhagens virais derivam do mesmo estgio prcelular da
evoluo. Este dado serve como fundamento para o conceito de um mundo viral ancestral.
Pool gentico primordial | Hiptese de Oparin-Haldane
Nas primeiras dcadas do sculo XX, o bioqumico russo Aleksandr Ivanovich Oparin e o geneticista britnico John Burdon
Sanderson Haldane, de maneira independente, sugeriram que, se a atmosfera primitiva era redutora e se houvesse um fornecimento
adequado de energia, como luz ultravioleta ou raio, ento, poderia ser sintetizada uma grande variedade de compostos orgnicos.
Oparin sugeriu que os compostos orgnicos poderiam ter sofrido uma srie de reaes, levando sntese de molculas mais
complexas. Ele props que as molculas formaram agregados coloidais em um ambiente aquoso, foram capazes de absorver e
assimilar compostos orgnicos do ambiente e tomaram parte nos processos evolutivos, levando ao surgimento das primeiras formas
de vida.
Haldane desenvolveu uma hiptese testvel, envolvendo um caldo pr-bitico ou sopa primordial. Ele props que os
precursores de molculas de importncia biolgica e formas primitivas de organismos vivos foram formados a partir de materiais
inorgnicos. A Terra primitiva apresentaria as condies necessrias para isso: uma atmosfera redutora composta principalmente por
gases como metano, amnia, vapor de gua e dixido de carbono; a existncia de um oceano e de fontes de energia como a luz UV
proveniente do Sol e descargas eltricas na atmosfera.

Hipteses para a origem dos vrus


Hipteses cell-first
Hiptese do escape dos genes
Os vrus so ladres de genes. Esta teoria tem tradicionalmente dominado a concepo de origem
viral, em grande parte porque os vrus so, agora, estruturas intracelulares e argumenta-se que
provavelmente sempre foi assim. Os vrus teriam se originado das clulas pelo escape de um grupo
mnimo de componentes celulares, os quais formaram um novo sistema replicante infeccioso. De

acordo com essa viso, todos os genes virais tm origem celular. Como consequncia, a prpria
existncia de genes essencialmente virais, ou seja, de origem viral, praticamente negada.
Nesse cenrio, existem duas possibilidades para explicar a existncia de protenas virais sem
homlogos nas clulas modernas:
Elas foram recrutadas de clulas modernas, cujos genomas ainda no foram sequenciados
Elas divergiram drasticamente de seus homlogos celulares, de maneira que todos os traos desta
homologia foram apagados ao nvel da sequncia de aminocidos.
A primeira explicao parece improvvel, uma vez que o nmero de protenas virais especficas
no diminui com o aumento do nmero de genomas celulares sequenciados. Ao contrrio, novas
protenas vrus-especficas so descobertas cada vez que um novo vrus sequenciado.
A segunda explicao tambm poderia ser descartada, visto que muitas protenas virais sem
homlogos celulares, como a RdRp, tambm no apresentam similaridade estrutural com protenas
celulares.

Hiptese da reduo gnica


Os vrus so formas de vida unicelulares degeneradas que perderam alguns dos genes e tornaramse parasitas intracelulares obrigatrios. Na vida real, essa dicotomia ofuscada pelo acrscimo de
genes transferidos lateralmente entre os vrus (ou organismos intracelulares), infectando o mesmo
hospedeiro, ou capturados diretamente do genoma da clula hospedeira. Na medida em que um maior
nmero de genomas de vrus de eucariotos sequenciado, novos genes continuam sendo identificados
a maioria deles sem uma afinidade filogentica bvia com hospedeiros ou organismos celulares
conhecidos. Tal observao favorece mais a ideia de que esses vrus so originados a partir da
reduo de genomas virais ancestrais mais complexos, em vez da hiptese do acrscimo de vrios
genes exgenos (sem origem conhecida) em um genoma viral primitivo.
A hiptese de reduo gnica ganhou suporte com a descoberta do mimivrus em 2003. O achado
de diversos componentes de um aparato de traduo de protenas codificadas por esse vrus sugere
fortemente um processo de reduo evolutiva de um ancestral ainda mais complexo que era capaz de
sintetizar protenas. Esse ancestral poderia ter se originado de um parasita intracelular obrigatrio ou
derivado do ncleo de uma clula eucariota primitiva.
A existncia dos VHG coloca em cheque as duas hipteses. A existncia de protenas especficas
de vrus nega o conceito de vrus como ladro de genes, o que levanta a questo se os genes virais
poderiam ter origem viral. Em outras palavras, seria possvel para os vrus criarem novos genes? A
alta prevalncia de genes virais homlogos aos dos hospedeiros em muitos vrus pode ser usada
como suporte para a hiptese dos escaped genes ou at mesmo para a hiptese da reduo gnica.

Novos possveis cenrios evolutivos | Hipteses virus first


A noo de que os vrus devem ser muito antigos (e at mesmo ancestrais das clulas) tem se
tornado o ponto de partida de muitos cenrios evolutivos ousados, modernizados para acomodar
nosso conhecimento atual de Biologia Molecular e genmica. O microbiologista franco-canadense
Felix dHerelle, descobridor dos bacterifagos e um dos fundadores da Virologia, props que os
fagos devem ser os precursores evolucionrios das clulas. Revendo a teoria de dHerelle, foi
proposto que os vrus de RNA emergiram antes das clulas individualizadas, como replicons
autnomos de RNA habitando compartimentos inorgnicos pr-biticos.

Pool gentico primordial


Sugere-se que as principais classes de vrus de procariotos, incluindo os vrus de RNAfs+,
elementos retroides e vrios grupos de vrus de DNA, emergiram do pool gentico primordial, em
que a mistura e o agrupamento de diversos elementos genticos foram incomparavelmente maiores
que na comunidade biolgica moderna.
Um possvel cenrio da origem viral tem como base o modelo de emergncia de clulas e
genomas dentro de uma rede de compartimentos inorgnicos. Tais compartimentos eram habitados
por diversas populaes de elementos genticos, inicialmente RNA autorreplicantes,
subsequentemente, molculas de RNA grandes e complexas contendo um ou poucos genes
codificadores de protenas e, mais tarde, segmentos de DNA. Assim, as formas de vida iniciais,
incluindo LUCA, seriam agrupamentos de elementos genticos presentes em um sistema de
compartimentos inorgnicos. Inicialmente, todos os segmentos de RNA na populao seriam
completamente selfish, e no haveria distino entre os elementos parasticos virais e aqueles que
dariam origem s formas de vida celulares. Esse modelo sugere que, nos estgios iniciais da
evoluo, incluindo o estgio LUCA, todo o sistema gentico era, de algum modo, virus-like.
Aparentemente, o pool gentico primordial carreava uma variedade extraordinria de entidades
virus-like. Quando as arqueias e bactrias escaparam da rede de compartimentos, elas poderiam ter
carreado consigo apenas uma frao desses vrus que, subsequentemente, evoluram no contexto
celular para produzir a diversidade dos vrus modernos.
Na verdade, o conceito de um mundo virus-like no requer necessariamente um LUCA acelular.
Neste modelo, o importante a existncia de um estgio pr-celular da evoluo, no qual uma
diversidade gentica substancial j existia.

Vrus de RNA | Ancestrais do DNA


A ideia de que os vrus de RNA estariam envolvidos na origem do DNA (Figura 2.2) bastante
provocativa. De acordo com esse cenrio, os vrus de RNA infectaram clulas de RNA e adquiriram
um sistema de modificao RNA DNA para resistir s enzimas celulares de degradao de RNA

(RNAses). Para que isso ocorresse, os vrus de RNA deveriam desenvolver uma enzima
ribonucleotdeo redutase, para converter ribonucleotdeo-difosfato em desoxirribonucleotdeodifosfato, e timidilato sintetase, para fazer dTMP (desoxitimidina monofosfato) a partir de dUMP
(desoxiuridina monofosfato), as duas vias fundamentais na sntese de DNA. O RNA celular foi ento
substitudo por DNA no curso da evoluo, devido grande estabilidade do DNA e capacidade de
reparo conferida pela sua estrutura de fita dupla. Isso tornou possvel que os genomas de DNA
maiores e mais complexos superassem os genomas de RNA das clulas mais primitivas. A ltima
adio a esse mecanismo foi o sistema de restrio-modificao (sistema RM), a fim de proteger a
clula de DNA exgenos.

Figura 2.2 Coevoluo do genoma viral e celular. Nessa hiptese, os vrus de RNA coexistiam com clulas de RNA em um
estgio evolutivo do mundo de RNA aps a introduo da sntese de protenas. Para proteger seu genoma das RNAses, os
vrus modificaram seu genoma para a forma U-DNA. Posteriormente, o genoma viral foi modificado para T-DNA para resistir
s U-DNAses. O DNA viral e as protenas de replicao de DNA foram transferidos por diversos vrus T-DNA para clulas de
RNA, o que resultou na modificao do genoma celular de RNA DNA. Essa transio deve ter envolvido a ao da
transcriptase reversa viral. Alguns vrus de T-DNA atuais modificaram seu DNA para proteger seus genomas das DNAses.
Finalmente, as clulas adquiriram o sistema de restrio-modificao para se proteger de DNA exgenos. (Adaptada de
Forterre, P. Curr. Opin. Microbiol. 5: 525, 2002)

Trs vrus | Trs domnios


A hiptese postula que a tecnologia de DNA foi transferida independentemente por trs diferentes
vrus de DNA para os organismos de RNA ancestrais das bactrias, eucariotos e arqueias. Essa
teoria atribui um novo papel aos vrus ancestrais o de estarem na origem dos trs domnios
celulares. Essa hiptese tenta explicar por que existem trs linhagens distintas das clulas modernas
em vez de um contnuo; a existncia de trs padres ribossomais cannicos; e as diferenas crticas
exibidas pela maquinaria replicativa dos eucariotos e arqueias.
De acordo com essa hiptese, cada um dos domnios celulares (arqueia, bactria e eucarioto) se
originou independentemente da fuso de uma clula com genoma de RNA e um vrus de genoma de
DNA (Figura 2.3). Possivelmente, as trs clulas nascentes de genoma de DNA e suas descendentes
superaram todas as linhagens de clulas de genoma de RNA contemporneas, visto que elas eram
capazes de acumular mais genes funcionais em genomas maiores. Uma consequncia importante da
completa remoo das clulas de RNA da biosfera seria que o espalhamento das clulas de DNA
eliminou do mesmo modo a possibilidade da origem de domnios adicionais.
Como os genomas de DNA podem replicar com mais fidelidade que os de RNA, a transformao
das clulas de RNA em clulas de DNA, induzida por vrus de DNA, seria seguida por uma reduo
drstica na frequncia da evoluo das protenas previamente codificadas pelos genes de RNA. Isso
explicaria a formao de trs padres cannicos de protenas ribossomais, um para cada domnio.
A existncia de trs vrus distintos de DNA (os vrus fundadores) na origem das clulas de DNA
explicaria a distribuio errtica de verses de protenas informacionais de DNA celulares e
famlias de arqueias e eucariotos, visto que cada domnio obteve suas protenas informacionais de
um vrus diferente. Em particular, alm de explicar a diferena entre o aparato replicativo do DNA
de arqueias e bactrias, a presente teoria tambm explicaria essas diferenas entre a maquinaria
replicativa do DNA das arqueias e eucariotos, tais como a existncia de DNA polimerases
especficas de cada domnio (famlia D em arqueias, DNA polimerase em eucariotos) e DNA
topoisomerases (famlia IIB em arqueias e IB em eucariotos).

Teoria da eucariognese | Virognese


Foi proposto que as protenas de replicao dos eucariotos atuais tiveram origem de vrus de
DNA, e que um vrus de DNAfd semelhante a um poxvrus pode ter originado o ncleo das clulas
eucariotas, capturado por uma clula ancestral e adaptado como uma organela a hiptese da
eucariognese viral. Nesse cenrio, o ncleo funcionaria como um vrus de DNA, ou seja, replica
seu DNA usando o metabolismo celular. Por outro lado, possvel utilizar nesse cenrio a noo da
virognese nuclear, em que o ncleo celular de uma clula eucariota primitiva daria origem aos vrus
de DNA (Figura 2.4).

Figura 2.3 Hiptese trs vrus trs domnios. VF-B, VF-A e VF-E so os vrus fundadores das bactrias, arqueias e
eucariotos. As setas entre VF-A e VF-E esto conectadas para simbolizar a relao evolutiva entre os dois vrus que deram
origem aos domnios arqueia e eucarioto. (Adaptada de Forterre, P. Proc. Natl. Acad. Sci. EUA, 103:3669, 2006)

Esse estado de idas e vindas de eucariognese virognese poderia explicar a multiplicidade


de linhagens virais existentes, assim como sua diversidade de tamanho, complexidade e a aparente
mistura de monofilia e polifilia observada entre os vrus. Nesse contexto, um vrus de DNA poderia
ter sido originado a partir dessas ondas interativas de virognese nuclear.

Origem dos vrus de eucariotos


A origem dos vrus de eucariotos um problema distinto; so relevantes duas caractersticas de
tais vrus:
Com exceo dos vrus complexos de DNAfd, todas as classes de vrus apresentam uma grande
diversidade em eucariotos e procariotos
Embora os vrus de eucariotos dividam um nmero substancial de genes com os bacterifagos e
outros elementos autnomos de procariotos, a relao entre os genomas de vrus de eucariotos e
procariotos sempre complexa, ao ponto de uma ligao direta entre grupos especficos de vrus
dos dois domnios nem sempre ser demonstrvel.
O surgimento dos vrus de eucariotos foi um complexo processo de mistura de genes de vrias

fontes, tendo provavelmente sido o pool de genes dos vrus de procariotos o mais importante. Com
base no conhecimento atual da genmica dos vrus de bactria e arqueia, parece que os bacterifagos
de endossimbiontes tiveram um papel significantemente mais importante na origem dos vrus de
eucariotos em comparao com os elementos autnomos das arqueias. Em particular, os vrus de
RNA de eucariotos, aparentemente, poderiam ter derivado somente dos fagos, visto que nenhum vrus
de RNA de arqueias foi descrito at hoje. Os elementos retroides so tambm mais caractersticos de
bactrias, particularmente -protobactria. O caso dos vrus de DNA mais complicado, pois
bacterifagos e vrus de arqueia e plasmdeos dividem genes com os vrus de DNA. Assim,
diferentes vrus de DNA de eucariotos devem ter herdado genes de bacterifagos, vrus de arqueias
ou uma mistura destes.

Figura 2.4 Um possvel cenrio interativo para a eucariognese viral e a virognese nuclear. (A) Um vrus de DNA primitivo
(um ancestral dos bacterifagos) capturado por uma clula de RNA e se torna o ncleo primitivo; (B) os genes celulares
so progressivamente recrutados para o ncleo devido s vantagens seletivas da bioqumica do DNA; (C) essa situao se
mantm instvel e reversvel por algum tempo, possibilitando a criao de novos vrus pr-eucariticos, os quais reinfectam
outras clulas em vrios estgios desse processo interativo. (D) Esse esquema hipottico fornece um mecanismo de
emergncia de vrias linhagens virais sobrepostas, mas no monofilticas, bem como para o rpido reagrupamento de
genes virais e celulares antes que eles cheguem ao seu limite Darwiniano, ou seja, (E) a evoluo de uma clula
eucariota estvel com genoma nuclear de DNA. (Adaptada de Claverie, J. M. Genome Biol., 7: 110, 2006)

A contribuio central dos vrus de procariotos para a origem dos genomas de vrus de

eucariotos parece ser fortemente amparada pela conservao dos VHG pela maior parte da virosfera,
bem como a emergncia dos vrus do pool gentico primordial. Como os VHG nunca se tornaram
parte integral do pool gentico celular, a nica fonte da qual os vrus de eucariotos poderiam ter
adquirido esses genes essenciais seria o pool gentico dos vrus de procariotos, plasmdeos e outros
elementos autnomos.

Redefinio dos vrus


Inicialmente, os vrus foram definidos como agentes infecciosos no visveis ao microscpio
ptico e filtrveis. Mais tarde, Andre Michel Lwoff, microbiologista francs, laureado com o Prmio
Nobel de Medicina, em 1965, pela elucidao de mecanismos de controle gentico de enzimas e
sntese viral, definiu vrus como entidades nucleoproteicas infecciosas, potencialmente patognicas,
que apresentam apenas um tipo de cido nucleico, o qual reproduzido de seu material gentico; so
incapazes de crescer ou fazer diviso binria, e so desprovidos de sistema de energia. A maioria
dos bilogos moleculares define vrus como parasitas gentico-moleculares que usam os sistemas
celulares para sua replicao; contudo, trata-se de uma definio muito ampla, que engloba diversos
tipos de elementos genticos (tais como plasmdeos, transposons, viroides e virusoides).
A descoberta do mimivrus desafiou os conceitos ortodoxos de vrus. O mimivrus faz parte de
um grupo de vrus conhecido como vrus de DNA gigantes nucleocitoplasmticos ou
nucleocytoplasmic large DNA viruses (NCLDV). Durante algum tempo, o mimivrus foi identificado
como um organismo Legionella-like e somente foi identificado como vrus quando seu capsdeo
icosadrico foi visualizado ao microscpio eletrnico. O tamanho e a composio genmica do
mimivrus desafiam a definio de vrus, em especial em termos de componentes bioqumicos, os
quais no se supunha que fossem codificados por genomas virais.
Em 2006, o microbiologista francs Jean-Michel Clavier props uma mudana da atual viso
cientfica sobre os vrus. Clavier comenta que, de um lado, temos as bactrias que so
metabolicamente ativas, sequestram ATP (adenosina trifosfato adenosine triphosphate) e
precursores bioqumicos de seus hospedeiros para transcrever seus genomas, traduzir protenas,
replicar DNA e dividir. Do outro lado, temos as partculas virais que so metabolicamente inativas e,
por isso, para a maioria dos bilogos, no merecem ser descritas como organismos vivos,
propondo que essa viso tradicional seja modificada. De acordo com Clavier, em vez de comparar
uma clula parastica (bactria intracelular) com a partcula viral, talvez devssemos compar-la
com o viroplasma (ou virus factory fbrica de vrus). O argumento para tal proposio seria que:
Aps infectarem a clula hospedeira, os NCLDV induzem a formao de uma estrutura
intracelular que transcreve o genoma viral, traduz transcritos em protenas e replica o DNA viral,
antes de empacot-lo em veculos sofisticados desenhados para reproduzir o viroplasma aps a
infeco de uma nova clula hospedeira

O viroplasma envolto por uma membrana celular (geralmente derivada do retculo


endoplasmtico) para excluir organelas celulares, embora contenha elementos do citoesqueleto e
ribossomas. Paralelamente, o viroplasma recruta mitocndrias para a sua periferia para a
obteno de ATP. Neste estgio, significativa a semelhana funcional entre uma bactria
intracelular e um NCLDV.
Dessa maneira, a complexidade genmica dos NCLDV proporcional complexidade de um
viroplasma, mas no com a partcula usada para reproduzi-lo (o vrion). Clavier props que o
viroplasma (ou clula viral virocell) corresponderia ao verdadeiro vrus, enquanto a partcula viral
(vrion) deveria ser considerada um mero veculo usado para disseminar seu genoma de uma clula
para outra.
Em 2008, os microbiologistas franceses Didier Raoult e Patrick Forterre sugeriram um novo
sistema para classificao dos organismos. Foi sugerido que todos os organismos celulares sejam
definidos como organismos codificadores de ribossomas (REO, ribossome-encoding organisms),
enquanto os vrus seriam definidos como organismos codificadores de capsdeo (CEO, capsidencoding organisms). A anlise do genoma dos CEO demonstra que no h uma nica protena
comum na virosfera. No existe um equivalente gentico ao RNA ribossomal ou s protenas
universais dos REO. Alm disso, protenas virais especficas so encontradas apenas em um
conjunto de grupos virais. Foi ento proposto que as protenas do capsdeo so o nico determinante
que pode ser considerado para a definio de vrus.
Foram identificados marcadores na protena de capsdeo que no esto presentes em nenhuma
protena celular. Estudos de modelagem molecular demonstraram que existe uma estrutura
denominada prega double-jelly-roll, que est presente nas protenas de capsdeo dos vrus de DNAfd
que infectam os trs domnios; essa prega no est presente em protenas celulares. Esta observao
favorece a hiptese de que uma forma ancestral de vrus que apresentava esse tipo de capsdeo
antecedeu ou foi contempornea de LUCA.
Interessantemente, essa estrutura tambm observada em vrus de RNAfs, e uma prega singlejelly-roll encontrada em muitos outros vrus de DNA e RNA. Ser til determinar se essas pregas
esto relacionadas evolutivamente, o que poderia sugerir uma origem comum e ancestral de alguns
vrus.

Impacto dos vrus na evoluo da vida


O fato de que o nmero de genes virais especficos suplanta o nmero de genes celulares
conhecidos nos estudos de metagenmica implica que mais genes foram transferidos dos vrus para
as clulas do que das clulas para os vrus. Em total contraste com a viso dos vrus como ladres de
genes celulares, os organismos celulares seriam de fato ladres de genes virais.
Bem mais que um simples veculo de transferncia de genes de uma clula para outra, os vrus

tm o potencial de introduzir novas funes nos genomas das clulas hospedeiras (funes que
emergiram na virosfera), com um imenso impacto na evoluo celular.
A importncia do fluxo de genes dos vrus para as clulas implica que os vrus podem ter sido
peas centrais na evoluo da vida. De acordo com as teorias mais recentes, os vrus podem ter tido
influncia direta na origem do DNA, dos mecanismos de replicao de DNA, na origem do ncleo de
clulas eucariotas, dos cdigos genticos alternativos e na formao dos trs domnios da vida.

Evoluo das populaes virais


medida que as populaes hospedeiras crescem e se adaptam, as populaes virais capazes de
infect-las so selecionadas. Por outro lado, as infeces virais podem ser uma fora seletiva
significativa na evoluo das populaes hospedeiras, e caso estas no consigam adaptar-se a uma
infeco viral letal, podem ser exterminadas. Os cientistas esto apenas comeando a compreender
as foras seletivas que regem a evoluo dos vrus, a emergncia de uma nova doena ou
reemergncia de uma infeco antiga, alm das implicaes desses fenmenos para a nossa
sobrevivncia.
Embora o genoma viral codifique uma quantidade pequena de genes, as populaes virais
apresentam uma enorme diversidade; a qual, manifestada pela grande coleo de permutaes
genmicas que esto presentes em uma populao viral, em um dado momento, possibilita a
manuteno dos vrus na natureza. Essa constante mudana nas populaes virais ocorre por meio de
fenmenos de mutaes, recombinaes, reagrupamentos e selees diante das presses seletivas, e
definida como evoluo viral. As presses seletivas podem ser impostas no apenas pelo ambiente,
uma vez que os vrus esto expostos a uma variedade de defesas antivirais do hospedeiro, mas
tambm pela limitao das informaes codificadas no genoma viral. crucial determinar se existem
regras que governam o processo evolutivo.
A evoluo das populaes virais tem sido muito estudada. A primeira lio a considerar que
se deve evitar o conceito de bom ou ruim. Partindo do princpio de que no existe outro objetivo
alm da perpetuao, pode-se deduzir que os processos evolutivos no alteram o genoma viral de
simples para complexo, ou em alguma direo objetivando apenas a perfeio. As alteraes
ocorrem por eliminao dos gentipos menos adaptados no momento, no com o propsito de
construir algo melhor para o futuro. A hiptese da Rainha Vermelha (boxe Hiptese da Rainha
Vermelha) diz que preciso correr cada vez mais rpido para ficar no mesmo lugar. Ao aplicar
essa teoria evoluo viral, possvel entender que a fora motriz da evoluo dos vrus a sua
perpetuao em uma populao hospedeira.
Hiptese da Rainha Vermelha

O termo derivado da Corrida da Rainha Vermelha, do livro Through the Looking-Glass, do britnico Lewis Carroll. A Rainha
Vermelha disse: preciso correr cada vez mais rpido para ficar no mesmo lugar. Em termos evolutivos, o princpio da Rainha
Vermelha pode ser colocado da seguinte maneira: preciso uma contnua adaptao para que uma espcie mantenha sua
adaptabilidade (fitness) entre os sistemas com os quais est coevoluindo. Assim, presses seletivas exercidas pelo hospedeiro e pelos
vrus geralmente resultam na oscilao da frequncia de alelos em ambas as populaes.

Definies importantes
Nos estudos de evoluo e emergncia de vrus, so utilizados termos especficos e frequentes.
Alguns deles so explicados a seguir.
Populao viral. A evoluo viral definida em termos de populao e no de uma partcula
viral individualmente. As populaes virais compreendem uma diversidade de mutantes que so
produzidos em grandes quantidades. Na maioria das infeces, milhares de partculas so produzidas
aps um nico ciclo replicativo viral na clula; devido ocorrncia de erros de cpia, praticamente
cada novo genoma pode diferir do outro. Do mesmo modo, equivocado assumir que uma partcula
individual seja representativa da mdia dos vrions da populao. A diversidade das populaes
virais oferece estratgias evolutivas; ocasionalmente, at mesmo o gentipo mais raro em uma
determinada populao pode tornar-se o mais comum aps um nico evento evolutivo.
Quasispecies. O termo refere-se mistura de variantes genticas presentes na populao viral. A
expresso fenotpica de uma populao de quasispecies resulta de uma presso seletiva complexa
em que alguns genomas esto mais aptos a se manter no ambiente que outros.
Aptido ou fitness. Adaptabilidade replicativa de um vrus ao seu ambiente. Trata-se da
capacidade de um vrus se manter em uma populao hospedeira e transmitir seus genes nova
gerao. Portanto, uma caracterstica gentica que possibilita a evoluo do genoma viral para
garantir a sua manuteno na natureza.
Paisagens de aptido ou adaptativas (fitness landscape ou adaptative landscape).
Conjunto de possibilidades evolutivas de uma populao viral. Trata-se do conjunto de
possibilidades que viabiliza que uma sequncia possa evoluir para outra, mais apta. Como os vrus
apresentam ndices elevados de erro (104/base do genoma viral, comparado com 109/base do
genoma do hospedeiro), genoma pequeno e tempo de replicao muito rpido, eles so capazes de se
adequar rapidamente por meio dessa paisagem adaptativa.
Em geral, as paisagens adaptativas so usadas para visualizar a relao entre os gentipos e o
sucesso replicativo; cada gentipo tem um fitness. Muitas vezes, paisagens adaptativas so
concebidas como cadeias de vales e montanhas. Existem locais de picos (fitness mais alto) e vales
(fitness mais baixo). Uma populao em evoluo geralmente se dirige em direo ao pico na
paisagem, por uma srie de pequenas alteraes genticas, at alcanar um equilbrio ideal com o

ambiente. Esta deve permanecer no pico, a menos que uma mutao rara abra o caminho para um
novo pico mais elevado (Figura 2.5).
Erro catstrofe ou limite de erro. A diversidade das populaes virais oferece estratgias
evolutivas; contudo, inerente teoria da quasispecies a existncia de um limite de erro acima do
qual o ndice de erros to alto que no so produzidas partculas infecciosas. Esse limite
chamado de erro catstrofe.
Gargalo gentico (genetic bottleneck). Evento evolutivo resultante de uma presso seletiva
extrema, levando perda de diversidade, ao acmulo de mutaes no seletivas ou ambos, em que
uma porcentagem significativa da uma populao eliminada (perde a capacidade replicativa e sofre
extino) ou se adapta nova realidade e se recupera.
Deriva gnica (genetic drift) e troca gnica (genetic shift). A diversidade originada de
erros de cpia e seleo imunolgica (genetic drift) contrasta com a diversidade originada a partir
de recombinao ou reagrupamento de genomas e segmentos genmicos (genetic shift). A deriva
pode ocorrer sempre que o genoma for replicado. A troca ocorre somente em certas circunstncias e
relativamente rara.

Figura 2.5 Representao grfica de uma paisagem adaptativa. Muitas vezes, paisagens adaptativas so concebidas
como cadeias de vales e montanhas. Existem locais de picos (fitness mais alto) e vales (fitness mais baixo). O processo
seletivo normalmente empurra a populao para o pico mais alto.

Doena emergente. Refere-se a uma doena que surgiu recentemente em uma nova populao
foi descoberta recentemente ou causada por um novo patgeno ou que j conhecida por algum

tempo, mas cuja incidncia ou disseminao geogrfica esteja aumentando rapidamente.

Gentica evolucionria da emergncia viral


Busca entender os processos que sustentam a emergncia de um patgeno. A gentica
evolucionria tem como meta compreender os processos responsveis pela origem e manuteno de
variaes genticas na populao.
A gentica evolucionria est igualmente relacionada com fatores do hospedeiro (tais como
suscetibilidade e imunidade), assim como com o patgeno. Entretanto, iremos nos concentrar nos
fatores relacionados com o patgeno.

Fatores evolutivos e emergncia de vrus


RNA DNA
Um dos principais critrios para a classificao de vrus a separao entre vrus, cujo genoma
constitudo de DNA (vrus de DNA) e aqueles em que o genoma constitudo de RNA (vrus de
RNA). Os retrovrus esto includos nos vrus de RNA, embora faam uma cpia de DNA do seu
RNA genmico por meio de transcrio reversa. Os vrus de RNA esto mais frequentemente
associados emergncia de doenas.
A princpio, a evoluo possvel somente quando mutantes so introduzidos na populao, o
que ocorre durante o processo de cpia do cido nucleico. Quando o genoma viral replicado,
mutaes se acumulam na prognie viral. A maioria dos vrus de RNA replicada com menor
fidelidade que os de DNA. A mdia da frequncia de erros descrita para a replicao do genoma de
RNA de aproximadamente um erro por 104 ou 105 nucleotdeos polimerizados. A taxa de erros
estimada da replicao de DNA viral cerca de 300 vezes menor que a descrita para os vrus de
RNA.
Acredita-se que os vrus de RNA evoluam mais rapidamente que os de DNA, devido a uma
combinao de ndices elevados de erros durante a replicao pela RNA polimerase ou transcriptase
reversa, o tamanho da populao viral e a velocidade da replicao. Dessa maneira, a velocidade
das mudanas evolutivas torna possvel que os vrus de RNA produzam rapidamente mutaes, as
quais podem ser necessrias adaptao ao novo ambiente, incluindo adaptao a uma nova espcie
hospedeira.

Receptores celulares
Embora as mutaes forneam a matria-prima para as mudanas evolutivas, em ltima instncia,
a combinao dos processos de variaes genticas e a seleo natural so responsveis por

determinar os mutantes que iro permanecer por um perodo prolongado. Como todos os vrus
apresentam total dependncia da maquinaria celular para a produo de novas partculas, a interao
das protenas virais com os receptores celulares um fator significativo na adequao do vrus aos
hospedeiros. Dessa maneira, seria razovel supor que as interaes de sequncias virais especficas
e receptores celulares tenham particular importncia como determinante na capacidade de alguns
vrus serem mais frequentemente associados transmisso entre espcies hospedeiras do que outros.
Por exemplo, o vrus da influenza A aviria , em geral, incapaz de evoluir para uma transmisso
humano-humano, porque no tem o aminocido correto em vrias protenas virais para
reconhecimento do receptor presente em clulas humanas. A intimidade da relao entre vrus e
receptor celular tambm prediz que os vrus que interagem com ampla variedade de receptores
celulares so mais capazes de cruzar as barreiras interespcies em comparao com os vrus que
apresentam um tropismo restrito.

Mecanismo de transmisso
Outro fator que pode influenciar a capacidade dos vrus para cruzar barreiras interespcies a
maneira de transmisso. fcil imaginar que certos mecanismos de transmisso, particularmente o
respiratrio, ou por meio de vetores, possa favorecer mais facilmente o surgimento de viroses que
outros. Em ambos os casos, a probabilidade de exposio a um vrus emergente relativamente alta,
se comparada transmisso sexual ou sangunea. Muitos dos vrus descritos como emergentes so
transmitidos por vetores artrpodes (arbovrus), os quais podem potencialmente se alimentar do
sangue de diversos mamferos hospedeiros. Embora um aumento na probabilidade de exposio, em
geral, resulte no aumento da possibilidade de emergncia, h vrios outros fatores que no esto
includos nessa anlise. Por exemplo, parece haver uma associao entre o mecanismo de
transmisso e a capacidade de o vrus ser eficientemente replicado nas clulas da nova espcie
hospedeira. Esse fenmeno bem documentado com alguns arbovrus, em que existem fortes
evidncias obtidas de estudos comparativos in vitro de que a necessidade de replicar em espcies
muito distantes, como artrpodes e mamferos, impe fortes restries contra alteraes genmicas.
Esse efeito provavelmente atribudo a um processo antagonista de adequao, em que o aumento da
adequao a uma espcie hospedeira reduz a adequao a outra. Assim, a maioria das mutaes que
ocorre em uma espcie pode ser deletria para outra, sendo esses mutantes removidos por um
processo de seleo.

Cruzamento da barreira interespcie


Uma questo central na emergncia de viroses a suposio de que praticamente todos os vrus
emergentes que acomentem seres humanos so oriundos de outras espcies, em um processo de

transmisso interespcies. A epidemiologia molecular tem identificado espcies-reservatrios de


uma mirade de vrus que infectam seres humanos. Tal questo ilustrada por meio da rpida
descoberta de primatas no humanos ancestrais do vrus da imunodeficincia humana (HIV) e de
algumas espcies de morcegos como reservatrios do vrus causador da SARS (severe acute
respiratory syndrome), o SARS-CoV. Contudo, h excees, e talvez a mais notvel seja o vrus
Ebola, em que milhares de amostras provenientes de animais foram analisadas sem a identificao
precisa da espcie-reservatrio, embora morcegos tenham sido implicados. O vrus da hepatite C
causa uma das novas doenas mais prevalentes em seres humanos, mas no foi descoberto nenhum
vrus similar que cause infeco em animal.
A questo seguinte a ser considerada se alguns vrus tm maior capacidade de cruzar barreiras
interespcies que outros. Nesse contexto, a ideia mais tentadora a de que existem restries
filogenticas nesse processo, de maneira que quanto mais prximas estiverem as espcies
hospedeiras em questo, maior a chance de sucesso na transmisso interespcie. Essa teoria
amparada em algumas observaes. Em particular, no h evidncias de que vrus que infecta seres
humanos venham de organismos to divergentes como plantas, peixes, rpteis ou anfbios, embora,
em alguns casos (tais como vrus de plantas), a exposio ocorra regularmente pelo consumo de
alimentos infectados. A maioria dos vrus que infectam seres humanos originria de mamferos,
com poucas excees ocasionais de vrus avirios. Alm disso, embora vrus de insetos (os
arbovrus) frequentemente infectem populaes humanas, esses sempre passam de uma espcie de
mamfero para outra, em vez de diretamente do inseto (que funciona como vetor), e tendem a causar
infeco terminal no novo hospedeiro (ou seja, no ocorre a transmisso homem-homem).
Outra questo importante se existe uma tendncia filogentica com relao aos vrus de outros
mamferos que tambm afetam seres humanos; especificamente, se os vrus de primatas smios so
mais capazes de infectar seres humanos do que os vrus de outras ordens de mamferos. No momento
no existem dados suficientes para validar essa hiptese. Alm disso, difcil dissociar totalmente a
probabilidade de transmisso com a possibilidade de exposio; por exemplo, embora sejamos
evolutivamente mais prximos de outros primatas do que de roedores, a populao humana global
est mais exposta aos roedores.
Existe tambm um bom motivo para crer em uma relao entre distncia filogentica e a
probabilidade de emergncia de vrus. Se a capacidade de infectar a clula hospedeira um pontochave para a transmisso interespcie, ento espcies filogeneticamente relacionadas so mais
provveis de dividir receptores celulares relacionados.
No entanto, h alguns fatores complicadores nessa teoria filogentica. Um grande nmero de
vrus emergentes de seres humanos parece ter se originado de roedores em vez de primatas. Isso
sugere que a densidade elevada de muitas populaes de roedores torna possvel que estes sejam
capazes de carrear uma grande diversidade de patgenos e/ou que, frequentemente, roedores vivam
em proximidade com seres humanos, aumentando a probabilidade de exposio. Outro fator

potencialmente importante a resposta imunolgica filogeneticamente relacionada. Especificamente,


espcies relacionadas, tais como seres humanos e outros primatas, provavelmente tambm dividem
os alelos determinantes da resposta imunolgica a patgenos. Isso tem sido particularmente bem
documentado para o locus do MHC (major histocompatibility complex complexo principal de
histocompatibilidade), no qual certos alelos tm persistido por milhes de anos. Em consequncia,
embora a espcie possa ser exposta a um novo patgeno, essa pode, por uma combinao de
ancestrais comuns e sorte, apresentar a capacidade imunolgica de evitar a infeco.

Adaptao na nova espcie hospedeira


A maioria das definies de vrus emergentes focada na questo da doena. Isso significa que
nenhuma distino feita entre os vrus que se espalham eficientemente entre seres humanos e
aqueles que causam doena esporadicamente, sem que ocorra a transmisso homem-homem.
Aparentemente, muitas doenas emergentes de seres humanos, se no a maioria, so infeces
terminais. Essa pode ser a dinmica basal natural das transmisses interespcies; por exemplo, quase
todas as transmisses aves-humanos do vrus da influenza A resultam em infeces terminais ainda
assim, ocasionalmente, esse processo pode causar uma pandemia.
No est claro se, aps a transmisso interespcie, o vrus emergente deve se adaptar para poder
replicar na nova espcie ou se o processo de emergncia indiferente para a seleo natural. Um
modelo de emergncia viral prope que, durante os estgios iniciais de uma epidemia, fundamental
a adaptao nova espcie hospedeira, porque eleva as taxas de replicao do vrus (R0 > 1 ver
Captulo 10), de maneira que uma cadeia sustentada de transmisso possa ser estabelecida. Assim,
os vrus que no evoluram de modo a apresentar a transmisso humano-humano so aqueles que no
se adaptaram completamente nova espcie (R0 < 1).
Um modelo alternativo de emergncia viral prope que a emergncia somente ser bem-sucedida
se o vrus que j apresentar a mutao necessria for exposto nova espcie hospedeira. Em outras
palavras, estirpes virais emergentes bem-sucedidas so aquelas j equipadas para estabelecer
infeces na nova espcie hospedeira, de modo que a probabilidade de emergncia se torna uma
funo da frequncia de exposio.

Papel das recombinaes na emergncia de vrus


Embora os elevados ndices de mutao sejam a fora motriz da evoluo dos vrus de RNA, h
evidncias de que a variabilidade gentica observada nas populaes desses vrus possa ser, em
parte, modulada pela ocorrncia de recombinaes. Mais ainda, como a recombinao um processo
que potencialmente aumenta a adequao, criando gentipos vantajosos e removendo mutaes
deletrias, pode-se supor que esta auxilie no processo de emergncia desses vrus. Um exemplo a

transmisso interespcie do vrus da influenza A de aves para seres humanos, fenmeno


frequentemente associado a reagrupamentos entre subtipos de hemaglutinina e neuraminidase.

Emergncia de vrus e viroses


Entre 1700 e 1900, os ndices de morbidade e mortalidade em associao s doenas infecciosas
haviam decado consideravelmente nos pases desenvolvidos, levando ao aumento da expectativa
mdia de vida. Essa melhoria foi atribuda a uma srie de fatores, os quais reduziram a
suscetibilidade do hospedeiro e dificultaram a transmisso de doenas, tais como: melhoria da
habitao e nutrio; melhoria da qualidade da gua e dos alimentos; melhoria dos padres de
higiene e de saneamento; introduo da imunizao das populaes humana e animal; e
desenvolvimento dos antibiticos (Figura 2.6).
Assim, durante a maior parte do sculo XX, a percepo era de que as doenas infecciosas
estavam controladas. Mdicos ilustres acreditavam nisso, como Henry E. Sigerist, diretor do Institute
of the History of Medicine da Johns Hopkins University dos EUA, que, em 1931, argumentou que a
maioria das doenas infecciosas (...) j foi desvendada (...). Muitas doenas (...) j foram
completamente exterminadas; outras tm sido largamente controladas (...), e William Stewart,
Secretrio de Sade dos EUA, que em depoimento ao Congresso americano, em 1969, sentenciou:
hora de fechar o livro das doenas infecciosas. A guerra contra a pestilncia acabou.
Essa atitude levou ao relaxamento da vigilncia epidemiolgica das infeces, das medidas de
controle e preveno das doenas infecciosas e ao surgimento da resistncia de patgenos aos
frmacos existentes. Assim, no incio do sculo XXI, o otimismo comeou a decair quando uma srie
de surtos e epidemias de doenas novas e reemergentes surgiu na imprensa leiga e nos jornais
cientficos, tanto em pases desenvolvidos quanto em desenvolvimento. Grande parte dessas doenas
emergentes ou reemergentes era causada por vrus. A partir desses eventos, o mundo cientfico se
voltou para o estudo dos mecanismos que levaram ao retorno das doenas infecciosas.

Processos evolutivos e disseminao de patgenos


At o incio da dcada de 2000, os estudos de emergncia de patgenos frequentemente
envolviam a compilao de listas de patgenos que eram considerados novos para a populao
humana ou cuja frequncia e abrangncia geogrfica tinham aumentado, alm da descrio dos fatores
ecolgicos responsveis pelo seu surgimento.

Figura 2.6 Fatores envolvidos no decrscimo das doenas infecciosas no sculo XX. (Adaptada de Cohen, M. L. Nature,
406:762, 2000)

Esses estudos enfatizaram particularmente mudanas na ecologia humana (fatores modificadores


da transmisso), tais como o tamanho da populao, levando a grandes aglomeraes de indivduos;
modificaes na utilizao do solo devido s novas prticas de agricultura e pecuria; viagens
globais, facilitando a disperso de patgenos e vetores; aumento do contato com animais silvestres,
expondo o homem a novos patgenos e vetores; e reviravoltas polticas, levando degradao do
sistema de sade pblica.
Esses fatores tm sido responsabilizados por um impacto significativo das doenas infecciosas,
frequentemente por aumentarem a proximidade e/ou densidade de possveis reservatrios. Nesses
estudos, foi largamente negligenciada a considerao do processo evolutivo que sustenta a
emergncia viral.
O principal papel da Biologia Evolucionria nos primeiros estudos de emergncia de patgeno
foi reconstruir a origem e a disseminao desse novo patgeno, primariamente por meio de anlises
filogenticas. Embora o foco nas mudanas da ecologia humana e histria filogentica tenha sido uma
primeira etapa importante e necessria, tambm essencial perguntar quais processos evolutivos so
responsveis pelo surgimento e pela disseminao de patgenos.

Etapas na emergncia de doenas infecciosas


A emergncia de uma doena infecciosa pode ser dividida, didaticamente, em duas etapas:
introduo de um agente em uma nova populao (originado de outras espcies, ou uma nova variante

de um patgeno humano j conhecido); e disseminao dentro da nova espcie hospedeira.


Fatores que promovam uma ou ambas as etapas iro precipitar a emergncia de doenas. Com
relao ao primeiro item, os numerosos exemplos de infeces que surgem como zoonoses sugerem
que o pool zoontico introduo de infeces entre diferentes espcies uma importante e
potencial fonte de emergncia de doenas. Uma vez introduzida, a nova infeco deve ento ser
disseminada na populao, embora o curso rpido da doena e a mortalidade elevada, combinados
com uma baixa transmissibilidade, funcionem, frequentemente, como fatores limitantes. Contudo,
mesmo que um agente zoontico no seja capaz de disseminar-se rapidamente de um hospedeiro para
outro e estabelecer-se dentro da nova espcie hospedeira, outros fatores podem espalhar a infeco.
Adicionalmente, se o hospedeiro-reservatrio ou os vetores transmissores da infeco tornam-se
mais amplamente disseminados, o agente pode emergir em novas localidades.
A maioria das infeces parece ser causada por patgenos j presentes no ambiente, que, por
meio de favorecimento seletivo, por alteraes das condies do seu ambiente, tm a oportunidade
de infectar uma nova populao hospedeira ou, menos comumente, uma nova variante de um patgeno
j conhecido pode evoluir e causar nova doena. O processo pelo qual um agente infeccioso pode ser
transferido de animais para seres humanos ou disseminar-se de grupos isolados para novas
populaes pode ser denominado trfego de agentes infecciosos. Uma srie de atividades aumenta
esse trfego e, como consequncia, promove a emergncia de doenas e epidemias.

Fatores envolvidos na emergncia de doenas infecciosas


A emergncia de doenas frequentemente acompanhada de alteraes ecolgicas causadas por
atividades humanas, tais como prticas inadequadas de agricultura uso de sistemas de irrigao
primitivos, desmatamentos e construo de barragens , o que possibilita a proliferao de vetores e
hospedeiros-reservatrios. A maioria das viroses emergentes constituda de zoonoses, em que um
reservatrio animal a fonte do vrus.
Seis fatores so reconhecidos como influenciadores da emergncia de novas doenas: adaptao
e mutao dos microrganismos (discutido anteriormente); alteraes demogrficas e
comportamentais; alteraes ambientais; comrcio e viagens internacionais; desenvolvimento
industrial e tecnolgico; falncia das medidas de sade pblica (Figura 2.7). Muitos desses fatores
aumentam a suscetibilidade da populao s doenas infecciosas ou aumentam a exposio ou
transmisso dos agentes infecciosos.

Alteraes demogrficas e comportamentais


Alteraes demogrficas envolvem alteraes nas populaes, tais como maior nmero de
pessoas suscetveis a uma determinada infeco aumento do envelhecimento da populao; avanos

mdicos elevando o uso de imunossupressores; alteraes sociais, tais como aumento da renda
familiar, porque ambos os pais trabalham maior frequncia no uso de creches e, consequentemente,
mais casos de transmisso de doenas. Alm disso, os movimentos das populaes humanas
causados por guerras ou migraes so frequentemente importantes na emergncia de doenas. Em
diversas partes do mundo, as condies econmicas encorajam a migrao em massa de
trabalhadores das reas rurais para as cidades. Uma vez na cidade, uma infeco recentemente
introduzida tem a oportunidade de disseminar-se localmente entre a populao e pode tambm
espalhar-se ao longo de rodovias e diferentes rotas de transportes.
O comportamento humano pode ter efeitos importantes na disseminao de doenas; os melhores
exemplos conhecidos so as doenas transmitidas por via sexual.

Figura 2.7 Fatores envolvidos na emergncia de doenas infecciosas. (Adaptada de Cohen, M. L. Nature, 406:762, 2000)

Alteraes ambientais climticas e utilizao do solo


Efeitos da globalizao no perodo Antropoceno
Nas ltimas dcadas, a conectividade internacional aumentou em diversas frentes, incluindo o
fluxo da informao, o movimento das pessoas, o comrcio, o fluxo de capital, os sistemas
regulatrios e a difuso cultural. Esse aumento exponencial nos ndices demogrficos, econmicos,
comerciais e ambientais foi denominado grande acelerao. A poca geolgica atual tem sido
denominada perodo Antropoceno (termo usado por alguns cientistas para descrever o perodo mais
recente da era do planeta Terra, quando as atividades humanas comearam a ter um impacto
significativo no clima do planeta).
As alteraes climticas globais so parte da sndrome antropocnica das alteraes ambientais

globais induzidas pelo homem. Essas alteraes incluem a degradao do solo, a acidificao dos
oceanos, a alterao e a diminuio da concentrao de oznio na estratosfera, a fertilidade do solo,
os recursos hdricos, a biodiversidade e o funcionamento do ecossistema e os ciclos globais de
nitrognio e fsforo.
A complexidade das alteraes climticas e suas manifestaes ambientais e sociais resultam em
diversos riscos para a sade humana. O Quadro 2.1 mostra uma classificao desses riscos e seus
mecanismos causais.
Os efeitos primrios ocorrem devido ao impacto direto do sistema fsico na sade pblica. Os
danos sade humana so normalmente rpidos e bvios, tais como ondas de calor, incndios
florestais, enchentes e tempestades, os quais tendem a aumentar em virtude das alteraes climticas.
Os efeitos secundrios decorrem das alteraes na ecologia de vetores, parasitas e espcies
hospedeiras. Os danos sade humana so menos bvios que os efeitos primrios e sua casualidade
contestada com frequncia, especialmente no caso de doenas infecciosas. Diversas doenas
infecciosas envolvem uma interao de seres humanos, hospedeiro animal, vetor e organismo
infeccioso; assim, a ecologia dessas doenas pode ser sensvel s condies climticas,
especialmente temperatura e ndice pluviomtrico.
Os efeitos tercirios resultam de uma interseo de clima, poltica e ecologia humana e animal.
Quadro 2.1 Categorias dos riscos sade humana decorrentes de alteraes climticas de acordo com mecanismos causais.
Categoria de risco

Mecanismo causal

Primrio

Consequncias biolgicas diretas das ondas de calor, eventos climticos extremos e


elevao dos nveis de poluio da atmosfera urbana em virtude da elevao da
temperatura

Secundrio

Riscos mediados por alteraes em processos e sistemas biofsicos e ecolgicos, que


levam ao contato com vetores transmissores de doenas infecciosas e alteraes da
ecologia dos hospedeiros intermedirios

Tercirio

Consequncias de tenses e conflitos causados pelo declnio dos recursos bsicos


recorrentes das alteraes climticas (gua, alimentos, espao para moradia)

Adaptado de Cohen, M.L. Nature, 406:762, 2000.

A emergncia e a ressurgncia de numerosas doenas infecciosas so muito influenciadas por


fatores ambientais, tais como clima e utilizao do solo. As doenas mais afetadas por esses fatores
so as de transmisso indireta, que requerem veculos para a transmisso entre hospedeiros (gua e
alimentos) ou vetores. A maioria das doenas transmitidas por vetores envolve vetores artrpodes,
os quais so afetados por variaes de temperatura. Dessa maneira, alteraes climticas podem
mudar a incidncia, transmisso sazonal e distribuio geogrfica dessas doenas. Alteraes

pluviomtricas (p. ex., enchentes e estiagens) tambm afetam a transmisso de doenas por vetores
ou por gua, visto que o excesso de chuvas pode provocar uma contaminao das guas recreacionais
e sobrecarregar os sistemas de tratamento de gua.
A destruio do habitat provocada pela utilizao do solo uma das principais causas de
disseminao de doena infecciosa. A mudana de habitat pode acarretar mudana de local de
criao dos vetores ou da biodiversidade dos vetores ou hospedeiros-reservatrios. As principais
alteraes ocorridas devido utilizao do solo so causadas por atividades como desenvolvimento
de projetos agrcolas ou reservatrios de gua (p. ex., construo de barragens), urbanizao e
desflorestamento. Essas mudanas desencadeiam uma cascata de fatores que exacerbam a emergncia
de doenas, tais como introduo de patgenos, pobreza, poluio e migrao humana.

Comrcio e viagens internacionais


Um dos grandes avanos do sculo XX foi a facilitao das viagens internacionais. Viagens que
anteriormente levavam meses foram reduzidas a horas, transformando o mundo em uma aldeia global.
Esse deslocamento facilitou a transmisso e o espalhamento de doenas. Grandes volumes de
plantas, animais e outros materiais so transportados por toda a superfcie do globo terrestre. A
maior parte resulta de um transporte planejado de bens de um lugar para outro. No entanto, todos
esses movimentos tm algum impacto na justaposio de vrias espcies em diferentes ecossistemas.

Desenvolvimento industrial e tecnolgico


Em linhas de produo, incluindo fabricao de alimentos, que processam ou usam produtos
biolgicos, os mtodos modernos tornam possvel um aumento de eficincia e reduo de custos. Por
outro lado, esses mtodos de produo tambm podem aumentar as chances de contaminaes
acidentais e amplificar seus efeitos. O problema agravado pela globalizao, criando a
possibilidade de introduo de novos agentes infecciosos em regies geograficamente distantes.

Falncia das medidas de sade pblica


Medidas clssicas de sade pblica e saneamento tm sido eficientes para minimizar a
disseminao de doenas, a exposio humana a muitos patgenos ou, ainda, para evitar seu
espalhamento por meio de medidas de imunizao ou controle de vetores. No entanto, tais medidas
podem no eliminar totalmente os patgenos que podem permanecer, embora em nmero reduzido,
em hospedeiros-reservatrios no ambiente, ou em pequenos focos de infeco. Como consequncia,
esses agentes podem reemergir se as medidas de controle e preveno forem interrompidas.

Impacto das zoonoses emergentes

Doenas infecciosas emergentes podem afetar seres humanos, animais domsticos, animais de
criao ou selvagens e podem ter impacto significativo na sade, comrcio e biodiversidade. Um
levantamento recente revelou que 58% dos patgenos humanos so zoonticos, e praticamente todos
os patgenos humanos mais importantes so zoonticos ou foram originados como zoonoses antes de
se adaptarem aos seres humanos. Das doenas infecciosas emergentes de seres humanos, 75% so
zoonoses, nas quais os animais selvagens vm surgindo como uma fonte importante de transmisso
entre espcies. Por trs desse padro, esto desafios especficos de sade pblica, originados a
partir de uma complexa ecologia multi-hospedeiros de infeces zoonticas, assim como rpidas
mudanas ambientais e antropognicas que esto alterando os ndices e a natureza dos contatos entre
as populaes humanas e animais.
O aumento massivo global pela demanda de alimentos de origem animal, associado ao
crescimento populacional, aumento do poder aquisitivo, urbanizao e mudanas na agricultura
global, tem um impacto profundo na sade, na subsistncia e no ambiente. Esses fatos tm
contribudo para a exacerbao dos problemas de sade pblica e ambientais, pressionando a
produo e distribuio de alimentos e o transporte e comrcio ilegais de animais de criao,
produtos e pessoas.
O peso econmico das zoonoses emergentes recai desproporcionalmente no setor rural e nas
reas pobres, devido ao maior risco de exposio s doenas oriundas de animais selvagens ou de
criao e em virtude da preexistncia de desigualdades socioeconmicas entre as reas urbanas e
rurais. O impacto das zoonoses na sade e na economia tem sido sentido principalmente, mas no
exclusivamente, por pases em desenvolvimento. A ausncia de dados de vigilncia epidemiolgica
sobre as zoonoses emergentes em muitos pases em desenvolvimento significa que o peso das
doenas de seres humanos, de animais de criao e selvagens subestimado, e as oportunidades de
implantao de medidas de controle so consequentemente limitadas.

Processo de emergncia de vrus zoonticos


O processo de emergncia de uma zoonose pode ser avaliado pela compreenso de diversos
fatores, tais como:
O modo como os vrus zoonticos evoluem e so mantidos nos seus hospedeiros-reservatrios
O mecanismo de transmisso desses vrus para outras espcies taxonomicamente distintas,
causando infeco produtiva nos hospedeiros secundrios e iniciando um processo patolgico que
resulta em doena
A capacidade de, nesses hospedeiros secundrios, induzir morbidade e mortalidade de magnitude
suficiente para serem detectados e caracterizados como um novo problema de sade de
significncia local, regional ou global.

Estgios de emergncia de vrus zoonticos


O processo de emergncia de uma zoonose pode ser dividido em cinco estgios:
Estgio 1: um vrus presente em animal, mas que no pode ser detectado em seres humanos em
condies naturais
Estgio 2: ocorrncia da transmisso interespcie em condies naturais. Um vrus de animal que,
em condies naturais, foi transmitido de animal para ser humano (infeco primria), mas no foi
transmitido entre seres humanos (infeco secundria). Exemplo: vrus Hendra, vrus West Nile
Estgio 3: transmisso limitada do vrus entre os membros da nova espcie. Vrus de animal
capazes de sustentar poucos ciclos de transmisso secundria entre seres humanos, causando
surtos ocasionais (iniciados por um evento de transmisso primria) de curta durao. Exemplo:
Ebola, Marburg, Monkeypox
Estgio 4: sustentao da transmisso do vrus entre os membros da nova espcie hospedeira,
independentemente de novos eventos interespcie. Vrus que existem em animais e que tm um
ciclo silvestre natural de infeco em seres humanos a partir de transmisso primria do
hospedeiro animal, mas mantm longos perodos de transmisso secundria entre seres humanos
sem o envolvimento do hospedeiro animal. Exemplo: vrus da febre amarela
Estgio 5: adaptao gentica e alteraes fenotpicas que acompanham a sustentao da
transmisso dentro da nova espcie. Vrus exclusivo de seres humanos. Exemplo: vrus do
sarampo, vrus da rubola, vrus da varola.
Os primeiros estgios podem requerer a intermediao de outra espcie hospedeira como, por
exemplo, um vetor artrpode ou vertebrado. Os ltimos estgios demarcam uma mudana na interrelao vrus-hospedeiro. Uma vez que a sustentao da transmisso ocorra entre hospedeiros
humanos, a adaptao evolutiva entre vrus e hospedeiro pode transformar um vrus zoontico em um
novo vrus que infecte seres humanos. O novo vrus associado a seres humanos deve ser gentica e
fenotipicamente distinto do vrus ancestral, para que seja reconhecido como emergente ou uma nova
entidade biolgica. Com relao ao HIV e s amostras pandmicas do vrus da influenza, as
diferenas do vrus recm-adaptado aos seres humanos so aparentes em termos de preferncia do
hospedeiro e patogenicidade. Com o SARS-CoV, as alteraes especficas do vrus que infecta
humanos, em relao ao vrus de animal, no so to claras, possivelmente pelo fato de a transmisso
do SARS-CoV ter sido interrompida nos estgios iniciais da sua interao com o novo hospedeiro
humano. Essa hiptese baseia-se nas variaes genticas observadas aps a sustentao da
transmisso do SARS-CoV, por meio de infeces secundrias humano-humano, em comparao com
os vrus detectados aps poucas passagens no hospedeiro humano.

Fatores envolvidos na emergncia de zoonoses

Abiticos ou ambientais
Os fatores ambientais frequentemente alteram as chances de contato entre as populaes das
espcies-reservatrios e a nova espcie ou hospedeiros intermedirios, modulando o risco potencial
de disseminao. As doenas zoonticas so altamente dependentes de fatores abiticos (tambm
denominados fatores ambientais). Em uma escala global, as mudanas climticas tm sido vinculadas
cada vez mais emergncia de zoonoses. O fenmeno denominado El Nino Southern Oscillation
(ENSO) forneceu a maior evidncia de variao climtica interanual. Uma hiptese para o
mecanismo pelo qual o ENSO desencadeou o aumento da incidncia de zoonoses entre seres
humanos por meio de uma cadeia de eventos induzidos sequencialmente, referidos como uma
cascata dos trpicos, que, em ltima instncia, levou ao aumento do nmero de indivduos entre as
populaes de hospedeiros-reservatrios, ou vetores, elevando o risco de exposio humana a um
patgeno zoontico. O fenmeno ENSO tem sido relacionado com o aumento do risco de sndrome
pulmonar por hantavrus e peste bubnica no sudeste dos EUA; com o maior ndice das infeces
pelo vrus Ross River na Austrlia e com o aumento de leishmaniose visceral na Amrica do Sul.

Fatores biticos e evolucionrios na emergncia de zoonoses


Como discutido no incio deste captulo, fatores intrnsecos biticos e evolucionrios reforam a
capacidade de certos vrus, particularmente vrus de RNA, produzirem infeces interespcie. Vrus
com elevadas taxas de replicao, altos ndices de mutao e potencial para recombinao ou
reagrupamentos podem se adaptar mais rapidamente a uma nova espcie hospedeira e tornarem-se
transmissveis entre seres humanos, emergindo como uma ameaa pandmica.

Interaes biticas extrnsecas na emergncia de zoonoses


Interaes extrnsecas como deslocamentos naturais ou induzidos por atividades humanas, de
indivduos de espcies-reservatrios ou vetores infectados, tm tido um papel importante na
emergncia de zoonoses nos ltimos anos. O espalhamento global do SARS-CoV e a disperso de
mosquitos, pssaros ou seres humanos infectados com o vrus West Nile (WNV) so exemplos dos
problemas crescentes de um mundo interconectado.

Influncias antropognicas | Fatores extrnsecos na emergncia de doenas


O crescimento populacional e as prticas de agricultura tm incitado a colonizao humana em
ecossistemas de elevada biodiversidade (p. ex., florestas tropicais), convertendo reas abrangentes
em campos cultivados e pastos. Nessas regies, tal prtica insere uma justaposio e mistura de
seres humanos, animais de criao e a populao nativa de animais com qualquer patgeno zoontico
existente nesse nicho. A construo de barragens para fornecimento de gua para consumo humano e
para a irrigao pode levar ao aumento da emergncia de zoonoses, pois estas fornecem o ambiente

para a aproximao de mosquitos vetores e hospedeiros-reservatrios de arbovrus.


Os animais domsticos podem favorecer novos nichos. Animais de criao como cavalos e
porcos podem ter um papel central na cadeia de transmisso de infeces para seres humanos, como
ocorreu com os henipavrus (vrus Nipha e Hendra). Inicialmente, esses vrus saltaram a barreira
entre espcies de porcos e cavalos, e posteriormente foram transmitidos para seres humanos.
Alteraes significativas na demografia da populao humana global nas ltimas dcadas tm
sido induzidas, no somente pelo crescimento populacional, mas por alteraes na distribuio e
estrutura social da populao, causadas por migraes, movimento de populaes entre as reas
urbanas e rurais e criao de campos de refugiados. A concentrao de indivduos em ambientes
urbanos deu origem a megacidades onde uma grande parcela dos indivduos vive em condies
precrias. As condies de vida nessas reas superpopulosas so degradadas ainda mais pela
inexistncia de condies sanitrias o que tem sido associado emergncia de doenas,
particularmente aquelas transmitidas por vetores.
Talvez o fator antropognico mais influente e certamente o mais infame associado emergncia
de doenas tenha sido o aumento da conectividade social por meio da construo de estradas e da
popularizao do transporte areo. A SARS o melhor exemplo do papel do transporte rpido na
ocorrncia de doena.
A prtica da medicina moderna, requerendo uso disseminado de agulhas, utilizao cada vez
maior de terapias imunossupressoras, transplante de rgos e transfuso sangunea, contribuiu
substancialmente para o espalhamento e emergncia de patgenos.

Reconhecimento de novas doenas


Em geral, os patgenos identificados como agentes de novas doenas no so agentes novos que
surgiram em um curto intervalo de tempo antes do reconhecimento da doena. Na maioria dos casos
dessas novas doenas, os patgenos estavam presentes h vrios sculos. O processo que leva ao
reconhecimento de uma nova doena, frequentemente, envolve eventos sociais, econmicos e
cientficos.
Doenas infecciosas novas so identificadas, mais rapidamente, em uma populao com bom
atendimento mdico e baixos ndices de infeces endmicas. Doenas com um perodo de incubao
longo tornam-se evidentes medida que a expectativa de vida da populao aumenta. Avanos
tecnolgicos que possibilitem a identificao de agentes infecciosos ou de alteraes patolgicas ou
imunolgicas induzidas por estes podem ser essenciais para a caracterizao de uma doena e sua
epidemiologia.

Reconhecimento de novos vrus

O primeiro vrus capaz de infectar seres humanos foi descrito em 1901 o vrus da febre amarela
, e trs ou quatro novos vrus so descritos anualmente (Figura 2.8A).
Uma extrapolao da curva de descoberta de novos vrus sugere que ainda h um pool
substancial de vrus que infectam seres humanos no identificados. Parece ser quase inevitvel que,
em um futuro prximo, novos vrus continuem emergindo entre seres humanos, particularmente
oriundos de outros mamferos e aves. Como toda curva de descobertas, esta reflete um nmero de
diferentes fatores, incluindo:
Tecnologia disponvel para deteco de vrus
Esforos investidos na deteco de novos vrus
Visibilidade de diferentes vrus, ou seja, o quo comuns eles so e a natureza da doena
causada por eles
Normas taxonmicas para designao de novo vrus
Emergncia de novas espcies que no infectavam seres humanos previamente.
Assim, necessrio um sistema de vigilncia global efetivo para deteco de novos vrus. Mais
de 2/3 dos vrus de seres humanos tambm infectam hospedeiros no humanos, principalmente
mamferos, e, eventualmente, aves. Uma poro substancial dos vrus de mamferos capaz de cruzar
a barreira interespcie e infectar seres humanos, embora apenas uma pequena parte que transmitida
de homem a homem seja capaz de causar surtos.

Figura 2.8 A. Curva de descoberta de vrus, mostrando o nmero cumulativo de espcies virais descobertas. B. Principais
desenvolvimentos tecnolgicos que favoreceram a descoberta de novos vrus. (Adaptada de Woolhouse, M. et al. Philos.
Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci., 367:2864, 2012)

Para a caracterizao de uma doena e sua epidemiologia, podem ser essenciais avanos
tecnolgicos que possibilitem a identificao de agentes infecciosos ou de alteraes patolgicas ou
imunolgicas induzidas por estes (Figura 2.8B). Novos vrus continuam sendo descobertos a partir
de tcnicas de metagenmica, incluindo PCR randmicas, nova gerao de sequenciamento e
microarranjos. O desafio ser o desenvolvimento do conhecimento e metodologias que se mantenham
frente, ou pelo menos acompanhem a emergncia de patgenos com testes diagnsticos.
Em um ambiente em que as doenas esto mudando constantemente, sero necessrios ensaios
rapidamente adaptveis, capazes de detectar vrus novos, no esperados ou mutantes, e fornecer
informaes com prontido quanto ao perfil de resistncia a frmacos, patogenicidade e preferncia

por hospedeiros.

Abordagens tecnolgicas para ampliar o espectro de diagnstico viral


Fundamentalmente, h 3 nveis ou categorias de diagnstico, com base no nvel de confiana na
hiptese sobre o agente etiolgico:
Suspeita da identidade especfica do agente. Exemplos: PCR-multiplex, microarranjos para
patgenos respiratrios
Suspeita da identidade do agente no nvel de gnero, famlia ou grupo de agentes que causam
encefalites, febres hemorrgicas, infeces respiratrias, etc. Exemplos: PCR pangnero, seguido
de sequenciamento, microarranjo, luminex, etc.
Identidade do agente totalmente desconhecida ou os testes diagnsticos apresentaram falha.
Exemplo: abordagem metagenmica: amplificaes randmicas seguidas de sequenciamento (ver
Captulo 8).

Medidas de preveno e controle de doenas infecciosas emergentes


Para vencer a guerra contra as doenas infecciosas, fundamental que haja coordenao e
cooperao perfeitas entre autoridades de sade e pesquisadores. Um plano ideal para o
gerenciamento de doenas infeciosas deve incluir: ampliao da capacidade de vigilncia
epidemiolgica e resposta aos surtos; investimentos em pesquisa aplicada; investimentos em
infraestrutura da sade pblica e oportunidades de treinamento para pessoal da rea de sade;
desenvolvimento, implementao e estratgias de avaliao para preveno e controle (medidas de
saneamento, controle de vetores, vacinao, etc.).
As atividades em cada uma dessas reas so frequentemente integradas e complementares.
Independentemente de qual seja o problema, a vigilncia necessria para detectar e definir a
abrangncia e a magnitude. A pesquisa aplicada fornece novas tcnicas de vigilncia, novos mtodos
de diagnstico e possveis intervenes. Vigilncia, pesquisa aplicada, assim como preveno e
controle no sero eficientes sem a infraestrutura e o treinamento apropriados.

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Fundamentos da Virologia
Definio de vrus
Os vrus so estruturas subcelulares, com um ciclo de replicao exclusivamente intracelular,
sem nenhum metabolismo ativo fora da clula hospedeira. Basicamente, uma partcula viral
completa, ou vrion, composta por uma molcula de cido nucleico circundado por uma capa de
protena, podendo conter lipdios e acares. A funo bsica do vrion carrear o genoma viral
para dentro da clula, a fim de ser replicado e amplificado. Esse fato requer uma estrutura que
contenha o cido nucleico e o mantenha protegido, juntamente com alguma protena necessria para
sua replicao, e ligantes na superfcie viral, que possibilitem sua entrada na clula hospedeira.
Assim, possvel definir vrus como um arranjo molecular, constitudo por protenas e cido
nucleico, eventualmente com um envelope lipdico; a funo deste aparato levar a informao
gentica a salvo para dentro da prxima clula a ser infectada.
A recente descoberta de vrus gigantes de DNA (NCLDV, nucleocytoplasmic large DNA
viruses), como o mimivrus, o megavrus e o pandoravrus, que podem ser vistos com o microscpio
ptico e que codificam mais de 1.000 protenas, vem mudando vrios conceitos bsicos da Virologia.
Alm do tamanho, com o capsdeo medindo de 400 a 1.000 nm e fibras que se estendem por cerca de
600 nm, esses vrus podem suportar a replicao de vrus-satlites, denominados virophages. Dessa
maneira, muito se tem discutido sobre os conceitos bsicos, a classificao e at mesmo a definio
de vrus.
Devido ao fato de esses conceitos ainda estarem sendo formados, pois muitos estudos esto em
andamento, consideramos pertinente apenas fazer um alerta a respeito da existncia dessas novas e
fascinantes descobertas, at que se tenham dados suficientes para discuti-los e apresent-los ao
leitor, tais como:
Com exceo dos NCLDV, os vrus so muito pequenos (menores que bactrias), no podem ser
vistos em microscopia ptica e passam por poros de filtros esterilizantes, usados para remoo
de bactrias e outros contaminantes. Essa qualidade no exclusiva dos vrus, pois algumas
bactrias, como os micoplasmas, passam atravs das membranas esterilizantes

Os vrus no podem ser cultivados em meio artificial, pois so agentes intracelulares, que
requerem metabolismo celular ativo para amplificao de seu material gentico e prognie. Essa
caracterstica tambm no exclusiva dos vrus, pois existem bactrias que no podem ser
cultivadas em nenhum meio sinttico, como o agente da sfilis, as riqutsias e as clamdias
Os vrus contm somente um tipo de cido nucleico (DNA ou RNA) como cdigo gentico. O
restante de sua composio protena ou glicoprotena ou, se o vrus apresentar envelope,
glicolipoprotena
A curva de produo de vrus, em cultura de clulas, em forma logartmica na base 10, ao passo
que as bactrias se multiplicam de forma binria
Fora da clula animal, bacteriana ou vegetal viva, um vrus incapaz de realizar sua replicao.

Nomenclatura e definies utilizadas em Virologia


A seguir, so apresentadas algumas nomenclaturas mais utilizadas em Virologia. So elas:
Unidade proteica: uma cadeia polipeptdica como, por exemplo, a VP1 do poliovrus
Subunidade estrutural ou protmero: uma ou mais unidades proteicas, no idnticas, que se
associam para formar estruturas maiores, denominadas capsmeros
Unidade de montagem: um grupo de subunidades ou de protmeros, formado durante a montagem
do vrus, no processo de sntese viral
Unidades morfolgicas ou capsmeros: protuberncias vistas nas superfcies dos vrus no
envelopados, por meio da microscopia eletrnica. Os capsmeros interagem entre si de maneira
ordenada, geralmente seguindo um eixo de simetria. Essas unidades morfolgicas formam o
capsdeo que, geralmente, formado por hexmeros nas reas planas dos vrus e pentmeros nos
vrtices virais
Capsdeo: capa de protena que envolve diretamente o cido nucleico
Core ou cerne: formado pelo cido nucleico viral mais as protenas virais envolvidas na
replicao e a ele associadas
Matriz proteica: estrutura de protenas no glicosiladas existente em alguns vrus, localizada entre
o envelope e o capsdeo, que tem como principais funes sustentar o envelope viral e servir de
ancoragem para as protenas virais de superfcie
Envelope: camada bilipdica proveniente da clula hospedeira, que envolve certas partculas
virais (vrus envelopados), em que se encontram inseridas as glicoprotenas conhecidas pelo
nome de peplmeros ou espculas virais
Vrion: entidade viral completa e infecciosa.

Estruturas virais e suas caractersticas


Capsdeo
A arquitetura dos vrus ou sua simetria definida pela forma e pela composio das subunidades
proteicas que compem o capsdeo, assim como as interaes dessas protenas com o cido nucleico
viral. O uso de pequenas subunidades proteicas para compor esse capsdeo um artifcio da natureza
para economizar energia devido ao tamanho do genoma. Esses componentes proteicos devem
interagir de maneira energeticamente favorvel ao redor do genoma, formando uma estrutura. A
morfologia dessa estrutura regulada pelas regras descritas por Caspar e Klug (1962): para que o
capsdeo seja feito de muitas cpias da mesma protena ou mesmo de poucas protenas diferentes,
existem formas geomtricas que so mais favorveis para que isso acontea. Na natureza,
encontramos capsdeos com simetrias denominadas helicoidal, icosadrica ou complexa
(pseudossimetria).
Em outras palavras, a ocorrncia de subunidades proteicas similares obriga a um arranjo
simtrico entre elas, que so unidas por meio de ligaes no covalentes. Tais ligaes tm a funo
de facilitar a liberao do cido nucleico dentro da clula, mas mantm as protenas unidas para a
manuteno da rigidez e estabilidade do vrus fora da clula.
Uma simetria icosadrica obedece s caractersticas de um slido geomtrico formado de 20
tringulos equilteros (faces) e 12 vrtices, denominado icosgono. Cada um dos 12 vrtices ou
ngulos do icosgono a interseo das cinco faces triangulares (Figura 3.1). Essa estrutura requer o
mnimo de energia para montagem, a partir das subunidades, e, ainda assim, a maneira mais
eficiente conhecida de uma protena ocupar uma rea externa menor com uma rea interna maior. A
forma icosadrica mais simples ocorre quando cada face do icosgono construda por trs
subunidades estruturais ou protmeros, com um total de 60 subunidades. As subunidades estruturais
se associam de maneira especfica, originando estruturas maiores, denominadas capsmeros, que
definem a unidade morfolgica do capsdeo.
Outros vrions so construdos usando mltiplas cpias desses trs protmeros, provocando
subdivises nos lados do icosgono. Nesses capsdeos, as subunidades agrupadas nas faces do
icosgono arranjam-se em grupos de seis e so denominadas hexons ou hexmeros. As subunidades
proteicas agrupadas nos vrtices so chamadas de pentons ou pentmeros.
Em micrografias eletrnicas, a simetria helicoidal aparece como um cilindro ou um tubo. As
unidades proteicas so arranjadas de tal modo que as protenas interajam, de maneira equivalente,
umas com as outras e com a molcula de cido nucleico. O nucleocapsdeo helicoidal pode ser
rgido, como observado em vrus de plantas, ou longo e flexvel, como nos vrus de animais.

Figura 3.1 Estrutura tridimensional do vrus Sindbis. A. As protenas do envelope so mostradas em amarelo; as protenas
do nucleocapsdeo so mostradas em azul. Os pontos de interao entre as protenas das espculas (S) e as protenas do
nucleocapsdeo esto indicados por pontas de setas. Tambm esto indicadas as localizaes da membrana lipdica (M) e
do RNA genmico (R). B. Representao tridimensional do nucleocapsdeo com a face triangular a partir de trs vrtices do
icosaedro (barra = 50 ). C = capsdeo. (Reproduo da Figura 3 de Paredes et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EUA, 90:90959099, 1993. Obs.: a PNAS no responsvel pela acurcia da traduo. Com permisso da National Academy of
Sciences, EUA)

A simetria complexa pode ser representada pelo bacterifago , que apresenta um


nucleocapsdeo tanto com simetria do tipo icosadrico quanto helicoidal, e pelo bacterifago T4, que
alm desse tipo de simetria, apresenta variedade de espculas e fibras na poro helicoidal. Outro
exemplo de simetria complexa aquela apresentada pelos poxvrus, com uma estrutura membranosa
lipoproteica (envelope) envolvendo um capsdeo em formato de haltere.
As bases fsicas e geomtricas da arquitetura do capsdeo viral sero discutidas de maneira mais
detalhada no Captulo 5.

Envelope
Derivado das membranas celulares. A aquisio do envelope realizada por um processo
denominado brotamento, e requer primeiramente o direcionamento de protenas virais (espculas)

para uma membrana celular (local de brotamento) e, posteriormente, ocorre a interao entre
protenas virais intracitoplasmticas com essas protenas virais inseridas na membrana celular.

cido nucleico viral


A maioria dos genomas virais composta de uma nica cpia de cada gene (haploide), com
exceo do genoma dos retrovrus, que apresentam duas cpias de cada gene (diploide). Os genomas
virais podem ser de fita dupla, fita simples, circular ou linear; alm disso, podem apresentar genoma
nico (apenas uma fita) ou segmentado, em que a informao gentica dividida em diferentes
segmentos do cido nucleico.
Os genomas do tipo DNA podem ser de fita dupla (herpesvrus) ou de fita simples (parvovrus).
Encontramos pequenas particularidades em alguns vrus como, por exemplo, os hepadnavrus
(hepatite B), que apresentam um genoma de DNA de fita dupla (DNAfd), com um segmento parcial
de fita simples.
Os genomas do tipo RNA de fita simples (RNAfs) podem ser de polaridade positiva (RNAfs+),
isto , apresentam a sequncia genmica que corresponde a um RNA mensageiro (poliovrus), que
imediatamente traduzido pela maquinaria celular, ou podem ser de polaridade negativa (RNAfs), ou
seja, complementar ao RNA mensageiro (paramixovrus). A maioria dos RNA virais de polaridade
negativa contm um nico segmento, com exceo dos ortomixovrus, que tm sete ou oito segmentos
de RNAfs.
Os genomas do tipo RNA tambm podem ser de fita dupla, segmentado, como o genoma dos
reovrus e birnavrus. Outro tipo encontrado o genoma de RNA que utiliza uma apresentao
intermediria de DNA em seu processo de replicao, como os retrovrus.
Quanto maior o genoma, maior a quantidade de protenas codificadas por ele. Contudo, h
mecanismos de aproveitamento do genoma viral, como por exemplo, a traduo das protenas em
uma poliprotena que clivada para originar as protenas finais. Nesse caso, muitas vezes, as
poliprotenas podem apresentar funes diferentes de seus produtos finais clivados durante o
processo de infeco. Protenas codificadas pelo genoma e traduzidas somente durante a replicao
viral so chamadas de protenas no estruturais, ao passo que aquelas que compem a estrutura da
partcula so denominadas protenas estruturais.
O conjunto de capsdeo e cido nucleico denominado nucleocapsdeo. Os termos RNA
genmico ou DNA genmico so designados para o cido nucleico, que se encontra na partcula viral
madura (vrion).

Biossntese viral
A produo de vrions a partir de uma nica partcula apenas pode ocorrer se essa partcula viral

encontrar uma clula que possa fazer o processo de replicao. Alguns vrus podem infectar vrios
tipos celulares, enquanto outros so bastante restritos quanto ao tipo celular que infectam. A
permissividade de uma clula a determinado vrus, ou seja, a capacidade de uma clula replicar ou
no determinado vrus depende de uma srie de fatores celulares. Se a maquinaria da clula consegue
no somente replicar o genoma viral, mas tambm ter como produto a montagem de partculas virais
infecciosas, dizemos que essa clula permissiva replicao desse vrus. Vale salientar que o fato
de uma clula replicar o genoma viral no significa que partculas virais infecciosas vo ser
produzidas. O processo de infeco pode ser abortado a qualquer momento no ciclo de replicao,
basta faltar algum componente celular necessrio para tal.
Em geral, aps a liberao do genoma viral na clula (RNA ou DNA), as primeiras protenas
produzidas so aquelas que asseguram a replicao do genoma (no estruturais); as protenas que
integram a nova partcula viral sintetizada so produzidas em uma fase mais tardia e so chamadas
protenas estruturais.

Etapas da biossntese viral


Adsoro
A adsoro a primeira etapa da biossntese viral (ou ciclo de replicao viral), na qual ocorre
a ligao especfica de uma ou mais protenas virais com protenas na superfcie celular. As
estruturas formadas por protenas celulares que so reconhecidas pelas espculas virais so
denominadas receptores componentes que desempenham funes na clula, mas tambm so
utilizados pelas partculas virais para esse primeiro contato vrus-clula. A existncia de receptores
na superfcie celular, que so reconhecidos pelas protenas virais, torna essa clula suscetvel
infeco. A suscetibilidade de uma clula limitada existncia de receptores, que no deve ser
confundida com permissividade, pois algumas clulas podem no ser suscetveis ao vrus
naturalmente por falta de receptores, mas podem produzir a prognie viral, caso nela seja
introduzido, artificialmente, o genoma do vrus. O contrrio tambm verdadeiro, pois clulas
podem conter receptores que so reconhecidos pelas protenas virais, mas no apresentarem
capacidade de replicar o vrus. A ligao clula hospedeira geralmente irreversvel, com exceo
dos ortomixovrus e de alguns paramixovrus, que podem ser eludos da superfcie da clula por
meio da ao de uma enzima viral (neuraminidase).

Penetrao
A penetrao ou internalizao um evento que depende de energia e envolve a etapa de
transferncia do vrus para dentro da clula. Durante a adsoro, mudanas conformacionais nas
protenas virais e receptores celulares possibilitam a entrada do genoma viral ou do nucleocapsdeo
na clula. Isso pode acontecer por mecanismos distintos. So eles:

Para alguns vrus envelopados, a adsoro expe aminocidos hidrofbicos das glicoprotenas
virais, que facilitam a fuso entre o envelope viral e a membrana plasmtica celular (fuso
direta), liberando o genoma viral para o citoplasma celular
Alguns vrus so endocitados pela clula aps a adsoro. Os vrus que realizam esse processo
podem ser envelopados ou no. Em geral, para os vrus envelopados, a acidificao da vescula
endoctica facilita a fuso do envelope viral com a membrana da vescula endoctica (fuso
dependente de pH). Para os vrus no envelopados, existem mecanismos de lise da vescula
endoctica para a liberao do genoma viral, podendo ou no depender de pH cido
Formao de um poro na membrana plasmtica celular e translocao do genoma viral atravs do
poro formado, com o restante da partcula viral permanecendo no meio extracelular
Passagem do vrus inteiro atravs da membrana citoplasmtica (penetrao direta).

Estratgias de replicao
Neste item, sero apresentadas as estratgias gerais utilizadas pelos vrus durante o processo de
replicao do genoma. Mais adiante, no Captulo 4, essas estratgias sero apresentadas com mais
detalhes.
Para que a replicao viral seja bem-sucedida, necessrio ultrapassar as barreiras impostas
pela fisiologia celular. Um exemplo dessas barreiras a compartimentalizao celular. As clulas
apresentam vrios compartimentos, delimitados por membranas (p. ex., ncleo, complexo de Golgi,
lisossomas), cada um com seu microambiente especfico em termos principalmente de enzimas e
outras protenas. Devido a isso, a replicao da maioria dos vrus com genoma de DNA ocorre no
ncleo, pois nesse local que a clula tem a maquinaria necessria para a replicao do DNA. Do
mesmo modo, a replicao de vrus de RNA costuma ocorrer no citoplasma, pois nesse ambiente
que uma molcula de RNA pode ser traduzida. H excees como, por exemplo, os poxvrus, que
contm genoma de DNA de fita dupla e tm a replicao no citoplasma, exigindo que os vrus tenham
mecanismos para suprir as enzimas necessrias para a replicao, em compartimentos no
compatveis com os mecanismos naturais da clula hospedeira. Outras enzimas necessrias para a
replicao viral que no existem na clula devem ser codificadas pelo genoma viral; e, para dar
incio infeco, muitas delas precisam estar presentes na partcula viral infecciosa. Por exemplo,
os retrovrus trazem na partcula viral a enzima transcriptase reversa, j pronta para dar incio ao
processo infeccioso. Caso isso no acontea, no existe na clula uma enzima capaz de transformar
RNA em DNA. O mesmo ocorre para enzimas que repliquem o RNA (RNA polimerase-RNA
dependente). Alm disso, as clulas traduzem apenas RNA mensageiros (RNAm) monocistrnicos,
no reconhecendo stios de iniciao de traduo no meio do RNA. Para tanto, um mecanismo
interessante desenvolvido pelos vrus para ultrapassar esse problema a formao de poliprotenas
que so clivadas posteriormente, originando as protenas individuais, como citado anteriormente.
Existem estratgias que conferem ao RNAm viral uma vantagem em relao aos RNAm celulares,

como, por exemplo, a inibio da transcrio de RNAm celular. Tais estratgias sero mostradas nos
captulos referentes s diferentes famlias virais.
A seguir, sero descritas algumas das principais estratgias de replicao sugeridas por
Baltimore, em 1971, que definiu uma classificao para os vrus com base na estratgia de
replicao e do tipo de cido nucleico viral, ficando conhecida por classificao de Baltimore
(Quadro 3.1). As estratgias e mecanismos de replicao dos diversos vrus humanos sero descritos
mais detalhadamente no Captulo 4.

Classificao de Baltimore
Os vrus de DNA de fita dupla (DNAfd) so agrupados na Classe I. O DNA genmico
transportado para o ncleo e imediatamente transcrito em RNAm por enzimas celulares. A partir
dessa transcrio, so traduzidas, primeiramente, protenas regulatrias de toda a sntese de
protenas e do genoma do vrus, assim como protenas que conferem vantagens para a produo de
RNAm viral. Em uma etapa mais tardia da biossntese, so sintetizadas protenas estruturais, para
ento comear a montagem da partcula viral.
Os vrus de DNA de fita simples (DNAfs) so agrupados na Classe II. Esses vrus fazem uma fita
complementar ao DNA genmico antes do incio da replicao, uma vez que a DNA polimerase
apenas reconhece DNAfd.
A maioria dos vrus DNA faz sua replicao no ncleo da clula, com exceo dos poxvrus
constitudos de DNAfd, que ficam no citoplasma durante toda a sntese de protenas e de cido
nucleico. Os poxvrus so praticamente autnomos com relao a fatores de transcrio; j os
parvovrus, constitudos de DNAfs, so replicados no ncleo celular utilizando-se de polimerases
celulares.
Os vrus de RNA de fita dupla (RNAfd) so agrupados na Classe III. Para que a replicao tenha
incio, necessria a sntese de RNAm. Esses vrus trazem a enzima RNA polimerase-RNA
dependente como parte do vrion.
Quadro 3.1 Classificao de Baltimore.
Classe

Estratgia

Exemplo

DNA de fita dupla

Herpesvrus

II

DNA de fita simples

Parvovrus

III

RNA de fita dupla

Reovrus

IV

RNA de fita simples polaridade positiva

Picornavrus

RNA de fita simples polaridade negativa

Ortomixovrus

VI

RNA de fita simples com intermedirio DNA

Retrovrus

VII

DNA de fita dupla com intermedirio RNA

Hepadnavrus

Na Classe IV, temos os vrus de RNA de fita simples de polaridade positiva (RNAfs+), que
servem como RNAm; essa a maneira mais simples de replicao. Assim que liberado no
citoplasma da clula-alvo, reconhecido pela maquinaria de traduo da clula, ocorrendo traduo
de protenas, que sero processadas posteriormente. Esse vrus vai necessitar da enzima de RNA
polimerase-RNA dependente para a replicao do seu genoma, que codificada pelo genoma viral.
O RNA genmico serve de molde para uma fita negativa complementar, que ser transcrita
novamente em RNA genmico por meio da polimerase viral. Durante o processo, muitas fitas
genmicas so sintetizadas, alm de protenas que sero utilizadas para a montagem da partcula.
Os vrus de RNA de fita simples com polaridade negativa (RNAfs) correspondem Classe V e
no podem ser traduzidos diretamente in vivo ou in vitro. Assim, seu genoma sozinho no
considerado infeccioso. Como no caso dos vrus de RNA de fita dupla, necessrio que o genoma
esteja associado a uma transcriptase viral (RNA polimerase-RNA dependente), que ir
primeiramente sintetizar uma fita complementar positiva (RNAm), para somente ento ser traduzido.
A partir da, maior quantidade de protenas virais e genoma ser sintetizada para a montagem dos
vrus.
Os retrovrus constituem a Classe VI; contm um genoma diploide e, durante o ciclo de
replicao, sintetizam um DNA intermedirio (transcrio reversa). Tal transcrio feita pela
enzima transcriptase reversa, que tem atividade de DNA polimerase-RNA dependente, que ir
transcrever o RNA viral em DNA para ser integrado no genoma da clula. Uma vez inserido no
genoma celular, o genoma viral recebe o nome de provrus, e a transcrio dos RNAm virais feita
por enzima RNA polimerase-DNA dependente celular.
A maioria dos vrus de RNA faz sua replicao no citoplasma da clula, com exceo dos
ortomixovrus, que utilizam enzimas nucleares para a sntese do cido nucleico.
Na Classe VII, esto os vrus com genoma de DNAfd, com o envolvimento de um intermedirio
RNA no ciclo replicativo. Esses vrus apresentam tambm uma transcriptase reversa codificada em
seu genoma, mas a sua produo de RNAm bastante similar dos vrus DNAfd da Classe I.

Morfognese
Na morfognese, fazem parte a automontagem, a maturao e a liberao do vrus das clulas
infectadas. Aps a sntese de protenas iniciais, geralmente regulatrias, a transcrio do cido
nucleico e a sntese de protenas estruturais, as partculas virais comeam a etapa de automontagem,
um processo que culmina com a liberao dos vrions.
Os vrus no envelopados podem ser montados no citoplasma (picornavrus, reovrus) ou no
ncleo (papovavrus, adenovrus). Os vrus no envelopados dependem da lise da clula para sua
liberao, embora, atualmente, existam modelos, ainda bastante discutveis, de liberao de alguns

desses vrus, sem necessariamente destruir a membrana celular.


Os vrus envelopados adquirem o envelope nas membranas celulares (Figura 3.2),
citoplasmticas, nucleares ou de algumas organelas ou vesculas intracelulares. Nesses vrus, o
processo de aquisio do envelope denominado brotamento, podendo ou no culminar com a
liberao da partcula viral; isso depender da membrana utilizada como local de brotamento. No
caso de brotamento em membranas intracitoplasmticas, a liberao das partculas pode ser feita por
exocitose de vacolos ou vesculas contendo partculas j envelopadas. Em geral, esse processo
feito sem causar dano membrana celular, embora, em alguns casos, o grande nmero de partculas
virais brotando em uma clula j prejudicada pela infeco viral possa levar lise celular. Na
maioria dos casos, os vrus j so infecciosos quando liberados da clula infectada; outros precisam
sofrer um processo de maturao aps a sua liberao.

Figura 3.2 Vrus Sindbis brotando pela membrana citoplasmtica.

Classificao internacional dos vrus


Embora os primeiros estudos a respeito das viroses tenham comeado no incio do sculo XX, as
evidncias sobre a estrutura e composio dos vrus foram conhecidas somente por volta da dcada
de 1930, devido ao aparecimento do microscpio eletrnico. Nessa poca, Bawden, patologista de
plantas, props que os vrus fossem agrupados de acordo com suas propriedades fsico-qumicas.
Entre 1950 e 1960, houve avano considervel na descoberta de novos vrus, o que motivou as
sociedades cientficas a sugerirem novos esquemas para a classificao com base nas caractersticas
comuns de patogenia, tropismo por rgos, modo de transmisso e ecossistemas. Em consequncia,
vrios vrus que causavam uma mesma doena foram colocados juntos, embora pertencessem a
diferentes famlias, como foi o caso dos vrus das hepatites. Isso causou muita confuso e houve a

necessidade de uma nova classificao e nomenclatura que pudesse ser utilizada internacionalmente.
Dessa maneira, em 1966, foi criado o International Committee on Nomenclature of Viruses
(ICNV), durante o Congresso Internacional de Microbiologia, realizado em Moscou. Esse Comit era
constitudo por 43 representantes de Sociedades de Microbiologia espalhadas pelo mundo e, em
1971, publicou o First Report, alterando o nome para International Committee on Taxonomy of
Viruses (ICTV), que permanece at hoje. Nessa publicao, constavam apenas as famlias
Papovaviridae (gneros Papillomavirus e Polyomavirus) e Picornaviridae (gneros Calicivirus,
Enterovirus e Rhinovirus), alm de uma terceira famlia no denominada, que abrangia 38 gneros
de vrus conhecidos at aquele momento. O ICTV, atualmente, formado por um Comit Executivo
com 20 membros e publicou o Ninth Report of the International Committee on Taxonomy of
Viruses, em 2009. Depois da ltima atualizao, em 2013 e publicada em 2014, foram registrados 7
ordens, 103 famlias, 22 subfamlias, 455 gneros e 2.827 vrus, alm de viroides (1 famlia, 3
gneros e 4 espcies), satlites e prions. Os grupos de estudo organizam os vrus em nveis
hierrquicos de ordem, famlia, subfamlia, gnero e espcie, alm de nveis inferiores, tais como
subespcies, estirpes e variantes.
Atualmente, na classificao dos vrus, o ICTV leva em considerao, principalmente, a estrutura
genmica. A base molecular fundamental para a classificao dos vrus, que era originariamente
emprica, est agora estabelecida pelo ICTV. A taxonomia formal dos vrus estabelecida pelas
normas internacionais baseia-se tambm em suas propriedades estruturais, como a seguir:
Morfologia: tamanho e forma do vrion; existncia ou no de glicoprotenas; existncia ou no de
envelope e simetria estrutural do capsdeo
Propriedades fsico-qumicas: massa molecular do vrion; coeficiente de sedimentao;
estabilidade a variaes de pH, calor, ons divalentes, detergentes e radiao; tipo e tamanho do
cido nucleico (DNA ou RNA); tipo de fita do cido nucleico (dupla ou simples, circular ou
linear); polaridade do cido nucleico (positiva ou negativa); nmero de sequncias nucleotdicas;
existncia de elementos repetidos no genoma; existncia de ismeros do cido nucleico; taxa de
G/C do genoma e existncia de terminais cap ou poli(A), no RNA mensageiro (RNAm)
Protenas: nmero, tamanho e atividade de protenas estruturais e no estruturais; sequncia de
aminocidos; tipo de glicosilao, fosforilao, miristilao e estrutura tridimensional da
protena
Lipdios e carboidratos: composio e teor dos lipdios e acares existentes
Replicao viral e organizao gnica: tipo de cido nucleico; estratgia de replicao; nmero e
posio das sequncias de leitura aberta (ORF, open reading frames); caractersticas da
transcrio e traduo; processamento ps-traducional; local de acmulo de protenas virais;
local de montagem; maturao e liberao da partcula viral
Propriedades antignicas: relaes sorolgicas obtidas de centros de referncias

Propriedades biolgicas: hospedeiro natural; modo de transmisso na natureza; vetores;


distribuio geogrfica; patogenicidade; tropismo; patologias e histopatologias
Sensibilidade a agentes fsicos e qumicos: de modo geral, os vrus so bastante sensveis
inativao qumica e fsica. Os vrus envelopados contm lipdios importantes para a integridade
da partcula e glicoprotenas essenciais para a infecciosidade. Todos os agentes qumicos e/ou
fsicos que dissolvem essa camada lipdica ou que produzem radicais livres entre as ligaes de
carbono diminuem ou eliminam a infecciosidade. Dentre os agentes qumicos, ressaltam-se todos
os solventes orgnicos que dissolvam lipdios, detergentes aninicos e catinicos que alterem as
cargas das glicoprotenas de superfcie, cidos e bases inorgnicas e orgnicas. Os agentes
fsicos mais utilizados para inativao so o calor e as radiaes ionizantes.

Taxonomia dos vrus


Nomenclatura oficial
A palavra empregada para designar famlia, subfamlia e gnero deve ser impressa em itlico ou
sublinhada com a primeira letra maiscula. Decidiu-se que a nomenclatura no usaria dois nomes
latinizados como feito para bactrias. At a penltima atualizao do ICTV, as designaes de
espcie no deveriam iniciar com letra maiscula (somente se o nome for derivado de um lugar, um
determinado hospedeiro com nome prprio ou do prprio gnero) e no deveriam ser escritas em
itlico. Na atualizao de 2014, as normas para a grafia dos nomes das espcies (How to write virus
names, ICTV, 2014) foram modificadas: os nomes das espcies segundo recomendao do ICTV,
2014, agora so escritos em itlico e a primeira letra maiscula, por exemplo, Measles virus.
Entretanto, esta recomendao para a lngua inglesa. Para o portugus, ainda h necessidade de
padronizao aps discusso entre a comunidade de virologistas brasileiros. Sendo assim, no
decorrer dos captulos seguintes, ainda ser utilizada a nomenclatura antiga.
A seguir, h alguns exemplos utilizando a nova grafia das espcies (em parntese, a grafia usual):
Famlia Poxviridae, subfamlia Chordopoxvirinae, gnero Orthopoxvirus, espcie Vaccinia virus
(vrus da vaccnia)
Famlia Herpesviridae, subfamlia Alphaherpesvirinae, gnero Simplexvirus, espcie Human
herpesvirus 2 (vrus herpes simplex tipo 2)
Famlia Picornaviridae, gnero Enterovirus, espcie Enterovirus C (poliovrus tipos 1, 2 e 3)
Ordem Mononegavirales, famlia Rhabdoviridae, gnero Lyssavirus, espcie Rabies virus (vrus
da raiva)
Famlia Totiviridae, gnero Totivirus, espcie Saccharomyes cerevisae virus L-A (vrus L-A do
Saccharomyces cerevisiae). Nesse caso, para designar espcie, o nome latino no escrito em
itlico mesmo que seja formado pela notao binomial originalmente escrita em itlico.

Nomenclatura vernacular ou informal


No uso informal, os nomes de famlia, subfamlia, gnero e espcie podem ser escritos em fonte
Times New Roman, sem a necessidade de ser em letras maisculas ou em itlico. Alm disso, o
nome no precisa estar com os sufixos referentes e pode vir da seguinte maneira: a famlia
picornaviridae, o gnero enterovrus, etc.

Ordem viral
As ordens virais representam agrupamentos de famlias de vrus que compartilham caractersticas
comuns. As ordens so reconhecidas pelo sufixo virales. De acordo com a atualizao de 2013 do
ICTV (2014), foram aprovadas 7 ordens: Caudovirales (famlias Myoviridae, Podoviridae e
Siphoviridae); Herpesvirales (famlias Alloherpesviridae, Herpesviridae e Malacoherpesviridae);
Ligamenvirales (famlias Lipothrixviridae e Rudiviridae); Mononegavirales (famlias
Bornaviridae, Filoviridae, Nyamivivadat, Paramyxoviridae e Rhabdoviridae); Nidovirales
(famlias Arteriviridae, Coronaviridae, Mesoniviridae e Roniviridae); Picornavirales (famlias
Dicistroviridae, Iflaviridae, Marnaviridae, Picornaviridae, Secoviridae); e Tymovirales (famlias
Alphaflexiviridae, Betaflexiviridae, Gammaflexiviridae e Tymoviridae e mais 78 famlias que ainda
no esto alocadas em nenhuma ordem).

Famlia e subfamlia viral


As famlias de vrus so representadas como um agrupamento de gneros virais que
compartilham caractersticas comuns e distintas de outros membros de outras famlias. Reconhece-se
a famlia pelo sufixo viridae; esse nvel da taxonomia estvel e a marca principal de todo
sistema internacional para taxonomia de vrus. A maioria das famlias compartilha morfologias
virais, estrutura genmica e/ou estratgias de replicao distintas, indicando uma grande separao
filogentica. Ao mesmo tempo, as famlias virais so reconhecidas como um fator de unio de vrus
com caractersticas filogenticas comuns, ainda que sejam filogeneticamente distantes. Em quatro
famlias, notadamente Poxviridae, Herpesviridae, Parvoviridae e Paramyxoviridae, as subfamlias
foram introduzidas devido ao reconhecimento de uma complexidade filogentica maior entre seus
membros. As subfamlias so reconhecidas pelo sufixo virinae.

Gnero viral
Os gneros representam um agrupamento de espcies que compartilham caractersticas comuns e
que so distintas de outros membros de outros gneros. O gnero reconhecido pelo sufixo virus.
Esse nvel da hierarquia tambm estvel, sendo tambm considerado como um marco dessa

taxonomia. Os critrios usados para criar os gneros diferem de famlia para famlia; quanto mais
vrus so descobertos, maior a presso para utilizar como critrio de enquadramento as pequenas
variaes genticas e estruturais nos novos gneros.

Espcie viral
As espcies so consideradas as mais importantes dentro da classificao hierrquica; contudo,
pelo menos para os vrus, so mais difceis de definir. Aps anos de controvrsia, em 1991, o ICTV
aceitou a definio de espcie viral, proposta por van Regenmortel: a espcie viral definida como
uma classe constituda de uma estirpe de replicao com um nicho ecolgico particular. Membros
de uma espcie so definidos por mais de uma propriedade, com a vantagem da acomodao da
variabilidade gentica dos vrus, sem depender de uma nica caracterstica. Apesar disso, os
pesquisadores ainda encontram dificuldade em denominar como espcie, subespcie, estirpe ou
variante.
Os grupos de estudo do ICTV determinaram propriedades mais especficas para definir a espcie
viral, e enfatizaram as diferenas genmicas ou estruturais, fsico-qumicas ou sorolgicas. Em sua
atualizao realizada em 2013, o ICTV priorizou a estrutura genmica dos vrus. O nome
acompanhado do termo vrus, como a espcie poliovrus 1.

Infeces subvirais
Com o aumento do conhecimento sobre a constituio dos vrus, no nvel molecular, tornou-se
claro que existem vrios agentes infecciosos que so ainda menores que os vrus.

Vrus-satlites
Um vrus-satlite contm cido nucleico incompleto, sendo necessrio outro vrus para
completar seu ciclo replicativo. Os vrus associados ao adenovrus (AAV) so um exemplo para ter
sua replicao efetivada, necessitam da coinfeco com um adenovrus ou herpesvrus. A funo
auxiliar (helper) desses vrus varia de um sistema para outro.

Viroides
Os viroides costumam apresentar genomas maiores (1.600 bases) em comparao com os
virusoides, e causam doenas em plantas. So constitudos de RNAfs circular, com uma pronunciada
estrutura secundria, em que algumas regies pareiam com outras. Alm disso, no codificam
protenas, mas podem replicar seu genoma independentemente do vrus helper. Replicam-se no
ncleo da clula com o auxlio das protenas celulares, sem que, em nenhum estgio, faam a sntese

de DNA ou protenas. A enzima que replica o RNA do viroide a RNA polimerase II celular
(anteriormente denominada polimerase DNA dependente), que normalmente replica RNA a partir de
DNA; no entanto, nesse caso, devido estrutura secundria da molcula, faz essa replicao
incomum.
Em 1980, o antgeno delta foi reconhecido como um componente de um novo vrus, o vrus da
hepatite delta ou HDV, que necessitava da coinfeco pelo vrus da hepatite B (HBV) para a sua
replicao. Atualmente, sabe-se que o HDV usa o HBsAg do HBV em sua estrutura. O HDV est
relacionado com os viroides, virusoides e vrus-satlites de plantas; no entanto, devido a suas
caractersticas peculiares, no pode ser classificado como nenhum desses agentes (ver Captulo 16).

Vrus defectivos
Muitos vrus com genoma de RNA e alguns vrus de DNA, como os adenovrus, produzem
partculas defectivas interferentes (DI, defective interfering) quando h alta multiplicidade de
infeco, isto , quando se inocula grande quantidade de vrus na clula hospedeira. As partculas
defectivas contm genomas incompletos ou defectivos, replicam-se somente se outro vrus completo
infectar a mesma clula, mas em maior velocidade devido ao tamanho reduzido. As partculas DI so
importantes porque estabelecem infeces persistentes, alterando o curso da infeco e interferindo
na replicao completa da partcula. Todas essas partculas so muito similares s parentais
completas e existem como uma populao mista.

Elementos genticos mveis


Estudos com bactrias mostraram que alguns elementos genticos replicativos ou plasmdeos
poderiam se transferir de uma clula para outra. Outros elementos mveis se integram no genoma da
bactria e so denominados transposons. As clulas eucariticas podem apresentar um equivalente
aos plasmdeos, que so os epissomas resultantes da replicao de alguns vrus.

Prions
Os prions foram descritos em 1982, pelo ganhador do Prmio Nobel de Fisiologia ou Medicina
em 1997, Prusiner. A origem da palavra prion proteinaceous infectious only particle e, como
recomendado pelo prprio Stanley, deve ser pronunciada como uma palavra oxtona. Os prions so
agentes subvirais inteiramente diferentes dos elementos descritos anteriormente, pois se compem
somente de protenas (denominadas PrP), sem qualquer resqucio de cido nucleico, e so muito
resistentes inativao por processos fsicos ou qumicos. So capazes de modificar outras protenas
celulares saudveis em protenas doentes (denominadas PrPS), fazendo o crebro infectado tornar-se

esponjoso e cheio de vacolos. A destruio dessa protena ocorre somente se o material


contaminado for incinerado. So agentes de encefalopatias espongiformes, tanto em humanos quanto
em animais.

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Introduo
Na natureza, os vrus so os principais exemplos de como a replicao e a propagao da
informao gentica podem ser realizadas com o mximo de economia e simplicidade. Diversas
estratgias replicativas foram selecionadas ao longo da coevoluo dos vrus e suas respectivas
clulas hospedeiras. Essas estratgias refletem os diferentes genes codificados pela informao
gentica viral, sua organizao genmica e as interaes estabelecidas entre os cidos nucleicos e
protenas virais com as protenas celulares.
Tanto os eventos de transcrio/traduo quanto os de replicao dos genomas virais dependem,
em maior ou menor grau, dos fatores proteicos das clulas hospedeiras. Para os vrus de DNA
discutidos nesta seo, o evento de traduo, seguido pelo de transcrio (com exceo dos poxvrus
que codificam sua prpria transcriptase), o mais dependente da maquinaria celular. Assim sendo,
os genomas virais devem apresentar sequncias sinalizadoras de traduo, transcrio e replicao
comuns aos genes e elementos de replicao celulares.
Evolutivamente, nos genomas virais, foram selecionadas combinaes de sequncias
sinalizadoras que fazem com que essas regies genmicas sejam mais eficientes do que as
contrapartidas celulares. Alm disso, protenas virais que respondem de maneira especfica e
eficiente a esses sinais, seja sozinhas ou estabelecendo interaes com fatores de
transcrio/traduo celulares, foram adquiridas/selecionadas ao longo da evoluo. Essas
inovaes virais garantiram, na maioria das vezes, durante o ciclo replicativo viral, a eficincia da
sntese dos constituintes dos vrus em detrimento das funes metablicas originais das clulas
hospedeiras.
Uma das caractersticas mais marcantes com relao s estratgias de replicao dos diversos
vrus presentes na natureza o modo como, na maioria dos casos, tamanhos to reduzidos de
informao gentica (que variam de aproximadamente 1.800 bases nucleotdicas para os menores
genomas, at 2,5 milhes de bases nos pandoravrus, que o maior genoma viral j caracterizado
(Figura 4.1) levam expresso de um nmero significativo de genes que so suficientes para

subverter a maquinaria de sntese celular para a execuo de seus programas genticos.

Figura 4.1 Comparao entre os tamanhos dos genomas virais e dos genomas dos demais organismos uni- e
multicelulares. As barras desenhadas sobre a escala representam os tamanhos j registrados do menor ao maior genoma
de cada um dos grupos apresentados.

Diversos mecanismos de sobreposio gnica, tais como sntese de poliprotenas, mudanas de


fase de traduo (frameshift), supresso de cdons de parada, entre outros, so empregados durante
a expresso gnica viral nas clulas hospedeiras. Esses mecanismos refletem a plasticidade da
informao gentica dos vrus e garantem a sntese de todas as protenas virais necessrias para que
o ciclo de replicao seja completado e novas partculas infecciosas sejam montadas e liberadas a
partir da clula hospedeira.
A compreenso das estratgias de expresso e replicao da informao gentica viral
importante para o conhecimento sobre os processos biolgicos em geral e especificamente para a
caracterizao das interaes entre os vrus e as clulas hospedeiras. A aquisio desse conjunto de
dados fundamental para o desenvolvimento, por exemplo, de drogas antivirais, estratgias vacinais
e vetores virais para utilizao em terapias gnicas.
Nesta seo, sero abordadas a composio e a organizao dos diferentes genomas virais, as
estratgias de expresso e replicao da informao gnica das principais famlias de vrus que
infectam mamferos e, quando possvel, sero identificados os princpios gerais das estratgias
replicativas, que podem sugerir relaes evolutivas entre os diferentes grupos de vrus.

Organizao dos genomas virais


Quando comparados aos genomas das bactrias, fungos, plantas ou animais, a composio e a
organizao dos genomas virais so as mais variveis na natureza. Diferentemente dos genomas

celulares que so constitudos normalmente por fitas duplas de DNA, os genomas virais existem em
todas as variaes estruturais possveis. Podem ser de fitas simples ou duplas de DNA ou de RNA,
de polaridade positiva, negativa ou ambas (ambivalente, ambisense), de topologia linear ou circular,
alm de serem compostos por um ou mais segmentos genmicos que podem conter informaes
genticas diferentes em cada segmento ou apresentar a mesma informao em ambos os segmentos
(genomas diploides). Dessa maneira, cada uma dessas configuraes refletir-se- em mecanismos
prprios e divergentes de replicao genmica, expresso gnica e montagem de novas partculas
virais. Na Figura 4.2 so apresentadas as caractersticas da composio genmica das diferentes
famlias de vrus que infectam mamferos. A grande diversidade dos vrus com genoma de RNA pode
ser observada na quantidade de diferentes tipos e topologias de molculas de RNA que compem
seus genomas.
As molculas de DNA e de RNA que compem os diferentes genomas virais podem apresentar
ainda modificaes terminais, que serviro como importantes sinais regulatrios para a expresso
gnica e a replicao viral.
Dentre os vrus de RNA de polaridade positiva, nos quais o genoma j o prprio RNA
mensageiro (RNAm), estes podem apresentar diferenas nas modificaes presentes nas extremidade
das molculas de RNA. Enquanto os vrus das famlias Picornaviridae, Caliciviridae e,
possivelmente, Astroviridae apresentam uma protena viral (VPg) covalentemente ligada
extremidade 5, os vrus da famlia Flaviviridae, Togaviridae, Coronaviridae, Arteriviridae e
Retroviridae tm a sua extremidade 5 modificada pela adio da 7-metil-guanosina (cap).
Curiosamente, de todas essas famlias de vrus de RNA de polaridade positiva, somente os
representantes da famlia Flaviviridae no apresentam a cauda poliadenilada poli(A) em sua
extremidade 3. O Quadro 4.1 apresenta um resumo das principais modificaes encontradas nas
terminaes dos genomas de vrus de RNA e de DNA.
De modo geral, os genomas dos vrus de RNA de polaridade positiva variam em nmero de
bases de 7 a 30 kilobases (kb) e apresentam sequncias de leitura abertas (ORF, open reading
frame) sintetizadas como precursores poliproteicos.
Os vrus das famlias Picornaviridae e Flaviviridae contm as ORF referentes s protenas
estruturais organizadas no tero inicial do genoma (extremidade 5) e quelas referentes s protenas
no estruturais nos dois teros terminais do genoma. Essas ORF so flanqueadas por regies no
traduzidas (5UTR e 3UTR) que apresentam complexa estrutura secundria e so essenciais para o
controle dos processos de transcrio e traduo dos genomas.
De maneira contrria, os vrus das famlias Togaviridae, Astroviridae, Arteriviridae,
Caliciviridae e Coronaviridae mostram, nos dois teros iniciais do genoma (extremidade 5), a
codificao para as ORF do precursor poliproteico no estrutural e, no tero restante, a ORF do
precursor poliproteico estrutural. Essas ORF tambm so flanqueadas por regies no traduzidas

(5UTR e 3UTR), cujas estruturas secundrias so importantes sinais regulatrios de traduo e


transcrio desses RNA.
Os vrus constitudos por genomas de RNA de polaridade negativa apresentam, invariavelmente,
em suas extremidades 5 e 3, sequncias lder (leader) e rastreadora (trailer), respectivamente.
Essas sequncias esto presentes tanto nos genomas no segmentados quanto nos segmentados e
apresentam graus variados de complementaridade. A complementaridade entre as extremidades 5 e
3 determina sua aproximao e a circularizao da molcula de RNA genmico, que pode ser to
forte quanto maior for o nvel de complementaridade. Para os genomas no segmentados
(Rhabdoviridae, Paramyxoviridae, Filoviridae e Bornaviridae), as ORF principais esto
distribudas da extremidade 3 para a extremidade 5 do RNA() genmico na seguinte ordem:
protena do nucleocapsdeo (N); fosfoprotena (P), que faz parte do complexo da replicase; protena
de matriz (M); glicoprotena do envelope (G) e RNA polimerase-RNA dependente (RpRd),
denominada L. Nas sequncias presentes entre cada uma dessas ORF, esto localizados importantes
sinais reguladores de incio e trmino de traduo. Existem variaes no tamanho dessas ORF e na
presena de outras ORF que se sobrepe ou intercalam esta sequncia geral, entretanto, esse tipo de
organizao genmica permanece invarivel para os diferentes vrus de genoma no segmentado. Os
vrus da famlia Bornaviridae, apesar de apresentarem organizao genmica similar aos
representantes das demais famlias de vrus de RNA de polaridade negativa, exibem estratgias
nicas de replicao e expresso gnica, que sero discutidas posteriormente.
Para os vrus constitudos por genoma de RNA de fita simples segmentado (Orthomyxoviridae,
Bunyaviridae), cada protena viral codificada por um RNA genmico diferente. Algumas
estratgias de replicao, que sero discutidas posteriormente, levam sntese de duas protenas
diferentes a partir de um mesmo RNA codificante.
Para os vrus com genomas constitudos por fitas duplas de RNA, a fita codificante modificada
pela adio de cap na extremidade 5; contudo, sua extremidade 3, apesar de modificada (presena
de uma base difosfato), no apresenta poliadenilao. Todos os vrus com genomas constitudos por
fitas duplas de RNA apresentam mais de um segmento de RNA genmico (segmentados); assim, cada
protena viral codificada por um dos RNA.

Figura 4.2 Representao da composio genmica das diversas famlias de vrus com representantes que infectam
mamferos. A e B representam, respectivamente, as famlias de vrus cujos genomas so constitudos de DNA ou RNA.
DNAfd = DNA fita dupla; DNAfs = DNA fita simples; RNAfs (+) = RNA fita simples positivo; RNAfs () = RNA fita simples
negativo; RNAfs (+/) = RNA fita simples ambivalente. *O genoma dos hepadnavrus formado por uma fita dupla de DNA
incompleta, cujas extremidades apresentam sequncias repetidas que se ligam por complementaridade, formando uma
estrutura circular no covalente. **Os retrovrus apresentam genoma composto por duas fitas de RNA positivo ligadas pela
extremidade 5. ***Os segmentos genmicos de alguns vrus da famlia Bunyaviridae podem funcionar como ambivalentes,
sendo tanto RNA de polaridade negativa quanto de polaridade positiva.

Quadro 4.1 Resumo das modificaes e estruturas, assim como as caractersticas encontradas nas extremidades 5 e 3 dos genomas
virais.
Famlia

Extremidade 5

Extremidade 3

Picornaviridae

VPg UTR (IRES)

UTR poli(A)

Flaviviridae
Vrus da hepatite C

cap UTR
cap UTR (IRES)

UTR (IRES-like*)

Caliciviridae

VPg UTR

UTR poli(A)

Astroviridae

Poli(A)

Togaviridae

cap UTR

UTR poli(A)

Coronaviridae

cap leader UTR

UTR poli(A)

Arteriviridae

cap UTR

Poli(A)

Rhabdoviridae

trailer**

leader**

Filoviridae

trailer***

leader***

Paramyxoviridae

trailer**

leader**

Bornaviridae

Sequncia complementar ao 3

Sequncia complementar ao 5

Orthomyxoviridae

NCR

NCR

Arenaviridae

Sequncia complementar ao 3

Sequncia complementar ao 5

Reoviridae

cap no RNAm

Base difosfato
(podendo estar bloqueado)

Retroviridae

cap no RNAm
5 LTR DNA

Poli(A) RNAm
3 LTR DNA

Hepadnaviridae

Adenoviridae

Repeties terminais invertidas

Repeties terminais invertidas

Parvoviridae

Repeties terminais

Repeties terminais

Herpesviridae

Repeties terminais

Repeties terminais

Poxviridae

Repeties terminais

Repeties terminais

UTR = untranslated regions; R = regies de redundncia de sequncia; IRES = internal ribosome entry site (stio interno de
entrada de ribossomas); VPg = viral protein genome linked (protena viral associada ao genoma); NCR = non coding
regions (regies no codificantes); RNAm = RNA mensageiro; LTR = long terminal repeats (estruturas terminais longas e
repetidas); ? = sem definio. *As estruturas secundrias encontradas na extremidade 3 do genoma do vrus da dengue
apresentam grande semelhana com a estrutura IRES dos picornavrus. **Sequncias trailer (rastreadora) e leader (lder)
apresentam algum nvel de complementariedade. *** Sequncias trailer (rastreadora) e leader (lder) apresentam alto nvel
de complementariedade. Elementos complementares. Podem estabelecer ligaes que levam circularizao dos RNA.

Terminaes longas repetidas presentes no genoma de DNA.

Os vrus classificados na famlia Arenaviridae so nicos em sua constituio genmica, uma vez
que cada um dos seus dois segmentos de RNA leva expresso de duas protenas diferentes. Uma
delas traduzida a partir do RNAm transcrito a partir da extremidade 3 do RNA genmico, enquanto
a outra protena traduzida a partir da extremidade 5 do prprio RNA genmico (RNA
ambivalentes). No entanto, o RNA genmico no serve como molde para a traduo proteica logo
aps a entrada do vrus na clula hospedeira; o primeiro evento direcionado pelos RNA genmicos
a transcrio de RNAm subgenmicos a partir das extremidades 3.
Assim como nos vrus com genomas constitudos por molculas de RNA, as diferentes famlias
de vrus com genomas constitudos por molculas de DNA tambm apresentam organizao genmica
variada. Uma caracterstica comum, entretanto, a presena de sequncias promotoras, em cis, que
iro determinar a transcrio dos RNAm virais. Alm disso, alguns genomas apresentam sequncias
de ntrons intercalantes s regies exnicas codificantes. Tais ntrons so removidos por splicing
pela maquinaria celular de processamento e, dessa maneira, nos genomas desses vrus, h sinais de
reconhecimento de locais de splicing comuns ao prprio genoma das clulas hospedeiras desses
vrus (p. ex., Adenoviridae, Herpesviridae). A existncia de origens de replicao nos genomas dos
vrus de DNA um requerimento bsico para que sejam reconhecidos pelo complexo das DNA
polimerases virais ou celulares e para que se inicie o processo de replicao.
Uma importante observao que surge das comparaes entre as diferentes caractersticas dos
genomas virais, e consequentemente de suas diferentes estratgias replicativas, a possibilidade de
serem traados paralelos evolutivos entre as distintas famlias virais uma noo que ser melhor
explorada ao longo deste captulo.

Estratgias de replicao e expresso dos vrus contendo genoma de DNA


Com exceo dos vrus das famlias Poxviridae, Asfarviridae e Iridoviridae, todos os vrus com
genomas constitudos por DNA apresentam replicao nuclear. Eles apresentam grande variao
relacionada com o tamanho de seus genomas (de 1,8 kb nos circovrus at 2,5 milhes de bases [Mb]
nos pandoravrus) e, consequentemente, h grandes diferenas com relao sua capacidade

codificante, principalmente no que se refere quantidade de funes necessrias para a replicao


viral que esto codificadas em seus prprios genomas. Dessa maneira, os vrus das famlias
Polyomaviridae, Papillomaviridae e Parvoviridae dependem das maquinarias de transcrio e
traduo celulares para a expresso e replicao de seus genomas. A consequncia dessa
dependncia que, uma vez que as clulas apresentem mecanismos de controle do incio da diviso
celular, tais vrus iro depender da entrada espontnea da clula na fase S do ciclo celular para que
ocorra a replicao de seus genomas (Parvoviridae); ou ento, devero codificar um gene ou genes
que induziro a clula a entrar em diviso celular (Papillomaviridae, Polyomaviridae). Esses
produtos gnicos geralmente inibem a funo das duas mais importantes protenas supressoras de
tumor celular (pRB e p53). A desativao da protena pRB, por exemplo, induz a expresso das DNA
polimerases celulares e enzimas que participam das vias de sntese de desoxinucleotdeos trifosfato
(dNTP). A expresso desses genes ser fundamental para a replicao dos genomas virais. Os
produtos gnicos virais que induzem a diviso celular so considerados oncogenes, uma vez que
levam perda dos controles celulares de entrada e progresso no ciclo celular.
Por outro lado, os vrus com genomas constitudos por extensas molculas de DNA
(Herpesviridae, Poxviridae) mostram grande capacidade codificante e, em seus genomas, esto
contidas as informaes para a sntese de suas prprias DNA polimerases e ainda de enzimas
necessrias para a sntese e modificao de dNTP. Igualmente, no genoma desses vrus esto
codificados fatores de transcrio (Herpesviridae), que iro competir intensamente com os
promotores dos genes celulares pela maquinaria de transcrio e, assim, induzir uma forte
transcrio a partir dos promotores virais. No caso dos vrus da famlia Poxviridae, uma vez que
todo o ciclo de replicao ocorre no citoplasma celular, no genoma destes vrus est codificada sua
prpria RNA polimerase e fatores proteicos que iro compor o complexo de transcrio viral,
demonstrando completa independncia das maquinarias celulares de transcrio e replicao.
Uma exceo importante dos vrus com genomas constitudos por molculas pequenas de DNA
so os Hepadnavrus, os quais, apesar de apresentarem limitada capacidade codificante (genoma
contendo aproximadamente 3 kb), contm sua prpria replicase, que, nesse caso, uma DNA
polimerase-RNA dependente (transcriptase reversa). A existncia dessa enzima determina uma
estratgia replicativa nica para esses vrus.

Famlias Parvoviridae, Polyomaviridae e Papillomaviridae


Os eventos que se seguem entrada dos vrus na clula hospedeira determinam a migrao do
genoma desses vrus para o ncleo celular. Apesar das diferenas nas estratgias de replicao
existentes entre os membros de cada uma dessas famlias de vrus, seu ciclo replicativo pode ser
dividido em duas fases: pr-replicativa, em que o evento principal a expresso de um subgrupo de
genes denominados genes iniciais; e de replicao, em que os eventos principais so a expresso dos

genes tardios e propriamente a sntese de novas cpias de DNA genmico. Essas cpias sero
empacotadas nas novas partculas virais que iro sair da clula infectada e reiniciar o ciclo de
replicao em outras clulas-alvo.
No caso dos parvovrus, que so constitudos por uma fita simples de DNA, o prximo evento do
ciclo replicativo, aps a chegada do DNA genmico ao ncleo celular, a sntese da molcula
complementar de DNA, o que depende da entrada espontnea da clula na fase S do ciclo de diviso
celular. Aps a sntese da molcula complementar de DNA, a fita dupla assume uma conformao de
grampo (hairpin) e os promotores dos genes iniciais (NS1 e NS2) so reconhecidos pela maquinaria
de transcrio celular. Os transcritos NS1 e NS2 sofrem eventos de processamento por splicing, com
a retirada de pelo menos um pequeno ntron, para a formao dos RNAm maduros; os RNAm virais
iniciais sero molde para a traduo de protenas no estruturais.
As protenas no estruturais exibem sinais de localizao nuclear e ali participaro na prxima
etapa de transcrio dos genes virais tardios e estimularo a replicao do DNA viral para dar
origem a cpias de DNA genmico. Os transcritos tardios sero os moldes das protenas estruturais
(VP1 e VP2) e seus sinais de localizao nuclear determinaro o local de montagem das novas
partculas virais no ncleo celular. A protena do capsdeo VP2 apresenta, alm do sinal de
localizao nuclear, um sinal de transporte a partir do ncleo, o qual, possivelmente, determina o
transporte das partculas virais recm-montadas atravs dos poros nucleares.
A replicao do DNA viral feita por um mecanismo denominado rolling-hairpin, no qual,
inicialmente, a estrutura intermediria da fita dupla de DNA (em formato de um grampo fechado)
processada por corte prximo extremidade 3 pela protena viral NS1, que se torna covalentemente
ligada extremidade 5 da fita de DNA original. Assim, a extremidade 3 serve como iniciador e a
DNA polimerase completa a sntese da fita de DNA complementar, formando uma nova estrutura
palindrmica no terminal 3. Desse modo, a sntese pode prosseguir em ambas as fitas-molde,
produzindo estruturas concatenadas que sero posteriormente separadas durante a etapa de
empacotamento do genoma viral. interessante citar que este o mesmo processo de replicao que
acontece com o genoma dos poxvrus.
As estratgias de expresso gnica e replicao dos poliomavrus e papilomavrus tambm
podem ter como base a expresso de um subconjunto de genes que codificam protenas no
estruturais (p. ex., antgeno T maior nos poliomavrus) expressas na fase pr-replicativa e a posterior
induo, pelas protenas no estruturais, da expresso dos genes que codificam as protenas
estruturais e da sntese das enzimas celulares que iro participar da replicao do DNA viral (Figura
4.3). Como citado anteriormente, a induo da sntese das enzimas celulares envolvidas na
replicao do DNA realizada a partir da inibio da funo de protenas celulares-chave,
primordiais no controle do ciclo de diviso celular. Assim, em clulas infectadas de maneira
persistente, a expresso constante dos genes virais iniciais pode levar a transformaes neoplsicas
e induo de tumores no organismo infectado.

A replicao do DNA desses vrus (poliomavrus e papilomavrus) realizada por mecanismo


muito similar ao de replicao dos cromossomas celulares. Formam-se duas forquilhas de replicao
na sequncia ori (origem) presente no DNA genmico circular desses vrus (regio rica em AT) com
a polimerizao de iniciadores de RNA e a sntese das fitas contnua e descontnua de maneira
bidirecional.

Famlias Adenoviridae, Herpesviridae e Poxviridae


A maior capacidade codificante dos adenoviridae, herpesviridae e poxvrus garante maior
independncia dos genomas desses vrus, tanto para a expresso gnica quanto para a replicao do
DNA genmico. Alm disso, esses vrus codificam um grupo de genes envolvidos na supresso da
resposta antiviral celular e na inibio do processo de apoptose que, na maioria das vezes,
deflagrado na clula infectada em resposta presena de intermedirios de sntese viral. Enquanto o
ciclo replicativo dos herpesvrus e adenovrus acontece dentro do ncleo da clula infectada, o dos
poxvrus acontece inteiramente no citoplasma celular.

Figura 4.3 Esquema geral da estratgia de replicao dos vrus de DNA. Durante o ciclo replicativo dos vrus de DNA, os
eventos acontecem em cascata; portanto, a prxima etapa do ciclo ocorre somente se a anterior tiver sido completada de
maneira bem-sucedida. Nesse esquema, esto representadas as fases inicial e tardia do ciclo replicativo dos poliomavrus,
papillomavrus e parvovrus. A estratgia de replicao dos hepadnavrus uma exceo a esse esquema geral. Aps a ida
do genoma viral para o ncleo da clula-alvo, fatores de transcrio virais que fazem parte da partcula viral, e tambm so
direcionados ao ncleo no incio da infeco, iniciam a transcrio dos genes virais iniciais que geram RNAm iniciais (1).
Os produtos desses genes voltam ao ncleo (2) e ali estimulam a transcrio de RNAm tardios (3) e atuam sobre
promotores celulares, levando transcrio de genes envolvidos na replicao do DNA (4). No caso dos poxvrus,
adenovrus e herpesvrus, os genes iniciais so responsveis pelo estmulo da transcrio dos genes intermedirios
(incluindo a DNA polimerase viral), e alguns desses genes intermedirios estimulam a transcrio dos genes tardios. Aps
o incio da sntese das protenas envolvidas com a replicao do DNA, o genoma viral ento replicado; os produtos dos
genes tardios voltam ao ncleo (5) e, nesse stio, ocorre a montagem de novas partculas virais contendo o DNA genmico
recm-replicado. Detalhes a respeito das diferenas da estratgia replicativa para cada famlia viral esto presentes no
texto.

De maneira semelhante para as famlias de vrus citadas anteriormente, o primeiro evento da


biossntese viral, aps a localizao dos genomas virais nos seus respectivos locais de replicao,
a induo da transcrio de um subconjunto de genes iniciais. No caso especfico dos herpesvrus, a
circularizao do DNA genmico viral um evento anterior transcrio dos genes iniciais. Ainda
para essa famlia de vrus, a presena de um fator transcricional viral que se liga aos promotores dos
genes iniciais fundamental para a ativao da transcrio desses genes pela RNA polimerase II
(RNA pol II) celular. Esse fator de transcrio faz parte do subconjunto de genes virais tardios,
empacotado na matriz proteica amorfa dos vrions e igualmente transportado para o ncleo da
clula infectada quando acontece a entrada e o desnudamento (desencapsidao) viral (Figura 4.3).
Para os poxvrus, a transcrio dos genes iniciais feita pelas prprias transcriptases virais e
eles tambm trazem no vrion produtos dos genes tardios que serviro de fatores de transcrio dos
genes iniciais.
No caso dos adenovrus, um conjunto de genes de supresso da produo de interferon tambm
expresso na fase inicial do ciclo, mas a transcrio desses genes feita pela RNA polimerase III
celular.
A expresso dos subconjuntos de genes iniciais desses vrus induz a expresso dos subconjuntos
de genes intermedirios (no caso dos herpesvrus e poxvrus) e dos genes tardios (no caso dos
adenovrus). As protenas iniciais tm funes diversas, tais como: de fatores de transcrio (ativam
os promotores dos genes intermedirios), inibidores da apoptose celular ou, ainda, so a prpria
DNA polimerase viral e as enzimas de sntese de intermedirios de dNTP, no caso de adeno e
poxvrus.
Com o acmulo das protenas da fase intermediria, ocorre a estimulao da transcrio dos
subconjuntos de genes tardios. Nos herpesvrus, fazem parte do conjunto de protenas de fase
intermediria, alm dos fatores de transcrio dos genes tardios, a DNA polimerase viral e as
enzimas que participam da sntese de dNTP. Nessa fase, ento, inicia-se a replicao do DNA viral.
O ciclo replicativo desses vrus chega ento fase tardia com o acmulo das protenas desta fase
e de molculas de DNA genmico recm-sintetizadas. As protenas de fase tardia so principalmente
estruturais, responsveis pela montagem das novas partculas virais. As molculas do DNA
genmico so empacotadas, havendo para os DNA que so replicados pela formao de estruturas
concatenadas (herpesvrus e poxvrus) a separao de tais estruturas durante seu empacotamento.
Algumas protenas de fase tardia so fatores de transcrio que sero empacotados juntamente com
as novas partculas virais e atuaro na fase inicial do ciclo replicativo viral na prxima clula-alvo.
Apesar das diferenas que existem para cada uma das famlias de vrus DNA apresentadas
anteriormente, pode-se perceber que o ponto comum das estratgias replicativas, durante a fase
inicial, tem como base a expresso de quantidades catalticas de protenas no estruturais necessrias
para a replicao do DNA viral e a modulao da expresso gnica celular. Aps a replicao do

DNA viral, um subconjunto diferente de genes expresso (genes tardios) em quantidades


estequiomtricas das protenas estruturais necessrias para a montagem de novas partculas virais.
Em geral, a expresso dos genes iniciais reprimida nessa fase. A mudana de fase inicial para fase
tardia pode ser entendida como uma estratgia adaptativa que traz aos vrus a vantagem de
competirem com a maquinaria de transcrio e traduo da clula hospedeira, uma vez que a taxa de
sntese dos genes iniciais modesta, enquanto a taxa de sntese dos genes tardios (e dos genes
intermedirios em herpesvrus e poxvrus) durante a fase ps-replicativa robusta, devido grande
amplificao do nmero de cpias genmicas. Desse modo, a informao gentica dos vrus ser
preferencialmente transcrita e traduzida, em detrimento da informao gentica celular.
Alm disso, os promotores dos genes intermedirios/tardios virais apresentam, alm das
sequncias promotoras normais, sequncias potencializadoras (enhancers) que aumentam a afinidade
da maquinaria de transcrio celular por estes promotores. Os herpesvrus e os poxvrus exibem
ainda estratgias de interrupo da sntese proteica celular por meio da induo do aumento da taxa
de degradao dos RNAm. Mesmo que isso no seja especfico para os RNAm celulares, os RNAm
virais sero ressintetizados em uma taxa muito superior, resultando na supresso especfica da
sntese proteica celular.

Famlia Hepadnaviridae
Os hepadnavrus so os que mais se distinguem dos vrus com genoma de DNA em sua estratgia
de replicao. Esses vrus codificam sua prpria replicase, que , ao contrrio dos demais vrus de
DNA, uma DNA polimerase que utiliza uma molcula de RNA como molde (ou seja, exerce
atividade de transcriptase reversa). Para esses vrus, a transcrio de seus genes ocorre no ncleo,
porm a replicao do DNA genmico ocorre no citoplasma das clulas infectadas.
O genoma dos hepadnavrus uma fita dupla de DNA incompleta, cuja extenso do final da fita
codificante no concluda durante o processo de replicao do DNA genmico. Quando as
partculas virais infectam uma nova clula, a fita dupla de DNA incompleta, associada s protenas
do capsdeo, direcionada ao ncleo celular e, ali, a sntese da fita de DNA codificante
completada e as extremidades da fita dupla so covalentemente ligadas, formando o que conhecido
como crculo covalentemente fechado (ccc). Na maioria das vezes, o DNA viral est associado a
histonas e outras protenas, e mantido no ncleo celular de maneira epissomal. A estrutura ccc
transcricionalmente ativa, e o reconhecimento dos quatro diferentes promotores dos genes virais
ocasiona a transcrio dos RNAm virais pela RNA pol II celular. So sintetizados RNAm de 3,5;
2,4; 2,1 e 0,8 kb, que sero moldes para as protenas. Os RNAm de 3,5 kb sero moldes para as
protenas pr-C ou C (capsdeo) ou C + Pol (capsdeo e polimerase). Uma vez que o promotor
desses transcritos no apresenta a sequncia TATA box, existir heterogeneidade do tamanho da
extremidade 5 do RNAm, o que resultar na sntese de RNAm para as diferentes protenas citadas

anteriormente. Essa espcie de transcrito de 3,5 kb ainda o RNA pr-genmico. Os RNAm de 2,4
kb sero moldes para a protena pr-S1 (glicoprotena maior do envelope ou Large). Os RNAm de
2,1 kb apresentaro heterogeneidade do tamanho da extremidade 5 e podero ser moldes para as
protenas pr-S (M e S, glicoprotenas mdia e menor do envelope). Os RNAm de 0,8 kb sero
moldes para a protena viral X, que apresenta vrias funes regulatrias na clula hospedeira. Alm
dos dois promotores presentes no genoma dos hepadnavrus que determinam a transcrio dos RNAm
virais, existem ainda dois elementos potencializadores (enhancers), um para cada promotor, que
aumentam a taxa de sntese a partir de cada promotor em resposta presena de fatores celulares
especficos.
A presena do RNA pr-genmico no citoplasma da clula infectada, juntamente com o acmulo
das protenas do capsdeo e polimerase, determinar o empacotamento dos primeiros em estruturas
capsdicas e dentro deste microambiente acontecer a transcrio reversa do molde de RNA em uma
fita dupla incompleta de DNA. Uma vez completada essa fase, os novos vrions iro sair da clula
para reiniciar o ciclo em uma nova clula-alvo.
A utilizao de uma estratgia de transcrio reversa do RNA pr-genmico para a replicao do
DNA viral pelos hepadnavrus pode ser sugerida como uma adaptao evolutiva, que garante a esses
vrus a possibilidade de acumular mutaes em uma taxa muito maior do que as observadas em vrus
com genoma DNA. Tais mutaes favorecem a rpida adaptao desses vrus s mudanas das
condies das clulas hospedeiras, beneficiando, consequentemente, sua manuteno na natureza e a
possibilidade de explorar novos hospedeiros.

Estratgias de replicao e expresso dos vrus contendo genoma de RNA


Os vrus com genoma constitudo por RNA so considerados nicos em suas estratgias
replicativas, uma vez que suas replicases so as nicas na natureza que sintetizam molculas de RNA
a partir de moldes de RNA. H evidncias de que a RNA pol II de clulas eucariticas pode
apresentar atividade de sntese de RNA a partir de moldes de RNA (RNA polimerase-RNA
dependente, RpRd), uma vez que essa j foi, por exemplo, implicada na replicao do genoma de
RNA dos vrus da hepatite delta (HDV). No entanto, a demonstrao de tal atividade ainda
controversa. Estudos in vitro utilizando a enzima altamente purificada demonstraram um baixo
desempenho da RNA pol II quando um molde de RNA foi utilizado. Entretanto, a demonstrao de tal
atividade residual da RNA pol II de eucariotos poder sugerir a aquisio da enzima ancestral, com
atividade RpRd completa, durante a evoluo dos vrus de RNA a partir das clulas eucariticas.
Trs estratgias de replicao distintas podem ser identificadas nos vrus de RNA. Elas esto
relacionadas com a polaridade do RNA genmico e com a presena, na partcula viral, de uma
replicase com atividade de DNA polimerase a partir de moldes de RNA. Os vrus de RNA de
polaridade positiva, cujo genoma a prpria molcula de RNAm (com exceo dos retrovrus), no

empacotam a replicase viral, uma vez que, ao ficar disponvel no citoplasma das clulas
hospedeiras, o genoma leva sntese imediata das protenas virais. Os vrus com genoma de RNA de
polaridade negativa necessitam empacotar sua prpria polimerase nas novas partculas virais, uma
vez que o RNA genmico ser inicialmente transcrito dentro das clulas, produzindo, ento, espcies
de RNAm que sero moldes para a sntese das protenas virais.
Apesar da diferena bsica entre as estratgias replicativas dos vrus de RNA de polaridade
positiva e negativa, um fator comum a ambos os grupos sempre identificado nas clulas infectadas:
a replicao dos RNA virais acontece em associao ntima a membranas celulares, exceo feita
queles vrus que tm replicao nuclear (ortomixovrus, bornavrus e retrovrus).
Os retrovrus, apesar de apresentarem genoma de RNA de polaridade positiva, empacotam a
prpria polimerase (transcriptase reversa), que uma vez no citoplasma da clula infectada ir
sintetizar o genoma viral sob a forma de uma fita dupla de DNA. Aps a integrao do DNA viral ao
material gentico da clula hospedeira, poder haver transcrio do RNAm viral e sntese proteica.

Vrus de RNA de polaridade positiva


Em termos quantitativos, os vrus de RNA de polaridade positiva so os mais frequentes na
natureza (Figura 4.2B). Essa observao pode sugerir tanto o surgimento desse tipo de genoma viral
no mundo eucaritico, como tambm maior frequncia de incorporao/fixao de erros durante a
etapa de replicao dos genomas virais observada nesses vrus.
Os mecanismos de replicao do vrus de RNA de polaridade positiva (RNA+) (excetuando os
retrovrus) so os menos complexos dentre todos os vrus de RNA e de DNA. No entanto, as
estratgias de controle de traduo/transcrio e transcrio/replicao so extremamente eficientes
e inovadoras.
A replicao dos vrus de RNA+ pode ser dividida em duas estratgias bsicas:
Traduo da poliprotena viral precursora completa (contendo todas as ORF codificadas pelos
vrus); processamento do precursor por proteases virais; transcrio da fita de RNA
complementar (negativa) pela RpRd viral a partir do molde genmico; transcrio da fita de RNA
genmico (positiva) pela RpRd viral a partir da fita de RNA negativo (Figura 4.4)
Traduo da poliprotena viral precursora contendo somente as protenas no estruturais;
processamento do precursor no estrutural pela protease viral; transcrio da fita de RNA
complementar (negativa) pela RpRd viral a partir do molde genmico; transcrio pela RpRd
viral, a partir da fita de RNA negativo, de RNAm subgenmicos que sero moldes para a traduo
das protenas estruturais; e transcrio da fita de RNA genmico completa pela RpRd viral a
partir da fita de RNA negativo (Figura 4.5).

As famlias de vrus que utilizam a primeira estratgia citada so Picornaviridae e Flaviviridae.


As famlias de vrus que utilizam a segunda estratgia so Togaviridae, Arteriviridae, Astroviridae,
Caliciviridae e Coronaviridae; essa segunda estratgia representa a aquisio de um mecanismo de
controle temporal da sntese de protenas no estruturais versus estruturais. A seleo dessa
estratgia por um maior nmero de genomas virais pode sugerir uma vantagem evolutiva da mesma
para os vrus.

Famlias Picornaviridae e Flaviviridae


A sntese proteica nos picornavrus iniciada a partir do reconhecimento de uma regio de
estrutura secundria complexa, independente de cap, denominada stio interno de entrada de
ribossomas (IRES, internal ribosome entry site), presente na extremidade 5 UTR do genoma desses
vrus. Nos flavivrus, que contm cap na extremidade 5, a traduo iniciada pelo mecanismo
dependente de cap comum aos RNAm da clula hospedeira. As consequncias dessa diferena para a
clula hospedeira e para a eficincia da expresso dos genes virais sero discutidas em outra seo
deste captulo.
O incio e o prosseguimento da traduo das protenas virais dependem de fatores celulares que
reconhecem e se associam s estruturas secundrias no RNAm viral. Uma protena celular importante
para a traduo da poliprotena dos picornavrus a poly(C) binding protein (PCBP), que se associa
ao IRES e favorece a traduo. A participao da protena celular que se liga cauda poliadenilada
(poly(A) binding protein PABP) tambm importante no processo de traduo, pois leva
aproximao das extremidades 5 e 3 do RNAm e aumenta a taxa de sntese proteica. Apesar de a
cauda poli(A) estar ausente no RNAm dos flavivrus, duas regies bem conservadas presentes na
extremidade 3 UTR (uma estrutura CS1, que contm o sinal de circularizao, e a estrutura em
grampo [stem loop, hairpin ou hairpin loop] da extremidade 3 UTR denominada 3 SL) so
responsveis pela aproximao das extremidades 5 e 3 e consequente circularizao do RNAm. A
forma circular do genoma dos flavivrus durante a replicao viral essencial para a traduo da
poliprotena e para a replicao do RNA genmico, como ser discutido adiante.
Em geral, a sntese proteica acontece durante as primeiras trs horas de infeco e leva ao
acmulo das protenas virais no citoplasma da clula infectada. Modificaes ps-traducionais em
determinadas protenas no estruturais virais, ou a presena de trechos de resduos de aminocidos
bsicos nessas protenas, determinaro seu direcionamento para a face citoplasmtica de membranas
internas celulares (retculo endoplasmtico, complexo de Golgi, endossomas modificados, etc.). Na
maioria das vezes, o encaminhamento para estruturas de membrana acontece antes mesmo do
processamento parcial ou total da poliprotena precursora, o que garante a localizao conjunta de
protenas que desempenharo funes complementares ou formaro complexos proteicos funcionais
durante a replicao viral.

Figura 4.4 Modelo de replicao dos vrus de RNA de polaridade positiva. So representados os modelos gerais dos vrus
das famlias Picornaviridae (A) e Flaviviridae (B). A primeira etapa do ciclo replicativo desses vrus a transcrio e a
traduo de uma poliprotena precursora que contm todas as protenas virais. Aps o processamento da poliprotena, para
a transcrio de um RNA complementar de polaridade negativa, a replicase viral (RpRd) utiliza o mesmo RNA positivo que
foi molde para a sntese proteica. O RNA complementar de polaridade negativa ser, por sua vez, molde para a transcrio
de novos RNA genmicos. VPg = protena viral ligada ao genoma; RpRd = RNA polimerase-RNA dependente.

Figura 4.5 Modelo de replicao dos vrus de RNA de polaridade positiva que apresentam RNAm subgenmicos. A primeira
etapa do ciclo replicativo desses vrus a transcrio e a traduo de uma poliprotena precursora que contm somente as
protenas virais no estruturais. Aps o processamento da poliprotena, a replicase viral (RpRd) utiliza o mesmo RNA
positivo, que foi molde para a sntese proteica, para a transcrio de um RNA complementar de polaridade negativa
completo, que, por sua vez, ser molde para a transcrio de RNAm subgenmicos (RNAmsg), que sero moldes para a
traduo das protenas virais estruturais; e transcrio de novos RNA genmicos de polaridade positiva. RpRd = RNA
polimerase-RNA dependente.

Quando a poliprotena viral processada, as protenas no estruturais se associam ao RNAm


viral para o incio da transcrio da fita negativa de RNA, iniciando assim o processo de replicao
do genoma viral (Figura 4.4A).

Uma regulao importante acontece nesse ponto. J foi determinado para os picornavrus que
necessria a interrupo da traduo para que ocorra o incio da transcrio. Quem regula esse
processo de parada da traduo e incio da transcrio a associao da protena precursora viral
3CD (protease + RpRd) estrutura secundria na extremidade 3 UTR, denominada clover leaf
(trevo-de-trs-folhas). Quando a 3CD se liga a essa estrutura e estabelece interaes tanto com a
PABP na 3 UTR quanto com a PCBP na 5 UTR, a traduo inibida. A inibio da traduo
acontece porque a 3CD promove o desligamento da interao da PCBP com o stio IRES presente no
5 UTR e, consequentemente, dele com a cauda poli(A) na extremidade 3.
Dessa maneira, inicia-se a fase de transcrio dos genomas virais. A transcrio acontece em
associao ntima face citoplasmtica de membranas perinucleares. Quem se associa a essas
membranas a precursora 3AB (3A + VPg), que est fortemente associada ao RNAm viral e se liga
em 3CD. Essa ligao determinar a uridinilao do ltimo resduo do aminocido carboxiterminal
de 3B (precursor de VPg), originando assim o iniciador necessrio para a sntese do RNA negativo.
A 3AB ento processada, ficando VPg associada extremidade 5 do RNA recm-sintetizado. As
novas molculas de RNA negativo serviro como molde para a sntese de novos RNAm genmicos
por um processo de formao do iniciador, idntico ao citado para a sntese do RNA negativo. A
existncia das fitas negativas de RNA sempre detectada sob a forma de intermedirios de
replicao, que so formados pela fita negativa mais a fita positiva de RNA.
Durante a fase de replicao, as snteses das novas molculas de RNAm genmico e da fita
negativa complementar ocorrem em uma taxa de cerca de 30 a 70:1. O excesso de RNA genmicos
em relao fita negativa complementar garante quantidades suficientes de protenas virais sendo
sintetizadas e de RNA genmico para empacotamento nos novos vrions.
Nos flavivrus, a circularizao do RNAm genmico igualmente fundamental para o aumento da
taxa de sntese proteica no incio da replicao e para a mudana da fase de traduo para a fase de
transcrio da fita negativa de RNA. As interaes entre as extremidades 5 e 3 da molcula de
RNAm so estabelecidas em cis via estruturas secundrias complementares presentes em cada
extremidade. Conforme o precursor poliproteico se acumula durante a fase de traduo e as protenas
comeam a ser processadas, h o aparecimento da RpRd viral (NSP5). A interrupo da sntese
proteica e o incio da transcrio da fita negativa de RNA so determinados pela ligao da NSP5 a
uma estrutura secundria de grampo (stem loop) presente na extremidade 5 UTR (denominada SLA).
Uma vez associada, a NSP5 transferida para a extremidade 3 do RNAm exclusivamente por
interaes RNA-RNA. As novas molculas de RNA negativo serviro de molde para a sntese de
novos RNAm genmicos (Figura 4.4B). A NSP5 apresenta atividade cap metil-transferase, e
responsvel pela adio da base 7-metil-guanosina extremidade 5 dos RNA recm-sintetizados.
Assim como acontece com os picornavrus, a sntese dos RNAm virais em relao sntese dos
RNA negativos cerca de 10 a 100 vezes maior. Prope-se que a sntese preferencial dos RNAm em
detrimento dos RNA de polaridade negativa seja favorecida pela ligao da NSP5 ao SLA.

Famlias Coronaviridae, Arteriviridae, Togaviridae, Caliciviridae e Astroviridae


A replicao dos coronavrus, arterivrus, togavrus, calicivrus e astrovrus tambm iniciada
com a sntese de uma poliprotena precursora. Esta, porm, contm apenas as protenas no
estruturais (Figura 4.5).
Os precursores proteicos no estruturais podem ser sintetizados a partir de mais de uma ORF
presente no RNAm genmico. Isso acontece, por exemplo, nos alfavrus (famlia Togaviridae), nos
quais as protenas no estruturais so sintetizadas como precursores NSP123 ou NSP1234. A sntese
de cada um desses precursores pode ser controlada por um evento de leitura por meio do cdon de
parada opal (UGA) (read through) ou por supresso deste cdon de terminao opal presente entre a
NSP3 e a NSP4. Ambos os eventos ocorrem com frequncias que variam de 5 a 20%, o que
traduzido em menores quantidades da RpRd NSP4 em relao s demais protenas no estruturais.
Esse mecanismo pode ser considerado um controle da traduo versus transcrio nesses vrus. A
presena do cdon opal entre a NSP3 e a NSP4 relacionada com a persistncia da infeco de
determinados alfavrus em insetos.
Outros vrus utilizam ainda uma estratgia de expresso de mais de uma poliprotena a partir do
mesmo RNAm por meio do mecanismo de mudana de fase de leitura pelo ribossoma (frameshift).
Isso aumenta a capacidade codificante do genoma sem aumentar o nmero de bases nucleotdicas que
o compem. A mudana de leitura do ribossoma normalmente induzida pela presena de complexas
estruturas secundrias (stem loop) e tercirias (pseudoknot), alm de sequncias escorregadias no
RNAm prximo ao stio preferencial de mudana de fase. Quando o ribossoma encontra tal estrutura,
h uma instabilidade na ligao com o molde de RNAm e a localizao dos stios A e P do
ribossoma pode ser deslocada em relao fase de leitura original, reiniciando a sntese proteica na
fase de leitura referente outra protena.
O genoma dos coronavrus, por exemplo, codifica duas ORF de poliprotenas no estruturais
(ORF 1a e ORF 1ab). A ORF1a traduzida preferencialmente a partir do acoplamento do ribossoma
ao AUG inicial, enquanto a ORF1ab traduzida a partir de um evento de frameshift, que, em geral,
tem frequncia baixa (5 a 20%), funcionando dessa maneira como mecanismo de controle das
quantidades relativas das diferentes protenas. O mesmo tipo de regulao da expresso das
protenas no estruturais acontece para as ORF 1a e 1b dos arterivrus.
O mecanismo de controle da parada de sntese proteica e incio da replicao da fita negativa de
RNA dos coronavrus similar ao mecanismo dos picornavrus e envolve a participao da protena
celular PABP. As RpRd virais tambm podem interagir com estruturas secundrias presentes nas
extremidades no traduzidas dos RNAm genmicos. Os RNAm desses vrus so poliadenilados na
extremidade 3 e apresentam a modificao cap na extremidade 5. Excees interessantes so os
calicivrus e possivelmente os astrovrus, que em vez da modicao cap, contm a protena VPg

covalentemente ligada extremidade 5 (Quadro 4.1). Os calicivrus, talvez, possam ser


considerados um intermedirio da evoluo dos vrus de RNA positivos entre os picornavrus e
togavrus, j que sua organizao e composio genmicas so muito semelhantes quelas dos
picornavrus, porm a estratgia de expresso e replicao genmica mais prxima dos togavrus.
A principal distino entre o ciclo replicativo desses vrus e dos picornavrus e flavivrus a
sntese de RNAm subgenmicos pela RpRd viral. Vrios mecanismos de sntese desses RNAm
subgenmicos foram propostos, e eles variam para cada uma das famlias virais. Em geral, os RNAm
subgenmicos dos vrus RNA positivos apresentam a extremidade 3 idntica do RNAm genmico
completo; o que os diferencia dos RNAm genmicos a reduo da extremidade 5, que a traz para
bem prximo do AUG inicial da ORF das protenas estruturais.
Os mecanismos de sntese dos RNAm subgenmicos j descritos para vrus de vertebrados so
sumarizados a seguir:
Incio de sntese interna. Neste mecanismo, a RpRd inicia a sntese da fita positiva subgenmica
em uma sequncia promotora interna presente na fita molde de polaridade negativa
Terminao prematura da sntese da molcula de RNA de polaridade negativa e posterior
utilizao desse molde, do incio ao fim, para a sntese do RNAm subgenmico
Transcrio descontnua do RNAm subgenmico. Nesse mecanismo a RpRd inicia a sntese do
RNAm a partir da extremidade 3 do RNA molde de polaridade negativa, sintetiza um pequeno
trecho, solta do molde e reinicia a sntese mais frente no molde RNA negativo.
Nesses trs mecanismos, o determinante principal que comanda o incio ou reincio da
transcrio do RNAm em regies internas do molde de RNA negativo so sequncias promotoras que
costumam estar presentes na regio 5 (em relao ao RNA positivo), de 6 a 90 nucleotdeos anterior
ao stio +1 de transcrio. Em alguns vrus, esses promotores podem se estender at 140
nucleotdeos aps o stio de iniciao da transcrio.
Os coronavrus e arterivrus apresentam capacidade codificante muito ampliada em comparao
com os togavrus, astrovrus e calicivrus. A RpRd desses ltimos sintetiza um nico tipo de RNAm
subgenmico, geralmente pela presena de promotores na regio 5 anterior ao incio +1 de
transcrico. A RpRd dos primeiros sintetiza um conjunto de pelo menos 7 diferentes RNAm
subgenmicos. Conforme mostrado anteriormente, os mecanismos propostos so diversos. No caso
desses vrus, pode haver a combinao do mecanismo de sntese descontnua do RNAm
subgenmico, uma vez que a sequncia lder presente na extremidade 5 do RNAm genmico
completo est presente em todos os diferentes RNAm subgenmicos, juntamente com o mecanismo de
terminao prematura da sntese da molcula de RNA de polaridade negativa. Foi proposta a sntese
descontnua do RNA negativo em um mecanismo complexo de troca de um molde de RNAm
genmico (doador) para outro (aceptor). Uma vez que cada um dos RNAm subgenmicos apresenta

uma sequncia promotora relacionada, o controle da expresso desses RNAm pode ser feito em nvel
transcricional.

Vrus de RNA de polaridade negativa


A primeira etapa de replicao dos vrus de genoma de RNA de polaridade negativa sempre a
transcrio de RNAm distintos que servem de molde para a sntese das protenas virais (Figura 4.6).
Dessa maneira, os vrions necessariamente carregam o complexo replicase, que composto pela
RpRd, denominada L; uma fosfoprotena, denominada P; e pela protena do nucleocapsdeo,
denominada NP. A protena do nucleocapsdeo participa do complexo replicase, principalmente
como reguladora da mudana da fase de traduo para a fase de replicao do genoma viral durante
o ciclo replicativo. A fosfoprotena forma trmeros e associa a RpRd L protena N.
A transcrio dos RNAm virais regulada pelas sequncias sinalizadoras de incio e trmino de
transcrio presentes, ou entre os genes de cada ORF para os vrus no segmentados, ou pelas
sequncias presentes nas extremidades dos RNA segmentados.
Para alguns dos vrus constitudos por RNA de polaridade negativa, o aumento da capacidade
codificante de seus genomas ocorre devido sobreposio de genes. Os mecanismos que garantem a
expresso de cada um dos genes podem envolver: eventos de processamento por splicing (vrus cujo
stio de replicao o ncleo da clula-alvo); incio da traduo a partir de um AUG diferente
presente na outra ORF que se sobrepe; ou editorao do RNAm pela adio de bases extras, no
originalmente presentes no molde de RNA, em posies especficas do RNAm. Um exemplo da
ocorrncia desses dois ltimos eventos a expresso das protenas P, C e V dos paramixovrus.
Essas protenas so codificadas por uma mesma regio do genoma que se sobrepe. A fosfoprotena
P traduzida a partir do primeiro AUG do RNAm relativo a essa regio genmica. A protena bsica
C sintetizada a partir de um AUG localizado, 19 nucleotdeos aps o AUG inicial de P, e a traduo
a partir desse segundo AUG determina uma fase de leitura diferente. A sntese da protena V ocorre a
partir desse mesmo RNAm; no entanto, a adio de uma riboguanosina (G) extra posio 751
modifica a fase de leitura do RNAm nesse ponto. Assim, nos primeiros 250 aminocidos, P e V so
iguais e, a partir desse ponto, apresentam domnios proteicos distintos.

Vrus de RNA negativo no segmentado


Aps a entrada do RNA genmico na clula-alvo, a primeira etapa da replicao dos vrus com
genomas constitudos por molculas de RNA de fita simples negativo no segmentado a transcrio
dos RNAm virais. Tanto os RNAm codificantes quanto a regio lder so transcritos pelo complexo
proteico formado pela RpRd + L + P. A polimerase L apresenta atividades de polimerizao, adio
de cap e atividade metil-transferase, alm de adio de cauda poli(A). Os diferentes RNAm so

transcritos com taxas diferenciadas, sendo aqueles mais prximos da extremidade 3 do RNA
negativo molde (N; P/C; M) transcritos em maior quantidade do que aqueles mais prximos
extremidade 5 (L). Assim, criado um gradiente de concentrao desses transcritos.

Figura 4.6 Modelo de replicao dos vrus de RNA de polaridade negativa no segmentados. A primeira etapa do ciclo
replicativo desses vrus a transcrio de vrios RNAm que sero moldes para a traduo de todas as protenas virais. A
protena do nucleocapsdeo (N em azul) forma um complexo com a RNA polimerase-RNA dependente (RpRd em
vermelho) e com a fosfoprotena (P em amarelo) e induz a transcrio de um RNA de polaridade positiva completo, que
ento ser molde para a transcrio de novos RNA genmicos.

Conforme nveis mais altos da protena N comecem a ser alcanados, essa protena se liga ao
RNA negativo e replicase L. A ligao de L e N controlada pelo nvel de fosforilao de L,
determinado pela protena P. Cada subunidade de N liga-se a seis nucleotdeos na molcula de RNA.
Foi demonstrado que os genomas de alguns paramixovrus constitudos por nmeros de bases
mltiplos de seis so replicados mais eficientemente. Esse fenmeno foi denominado regra do seis
(rule of six) e significa que quando o RNA negativo e, posteriormente, o RNA antigenmico (RNA+)

esto inteiramente associados protena N, a transcrio dos RNAm interrompida, pois o


complexo da replicase passa a ignorar as regies sinalizadoras de incio e final de transcrio
presentes nas regies intergnicas. A sntese do RNA antigenmico iniciada na regio lder e segue
at o final da regio rastreadora. A associao de N ao RNA antigenmico recm-formado leva
sntese das molculas de RNA genmico.
Os vrus da famlia Bornaviridae (composta por vrus de RNA negativo no segmentado)
apresentam alguns aspectos nicos de estratgia replicativa e de expresso gnica. Esta a nica
famlia de vrus de RNA negativo no segmentado com replicao nuclear. Alm disso, com exceo
da protena N, que traduzida a partir de transcrito nico, as ORF das demais protenas so
sobrepostas (sobreposio das ORF das protenas X e P; sobreposio das ORF das protenas M, G
e L) e a expresso de cada uma das protenas garantida pelo processamento por splicing dos
transcritos precursores.

Vrus de RNA negativo segmentado


Apesar de as estratgias de replicao e expresso gnica dos ortomixovrus e buniavrus serem
muito semelhantes, h uma diferena fundamental entre esses vrus. Para o primeiro, a replicao
acontece no ncleo da clula-alvo; ao passo que, para o segundo, a replicao inteiramente
citoplasmtica.
Nos ortomixovrus, 8 segmentos de RNA genmico geralmente compem o vrion. No ncleo
celular, esses RNA genmicos so utilizados como molde para a sntese de oito diferentes RNAm;
cada um servir de molde para a sntese de uma protena viral. Exceo importante a ocorrncia de
sobreposio entre as ORF das protenas M1 e M2, e NS1 e NS2. A expresso de cada uma dessas
protenas garantida por processamento por splicing do RNAm de M1 (produz transcrito para M2) e
igualmente por splicing do RNAm de NS1 (produz transcrito para NS2).
A transcrio dos RNAm virais feita pelo complexo proteico com atividade de replicase. A
esses RNAm virais, incorporada a estrutura cap juntamente com cerca de 14 nucleotdeos iniciais
dos RNAm celulares. Logo, o processo de adio de cap pela polimerase viral feito a partir do
sequestro dessa estrutura dos RNAm celulares. Isto acontece igualmente nos buniavrus, no
citoplasma da clula-alvo. Esse tipo de estratgia interessante, pois, por um lado, garante que a
estrutura cap esteja presente nos RNAm virais mesmo quando a polimerase no apresentar atividade
especfica de metil-transferase, e por outro lado, um eficiente mecanismo de competio dos vrus
pela maquinaria de traduo celular. Assim, o conjunto de RNAm celulares capeados reduzido,
deixando a maquinaria celular disponvel para a traduo dos RNAm virais.
Aps a fase inicial de sntese proteica, as protenas virais comeam a se acumular no ncleo da
clula infectada. A nucleoprotena (NP) parece servir como reguladora importante da mudana da
transcrio dos RNAm virais para a replicao dos genomas virais. Essa protena, ao se associar aos

RNA genmicos negativos, leva sntese do RNA positivo antigenmico completo (possivelmente,
um complexo replicase diferente daquele responsvel pela transcrio dos RNAm virais montado
na regio lder do RNA negativo). O RNA positivo antigenmico completo, que no capeado, serve
de molde para a sntese de molculas de RNA negativo genmico, que podem ser, ento,
empacotadas nos novos vrions. Para os vrus de RNA negativo no segmentado, tambm
observado excesso de RNA negativo genmico com relao ao molde positivo antigenmico
completo durante a fase de replicao do genoma viral.

Vrus de RNA de fita dupla


Os reovrus e os birnavrus so os nicos vrus na natureza que empacotam uma fita dupla de
RNA nos vrions. A replicase viral tambm est presente nos vrions em associao s protenas
estruturais VP1 e VP3. Apesar de os genomas desses vrus serem constitudos pelos RNA
codificantes positivos, uma vez dentro das clulas, eles no sero moldes iniciais para a sntese
proteica. A replicase inicia a transcrio de novos RNAm a partir da fita negativa molde e cada
segmento genmico transcrito por um complexo com polimerase. Esses RNAm tm a modificao
cap na extremidade 5 catalisada pela prpria polimerase viral, mas no so poliadenilados. Essa
etapa de transcrio inicial ocorre no microambiente dos capsdeos de dupla camada (DLP, double
layered particles). Os RNAm recm-sintetizados so transportados para fora dos DLP atravs dos
canais formados nos vrtices do capsdeo.
A traduo desses RNAm ocorre em ribossomas livres no citoplasma celular e as glicoprotenas
VP7 e NSP4 so sintetizadas em associao ao retculo endoplasmtico. A protena no estrutural
NSP3 tem participao fundamental durante a traduo, uma vez que se associa extremidade 3 no
poliadenilada dos RNAm virais e ao fator de incio de traduo eIF4G associado ao cap na
extremidade 5, aproximando, dessa maneira, os terminais 5 e 3. A NSP3 funciona conforme a PABP
celular, levando circularizao dos RNAm virais e assim aumentando sua taxa de traduo. Outra
consequncia da circularizao dos RNAm virais que esta deve ser a forma preferencialmente
transportada para as regies denominadas viroplasmas (regies de acmulo de componentes virais
onde ocorre a replicao do genoma e formao de novas partculas virais, formadas por
modificaes de estruturas de membranas internas celulares), nas quais posteriormente ocorrer a
replicao do genoma viral. Outra funo atribuda circularizao dos RNAm virais o aumento da
taxa de sntese proteica a partir deles.
Nos viroplasmas, os RNAm so replicados pela polimerase viral e, nesse local, so sintetizados
RNA de fita negativa que permanecem associados fita molde positiva. Desse modo, em nenhum
momento durante a replicao viral so detectadas fitas negativas de RNA sozinhas na clula.
As protenas virais estruturais recm-sintetizadas formam novos capsdeos, contendo em seu
interior os diferentes segmentos de RNA genmico de fita dupla. Os mecanismos que regulam a

parada da traduo dos RNAm virais e o incio da transcrio podem ser o transporte desses RNAm
para os viroplasmas e a associao de protenas no estruturais virais recm-sintetizadas e fatores
celulares. A regulao das diferentes etapas do ciclo replicativo dos reovrus tem sido objeto de
intensos estudos e novas informaes sobre os mecanismos envolvidos devem ser obtidas
futuramente.

Vrus de RNA ambivalente


A estratgia de replicao dos arenavrus envolve a utilizao da mesma fita de RNA, tanto como
fita de RNAm codificante quanto como fita de RNA de polaridade negativa. Esses RNA genmicos
so ento denominados ambivalentes (ambisense), ou seja, podem ser lidos em ambos os sentidos
35, pela maquinaria de transcrio viral, e 53, pela maquinaria de traduo celular. No
entanto, o RNA genmico no incio do ciclo replicativo funciona primordialmente como um RNA
negativo; somente no decorrer do ciclo replicativo que eles funcionaro como RNA ambivalentes.
Os arenavrus contm genoma segmentado e a estratgia utilizada nos diferentes segmentos dos RNA
genmicos foi descrita anteriormente.
Os segmentos de RNA desses vrus contm estruturas secundrias do tipo grampo localizadas no
meio das molculas. Essas estruturas so denominadas IGR (intergenomic region) e funcionam como
sinais de terminao de transcrio. Estes segmentos de RNA so denominados L e S (significando
large e small).
Assim que o genoma viral entra no citoplasma da clula-alvo, utilizado como molde pela RpRd
viral, denominada L, para a sntese de RNAm subgenmicos que sero moldes para a traduo da
protena NP (nucleocapsdeo), a partir do fragmento S, e da RpRd a partir do fragmento L.
O acmulo da protena NP recm-sintetizada associada aos RNA genmicos faz com que RpRd
transcreva RNA completos. A associao de elevadas quantidades da protena NP nas regies
intergnicas parece favorecer o relaxamento da estrutura de grampo e, desse modo, no mais levar
parada de sntese de RpRd. Ou seja, nessa situao, so sintetizados RNA completos em vez dos
RNAm subgenmicos. Nesse sentido, os RNA completos so moldes tanto para a sntese de novos
RNA genmicos quanto para a sntese a partir da extremidade 3 de RNAm subgenmicos. Por sua
vez, agora, os RNAm subgenmicos so moldes para a traduo do precursor GPC (glicoprotena
precursora; processada em GP1 e GP2), a partir do fragmento S, e da protena Z (zinc finger), a
partir do segmento L (Figura 4.7).
Um dado controverso que a ausncia de NP provoca a diminuio da transcrio tanto dos
RNAm subgenmicos quanto dos RNA completos (genmicos e complementares). Logo, apesar de
NP favorecer a sntese dos RNA completos, no responsvel pelo balano quantitativo entre esses
tipos de RNA. Uma hiptese para explicar a sntese de cada um desses RNA (RNAm subgenmicos
versus RNA completo) que, durante a transcrio e replicao, dois diferentes complexos da

polimerase L so formados e cada um deles estaria comprometido com a sntese de cada um dos
tipos de RNA. possvel que a protena viral Z auxilie no controle dos eventos de transcrio e
traduo e, uma vez que comece a se acumular, favorea o empacotamento dos RNA genmicos, o
que levaria diminuio da taxa de transcrio dos RNAm subgenmicos.

Figura 4.7 Modelo de replicao dos arenavrus. Os arenavrus apresentam dois segmentos de RNA de polaridade negativa
que funcionam como RNA ambivalente durante o ciclo replicativo. A primeira etapa da replicao a transcrio de RNAm
subgenmicos (RNAmsg), um tipo a partir de cada segmento (L ou S). A RNA polimerase-RNA dependente (RpRd em
vermelho) ser traduzida a partir de L e a protena do nucleocapsdeo (NP em azul-escuro), a partir de S. NP se associa
s regies intergnicas (IGR) e induz a transcrio das fitas inteiras de RNA complementar. Esses ltimos sero moldes
para: transcrio dos RNAmsg, que sero molde para a traduo da protena Z (em laranja) e do precursor glicoproteico
GP (em azul sombreado); e transcrio de fitas completas do RNA genmico. Note que NP tambm se associa s fitas
inteiras de RNA complementar (sombreado) para induzir a transcrio do RNA genmico.

Famlia Retroviridae
Os retrovrus se distinguem dos demais vrus de RNA de fita positiva pelo fato de codificarem
uma enzima com atividade de polimerizao de molculas de DNA a partir de moldes de RNA. A

estratgia de replicao desses vrus baseia-se na transcrio reversa da molcula de RNA em uma
fita dupla de DNA, to logo seu capsdeo semidesestruturado chegue ao citoplasma das clulas-alvo.
Assim, apesar de ambas as fitas de RNA genmico poderem ser diretamente traduzidas em protenas
virais to logo esses vrus entrem na clula hospedeira, a fase de sntese proteica ocorre apenas mais
tardiamente, aps a integrao da fita dupla do DNA viral ao genoma da clula hospedeira, evento
catalisado pela enzima viral integrase (o genoma viral integrado denominado provrus). Dessa
maneira, diferentemente dos vrus de RNA de polaridade positiva, os retrovrus empacotam a
polimerase viral em suas partculas. Apesar de a replicao do genoma ser equivalente entre os
diferentes gneros da famlia Retroviridae, a estratgia de expresso das protenas virais to mais
complexa quanto o forem seus genomas. Os retrovrus mais simples (alfa-, beta- e gamarretrovrus)
codificam somente as ORF gag (poliprotena precursora de protenas estruturais), pol (poliprotena
precursora das enzimas virais) e env (glicopoliprotena precursora de glicoprotenas do envelope).
Os demais retrovrus, ditos complexos (deltarretrovrus, lentivrus e espumavrus) codificam, alm
das ORF principais j citadas, inmeras variveis de outras ORF localizadas na metade 3 do
genoma, sobrepostas entre si e com as ORF principais. Esses novos genes tm papel importante no
controle da replicao viral e representam um ganho de funo para esses vrus, aumentando a
eficincia dos eventos celulares que levam produo de novas partculas virais.
O DNA viral contm estruturas terminais longas e repetidas, denominadas LTR (long terminal
repeats). Na LTR presente na extremidade 5 do provrus, encontram-se sinais de reconhecimento de
fatores de transcrio celulares. Assim, a RNA polimerase II celular transcreve um RNAm completo,
com cerca de 9,5 kb, que contm toda a codificao gentica viral. Sinais aceptores e doadores de
splicing esto presentes ao longo do RNAm de 9,5 kb e seu processamento completo produz
transcritos menores (mais de um tipo de transcrito ser produzido, dependendo da combinao de
stios doadores e aceptores de splicing utilizada), que so transportados do ncleo para o
citoplasma, no qual servem como molde para a sntese das protenas virais. O RNAm completo
tambm transportado para o citoplasma e, funciona, nos retrovrus simples, como molde para a
traduo da poliprotena gag e, em alguns vrus, para a traduo da poliprotena pol, e tambm para
ser empacotado como RNA genmico. Nos retrovrus complexos, o RNAm viral completo serve
como molde tanto para a traduo das poliprotenas gag e pol, quanto para ser empacotado para
compor o genoma viral (Figura 4.8).
O que garante que todos os diferentes RNAm processados sejam expressos a presena de stios
de splicing crpticos (com menos similaridade com as sequncias nucleotdicas consenso
reconhecidas pela maquinaria de splicing) presentes no genoma.
Nos retrovrus simples, as quantidades relativas de RNAm processados versus RNAm completos
no so finamente controladas e, assim, a sntese de todas as protenas virais acontece ao mesmo
tempo durante a fase de transcrio/traduo do ciclo replicativo. Em geral, nas clulas eucariticas,
RNAm no processados costumam ser transportados para o citoplasma. O que garante que o RNAm

completo dos retrovrus chegue ao citoplasma da clula infectada a presena de uma sequncia
especfica na regio 3, que assume uma estrutura secundria em lao (loop); essa estrutura
reconhecida por protenas celulares transportadoras (TAP, transporters associated proteins). A TAP
se associa a protenas do poro nuclear e a uma protena ligadora de GTP, transportando RNAm do
ncleo para o citoplasma da clula.
Nos retrovrus complexos, o ciclo replicativo dividido em duas partes; na primeira parte,
observada a presena das protenas virais iniciais, sintetizadas a partir de RNAm completamente
processados. Essas protenas virais apresentam funes regulatrias. Nos lentivrus que infectam
primatas, por exemplo, a protena tat a transativadora viral. Essa protena, ainda no citoplasma, se
associa a uma ciclina celular (T1) e proteino-cinase dependente de ciclina (CDK9), e forma um
complexo ternrio. Ao chegar ao ncleo, tat se associa a uma regio nascente do RNAm, que est
sendo sintetizado (denominada TAR), e a CDK9, ento, fosforila fortemente o carboxiterminal da
RNA pol II. Esse mecanismo aumenta em mais de 100 vezes a taxa de transcrio do RNAm viral.
Outra protena regulatria responsvel pela mudana de fase do ciclo replicativo de inicial para
tardia a protena rev, que tambm tem caractersticas de protena transportadora, apresenta sinais
de localizao nuclear (NLS, nuclear localization sequences) e de transporte para o citoplasma
(NES, nuclear export sequence) e migra do citoplasma para o ncleo e, deste, para o citoplasma,
atravs dos poros nucleares.
Uma vez no ncleo, a protena rev se associa a uma regio de loop chamada RRE (rev-response
element), presente na extremidade 3 dos RNAm virais (presente no RNAm completo ou nos RNAm
parcialmente processados). Ao se associar regio RRE, rev direciona o transporte imediato desses
RNAm para o citoplasma. Assim, com a presena de rev na clula infectada, estaro presentes no
citoplasma: RNAm de tamanhos intermedirios (4,5 kb), que servem de molde para a expresso de
protenas virais acessrias e para a glicoprotena precursora do envelope; alm do RNAm completo,
que serve de molde para a sntese dos precursores estruturais e enzimticos e como genoma viral.
Logo, rev compete com a maquinaria de splicing nuclear pelos RNAm no processados ou
parcialmente processados, fazendo com que estes deixem o ncleo antes de sofrerem o
processamento completo (Figura 4.8).
A sntese de Gag ou Pol controlada por um evento de mudana de fase de leitura
(frameshifting) que ocorre 5% das vezes quando o ribossoma escorrega em uma sequncia presente
no RNAm viral, prxima ao final da fase de Gag, e se desloca um nucleotdeo para trs, entrando na
fase de Pol. Assim, so produzidos precursores Gag e GagPol em uma proporo de 20:1. Esses
precursores so clivados pela atividade da aspartil-protease presente em Pol. Dessa maneira, as
novas partculas virais formadas pelas protenas estruturais, enzimas virais e glicoprotenas do
envelope, alm das duas molculas de RNA genmico associadas pela extremidade 5, so montadas
e saem da clula infectada, por brotamento. As clivagens das poliprotenas Gag e GagPol somente
so iniciadas aps o brotamento dos novos vrions.

Figura 4.8 Modelo de replicao do HIV. A primeira etapa da replicao dos retrovrus a de transcrio reversa do RNA
viral, na qual ocorre a produo de uma fita dupla de DNA; acontece no citoplasma da clula infectada, no interior do
capsdeo viral parcialmente desestruturado (1). O DNA viral transportado para o ncleo celular (2) e integrado pela enzima
viral integrase ao genoma celular (3). A partir do DNA viral, a RNA pol II celular transcreve um RNAm completo (4), que sofre
processamento por splicing (5) produzindo RNAm processados, que so transportados ao citoplasma e servem como
moldes para a sntese de protenas virais regulatrias (6) que voltam ao ncleo (7) e tm funo de: fator de transcrio
viral (tat representada em vinho); transportadora de RNAm no processados ou parcialmente processados, do ncleo
para o citoplasma da clula infectada (rev representada em amarelo). Nesse momento, o ciclo passa fase tardia.
Transcritos completos ou parcialmente processados so transportados para o citoplasma (8) e serviro de molde para a
traduo das protenas estruturais que, juntamente com o RNA genmico, so empacotadas nos novos vrions (9).

interessante notar que os espumavrus, cujo representante que infecta seres humanos
denominado human foamy virus (HFV), quando brotam a partir da clula hospedeira, j tm seu
genoma completamente retrotranscrito, ou seja, como DNA de fita dupla. Assemelham-se assim aos
hepadnavrus e podem ser considerados elos da evoluo viral entre os vrus de genoma de DNA e
os retrovrus.

Estratgias virais de interferncia com a sntese proteica celular


Tem-se como premissa o fato de que todos os vrus utilizam diversos componentes da maquinaria
celular em associao s protenas virais por eles codificadas. No caso de alguns vrus de RNA de
fita de polaridade positiva, ocorre um sequestro de componentes proteicos envolvidos no processo
de traduo celular, que quase inteiramente direcionada para a sntese proteica viral. Logo, a clula
hospedeira diretamente prejudicada, uma vez que os RNAm virais passam a ser traduzidos em
detrimento dos RNAm celulares, ocasionando a inibio da sntese de protenas celulares
(mecanismo denominado host cell translation shut-off).
Nos alfavrus, por exemplo, a inibio da sntese das protenas celulares pode ser bloqueada em
apenas 2 h aps o incio da infeco. Apesar de vrios mecanismos j terem sido propostos para
explicar esse fenmeno, ainda no h um consenso sobre qual deles contribui de fato para a inibio
da sntese proteica celular durante a infeco pelos alfavrus. Um dos mecanismos propostos est
relacionado com a identificao da interao da protena viral no estrutural NSP2 com a principal
fosfoprotena ribossomal RpS6. Essa protena um componente da subunidade ribossomal 40S e seu
alto grau de fosforilao est relacionado com o aumento da taxa de traduo celular global. Foi
demonstrado que a protena viral NSP2 pode interagir com uma protena hipofosforilada ou, ao
interagir com RpS6, diminui seus nveis de fosforilao. A real funo de RpS6 no aumento global da
taxa de sntese proteica celular ainda controversa, porm parece que a interao de NSP2 e RpS6
levaria traduo preferencial dos RNAm virais em detrimento dos RNAm celulares. Um segundo
mecanismo interessante que explicaria a inibio da sntese proteica pelos alfavrus diz respeito
fosforilao do fator celular eIF2 durante a infeco das clulas-alvo. O fator eIF2 participa do
processo de incio de montagem da subunidade ribossomal 40S nos RNAm. A fosforilao desse
fator restringe a atividade de um segundo fator de iniciao da traduo, o GTP-eIF2tRNAiMet.
Nesse caso, a traduo dos RNAm virais estaria garantida pela presena de um elemento sinalizador
potencializador da traduo, presente nesses RNAm, que aumentaria a afinidade dos fatores de
iniciao da traduo pelos RNAm virais, diminuindo o requerimento pelo GTP-eIF2tRNAiMet. Foi
demonstrado ainda que a induo de protenas de estresse pela infeco viral importante para a
inibio da sntese proteica celular.
O poliovrus foi muito bem estudado nas ltimas dcadas e, por esse motivo, ser usado para
ilustrar esse tipo de estratgia. O mecanismo de direcionamento de determinados elementos celulares
envolvidos na traduo, especificamente para o vrus, somente possvel devido ao fato de os
RNAm dos poliovrus compartilharem diversas estruturas com os RNAm celulares, que so
reconhecidas pela maquinaria celular, concomitante existncia de uma estrutura diferenciada que
torna os RNAm virais resistentes a esse processo inibitrio.
Portanto, estruturalmente, os RNAm de poliovrus, tais como os RNAm celulares, possuem
extremidades que contm uma sequncia de nucleotdeos no traduzida, denominada UTR, sendo o 3

UTR poliadenilado e, assim, envolvido na manuteno da integridade do RNAm, prolongando sua


meia-vida no citoplasma. No entanto, diferentemente dos RNAm celulares que recebem a adio de
um cap na extremidade 5 UTR, os RNAm de poliovrus no so capeados. Em contrapartida, essa
regio 5 UTR viral contm diversas estruturas secundrias em formato de grampo, conhecidas como
IRES, que so reconhecidas por um complexo proteico celular responsvel por recrutar a subunidade
40S ribossomal.
O processo de iniciao da sntese proteica celular ocorre por meio do reconhecimento do cap
na extremidade 5 via complexo proteico de iniciao, denominado eIF4F (eukaryotic initiation
factor 4F), e posterior recrutamento da subunidade 40S que desliza pelo RNAm at encontrar um
AUG. O complexo eIF4F consiste em trs polipeptdeos: eIF4E, eIF4A e eIF4G. O eIF4E uma
subunidade ligadora de cap; eIF4A uma helicase dependente de RNA que, junto a eIF4B, desfaz a
estrutura secundria presente na extremidade 5 dos RNAm; enquanto eIF4G funciona como uma
ponte em razo de sua interao com eIF4E, pela extremidade aminoterminal, e eIF4A, pela
extremidade carboxiterminal. A eIF3 outra subunidade que se liga diretamente extremidade
carboxiterminal de eIF4G e responsvel pelo recrutamento da subunidade menor do ribossoma 40S
(Figura 4.9A).
Distintamente, ocorre a iniciao da sntese proteica dos poliovrus. Todo o processo se inicia
com uma protena viral denominada protease 2A, que liberada autocataliticamente da poliprotena
inicial. Essa protease cliva eIF4G prximo sua extremidade aminoterminal, separando os stios de
ligao eIF4E do restante carboxiterminal da protena (Figura 4.9B). Esse ltimo fragmento (2/3
restantes da protena) mantm os stios de ligao a eIF3 e eIF4A.
A clivagem proteoltica de eIF4G no possibilita a montagem do complexo de iniciao nos
RNAm celulares, causando a inibio da sntese proteica celular. Entretanto, o fragmento de eIF4G
correspondente extremidade carboxiterminal utilizado pelos RNAm do poliovrus, uma vez que
no h necessidade da extremidade aminoterminal responsvel pelo reconhecimento do cap.
Portanto, a iniciao da traduo em poliovrus ocorre independentemente da presena de um cap,
mas dependente da presena do IRES, visto que o complexo formado com eIF4G carboxiterminal,
eIF4A e eIF3 tem mais afinidade por IRES que o complexo eIF4F (Figura 4.9B).
Em 1988, os IRES foram observados pela primeira vez nos prprios poliovrus; so estruturas
secundrias estveis, presentes no 5 UTR de vrios picornavrus, alguns flavivrus (como HCV) e
alguns retrovrus (HTLV e SIV), que podem ou no conter o cdon de iniciao, sendo esta uma das
caractersticas consideradas para a classificao das trs classes de IRES:
Tipo I: so traduzidos de maneira escassa em RRL (lisado de reticulcito de coelho). Necessitam
de um escaneamento 5-3 do ribossoma at o cdon de iniciao. Exemplos: enterovrus e
rinovrus
Tipo II: traduo eficiente em RRL. O IRES abrange o cdon de iniciao. Exemplos: cardiovrus

e aphtovrus
Tipo III: no traduzido em RRL. Seu IRES tambm abrange o cdon de iniciao. Exemplo:
vrus da hepatite A.
Embora inicialmente tenham sido descritos em vrus, tambm foi observada a presena de IRES
em RNAm celulares e funcionam preferencialmente quando a traduo cap dependente inibida,
como em casos em que a clula passa por situaes de estresse, apoptose, mitose e diferenciao.
Portanto, aparecem em poucos RNAm celulares, tais como aqueles que expressam fatores de
crescimento, protenas ligadoras de RNA, fatores de transcrio, inibidor de apoptose e o RNAm do
prprio eIF4G.
Todos os IRES necessitam de determinados ITAF (IRES trans-activator factors), que so fatores
de transativao de IRES e agem em conjunto ou individualmente e no esto presentes em todas as
clulas. Esses ITAF reconhecem estruturas secundrias-padro e so responsveis pela
funcionalidade do IRES.
Aps a descoberta dessas peculiaridades do 5 UTR, pde-se, enfim, cogitar uma possibilidade
plausvel que explicasse a atenuao do poliovrus vacinal produzido por Sabin e colaboradores, em
1954. Sabe-se que esses vrus atenuados so replicados facilmente no sistema digestrio e induzem
imunidade contra a infeco. Em uma posterior anlise da sequncia do vrus vacinal, observou-se
que a atenuao ocorria devido a mutaes pontuais, especialmente na regio 5 UTR dentro da
sequncia do IRES, como tambm em genes do capsdeo. Foi observado que a atenuao est
diretamente associada baixa neurovirulncia e j foi descrito que a mutao pontual na sequncia
do IRES dos 5 UTR causa um defeito na traduo proteica viral nas clulas do crebro e da medula
espinhal. A replicao reduzida nesses stios poderia explicar a neurovirulncia atenuada dos
poliovrus vacinais.
Uma teoria que tenta explicar esse baixo nvel de replicao no sistema nervoso baseia-se nos
conceitos vistos anteriormente: uma mutao pontual na sequncia do IRES causaria uma mudana na
sua estrutura secundria, o que impediria o reconhecimento dessa estrutura pelas ITAF especficas
desse tipo celular, enquanto nas clulas do sistema digestrio, essa mudana estrutural no afetaria o
reconhecimento do IRES por outra gama de ITAF.

Figura 4.9 A. Montagem do complexo de iniciao da traduo em RNAm celulares. No esquema proposto, est
representada a montagem dos fatores de incio de traduo e da subunidade ribossomal 40S a partir do reconhecimento da
estrutura cap na extremidade 5 dos RNAm celulares. B. Consequncias da clivagem do eIF4G pela protease 2A. Durante a
infeco por poliovrus, a protease viral 2A cliva o fator de iniciao da traduo do eIF4G. Esse evento inibe a montagem
da subunidade ribossomal 40S nos RNAm celulares, uma vez que o reconhecimento do cap j est inibido. A traduo no
ser inibida a partir do RNAm viral, uma vez que a poro carboxiterminal do fator eIF4G clivado reconhecer a estrutura
IRES, presente no RNAm viral e haver a montagem da subunidade ribossomal 40S para o incio da traduo.

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Conceito e propriedades elementares dos vrus


Vrus so agentes infecciosos que se propagam em uma clula hospedeira capaz de sustentar sua
biossntese; eles esto em um nvel de complexidade inferior ao da clula mais primitiva, no tendo
autonomia metablica para obter sua prpria energia e para se autorreplicar. So superestruturas
formadas por um genoma de RNA ou de DNA revestido por protenas e, algumas vezes, por um
envelope glicolipoproteico. A partcula viral tem, em mdia, dimenses inferiores ao comprimento
de onda mdio da radiao ultravioleta, motivo pelo qual s podem ser discernveis por visualizao
em microscopia eletrnica.
Sendo basicamente um complexo nucleoproteico, as propriedades gerais dos vrus so as mesmas
das protenas e dos cidos nucleicos. Tambm so inativados pelo calor, sendo mais comumente
utilizado o calor mido. No caso dos vrus que apresentam revestimento glicolipoproteico, sua
inativao ocorre rpida e facilmente pela ao de detergentes e por solventes lipdicos (p. ex.,
clorofrmio, ter e desoxicolato de sdio). Um teste rpido de inativao com esses solventes j
decide de maneira rpida e direta se um vrus apresenta envelope lipoproteico ou no.
Vrus com envelopes glicolipoproteicos tambm so rapidamente inativados no meio ambiente,
como herpesvrus, vrus da influenza ou coronavrus mantendo-se infecciosos por algumas horas se
estiverem protegidos por secreo mucoide ou sangue. J os vrus desnudos, isto , sem envelope e
constitudos somente por seu complexo nucleoproteico, podem manter-se infecciosos por dias ou
semanas no meio ambiente, como os rotavrus e os norovrus.

Elementos da organizao viral


A estrutura e a organizao dos vrus foram primeiramente inferidas a partir de fotografias de
difrao de raios X obtidas com amostras cristalizadas, que revelaram eixos de simetria quntupla
no reconhecida na cristalografia clssica. A frmula de simetria rotacional 5:3:2 foi assim
demonstrada pela primeira vez em 1956 e, da, deduziu-se que uma classe das partculas virais

apresentava simetria icosadrica. Outra classe de vrus tinha simetria helicoidal, esta facilmente
dedutvel das figuras de difrao. A evidncia de que as protenas ficavam externas ao cido
nucleico das partculas foi meramente dedutiva, assim como a organizao multimrica das protenas,
at sua confirmao por microscopia eletrnica por volta de 1960 (este assunto ser abordado mais
adiante).
A microscopia eletrnica elucidou a morfologia geometricamente regular das partculas virais
com a introduo da tcnica de colorao negativa usando metais pesados, sendo possvel confirmar
as simetrias icosadrica e helicoidal e os detalhes relevantes de sua organizao. Com o
aperfeioamento da tcnica de microscopia eletrnica, foi possvel acoplar sistemas de difrao
ptica e obter imagens com alto grau de detalhamento e sua anlise automtica por computao.
Alguns vrus como os poxvrus e os pandoravrus so grandes vrus, com mais de uma centena de
genes, e sem simetria polidrica, assemelhando-se a cocobacilos (simetria bilateral).
A nomenclatura da estrutura viral foi formalizada por Caspar e colaboradores (1962). O
revestimento proteico que envolve o genoma foi denominado capsdeo, uma palavra derivada do
grego, que significa concha; o conjunto do capsdeo mais o genoma viral chamado de
nucleocapsdeo. O genoma viral tem a natureza do DNA ou do RNA. Outros vrus apresentam um
envelope glicolipoproteico superposto ao nucleocapsdeo, cuja parte proteica uma glicoprotena
codificada pelo genoma viral, que adquirido durante a sada do vrus da clula infectada, onde
carreia parte da membrana. A designao original para envelope peplos, e a de suas glicoprotenas,
com a aparncia de espculas, peplmeros. A partcula viral completa infecciosa denominada
vrion. As protenas que formam o capsdeo so chamadas de unidades estruturais; nos vrus que so
dotados de simetria icosadrica, elas formam grupos morfologicamente distintos denominados
capsmeros, alguns com cinco unidades (pentons) e outros com seis (hexons), mas isso no uma
regra fixa (h vrus com capsmeros trimricos).
O capsdeo viral o veculo que reconhece a clula hospedeira, transfere o genoma viral e o
protege de nucleases externas. Quando o vrus contm um envelope, o reconhecimento primrio
feito pelas espculas glicoproteicas desse revestimento.

Arquitetura do capsdeo viral | Lei geral da organizao baseada em protenas


A elucidao da organizao do capsdeo viral revelou a lei geral da formao de estruturas
biolgicas baseadas em protenas. Trata-se de um modelo ideal para se compreenderem as leis
fundamentais da organizao molecular dos sistemas biolgicos: como se originam, como se mantm,
como se comportam.
Aps decifrar cristalograficamente a dupla hlice do DNA e a hlice simples do RNA, Crick e
Watson ocuparam-se de outro desafio: as imagens de difrao de vrus cristalizados (partculas
pequenas, nucleoproteicas, de forma regular). Eles partiram de um raciocnio simples com base na

cristalografia geomtrica: caso o capsdeo dos vrus mais simples (cristalizveis) fosse composto de
um s tipo de protena ou de protenas muito semelhantes, ento o capsdeo viral seria uma estrutura
altamente simtrica, pois, para ser estvel, as unidades devem apresentar domnios de interao
idnticos e se empacotar da maneira mais econmica possvel, maximizando suas interaes. Isso
somente possvel se o arranjo for simtrico. Nessa linha de raciocnio, considerando que as
protenas so assimtricas e que elas s podem formar arranjos simtricos reunindo-se em grupos,
concluram que esses grupos s poderiam formar dois tipos de arranjos: de simetria helicoidal ou
simetria cbica. O tempo viria provar, mais uma vez, que eles estavam certos.
Nessa poca, a microscopia eletrnica ainda engatinhava e no tinha resoluo para elucidar o
nvel da organizao do capsdeo viral, mostrando apenas esferoides e bastonetes como as formas
bsicas dos vrus. Como mencionado anteriormente, o aperfeioamento da resoluo e a tcnica de
colorao por contraste negativo confirmaram visualmente essas concluses. A seguir, sero
descritos os princpios gerais da organizao do capsdeo viral, os quais se aplicam, por extenso, a
toda estrutura biolgica baseada em protenas.

Princpio da economia gentica e correo automtica de erros


Crick e Watson previram que uma molcula proteica nica no poderia incluir o cido nucleico
que a codifica, pois o capsdeo sempre mais pesado que o cido nucleico viral. A razo do cdigo
gentico para as protenas corresponde a trs bases nucleotdicas para cada aminocido, e disso
resulta uma protena aproximadamente 1/10 menor e 1/5 menos pesada que o cido nucleico
codificador. Consequentemente, para conter o genoma que a codifica, a protena dever formar
agregados espontneos e estveis com outras semelhantes para produzir uma estrutura
suficientemente grande para conter o cido nucleico. Esses agregados se formam espontaneamente
(minimizao da energia livre), servindo como mecanismo automtico de correo de erros, pois, se
uma estrutura errada for sintetizada, ela ser excluda do agregado, pois no conseguir interagir de
modo estvel, sendo assim deslocada uma unidade estrutural correta, que se agregar estavelmente.
Desse modo, uma grande economia gentica empregada na construo de estruturas: uma
informao mnima multiplicada muitas vezes produz protenas suficientes para formar grandes
estruturas.

Princpio do arranjo por eixos de simetria rotacional


As protenas no apresentam simetria interna, pois seus aminocidos constituintes exibem
somente um tipo de atividade ptica: todos so -L-aminocidos (ismeros levgiros, que desviam o
plano da luz polarizada para a esquerda no polarmetro). Isso faz com que protenas idnticas
(unidades estruturais) no tenham simetria interna e, consequentemente, s possam formar arranjos

simtricos agrupando-se em torno de pontos ou eixos, formando grupos rotacionais de simetria. Esses
grupos so anis de protenas representados como Cn, sendo n o nmero de protenas no anel. Por
exemplo, um capsmero pentamrico em um capsdeo icosadrico apresenta simetria rotacional C5.
Os grupos rotacionais podem se empilhar em tubos (maximizando sua interao entre eles) ou
podem cobrir uma superfcie esfrica, dando origem a figuras de simetria cbica, das quais a
icosadrica a mais recorrente nos vrus esferoides ou isomtricos. O arqutipo geomtrico da
simetria icosadrica o icosaedro, um slido regular (ou platnico) formado por 12 vrtices, 20
faces triangulares equilteras e 30 arestas, que correspondem, respectivamente, aos eixos rotacionais
C5, C3 e C2, ou 5:3:2. A Figura 5.1 ilustra esses princpios. Essas organizaes simtricas so as que
apresentam maior interao entre suas unidades estruturais; portanto, a menor energia mnima de
todas as possibilidades de agregao.
Assim, h duas simetrias possveis nos vrus simples: a helicoidal e a cbica (icosadrica).

Simetria helicoidal
Neste caso, os anis de protenas se enroscam em torno de uma molcula de RNA em fita
simples, formando uma hlice, que o arranjo mais prximo de discos empilhados. Desse modo, o
capsdeo incorpora a molcula de RNA e amplia o domnio de ligao (agora no apenas entre
protena-protena, mas tambm entre protena-RNA), aumentando, consequentemente, a estabilidade
do arranjo, ou seja, minimizando ainda mais a energia livre durante a formao do nucleocapsdeo.
Nos vrus de plantas com capsdeos tubulares, estes so hlices rgidas com aparncia de varas.
No caso de vrus com RNA de fita simples de muitos vertebrados, o capsdeo helicoidal flexvel,
enovelando-se no interior de um envelope como um chicote enroscado, com a aparncia de uma gota.
Assim, enquanto os vrus com simetria helicoidal dos vegetais apresentam um capsdeo rgido, sem
envelope, nos vrus de capsdeo helicoidal dos vertebrados eles so flexveis e includos no interior
de um envelope glicolipoproteico (Figura 5.2).

Figura 5.1 A. Arranjos em discos empilhados que geram simetria helicoidal (modelo do vrus do mosaico do tabaco)
quando se adiciona o RNA viral s unidades estruturais. B. Figura de um icosaedro regular e uma superfcie de simetria
icosadrica formada por capsmeros (C). Neste ltimo caso, os crculos representam os capsmeros (unidades
morfolgicas), formados por grupos de 5 e 6 unidades estruturais, respectivamente, nos vrtices e faces. Os capsmeros
pentamricos so identificados pela vizinhana de 5 outros capsmeros e correspondem ao eixo C5 (vrtices) os
capsmeros hexamricos so identificados pela vizinhana de 6 outros. D. Icosaedro visto pelo centro de seus vrtices
(eixo C5), centro de face (eixo C3) e centro de aresta (eixo C2), formando a simetria coposta 5:3:2.

Figura 5.2 Simetria helicoidal no vrus da influenza. A. Capsdeo viral exposto aps remoo do envelope. Observar o
aspecto denteado da imagem, que so as unidades estruturais evidenciadas com maior aumento na figura C. B. Espculas
glicoproteicas isoladas do envelope viral (note que elas tendem a se agregar). C. Detalhe no capsdeo viral.

Simetria cbica
Se a simetria helicoidal intuitivamente compreendida, o mesmo no se pode dizer da simetria
cbica, conforme ser mostrado a seguir.
No caso da simetria cbica, os grupos rotacionais das unidades estruturais no se empilham, mas
renem-se lado a lado em uma composio de eixos de simetria com um centro (intercesso) comum,
formando uma superfcie esferoidal (ou geodsica) ou polidrica. Desse modo, os arranjos de
protenas idnticas ou semelhantes somente podem existir como conjuntos que se baseiam em
agregao de grupos de protenas arranjadas em simetria rotacional.
A simetria cbica compreende qualquer construo com base nos eixos de simetria encontrados
nos slidos regulares (ou platnicos), os quais so: tetraedro, octaedro, hexaedro (ou cubo),
dodecaedro e icosaedro. As propriedades de simetria e a sua eficincia de conteno de espao
esto resumidas no Quadro 5.1, e as respectivas formas ilustradas na Figura 5.3. Entende-se por
simetria a disposio regular de unidades idnticas ou quase idnticas em uma estrutura, um padro
regular de organizao que se repete ao longo da estrutura, produzindo uma forma como resultado
final do conjunto. Portanto, simetria no forma, mas um padro de construo de uma estrutura que
resultar em uma forma. Simetria icosadrica e icosaedro no so necessariamente a mesma coisa.
Quadro 5.1 Caractersticas essenciais dos slidos regulares de Plato e seus parmetros cristalogrficos.
Tipo

Classe*

V, F, A**

Faces

Razo S/V***

No de subunidades
equivalentes****

Tetraedro

3:2

4, 4, 6

Triangulares
equilteras

12

Octaedro

4:3:2

6, 8, 12

Triangulares
equilteras

1/2

24

Hexaedro (cubo)

4:3:2

8, 6, 12

Quadradas

1/2,4

24

Icosaedro

5:3:2

12, 20, 30

Triangulares
equilteras

1/3,6

60

Dodecaedro

5:3:2

20, 12, 30

Pentagonais
equilteras

1/5,3

60

*Refere-se aos eixos de rotao que compem a figura (centro de vrtices, faces e arestas), assinalados pela ordem
decrescente dos nmeros. **Nmeros de vrtices (V), faces (F) e arestas (A). ***Razo entre superfcie (S)/volume (V),
considerando o tetraedro como unidade. ****Nmero de subunidades assimtricas que formam a figura.

Figura 5.3 Os cinco slidos regulares ou platnicos, que so poliedros formados por faces equilteras idnticas. A.
Tetraedro, com quatro faces triangulares equilteras. B. Octaedro, com oito faces triangulares equilteras. C. Hexaedro ou
cubo, com seis faces quadradas. D. Dodecaedro, com 12 faces pentagonais equilteras. E. Icosaedro, com 20 faces
triangulares equilteras.

O termo simetria cbica deriva do fato de que esses slidos podem ser contidos no interior de um
cubo, de modo a coincidirem com os eixos C3 desse slido (seus vrtices). A escolha do cubo como
cela conceitual arbitrria e tem como base a opo da forma mais intuitiva de dividir o espao. Os
eixos C5 do dodecaedro e do icosaedro no tm contrapartida no cubo, da a dificuldade de sua
determinao nas figuras de difrao de raios X. Essas dificuldades foram contornadas graas
tcnica de sombreamento metlico em microscopia eletrnica, aplicada anlise da figura viral, bem
como pela tcnica de colorao negativa que confirmaria a ocorrncia de capsmeros pentamricos,
correspondentes ao grupo de rotao C5, e hexamricos, correspondentes ao grupo C6. Esses
capsmeros so unidades morfolgicas formadas respectivamente por cinco e seis unidades
estruturais. Os avanos no detalhamento das imagens eletrnicas e nas resolues das figuras de
difrao por raios X elucidaram definitivamente a questo em nvel ultraestrutural.

Simetria icosadrica e capsdeos virais


Para Caspar e Klug (1962), frequentemente os capsdeos de simetria cbica escolhem a simetria
icosadrica supostamente por ser a de menor energia livre de formao (maior domnio de
interaes), e por ter o menor ngulo de deformao que esta simetria confere ao arranjo proteico,
cujos limites, 5 a 7, so compatveis com a flexibilidade das protenas. De acordo com a
cristalografia geomtrica, esses capsdeos se formam basicamente pela reunio de 12 pentmeros
(capsmeros) topologicamente relacionados com os vrtices C5 do icosaedro, portanto, por 60
unidades estruturais idnticas. Este o nico nmero possvel, pois somente ele torna possvel que
todas as unidades estruturais estejam equivalentemente relacionadas, isto , todas tero um domnio
idntico de interao.

No entanto, considerando que os vrus de simetria icosadrica frequentemente apresentam um


mltiplo de 60 unidades estruturais, a simetria perfeita dos domnios de ligaes entre as unidades
estruturais no parece ser a condio necessria para que o arranjo seja o de menor energia. Assim,
possvel construir arranjos com simetria icosadrica com mais de 60 unidades estruturais, conforme
foi demonstrado por Caspar e Klug (1962). Tais autores tomaram como base os princpios da
construo de domos geodsicos de Buckminster Fuller, fundamentada na simetria icosadrica, para
encontrar a soluo para o problema de empacotar mais de 60 subunidades em um arranjo estvel
com simetria icosadrica.
Anteriormente, Horne e Wildy (1961) estabelecerem o primeiro modelo de capsdeos
icosadricos com base na descoberta dos capsmeros pentamricos e hexamricos, utilizando o
mtodo de empacotamento de pentgonos e hexgonos em poliedros com simetria icosadrica,
descoberto por Goldberg (1937). Esse autor mostrou ser possvel construir uma superfcie de
simetria icosadrica preservando os 12 vrtices (no formato de pentgonos) e adicionando-se
hexgonos de acordo com uma regra especfica. As Figuras 5.4 e 5.5 mostram vrios tipos de vrus
com simetria icosadrica. Em alguns deles, possvel identificar os pentons e hexons pela
vizinhana: os pentons (capsmeros pentamricos) so circundados por cinco outros capsmeros; e
os hexons (capsmeros hexamricos), por seis outros. possvel ver capsdeos deltadricos
(herpesvrus e adenovrus) e geodsicos (poliomavrus), com capsmeros homogneos ou ocos. Nos
capsdeos helicoidais, no ocorrem capsmeros, mas as unidades estruturais podem ser vistas se a
resoluo for boa.
Horne e Wildy (1961) consideraram apenas os pentons e hexons, no levando em conta a teoria
de Crick e Watson das unidades estruturais. Dessa maneira, eles construram um modelo meramente
descritivo. Caspar e Klug (1962) avanaram na questo, explicando o capsdeo a partir de como as
unidades estruturais se organizam para formar pentmeros e hexmeros e como isso resulta em uma
superfcie de simetria icosadrica. Assim, por exemplo, em um vrus com 180 unidades estruturais
(como o caso dos poliovrus e muitos vrus de plantas), 60 delas formariam os 12 pentmeros
(equivalentes aos vrtices), e as 120 restantes formariam 20 hexmeros, distribudos ao longo das
faces e/ou arestas.

Geometria utilitria e o princpio da quasi-equivalncia


Caspar e Klug (1962) ampliaram a teoria do capsdeo icosadrico em uma topologia geral em
que as unidades estruturais tm certa liberdade de variao em tamanho e flexibilidade, sem
comprometer a estabilidade do arranjo. Eles partiram da ideia de Buckminster Fuller sobre a
construo de domos geodsicos, em que o desenho concebido dentro de uma geometria utilitria,
isto , sem o rigor terico, mas objetivando o valor prtico do que se quer obter.
Um domo geodsico uma construo baseada na simetria icosadrica e que pode ser expandida

vontade, conforme regra determinada. Fuller partiu de um desenho com base na diviso triangular
do espao, o qual pode ser dobrado em pontos equidistantes de simetria C5 para formar um continer
geodsico. Esse tipo de dobra forma uma superfcie quase esfrica de tenso mnima, resultando em
uma estrutura de simetria icosadrica. Dependendo do tamanho que se quer obter, os pontos das
dobras ficaro mais distantes entre si, e os pontos de simetria C6 vo sendo includos naturalmente,
enquanto a curvatura da estrutura vai ficando mais aberta sem criar tenso na estrutura. Fuller
mostrou ainda que no havia necessidade de as unidades (no caso, canos de plstico conectados entre
si em um plano triangulado) serem exatamente do mesmo tamanho, podendo variar um pouco para
facilitar a construo, tal o conceito de geometria utilitria econmica (ele chamou as estruturas
construdas a partir desse princpio de dimaxion).

Figura 5.4 Capsdeos de simetria icosadrica e helicoidal. A. Poliomavrus com capsdeo geodsico e capsmeros. B.
Adenovrus, exibindo capsdeo polidrico (simetria icosadrica), capsmeros homogneos e apndices proteicos que
emergem dos capsmeros pentamricos. C. Herpesvrus ainda dentro do seu envelope, exibindo capsdeo icosadrico e
capsmeros ocos. D. Paramixovrus mostrando seu nucleocapsdeo de simetria helicoidal, ainda dentro do envelope.

Figura 5.5 Capsdeo do herpesvrus humano tipo 1 (HHV-1), mostrando seu aspecto oco. A. Nuclecapsdeos ntegros no
interior de uma membrana, mostrando seu aspecto geodsico com simetria icosadrica. B. Dois capsdeos vazios (sem o
DNA) no interior de uma membrana, mostrando as espculas glicoproteicas projetadas dessa membrana. C.
Nucleocapsdeo ntegro como em A, mostrando os capsmeros. D. Capsmeros purificados, mostrando seu aspecto oco
(na maioria dos vrus, os capsmeros so compactos). E. Dois capsdeos vazios (sem o DNA) no interior de uma
membrana, como em B.

Caspar e Klug (1962) aplicaram as ideias de Fuller e ento perceberam que as estruturas
biolgicas seguiam o mesmo princpio. Capsmeros em um vrus icosadrico com um mltiplo de 60
unidades estruturais no podem estar todos equivalentemente relacionados. Uma discreta deformao
no domnio de ligao entre os capsmeros deve acontecer para acomod-los, e isso ocorre sem
prejuzo da estabilidade da estrutura, pois, embora algumas ligaes sejam levemente tensionadas, a
energia de formao do sistema deve permanecer adequada para prosseguir a construo. Caspar e
Klug chamaram esse princpio de quasi-equivalncia.
Desse modo, a ideia de quasi-equivalncia despreza o rigor matemtico da cristalografia
geomtrica e retm os princpios bsicos da interao entre os polipeptdeos estruturais. A deciso
do que constitui quasi-equivalncia parte da utilidade da noo em fazer predies sobre a estrutura
do capsdeo ou distinguir distores na mesma sem prejuzo desse conceito. Caspar e Klug
consideraram, inclusive, que os arranjos quasi-equivalentemente relacionados so
termodinamicamente mais estveis que os equivalentemente relacionados, devido possibilidade de
um maior nmero de interaes tanto em grupos locais quanto no conjunto. Nessa teoria, importante
considerar que tais estruturas se formam por agregao espontnea de suas unidades estruturais.

a quasi-equivalncia um princpio universal?


A concluso central da quasi-equivalncia que ela leva, necessariamente, a um arranjo de
simetria icosadrica, pois possibilita um mximo de domnios de ligaes e ngulos didricos mais
abertos (mnimo de tenso entre unidades), sendo, por consequncia, o arranjo de maior estabilidade.
O argumento de Caspar e Klug claramente exclui qualquer outro tipo de simetria cbica, conforme
eles mesmos explicitam em seu trabalho; contudo, a ocorrncia da simetria octadrica (Figura 5.6)
documentada em vrios tipos de fagos colocou em cheque essa afirmao. evidente a existncia de
capsmeros tetravalentes e hexavalentes nesses fagos, violando o princpio proposto por Caspar e
Klug. Outro exemplo o da ocorrncia de pentmeros e trmeros no vrus-3 de r; alm disso, a
descoberta de que os 72 capsmeros dos poliomavrus so todos pentamricos e formados por um s
tipo de protena questiona a concluso de Caspar e Klug.
Cmara, em 1991, sugeriu que as interaes entre capsmeros dependem de segmentos
polipeptdicos filamentosos com alto grau de liberdade, e que o modelo de Goldberg deveria ser
formalmente adotado, considerando os hexgonos no como capsmeros especficos, mas como celas
de alocao de capsmeros de qualquer grupo de rotao.

Nmero de triangulao (T)


Para explicar como um mltiplo de 60 unidades estruturais pode construir uma superfcie de
simetria icosadrica (grupo 5:3:2), basta encontrar a frmula que defina como essas unidades devem
ser distribudas em tal superfcie. Isso se faz subdividindo um plano em tringulos unitrios e, ento,

usando uma de duas coordenadas (separadas por um ngulo de 60, pois o grfico triangular) para
selecionar os pontos que definam os vrtices do geodsico de simetria somente em 60 unidades
estruturais (formando cinco vrtices C5). Caso sejam delimitados quatro tringulos unitrios por face,
a classe do icosaedro ser T = 4, e ele conter 240 unidades estruturais, 60 das quais formaro 12
eixos C5 e 180 formaro 30 eixos C6, e assim sucessivamente, conforme uma determinada regra
mostrada adiante.
Por outro lado, pode-se formar outra classe de geodsicas icosadricas com T = 3, o que
comporta 180 unidades estruturais; assim como icosaedros T = 7, comportando 420 unidades
estruturais. Essa ltima classe possibilita que os arranjos sejam tanto dextrgiros quanto levgiros,
mas somente um selecionado quando o DNA acrescentado partcula.
Portanto, o nmero total de unidades estruturais de um capsdeo icosadrico qualquer ser 60T;
desses, 60 sero obrigatoriamente consumidos na formao de 12 pentmeros (60/5 = 12), restando
60T 60 unidades estruturais, que sero consumidas na formao dos hexmeros, sendo (60T
60)/6 = 10T 10. Assim, o nmero total de capsmeros (hexmeros + pentmeros) em um capsdeo
com 60T unidades estruturais ser:
C = 10T 10 + 12
C = 10T + 2
Em que C o nmero de capsmeros e T o nmero de triangulao.

Figura 5.6 Vrus com simetria octadrica (fago mega). As figuras A e B foram obtidas aps colorao com acetato de
uranila. Observa-se a conformao deltadrica de um octaedro regular na cabea do fago, representado em uma figura de
papelo no canto inferior direito da foto A.

Classe de icosaedros
Ser apresentado o desenvolvimento da teoria de Caspar e Klug (1962) para o desenho dos
capsdeos de simetria icosadrica, visto que a deduo da topologia do modelo no foi publicada no
trabalho desses autores. O mesmo desenvolvimento pode ser aplicado para vrus de simetria
octadrica.

Um icosaedro regular (Figura 5.7C) construdo recortando-se 20 tringulos do plano mostrado


na Figura 5.7A e dobrando-se conforme indicado na Figura 5.7B. Esse o plano de construo de um
icosaedro. A rea da face triangular desse icosaedro unitria, pois um icosaedro da classe T = 1.
A partir da Figura 5.7A, possvel escolher icosaedros com faces equivalentes a vrios tringulos
unitrios, bastando selecionar as coordenadas h, k para os segundo e terceiro vrtices (o primeiro
est selecionado na origem [0, 0] dessas coordenadas), definindo a face triangular que servir de
modelo para a geodsica icosadrica que se deseja construir. As coordenadas h, k esto separadas
por um ngulo de 60. A Figura 5.8 mostra o procedimento geral.

Figura 5.7 A. Retculo equitriangulado formador de deltaedros (slidos de faces triangulares com simetria icosadrica) com
as coordenadas h e k divergindo em ngulo de 60. B. Para formar uma figura de simetria icosadrica, seleciona-se o
primeiro vrtice em h, k (0, 0) e o seguinte em um valor qualquer h, k (o terceiro fica automaticamente determinado, uma
vez que a face delimitada equiltera), que no exemplo da figura (1, 1). C. O icosaedro moldado de acordo com o
recorte mostrado, que define as faces da figura, as quais podem estar subdivididas conforme as coordenadas tomadas no
plano reticular. O numero de triangulao, T, ser determinado pelos valores tomados das coordenadas h e k.

Figura 5.8 Determinao de coordenadas para a construo de um icosaedro com face subdividida em qualquer nmero
de tringulos unitrios.

Um dos lados desse tringulo dever coincidir com a diagonal b do paralelogramo (linhas
pontilhadas na Figura 5.3) traado de acordo com as linhas das coordenadas h, k, cuja expresso

dada pela conhecida frmula:

Temos que = 120, portanto, cos = 1/2, ento, a equao anterior fica:

Sabe-se que a rea de um tringulo o produto do semicomprimento da base b por sua altura L,
ou seja:

E o valor da altura dado pela equao:

De modo que a rea do tringulo equiltero geral da Figura 5.8 ser dada pela equao:

Considere-se, agora, um tringulo unitrio definido como Au = 1 que forma o retculo da Figura
5.8. Sua rea, Au, ser:

Se a geodsica icosadrica formada a partir desse retculo tiver sua face triangular constituda de
um ou mais desses tringulos unitrios do retculo, o nmero de tringulos unitrios contidos na face
triangular da figura, T (nmero de triangulao), ser:

Ou seja,

Sendo (h, k) nmeros inteiros no negativos.


Fatorando os diversos valores de T, chega-se equao T = Pf2, em que P assume valores
inteiros correspondentes srie 1, 3, 7, 13, 19, 21, 31,... h2 + hk + k2, para todos os pares de inteiros
(h, k), no tendo fator comum e f sendo qualquer inteiro. As classes observadas nos vrus
icosadricos so as seguintes:
P = 1 (Figura 5.9), que resulta quando a seleo do segundo vrtice feita ao longo da
coordenada h, sendo k = 0. Neste caso, T = h2 e o nmero de capsmeros ser C = 10 h2 + 2.
Nesta classe, as arestas da figura icosadrica esto preenchidas com capsmeros, e isso identifica
a classe a que pertence o vrus
P = 3 (Figura 5.10), quando a seleo do segundo vrtice tem por coordenadas h = k. Neste caso,
temos T = 3 h2 e C = 30 h2 + 2. Nesta classe, as arestas no esto totalmente, seno parcialmente,

preenchidas com capsmeros


P = 7 (Figura 5.11). A esta classe pertencem as superfcies enantiomrficas, ou seja, formas que
podem ser construdas tanto no sentido levgiro quanto no dextrgiro. Nestas classes, h, k 0 e h
k, sendo T = h2 + hk + k2. A razo deste enantiomorfismo que, para qualquer icosaedro desta
classe, h sempre dois grupos de coordenadas simtricas entre si (h = m, k = n e h = n, k = m)
para um mesmo valor de T e C. Cada par de icosaedros torcidos enantiomorfo entre si. Por
conveno, sero levgiros quando h > k e dextrgiros quando h < k.
Desse modo, generalizam-se T = Pf2 e C = 10 T + 2 (para capsmeros penta e hexamricos).

Figura 5.9 Icosaedros da classe P = 1 com sua respectiva srie (T = 1, 4, 9 etc.), tomada conforme o plano geral de
construo sobre o retculo equitriangulado padro. Note que cada unidade estrutural ocupar um vrtice dos tringulos
unitrios do plano geral.

Figura 5.10 Icosaedros da classe P = 3 com sua respectiva srie (T = 3, 12 etc.), tomada conforme o plano geral de
construo sobre o retculo equitriangulado padro. Note que cada unidade estrutural ocupar um vrtice dos tringulos
unitrios do plano geral.

Figura 5.11 Icosaedros da classe P = 7. Note que cada unidade estrutural ocupa um vrtice dos tringulos unitrios do
plano geral. A partir dessa classe, os icosaedros construdos podem ser levgiros ou dextrgiros, sendo um deles
selecionado durante a incorporao do DNA viral. Na figura est ilustrada apenas a forma levgira.

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Introduo
O prefixo pato (do grego, pathos) significa sofrimento ou doena e utilizado em diversos
termos para definir os processos envolvidos nas doenas, tais como:
Patgeno: agentes infecciosos capazes de causar doena
Patologia: estudo da natureza e das modificaes estruturais e/ou funcionais produzidas por
doena no organismo
Patogenicidade: capacidade de o agente infectar o hospedeiro e causar doena
Patognese ou patogenia: os dois termos so sinnimos e so utilizados para definir as etapas ou
mecanismos envolvidos no desenvolvimento de uma doena.
Virulncia uma palavra que vem do latim (virulentia) e pode ser usada de vrias maneiras; em
algumas situaes, o termo virulento usado como sinnimo de patognico. Assim, so descritas
variantes virulentas (ou patognicas), capazes de causar doena, e variantes no virulentas (ou no
patognicas) de um agente infeccioso.
Em outras circunstncias, o termo virulncia pode ser usado para expressar o grau de
patogenicidade; embora, por definio, um patgeno seja capaz de causar doena, alguns esto mais
capacitados a causar doena que outros. Em alguns casos, certas variantes de um determinado agente
so mais virulentas que outras.
Finalmente, o termo virulncia pode ser usado em referncia gravidade da doena, o que
significa que um patgeno mais virulento que outro se este for capaz de causar doena mais grave.

Transmisso dos vrus na natureza


Os vrus somente so mantidos na natureza se puderem ser transmitidos de um hospedeiro para
outro, da mesma espcie ou no. A transmisso dos vrus na natureza pode ocorrer de maneira
horizontal, de um indivduo para outro da mesma espcie ou no; ou vertical, da me para o
embrio/feto (esse processo pode ocorrer durante a gestao ou durante o nascimento).

A transmisso horizontal pode ocorrer por diversos meios. So eles:


Contato: pode ocorrer diretamente de um indivduo infectado para um hospedeiro suscetvel por
meio de contato sexual, saliva, contato direto com pele infectada, ou indiretamente por fmites
(objetos) ou perdigotos (aerossis de secrees respiratrias ou saliva)
Veculo: gua ou alimentos contaminados
Vetores: os vrus podem ser transmitidos por meio de animais vertebrados ou invertebrados,
sendo possvel classificar os ltimos em vetores biolgicos (o vrus replicado no vetor) ou
mecnicos (o vetor apenas carreia o vrus).

Estabelecimento da infeco
Para garantir que a infeco seja bem-sucedida, necessrio que pelo menos 3 requisitos sejam
atendidos: o inculo viral deve ser suficiente para iniciar a infeco; as clulas no stio inicial da
infeco devem ser acessveis, suscetveis e permissivas ao vrus; e os mecanismos de defesa local
do hospedeiro devem estar ausentes ou ineficientes.

Inculo viral
Esse requisito impe uma barreira substancial infeco e representa um elo sensvel na
transmisso do vrus de um hospedeiro para outro. Partculas virais livres sofrem presso de um
ambiente hostil, alm de uma diluio que reduz a sua concentrao. Os vrus transmitidos por gua
contaminada precisam manter-se estveis na presena de choque osmtico, alteraes de pH e luz
solar, e no devem se adsorver de modo irreversvel a resduos contidos na gua. Os vrus
transmitidos por aerossis devem permanecer hidratados e em altas concentraes para infectar o
prximo hospedeiro. Esses vrus so transmitidos mais eficientemente em situaes em que os
indivduos esto em contato prximo. Diferentemente, os vrus transmitidos por insetos, contato com
mucosas, ou outras maneiras de contato, incluindo agulhas contaminadas, tm pouca exposio ao
ambiente. Ainda que as partculas virais permaneam infecciosas ao passar de um hospedeiro para
outro, a infeco poder no ser bem-sucedida devido concentrao insuficiente de partculas.

Local de entrada
O sucesso da infeco tambm depende da acessibilidade fsica das clulas na porta de entrada,
da suscetibilidade (presena de receptores celulares) e da permissividade (presena de produtos
intracelulares necessrios replicao dos vrus).

Defesa local do hospedeiro


Para iniciar a infeco, os vrus precisam dispor de mecanismos que lhes possibilitem contraatacar as defesas do hospedeiro atravs de mecanismos passivos, ativos ou pela combinao de
ambos. O padro da infeco resultante determinado pela cintica da replicao do vrus diante das
defesas do hospedeiro. A interao entre a ao do vrus e as defesas do hospedeiro dinmica.
Haver consequncias distintas para vrus que replicam mais rapidamente ou lentamente, dependendo
da intensidade da defesa do hospedeiro.
Os mecanismos de evaso ativa das defesas do hospedeiro requerem a sntese de produtos
gnicos virais. Provavelmente, os processos evolutivos possibilitaram o desenvolvimento de
mecanismos virais de evaso, modulao ou desarme das defesas do hospedeiro.
Alguns vrus podem evadir-se das defesas do hospedeiro de um modo passivo, em virtude de
concentraes extremamente elevadas de partculas no inculo. A passagem de vrus atravs das
barreiras fsicas da pele e das mucosas pode ser possvel pela existncia de cortes, abrases ou
perfuraes de agulhas. Alguns vrus produzem infeces em stios em que as clulas no esto
diretamente expostas ao dos anticorpos ou linfcitos citotxicos. Um rompimento mais marcante
das defesas primrias e secundrias ocorre durante o transplante de rgos, o que coloca os vrus em
contato direto com as clulas suscetveis dos pacientes imunossuprimidos.

Rotas de entrada dos vrus no organismo


Em geral, os vrus penetram nos organismos pelo contato com as clulas nas superfcies do
corpo. Os stios de entrada comumente utilizados por vrus incluem as mucosas dos sistemas
respiratrio e urogenital, a conjuntiva, o trato gastrointestinal e a pele.

Mucosas
As superfcies mucosas representam uma vasta rea do corpo coberta por barreiras epiteliais.
Devido ao fato de as mucosas estarem em contato com o ambiente externo e, portanto, em contato
frequente com antgenos estranhos, esses tecidos so imunologicamente ativos. A maioria das clulas
das mucosas envolvidas na defesa imunolgica est distribuda difusamente pelo tecido conjuntivo e
direta ou indiretamente responsvel por funes efetoras, tais como evitar a entrada de patgenos
pela barreira epitelial e destruir patgenos e/ou clulas infectadas, caso a invaso ocorra. Essas
clulas efetoras incluem linfcitos B, linfcitos T citotxicos (CTL) e clulas NK (natural killer).
Alm disso, macrfagos e clulas dendrticas presentes na mucosa fagocitam patgenos e resduos
macromoleculares, e tambm monitoram a mucosa para a deteco de antgenos estranhos. A ao
coletiva dessas clulas minimiza a invaso de patgenos e a infeco das mucosas. A maioria dos

eventos que induz a produo de resposta efetora ocorre em stios sentinelas das mucosas, que so
caracterizados pela existncia de tecidos linfoides organizados, constitudos por folculos linfoides
primrios compostos de grupos de clulas B imaturas e reas adjacentes de clulas T. Acima de cada
folculo existe uma regio rica em clulas B, clulas T e clulas dendrticas, que funcionam em
estreita colaborao com a barreira epitelial adjacente.
Nas mucosas dos intestinos, das tonsilas e adenoides, assim como nas submucosas das vias
respiratrias superiores e no apndice, existem folculos linfoides que so recobertos na face luminal
por um epitlio associado-folculo especializado, constitudo, principalmente, por clulas colunares
absortivas e clulas M (clulas epiteliais membranosas). Estas ltimas so clulas epiteliais
especializadas presentes somente no epitlio de folculos do tecido linftico associado a mucosas;
so polarizadas e formam junes coesas que definem 2 domnios plasmticos principais: apical e
basolateral. Sua principal caracterstica apresentar um subdomnio incomum na membrana
basolateral que amplifica a superfcie celular e forma uma bolsa intraepitelial. Essa bolsa fornece um
reservatrio para subpopulaes de linfcitos B e T, clulas dendrticas e macrfagos intraepiteliais,
assim como reduz a distncia que os antgenos precisam transcorrer entre a face apical e a
basolateral da barreira epitelial (Figura 6.1). As clulas M so estrutural e funcionalmente
especializadas no transporte e na apresentao de antgenos e microrganismos ao tecido linftico.
Endocitam e transferem antgenos, por transcitose, para o tecido linfoide localizado abaixo do
epitlio, onde o material endocitado pelas clulas M na face luminal atravessa o citoplasma intacto e
transferido para a membrana basal e para o espao extracelular. Contudo, o transporte de antgenos
realizado pelas clulas M tem desvantagens, pois alguns patgenos exploram essa caracterstica de
promover a captura de antgenos para apresentar s clulas do sistema imunolgico, para ganhar
acesso a tecidos mais profundos do organismo.

Mucosa do sistema respiratrio


O sistema respiratrio , provavelmente, a rota mais comum de entrada dos vrus no organismo
(Quadro 6.1). Existem vrios mecanismos de defesa do hospedeiro que objetivam bloquear a
infeco do sistema respiratrio; no entanto, muitos vrus penetram no organismo atravs dessa via,
pelo contato com perdigotos (aerossis) provenientes de tosse e espirro ou saliva de indivduos
infectados.
Barreiras mecnicas desempenham papel importante na defesa contra infeces virais que
acometem o sistema respiratrio, como a camada de clulas ciliadas que recobre o tecido das vias
respiratrias, clulas secretoras de muco (goblet cells) e glndulas subepiteliais secretoras de muco.
As partculas estranhas so capturadas pelo muco presente na cavidade nasal e no sistema
respiratrio superior, sendo deglutidas aps serem carreadas para a garganta, com o auxlio do
movimento das clulas ciliadas.

No sistema respiratrio inferior, as partculas capturadas no muco tambm so carreadas para a


garganta com o auxlio das clulas ciliadas. A poro mais baixa do sistema respiratrio inferior, os
alvolos, no contm clios ou muco; contudo, apresentam macrfagos que so responsveis pela
fagocitose e pela destruio das partculas estranhas.
O tamanho da partcula fundamental para o estabelecimento da infeco. Partculas maiores no
atingem as pores mais profundas dos pulmes, enquanto partculas menores de 5 m alcanam os
alvolos. Dessa maneira, gotculas de suspenses infecciosas maiores ficam depositadas na cavidade
nasal, enquanto gotculas menores alcanam os alvolos. As partculas inaladas que chegam aos
alvolos so fagocitadas por macrfagos alveolares. A maioria dos agentes infecciosos destruda
por esses macrfagos; contudo, muitos patgenos, incluindo vrios vrus, conseguem escapar da
destruio por essas clulas.

Figura 6.1 Representao esquemtica das clulas M.

Quadro 6.1 Stios de replicao viral no sistema respiratrio.


Stio de infeco

Manifestao clnica

Exemplo de vrus

Rinite, sinusite, faringite, laringite,

Rinovrus, coronavrus, vrus da


parainfluenza, vrus da influenza, vrus

Sistema respiratrio superior


Boca, cavidades nasais, faringe, laringe,

tonsilas

tonsilite

respiratrio sincicial, adenovrus,


metapneumovrus humano, bocavrus
humano

Sistema respiratrio inferior


Traqueia, brnquios, bronquolos, alvolos Traque te, bronquite, bronquiolite,
pulmonares
pneumonia

Vrus da parainfluenza, vrus da influenza,


vrus respiratrio sincicial,
metapneumovrus humano, bocavrus
humano

Uma vez que ocorra a infeco do sistema respiratrio, esta pode ficar restrita ao epitlio do
sistema respiratrio ou pode ser disseminada pelo organismo.

Mucosa do trato gastrointestinal


A mucosa do trato gastrointestinal uma rota comum de entrada e disseminao de vrus. um
ambiente extremamente hostil devido a acidez do estmago, alcalinidade do intestino, presena de
sais biliares, enzimas digestivas, camada de muco, anticorpos da classe IgA e clulas fagocitrias.
Os vrus que infectam o organismo por essa rota so resistentes a extremos de pH, proteases e sais
biliares. Os vrus que no apresentam essas caractersticas so destrudos quando expostos s
condies do trato gastrointestinal.
Praticamente toda a superfcie do intestino coberta por clulas epiteliais colunares que
apresentam microvilosidades na superfcie apical. Essa superfcie ciliada, semelhante a uma escova,
em conjunto com uma superfcie recoberta de enzima digestiva, glicolipdios, alm de uma camada
de muco, permevel a eletrlitos e nutrientes, mas representa uma barreira para microrganismos.
No entanto, alguns vrus, tais como adenovrus, norovrus, rotavrus e astrovrus, dentre outros, so
replicados eficientemente nas clulas do epitlio intestinal.
O mecanismo pelo qual os vrus atravessam as barreiras fisiolgicas do trato gastrointestinal e
atingem as clulas suscetveis ainda no est completamente esclarecido. Sugere-se que a transcitose
mediada pelas clulas M seria o mecanismo pelo qual alguns vrus teriam acesso a tecidos profundos
do hospedeiro a partir do lmen do intestino.
Aps atravessar a mucosa, os vrus podem invadir os vasos linfticos e capilares do sistema
circulatrio, facilitando a disseminao no organismo. No entanto, alguns vrus so replicados nas
clulas M e no so disseminados para os tecidos adjacentes.
Os vrus tambm podem invadir o organismo pela mucosa anal. provvel que as clulas M
presentes no clon facilitem a entrada desses vrus e sua invaso ao tecido linftico.

Mucosa do sistema urogenital


O sistema urogenital bem protegido por barreiras fisiolgicas, incluindo muco e pH cido. A

atividade sexual pode resultar em abrases no epitlio vaginal ou na uretra, possibilitando a entrada
de vrus que podem infectar o epitlio e causar leses locais. Outros vrus ganham acesso s clulas
dos tecidos adjacentes e podem causar infeces disseminadas.

Mucosa da conjuntiva
A conjuntiva constantemente lavada pela secreo ocular e pelo movimento das plpebras.
Dessa forma, a possibilidade de ocorrer infeco viral atravs do olho muito pequena, a menos que
haja abraso da mucosa. A infeco viral no olho pode ocorrer durante procedimentos oftlmicos ou
por contaminao do ambiente como, por exemplo, pela contaminao da gua de piscinas. Na
maioria dos casos, a replicao localizada e resulta na inflamao da conjuntiva. rara a
disseminao sistmica do vrus a partir do olho, embora possa acontecer (p. ex., doena paraltica
aps conjuntivite por enterovrus 70).

Pele
A poro mais superficial da pele, a epiderme, composta por vrias camadas de clulas
epiteliais chamadas de queratincitos. Essas clulas so produzidas nas camadas mais internas da
epiderme (basal e germinativa) e sofrem queratinizao ou corneificao durante sua migrao para a
superfcie, dando origem camada crnea, composta basicamente de queratina, que responsvel
pela impermeabilizao da pele. Alm dos queratincitos, encontram-se na epiderme os melancitos
e as clulas de defesa imunolgica (clulas de Langerhans). Os queratincitos proveem rgida e
impermevel barreira entrada de vrus. Desse modo, os vrus s podem penetrar no organismo pelo
rompimento da integridade da pele, produzindo leses locais aps penetrao atravs de pequenas
abrases. Em geral, a replicao limitada ao local de entrada, porque a epiderme destituda de
vasos sanguneos ou linfticos que poderiam facilitar a disseminao dos vrus.
A epiderme est apoiada na derme, uma camada extremamente vascularizada. Muitos vrus
podem ter acesso derme por meio da picada de vetores artrpodes, tais como mosquitos, caros ou
carrapatos. Pode ocorrer ainda a inoculao viral mais profunda, no msculo abaixo da derme, por
meio de agulhas contaminadas instrumentos utilizados em tatuagens e na colocao de piercings. H
tambm a penetrao pelo contato sexual em que agentes infecciosos presentes em fluidos corporais
penetram pelas abrases ou ulceraes da pele. Infeces letais podem tambm ser adquiridas por
mordida de um animal. Diferentemente da infeco localizada na epiderme, os vrus que iniciam
infeco na derme ou tecidos adjacentes podem atingir vasos sanguneos, tecido linftico e clulas do
sistema nervoso, com consequente disseminao para outros stios do organismo.

Tropismo

Muitos vrus no so replicados em todos os tipos celulares do hospedeiro, ficando restritos a


algumas clulas especficas de certos rgos. Tropismo a capacidade do vrus para infectar alguns
tecidos do hospedeiro e no outros; por exemplo, um vrus enterotrpico replicado no intestino, ao
passo que um vrus neurotrpico replicado nas clulas do sistema nervoso. Alguns vrus so
pantrpicos, infectando diversos tipos de clulas e tecidos e sendo replicados neles. O tropismo
determinado pela existncia de receptores celulares (suscetibilidade), assim como de constituintes
intracelulares essenciais para a sntese viral (permissividade). Contudo, ainda que a clula seja
suscetvel e permissiva, a infeco pode no ocorrer em virtude da dificuldade de o vrus interagir
diretamente com o tecido (acessibilidade). Finalmente, a infeco pode no ocorrer ainda que a
clula seja acessvel, suscetvel e permissiva, devido s defesas imunolgicas inatas presentes no
local da infeco.

Mecanismos de disseminao dos vrus pelo organismo


Os vrus podem permanecer localizados na superfcie do corpo na qual penetraram ou podem
causar infeces disseminadas. Para uma infeco se espalhar para alm do stio primrio,
necessrio ultrapassar as barreiras fsicas e imunolgicas. Aps cruzar o epitlio, as partculas
virais alcanam a membrana basal, comprometendo sua integridade pela destruio das clulas
epiteliais e pelo processo inflamatrio. Abaixo da membrana esto os tecidos subepiteliais, nos
quais os vrus encontram fluidos teciduais, sistema linftico e fagcitos. Todos apresentam papel
importante na eliminao das partculas estranhas; contudo, tambm podem disseminar os vrus a
partir do stio primrio da infeco.

Liberao direcionada das partculas virais


Um mecanismo importante para possibilitar o escape das defesas locais do hospedeiro e facilitar
o espalhamento da infeco no organismo a liberao direcionada das partculas virais pelas
clulas polarizadas na superfcie da mucosa. Os vrus podem ser liberados pela face apical ou
basolateral ou por ambas (Figura 6.2).
Aps a replicao, os vrus que so liberados por meio da face apical retornam ao ponto inicial
da infeco, iro infectar clulas vizinhas ou sero eliminados do organismo. Contrariamente, as
partculas virais liberadas da face basolateral das clulas epiteliais polarizadas so protegidas dos
mecanismos de defesa do lmen; portanto, a liberao direcionada o principal determinante do
padro de infeco. Em geral, os vrus liberados na membrana apical estabelecem uma infeco
localizada ou limitada. Nesses casos, o espalhamento local clula a clula ocorre no epitlio
infectado, mas as partculas virais raramente invadem os vasos linfticos e sanguneos adjacentes.
Por outro lado, a liberao dos vrus na membrana basolateral possibilita o acesso aos tecidos

adjacentes e pode facilitar o espalhamento sistmico.

Disseminao local pela superfcie do epitlio


Aps a penetrao dos vrus nas clulas do epitlio, ocorre a replicao com invaso das clulas
vizinhas pelos novos vrus formados. Essa a maneira de disseminao dos vrus que causam
infeco localizada na pele e nas mucosas. Os vrus que entram no corpo via trato gastrointestinal ou
sistema respiratrio tambm podem ser disseminados rapidamente pela superfcie epitelial, com o
auxlio do movimento mucociliar local.

Disseminao pelos nervos perifricos


Muitos vrus se disseminam a partir do stio primrio da infeco por meio das terminaes
nervosas locais. Para alguns vrus, a disseminao neural a caracterstica definitiva da sua
patognese; para outros, a invaso do sistema nervoso um desvio pouco frequente do seu stio de
replicao e destino. Alguns vrus podem atingir o tecido cerebral por via hematognica; outros vrus
ganham acesso ao sistema nervoso central via nervo olfatrio ou oftlmico (Quadro 6.2). Nossa
compreenso sobre os processos de locomoo das partculas virais nas clulas do sistema nervoso
limitada. Aparentemente, os vrions entram nos neurnios por meio dos mesmos mecanismos
usados em outros tipos celulares. Como a sntese de protenas no ocorre nas clulas neurais, as
partculas virais devem ser transportadas para o stio de replicao. As evidncias indicam que os
vrions so transportados para os neurnios por meio dos sistemas de transporte celulares; no
entanto, protenas virais devem orientar a direo desse transporte.

Figura 6.2 Esquema representativo da liberao de vrus em clulas polarizadas.

A disseminao dos vrus no sistema nervoso pode ocorrer em um movimento centrpeto ou


retrgrado (das extremidades para o centro) ou centrfugo ou antirretrgrado (do centro para as
extremidades).
Os vrus que infectam o sistema nervoso so chamados de neurotrpicos, e eles so, em geral,
capazes de infectar grande variedade de tipos celulares. A replicao viral costuma ocorrer em
clulas no neurais com o subsequente espalhamento dos vrus para fibras nervosas aferentes ou
eferentes no tecido infectado. Em determinadas circunstncias, os vrions podem entrar diretamente
nos neurnios sem replicao prvia em clulas no neurais; contudo, esse evento no frequente. A
menos que as partculas sejam injetadas diretamente no crebro ou medula espinhal, invadam os
neurnios olfatrios e oftlmicos ou infectem clulas ganglionares retinais, os primeiros neurnios a
serem infectados so os constituintes do sistema nervoso perifrico.
Quadro 6.2 Disseminao viral pelo sistema nervoso central.

Rota de entrada

Exemplo de vrus

Neural

Poliovrus, vrus da febre amarela, vrus da encefalite venezuelana, vrus da raiva, reovrus
tipo 3, vrus herpes simplex tipos 1 e 2

Nervo olfatrio ou oftlmico

Vrus herpes simplex, vrus da varicela-zoster, coronavrus, vrus da raiva

Hematolgica

Poliovrus, vrus do sarampo, Coxsackievrus, arenavrus, vrus da caxumba, vrus herpes


simplex, citomegalovrus humano, vrus West Nile

Disseminao linftica
Os capilares linfticos so consideravelmente mais permeveis do que os capilares do sistema
circulatrio, facilitando a entrada de vrus. Como os vasos linfticos, eventualmente, se juntam ao
sistema venoso, as partculas virais na linfa tm livre acesso circulao sangunea. Os vrus que
entram nos capilares so transportados para os linfonodos, nos quais encontram clulas migratrias
do sistema imunolgico (macrfagos e linfcitos). Alguns vrus so replicados nessas clulas e a
prognie viral liberada no plasma. A clula linftica infectada pode tambm migrar do linfonodo
local para stios distantes do sistema circulatrio.

Disseminao pelo sangue (viremia)


Os vrus que escapam das defesas locais podem chegar circulao sangunea e produzir
infeco disseminada. Entram na corrente sangunea de diferentes maneiras: pelos capilares, aps
replicao viral nas clulas endoteliais, por inoculao pela picada de um vetor ou por via
iatrognica. Uma vez no sangue, os vrus ganham acesso a todos os tecidos do hospedeiro; assim, os
vrus podem circular livres no plasma ou estar associados a leuccitos, plaquetas ou eritrcitos. Os
vrus associados a leuccitos, geralmente linfcitos e moncitos, no so eliminados to rapidamente
quanto os vrus que circulam livres no plasma, porque esto protegidos da neutralizao pelos
anticorpos e outros componentes do plasma, podendo ser carreados para tecidos distantes.
O termo viremia designa presena de partculas virais infecciosas no sangue. A viremia ativa
produzida pela replicao do vrus, ao passo que a viremia passiva resultado da introduo das
partculas virais no sangue sem que ocorra replicao no stio de entrada (p. ex., inoculao de vrus
por picada de mosquito ou agulha contaminada). A liberao de partculas virais no sangue aps a
replicao inicial no stio de entrada se constitui na viremia primria. Em geral, a concentrao de
partculas virais durante a viremia primria baixa; no entanto, a infeco disseminada subsequente
viremia primria resulta na liberao de grande quantidade de partculas virais e denominada
viremia secundria.
Em mulheres grvidas, a viremia pode resultar na transmisso da infeco para o feto. Isso pode

ocorrer por infeco direta da placenta e posterior invaso do tecido fetal, ou clulas circulantes
infectadas, tais como moncitos e linfcitos, que podem atingir a circulao fetal.
A concentrao de vrus no sangue determinada pela velocidade de replicao nas clulas
permissivas e pela velocidade com que as partculas so liberadas e retiradas do sangue. As
partculas circulantes so removidas por clulas fagocticas do sistema reticuloendotelial no fgado,
pulmes, bao e linfonodos. Os anticorpos especficos presentes no soro iro se ligar s partculas
virais e neutraliz-las. A formao de complexos vrus-anticorpo facilita a captura por macrfagos.
Os complexos vrus-anticorpo podem ser sequestrados em quantidades significativas nos rins, no
bao e no fgado.

Invaso de outros tecidos


Aps a disseminao dos vrus pelo sangue, para que continuem sendo replicados, eles precisam
invadir novas clulas e tecidos. Existem 3 tipos principais de junes tecidovaso sanguneo que
fornecem rotas de invaso tecidual. Em alguns tecidos, as clulas endoteliais esto associadas a uma
densa membrana basal; em outros stios, o endotlio contm lacunas e, em outros, podem existir
sinusoides nos quais os macrfagos formam parte da juno tecidovaso sanguneo.

Fgado, bao, medula ssea e glndulas adenoides


Esses tecidos so caracterizados pela existncia de sinusoides (ou cavidades) recobertos por
macrfagos. Tais macrfagos, que pertencem ao sistema reticuloendotelial, funcionam filtrando o
sangue e removendo partculas estranhas. Essas clulas, frequentemente, constituem-se em uma porta
de entrada para os vrus em vrios tecidos. Os vrus costumam infectar o fgado pelo sangue,
resultando na infeco das clulas de Kupffer (macrfagos que recobrem os sinusoides hepticos).
A interao dos vrus com as clulas hepticas pode resultar em:

Passagem de partculas virais para os sinusoides, sem serem fagocitadas


Fagocitose e destruio das partculas virais
Replicao viral nas clulas de Kupffer
Transferncia das partculas virais por transcitose, para as clulas hepticas em que sero
replicadas e excretadas no ducto biliar
Replicao nas clulas de Kupffer e nas clulas endoteliais, seguida da infeco dos hepatcitos
e excreo no ducto biliar.

Glomrulos renais, pncreas, leo e clon


Esses tecidos no possuem sinusoides e, portanto, os macrfagos no esto presentes. Para

infectar tais tecidos, os vrus devem, a princpio, aderir s clulas endoteliais, geralmente dos
capilares ou vnulas, em que o fluxo sanguneo lento e as paredes so menos espessas. Como as
clulas endoteliais no so muito fagocticas, a adeso das partculas virais a essas clulas depende
da presena de receptores celulares. Para aumentar a chance de adeso, necessrio que as
partculas estejam presentes em concentraes elevadas e permaneam em circulao por tempo
suficiente. Uma vez que os vrus estejam aderidos parede do vaso, podem invadir rapidamente os
glomrulos renais, pncreas, leo e clon, porque a juno das clulas endoteliais que recobrem os
capilares, nesse caso apresenta brechas (fendas entre as clulas; junes frouxas), o que possibilita
que os vrus ou a clula infectada atravessem para os tecidos adjacentes. Alguns vrus atravessam o
endotlio dentro de moncitos ou linfcitos enquanto esto realizando o processo de diapedese.

Sistema nervoso central, tecido conjuntivo, msculos esqueltico e cardaco


No sistema nervoso central (SNC), no tecido conjuntivo e nos msculos esqueltico e cardaco,
as clulas do endotlio capilar no apresentam brechas e so envoltas por densa membrana basal. No
SNC, a membrana basal a base para a barreira hematoenceflica. Contudo, no se trata apenas de
uma barreira, mas de um sistema de permeabilidade seletiva. Em algumas partes do crebro, o
epitlio capilar apresenta brechas, e a membrana basal esparsa; esses stios, altamente
vascularizados, incluem o plexo coroide. Alguns vrus atravessam o epitlio capilar e invadem o
estroma do plexo coroide, em que podem cruzar o epitlio e invadir o liquor por transcitose ou
replicao e liberao direta no fluido cerebroespinhal (ou liquor). Uma vez no liquor, a infeco se
espalha para as clulas ependimais que recobrem os ventrculos e os tecidos adjacentes ao crebro.
Outros vrus podem infectar diretamente ou ser transportados pelo epitlio capilar. Alguns vrus
atravessam o endotlio dentro de clulas como moncitos e linfcitos. O aumento da permeabilidade
local do endotlio capilar, causado por certos hormnios, pode tambm possibilitar a entrada de
vrus no crebro e medula espinhal.
Alguns vrus so replicados nos msculos cardaco e esqueltico ou no tecido conjuntivo. Ainda
no foram elucidados os mecanismos pelos quais esses vrus invadem esses stios pelo sangue.

Tecidos placentrio, embrionrio e fetal


A membrana basal menos desenvolvida no embrio e no feto, podendo ocorrer infeces por
invaso do tecido placentrio e subsequente invaso do tecido embrionrio ou fetal. Clulas
circulantes infectadas, tais como moncitos, podem entrar na circulao embrionria ou fetal
diretamente.

Danos teciduais induzidos por vrus

Em ltima instncia, os distrbios das funes do corpo, que so observados como sinais e
sintomas das viroses, resultam do dano causado pelos vrus nas clulas. Esses danos podem resultar
da replicao viral nas clulas, das consequncias da resposta imunolgica ou de ambas.

Efeitos da infeco por vrus citocidas


Eventualmente, a patogenia pode ser induzida pelo dano celular causado por um vrus altamente
citocida. Um dos principais mecanismos de dano celular a apoptose aps a infeco viral. Em
outras ocasies, protenas virais induzem ou bloqueiam a apoptose, presumivelmente para favorecer
a evoluo do ciclo infeccioso e a produo de nova prognie viral.
A infeco viral tambm pode resultar na interrupo de processos essenciais para o hospedeiro,
tais como sntese de protenas, sntese de cido nucleico e transporte de molculas, fazendo com que
a permeabilidade da membrana celular seja alterada. Outra possvel consequncia a difuso do
contedo dos lisossomas no citoplasma, resultando na autlise da clula.
O genoma celular tambm pode ser danificado diretamente pela infeco viral; por exemplo, a
replicao dos retrovrus requer a insero de cpias do DNA proviral em localizaes randmicas
do genoma celular. Essas inseres podem afetar a expresso ou a integridade de genes celulares.
Alguns efeitos patognicos so indiretos. Nesse caso, a infeco viral no causa morte celular,
mas pode interferir com a sntese de molculas importantes para a sobrevivncia da clula. Por
exemplo, quando o vrus da coriomeningite linfoctica inoculado em camundongos recm-nascidos,
ele replicado nas clulas da glndula pituitria que produz o hormnio do crescimento, reduzindo
significativamente sua sntese como resultado, o camundongo no se desenvolve e morre em pouco
tempo.

Imunopatologia
possvel que a resposta imunolgica seja a nica causa dos sintomas da doena em algumas
infeces por vrus. Os danos causados pelo sistema imunolgico so denominados imunopatologias
e podem representar o preo a ser pago pelo hospedeiro para eliminar a infeco viral. Para os vrus
no citopatognicos, possvel que a resposta imunolgica seja a nica causa da doena. A maioria
das imunopatologias induzidas por vrus causada por clulas T ativadas, mas h exemplos de
doenas provocadas por anticorpos ou resposta inata exagerada.
Leses causadas por linfcitos T citotxicos (CTL). Ainda no est claro o mecanismo
pelo qual essas clulas causam danos ao organismo. H evidncias de que o dano tecidual possa ser
consequncia da citotoxicidade dos CTL. Essas clulas tambm podem liberar protenas que
recrutam clulas inflamatrias para o stio da infeco, as quais liberam citocinas proinflamatrias.

Leses causadas por clulas TCD4+. Os linfcitos TCD4+ produzem mais citocinas que os
CTL, alm de recrutarem e ativarem muitas clulas efetoras no especficas. Essa reao
inflamatria denominada hipersensibilidade tardia. Muitas das clulas recrutadas so neutrfilos e
clulas mononucleares, as quais causam danos teciduais. A imunopatologia o resultado da
liberao de enzimas proteolticas, radicais reativos como perxido e xido ntrico, e citocinas.
Leses causadas por clulas B. Quando ocorre replicao viral na presena de resposta
imunolgica inadequada, acontece a formao de grandes quantidades de complexos vrusanticorpo.
Esses complexos acumulam-se em concentraes extremamente elevadas quando ocorre a replicao
viral em stios inacessveis ao sistema imunolgico ou quando a replicao viral continua na
presena de uma resposta imunolgica inadequada. Esses complexos no so removidos
eficientemente pelo sistema reticuloendotelial e permanecem circulando na corrente sangunea.
Assim, so depositados nos pequenos capilares, causando leses que so agravadas quando o
sistema complemento ativado.
Imunossupresso induzida por vrus. A modulao da resposta imunolgica por produtos
virais pode variar de uma atenuao branda e especfica at uma inibio drstica e global da
resposta. Alguns mecanismos imunossupressivos utilizados pelos vrus incluem: infeco de clulas
do sistema imunolgico, desenvolvimento de tolerncia aps a infeco fetal, interrupo de
liberao de citocinas e produo de virocinas.
Sndrome da resposta inflamatria sistmica. Um fato importante da defesa imunolgica
contra as infeces virais que quando a replicao viral atinge um determinado limiar, a resposta
imunolgica mobilizada e amplificada, resultando em uma resposta global. Em geral, essa resposta
bem tolerada e bloqueia rapidamente a infeco. A maneira como esse limiar determinado no
est clara; entretanto, se o limiar for alcanado muito rapidamente ou se a resposta imunolgica no
for proporcional infeco, a produo e a liberao de citocinas inflamatrias e mediadores de
estresse, em larga escala, podem sobrecarregar e matar o hospedeiro infectado. Esse fenmeno
costuma ocorrer em indivduos muito jovens, malnutridos ou em pacientes cujos sistemas de defesa
do organismo encontram-se comprometidos sendo, s vezes, denominado de tempestade de
citocinas.
Hiperativao do sistema imunolgico por superantgenos. Superantgenos so
protenas que atuam como potentes mitgenos de clulas T. Essas protenas se ligam s molculas do
complexo principal de histocompatibilidade (MHC) do tipo II presentes nas clulas apresentadoras
de antgenos, e interagem com a cadeia V do receptor de clulas T. Em torno de 2 a 20% das clulas
T expressam a cadeia V em que os superantgenos se ligam. Assim, em vez de serem apresentados
ao receptor de clulas T, como peptdeos, pelas molculas de MHC classe II, os superantgenos se
ligam cadeia V diretamente. Como resultado, ocorrem a ativao e a proliferao de todas as
subclasses de clulas T que expressam essa cadeia s quais os superantgenos se ligaram. Os

superantgenos interferem claramente com a coordenao da resposta imunolgica e desvia as


defesas do hospedeiro. Todos os superantgenos conhecidos so oriundos de agentes infecciosos;
muitos so protenas virais, como os produzidos pelo vrus do tumor mamrio de camundongos
(MMTV), vrus Epstein-Barr (EBV) e citomegalovrus (HCMV).
Mecanismos associados aos radicais livres. Dois radicais livres superxido (O2) e
xido ntrico (NO) so produzidos durante a resposta inflamatria e podem ter um papel importante
na patologia induzida por alguns vrus. O superxido produzido pela enzima xantino-oxidase
presente em fagcitos; por si s, no txico para algumas clulas e vrus e seu efeito deve resultar
da formao de peroxinitrito (ONOO) pela interao com o NO que produzido em abundncia nos
tecidos infectados por vrus durante a inflamao, como parte da resposta imunolgica inata. Esse
gs capaz de inibir a replicao de muitos vrus. Enquanto baixas concentraes de NO apresentam
um efeito protetor, concentraes elevadas ou produo prolongada tm o potencial de contribuir
para a induo de danos teciduais. Embora o NO seja relativamente inerte, reage rapidamente com o
O2 formando ONOO, o qual mais reativo e pode ser responsvel pelos efeitos citotxicos nas
clulas.
Autoimunidade. Doenas humanas autoimunes so causadas por uma resposta imunolgica
direcionada contra tecidos do prprio hospedeiro. Uma das hipteses para a autoimunidade induzida
por vrus teoriza que alguns agentes virais dividam determinantes antignicos comuns com os tecidos
do hospedeiro. Essa teoria denominada mmica molecular. A infeco levaria produo de uma
resposta imunolgica contra esses antgenos comuns, resultando na resposta autorreativa. Embora
muitos peptdeos virais apresentem sequncias comuns com protenas humanas, ainda difcil obter
evidncias diretas que comprovem essa teoria.

Determinantes genticos de virulncia viral


Os genes que afetam a virulncia viral podem ser divididos em 4 categorias (alguns deles podem
ser includos em mais de uma categoria). Eles codificam protenas que afetam a replicao viral;
interferem com os mecanismos de defesa do hospedeiro; facilitam a disseminao dos vrus no
hospedeiro e entre hospedeiros; e so diretamente txicos para a clula.
Produtos gnicos que afetam a replicao viral. Um requerimento primrio para a
replicao de vrus de DNA o acesso a grandes quantidades de desoxirribonucleotdeos
trifosfatados na clula, o que se torna uma limitao significativa para vrus que se replicam em
clulas diferenciadas como os neurnios. Por outro lado, o genoma de muitos vrus de DNA codifica
protenas que alteram a sntese celular de maneira que sejam produzidos substratos para a sntese de
novos vrus. Outro mecanismo a codificao de enzimas virais que funcionam no metabolismo de
nucleotdeos e sntese de DNA, tais como timidino-cinases e ribonucleotdeo-redutases. Mutaes
nesses genes frequentemente reduzem a neurovirulncia dos vrus herpes simplex pois esses mutantes

no so replicados nos neurnios ou em clulas incapazes de complementar essa deficincia.


Sequncias no codificantes que afetam a replicao viral. As variantes atenuadas
utilizadas na vacina Sabin contra os poliovrus so exemplos de vrus com mutaes em protenas
no codificantes. Cada um dos trs sorotipos virais presentes na vacina contm uma mutao na
regio 5 no codificante do RNA viral, o que impede a replicao dos vrus no SNC.
Produtos gnicos que modificam as defesas do hospedeiro. Os estudos de virulncia
viral identificaram uma gama de protenas virais que sabotam as defesas inata e adaptativa do
hospedeiro. Algumas dessas protenas virais so chamadas de virocinas (protenas virais anlogas
de citocinas, de fatores de crescimento ou de reguladores imunolgicos extracelulares; aumentam a
proliferao das clulas hospedeiras e a produo de vrus) ou virorreceptores (homlogos de
receptores celulares para citocinas e quimiocinas, ou homlogos de molculas do sistema
imunolgico na superfcie da clula). Mutaes nesses genes podem afetar a virulncia viral.
Genes que facilitam a disseminao viral. Mutaes em alguns genes virais podem afetar a
disseminao dos vrus do stio de inoculao para o rgo em que ocorre a doena. Algumas
protenas virais tm sido implicadas em neuroinvasividade como, por exemplo, a glicoprotena D
(gD) do vrus herpes simplex (HSV) tipo 1, que, ao sofrer a mudana de um nico aminocido,
bloqueia a via neural para o seu espalhamento para o SNC. Outro exemplo a protena 1 do
capsdeo dos reovrus que reconhece o receptor celular e determina a rota de disseminao para o
SNC, por via neural ou hematognica.
Toxinas virais. Alguns produtos gnicos virais podem causar dano celular diretamente; no
entanto, a virulncia reduzida caso ocorram alteraes nesses genes. O exemplo mais convincente
de uma protena viral com toxicicidade intrnseca relevante para a doena a protena NSP4 dos
rotavrus. A NSP4 uma glicoprotena no estrutural que participa do processo de maturao da
partcula viral. Ao ser administrada a camundongos jovens, a NSP4 atua como uma enterotoxina e
desencadeia uma via de transduo de sinal na mucosa intestinal. Quando essa protena produzida
em clulas de inseto e mamferos, provoca aumento da concentrao de clcio intracelular.

Evaso das defesas do hospedeiro


Os mamferos desenvolveram elaborados mecanismos de defesa para impedir as infeces por
vrus. Os vrus, por outro lado, desenvolveram mecanismos de contradefesa que os possibilitam
continuar infectando mamferos; tais mecanismos de contradefesa variam de simples a elaborados
(Quadro 6.3). Um mecanismo comum a parada da sntese de macromolculas da clula rapidamente
aps a infeco, outro seria a produo rpida da prognie viral. A rpida parada da clula
hospedeira impede a produo de interferon ou outras citocinas requeridas para as funes da
resposta imunolgica inata e adaptativa. Esse mecanismo tambm interrompe a produo de
molculas de MHC classes I e II, necessrias para o reconhecimento da clula infectada. A

replicao rpida possibilita que os vrus completem vrios ciclos de produo de partculas antes
que a resposta adaptativa seja formada e quantidades suficientes de citocinas sejam produzidas para
levar a clula a esse estado antiviral, e antes que a resposta adaptativa seja formada.
Quadro 6.3 Estratgias utilizadas pelos vrus para sua evaso do sistema imunolgico.
Rpida interrupo da sntese de macromolculas do hospedeiro
Comprometimento da produo de antgenos virais:

Restrio da expresso gnica

Infeco em stios pouco acessveis ao sistema imunolgico

Variaes antignicas

Interferncia com a apresentao de antgenos pelo MHC I e MHC II


Interferncia com a atividade das clulas NK
Interferncia com a funo das citocinas:

Produo de homlogos virais de reguladores celulares de citocina

Neutralizao da atividade das citocinas

Produo de receptores de citocinas solveis

Inibio da apoptose

J foram identificadas mais de 50 protenas virais capazes de modular os mecanismos de defesas


dos mamferos para controlar as infeces virais e para eliminar os vrus, uma vez que a infeco
ocorra.

Interferncia com a expresso de peptdeos e funo das molculas do complexo


principal da histocompatibilidade
A resposta imunolgica mediada pelos CTL representa uma ferramenta potente da defesa
adaptativa do hospedeiro contra infeces virais. Essa resposta depende, em parte, da capacidade de
as clulas T detectarem os antgenos virais na superfcie da clula infectada e as eliminarem. Tal
reconhecimento requer a apresentao de peptdeos virais por molculas de MHC de classe I (MHC
I), por vias de produo e transporte de peptdeos virais endgenos para a superfcie da clula. As
protenas virais so degradadas por meio de poliubiquitinizao e processadas no proteossoma, em

que so clivadas em pequenos peptdeos de 8 a 10 aminocidos. Esses peptdeos entram no retculo


endoplasmtico (RE) pelas protenas transportadoras de antgenos (TAP, transporters associated
proteins). Dentro do RE, o stio de ligao dos peptdeos nas molculas de MHC I est inicialmente
coberto por uma chaperona, que removida para possibilitar a ligao dos peptdeos virais. Em
seguida, os complexos peptdeosMHC I so transportados do RE para a membrana citoplasmtica
dentro de vesculas do complexo de Golgi, onde, ento, podem ser detectados pelos CTL. Todas
essas etapas podem sofrer interferncia de protenas virais que agem interrompendo ou retardando o
processo por tempo suficiente, a fim de tornar possvel a replicao viral (Figura 6.3 e Quadro 6.4).

Figura 6.3 Mecanismos de interferncia de protenas virais com a apresentao de antgenos pelo MHC I. Na clula
infectada, uma parte das protenas virais recm-sintetizadas transportada para o proteossoma, onde so digeridas em
pequenos peptdeos (laranja). Esses peptdeos so transportados para o lmen do retculo endoplasmtico (RE) por
intermdio de protenas TAP. Os peptdeos se ligam a uma fenda na molcula recm-sintetizada de MHC I (rosa); o
complexo peptdeo-MHC I ento transportado para o complexo de Golgi e, finalmente, para a superfcie da clula onde
ser reconhecido pelas clulas TCD8+. Protenas virais podem bloquear (X, vermelho) quase todas as etapas desse
processo. As setas verdes indicam estimulao. No ncleo, a transcrio dos genes de MHC I pode ser bloqueada por

protenas virais que reprimem o promotor desses genes. Para mais detalhes, ver texto. HCMV = citomegalovrus humano;
HIV-1 = vrus da imunodeficincia humana tipo 1; HPV = vrus do papiloma humano; HSV = vrus herpes simplex; VV = vrus
vaccnia; AdV = adenovrus; HHV-8 = herpesvrus humano tipo 8. TAP = transporters associated proteins; MHC = complexo
principal de histocompatibilidade; TCR = receptor de clula T; CTL = linfcito T citotxico.

Quadro 6.4 Mecanismos virais de interferncia com MHC.


Vrus

Protena viral

Mecanismo proposto

pp65

Fosforilao da protena de 72 kDa, impedindo sua degradao no proteossoma

US6

Inibio de TAP

US2 e US11

Degradao das cadeias pesadas do MHC I no proteossoma

US3

Reteno do MHC I no retculo endoplasmtico

nef

Endocitose de molculas MHC I

tat

Represso do promotor do gene de MHC I

Vpu

Desestabilizao da sntese de MHC I

Inibio de TAP

HPV

E7

Represso do promotor dos genes do MHC I

HSV

ICP 47

Inibio de TAP

VV

UL49.5

Inibio de TAP

E3/19K

Reteno do MHC I no retculo endoplasmtico

E1A

Represso do promotor dos genes do MHC I

HHV-8

K3 e K5

Endereamento das molculas de MHC I para degradao nos lisossomas

Poliovrus

3A

Inibio do transporte vesicular das molculas de MHC I

Poxvrus

T7 e B8-R

Inibio da induo da expresso de genes do MHC II

AdV

E1A

Inibio da induo da expresso de genes do MHC II

HPIV-3

V?

Inibio da induo da expresso de genes do MHC II

Vrus da caxumba

V?

Inibio da induo da expresso de genes do MHC II

NiV

V?

Inibio da induo da expresso de genes do MHC II

BZLF1

Inibio da induo da expresso de genes do MHC II

BZLF2

Interao com MHC II bloqueando a ativao dos linfcitos TCD4+

MHC I

HCMV

HIV-1

AdV

MHC II

EBV

HCMV

US2

Degradao das molculas do MHC I HLA-DR- e HLA-DM-, no proteossoma

HSV (KOS)

Remoo das molculas de MHC II do compartimento endoctico

HIV-1

Nef

Reduo da expresso de MHC II na superfcie da clula

HCMV = citomegalovrus humano; HIV-1 = vrus da imunodeficincia humana tipo 1; HPV = vrus do papiloma humano; HSV
= vrus herpes simplex; HSV (KOS) = vrus herpes simplex estirpe KOS; VV = vrus vaccnia; AdV = adenovrus; HHV-8 =
herpesvrus humano tipo 8; HPIV-3 = vrus da parainfluenza humano tipo 3; NiV = vrus Nipah; EBV = vrus Epstein-Barr;
TAP = transporters associated proteins; MHC = complexo principal de histocompatibilidade.

O processamento inicial das protenas virais pode ser interrompido pela estabilizao da
protena de tal maneira que esta no seja degradada no proteossoma. O HCMV codifica uma protena
de 72 kDa que, quando expressada juntamente com a pp65 (outra protena viral), no ocorre a
resposta mediada por CTL. A pp65 fosforila a protena 72 kDa e, de algum modo, impede que esta
seja degradada pelo proteossoma.
As TAP so tambm alvo da ao de protenas virais. Por exemplo, a protena US6 do HCMV
bloqueia o canal interno do transportador TAP na face luminal do RE, impedindo a entrada dos
peptdeos virais. A protena ICP47 dos vrus herpes simplex (HSV) se liga TAP pelo lado
citoplasmtico e bloqueia a entrada dos peptdeos no RE. A protena UL49.5 do vrus vaccnia (VV)
inibe TAP por 2 mecanismos: causando alteraes conformacionais neste complexo ou degradando
TAP no proteossoma. O vrus da imunodeficincia humana tipo 1 (HIV-1) tambm bloqueia o
transporte de peptdeos do citoplasma para o RE por um mecanismo ainda no elucidado.
O transporte da molcula de MHC I ligada ao peptdeo viral do RE para o complexo de Golgi
outro alvo das protenas virais. As protenas US11 e US2 do HCMV removem a molcula de MHC I
do RE para o citoplasma, em que elas so degradadas no proteossoma e a protena US3 se liga s
molculas de MHC I, retendo-as no RE. A glicoprotena 19 k codificada pela regio E3 dos
adenovrus (AdV) tambm retm as molculas de MHC I no RE.
Alguns peptdeos virais, tais como as protenas K3 e K5 do herpesvrus humano tipo 8 (HHV-8),
atuam como ubiquitino-ligases encaminhando as molculas de MHC I para degradao nos
lisossomas e impedindo sua expresso na superfcie da clula. A protena nef do HIV-1 reduz a
expresso das molculas de MHC I, sequestrando-as da superfcie celular e as direcionando para os
lisossomas onde sero destrudas. A protena 3A do poliovrus inibe o transporte vesicular das
molculas de MHC I. A protena tat do HIV-1, a protena E1A do AdV e a protena E7 do vrus do
papiloma humano (HPV) reprimem o promotor dos genes do MHC I, interferindo com a transcrio
de RNA mensageiros para a sntese das molculas de MHC I. A protena Vpu do HIV-1 interfere nos
estgios iniciais da sntese de MHC I, desestabilizando as molculas recm-sintetizadas por um
mecanismo ainda no elucidado.
Nas vias de apresentao de antgenos exgenos, as protenas so internalizadas e degradadas em

peptdeos que podem se ligar a molculas de MHC II presentes em clulas apresentadoras de


antgenos (APC, linfcitos B, clulas dendrticas e macrfagos). No lmen do RE as molculas de
MHC II se ligam a uma protena denominada cadeia invariante (Ii, CD74) o que impede a ligao
do MHC II com peptdeos endgenos presentes no RE e direciona a molcula para a via endoctica
pelo complexo de Golgi e trans-Golgi para um stio denominado MIIC (MHC class II loading
compartments). No MIIC, a cadeia Ii degradada por proteases, incluindo catepsinas S e L,
deixando um fragmento conhecido como peptdeo de classe II associado cadeia invariante (CLIP =
class II associated invariant chain peptide), ligado fenda da molcula de MHC II.
Os antgenos exgenos entram nas APC por endocitose e so internalizados em vesculas
(endossomas). A reduo do pH ativa proteases dentro do endossoma, levando degradao dos
antgenos exgenos em pequenos peptdeos. Este endossoma ir fundir-se com as vesculas
exocticas contendo as molculas de MHC II em subdomnios do MIIC em que o CLIP ser removido
com o auxlio das molculas de HLA-DM em pH cido, possibilitando a formao do complexo
peptdeo-MHC II, o qual ser transportado para a superfcie da clula, onde podem ser reconhecidos
pelos receptores das clulas TCD4+. As clulas TCD4+ helper (Th) ativadas estimulam os CTL e
auxiliam a coordenar a resposta antiviral. Qualquer protena viral que module a via de apresentao
de antgenos pelo MHC II ir interferir com a ativao das clulas Th. Muitos produtos virais
modulam MHC II (Figura 6.4 e Quadro 6.4).
Os vrus podem escapar da deteco pelas clulas TCD4+ por pelo menos 2 mecanismos; um
deles a inibio da induo da expresso de genes do MHC II pelo bloqueio do sinal de transduo
do interferon- (INF-) e da expresso do transativador de molculas MHC classe II (CIITA, class II
transactivator). O outro mecanismo a inibio da via de apresentao de antgeno pelo MHC II por
protenas virais que afetam a estabilidade ou o ordenamento das molculas de MHC II.

Figura 6.4 Mecanismos de interferncia de protenas virais com a apresentao de antgenos pelo MHC II. Os antgenos
exgenos entram nas APC por endocitose e so internalizados em endossomas que se fundem com vesculas endocticas
contendo as molculas de MHC II. Isso resulta na formao do complexo peptdeoMHC II, que transportado para a
superfcie da clula em que ser reconhecido pelas clulas TCD4+. Protenas virais podem bloquear (X vermelho) quase
todas as etapas desse processo. As setas verdes indicam estimulao. No ncleo, a transcrio dos genes de MHC II
pode ser bloqueada por protenas virais que reprimem o promotor desses genes. Para mais detalhes, ver texto. HCMV =
citomegalovrus humano; HIV-1 = vrus da imunodeficincia humana tipo 1; HSV = vrus herpes simplex; HPIV-3 = vrus da
parainfluenza humano tipo 3; NiV = vrus Nipah; HRSV = vrus respiratrio sincicial humano; HRV-14 = rinovrus humano tipo
14; EBV = vrus Epstein-Barr; APC = clulas apresentadoras de antgenos; TAP = transporters associated proteins; MHC =
complexo principal de histocompatibilidade; TCR = receptor de clula T.

Os poxvrus produzem protenas (p. ex., T7, B8-R) que funcionam como homlogos solveis de
receptores para IFN- (IFN-R). A protena BZLF1 do EBV reduz a transcrio do IFN-R1 e a
protena E1A do AdV inibe a transcrio de IFN-R2. Alguns paramixovrus tais como o vrus da
caxumba, o vrus da parainfluenza humano tipo 3 (HPIV-3) e o vrus Nipah (NiV) produzem uma
protena (possivelmente a protena V) que interfere com STAT1 (signal transducer and activator of
transcription 1).

descrito que a protena US2 do HCMV promove a degradao de 2 componentes das molculas
de classe II no proteossoma, HLA-DR- e HLA-DM-, impedindo o reconhecimento pelas clulas
TCD4+. A protena BZLF2 do EBV interage com as molculas de MHC II no citoplasma e na
superfcie da clula, bloqueando a ativao de linfcitos TCD4+. A infeco pela estirpe KOS do
HSV remove molculas de MHC II de compartimentos de vesculas endocticas. A protena nef do
HIV-1 reduz a expresso de MHC II na superfcie da clula, possivelmente por interferir com a
acidificao nas vesculas endossomais, afetando a formao do complexo peptdeo-MHC II.
Alguns vrus inibem a apresentao de antgenos pelo MHC II por induo de secreo de IL-10
ou expresso de homlogos virais de IL-10, que podem reduzir a expresso de MHC II na superfcie
celular retendo os complexos peptdeo-MHC II no MIIC (Quadro 6.5).
Quadro 6.5 Exemplos de vrus que induzem a expresso de interleucina 10 (IL-10) ou codificam homlogos de IL-10.
Induo da expresso de IL-10

Expresso de homlogos de IL-10

HIV; HCMV; HRV-14; HPIV-3; HRSV

EBV; HCMV

HIV = vrus da imunodeficincia humana; HCMV = citomegalovrus humano; HRV-14 = rinovrus humano tipo 14; HPIV-3
vrus da parainfluenza humano tipo 3; HRSV = vrus respiratrio sincicial humano; EBV = vrus Epstein-Barr.

Interferncia com a atividade do sistema complemento


Clulas infectadas podem ser destrudas por meio do complemento, por uma via ativada pelos
anticorpos ligados aos antgenos virais na superfcie da clula. A neutralizao viral por anticorpos
tambm amplificada pela ao do complemento. Os herpesvrus expressam protenas que
interferem com a ativao do complemento como, por exemplo, os HSV, que contm a glicoprotena
C(gC) na superfcie da partcula que se liga ao componente C3b, bloqueando o incio da cascata do
complemento. Os HSV tambm expressam um complexo de protenas (gE e gI), que apresentam
receptor para a frao Fc da imunoglobulina. Esse complexo liga-se IgG pelo domnio Fc,
bloqueando a ativao do complemento. O HCMV tambm expressa protenas que funcionam como
receptor para Fc.

Infeco de clulas do sistema imunolgico


Alguns vrus infectam clulas do sistema imunolgico como linfcitos e macrfagos. Alm de
desempenharem papel direto nas defesas imunolgicas, essas clulas tambm migram por todo o
organismo, facilitando o transporte desses vrus. A infeco ltica pelo HIV nos linfcitos T induz
uma profunda imunossupresso, uma vez que essas clulas so necessrias produo da resposta
imunolgica. Da mesmo modo, o vrus do sarampo infecta diversas clulas do sistema imunolgico,

incluindo linfcitos T e B, e moncitos, resultando em uma imunossupresso que persiste por


algumas semanas aps a infeco. Outros vrus infectam clulas T, clulas B, macrfagos ou outras
clulas importantes para a resposta imunolgica. Alm disso, a infeco do timo por vrus no incio
da vida de um animal, quando o sistema imunolgico ainda est se desenvolvendo, pode resultar em
tolerncia imunolgica, que faz com que o vrus no seja reconhecido como um antgeno estranho.
Isso possibilita que o vrus estabelea uma infeco que perdura para toda a vida.

Reduo da atividade das clulas natural killer


As clulas natural killer (NK) so as principais efetoras da resposta imunolgica inata a
infeces virais. A funo das clulas NK induzir a lise da clula infectada por meio da liberao
de grnulos citotxicos, tais como perforinas e granzimas. A ao das clulas NK controlada pelo
balano dos receptores de ativao e inibio presentes nessas clulas (Quadro 6.6). As molculas
de MHC I se ligam em receptores na superfcie das clulas NK, inibindo a atividade dessas clulas.
A reduo da expresso de MHC I torna a clula infectada mais suscetvel lise pela ao das
clulas NK. A reduo da expresso de MHC I um evento comum em infeces virais; nesse
sentido, a clula infectada atuaria causando sua prpria destruio, promovendo assim um
mecanismo de proteo.
Quadro 6.6 Exemplos de receptores de inibio e ativao encontrados em clulas NK.
Receptor

Efeito nas clulas NK

CD94/NKG2A

Inibio

Ly49I

Inibio

LIR-1

Inibio

Ly49H

Ativao

IL18R

Ativao

NKG2D

Ativao

Os vrus podem provocar a inibio das clulas NK por vrios mecanismos. A inibio pode ser
causada por: modificao da expresso de ligantes na superfcie da clula infectada, seja por
aumento da expresso de ligantes de inibio, expresso de molculas virais que mimetizam ligantes
de inibio ou decrscimo da expresso de ligantes de ativao, inibio de citocinas como IFN- ou
IL-18, expresso de molculas virais que competem com receptores de IL-18, sequestro intracelular
de quimiocinas ou interferncia com a liberao de grnulos citotxicos como perforinas e
granzimas. Exemplos desses mecanismos so mostrados na Figura 6.5.

As clulas humanas esto protegidas da destruio pelas clulas NK primariamente pelas


molculas de HLA-C e HLA-E. As clulas infectadas pelo HIV provavelmente tambm se protegem
da atividade das clulas NK, por um mecanismo de interferncia com a expresso das molculas do
MHC I, reduzindo seletivamente a expresso de molculas de HLA-A e HLA-B, as quais so
molculas do MHC I de reconhecimento para a maioria dos CTL. Isso no afeta a expresso de
molculas HLA-C ou HLA-E. Dessa maneira, as clulas so resistentes lise mediada por clulas
NK e, embora permaneam sensveis lise por CTL, essa sensibilidade est fortemente reduzida.

Variaes antignicas
Os hospedeiros que sobrevivem infeco aguda tornam-se, em geral, imunes infeco pelo
mesmo vrus, por toda a vida, como ocorre, por exemplo, com o poliovrus e o vrus do sarampo. Por
outro lado, a infeco aguda causada por alguns vrus (p. ex., rinovrus e vrus da influenza) ocorre
repetidamente, apesar da eliminao do vrus pelo sistema imunolgico. Os mecanismos
responsveis por reinfeces ainda no so completamente compreendidos, mas as propriedades
estruturais dos vrus e a capacidade dos anticorpos neutralizantes de bloquear a infecciosidade dos
vrus so parmetros crticos.
Os vrus que conseguem tolerar diversas substituies de aminocidos nas suas protenas
estruturais e permanecem infecciosos apresentam o que se denomina plasticidade estrutural (p. ex.,
HIV, vrus da influenza, rinovrus). Assim, os vrus que sofrem mutaes no so completamente
neutralizados pelos anticorpos j existentes no organismo, podendo acarretar a reinfeco dos
indivduos que esto parcialmente protegidos. Por outro lado, alguns vrus no suportam alteraes
indiscriminadas de aminocidos (p. ex., poliovrus, vrus do sarampo, vrus da febre amarela), e
rara a ocorrncia de mutaes em genes que codificam protenas estruturais e que resultem na
reduo da capacidade de reconhecimento pelos anticorpos.
Os princpios envolvidos na seleo e manuteno de partculas virais que escapam dos
anticorpos durante a infeco natural ainda no so muito compreendidos. Por exemplo, os rinovrus
apresentam uma plasticidade estrutural extraordinria com mais de 100 diferentes sorotipos de
rinovrus circulando na populao, o que explica o fato de um indivduo poder sofrer vrios
episdios de resfriado por ano. O mesmo acontece com a gripe, porque os vrus da influenza sofrem
mutaes muito frequentemente, no sendo completamente neutralizados pelos anticorpos. Por outro
lado, os poliovrus que pertencem mesma famlia dos rinovrus, por um motivo ainda no
explicado, apresentam apenas 3 sorotipos. Contudo, essa propriedade garante que a vacina contra os
poliovrus, que foi produzida nos anos 1950, continue apresentando a mesma eficcia. Isso tambm
acontece com o vrus do sarampo e o da febre amarela, que, por apresentarem poucas alteraes nas
sequncias das protenas do envelope, induzem uma proteo duradoura reinfeco. Em
consequncia, a proteo da vacina contra o sarampo dura por longos perodos, enquanto a vacina

contra a gripe deve ser administrada anualmente.

Figura 6.5 Mecanismos de interferncia de protenas virais com a atividade de clulas NK. A ao das clulas NK
controlada por interaes com ligantes de inibio ou ativao. Os ligantes de inibio so molculas de MHC I; quando a
clula NK se liga a essas molculas, sua ativao bloqueada. Quando os receptores das clulas NK se ligam a antgenos
virais, essas clulas so ativadas e provocam a morte da clula infectada por meio da liberao de grnulos citotxicos. Os
vrus podem causar a inibio (X, vermelho) das clulas NK por vrios mecanismos. Para mais detalhes, ver texto. NK =
clulas natural killer; HCMV = citomegalovrus humano; HIV = vrus da imunodeficincia humana; HPV = vrus do papiloma
humano; HCV = vrus da hepatite C; HHV-8 = herpesvrus humano tipo 8; MCV = vrus do molusco contagioso.

As alteraes nas protenas virais so denominadas variaes antignicas. Em um hospedeiro


imunocompetente, as variaes antignicas ocorrem por 2 processos distintos: o primeiro o
surgimento de vrions com protenas de superfcie apresentando alteraes antignicas discretas

(antigenic drift), aps a replicao no hospedeiro natural; o segundo consiste em uma alterao mais
drstica nos genes que codificam as protenas de superfcie, resultando na expresso de uma nova
protena (antigenic shift). Essa alterao drstica na composio do vrion resulta da coinfeco de
um hospedeiro com dois sorotipos virais. Vrus com genoma segmentado podem trocar segmentos, ou
genomas correplicantes podem produzir genomas recombinantes, resultando em um vrion hbrido
que pode temporariamente escapar das defesas imunolgicas.

Quasispecies
A mistura de variantes de um mesmo vrus presente em um hospedeiro, em um determinado
momento, denominada de quasispecies. Embora seja conveniente pensar nos vrus como partculas
homogneas, isso no corresponde realidade, uma vez que tanto a RNA polimerase quanto a DNA
polimerase virais promovem erros, produzindo mutantes durante a infeco. Em geral, a polimerase
dos vrus de genoma de RNA apresenta uma preciso menor que a enzima dos vrus de DNA. Dessa
maneira, as mutaes tm um peso maior na patognese dos vrus de RNA em comparao com a dos
vrus de DNA. No entanto, mutaes tm papel importante na patognese de qualquer vrus. A
gerao de uma populao de quasispecies resulta de uma presso seletiva complexa e intensa no
hospedeiro, em que alguns vrions esto mais capacitados a escapar da resposta imunolgica que
outros. A natureza dessa presso seletiva e o potencial patognico dos vrus selecionados so
determinantes importantes da patognese viral.

Bloqueio da apoptose
Frequentemente, a infeco de clulas de animais por vrus resulta em apoptose celular, caso o
vrus no a bloqueie. As clulas NK e os CTL induzem apoptose para a destruio das clulas
infectadas. Contudo, a prpria replicao viral, com frequncia, induz a apoptose celular. Para os
vrus de replicao rpida, como a maioria dos vrus de genoma de RNA, a apoptose parece no
inibir a produo de vrus. Isso pode resultar no espalhamento mais rpido do vrus para as clulas
vizinhas devido lise celular e a um processo inflamatrio mais discreto do que normalmente
ocorreria, uma vez que a apoptose no induz inflamao. Para os vrus de replicao mais lenta,
como a maioria dos vrus de DNA, a apoptose prematura resulta em declnio significativo da
produo de partculas virais. Dessa maneira, muitos vrus desenvolveram mecanismos para inibir
ou retardar a apoptose das clulas infectadas. A maioria desses mecanismos interfere na via de
ativao das caspases ou regula a atividade da protena p53.

Produo de serpinas

Muitos poxvrus produzem protenas que inibem a atividade das caspases (cisteno-proteases).
Essas protenas dos poxvrus so relacionadas com as serpinas (inibidores de protease) celulares,
que so pequenas protenas que servem como substrato para as serino-proteases, mas que,
permanecendo ligadas protease aps a clivagem, bloqueiam sua atividade. As serpinas so
importantes na regulao da resposta inflamatria e apoptose. As serpinas dos poxvrus inibem as
caspases possivelmente de maneira semelhante s serpinas celulares: so clivadas pelas caspases,
mas permanecem ligadas a elas com consequente bloqueio da sua atividade. Esses produtos virais
provavelmente bloqueiam a apoptose induzida por qualquer via que requeira a ativao de caspases.

Interferncia com a sinalizao do receptor Fas ou fator de necrose tumoral


Alguns poxvrus codificam uma protena homloga ao receptor (R) do fator de necrose tumoral
(TNF). Essa protena inibe a interao do TNF- com o TNFR, impedindo a apoptose ativada via
TNF-. Os adenovrus produzem protenas que antagonizam os efeitos do TNF-. O vrus do molusco
contagioso, um poxvrus, produz uma protena similar protena celular FADD (Fas-associated
death domain), a qual se associa caspase-8, recrutando-a para ativar os receptores Fas (tambm
chamados CD95 ou APO-1) e TNF na superfcie da clula, resultando na ativao da caspase-8. A
protena viral impede essa interao e consequente ativao da sinalizao da caspase-8 por Fas e
TNF. Alguns herpesvrus produzem protenas que interferem com a ativao da caspase-8 por
interao com FADD em um mecanismo semelhante ao vrus do molusco contagioso.
Outro mecanismo de interferncia com a ativao da apoptose por receptores Fas a reduo do
nmero dessas molculas na superfcie da clula. Os adenovrus produzem uma protena que faz com
que esses receptores sejam internalizados e degradados na clula.

Produo de homlogos de Bcl-2


A protena celular Bcl-2 inibe a apoptose. Vrios herpesvrus, adenovrus e o vrus da peste
suna africana produzem homlogos da Bcl-2, os quais atuam como agentes antiapoptticos. O EBV
desenvolveu outro mecanismo para a inibio da apoptose, codificando uma protena que estimula a
produo celular da Bcl-2.

Controle da concentrao de p53


Muitos vrus de DNA induzem a sntese de DNA celular, o que leva ao aumento da concentrao
de p53. Essa protena antitumor tem papel central no controle do ciclo celular, sendo que uma de suas
funes a de ativador da transcrio. A sua concentrao controlada por uma rpida rotatividade
do ndice de produo/degradao e pela ativao, induzida pela prpria p53, da transcrio de um
gene celular denominado mdm-2, o qual tambm requer interao com p300.
A protena mdm-2 se liga p53 e inibe a sua capacidade de atuar como fator de transcrio,

regulando assim sua prpria sntese. Esse balano desestabilizado por vrus de DNA durante o
processo de estimulao da clula para entrar na fase S, tornando possvel o acmulo da p53. Altas
concentraes de p53 induzem apoptose, provavelmente como resultado da sua atividade
transcricional. Muitos vrus de DNA resistem apoptose induzida pela protena p53 sequestrando-a
ou interferindo com suas funes como ativador transcricional, ou causando sua rpida degradao.
Alguns herpesvrus, adenovrus, papilomavrus e o vrus da hepatite B (HBV) apresentam esses
mecanismos.

Defesas virais contra citocinas e quimiocinas


As citocinas e quimiocinas so reguladores potentes das defesas inata e adaptativa. Em virtude
de sua importncia na regulao da resposta imunolgica e devido ao seu potencial efeito contra a
infeco viral, muitos vrus desenvolveram mecanismos de interferncia nas atividades dessas
defesas. Isso inclui a codificao de homlogos ou anlogos de citocinas e quimiocinas, ou de seus
receptores. Pelo fato de as interaes das citocinas e quimiocinas serem complexas, as vias pelas
quais os produtos virais induzem seus efeitos no so compreendidas com frequncia. Os vrus
tambm produzem protenas que inibem aspectos especficos da resposta inata, induzidos por
citocinas.

Evaso do estado antiviral


Muitos vrus codificam produtos que especificamente interferem com a ativao da via da
proteno-cinase dependente de RNA (PKR), que leva interrupo da sntese de protenas celulares.
Isso sugere que essa via importante para o controle das infeces por vrus. Diversos mecanismos
esto envolvidos: sntese de RNA competitivo que se liga PKR, mas no a ativa (p. ex., adenovrus,
EBV e HIV); sntese de produtos que sequestram RNA de dupla fita (p. ex., vrus vaccnia e
reovrus); produo de protenas que se ligam PKR e a impedem de fosforilar eIF-2 (p. ex., vrus
vaccnia); e ativao de inibidores celulares ou degradao de PKR (p. ex., vrus da influenza,
poliovrus e HIV).

Interferncia com vias de transduo de sinais


Adenovrus, EBV, e HBV codificam produtos que interferem com a transduo de sinal do
receptor de interferon. No esto esclarecidos os mecanismos pelos quais a transduo de sinal
bloqueada.

Produo de protenas de ligao a citocinas


Alguns vrus codificam protenas que mimetizam os receptores celulares que se ligam a citocinas.

A maioria dessas protenas virais secretada pela clula na forma de protenas solveis que
neutralizam a atividade das citocinas, ligando-se a elas de maneira no produtiva. Poxvrus, EBV,
HCMV e HHV-8 so exemplos de vrus que produzem essas protenas semelhantes aos receptores de
citocinas e quimiocinas.

Secreo de virocinas
Alguns herpesvrus como o EBV e o HHV-8 produzem anlogos de citocinas (IL-6, IL-10) ou
quimiocinas, denominados virocinas. As IL-6 e IL-10 so necessrias para a proliferao de clulas
B e, presumivelmente, servem para expandir essa populao. As virocinas servem para atrair as
clulas-alvo, uma vez que esses vrus infectam linfcitos B; alm disso, desviam a resposta
imunolgica para uma resposta das clulas B auxiliada por clulas Th-2, reduzindo a intensidade da
resposta por CTL auxiliada por clulas Th-1. Dessa maneira, enquanto expande o nmero de clulas
permissivas disponveis para a infeco viral, essas virocinas tambm reduzem o nmero de CTL,
controlando a populao de clulas infectadas.

Infeco de tecidos com vigilncia imunolgica reduzida


As clulas e rgos do corpo diferem no grau de suas defesas imunolgicas. Alguns tecidos (p.
ex., pele, glndulas, ductos biliares e tbulos renais) so expostos rotineiramente a partculas
estranhas e, em consequncia, apresentam um limiar mais elevado para a ativao das defesas
imunolgicas. O HCMV, por exemplo, replicado na superfcie luminal das glndulas salivares e
mamrias e ductos renais. Nesses tecidos, a vigilncia imunolgica frouxa, o que torna possvel a
manuteno da infeco. Os vrus do papiloma so outro exemplo desse mecanismo. A replicao
desses vrus ocorre na camada externa diferenciada da pele, no afetada pela resposta imunolgica.
Certos compartimentos do organismo, tais como o SNC, o humor vtreo do olho e reas de
drenagem linftica, so destitudos de iniciadores e efetores da resposta inflamatria, visto que esses
tecidos podem ser danificados pelo acmulo de fluido, inchao e desbalano inico, que
caracterizam a inflamao. Alm disso, como a maioria dos neurnios no se regenera, uma defesa
imunolgica com base na morte celular certamente prejudicial.

Padres de infeco
Em geral, as infeces naturais podem ser rpidas ou autolimitadas (infeces agudas) ou de
longa durao (infeces persistentes) (Figura 6.6); podem ocorrer variaes e combinaes desses
dois modelos.

Figura 6.6 Esquema dos padres de infeco.

Infeces agudas e infeces inaparentes


O termo infeco aguda indica a produo rpida de vrus, seguida da resoluo e eliminao
rpida da infeco pelo hospedeiro. Essas infeces so relativamente passageiras e, em um
hospedeiro saudvel, as partculas virais e as clulas infectadas so completamente eliminadas pelo
sistema imunolgico em poucos dias. Uma infeco aguda uma estratgia eficiente de manuteno
de alguns vrus, visto que sua prognie estar disponvel para infectar outro hospedeiro antes de a
infeco ser debelada.
As infeces agudas so frequentemente associadas a grandes epidemias, afetando milhes de
indivduos anualmente (p. ex., dengue, gripe, sarampo). A natureza de uma infeco aguda impe
dificuldades para mdicos, epidemiologistas, indstrias farmacuticas e rgos de sade pblica,
pois, no momento em que as pessoas adoecem ou produzem uma resposta imunolgica detectvel, os

vrus j foram disseminados para outro hospedeiro. Pode ser difcil diagnosticar essas infeces
restrospectivamente ou control-las em grandes populaes ou ambientes superlotados (p. ex.,
creches, acampamentos militares, dormitrios, abrigos, escolas e escritrios).
As infeces agudas no resultam, necessariamente, em doena, podendo ocorrer de modo
inaparente ou assintomtico. Nesse caso, h a produo suficiente de vrus para sua manuteno na
populao, mas a quantidade est abaixo da requerida para a produo de sintomas no hospedeiro.
Na verdade, as infeces virais inaparentes so bastante comuns e podem funcionar como fonte de
infeco na populao. Essas infeces so reconhecidas pela presena de anticorpos vrusespecficos sem qualquer registro de doena.
A resposta imunolgica inata limita e controla a maioria das infeces agudas. Em consequncia,
essas infeces so desastrosas para indivduos cujas defesas iniciais esto comprometidas,
principalmente pelo fato de as partculas virais no permanecerem localizadas no stio primrio da
infeco, sendo amplamente disseminadas. Em uma infeco primria, a resposta imunolgica
adaptativa no influencia a replicao do vrus por vrios dias, mas essencial para a eliminao
final do vrus e clulas infectadas. A resposta adaptativa tambm fornece memria para a defesa
contra exposies subsequentes.

Infeces persistentes
Ao contrrio das infeces agudas, as infeces persistentes no so eliminadas rapidamente
pela resposta imunolgica adaptativa, e as partculas ou produtos virais continuam sendo produzidos
por longos perodos. As partculas infecciosas podem ser produzidas contnua ou intermitentemente
por meses ou anos. Em algumas situaes, o genoma viral permanece por longos perodos na clula
infectada, mesmo depois de cessar a deteco das protenas virais. Existem 3 tipos de infeces
persistentes: crnica, em que o vrus continuamente replicado e excretado; lenta, em que ocorre um
longo perodo entre a infeco aguda primria e o surgimento dos sintomas, havendo produo
contnua de vrus durante esse perodo; e latentes, na qual o vrus persiste em uma forma no
infecciosa, com perodos intermitentes de reativao.
Muitas doenas cerebrais fatais, caracterizadas por ataxia ou demncia, derivam de um tipo
extremo de infeco persistente lenta. O perodo entre o contanto inicial com o agente infeccioso e o
surgimento de sintomas pode ser de vrios anos. Uma vez que surgem os sintomas, a morte
geralmente ocorre rapidamente. Alguns vrus, como o do sarampo, o JCPyV, o HIV e o HTLV, podem
estabelecer infeces lentas com patognese grave do sistema nervoso nos estgios finais da doena.
Em muitos casos, a infeco persistente ocorre em compartimentos perifricos sem nenhum efeito
aparente, e apenas afeta o crebro depois de muitos anos.
As infeces persistentes latentes podem ser caracterizadas por 3 propriedades gerais:

Expresso do ciclo viral produtivo ausente ou ineficiente


Reconhecimento da clula contendo o genoma viral latente pelo sistema imunolgico ineficiente
Persistncia do genoma viral intacto, podendo, eventualmente, iniciar uma infeco aguda
produtiva, garantindo a disseminao da prognie para um novo hospedeiro.
O genoma latente pode ser mantido integrado ou no ao genoma da clula hospedeira. A
manuteno do genoma viral latente notvel por sua estabilidade, o que requer um balano entre a
expresso de genes reguladores virais e celulares. Em geral, um pequeno nmero de produtos virais
produzido durante a infeco latente; contudo, os vrus latentes devem apresentar mecanismos de
reativao de maneira que tais vrus possam disseminar-se para outros hospedeiros. A reativao
geralmente decorre de traumas, estresse ou outras agresses.

Infeces abortivas
Infeco abortiva aquela em que o vrus infecta um hospedeiro ou uma clula suscetvel, mas a
replicao no se completa, geralmente pelo fato de um gene viral ou celular essencial no ser
expresso. Desse modo, a infeco abortiva no produtiva; no entanto, essa infeco no
necessariamente ignorada ou benigna para o hospedeiro infectado. A interao do vrus com
protenas da superfcie da clula, seguida do desnudamento da partcula, pode induzir danos na
membrana, desarrumao de endossomas, ou ativar vias de sinalizao que causam apoptose e
produo de citocinas. Em algumas situaes, clulas sofrendo infeco abortiva no so
reconhecidas pelo sistema imunolgico, e o genoma viral pode persistir por todo o tempo de vida da
clula. Em alguns casos, a infeco pode prosseguir por tempo suficiente para que os CTL
reconheam a clula infectada. Essa infeco, possivelmente, pode induzir a produo de interferon e
resposta inflamatria, que podem ser danosas para o hospedeiro se um nmero suficiente de clulas
estiver envolvido.

Transformao celular
A transformao celular um tipo especial de infeco persistente. Uma clula infectada com
certos vrus de DNA e tambm alguns retrovrus pode exibir propriedades de crescimento alteradas e
comear a proliferar mais rapidamente que clulas no infectadas. Em algumas infeces, essas
mudanas so acompanhadas pela integrao do genoma viral ao genoma celular. Em outras
situaes, a replicao coordenada pela clula. As partculas virais podem no mais ser
produzidas; no entanto, parte ou todo o seu material gentico geralmente persiste. Esse padro de
infeco persistente causa alterao no comportamento da clula que leva transformao celular,
podendo progredir para o cncer.

Perodos de infeco
Os perodos de infeco so designados de acordo com a etapa da doena. Desse modo, temos:
Perodo de incubao: perodo compreendido entre o incio da infeco e o aparecimento dos
primeiros sintomas caractersticos da doena
Perodo prodrmico: o indivduo apresenta sintomas clnicos generalizados e inespecficos (p.
ex., febre, mal-estar, dor de cabea, etc.) e esses sintomas antecedem aqueles caractersticos da
doena
Perodo da doena: o indivduo apresenta os sintomas caractersticos associados doena
Perodo de infecciosidade: o indivduo infectado permanece excretando e transmitindo o vrus
Perodo de convalescena: perodo durante o qual o paciente se recupera.

Excreo do vrus pelo organismo


O ltimo estgio da patognese a excreo do vrus infeccioso, necessrio para a manuteno
da infeco na populao. A excreo, normalmente, ocorre por uma das superfcies do corpo
envolvidas na entrada do vrus. No caso das infeces localizadas, a mesma superfcie est
envolvida na entrada e na sada do vrus. Em infeces generalizadas, uma variedade de tipos de
excreo est frequentemente envolvida.
Secrees respiratrias. Os vrus que causam infeces localizadas no sistema respiratrio,
por exemplo, o vrus da influenza e o vrus respiratrio sincicial, so liberados no muco e na saliva,
e excretados do organismo por meio da tosse, do espirro e da fala. Em vrias infeces sistmicas,
tais como na rubola, na caxumba e no sarampo, os vrus tambm so excretados pelo sistema
respiratrio.
Fezes. Todos os vrus que infectam o trato gastrointestinal so excretados nas fezes e podem
poluir o ambiente, provocando epidemias pela contaminao da gua e alimentos. So exemplos de
vrus excretados pelas fezes os vrus das hepatites A (HAV) e E (HEV) e os rotavrus.
Pele. Muitos vrus so replicados na pele e as leses induzidas por estes contm partculas
infecciosas que podem ser transmitidas a outro hospedeiro. Em geral, a transmisso da infeco
ocorre por contato direto. Vrus transmitidos por essa rota incluem os poxvrus, HSV, vrus da
varicela-zoster e os papilomavrus.
Sistema genitourinrio. importante rota de excreo para vrus transmitidos por via sexual
como HIV, HSV, HPV e HBV. Alguns vrus so excretados na urina (virria) e tambm podem
contaminar o ambiente e, eventualmente, infectar outros hospedeiros como, por exemplo, HCMV,
vrus da caxumba, hantavrus e arenavrus.
Leite materno. Vrios tipos de vrus so excretados no leite, o que pode servir como rota de

transmisso como, por exemplo, HCMV, HBV, HIV e HTLV.


Sangue. O sangue uma fonte importante para a veiculao de vrus pelos artrpodes e tambm
serve como rota de transferncia de vrus para o embrio ou o feto, transmisso de vrus por
transfuso sangunea ou por agulhas e seringas contaminadas.

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Introduo
O estabelecimento e desenvolvimento de uma infeco viral e o surgimento ou no de
manifestaes clnicas decorrentes dessa infeco dependem de um conjunto de fatores, incluindo o
ambiente epidemiolgico, as caractersticas virais e os fatores inerentes ao prprio hospedeiro.
Nesse contexto, juntamente com o tropismo viral e as propriedades de replicao de um dado vrus, e
com o tamanho do inculo viral, as caractersticas genticas de um indivduo, incluindo seu status
imunolgico e o perfil da resposta imunolgica elicitada durante a infeco, determinaro o perfil
dessa infeco como assintomtica (crnica, aguda ou latente).
A interao dos vrus com os diversos componentes do sistema imunolgico (SI) se inicia pelo
reconhecimento do patgeno por clulas residentes na porta de entrada das infeces. Esse
reconhecimento induz a produo de mediadores inflamatrios, que contribuem para a inibio da
replicao viral e que participam da regulao da prpria resposta de outros componentes do SI. Em
geral, o conjunto dessas interaes possibilita a eliminao do vrus com mnimo dano, mas tambm
pode estar diretamente relacionado com os sintomas da infeco. Assim, a doena viral pode ser
resultado da incapacidade do SI de conter a replicao viral e disseminao da infeco, ou pode ser
consequncia de uma resposta inflamatria exacerbada.
Alm disso, uma vez que componentes do SI participam diretamente da infeco, uma das
maneiras de se evidenciar o contato com um agente viral ou, ainda, avaliar a progresso de uma
determinada infeco a medida da ativao celular e/ou produo de anticorpos especficos. Desse
modo, a compreenso da resposta do hospedeiro essencial no apenas para entender os diversos
fatores associados patognese da mesma, mas tambm para definir estratgias de diagnstico e de
preveno e/ou controle por meio de vacinao. Em geral, as estratgias de controle de uma infeco
viral consistem basicamente em mecanismos fsico-qumicos de eliminao do agente viral;
neutralizao e/ou eliminao de vrus livres no hospedeiro; e eliminao das clulas infectadas.
Neste captulo, ser discutida a maneira como diferentes componentes do hospedeiro podem
influenciar a progresso de uma infeco viral.

Mecanismos de resposta inespecfica


Barreiras anatmicas e secrees de superfcie
Antes mesmo do desenvolvimento de uma resposta imunolgica antiviral especfica, j na porta
de entrada, os vrus precisam atravessar barreiras fsicas e qumicas inespecficas. Propriedades
fsico-qumicas e estruturais de um tecido influenciam a estabilidade do vrus em um determinado
ambiente. A camada de clulas epiteliais, o muco, o pH, a temperatura e a presena de proteases e de
peptdeos antimicrobianos podem influenciar direta ou indiretamente (pela modulao de
mecanismos da imunidade inata) a eficincia da replicao viral em um determinado stio.
O sistema respiratrio apresenta como barreiras a camada de muco, o epitlio ciliado e a prpria
temperatura. Dessa forma, as infeces virais respiratrias esto normalmente associadas a vrus
envelopados, como vrus da influenza, vrus da parainfluenza, e vrus respiratrio sincicial humano
(HRSV), que so mais estveis nesse ambiente.
O trato gastrointestinal outro ambiente adverso replicao de diversos vrus. As propriedades
desses tecidos como o pH cido, as proteases secretadas, sais de bile e muco so barreiras
importantes. O envelope viral, por exemplo, sensvel ao dos sais de bile, de modo que a
maioria das infeces desse tecido causada por vrus no envelopados, como os rotavrus. Por
outro lado, alguns vrus podem utilizar as proteases presentes no trato gastrointestinal para alterar o
capsdeo externo ou envelope, expondo produtos da clivagem necessrios para a infeco, o que
favorece sua infecciosidade.
Uma srie de propriedades fisiolgicas do sistema genital feminino tambm promove proteo
contra a infeco por diferentes vrus. Essas propriedades incluem o pH cido, a presena de
bactrias produtoras de perxido de hidrognio, o muco e as camadas da barreira epitelial.
Hormnios sexuais tambm influenciam a suscetibilidade e a predisposio a doenas, em parte por
modularem a imunidade de mucosas.
Alm dos fatores descritos, protenas e peptdeos antimicrobianos (como as defensinas),
presentes em diferentes tecidos, tambm apresentam papel fundamental na defesa inata. As defensinas
so pequenos peptdeos catinicos produzidos por clulas epiteliais, polimorfonucleares e at
linfcitos, capazes de formar poros em membranas, podendo atuar diretamente na partcula viral ou
na membrana da clula infectada. Esses peptdeos podem tambm participar da neutralizao de
partculas virais quando se ligam a carboidratos envolvidos na interao com o receptor da clula
hospedeira ou ao capsdeo de determinados vrus, inibindo seu desnudamento.

Idade
Outro fator que influencia o desenvolvimento de uma infeco viral a idade. Recm-nascidos

ainda no apresentam o sistema imunolgico completamente maduro; assim, muitas vezes, h


deficincia na resposta, ocasionando maior suscetibilidade a determinadas infeces e/ou maior
gravidade dos sintomas. Clulas de neonato infectadas por HRSV, por exemplo, tm menor eficincia
de produo de determinadas citocinas importantes para o controle da infeco, o que pode estar
associado a maior gravidade da doena causada por esse vrus nos primeiros meses de vida. Outro
exemplo que demonstra as diferenas observadas no prognstico de uma infeco viral com relao
idade a infeco pelo vrus da hepatite B (HBV). Quando ocorre na infncia, essa infeco tem
maior probabilidade de persistncia se comparada quando o indivduo j adulto.
Em termos de resposta humoral, os neonatos dependem, em grande parte, dos anticorpos
transmitidos verticalmente durante a gestao, ou durante a amamentao. Esses anticorpos
influenciam, ainda, na eficincia dos processos de vacinao, interferindo no desenvolvimento de
uma imunidade ativa por neutralizar o agente vacinal. Por esse motivo, algumas vacinas so
administradas apenas aps 6 meses de idade, quando no haver mais interferncia de anticorpos
maternos.
Por outro lado, o envelhecimento est associado ao aumento de morbidade e mortalidade por
infeces virais, alm de apresentar menor eficcia de resposta a vacinas. Isso se deve a alteraes
funcionais do sistema imunolgico que ocorrem durante o processo de envelhecimento, chamadas
coletivamente de imunossenescncia. Essas alteraes incluem reduo do nmero de linfcitos T e
B (em especial a reduo na proporo de linfcitos T virgens) e limitao progressiva do repertrio
de linfcitos T. A involuo tmica e a exposio a antgenos ao longo da vida contribuem para a
reduo do nmero e do repertrio de linfcitos T, e tambm para o processo de exausto funcional
dessas clulas, o que est relacionado com perda da capacidade proliferativa e de suas atividades
efetoras. Alguns autores sugerem que clulas apresentadoras de antgenos tambm podem mostrar
algumas alteraes funcionais, tais como diminuio da capacidade fagoctica e migratria e
alterao nos nveis de citocinas secretadas. Assim, diversos estudos demonstram que o avano da
idade est associado a risco maior de complicaes aps infeces virais, como aquelas causadas
por vrus da influenza ou HRSV, e reativao de herpes-zoster, induzindo neuralgia, por exemplo.

Constituio gentica
O papel da constituio gentica intrnseca de um indivduo no controle ou progresso de uma
infeco pode ser evidenciado pelo fato de que algumas infeces virais parecem ser mais ou menos
prevalentes em determinados grupos tnicos, em populaes presentes em regies especficas ou,
ainda, em grupos familiares. Estudos realizados nos EUA sugeriram que a populao afro-americana
apresenta maior probabilidade de desenvolver hepatite crnica causada pelo vrus da hepatite C
(HCV). Nos pacientes com hepatite crnica causada pelo HBV, o histrico familiar considerado
fator de risco para o desenvolvimento de hepatocarcinoma celular, sendo esse mais um indcio da

importncia das caractersticas genticas do hospedeiro na progresso das infeces virais.


Uma das alteraes genticas conhecidas que apresentam efeito marcante sobre a
evoluo/suscetibilidade a uma infeco o alelo delta32 do gene de CCR5, associado resistncia
do hospedeiro infeco pelo vrus da imunodeficincia humana (HIV). Trata-se de uma deleo de
32 bp em uma regio transmembrana do correceptor CCR5, e indivduos que carregam duas cpias
dessa deleo so virtualmente protegidos da infeco.
Polimorfismos genticos tm sido associados a melhor ou pior progresso de infeces virais.
Diante disso, o estudo de polimorfismos de genes diretamente associados resposta imunolgica tem
se mostrado extremamente revelador para a caracterizao dos componentes importantes do sistema
imunolgico para o controle de uma dada infeco. Sabe-se, por exemplo, que determinados alelos
do complexo principal de histocompatibilidade (MHC, major histocompatibility complex) esto
mais ou menos associados progresso de determinadas infeces virais, provavelmente
influenciando o padro de antgenos apresentados aos linfcitos T, o que est diretamente
relacionado com a qualidade da resposta imunolgica celular induzida. Polimorfismos em HLA
(human leukocyte antigen) podem influenciar o controle, a progresso e a probabilidade de
transmisso do HIV. Homozigose de alguns genes de HLA I foi associada progresso mais rpida
para a doena; alm disso, a identidade de alelos entre doadores e receptores, ou seja, a transmisso
de vrus entre indivduos que compartilham os mesmos alelos no loci de classe I, como pode ser
observado na transmisso vertical, aumenta a suscetibilidade infeco. Alguns grupos HLA
especficos tm demonstrado diferentes efeitos na infeco pelo HIV, como HLA-B27 e B57, que
parecem estar associados a uma evoluo mais lenta, sendo esse ltimo independente da etnia, clade
viral ou grupo de risco. Por outro lado, HLA-B35 e B53 tm sido associados a maior carga viral.
Polimorfismos de receptores importantes da imunidade inata, como de PKR (proteno-cinase
RNA dependente), ou de enzimas essenciais para o controle da infeco intracelular, como as xidontrico-sintases, tambm tm sido descritos como associados progresso de infeces por HCV e
HRSV. Do mesmo modo, polimorfismos de regies estruturais ou promotoras do gene de uma lectina
do sistema complemento (MBL, mannam binding lectin) tm sido associados progresso das
hepatites mediadas por HBV e HCV. Alm disso, SNP (single nucleotide polymorphism) em genes
de citocinas, como interferons, TNF-, IL-1 e TGF- tm sido estudados em diferentes infeces,
como as causadas por vrus da dengue (DENV), HBV, HCV, dentre outros.
Polimorfismos em genes no diretamente associados resposta imunolgica tambm tm sido
descritos como o caso de SNP em tsg101 (tumor susceptibility gene 101); esse gene codifica
uma protena celular importante para a liberao do HIV. Trs alelos diferentes foram caracterizados,
e um deles est associado a progresso mais rpida para a sndrome da imunodeficincia adquirida
(AIDS), provavelmente por tornar possvel maior eficincia da liberao de partculas virais da
clula hospedeira e, consequentemente, maior taxa de replicao viral.

Estado nutricional
O estado nutricional de um indivduo pode influenciar direta ou indiretamente, por uma
deficincia imunolgica, a eficincia da resposta protetora. Um exemplo clssico a maior
prevalncia de casos graves de sarampo em indivduos subnutridos.

Estado imunolgico
Diferentes situaes de imunodeficincia tambm vo influenciar o progresso de infeces virais.
Indivduos com imunossupresso crnica, como no caso de infeco pelo HIV, podem ter replicao
viral descontrolada e doena grave causada, potencialmente, por qualquer patgeno viral. A
deficincia na produo de anticorpos, como em indivduos com agamaglobulinemia associada ao
cromossoma X, tambm resulta em maior replicao e disseminao virais. A infeco por
enterovrus nesses indivduos, por exemplo, est associada ao acometimento do sistema nervoso
central. Do mesmo modo, camundongos deficientes em linfcitos B infectados com vrus da influenza
ou vrus West Nile (WNV) sucumbem infeco em poucos dias.

Papel da imunidade inata no controle das infeces virais


Ao entrarem em contato com clulas hospedeiras, componentes estruturais dos vrus sero
reconhecidos por receptores de reconhecimento de padro (PRR, pattern recognition receptors).
Tais receptores podem estar na superfcie celular e reconhecerem protenas presentes na superfcie
viral no momento da adsoro; eles tambm podem estar localizados no citoplasma ou em vesculas
celulares e reconhecer o genoma viral liberado aps a internalizao. A ativao desses receptores
induzir a ativao das clulas hospedeiras que iro produzir mediadores envolvidos na resposta
antiviral ou no recrutamento e ativao de clulas do sistema imunolgico, iniciando-se, ento, uma
resposta inflamatria.
A ativao de clulas da imunidade inata por agentes virais tem, basicamente, dois objetivos no
controle da infeco: o controle inicial do patgeno em si, por meio da produo de citocinas, como
os interferons (IFN), e da ativao de fagcitos e clulas citotxicas; e a integrao com
componentes da imunidade adquirida, por intermdio da maturao e ativao de clulas
apresentadoras de antgenos, da prpria apresentao de antgenos e da produo de citocinas prinflamatrias, que contribuem para o recrutamento de outros tipos celulares e amplificao da
resposta imunolgica. Por outro lado, a secreo de citocinas pr-inflamatrias e com caractersticas
pirognicas, por componentes da imunidade inata, ainda no incio da infeco, est associada s
manifestaes clnicas no especficas que so observadas no perodo prodrmico das infeces,
como a febre.

A seguir, sero abordadas as clulas efetoras da imunidade inata e as estratgias de


reconhecimento viral por essas clulas, assim como os mediadores produzidos aps o
reconhecimento e seu efeito biolgico e antiviral.

Clulas efetoras da imunidade inata


Antes mesmo da estimulao de clulas especficas do sistema imunolgico, diferentes tipos
celulares, muitas vezes presentes j na porta de entrada das infeces virais, so capazes de produzir
mediadores que participam do controle da replicao viral. Clulas endoteliais e epiteliais
participam da resposta inicial a uma infeco viral pela produo de xido ntrico (NO), que inibe a
replicao intracelular de alguns vrus, e de quimiocinas e de leucotrienos, que ajudam no
recrutamento de outros tipos celulares, iniciando a resposta e o processo inflamatrio.
Alm disso, macrfagos e clulas dendrticas, distribudos por diversos tecidos do hospedeiro,
atuam como sentinelas no reconhecimento de patgenos e incio da resposta imunolgica inata.

Macrfagos e clulas dendrticas


Moncitos circulantes e macrfagos so clulas-alvo da infeco por diferentes vrus e
participam ativamente da disseminao e transmisso dos vrus para outros tipos celulares. Alm
disso, os macrfagos tm papel importante na etapa inicial da infeco, por meio da liberao de
citocinas pr-inflamatrias e quimiocinas, como IL-1, TNF-, IL-6 e IL-8. Essas clulas podem,
ainda, ter um papel antiviral direto pela produo de NO e mediadores reativos de oxignio,
contribuindo para a inibio da replicao dos vrus. Finalmente, moncitos/macrfagos infectados
podem apresentar antgenos virais para os linfcitos T e produzir citocinas que regulam a atividade
dessas clulas, contribuindo para a ativao da imunidade adquirida.
Juntamente com moncitos e macrfagos, um dos tipos celulares mais importantes nessa etapa so
as clulas dendrticas (DC), que apresentam ampla distribuio nos tecidos epiteliais e de mucosa,
em geral, portas de entrada de uma infeco viral. Essas clulas tambm atuam na produo de
mediadores antivirais, na secreo de citocinas pr-inflamatrias e quimiocinas, e na apresentao
de antgenos e estimulao dos linfcitos T.
As DC so importantes produtoras de citocinas que participam da imunidade inata,
particularmente de IFN tipo 1 (IFN-1). Na verdade, existem subpopulaes de DC, caracterizadas
fenotpica e funcionalmente como DC mieloides (mDC) e plasmocitoides (pDC). Ambas so
importantes apresentadoras de antgenos e participam na regulao da imunidade adquirida. As mDC
ativadas produzem IL-12, IL-15 e IL-18, as quais so crticas para a ativao de clulas Th1 e
subsequente ativao de resposta de clulas TCD8+ citotxicas e eliminao de clulas infectadas.
Alm disso, essas citocinas so importantes para a ativao de clulas natural killer e manuteno

de clulas T de memria.
J as pDC so as principais clulas produtoras de IFN em resposta a uma infeco viral. Alm de
IFN, as pDC produzem tambm IL-6, a qual importante para a diferenciao de linfcitos B em
plasmcitos, alm de produzirem quimiocinas envolvidas no recrutamento de outros tipos celulares
para o stio inflamatrio. A importncia das pDC no controle das infeces virais pode ser
evidenciada na infeco pelo HIV. Em pacientes infectados, observa-se diminuio do nmero dessas
clulas, sendo inversamente proporcional carga viral. Alm disso, pacientes em terapia
antirretroviral apresentam restituio parcial dessa populao celular. Na infeco por HRSV, essas
clulas tambm parecem ser essenciais, uma vez que a depleo de pDC resulta em inibio do
controle da replicao viral e exacerbao da patologia.

Reconhecimento de componentes virais por receptores da imunidade inata


A primeira etapa necessria para o desencadeamento de uma resposta imunolgica a determinado
vrus o reconhecimento desse agente. Em linhas gerais, os componentes da imunidade inata
reconhecem estruturas moleculares compartilhadas por diferentes agentes infecciosos e que so
coletivamente chamadas de padres moleculares associados a patgenos (PAMP, pathogenassociated molecular patterns). Dentro do grupo de PAMP virais, esto includos componentes de
superfcie e o prprio genoma viral. Os receptores que reconhecem os chamados PAMP so
coletivamente chamados de PRR (PAMP-recognizing receptors). O engajamento desses receptores
est associado a uma srie de funes que incluem produo de IFN-1, produo de citocinas prinflamatrias e quimiocinas, e maturao de clulas dendrticas. Por este motivo, o reconhecimento
por PRR um ponto-chave para o incio do desenvolvimento de uma resposta imunolgica vrusespecfica.

Proteno-cinase R
Um dos principais padres moleculares associados a alguns agentes virais so as molculas de
RNA de fita dupla (RNAfd). Essas estruturas so caractersticas de vrus e podem estar presentes
tanto em vrus que apresentam RNA de fita dupla como genoma, quanto durante o processo de
replicao de vrus de RNA de fita simples (RNAfs). As molculas de RNAfd so reconhecidas
intracelularmente por diferentes PRR. Um dos exemplos mais conhecidos a enzima PKR (protenocinase RNA dependente). Trata-se de uma cinase que apresenta um domnio de reconhecimento de
RNAfd e um stio cataltico, responsvel pela fosforilao de fatores de alongamento da transcrio.
Essa enzima ativada aps o reconhecimento de uma molcula de RNAfd e sua ao est associada,
principalmente, inibio da sntese de protenas, incluindo a de protenas virais. Alm disso, a
ativao dessa enzima pode ser regulada no apenas pela ligao ao RNA, mas tambm por citocinas

como o IFN.
Muitos vrus apresentam mecanismos de escape desse reconhecimento. Vrus que apresentam
capsdeo helicoidal geralmente mantm suas protenas de capsdeo associadas ao RNA durante o
processo replicativo, impedindo o reconhecimento do genoma pela PKR. Outros vrus, como o HCV,
apresentam protenas capazes de se ligar ao stio cataltico da enzima, bloqueando sua funo. A
protena NS1 do vrus da influenza, alm de se ligar ao RNA, tambm estimula inibidores celulares
da PKR.

Receptores do tipo toll | Reconhecimento de componentes virais na superfcie celular ou


em vesculas intracelulares
Uma das famlias de receptores mais bem estudadas a do tipo toll (TLR, toll-like receptors).
Essa famlia abrange um grupo de 11 receptores descritos at o momento (TLR1-TLR11), que
reconhecem diferentes padres moleculares associados a patgenos, e so expressos em diferentes
tipos celulares, incluindo clulas dendrticas, macrfagos, clulas epiteliais, endoteliais, linfcitos e
clulas NK. Os TLR apresentam diferente localizao intracelular. TLR1, 2, 4, 5, 6, 10, 11 so
expressos na superfcie celular e participam do reconhecimento de componentes de superfcie viral;
TLR3, 7, 8, e 9 so expressos em vesculas intracelulares e esto associados ao reconhecimento de
molculas de cido nucleico viral, que chegam at esses compartimentos por endocitose.
Os TLR contm domnio extracelular (TLR expressos na membrana plasmtica) ou voltado para
o lmen dos endossomas (TLR intracelulares), caracterizado por repeties ricas em leucina (LRR,
leucine-rich repeats); um nico domnio transmembrana; e um domnio citoplasmtico, conhecido
como domnio TIR (de toll/IL-1R). O domnio LRR est envolvido com o reconhecimento do
patgeno e, embora todos os TLR compartilhem LRR similares, diferentes TLR reconhecem
assinaturas moleculares distintas. J o domnio TIR responsvel pela sinalizao intracelular que
se inicia pelo recrutamento de molculas adaptadoras, iniciando uma via de transduo de sinal que
culmina na induo de IFN e de citocinas inflamatrias.
J foram descritos muitos padres presentes em partculas virais, tendo sido mais bem estudado o
reconhecimento de componentes do genoma viral. Nesse sentido, TLR3 reconhece a principal
assinatura molecular viral, que a molcula de RNAfd. Na verdade, essa estrutura pode estar
presente tambm durante a replicao de vrus de RNAfs, e TLR3 parece estar envolvido no
reconhecimento de RNA de vrus de RNAfd como reovrus, mas tambm de RNAfs como HRSV,
WNV, DENV e vrus da influenza. TLR7 e TLR8 reconhecem molculas de RNAfs, e TLR7 est
envolvido no reconhecimento de RNA ricos em guanosina ou uridila (G/U), presentes no genoma do
vrus da influenza, por exemplo. TLR9 reconhece domnios GpC no metilados de DNA, presentes
em vrus de DNA, como os vrus herpes simplex (HSV) e o citomegalovrus humano (HCMV). Alm
do genoma, outras estruturas moleculares virais tambm so reconhecidas por TLR. J foi descrito

que componentes do envelope de HRSV levam ativao de TLR4. Tanto HSV tipo 1 (HSV-1)
quanto o tipo 2 (HSV-2) podem ativar TLR2, o qual tambm tem sido implicado no reconhecimento
de HCMV e da protena HA do vrus do sarampo. Alm disso, alguns vrus podem conter diferentes
PAMP reconhecidos por mais de um TLR, como o caso do HSV, cuja interao com a clula
hospedeira capaz de levar ativao de TLR2, supostamente por meio de sua gD, e de TLR9, por
seu DNA genmico.
A ativao de TLR aps o reconhecimento das assinaturas moleculares descritas induz uma
cascata de sinalizao intracelular, a qual se inicia com o recrutamento de molculas adaptadoras e
segue com a ativao de fatores de transcrio, que incluem elementos que regulam a produo de
interferons (IRF, interferon regulatory factor) e NF--B (nuclear fator- B). A ativao desses
fatores leva secreo de IFN-1 pelas clulas infectadas e de citocinas pr-inflamatrias e
quimiocinas. Essas ltimas funcionam na amplificao da resposta inflamatria e facilitam o
recrutamento de leuccitos, a fim de agir em conjunto com os IFN na resposta antiviral. Com exceo
do TLR3, os TLR recrutam a protena adaptadora MyD88 para iniciar a sinalizao. Esse
recrutamento leva ativao de IKK- e NF--B, alm de IKK- e IRF7 e induo de IFN-. J o
TLR3 recruta a protena adaptadora TRIF, que tambm leva ativao de fatores de transcrio,
incluindo NF--B, IRF3 e AP-1. A ativao de IRF3 est envolvida com a produo de IFN-1,
enquanto NF--B e AP-1 regulam a expresso de genes que codificam citocinas inflamatrias. A via
de ativao de TRIF tambm compartilhada por TLR4.
O papel do reconhecimento de PAMP virais por TLR na induo da produo de IFN pode ser
evidenciado em uma srie de modelos experimentais. A depleo de TLR7 causa deficincia na
produo de IFN-I por pDC aps a infeco pelo vrus da influenza ou vrus da estomatite vesicular
(VSV). De maneira similar, a produo de IFN-a por pDC em resposta a vrus DNA, como HCMV,
HSV-1 e HSV-2, depende da expresso de TLR9.
Outro aspecto importante da ativao de TLR a maturao de DC, que parece ser crtica para a
ativao de linfcitos TCD4+ e TCD8+ durante infeces virais. J foi demonstrado, por exemplo,
que camundongos deficientes em MyD88 no so capazes de estimular linfcitos TCD4+ aps
infeco com HSV-2. Do mesmo modo, esses animais tambm apresentam deficincia na resposta
mediada por clulas TCD8+ ao vrus da coriomeningite linfoctica (LCMV). O reconhecimento via
TLR est associado, ainda, apresentao cruzada de antgenos virais a clulas TCD8+ citotxicas.
Esse efeito foi particularmente descrito para TLR3, o qual altamente expresso em DC com alta
capacidade fagoctica. Essas clulas podem, ento, englobar restos de clulas infectadas por vrus
que sofreram apoptose em decorrncia da infeco. O TLR3 reconheceria RNAfd presente no
interior dessas clulas, e esse processo possibilitaria a apresentao cruzada de antgenos para
clulas TCD8+, provenientes de vrus que no infectam DC. Por outro lado, a dependncia de TLR
para ativao dos linfcitos T tambm pode ser indireta, via IFN-1. J foi demonstrado que clulas
TCD8+, que no expressam receptor para IFN-I, apresentam capacidade limitada de expanso e

diferenciao aps infeco com LCMV. Assim, uma das principais funes dos TLR durante uma
infeco viral o reconhecimento do vrus para posterior apresentao e ativao de linfcitos T. Os
mecanismos de apresentao de antgenos e ativao dos linfcitos T sero discutidos mais adiante.
interessante notar que nem sempre o reconhecimento do vrus e consequente ativao de TLR
benfico para o hospedeiro. Em alguns casos, o reconhecimento por esses receptores est mais
associado induo de uma atividade inflamatria, diretamente envolvida com as manifestaes
clnicas da infeco. J foi descrito que a capacidade do WNV em atravessar a barreira
hematoenceflica depende de processo inflamatrio, iniciado pelo reconhecimento viral pelo TLR3.
De maneira idntica, camundongos com deficincia de TLR2 parecem estar mais protegidos da
encefalite induzida por HSV-1. Por outro lado, camundongos com deficincia de TLR4 no
respondem bem infeco por HRSV, e polimorfismos desse receptor esto associados a maior
gravidade da doena em crianas.

RNA helicases (RIG e MDA-5) | Reconhecimento de RNA viral no citoplasma


A famlia de RNA helicases do tipo RIG-I (retinoic acid inducible gene-I), ou RLR, inclui RIGI, MDA-5 e Lgp-2, que so protenas altamente ubquas e, diferentemente dos receptores do tipo TLR
envolvidos no reconhecimento de genoma viral, se localizam no citoplasma celular. RIG-I formada
por um domnio helicase capaz de ligar a molculas de RNAfd virais e dois domnios tipo CARD
(caspase recruiting domain), necessrios para a sinalizao. O reconhecimento de RNAfd parece
induzir uma alterao conformacional na molcula que expe seus domnios CARD, possibilitando o
recrutamento da protena adaptadora MAVS (mithocondrial antiviral signaling protein). O
recrutamento de MAVS promove, ento, a ativao de NF--B e IRF-3. De fato, foi demonstrado em
linhagens celulares que o bloqueio de RIG impede a ativao de IRF-3 e a produo de IFN-I em
resposta infeco viral. Estudos realizados com camundongos deficientes de RIG-I e MDA-5
revelaram que enquanto RIG essencial para o reconhecimento de vrus que apresentam RNAfs
tais como flavivrus, paramixovrus, ortomixovrus e rabdovrus MDA-5 requerido para o
reconhecimento de outro grupo de vrus, que incluem os picornavrus.
Embora tanto RIG quanto alguns TLR reconheam molculas de RNA viral, aparentemente, a
resposta mediada por RIG-I e TLR no redundante. Primeiramente, a expresso desses receptores
difere de acordo com o tipo celular, de modo que TLR parece ser essencial em pDC, enquanto RIG
importante em mDC, macrfagos e fibroblastos. Alm disso, a expresso desses receptores ocorre
em diferentes compartimentos celulares, ou seja, aqueles vrus que infectam clulas dendrticas, que
entram por fuso e se replicam no citoplasma, devem ser primariamente reconhecidos por RIG;
enquanto aqueles que so endocitados podem ser reconhecidos por TLR. J foi comentado tambm
que TLR3, principalmente, pode reconhecer seus ligantes aps interao com clulas que entraram
em apoptose ou que sofreram lise, seja por necrose, seja pela prpria infeco viral.

Outras RNA helicases tambm tm papel na resposta imunolgica antiviral, porm,


aparentemente, como reguladores negativos de RIG-I e MDA-5. Esse o caso da Lgp-2, que
apresenta atividade de ligao com molculas de RNA, mas no contm os domnios CARD.

Sensores de DNA | Reconhecimento de DNA viral citoplasmtico ou nuclear


A ativao celular por molculas de DNA viral estava associada exclusivamente ao
reconhecimento dessas molculas por TLR9 presente em vesculas intracitoplasmticas. Entretanto,
uma srie de receptores capazes de reconhecer molculas de DNA presentes no ncleo ou no
citoplasma tem sido caracterizada, e sua estimulao associada ativao de vias de sinal,
envolvendo IRF e inflamassomas, levando produo de interferons e citocinas pr-inflamatrias.
Os fatores ativadores de IRF dependentes de DNA, ou DAI (DNA-dependent activator of
interferon regulatory factors) esto presentes no citoplasma e reconhecem molculas de DNA de fita
dupla na sua forma cannica de beta-hlice. A estimulao de DAI induz a ativao de NF--B e
IRF3/IRF7 pelo IKK- e TBK (TAML-binding kinase 1), respectivamente, resultando na produo
de citocinas inflamatrias e IFN-1. A produo de IFN, associada estimulao de DAI, j foi
descrita em modelos de infeco por adenovrus e HSV-1.
Outro receptor descrito, IFI-16 (IFN- inducible 16), parece ter tambm participao importante
na infeco por vrus DNA e seu papel na produo de IFN- e controle da replicao de HSV, por
exemplo, j foi relatado. O engajamento desse sensor comumente associado ativao de
inflamassomas; contudo, em alguns modelos de infeco, sua ativao foi associada produo de
IFN-, por IRF3 e NF--B. Alguns desses sensores de DNA sinalizam pela molcula adaptadora
STING (stimulator of interferon genes). Se houver DNA intracelular, STING migra do retculo
endoplasmtico para o citosol, no qual parece ativar TBK, cuja ativao est associada produo
de IFN-I.
A caracterizao dos sensores celulares responsveis pelo reconhecimento de vrus que
apresentam DNA como genoma est em ampla expanso, e os mecanismos moleculares envolvidos na
ativao de clulas aps infeco por esses vrus ainda no so amplamente conhecidos.
As Figuras 7.1 e 7.2 representam diferentes estratgias de reconhecimento de vrus de RNA e de
DNA, respectivamente, e o efeito desse reconhecimento na ativao celular e produo de IFN e
citocinas pr-inflamatrias.

Mediadores da resposta imunolgica antiviral | Interferon


Os IFN so citocinas produzidas por diferentes tipos celulares e so classificados como IFN-I
(IFN- e IFN-), do tipo II (IFN-) e do tipo III (IFN-). Os IFN-I incluem os IFN- e IFN-, os
quais so elementos-chave na resposta imunolgica antiviral. Essas citocinas apresentam uma srie

de funes envolvidas tanto no controle direto da replicao viral, quanto na regulao de outros
componentes do sistema imunolgico. A produo de IFN-I induzida aps a infeco viral em
diferentes tipos celulares, por meio do engajamento e da ativao de receptores que reconhecem
padres moleculares associados a patgenos (PRR), como foi anteriormente descrito. Essas citocinas
secretadas interagem com receptores especficos presentes nas clulas vizinhas e induzem diferentes
vias de sinalizao intracelular, que podem culminar na induo do chamado estado antiviral
nessas clulas, como ser explicado adiante.

Figura 7.1 Reconhecimento de vrus de DNA por receptores da imunidade inata. Diferentes sensores celulares so
responsveis pelo reconhecimento de vrus de DNA pelas clulas. Na superfcie celular, receptores do tipo toll 2 e 4 (TLR2 e
TLR4), por exemplo, so capazes de reconhecer componentes estruturais dos vrus, tais como protenas em sua
superfcie (1). Uma vez ativados pela ligao ao vrus, os TLR iniciam uma cascata de ativao, que leva fosforilao da
molcula adaptadora Myd88 (2a), ativando, por sua vez, diversos fatores transcricionais, tais como IRF7, NF--B e MAPK
(3). Esses fatores ativados so translocados para o ncleo celular e dirigem a transcrio dos genes que codificam
interferons do tipo I (IFN-I) e citocinas pr-inflamatrias (4). Ao penetrar em uma clula, os vrus de DNA tambm podem ser
detectados por sensores celulares intracitoplasmticos. Vrus que penetram por endocitose (5), por exemplo, tm
assinaturas moleculares detectadas por TLR intracitoplasmticos, que se localizam em vesculas, como o TLR9 (6). O

TLR9 reconhece o DNA viral e ativa a molcula adaptadora Myd88 (2b), a qual sinaliza a infeco viral de maneira
semelhante ao que acontece com os TLR de superfcie (3, 4). Adicionalmente, molculas de DNA viral livres no citoplasma
tambm podem ser detectadas por sensores de DNA no associados a vesculas, tais como DAI e IFI-16 (7). Uma vez
ativados, esses sensores traduzem o sinal pela molcula ativadora STING (8), que deixa o retculo endoplasmtico e ativa
TBK (9) e IKK- (no mostrado). Essas molculas, por sua vez, induzem a ativao de IRF3/IRF7 e NF--B,
respectivamente (10), os quais se translocam para o ncleo e induzem a transcrio de IFN-I e citocinas pr-inflamatrias
(4).

O IFN- se liga a seus receptores de maneira autcrina e parcrina, o que resulta em um feedback
positivo da produo dessa citocina. Essa ligao inicia uma cascata de sinalizao intracelular,
levando ativao de fatores de transcrio chamados STAT (signal transducing activators of
transcription), que se ligam a elementos de resposta estimulados por IFN (ISRE, interferonstimulated response elements), iniciando a transcrio de vrios genes estimulados por IFN (ISG,
interferon-stimulated genes).
Os genes induzidos por IFN levam ao estado antiviral nas clulas hospedeiras por influenciar na
sntese proteica, na inibio do crescimento celular e na apoptose. Dentre esses genes, pode-se
destacar o gene para uma endorribonuclease, que degrada RNA viral, e o gene para a proteno-cinase
R (PKR), que fosforila um fator de iniciao da sntese proteica, inibindo a sntese de protenas
celulares e virais. Alm disso, os elementos estimulados por IFN potencializam a maturao de
clulas dendrticas, a citotoxicidade mediada por clulas NK e a diferenciao de clulas T
citotxicas, contribuindo para a integrao entre a imunidade inata e a adaptativa.
Uma clara evidncia do papel dos IFN para o controle de infeces virais o fato de que, em
modelos de cultura de clulas ou animais experimentais deficientes em IFN ou nos seus receptores
(IFNR), observa-se aumento da replicao de diferentes vrus, incluindo flavivrus, reovrus,
filovrus e herpesvrus. Por outro lado, alguns vrus estabelecem infeco produtiva no hospedeiro,
mesmo aps induo de IFN pelas clulas hospedeiras, o que demonstra que os mesmos apresentam
estratgias de escapar dos efeitos mediados por essas citocinas, como ser descrito adiante.
Alm dos IFN- e IFN-, o IFN- tambm participa ativamente do controle da replicao de
vrios patgenos virais, especialmente pela ativao de diferentes tipos celulares, como clulas NK
e linfcitos T citotxicos. Esses mecanismos sero discutidos posteriormente.
A estrutura, a funo e os receptores de um novo grupo de IFN foram caracterizados. Essas
citocinas, classificadas como IFN-III, so chamadas de IFN- 1, IFN- 2 e IFN- 3, ou de IL-29, IL28A e IL-28B, respectivamente. Assim como os IFN-I, a produo desses mediadores pode ser
induzida por uma infeco viral, por meio do reconhecimento de componentes virais e ativao de
PRR. Os IFN- so reconhecidos por receptores distintos daqueles engajados por IFN-I, mas as vias
de sinalizao estimuladas so semelhantes e incluem a ativao de STAT. Assim, os efeitos
antivirais atribudos aos IFN- e , aparentemente, tambm podem ser induzidos por IFN-.
Polimorfismos nos genes que codificam IFN-III foram associados progresso e/ou melhor resposta

terapia aps infeco com HCV, e o potencial teraputico dessas citocinas tem sido investigado
(Figura 7.3).

Figura 7.2 Reconhecimento de vrus de RNA por receptores da imunidade inata. Diferentes sensores celulares so
responsveis pelo reconhecimento de vrus de RNA pelas clulas. Na superfcie celular, receptores do tipo toll 2 e 4 (TLR2 e
TLR4), por exemplo, so capazes de reconhecer componentes estruturais dos vrus, tais como protenas em sua
superfcie (1). Uma vez ativados pela ligao ao vrus, os TLR iniciam uma cascata de ativao que leva fosforilao da
molcula adaptadora Myd88 (2a), que, por sua vez, ativa diversos fatores transcricionais, tais como IRF7, NF--B e MAPK
(3). Esses fatores ativados so translocados para o ncleo celular e dirigem a transcrio dos genes que codificam
interferons do tipo I (IFN-I) e citocinas pr-inflamatrias (4). Ao penetrar em uma clula, os vrus de RNA tambm podem ser
detectados por sensores celulares intracitoplasmticos. Vrus que penetram por endocitose (5), por exemplo, tm
assinaturas moleculares detectadas por TLR intracitoplasmticos que se localizam em vesculas, tais como TLR3, TLR7,
TLR8 (6). O TLR3 detecta a existncia de RNA viral de fita dupla (RNAfd) e desencadeia uma cascata de sinalizao pela
molcula adaptadora TRIF (7), que, por sua vez, ativa fatores de transcrio, tais como IRF3, NF- B e MAPK (8). Esses
fatores, uma vez translocados para o ncleo, induzem a transcrio dos genes codificadores de interferons do tipo I (IFN-I)
e citocinas pr-inflamatrias (4). J o TLR7 e o TLR8 ativam a molcula adaptadora Myd88 (2b) e sinalizam a infeco viral
de maneira semelhante aos TLR de superfcie (3, 4). Por fim, vrus ou componentes virais livres no citoplasma, como

acontece quando determinados vrus penetram na clula por fuso de seu envelope com a membrana celular (9), por
exemplo, podem ter seus padres moleculares detectados por sensores livres no citoplasma, tais como RIG-I, MDA-5, e
Lgp-2, membros da famlia de RNA helicases do tipo RIG-I (10). Estes sensores apresentam domnios que reconhecem
RNAfd do vrus e desencadeiam sinais pela ativao da protena adaptadora MAVS (11). Uma vez ativada, MAVS induz a
ativao dos fatores transcricionais IRF3 e NF--B (8), os quais se translocam para o ncleo e induzem a transcrio de
IFN-I e citocinas pr-inflamatrias (4).

Ativao de inflamassomas
O reconhecimento de padres moleculares virais em associao a alteraes no metabolismo das
clulas infectadas pode levar, ainda, ativao de complexos proteicos, chamados inflamassomas. A
ativao de inflamassomas j foi reportada em vrus de DNA e de RNA, incluindo adenovrus, vrus
vaccnia, vrus da influenza, vrus da encefalomiocardite e vrus do sarampo. Esses complexos tm
um importante papel na resposta inflamatria e controle da infeco causada por diferentes vrus, por
atuarem como plataformas proteicas para a ativao da enzima caspase 1, a qual responsvel pela
maturao e secreo das citocinas inflamatrias IL-1- e IL-18. Alm disso, apresentam atuao
local e sistmica, e esto associadas a febre, ativao de linfcitos T e clulas NK, e infiltrao de
leuccitos.
Os inflamassomas podem ser formados por diferentes receptores e os mais bem estudados so
aqueles constitudos de receptores do tipo NOD (nucleotide oligomerization domain) ou NLR (nodlike receptors), particularmente o do tipo NLRP3. Diferentes NLR e complexos inflamassomas
podem ser ativados, dependendo do patgeno em questo. Quando ativados, esses receptores
recrutam a protena adaptadora ASC (apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD
[caspase recruitment domain]) a qual se liga, e recruta a protena caspase 1 para a formao do
complexo.
Na verdade, so necessrios dois sinais para ativao completa do sistema at a secreo das
citocinas da famlia da IL-1. O primeiro, muitas vezes mediado por TLR, induz a sntese de pr-IL-1 e pr-IL-18. Um segundo sinal disparado por alteraes inicas no citoplasma celular, como o
efluxo de potssio ou outros ons, que induzem ativao de receptores do tipo NOD e ativao de
caspase 1 que, ento, cliva as formas imaturas das citocinas, tornando possvel sua secreo. Na
infeco pelo vrus da influenza, por exemplo, foi sugerido que a ativao de inflamassomas e a
secreo de IL-1- requerem a ativao de TLR7 pelo RNA viral e atividade da protena M2,
induzindo efluxo de prtons do complexo de Golgi e a ativao de NLRP3. Mecanismo semelhante j
foi descrito na infeco por HRSV, na qual a ativao de TLR2, seguida de produo de espcies
reativas de oxignio (ROS) e efluxo de K+, com ativao de inflamassoma NLRP3, produz IL-1-.
Essa pode ter carter protetor, mas tambm provocar os sintomas inflamatrios, em casos de
pneumonia.

Figura 7.3 Mecanismos de produo e ao dos IFN-I durante uma infeco viral. Durante a infeco celular por um
determinado tipo de vrus (1), h produo de molculas de DNA ou de RNA virais (2) dentro de endossomas, ou livres no
citoplasma da clula infectada. Esses cidos nucleicos virais so detectados por receptores de reconhecimento de
patgenos (PRR) (3), tais como receptores toll-like, RIG-like, dentre outros. A ativao desses receptores leva a uma
cascata de sinalizao, que culmina com a fosforilao e a ativao de fatores regulatrios de transcrio de IFN (IRF) (4),
os quais so translocados para o ncleo e induzem a transcrio dos genes codificadores dos IFN-I (5 e 6). Os IFN
produzidos so secretados da clula infectada (7) e se ligam aos receptores de IFN (IFNR) (8) de maneira autcrina ou
parcrina. A ativao dos IFN leva fosforilao das cinases Jak1 e Tyk2 (9), as quais, por sua vez, fosforilam e ativam os
fatores de transcrio STAT1 e 2 que formam, juntamente com os IRF ativados, um complexo transcricional (10) que migra
para o ncleo e se liga a elementos gnicos estimulados por IFN (ISRE) (11), culminando com a transcrio de genes
estimulados por IFN (ISG). Dentre os produtos expressos que se acumulam no citoplasma destacam-se a cinase
dependente de RNA (PKR) e a RNAse L, dentre outros (12). Caso ocorra a infeco da clula (13), a PKR se liga ao RNA
de fita dupla (RNAdf) produzido pelo vrus e fosforila o fator de iniciao da sntese proteica (eIF-2a), bloqueando a traduo
de novas protenas virais ou celulares (14), deixando a clula refratria replicao viral (estado antiviral) (15). As funes
de imunorregulao pelos IFN-I e a ao de outros fatores codificados por ISG no esto representadas na figura.

Sensores de DNA, como AIM2 e IFI16, tambm tm sido associados ativao de


inflamassomas. Essas molculas apresentam, alm dos seus domnios de ligao a DNA, domnios
pirina (PYN), os quais esto associados ao recrutamento de ASC. O papel de AIM2 na ativao de
caspase 1 e produo de IL-1- foi descrito aps reconhecimento de vrus vaccnia, e IFI-16 foi
associado formao e ativao de inflamassomas durante a infeco pelo HHV-8 (herpesvrus
humano tipo 8 ou herpesvrus associado ao sarcoma de Kaposi), HSV e HCMV (Figura 7.4).

Papel da resposta imunolgica humoral nas infeces virais


A presena de componentes da resposta imunolgica humoral, como anticorpos e peptdeos do
sistema complemento, essencial para neutralizar e eliminar partculas virais circulantes, impedindo
sua entrada em clulas hospedeiras e inibindo sua disseminao pelo organismo, alm de ter um
papel importante na preveno de reinfeces. O papel de cada um desses componentes ser
discutido a seguir.

Linfcitos B e produo de anticorpos


Um dos mecanismos mais importantes de controle de uma infeco viral bloquear a interao
do vrus com a clula hospedeira, em um processo chamado neutralizao. Os mecanismos de
resposta imunolgica humoral tm um papel-chave nesse processo, particularmente pela ativao de
linfcitos B especficos e produo de anticorpos. Os linfcitos B so estimulados aps o
reconhecimento de antgenos virais por suas imunoglobulinas (Ig) de superfcie. Essas Ig, em
associao a outras protenas responsveis pela sinalizao intracelular, formam o BCR (B cell
receptor), o receptor de antgenos da clula B. A ativao inicial dessas clulas induz a expanso de
um clone de clulas especficas contra um dado antgeno viral e secreo de anticorpos do isotipo
IgM. Subsequentemente e em especial aps a interao das clulas B com linfcitos TCD4+ tambm
especficos para o antgeno, essas clulas so capazes de fazer mudana de classe de Ig, secretando
IgG, IgA e IgE. A IgG o principal isotipo presente na circulao sangunea e em fluidos
extracelulares, e funciona como eficiente opsonina para o reconhecimento por fagcitos e ativao do
sistema complemento, como ser discutido mais adiante. J a IgA o principal isotipo presente em
secrees, especialmente na mucosa do trato intestinal e do sistema respiratrio, tendo, ento, grande
importncia no controle das infeces desses tecidos. A IgE est presente em nveis mais baixos na
circulao e, aparentemente, suas funes no esto associadas a mecanismos de neutralizao ou
opsonizao viral.

Figura 7.4 Ativao de inflamassomas por infeces virais. Diferentes sensores celulares como, por exemplo, os
receptores toll-like (TLR) na superfcie celular ou em vesculas citoplasmticas, dentre outros, detectam padres
moleculares de vrus (1). Este reconhecimento leva ativao dos TLR e ao recrutamento da protena adaptadora Myd88
(2), a qual ativa NF- B (3). O fator transcricional NF- B se transloca para o ncleo e induz a transcrio dos genes
codificadores de IL-1- e NOD (NLRP3) (4). Essa etapa corresponde ao primeiro sinal de ativao do inflamassoma. O
efluxo de ons como o potssio (K+) no citoplasma celular e a presena de cido nucleico viral, espcies reativas de
oxignio (ROS) e determinadas protenas virais, como a protena M2 do vrus da influenza, correspondem ao segundo sinal
de ativao do inflamassoma (5). O sinal induz o recrutamento e a ativao de NOD (NLRP3) (6), a qual ativa a protena
adaptadora ASC (7). ASC capaz de se ligar e ativar a caspase-1 (8), que, por sua vez, converte pr-IL-1- em IL-1- (9),
levando secreo dessa citocina pr-inflamatria (10). Outros componentes celulares e vias transdutoras de sinal, no
ilustradas na figura, tambm esto associados ativao do inflamassoma por vrus especficos.

A importncia dos anticorpos na proteo contra infeces virais claramente evidenciada em


infeces agudas que induzem imunidade protetora e duradoura. Esse o caso da infeco por vrus
do sarampo, da poliomielite e outros, em que se observa que indivduos soropositivos para essas
infeces (ou seja, que j tiveram contato e apresentam anticorpos especficos contra esses vrus)
no voltam a apresentar a doena caso ocorra a reinfeco. Alm disso, possvel notar que, mesmo

no caso de vrus que no induzem imunidade protetora, a infeco primria, em geral, mais grave
do que em indivduos soropositivos. A ativao rpida de linfcitos B com induo de anticorpos
IgM neutralizantes essencial, muitas vezes, para a prpria sobrevivncia do hospedeiro,
especialmente na infeco com vrus altamente citopticos, como o vrus Ebola. Outro exemplo, j
relatado anteriormente, o de modelos experimentais de infeco com vrus da influenza ou o WNV,
nos quais camundongos deficientes em linfcitos B sucumbem rapidamente infeco.
O processo de neutralizao, na verdade, indica a capacidade de um anticorpo se ligar e inativar
o vrus e pode ocorrer por diferentes mecanismos. A ligao dos anticorpos a um vrus pode induzir:
agregao das partculas virais; desestabilizao da estrutura da partcula; inibio da adsoro a
clulas hospedeiras; inibio da fuso do vrion com a membrana da clula hospedeira ou da entrada
do genoma de vrus no envelopados no citoplasma; inibio da funo do core viral pelo sinal
desencadeado pelo anticorpo e bloqueio do brotamento ou liberao viral da superfcie celular.
O mecanismo de agregao de partculas virais mediado pela ligao de anticorpos depende do
isotipo de Ig e sua valncia, e da distncia entre os eptopos virais. Esses agregados podem ser
fagocitados e degradados com mais eficincia que a partcula isolada, facilitando, ento, a
eliminao do vrus da circulao. Anticorpos neutralizantes podem, ainda, induzir alteraes
conformacionais em protenas de superfcie virais, impedindo sua funcionalidade. Na infeco por
poliovrus, demonstrou-se que a ligao dos anticorpos pode induzir um processo diferente de
desestabilizao da estrutura viral. Embora esse mecanismo no esteja totalmente esclarecido,
possvel que esses anticorpos mimetizem a funo de receptores da clula hospedeira que contribuem
para o desnudamento da partcula.
provvel que o mecanismo de neutralizao mais bem conhecido esteja relacionado com a
inibio da adsoro do vrus clula hospedeira. Essa inibio pode ser mediada no apenas pela
ligao dos anticorpos diretamente ao stio de ligao do vrus ao receptor, mas tambm pela ocluso
e bloqueio estrico desse stio, ou interferncia em sua funo. Esses anticorpos podem bloquear,
ainda, a fuso do envoltrio viral com a membrana da clula hospedeira. Em geral, os peptdeos
hidrofbicos presentes nas protenas virais responsveis pela fuso no esto expostos ao
reconhecimento por anticorpos. Ainda assim, a inibio do processo de fuso pode ocorrer devido
ligao dos anticorpos s espculas virais, impedindo a interao subsequente do vrus com o
receptor celular de fuso, de maneira semelhante ao processo de inibio de adsoro. Alm disso,
possvel que a presena do anticorpo bloqueie a interao entre as membranas viral e celular,
impedindo o processo de fuso de membranas. Alternativamente, a ligao dos anticorpos pode
estabilizar a conformao pr-fuso das protenas virais, impedindo a ativao do processo de fuso.
Outras estratgias podem estar associadas neutralizao dos vrus em etapas posteriores
entrada na clula hospedeira. Anticorpos que reconhecem a neuraminidase do vrus da influenza, por
exemplo, impedem a liberao da partcula da clula infectada.

No entanto, a maioria dos anticorpos no apresenta atividade neutralizante. Muitas vezes, os


antgenos reconhecidos pela clula B so fragmentos ou protenas virais liberados de clulas que
foram lisadas aps a infeco, e podem ser protenas internas dos vrus que no esto expostas na
partcula circulante, ou protenas que foram desnaturadas, degradadas, processadas ou que no foram
sintetizadas completamente. Alternativamente, esses anticorpos podem ser especficos contra
protenas nativas, mas sem papel na adsoro ou penetrao viral, e tambm no apresentar atividade
neutralizante. Contudo, mesmo anticorpos sem atividade neutralizante direta podem contribuir para o
controle da infeco por outros mecanismos. Nesse sentido, os anticorpos agem tambm como
opsoninas, possibilitando o reconhecimento desses imunocomplexos por receptores para a poro Fc
das Ig (FcR), presentes em macrfagos e neutrfilos. Esse processo leva internalizao dos
complexos e destruio da partcula viral pelos fagcitos. Por outro lado, o reconhecimento desses
imunocomplexos por receptores Fc pode estar associado potencializao da infeco de
macrfagos, como tem sido descrito na infeco por DENV e outros.
A ligao de anticorpos com antgenos virais expressos na superfcie da clula infectada pode,
ainda, induzir o fenmeno de ADCC (antibodydependent cell-mediated cytotoxicity) mediado
pelo reconhecimento de receptores Fc, seguido de ativao de clulas NK e liberao de seus
grnulos citolticos, como ser discutido posteriormente. Alm disso, a formao de complexos
vrus-anticorpos pode estimular a ativao da via clssica do sistema complemento, como ser
detalhado mais adiante.
Vale lembrar que os linfcitos B so tambm clulas apresentadoras de antgeno. A penetrao de
vrus nessas clulas pode levar ao processamento e apresentao de seus peptdeos e ativao
subsequente de linfcitos T. Na verdade, esse processo importante para a prpria ativao dos
linfcitos B, uma vez que a regulao da atividade dessas clulas pelas clulas T essencial para a
maior eficincia da resposta B (com anticorpos com maior afinidade) e para o desenvolvimento de
memria celular. O desenvolvimento de clulas de memria com produo de anticorpos especficos
o principal mecanismo de controle de reinfeces em indivduos convalescentes ou imunizados.
Assim, um dos principais objetivos para o desenvolvimento de vacinas a elicitao de anticorpos
potentes/neutralizantes que impeam a morbidade e a mortalidade causada por um patgeno viral.
Em resumo, a principal funo efetora dos linfcitos B envolvida no controle de uma infeco
viral a neutralizao, mediada pela secreo de anticorpos especficos, possibilitando o bloqueio
da interao do vrus com receptores na clula hospedeira e tornando possvel a opsonizao da
partcula, levando ativao do sistema complemento e fagocitose.

Sistema complemento
Componentes do sistema complemento tm papel importante no controle da replicao viral,
participando diretamente da destruio do agente viral, da opsonizao desses vrus para o

reconhecimento e englobamento por clulas fagocticas e da induo de resposta inflamatria. A


cascata do complemento pode ser iniciada por trs diferentes vias: clssica, que se inicia com a
ligao de C1 a complexos antgeno-anticorpo; alternativa, que se inicia pela ligao de C3 a
estruturas do vrus ou de clulas infectadas; e das lectinas, que envolve a protena MBL (mannanbinding lectin) uma protena srica que se liga a alguns carboidratos expressos em glicoprotenas
de envelopes virais. Todas essas vias envolvem uma cascata de reaes que produzem uma C3
convertase ligada superfcie viral. Essa enzima cliva C3, liberando C3b e C3a; C3b se mantm
associado superfcie do patgeno e pode funcionar como uma opsonina, tornando o vrus alvo de
fagcitos que apresentam receptores para C3 (CR1), facilitando a eliminao dos vrus da
circulao. Alternativamente, C3b pode se associar a C5, produzindo uma C5 convertase que cliva
C5, gerando C5a e C5b. A presena de C5b associada ao vrus pode iniciar uma nova sequncia de
reaes, resultando na associao de outros componentes do complemento e na formao do
complexo de ataque membrana (MAC). Esse complexo cria um poro na bicamada lipdica que pode
causar a lise de vrus envelopados e de clulas infectadas por vrus. Alm disso, C3a, C4a e,
principalmente, C5a, liberados aps as clivagens das convertases, tm funo de anafilatoxinas e
induzem a liberao de histamina por mastcitos e basfilos, causando vasodilatao e aumento da
permeabilidade vascular. Alm disso, esses fragmentos tambm so importantes mediadores
inflamatrios envolvidos no recrutamento de leuccitos para o stio infectado.
Alm dos mecanismos descritos, componentes do complemento, como a MBL, podem agir na
neutralizao viral por meio da competio pela ligao em receptores de superfcie das clulas
hospedeiras, como foi descrito para o HIV e os filovrus Ebola e Marburg. O papel dessa via no
controle de algumas infeces virais comeou a ser mais bem compreendido aps a descrio de
polimorfismos genticos, que afetam a concentrao plasmtica e o estado oligomrico de MBL. Na
infeco por HBV, por exemplo, polimorfismos associados a baixos nveis de expresso de MBL se
correlacionam a pior prognstico, associado persistncia viral, progresso da doena e
sobrevivncia ou no doena heptica fulminante.
Alm de macrfagos e neutrfilos que apresentam receptores para C3, outros tipos celulares
tambm tm receptores para complemento, cujo engajamento pode estar associado ativao dessas
clulas, como ocorre com CD21 (CR2) presentes nos linfcitos B. O sistema complemento apresenta,
ainda, um importante papel no controle da resposta imunolgica adaptativa. J foi demonstrado, por
exemplo, que animais deficientes em C3, infectados com vrus da influenza, apresentam reduo da
capacidade migratria de linfcitos TCD8+, levando inibio da atividade citoltica e do controle
da infeco.
A ativao exacerbada ou crnica do sistema complemento, por outro lado, pode ser prejudicial
para o hospedeiro, podendo levar a um dano tecidual devido lise celular pela formao do MAC;
opsonizao de clulas infectadas seguida de fagocitose; e ao aumento da resposta inflamatria
mediada por fragmentos de complemento e anafilatoxinas. Em modelos de infeco experimental por

HRSV, demonstrou-se que a ocorrncia de formao e deposio de imunocomplexos, seguida de


fixao de complemento, est diretamente relacionada com a hiper-reatividade brnquica e
pneumonia. A deposio de imunocomplexos, levando inflamao e a alteraes vasculares, est
associada, ainda, a manifestaes clnicas comuns a diferentes infeces, tais como os exantemas e a
produo de edemas (Figura 7.5).

Papel da resposta imunolgica celular nas infeces virais


Enquanto a resposta humoral e a presena de anticorpos e componentes do sistema complemento
so fundamentais para a neutralizao de vrus circulantes e a inibio da disseminao viral, a
resposta imunolgica celular essencial para outra etapa a eliminao das clulas infectadas.
Nesse sentido, os linfcitos TCD8+, com atividade citotxica, surgem ao lado das clulas natural
killer (NK), como as principais clulas efetoras. Alm desses, as clulas TCD4+ tambm apresentam
papel importante de regulao da resposta imunolgica como um todo. Essas clulas produzem
diferentes citocinas envolvidas na regulao da ativao de componentes da imunidade inata, de
clulas TCD8+ e de linfcitos B, alm de serem essenciais para o desenvolvimento de memria
imunolgica.

Clulas natural killer


Embora sejam de origem linfocitria, as clulas natural killer (NK) so consideradas
componentes efetores da imunidade inata, uma vez que seu padro de reconhecimento da clula-alvo
distinto de linfcitos T e B (no apresentam receptores clonais como TCR ou BCR) e sua ativao
no est relacionada com o desenvolvimento de memria imunolgica. Essas clulas apresentam
atividade citotxica e, quando ativadas, liberam grnulos citolticos, contendo enzimas como
granzimas e perforinas, que induzem a apoptose da clula-alvo. O reconhecimento da clula-alvo
pelas clulas NK pode ocorrer por dois mecanismos; o primeiro est relacionado com a expresso
de FcR e com o reconhecimento e a induo de apoptose das clulas infectadas recobertas por
anticorpos. Tal processo chamado de citotoxicidade mediada por anticorpos (ADCC).
Clulas NK expressam, ainda, um conjunto de receptores que reconhecem padres de
carboidratos expressos em diferentes ligantes celulares, levando ativao dessas clulas, com
liberao de grnulos citotxicos. A ativao induzida por esses receptores regulada por outro
grupo destes, que reconhecem molculas de MHC I e tm atividade inibitria sobre clulas NK.
Desse modo, o segundo mecanismo de ativao das clulas NK est relacionado com o
reconhecimento de um padro anormal de expresso de molculas de MHC I nas clulas-alvo.
Diferentes vrus so capazes de modular a expresso de molculas de MHC nas clulas hospedeiras,
de modo que, em geral, clulas infectadas por vrus apresentam uma diminuio da expresso de

MHC I. Dessa maneira, a baixa expresso de MHC I em clulas infectadas torna possvel o
reconhecimento dessas clulas pelas clulas NK, sem que ocorra o engajamento dos receptores
inibitrios, levando ativao das clulas NK e liberao de seus grnulos citotxicos.

Figura 7.5 Exemplos de estratgias de neutralizao viral mediada por anticorpos. (1) A ligao dos anticorpos s
partculas virais pode promover a agregao das mesmas, impedindo sua interao com receptores de superfcie. Assim,
esses agregados podem ser mais facilmente eliminados da circulao por fagcitos. (2) Anticorpos podem bloquear o stio
de ligao do vrus com o receptor celular, impedindo a adsoro. Esses imunocomplexos vrus-anticorpo podem ser
reconhecidos por receptores para a poro Fc das Ig (FcR), presentes em fagcitos (2a). A seguir, os imunocomplexos
podem ativar o sistema complemento, possibilitando a interao com opsoninas, as quais tambm podem ser
reconhecidas por receptores na superfcie dos fagcitos (CR1) (2b). (3) A ligao do anticorpo pode impedir a fuso por
interagir diretamente com o peptdeo de fuso, bloque-lo estericamente ou impedir as alteraes conformacionais
necessrias para que ocorra a fuso. (4) Anticorpos podem se ligar ao vrus durante o brotamento e impedir sua liberao
(p. ex., anticorpo antineuraminidase de vrus da influenza).

Alm de sua atividade citotxica, as clulas NK so capazes de secretar uma srie de citocinas
(como o IFN-) e quimiocinas (como MIP-1-, MIP-1- e RANTES) que participam da regulao da

resposta imunolgica.

Linfcitos T
Diferentemente das clulas NK, os linfcitos T apresentam um padro clonal de reconhecimento
e necessitam de ativao prvia para a realizao da sua funo efetora, fazendo parte da chamada
imunidade adaptativa. O reconhecimento do patgeno feito por meio de seus receptores especficos
de antgenos (TCR, T cell receptor), os quais reconhecem pequenos peptdeos associados a
molculas de MHC expressas na superfcie de clulas apresentadoras de antgenos. O TCR age em
conjunto com duas molculas assessrias, CD4 e CD8, as quais so mutuamente exclusivas e
determinam com qual tipo de MHC os linfcitos T iro interagir. Clulas TCD8+ reconhecem
antgenos via MHC I, enquanto as TCD4+ tm seu reconhecimento antignico restrito apresentao
via MHC II. Todas as clulas nucleadas expressam MHC I, enquanto a expresso de MHC II est
restrita s APC, que so as clulas dendrticas, os macrfagos e os linfcitos B. A ligao do TCR
especfico ao antgeno apresentado pela molcula de MHC promove a ativao do linfcito T e a
rpida diviso celular expandindo o pool de clulas especficas ao antgeno e promovendo a
amplificao da resposta.
Classicamente, a apresentao de antgenos virais ocorre via molculas de MHC I. Esse tipo de
apresentao caracterstico de patgenos citoplasmticos, que so degradados nos proteossomas
celulares. A degradao ou processamento desses antgenos nos proteossomas produz pequenos
peptdeos os quais so endereados ao retculo endoplasmtico (RE), em que se associam s
molculas de MHC I recm-sintetizadas. Assim, o complexo peptdeo-MHC formado migra para a
membrana celular, na qual apresentado para os linfcitos TCD8+. J a apresentao via molculas
de MHC II caracterstica de patgenos intravesiculares. A degradao ocorre dentro das vesculas,
principalmente lisossomas, por meio de proteases cidas presentes. Posteriormente, ocorre a fuso
dessas vesculas com outras vesculas contendo a molcula de MHC II, o que permite sua associao
aos peptdeos virais gerados. Esses complexos migram para a membrana celular, onde so
apresentados a linfcitos TCD4+. sabido, no entanto, que essas vias no so to restritas e que
existem mecanismos de processamento e apresentao cruzada de antgenos. Nesse sentido, antgenos
provenientes de patgenos intravesiculares podem ser apresentados via MHC I. Acredita-se que isso
possa ocorrer devido associao de componentes do proteossoma a vesculas endossomais ou,
ainda, pela reciclagem de molculas de MHC I da membrana plasmtica por meio de endocitose.
Dessa maneira, antgenos processados nos lisossomas podem se associar ao MHC I presente nas
vesculas. Vale ressaltar que os antgenos presentes nas vesculas podem ser oriundos tanto de vrus
endocitados quanto de fragmentos originados de clulas que entraram em apoptose aps a infeco
viral, os quais podem ser capturados pelas APC. Desse modo, essa via de apresentao cruzada
importante para a apresentao de antgenos derivados de vrus que no infectam APC, para que haja

ativao dos linfcitos TCD8+ citotxicos.


A apresentao cruzada importante tambm para ativao de clulas TCD4+. A gerao de
peptdeos para a apresentao via MHC II para clulas TCD4+ pode ocorrer aps lise de clulas
infectadas e liberao desses antgenos, os quais podem ser capturados e endocitados por APC, em
um processo semelhante ao descrito anteriormente. possvel, ainda, que molculas de MHC II
recm-sintetizadas e expressas no RE se encontrem e se associem a peptdeos produzidos no
proteossoma, possibilitando a apresentao dos mesmos via MHC II. Independentemente de
mecanismos de apresentao cruzada, a apresentao de antgenos virais via MHC II pode ocorrer
aps a captura dos vrus por receptores do tipo lectina (receptores de manose, DC-SIGN), que
direcionam as partculas para os endossomas.
Durante a apresentao do antgeno clula T, necessria, alm da ligao MHC/TCR, a
participao de outras molculas chamadas coestimulatrias. Esses sinais so imprescindveis tanto
para a maturao do linfcito T quanto para a maturao das APC que, quando maduras, liberam
citocinas importantes para a determinao do padro de resposta, como o caso dos linfcitos
TCD4+, que podem se diferenciar em Th1, Th2 e Th17 ou, ainda, em clulas T regulatrias. Alm
disso, h maior expresso de molculas de adeso e receptores de quimiocinas nos linfcitos T,
como um mecanismo de direcionar essas clulas para o stio de infeco.

Linfcitos TCD8+
A principal funo efetora dos linfcitos TCD8+ est associada sua atividade citotxica e
induo de apoptose da clula-alvo. O processo tem incio pelo reconhecimento do antgeno viral,
associado a molculas de MHC I na superfcie das clulas infectadas. Isso leva ativao das
clulas TCD8+ com liberao de grnulos citolticos. O contedo desses grnulos contm uma srie
de protenas e enzimas que podem causar dano e morte da clula-alvo infectada. Uma dessas
molculas a perforina, uma protena capaz de formar poros nas membranas celulares. Outras
molculas so as granzimas, que so serino-proteases, e, ao entrarem na clula infectada, ativam a
cascata de apoptose, iniciada pela ativao de caspase-3. A granulisina tambm uma enzima capaz
de levar a clula a entrar em apoptose. Dessa maneira, por apoptose, essas molculas atuam em
conjunto, possibilitando que a clula infectada seja eliminada sem que haja ativao de processo
inflamatrio. A apoptose da clula infectada, consequentemente, causa destruio das partculas
virais, impedindo a infeco de outras clulas e sua disseminao no hospedeiro.
A lise das clulas infectadas, em consequncia da apoptose pode ocorrer, ainda, por outros
mecanismos de induo de citotoxicidade, como o mediado pelo engajamento do receptor Fas, que
induz a ativao de cascata de caspases. Quando ativados, os linfcitos TCD8+ expressam em sua
membrana o ligante de Fas (FasL), que pode interagir com o receptor Fas na superfcie da clula
infectada e induzir a apoptose dessas clulas.

Alm de sua atividade citotxica, as clulas TCD8+ tambm secretam inmeros mediadores
imunolgicos, incluindo citocinas e quimiocinas, tais como o IFN-, TNF-, MIP-1, dentre outros,
que podem contribuir para ativao de mecanismos antivirais nas clulas infectadas. A liberao de
IFN-, por exemplo, inibe a replicao viral e promove aumento na expresso de molculas de
MHC, alm de ativar macrfagos. A ativao dessas clulas leva inibio da replicao viral pela
produo de espcies reativas de oxignio e pela maior eficincia na degradao de protenas.
Esses achados demonstram o papel crucial da ativao dos linfcitos TCD8+ para o controle da
replicao viral. No entanto, a persistncia do antgeno e a ativao crnica dessas clulas podem
resultar em deficincia de sua funo efetora, devido exausto celular a qual est associada a alta
carga viral, manuteno do patgeno no hospedeiro e induo progressiva da inibio da atividade
citotxica e produo de citocinas mediadas pelos linfcitos TCD8+. Nesse sentido, a expresso de
marcadores associados exausto, como o receptor PD-1, foi demonstrada em infeces crnicas,
como aquelas causadas por HCV e HIV. Alm desse mecanismo, a deficincia de linfcitos TCD4+
tambm pode contribuir para a inibio da funo das clulas TCD8+, como ser discutido a seguir.

Linfcitos TCD4+
A ativao de linfcitos TCD4+, tambm chamados linfcitos T auxiliares ou T helper (Th), de
extrema importncia para o controle de uma infeco viral, uma vez que sua principal funo efetora
esta associada produo de citocinas envolvidas na regulao de diferentes componentes da
resposta imunolgica. O papel central das clulas TCD4+ na resposta antiviral pode ser evidenciado
pelo fato de que uma deficincia de nmero ou funo dessas clulas associada reativao de
infeces latentes, suscetibilidade aumentada a infeces oportunistas e baixa eficincia de
vacinas.
As clulas TCD4+ so estimuladas aps interao e apresentao de antgenos por APC e, de
acordo com o estmulo e padro de citocinas produzidas pelas APC, as clulas T helper podem ser
diferenciadas em Th1, Th2, Th17, ou Treg (regulatory T cells).
As clulas Th1 produzem, sobretudo, IFN-, IL-2 e IL-18. Essas citocinas so importantes para a
sobrevivncia, a manuteno e a expanso de linfcitos e para a ativao de macrfagos, clulas NK
e linfcitos TCD8+. Desse modo, a ativao de clulas Th1 central para a induo e a manuteno
da resposta antiviral. J as clulas Th2 produzem IL-4, IL-5 e IL-13 e, classicamente, so associadas
modulao da produo de determinados isotipos de imunoglobulina.
As clulas Th17 produzem IL-17, IL-21 e IL-22 e participam ativamente de respostas
inflamatrias. O aumento da produo de IL-17 j foi associado exacerbao da resposta
inflamatria e ao surgimento de determinados sintomas em diferentes infeces virais, tais como na
ceratite causada aps a infeco da crnea pelo HSV, na miocardite causada pelo Coxsackievrus B3
e na infeco crnica pelo HBV. Por outro lado, as clulas Th17 parecem ser importantes para a

imunidade de mucosas; alm disso, o equilbrio na proporo desse subtipo celular parece ser
importante para o controle de infeces nesses tecidos. Na infeco pelo HIV, por exemplo, h relato
de que a produo de citocinas com perfil Th1 e Th17 est inversamente correlacionada carga
viral. Alm disso, clulas Th17 so preferencialmente depletadas no trato gastrointestinal de
pacientes HIV-positivos, enquanto em modelos de infeco por SIV em seus hospedeiros naturais que
no adoecem, a populao de clulas Th17 se mantm intacta, sugerindo que a preservao da mesma
influencie a progresso para doena.
As clulas Treg caracterizadas pela expresso do receptor CD25 e, muitas vezes, do fator de
transcrio Foxp3, esto associadas supresso da resposta imunolgica mediada por linfcitos
TCD4+. Essa inibio ocorre, principalmente, pela produo de citocinas, tais como IL-10 e TGF-,
que modulam negativamente a resposta T. A participao de clulas Treg em infeces virais j foi
demonstrada em infeces por HIV e HCV. Em pacientes com infeco crnica por HCV, foi
observada a induo de citocinas caractersticas da ativao de Treg, como IL-10 e TGF-. Alm
disso, foi descrita maior frequncia de Treg nos pacientes com infeco crnica em relao queles
que eliminaram a infeco. De maneira semelhante, em pacientes HIV-positivos no tratados,
observou-se que a proporo de clulas Treg em mucosas se correlaciona diretamente carga viral.
Diante da enorme plasticidade das clulas TCD4+, seu papel na ativao de outros tipos
celulares tambm bastante diverso. Nesse sentido, sabe-se que a expanso de linfcitos TCD8+ e
induo de resposta citotxica pode ser positivamente modulada por essas clulas. Algumas das
citocinas produzidas por clulas TCD4+ so essenciais para a sobrevivncia, expanso ou
manuteno das clulas T, de maneira que a ativao das clulas Th importante para a expanso de
CTL especficos para o vrus nas respostas primrias e sua subsequente diferenciao em clulas de
memria. Tem sido observado em vrios modelos de infeco viral que a ativao de clulas TCD8+
na ausncia do help de TCD4+ est associada produo de clulas com menor potencial de
produo de citocinas, de resposta a quimiocinas, menor desenvolvimento de clulas de memria e,
consequentemente, deficincia de uma resposta secundria. Esses achados so claramente
evidenciados em infeces virais crnicas, como na infeco pelo HIV. Nesse caso, devido
depleo marcante dos linfcitos TCD4+, as clulas TCD8+ esto expostas estimulao antignica
constante, na ausncia ou ineficincia do estmulo de clulas T helper, o que tem sido associado
alterao funcional das clulas TCD8+, levando-as a um processo de inativao funcional e exausto.
A importncia do papel das clulas Th na funcionalidade dos CTL pode ser evidenciada, ainda, em
modelos de vacinao, nos quais tem sido possvel observar que a induo de uma resposta
citotxica tima ao antgeno vacinal e, consequentemente, ao desafio com o vrus selvagem, depende
de clulas TCD4+.
A resposta mediada por clulas TCD4+ essencial tambm para a modulao da produo de
anticorpos. Embora os linfcitos B possam ser estimulados de maneira T-independente, isso apenas
produz a secreo de IgM de baixa afinidade. A resposta T-dependente (ou seja, quando o linfcito

B, alm do reconhecimento do antgeno especfico pelo BCR, interage com clulas TCD4+ ativadas)
provoca mudana de classe de Ig em um processo chamado de maturao da afinidade. Tal processo
est relacionado com a induo de sinais na clula B e com a seleo de clones de linfcitos B
capazes de secretar anticorpos com maior afinidade/avidez pelo antgeno especfico.
O desenvolvimento de memria imunolgica, tanto de linfcitos TCD8+ quanto de clulas B,
tambm parece depender da ativao de clulas TCD4+, como demonstrado em uma variedade de
modelos de infeces virais.
As clulas TCD4+ apresentam, ainda, atividade citotxica, uma vez que, assim como os linfcitos
TCD8+, expressam FasL em sua superfcie, podendo induzir o sinal de morte celular em clulas
infectadas expressando Fas (Figura 7.6).

Mecanismos de agresso tecidual mediados pela resposta imunolgica celular


A ativao dos linfcitos T provoca um quadro de inflamao que pode levar a danos teciduais
ou sistmicos. Um dos exemplos mais bem conhecidos dos efeitos deletrios da resposta imunolgica
celular o desenvolvimento de cirrose e carcinoma hepatocelular nas infeces crnicas por HBV,
que parece ser mediado pela resposta citotxica dos linfcitos T CD8+. O infiltrado de clulas
TCD8+ tambm est associado patologia pulmonar observada aps infeco com vrus da influenza.
A atividade citotxica mediada pelos linfcitos TCD8+ tambm um dos mecanismos de
imunodeficincia observados na infeco pelo HIV. O HIV, infecta, principalmente clulas TCD4+;
dessa maneira, o reconhecimento e a destruio das clulas infectadas afetam diretamente o sistema
imunolgico do hospedeiro.
Na infeco pelo DENV, tambm existem evidncias de que a ativao de clulas TCD4+ e
TCD8+ mais potente em pacientes com as manifestaes graves da doena. Nas infeces
secundrias por esse vrus, acredita-se que ocorra um fenmeno chamado pecado antignico
original, no qual se tem ativao de clulas de memria com maior afinidade por outros sorotipos
virais que no o da infeco corrente. Essas clulas tm um fentipo ativado e entram em apoptose;
alm disso, apresentam um padro de degranulao deficiente, porm com liberao eficiente de
citocinas como IFN- e TNF-, que podem atuar diretamente nas clulas endoteliais, contribuindo
para o extravasamento de plasma e para a patognese da dengue hemorrgica.
A produo exacerbada de citocinas pr-inflamatrias, tanto por linfcitos T quanto por clulas
da imunidade inata, pode estar associada leso tecidual e gravidade de diversas infeces virais.
Nas infeces causadas pelo vrus da influenza associado pandemia de 1918 (gripe espanhola) e
pela estirpe H5N1, foi observada maior produo de citocinas e quimiocinas, tais como IL-6, TNF, IFN-, IL-10 e MCP-1, em comparao com os nveis observados em infeces mais brandas por
outros subtipos antignicos. O nvel mais alto dessas citocinas tambm foi relacionado com maior
probabilidade de letalidade da infeco.

Em geral, muitas citocinas como IL-6, IL-1 e IFN- so necessrias para o controle da replicao
viral, mas tambm esto associadas patologia. Esse fato pode ser evidenciado em modelos
experimentais, em que a deficincia na produo dessas citocinas ou na expresso de seus receptores
especficos est associada inflamao mais branda e a menor leso tecidual; no entanto, se
correlaciona tambm ao retardo no controle da replicao viral.

Figura 7.6 Mecanismos efetores de resposta imunolgica celular no controle da infeco viral. (1) Clulas infectadas
apresentam antgenos virais, via MHC I, para linfcitos TCD8+. As clulas TCD8+ estimuladas secretam grnulos citolticos
que induzem a apoptose da clula-alvo e a destruio dos vrus intracelulares. (2) Essas clulas podem expressar FasL,
que interage com Fas na clula-alvo, tambm induzindo a morte celular. (3) Os linfcitos TCD8+ ativados secretam
citocinas, estimulando a ativao das APC, com aumento da expresso de molculas coestimulatrias e produo de
citocinas. (4) Antgenos virais podem ser apresentados por APC, via MHC II, estimulando clulas TCD4+. A ativao de
clulas TCD4+ induz a secreo de citocinas que podem: (4a) estimular as APC, induzindo aumento da expresso de
molculas coestimulatrias, produo de NO e de citocinas pr-inflamatrias (algumas citocinas secretadas pelas APC
so induzidas pelo prprio patgeno); (4b) potencializar a ativao de linfcitos TCD8+ citotxicos. (5) Clulas TCD4+
ativadas podem tambm expressar FasL, induzindo apoptose da clula infectada, expressando Fas. (6) Linfcitos B
reconhecem e internalizam os vrus via BCR e apresentam peptdeos virais para clulas TCD4+. Essas ltimas so

ativadas e passam a expressar molculas estimulatrias (p. ex., CD40L) e a produzir citocinas que auxiliam na ativao
das clulas B e na secreo de anticorpos para neutralizao viral.

Mecanismos de escape do sistema imunolgico


Alguns vrus induzem uma infeco aguda e so transmitidos de maneira eficiente para outro
hospedeiro; outros persistem no hospedeiro em equilbrio com o sistema imunolgico. Para isso, os
diversos agentes virais apresentam diferentes mecanismos de escape contra a resposta imunolgica.

Modulao das vias de sinalizao intracelular induzidas por IFN e receptores da


imunidade inata
A inibio da produo de IFN ou da sinalizao induzida pelo mesmo parece ser um efeito
comum a vrios agentes virais. Em alguns casos, os mecanismos no esto caracterizados, mas a
inibio da sinalizao induzida por PRR ou pelos prprios receptores de IFN (IFNR) tem sido
largamente demonstrada e pode estar associada a diferentes protenas virais. A clivagem ou a
inativao de molculas adaptadoras envolvidas na ativao por PRR j foram associadas
expresso de protenas no estruturais de diferentes vrus. Por exemplo, a protease NS3A/4 do HCV
cliva e inativa TRIF, inibindo a sinalizao via TLR3. J a protena A46R do vrus vaccnia, que
apresenta stios de similaridade com domnios TIR, parece ser capaz de se ligar a TRIF e tambm
interferir na sinalizao mediada por TLR, por impedir a ativao de IRF3 e NF--B. A protena
NS3 de DENV se associa a MAVS em determinados tipos celulares, inibindo o sinal mediado por
RIG-I/MDA-5.
Outras estratgias de escape j descritas esto associadas inibio dos sinais mediados por
IFN. Protenas no estruturais de diferentes flavivrus e vrus respiratrios, por exemplo, j foram
associadas reduo da expresso de genes dependentes de IFN por bloquear a fosforilao,
aumentar a degradao ou inibir a expresso de componentes essenciais da transduo de sinal,
pertencentes via Jak/STAT. J foi sugerido que a modulao da resposta aos IFN um elemento
importante para o desenvolvimento de doenas mais graves causadas por flavivrus.
Diferentes vias de sinalizao celular mediada por INF, por ativao de receptores da imunidade
inata, ou por receptores de reconhecimento de antgeno de clulas T e B (TCR e BCR) convergem na
ativao de NF--B, e diversos vrus desenvolveram estratgias para subverter esse sinal. A protena
no estrutural 1 (NS1) do vrus da influenza, por exemplo, interfere na sinalizao de IRF3 e NF-B, inibindo a produo de IFN. J os poxvrus produzem protenas que inibem a degradao de IKK,
impedindo a translocao e a ativao de NF--B. Estratgias semelhantes de inibio da
translocao de NF--B por protenas virais tambm j foram relatadas nas infeces por rotavrus,
WNV e HIV.

Alguns vrus apresentam mecanismos de escape dos inflamassomas; o vrus do mixoma produz
uma protena que inibe a ativao de inflamassomas. Protena V de vrus do sarampo interage com
NLRP3, inibindo a produo de IL-1- mediada pelo inflamassoma.

Sequestro de antgenos
Uma vez que o reconhecimento de assinaturas moleculares ou eptopos especficos o pontochave da resposta imunolgica, uma das estratgias para inibi-la ocultar essas estruturas. O
sequestro de antgenos ocorre, por exemplo, quando os vrus infectam clulas no permissivas ou
semipermissivas e se mantm em estado de latncia. Em geral, a latncia est associada a uma baixa
taxa de transcrio e, consequentemente, de sntese e expresso de protenas virais. Com isso, os
vrus mantm sua informao gentica, mas escapam do reconhecimento pelo sistema imunolgico,
at que ocorra algum evento que converta o estado de latncia em um estado de replicao viral
ativa. Diferentes vrus so capazes de permanecer nesse estado de replicao no permissiva ou
semipermissiva, como o caso dos HSV, vrus da varicela-zoster (VZV), EBV e at mesmo o HIV.
Alguns desses vrus, como o HSV, mesmo nas fases iniciais do processo de reativao, so
primariamente transmitidos clula a clula, com pouca liberao de partculas virais no meio
extracelular, inibindo, assim, a exposio de eptopos e o acesso de anticorpos para neutralizar a
partcula.
Outro modo de sequestro de antgenos virais ocorre quando os vrus so mantidos em stios
imunoprivilegiados como o crebro. Esse tecido protegido pela barreira hematoenceflica, a qual
limita a presena de componentes do sistema perifrico. Alm disso, as clulas nervosas tm uma
baixa capacidade de apresentao de antgenos, dificultando a ativao de uma resposta imunolgica
especfica nesses stios.

Mutaes de eptopos
A mutao de eptopos T e B tem sido associada resistncia ou cronicidade de diferentes
infeces virais. Esse dado est de acordo com relatos de que a amplitude/diversidade da resposta
celular pode indicar melhor prognstico da infeco. Isso possibilitaria a manuteno da resposta
mesmo que um eptopo imunodominante fosse alterado; alm disso, uma resposta ampla j no incio
da infeco diminuiria o impacto da presso seletiva sobre um nmero restrito de eptopos. A
induo de uma resposta mais ampla, contra maior nmero de eptopos especficos, j foi associada
a um melhor prognstico em infeces pelo HIV e HCV. Na verdade, a existncia de sorotipos ou
subtipos de vrus da mesma espcie, por si s, j pode ser considerada um mecanismo de escape do
reconhecimento viral. Embora diferentes sorotipos compartilhem muitos antgenos, os eptopos
neutralizantes no costumam ser comuns.

Os vrus que apresentam genoma segmentado, como o caso do vrus da influenza e do rotavrus,
podem sofrer alteraes antignicas mais drsticas, devido ao rearranjo entre segmentos de
diferentes sorotipos virais, aumentando ainda mais a possibilidade de escape da resposta
imunolgica. Os rearranjos dos segmentos de vrus da influenza (antigenic shift), produzindo novos
sorotipos virais, tm sido associados s grandes pandemias de influenza com maiores ndices de
mortalidade.

Inibio de apoptose
Como discutido anteriormente, a induo de apoptose uma das estratgias disparadas por
linfcitos TCD8+ citotxicos e clulas NK para a eliminao de clulas infectadas por vrus. No
entanto, para o vrus, importante retardar a morte celular at que a prognie viral tenha sido gerada.
Alguns vrus produzem protenas que modulam a atividade de componentes celulares envolvidos no
controle da apoptose, tal como a Bcl-2 uma protena celular que inibe a apoptose. Protenas virais
podem aumentar a produo de Bcl-2 ou bloquear sua destruio natural. A p53, por sua vez,
codificada por um antioncogene pr-apopttico que pode ser bloqueado por protenas virais.

Infeco e modulao da ativao de clulas do sistema imunolgico


Alguns vrus apresentam tropismo por clulas do prprio SI, o que, por si s, j representa um
mecanismo de escape do hospedeiro. Alm disso, muitas vezes, esses vrus utilizam fatores de
transcrio envolvidos com a ativao dessas clulas para sua prpria replicao; podem, ainda,
produzir protenas que so anlogas a protenas celulares envolvidas na ativao celular,
mimetizando sua funo efetora e modulando a ativao das clulas infectadas.
Um dos principais exemplos de vrus que infectam clulas do SI o HIV, que apresenta tropismo
por clulas que expressam o receptor CD4, especialmente os linfcitos TCD4+ auxiliares, mas
tambm clulas apresentadoras de antgenos como macrfagos e clulas dendrticas. Assim, a
infeco pelo HIV resulta em uma imunodeficincia que, conforme a infeco progride, o hospedeiro
se torna incapaz de controlar a replicao de qualquer patgeno, incluindo o prprio HIV, o qual
tambm utiliza a maquinaria de ativao celular para controle de sua prpria replicao. Dentre
outros elementos, esse vrus apresenta stios de ligao de NF--B em seu genoma, envolvidos na
ativao de sua transcrio. Desse modo, a ativao linfocitria com ativao desse fator de
transcrio acaba contribuindo para a replicao viral.
O vrus linfotrpico para clulas T de humanos (HTLV) outro retrovrus que tem tropismo por
linfcitos T, e a infeco por esse vrus est associada leucemia linfoma de clulas T do adulto
(LLcLA), alm da paraparesia espstica tropical ou mielopatia associada ao HTLV-1. A protena Tax
do HTLV a principal responsvel pela transformao das clulas leucmicas, e um de seus efeitos

est associado interao com fatores de transcrio celulares como NF--B. A atividade
oncognica dessa protena primariamente resultado de seu efeito sobre a via de NF--B, resultando
em uma ativao persistente desse fator. Dentre outras funes, a ativao de NF--B torna possvel
o crescimento dos linfcitos T de maneira independente de IL-2. Inicialmente, a ativao est
envolvida em um aumento da expresso de IL-2 e IL-2R, que tero efeito autcrino, o qual seguido
de crescimento sem depender dessa citocina. Pacientes com LLcLA so imunocomprometidos e
apresentam infeces oportunistas com frequncia, causadas por diferentes patgenos.
Outro exemplo de vrus que infectam clulas do SI o EBV, que apresenta tropismo por clulas
epiteliais, mas tambm por linfcitos B, sendo capaz de induzir a formao de tumores e linfomas B.
O EBV, assim como outros vrus da subfamlia Gamaherpesvirinae, incluindo HHV-8, tambm
apresenta stios de ligao de NF--B em seus promotores. A infeco latente por esses vrus resulta
em uma ativao persistente de NF--B, a qual est envolvida na capacidade de tais vrus em induzir
transformao celular. O EBV apresenta tambm uma protena denominada LMP-1, que funciona
como um receptor de CD40 ativado, promovendo sobrevivncia, proliferao e expresso de
marcadores de ativao por linfcitos B infectados. Essa protena tambm ativa NF--B, o que
essencial para a sobrevivncia dessas clulas.

Produo de imunomoduladores virais


Os prprios vrus so capazes de produzir e induzir a secreo de protenas que funcionam como
imunomoduladores. A literatura bastante vasta com relao descrio de imunomoduladores
virais que so secretados por clulas infectadas e incluem inibidores do sistema complemento,
reguladores de cascata de coagulao, molculas de adeso e homlogos de citocinas e de seus
respectivos receptores.
Vrus associados a infeces persistentes interrompem a sntese normal de citocinas e
quimiocinas e/ou a expresso de seus receptores, inibindo sua funo. Alm disso, alguns vrus
codificam homlogos de citocinas, tambm chamadas virocinas, as quais se ligam ou substituem as
citocinas do hospedeiro, tornando-as inativas ou no funcionais. Os herpesvrus e os poxvrus
codificam uma srie de protenas homlogas a receptores de quimiocinas e protenas capazes de se
ligar a uma variedade de citocinas, incluindo TNF, IL-1, IFN-/, IFN-, CC quimiocinas, IL-18,
GM-CSF e IL-2. O efeito de todas essas protenas no conhecido algumas podem bloquear a
ligao das citocinas com seus receptores celulares; outras funcionam como ligantes independentes,
capazes de induzir sinalizao intracelular, levando a uma ativao constitutiva dessas vias. Esses
imunomoduladores tambm podem interferir com a sinalizao mediada pelas citocinas, inibindo
cinases e podendo modular positiva ou negativamente a expresso de receptores e correceptores
celulares.

Modulao no processamento e na apresentao de antgenos


Um dos mecanismos mais bem conhecidos de evaso da resposta imunolgica a inibio do
processamento e/ou da apresentao de antgenos aos linfcitos T. Essa modulao pode ocorrer em
todas as etapas do processamento, mediada por diferentes protenas virais e resulta na diminuio
da expresso de complexo peptdeo viral-MHC na superfcie da clula infectada.
possvel inibir a fragmentao de antgenos pelo proteossoma, assim como seu transporte para
o retculo endoplasmtico (RE); por exemplo, algumas protenas virais so resistentes
fragmentao pelo proteossoma, como o caso da protena EBNA1 de EBV. Outras, como a ICP47
de HSV e US6 de HCMV, se ligam s protenas transportadoras TAP ou ao prprio MHC, inibindo a
translocao de peptdeos e sua associao ao MHC. A associao dos peptdeos produzidos pelo
processamento com molculas de MHC e/ou o trfego dos complexos peptdeo-MHC podem ser
impedidos pelo bloqueio da sntese de molculas de MHC, pela manuteno de molculas de MHC
no RE ou pelo redirecionamento dessas molculas (ou do complexo) do RE para o citosol,
provocando sua protelise e degradao. O redirecionamento do complexo peptdeo-MHC da
superfcie celular para lisossomas j foi descrito e tambm resulta na degradao do complexo e
inibio da apresentao de antgenos.
Por outro lado, muito pouco se conhece sobre o efeito de protenas virais sobre a apresentao
de antgenos via MHC II. No entanto, j se sabe que essa apresentao pode ocorrer no apenas aps
processamento de protenas ditas exgenas nos lisossomas, mas tambm aps o processamento de
antgenos virais por uma via dependente de proteossomas (apresentao cruzada). Desse modo,
possvel que os efeitos ou resistncia de protenas virais fragmentao pelos proteossomas tambm
influenciem a apresentao de antgenos via molculas de MHC II. Outro mecanismo associado
apresentao de antgenos via MHC II a autofagia, que pode ser desencadeada por situaes de
estresse celular e est associada formao de vesculas celulares e ao englobamento de contedo
citoplasmtico por essas vesculas. Essas vesculas se fundem aos lisossomas, levando degradao
dos componentes presentes. Diferentes vrus modulam a produo dos autofagossomas e o processo
de autofagia, o que poderia tambm influenciar a apresentao de antgenos gerados nos lisossomas.
Outro mecanismo de apresentao de antgenos ocorre pela apresentao de estruturas lipdicas
por molculas CD1, reconhecidas por subtipos especficos de linfcitos T, e esse mecanismo tambm
inibido por alguns patgenos virais.
Alm do reconhecimento do complexo peptdeo-MHC pelo receptor de antgenos (TCR)
expresso nas clulas T, o processo de apresentao de antgenos e ativao de linfcitos T depende
da expresso dos receptores CD4 e CD8 pelos linfcitos T e da interao entre molculas
coestimulatrias presentes na superfcie das APC, com seus ligantes na clula T. Essas etapas
tambm so inibidas por alguns vrus que inibem a expresso de molculas coestimulatrias pelas
APC ou inibem a expresso de CD4 ou CD8 pelas clulas T.

Evaso da citotoxicidade mediada por clulas NK


Como j discutido, a diminuio da expresso de molculas de MHC I pelas clulas infectadas
um dos mecanismos de escape de clulas citotxicas desenvolvido por vrios vrus, inibindo seu
reconhecimento por linfcitos TCD8+. Por outro lado, esse mecanismo torna essas clulas mais
suscetveis ao de clulas NK. Alguns vrus desenvolveram mecanismos para escapar de ambos
os tipos celulares. O HCMV produz uma protena que funciona como um anlogo de MHC I, no
capaz de apresentar antgeno e no induz ativao de clulas TCD8+; contudo, a protena
reconhecida pelo receptor inibitrio expresso nas clulas NK, CD94, induzindo sinal negativo e
impedindo sua atividade citotxica. Outros vrus codificam protenas que funcionam como
antagonistas dos receptores de ativao de clulas NK ou inibem a expresso dos ligantes dos
receptores de ativao de clulas NK nas clulas infectadas, como ocorre com algumas estirpes de
HCMV.

Evaso de anticorpos e complemento


Os vrus so capazes de subverter a atividade de anticorpos e complemento por mecanismos
altamente diversos e complexos. As estratgias de evaso da resposta mediada por anticorpos esto
associadas principalmente aos mecanismos j discutidos de sequestro de antgenos, mutao de
eptopos especficos e/ou recombinao, alm da existncia de diferentes sorotipos dentro de uma
mesma espcie viral.
Com relao ao escape do sistema complemento, sabe-se que essa cascata finamente controlada
por protenas inibitrias do hospedeiro, e os vrus so capazes de sequestrar algumas dessas
protenas ou de codificar protenas homlogas a esses inibidores. Vrus como HIV, HTLV-1 e vrus
vaccnia incorporam esses inibidores em seu envelope durante o processo de replicao. J o HSV
produz uma protena chamada gC, que se liga ao componente C3b do complemento e bloqueia sua
capacidade de neutralizao. A importncia desse mecanismo de escape pode ser evidenciada pelo
fato de que vrus mutantes, que no expressam essa protena, apresentam carter atenuado em
modelos de infeco animal. Da mesma famlia, o HHV-8 codifica uma protena de controle do
complemento KCP, que homloga aos reguladores de complemento humanos e atua como cofator
para o fator I inibitrio (associado inativao de C3b e C4b), responsvel por acelerar a
decomposio ou inibir a formao das C3 convertases. Vale lembrar que esta formao uma etapachave da cascata de complemento, associada liberao de anafilatoxinas, opsonizao do
patgeno e ao incio da formao do complexo ltico terminal (MAC). A deleo desse gene em um
KSHV de murino inibiu de modo significativo o estabelecimento da infeco aguda e a capacidade
de manuteno de uma infeco persistente pelo vrus nesse modelo animal. O vrus vaccnia tambm
codifica uma protena de controle do complemento (VCP), estruturalmente similar a C4b-BP, e que

atua bloqueando a via clssica e alternativa dessa cascata (Figura 7.7).

Vacinas antivirais
Muitas vezes, a resposta imunolgica do hospedeiro ao agente infeccioso no bem-sucedida,
sendo incapaz de eliminar a infeco. A no eliminao do patgeno resulta no comprometimento do
indivduo e no desenvolvimento de doenas graves e at letais. Assim, durante sculos, tm sido
estudadas maneiras de reforar a defesa do organismo contra patgenos. Poucas descobertas
mdicas tiveram tanto impacto na histria humana como o desenvolvimento das vacinas. A utilizao
de imungenos vacinais alterou profundamente as relaes entre seres humanos e muitas doenas
infecciosas consideradas cones para a humanidade, tais como a poliomielite, o sarampo, a varola, a
febre amarela e outras. Um dos fatores associados ao enorme impacto clnico das vacinas que
poucas aes de sade pblica apresentam um balano da razo custo-benefcio to favorvel como
a vacinao de uma populao. Adicionalmente, a vacinao produz um efeito amplificador de
controle, uma vez que, quando realizada em um percentual significativo de uma dada populao,
acaba por reduzir a circulao do patgeno, devido diminuio do nmero de indivduos
suscetveis e reduo da quantidade de hospedeiros disponveis para a multiplicao do agente
infeccioso.

Histrico
Antes mesmo do conhecimento dos microrganismos ou vrus e de seu papel como agentes
causadores de doenas infecciosas, a observao de que um indivduo exposto a determinadas
doenas no adoecia novamente levantou a hiptese de que a inoculao de um patgeno atenuado
em um indivduo poderia proteg-lo de uma infeco mais grave. Nos anos finais do sculo XVIII, o
mdico e naturalista ingls, Jenner, observou que ordenhadores de vacas pareciam ser imunes
varola. Devido ao contato com vacas que apresentavam cowpox, uma forma de varola bovina mais
branda, esses indivduos adquiriam uma doena localizada, com a formao de pstulas nas mos.
Jenner postulou, ento, que o material proveniente das vacas estaria protegendo os ordenhadores da
infeco pelo agente causador da varola. Para testar sua hiptese, ele inoculou fluido coletado da
pstula da mo de uma ordenhadora em ambos os braos de um garoto de 8 anos e o exps a material
proveniente de pacientes infectados com varola humana. Feito isso, nenhuma doena se manifestou,
o que levou Jenner a publicar o primeiro tratado de vacinao em 1798. Embora Jenner tenha
desenvolvido uma maneira de proteo contra a infeco, ele no conhecia o agente etiolgico, o
modo de transmisso e os mecanismos fisiolgicos da doena. Em 1980, quase 200 anos depois da
publicao do tratado de Jenner, a Organizao Mundial da Sade (OMS) decretou a erradicao
global da varola aps uma intensa campanha de vacinao mundial. Interessante o fato de que a

vacina utilizada na campanha no tinha em sua composio o agente causador da varola bovina
(vrus cowpox), como originalmente proposto por Jenner, mas havia um vrus denominado vaccinia
virus, o qual filogeneticamente relacionado com o cowpox virus e com o agente causador da
varola humana. Ainda hoje, no esto elucidadas as circunstncias que levaram a substituio do
vrus cowpox pelo vrus vaccnia, como agente vacinal.
Durante muitos anos, o desenvolvimento de outras vacinas permaneceu relativamente estagnado e
foi somente aps o conhecimento da teoria microbiana das doenas, descrita por Pasteur na segunda
metade do sculo XIX, que a ideia de usar microrganismos atenuados para imunizao voltou a
ganhar fora. O grupo coordenado por Pasteur foi responsvel por diversos testes pioneiros de
desenvolvimento de vacinas, e a primeira vacina de uso humano desenvolvida pelo grupo foi a
antirrbica. Embora desconhecessem a origem viral da doena, os pesquisadores utilizaram
passagens seriadas de amostras de sangue proveniente de ces raivosos no sistema nervoso de
coelhos. Em 1885, Pasteur injetou material proveniente da medula de coelho infectado em uma
criana mordida por um co. A criana no desenvolveu a doena e foi descoberto, ento, um
imunizante contra a raiva, o qual foi denominado vacina. Com o estudo da imunologia e o
conhecimento dos agentes infecciosos, tornou-se possvel o desenvolvimento de vacinas a partir das
caractersticas dos patgenos e da doena causada por eles.

Figura 7.7 Mecanismos de escape viral. (1) Estado de latncia viral o vrus capaz de se manter dentro da clula
hospedeira com baixa taxa transcricional, limitando, assim, a sntese e a expresso de protenas virais. (2) Os vrus sofrem
mutaes alterando eptopos imunognicos e, dessa maneira, escapam do reconhecimento por clulas do sistema
imunolgico. (3) Alguns vrus so capazes de inibir a apoptose celular por meio do aumento da expresso de Bcl (protena
antiapopttica) ou bloqueando a produo da protena p53 (pr-apopttica). (4) Protenas produzidas por vrus, como a Tax
(HTLV) e a LMP-1 (EBV), podem ter funo anloga a protenas celulares, levando ativao de fatores de transcrio
como NF--B. Esses fatores podem atuar modulando a ativao da clula hospedeira (4a) ou a transcrio do genoma viral
(4b). (5) Alguns vrus codificam protenas anlogas de citocinas, denominadas virocinas, que so capazes de se ligar a
receptores de citocinas celulares e inibir a transduo de sinal; consequentemente, inibindo vias de ativao celular. (6 a
10) Os vrus podem tambm interferir no processamento e na apresentao de antgenos. (6) Algumas protenas virais so
resistentes degradao pelo proteossoma; (7) outras protenas impedem a ligao dos peptdeos produzidos no
proteossoma molcula de MHC (8) ou impedem que o complexo MCH-antgeno seja levado at a membrana,
impossibilitando que o antgeno seja apresentado para as clulas T. (9) Outra estratgia utilizada pelos vrus para impedir a
apresentao de antgeno por meio do redirecionamento do complexo MCH-antgeno para vesculas lisossomais e
posterior destruio. Algumas dessas estratgias levam diminuio da expresso de molculas de MHC I, o que
possibilita o escape dos linfcitos TCD8+, mas torna essas clulas mais suscetveis ao reconhecimento de clulas NK.
(10) Para escapar desse reconhecimento por clulas NK, alguns vrus produzem protenas anlogas ao MHC I, as quais
no so capazes de apresentar antgenos, mas so reconhecidas pelo receptor inibitrio de NK, produzindo um sinal
negativo e inibindo a ao citotxica dessas clulas.

Algumas exigncias devem ser cumpridas para que a produo de vacinas tenha xito.
necessrio que sejam seguras, sendo inaceitvel qualquer nvel de toxicidade, e devem proporcionar
proteo maior parte das pessoas que a receberem. Devido dificuldade de aplicar doses de
reforo a grandes populaes, recomendada a fabricao de vacinas que ofeream proteo
imunolgica duradoura. Alm disso, importante que as vacinas tenham baixo custo, para serem
administradas ao maior nmero de indivduos possvel.
Programas efetivos de vacinao, associados baixa variabilidade de um determinado agente
viral e ausncia de diferentes reservatrios, so capazes de erradicar a doena, mesmo que nem
todos os indivduos sejam contemplados. O aumento de pessoas imunizadas leva diminuio de
reservatrios naturais, reduzindo ou at eliminando a incidncia do patgeno na populao.
possvel citar como exemplo a erradicao da varola no mundo, em 1980, e a eliminao do
poliovrus nas Amricas, em 1994.
A maioria das vacinas tem sido desenvolvida com o intuito de induzir uma resposta imunolgica
protetora por meio da produo de clulas efetoras de longa vida e de memria. Tais vacinas so
denominadas ativas. No entanto, um nmero bem menor de vacinas funciona de maneira passiva, pela
transferncia de anticorpos ou clulas especficas. Nesta seo, sero abordadas as diferentes
estratgias de vacinao existentes e seus mecanismos de ao.

Imunizao passiva
A vacinao passiva tem curta durao, pois o hospedeiro no desenvolve uma resposta ao
patgeno. Nesse caso, a imunidade protetora dura apenas pelo perodo de meia-vida dos
anticorpos/clulas injetados. Em geral, a imunizao passiva indicada em casos de doenas
potencialmente fatais induzidas geralmente por toxinas ou em acidentes graves, quando uma
interveno rpida essencial para o controle da infeco. Esse tipo de vacinao consiste na
administrao de imunoglobulinas (Ig) especficas contra o patgeno, na forma recombinante ou
previamente produzida em hospedeiros heterlogos (soros).
A imunizao passiva utilizada na terapia ps-exposio contra diferentes vrus. A mais
comumente utilizada o soro antirrbico, produzido em equinos e indicado aps mordida por
animais infectados com vrus da raiva ou com suspeita. Essa interveno importante porque, uma
vez que o vrus se dissemine para o sistema nervoso, no h mais como controlar a infeco, que
letal. Desse modo, a administrao do soro, juntamente com outras medidas preventivas de
higienizao do local do ferimento, tem o objetivo de neutralizar o vrus na porta de entrada,
contribuindo para o controle da infeco, induzido pela vacinao ativa. A utilizao de Ig passiva
tambm pode ser indicada aps exposio aos vrus do sarampo, HAV, HBV e VZV e indicada,
particularmente, em indivduos que no foram previamente imunizados e que apresentam risco de
desenvolvimento de doenas graves, como os pacientes imunocomprometidos.

Vacinas de vrus atenuados


Os vrus atenuados so tradicionalmente produzidos por meio de vrias passagens em um sistema
hospedeiro, que resulta no acmulo de mutaes as quais tornam o vrus menos patognico clula
humana, mas so capazes de induzir resposta imunolgica eficiente. A atenuao deliberada por
passagens sucessivas em culturas de clulas ou ovos embrionados vem sendo utilizada h muitos
anos e possibilitou o desenvolvimento de uma srie de vacinas antivirais, como a da poliomielite,
febre amarela, sarampo, caxumba e rubola (as trs ltimas podem ser administradas isoladamente
ou na forma de trplice viral MMR). Com maior conhecimento dos mecanismos de replicao e
patognese dos vrus, tem sido possvel desenvolver novas estratgias para a sua atenuao, alm do
desenvolvimento de outras vacinas.
Como exemplo, necessrio que a vacina contra o vrus da influenza seja: abrangente contra os
diferentes subtipos virais; incapaz de induzir complicaes graves (como a pneumonia); e
preferencialmente capaz de induzir imunidade de mucosa, como na infeco natural. Uma das vacinas
utilizadas na preveno da infeco pelo vrus da influenza composta de vrus atenuados que foram
selecionados pela sensibilidade temperatura. Dessa maneira, os vrus so capazes de se replicar no
sistema respiratrio superior (no qual a temperatura mais baixa), mas no no sistema respiratrio
inferior (pulmes, em que a temperatura mais elevada, em torno de 37C). Alm disso, uma
vacina trivalente, constituda por trs subtipos do vrus. A deciso de modificar a composio da
vacina anualmente realizada com base no conhecimento de que esses vrus so capazes de fazer
rearranjo de seus segmentos genmicos por um mecanismo conhecido como shift antignico
(discutido no Captulo 14, Viroses Respiratrias). No entanto, em linhas gerais, possibilita o
surgimento de novos vrus contendo antgenos de outros subtipos de vrus da influenza. Outro ponto
importante que essa vacina administrada pela via intranasal, mimetizando a infeco natural por
esse vrus e produzindo, assim, uma resposta imunolgica de mucosa (esta vacina ainda no est
disponvel no Brasil).
O rotavrus outro vrus de genoma segmentado, contra o qual vacinas preparadas com vrus
atenuados vm sendo desenvolvidas a partir de rearranjos gnicos. A rotavirose caracterizada por
gastroenterites com eventos de vmito, diarreia e febre, podendo evoluir ao bito em muitos casos.
Com o intuito de desenvolver imunidade de mucosa, via produo de IgA, vrios estudos tm sido
feitos utilizando vrus atenuados, que so administrados por administrao oral.
A primeira vacina desenvolvida contra rotavrus (RotaShield) foi construda utilizando um
rearranjo de vrus que infectam smios e seres humanos e constituda de quatro vrus atenuados. Ela
foi licenciada nos EUA, em 1998, mas foi retirada do mercado 9 meses depois, por estar associada
ao aumento da intussuscepo intestinal. Em 2000, foi desenvolvida uma nova vacina preparada com
vrus atenuados monovalente (Rotarix), utilizando a estirpe viral RIX4414, sorotipo G1[P8]
proveniente de vrus isolado de uma criana com diarria. Embora essa vacina tenha se mostrado

bastante eficiente contra a diarreia, ela pouco abrangente. Outra vacina, preparada com vrus
atenuados e tetravalente (RotaTeq), utiliza rearranjo de vrus isolados de seres humanos e de
bovinos e tem apresentado elevada proteo contra manifestaes graves de diarreia. Em julho de
2005, foi licenciada no Brasil a vacina de rotavrus de seres humanos (VORH Rotarix), foi
includa no calendrio de vacinao infantil em maro de 2006. A vacina indicada para crianas de
2 a 12 meses de vida, sendo aplicada em 2 doses por via oral.
Em geral, as vacinas produzidas com vrus atenuados so muito potentes, pois so capazes de
estimular diferentes componentes do sistema imunolgico. O fato de o vrus atenuado manter sua
capacidade replicativa provoca no apenas a produo de anticorpos, mas tambm possibilita o
processamento e a apresentao de protenas virais via MHC I, e ativao de linfcitos TCD8+.
Alm disso, a vacinao com vrus atenuado est associada ativao de clulas TCD4+ e ao
desenvolvimento de clulas de memria.
A limitao dessa estratgia de vacinao dada pela possibilidade de o vrus sofrer mutaes
que possam reverter o estgio no patognico para um estgio patognico. Essa reverso pode levar
ao desenvolvimento da doena e possibilita a transmisso do vrus de indivduos vacinados para
indivduos que no tiveram contato com o vrus. Alm disso, vacinas atenuadas de vrus capazes de
ser transmitidos verticalmente tambm no so recomendadas a gestantes, uma vez que ainda mantm
sua capacidade replicativa.
A utilizao da tcnica de DNA recombinante para atenuar vrus uma estratgia adotada para
superar a limitao das tcnicas anteriores. Genes virais especficos so isolados, submetidos
mutao e inseridos em um genoma viral reconstitudo. A mutao realizada por engenharia gentica
torna impossvel a reverso ao tipo selvagem.

Vacinas de vrus inativados


Os vrus inativados perdem a capacidade de se replicar devido a alteraes irreversveis, as
quais podem ser provocadas por calor, alterao do pH, radiao ou agentes qumicos. Essas vacinas
no tm o fator limitante de reverso ao tipo selvagem; no entanto, a resposta imunolgica produzida
por esse tipo de vacinao, em geral, menos potente, com pouca ou nenhuma ativao de linfcitos
TCD8+.
A estratgia de vacinao com vrus inativado tem sido adotada durante anos contra o vrus da
influenza. A vacina trivalente constituda por duas linhagens de vrus do tipo A e uma linhagem de
vrus do tipo B, que so propagados em ovos embrionados, purificados e inativados com
formaldedo ou com betapropiolactona. Essa combinao permite maior abrangncia na proteo
contra doena devido grande variedade de gentipos do vrus. Alm disso, como o vrus da
influenza tem capacidade mutagnica alta, as estirpes circulantes so revisadas anualmente pela OMS
e inseridas na vacina (o mesmo acontece com a vacina de vrus atenuados trivalente para influenza).

Diferentemente da vacina atenuada, a inativada administrada por via intramuscular e, embora


desenvolva uma resposta local e sistmica, no h produo de anticorpos de mucosa.
Vacinas contra a hepatite A, poliomielite (Salk) e raiva tambm se baseiam nessa estratgia de
inativao viral. Devido ao risco da administrao de vacinas preparadas com vrus atenuados para
a infeco pelo HIV, estudos tm sido realizados no sentido de empregar vacinas preparadas com
vrus inativados. No entanto, a proteo conferida doena no satisfatria, em virtude da grande
variabilidade gentica do HIV e da ausncia de induo de clulas TCD8+.

Vacinas de subunidades/vacinas recombinantes


A dificuldade em inativar alguns vrus (HIV e HSV), a baixa proteo proporcionada por
algumas vacinas preparadas com vrus atenuados (HBV) e a limitao de cultivo de alguns vrus
(HPV) estimularam a busca de novas estratgias para a produo de vacinas. As vacinas de
subunidades so compostas por antgenos purificados de vrus patognicos ou so formadas por
eptopos imunognicos, que so sintetizados em laboratrio.
A primeira vacina no infecciosa feita a partir de subunidade viral foi licenciada em 1981, nos
EUA, contra o vrus da hepatite B. O antgeno HBs foi isolado de plasma humano, clonado e
expresso em leveduras (Saccharomyces cerevisiae). A protena HBs liberada das clulas de
leveduras por meio da ruptura celular e purificada por mtodos fsico-qumicos. A vacina atualmente
produzida no contm DNA detectvel de levedura, e menos de 1% do teor de protenas da
levedura; ela administrada via intramuscular em trs doses e apresenta eficcia de 90 a 100%.
A utilizao de protenas recombinantes expressas em sistemas de vrus, como o baculovrus,
est sendo aplicada no combate ao HPV. A vacina se baseia na sntese e utilizao de protenas virais
do capsdeo (L1), formando as chamadas partculas semelhantes a vrus, ou virus-like particles
(VLP), que so administradas em associao a adjuvantes. Duas vacinas foram desenvolvidas uma
bivalente, contendo dois tipos de vrus, e outra tetravalente, com quatro diferentes tipos virais. Essas
vacinas tm mostrado eficcia para induzir resposta imunolgica humoral e celular.
As vacinas que utilizam vrus inativados, protenas recombinantes e VLP induzem resposta
imunolgica mais fraca, quando comparadas com as de vrus atenuados. Essas estratgias vacinais
so capazes de induzir a produo de anticorpos e ativao de clulas TCD4+; no entanto, devido
incapacidade do vrus em se replicar in vivo, induzem menor ativao de clulas TCD8+. Em virtude
da menor imunogenicidade, necessrio que sejam administradas juntamente com substncias
adjuvantes que aumentam a resposta imunolgica para os antgenos da vacina. Acredita-se que a
maioria dos adjuvantes atue em clulas apresentadoras de antgenos, induzindo a ativao de clulas
T.
Vrias substncias vm sendo usadas como adjuvantes como, por exemplo, constituintes de

microrganismos, sais minerais, emulses, lipossomas, nano-beads, dentre outros, sendo necessrio
avaliar muito bem o risco-benefcio dos efeitos colaterais. As reaes que podem ocorrer incluem
dor, inflamao local, inchao, necrose no local de injeo, nusea, febre, eosinofilia, alergia e
imunotoxicidade, podendo conduzir ao desenvolvimento de doenas autoimunes. Estudos prclnicos do uso de adjuvantes so de extrema importncia e costumam ser feitos em animais de
pequeno porte.
Novas estratgias vacinais tm sido desenvolvidas com o intuito de aumentar a eficcia das
vacinas. A utilizao de microrganismos como vetores vacinais possibilita a insero de genes de
diferentes patgenos em um mesmo veculo, possibilitando, assim, a criao de uma nica vacina que
abranja vrios agentes infecciosos. Outra estratgia adotada a utilizao de DNA de patgenos
como vacina.

Vacinas de DNA
As vacinas de DNA so constitudas por plasmdeos que codificam protenas virais especficas e
podem ser expressos pelas clulas do hospedeiro em que foram inoculadas. Em geral, as vacinas so
preparadas utilizando-se genes que codificam protenas de superfcie, por serem mais imunognicas,
em associao a promotores de expresso no hospedeiro, alm de uma enzima responsvel pela
transcrio viral. A apresentao dos antgenos produzidos poderia ser realizada pelos micitos
presentes no local de inoculao; contudo, mais provvel que as protenas expressas sejam
liberadas por secreo ou devido morte (por apoptose ou necrose) das clulas portando o DNA. As
APC capturam essas protenas, processam e apresentam para as clulas do sistema imunolgico,
oferecendo resposta especfica contra o patgeno em questo. A administrao pode ser feita por
injeo intramuscular, endovenosa ou intradrmica, alm de inoculao intranasal do DNA puro ou
complexo DNA-lipossoma.
A vacina de DNA apresenta vantagem sobre as demais estratgias, por no utilizar agentes
infecciosos, no requerer o uso de vetores ou protenas purificadas e, principalmente, por fornecer
resposta imunolgica mais efetiva a infeces virais com ativao de clulas TCD8+. Alm disso,
uma vez que a manipulao de plasmdeos para a construo de vacinas de DNA tecnicamente mais
simples que a manipulao de partculas virais completas ou protenas intactas, essa estratgia
possibilita a insero de genes de diferentes sorotipos virais na mesma vacina e a seleo e insero
de eptopos imunodominantes especficos. Vacinas de DNA tm sido elaboradas contra vrus como
DENV, parvovrus, vrus da influenza, HCV, HIV, dentre outros.
Apesar dos avanos dos estudos em modelos experimentais utilizando animais de pequeno porte,
nem sempre a vacina de DNA tem se mostrado eficiente com os animais de grande porte e, at o
momento, no existem preparaes licenciadas para uso em seres humanos. Todavia, outras
estratgias tm sido desenvolvidas para melhorar a eficincia das vacinas de DNA, como a insero

de imunomoduladores nessas vacinas, o que contribui para a potencializao da resposta


imunolgica. Alm disso, diferentes metodologias tm sido avaliadas, como a adio de genes de
citocinas e a adio de molculas coestimulatrias e de direcionamento de antgenos para uma via de
apresentao especfica. Est em estudo, ainda, a associao do uso de vacinas de DNA a outras
tecnologias, como a utilizao de vetores virais mais imunognicos.
Quadro 7.1 Caractersticas e exemplos de diferentes estratgias de vacinao antiviral.
Estratgia

Resposta imunolgica

Vantagens

Desvantagens

Exemplos

Mimetiza a infeco
natural; resposta
duradoura

Reverso; lbil

Caxumba, febre
amarela, influenza,
poliomielite (Sabin),
rubola, sarampo,
rotavirose, varicela
Influenza, hepatite A,
poliomielite (Salk),
raiva

Vrus atenuado

Anticorpos, clulas
TCD8+ , clulas TCD4+

Vrus inativado

Anticorpos, clulas
TCD4+

Estvel; segura

Resposta de curta
durao

Vacinas de subunidades
(recombinantes)

Anticorpos, clulas
TCD4+

Segura; vrus no
cultivveis

Alto custo; resposta de


curta durao

Hepatite B

VLP

Anticorpos, clulas
TCD4+

Segura; vrus no
cultivveis

Alto custo; resposta de


curta durao

Papilomatose

VLP = virus-like particles.

Vetores virais
Os vetores virais so desenvolvidos a partir da insero de uma molcula de DNA, que expressa
os genes virais de interesse, em um vrus no patognico. Modelos experimentais de vacinao
utilizando vetores virais esto sendo desenvolvidos para DENV, vrus da influenza, vrus do
sarampo, HIV, HBV e vrus da raiva. No uso veterinrio, foi licenciada uma vacina contra raiva que
utiliza essa estratgia.
Em geral, os vetores virais com capacidade replicativa so mais imunognicos que plasmdeos
de DNA isolados. No entanto, essa tcnica apresenta como limitao a possibilidade de
neutralizao da vacina por hospedeiros previamente imunizados pelo vrus utilizado como vetor.
Ainda, se for necessrio o uso de doses de reforo, o hospedeiro que desenvolveu memria
imunolgica contra o vetor na primeira dose poderia neutralizar a vacina nas doses subsequentes.
A combinao de vacinas de DNA puro com vetores virais contendo a mesma sequncia
antignica tem sido estudada para suplantar a limitao de ambas as estratgias. Dessa maneira, a
ativao inicial do sistema imunolgico com o DNA isolado forneceria uma resposta de memria que

seria amplificada pela administrao subsequente do vetor viral (Quadro 7.1).

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Introduo
Nas ltimas dcadas, o diagnstico das infeces virais tem emergido como uma importante
ferramenta na medicina, contribuindo de maneira precisa na identificao de patgenos e
direcionando o seu tratamento.
A amplitude do uso das tcnicas de diagnstico tem vrias explicaes. Primeiro, a epidemia do
vrus da imunodeficincia humana (HIV) e o sucesso dos transplantes de medula ssea e de rgos
slidos aumentaram o nmero de pacientes sujeitos a infeces virais oportunistas. Segundo, o
aumento do nmero de agentes antivirais disponveis e seu uso dependem da rpida identificao do
patgeno. Terceiro, o desenvolvimento tecnolgico (p. ex., produo de anticorpos monoclonais e
ensaios de amplificao de cido nucleico) tem tornado o diagnstico virolgico rpido e preciso.
Alm disso, o desenvolvimento da reao em cadeia da polimerase (PCR) em tempo real
possibilitou a aplicao de um mtodo quantitativo no diagnstico laboratorial das infeces virais.
Uma importante caracterstica do diagnstico virolgico moderno o uso de mltiplos mtodos
na deteco das infeces virais, incluindo o isolamento viral, a deteco de antgenos e anticorpos e
a amplificao de cido nucleico.
O diagnstico virolgico pode ser fundamental em algumas situaes clnicas. Por exemplo, o
laboratrio tem papel crucial na identificao rpida e precisa de patgenos causando doenas em
pacientes com o sistema imunolgico comprometido, especialmente pacientes transplantados, HIVpositivos, com doenas sexualmente transmissveis, com infeces respiratrias graves, infeces
gastrointestinais, hepatites virais agudas ou crnicas e infeces congnitas.
O diagnstico virolgico tem importncia tambm na sade pblica. Por exemplo, a vigilncia de
pacientes com infeces respiratrias agudas primordial para o reconhecimento de uma nova
estirpe viral com potencial pandmico; diagnsticos especficos no caso de caxumba, rubola e
poliomielite podem guiar um programa de imunizao eficiente; o reconhecimento de encefalites
causadas por arbovrus pode sugerir um programa de controle de mosquitos; a deteco de norovrus
pode ser importante para o controle de gastroenterites causadas por alimentos e guas contaminados.

Histria do diagnstico virolgico


A era da medicina virolgica comeou em 1898, quando Loeffler e Frosch descobriram que a
doena dos ps e boca que afligia o gado era causada por um vrus denominado de agente filtrvel
naquela na poca. Em 1892, incluses virais j haviam sido notadas por Guarnieri, que descreveu
incluses intranucleares e intracitoplasmticas em tecidos infectados pelo vrus da varola.
No primeiro quarto do sculo XX, o conhecimento dos vrus como causadores de doenas em
seres humanos aumentou rapidamente. Os primeiros mtodos utilizados amplamente no diagnstico
virolgico foram os sorolgicos, que buscavam a deteco de antgenos virais ou anticorpos contra o
vrus. O teste de fixao do complemento descrito por Bedson e Bland, em 1929, foi o primeiro
mtodo empregado para detectar anticorpos contra os vrus da vaccnia (VV) e varicela-zoster
(VZV).
O primeiro isolamento de patgenos virais de seres humanos em cultura de clulas por Weller e
Enders, em 1948, possibilitou grande avano no diagnstico virolgico. Atualmente, o cultivo celular
ainda considerado o padro de referncia (gold standard) para o diagnstico de muitas viroses.
A primeira aplicao de anticorpos fluorescentes para diagnstico virolgico foi para a deteco
do antgeno do vrus da influenza (FLUV) em secreo nasal. O desenvolvimento de anticorpos
monoclonais na dcada de 1970 aumentou a disponibilidade de reagentes imunolgicos com alta
especificidade. A partir da dcada de 1980, os laboratrios foram capazes de implantar testes
utilizando como base anticorpos monoclonais para a deteco de uma variedade de antgenos virais
em amostras clnicas. A introduo de tcnicas moleculares para diagnstico virolgico teve incio
com o desenvolvimento da PCR, descrita em 1985 e aprimorada com a introduo da metodologia da
PCR em tempo real, no final da dcada de 1990.

Espcimes clnicos para o diagnstico virolgico


Um dos mais importantes fatores para um diagnstico apurado na Virologia est relacionado com
a maneira com que a amostra clnica manuseada. O tempo da colheita em relao ao aparecimento
da doena, a quantidade, a qualidade do material colhido, o tempo antes de ser processado e as
condies do transporte para o laboratrio so importantes variveis a serem destacadas.
Colher o material clnico na fase aguda da doena e no stio em que est ocorrendo replicao
viral aumenta o xito no diagnstico laboratorial. Por esse motivo, importante o conhecimento a
respeito da patogenia da doena. Por exemplo, se um paciente estiver com suspeita de meningite
viral, o liquor a amostra ideal a ser colhida. Em infeces envolvendo leses de pele ou mucosa,
as amostras colhidas da prpria leso so consideradas ideais.
O isolamento viral requer mais ateno nas condies de armazenagem e transporte do que as
amostras submetidas para deteco de antgeno viral ou cido nucleico, pelo fato de a infecciosidade

do vrus ter de ser preservada.


As amostras clnicas devem ser colocadas em meio de cultura com salina balanceada e
tamponada em pH 7,2, contendo antibiticos e antifngico (meio de transporte de vrus; MTV), e
transportadas rapidamente para o laboratrio para garantir a integridade das partculas virais.
Quando no for possvel o transporte imediato, a amostra em meio de transporte deve ser mantida
refrigerada ou em gelo. Se houver necessidade de estocagem da amostra por poucas horas, o
laboratrio deve ser consultado sobre as condies ideais para o agente suspeito. Em geral, no
recomendvel a manuteno da amostra na temperatura ambiente, e se houver demora maior que 24 h
para o transporte, as amostras devem ser congeladas a temperatura de 70C ou mais baixa, e
transportadas para o laboratrio em gelo seco. A recuperao de alguns vrus, tais como o vrus
respiratrio sincicial humano (HRSV) e os herpesvrus, pode ser seriamente comprometida por
congelamento, e as amostras suspeitas de conter esses vrus devem permanecer na geladeira (4C) e
no devem ser congeladas a 20C. Alguns meios apresentam um fator estabilizante como gelatina ou
outra protena para diminuir os danos fsicos s partculas virais; tal procedimento crtico para as
amostras que sero submetidas ao isolamento do vrus.
Em geral, o processamento da amostra clnica inclui a adio de mais antibiticos e antifngicos
amostra e centrifugao para retirar debris e contaminantes (clarificao), antes da inoculao nos
sistemas hospedeiros.
Para o diagnstico sorolgico, a amostra do soro na fase aguda deve ser colhida nos primeiros
dias da doena e a amostra da fase convalescente dentro de 2 a 4 semanas depois. Se um teste
especfico para IgM estiver disponvel, a amostra na fase aguda j suficiente. Caso o teste seja
realizado poucos dias aps a colheita, o material pode ser estocado a 4C, visto que as
imunoglobulinas so estveis no soro ou plasma. Caso o perodo de estocagem seja prolongado, o
material dever ser mantido a 20C ou 70C. Para certas infeces virais, a sorologia pode ser
realizada em saliva ou urina.
Acompanhando o material colhido deve seguir uma ficha contendo as seguintes informaes:
nome, idade, endereo e sexo do paciente; descrio do material colhido; poca da colheita e
suspeita clnica; histrico das vacinas virais j tomadas pelo paciente; situao epidemiolgica da
doena na zona residencial do paciente, no seu local de trabalho ou em reas prximas, e se realizou
viagem a local de circulao de algum vrus endmico.
Os tipos de materiais que podem ser utilizados na tentativa de deteco e isolamento de vrus
esto listados nos Quadros 8.1 e 8.2.
Quadro 8.1 Tipos de materiais indicados para exame virolgico.
Material a ser colhido
Local da leso

Para propagao viral

Para exame direto

Sistema respiratrio

Lavado de garganta, aspirado de nasofaringe


Aspirado de nasofaringe, lavado de garganta
em crianas de at 2 anos

Sistema nervoso central

Liquor, sangue (para isolamento de


arbovrus), fezes ou swab retal, lavado de
garganta, bipsia cerebral

Bi psia cerebral, liquor, esfregao de


fragmentos de corno de Ammon*

Trato gastrointestinal

Fezes

Fezes

Sistema cardiovascular

Fezes

Bi psia de tecido cardaco, lquido


pericrdico

Pele

Lquido de vesculas, raspado de lceras ou


crostas, fezes, swab de garganta

Lquido de vescula, raspado de lceras ou


crostas

Fgado

Sangue (para isolamento do vrus da febre


amarela)

Soro**, fezes***

Infeces congnitas

Lavado de garganta, placenta

Bi psia de tecido do feto

Febres de origem desconhecida

Sangue heparinizado, lavado de garganta,


fezes e urina recente

No descrito

*Somente para diagnstico de raiva. **Para demonstrao de HBsAg. ***Para demonstrao do vrus da hepatite A e E.

Para isolamento do vrus da rubola ou citomegalovrus humano. Para deteco de citomegalovrus humano.

Quadro 8.2 Tipos de materiais indicados para exame virolgico post-mortem.


Patologia

Material a ser colhido

Doena respiratria

Pulmo, swab traqueal, sangue

Doena do SNC

Meninges, tecido cerebral, medula espinhal, liquor, contedo do


clon, sangue

Doena cardiovascular

Miocrdio, sangue

Doena de pele

Lquidos de vesculas, raspado de lceras, swab de nasofaringe

Hepatite

Fgado, sangue

Febres de origem desconhecida

Crebro, fgado, pulmo, lquido pleural, bao, rins, lquido


peritoneal, sangue

SNC = sistema nervoso central.

Significado da deteco de vrus


A deteco de vrus em uma amostra clnica per si no prova suficiente do envolvimento do
vrus detectado no quadro clnico do paciente. Essa questo exacerbada com a utilizao das
metodologias de amplificao do genoma viral, tais como a PCR e outras altamente sensveis que

podem detectar baixos nveis de partculas virais em infeco persistente produtiva ou at mesmo
latente, no necessariamente relacionados com o quadro que o paciente est apresentando naquele
momento. A fim de determinar a existncia de relao causal entre o vrus detectado e a doena
apresentada pelo paciente, diversos fatores precisam ser considerados. Um deles verificar se o
vrus detectado associado infeco persistente produtiva ou latente, pois sua deteco pode
requerer o suporte de outras evidncias antes de ser determinado seu papel na doena. Por exemplo,
a deteco do anticorpo IgM especfico ou demonstrao de soroconverso, juntamente com a
deteco do vrus, sugere infeco aguda e, consequentemente, fortalece a relao causal.
Alternativamente, podem ser utilizados mtodos de biologia molecular para deteco de RNA
mensageiro viral que codifica uma protena estrutural ou outra protena viral que seria expressa
somente na infeco ativa.

Mtodos utilizados no diagnstico virolgico


As tcnicas utilizadas para o diagnstico laboratorial de uma virose podem ser realizadas com
base em 4 parmetros:

Isolamento e identificao do vrus


Sorologia para deteco de antgenos e/ou anticorpos
Deteco direta da partcula viral
Amplificao de cidos nucleicos virais.

O mtodo clssico empregado para a confirmao da infeco viral consiste no isolamento e na


identificao do vrus, juntamente com a sorologia para deteco de anticorpos. Atualmente, a
sorologia para deteco de antgenos e a deteco direta da partcula viral ou a amplificao de
cidos nucleicos virais tm sido, em muitos casos, teis para confirmar a suspeita clnica.
Para o isolamento e a identificao de vrus, o virologista utiliza sistemas vivos, nos quais os
vrus so propagados; na maioria dos laboratrios, as culturas de clulas constituem o sistema mais
utilizado.
Na sorologia, so utilizados mtodos para deteco de antgenos virais e/ou anticorpos
especficos, produzidos pelo hospedeiro em resposta infeco viral (p. ex., mtodos
imunoenzimticos, aglutinao, imunofluorescncia, Western blotting, testes imunocitoqumicos). A
deteco do antgeno viral diretamente no material clnico, sem uma etapa prvia de amplificao em
cultura, em alguns casos, constitui forma rpida e eficiente de diagnstico. Por meio da demonstrao
da presena de anticorpos ou alteraes nos nveis destes, possvel obter informaes valiosas
quanto condio imunolgica do indivduo.
Uma variedade de mtodos de diagnstico rpido pode ser empregada, com base na deteco do

vrus ou do cido nucleico viral em espcimes retirados diretamente do paciente, sem o isolamento
do vrus em laboratrio. Como exemplos desses mtodos, temos: microscopia eletrnica,
imunoeletromicroscopia, hibridizao e amplificao do cido nucleico, mas dependendo do vrus,
ser necessria a comprovao do aumento significativo do nvel de anticorpos especficos para o
diagnstico da infeco atual.
No entanto, as tcnicas utilizadas para o diagnstico virolgico no esto restritas somente a
essas abordagens. Esfregaos de clulas infectadas, provenientes de leses ou colhidas de outros
stios infectados, podem ser corados por mtodos como Giemsa, hematoxilina-eosina, e observados
ao microscpio ptico quanto a incluses induzidas por vrus. Essas incluses podem ser localizadas
no ncleo ou no citoplasma, sendo representadas por grandes agregados de protenas virais ou uma
combinao de vrions e produtos do metabolismo celular. Algumas delas podem ser teis na
identificao presuntiva do vrus, ou podem at mesmo confirmar (patognomnicas) a infeco viral,
como no caso dos corpsculos de Negri, produzidos pelo vrus da raiva e encontrados no crebro de
animais e seres humanos infectados.

Isolamento e identificao de vrus


Para se demonstrar que uma dada infeco tem etiologia viral, de fundamental importncia
comprovar-se, laboratorialmente, a presena dos vrus no paciente infectado. Essa comprovao
pode ser feita por isolamento e identificao do vrus no espcime e deteco de antgenos e/ou
anticorpos especficos, ou amplificao do genoma. No caso dos anticorpos, possvel fazer tanto a
deteco de IgM em uma nica amostra de soro quanto a de anticorpos totais por sorologia pareada.
Nesse ltimo caso, procura-se a converso sorolgica ou soroconverso, representada pela diferena
significativa (4 vezes ou mais) nos ttulos de anticorpos especficos contra o agente etiolgico no
soro do paciente infectado, no intervalo entre as fases aguda e convalescente da doena.
Apesar do desenvolvimento de tcnicas novas e rpidas para o diagnstico das infeces virais,
por meio da demonstrao do vrus, antgeno viral ou cido nucleico viral nos espcimes clnicos, o
isolamento do vrus ainda permanece como o padro de referncia para a comparao dos novos
mtodos.
O isolamento viral comparado a outros mtodos de diagnstico apresenta vantagens e
desvantagens. As culturas de clulas amplificam a quantidade de vrus, facilitando sua deteco e
identificao; tornam possvel a produo de partculas infecciosas que podem ser caracterizadas e
estocadas para estudos futuros; possibilitam o isolamento de diferentes tipos de vrus, incluindo
aqueles no considerados no momento da inoculao, e at mesmo vrus previamente desconhecidos
podem ser isolados. Esse ltimo item um contraste entre os mtodos de isolamento e os que se
baseiam no diagnstico imunolgico, ou na deteco do cido nucleico, os quais normalmente
detectam o vrus especfico para o qual os reagentes foram direcionados.

O isolamento viral tambm apresenta desvantagens como mtodo de diagnstico, incluindo: o


sistema usado para o isolamento de certos vrus pode no estar disponvel ou ser muito complicado
para a rotina laboratorial; o tempo necessrio para isolar certos vrus pode ser demorado, e no
satisfazer necessidade clnica, etc.
Um dos princpios mais importantes para o protocolo do isolamento viral a escolha do sistema
de propagao para o vrus pesquisado. Uma vez inoculados no sistema hospedeiro suscetvel, os
vrus provocam modificaes fisiolgicas nesse sistema, que so observadas como efeitos
consequentes da biossntese viral.
Os fenmenos de alterao morfolgica celular denominados efeito citoptico (CPE,
cytopathogenic effect) e atividade de hemadsoro, alm do desenvolvimento de paralisia e/ou
leses degenerativas e morte em animais, so exemplos de efeitos consequentes da biossntese de
vrus pelas clulas competentes dos sistemas hospedeiros utilizados.
A propagao de vrus em laboratrio feita em sistemas hospedeiros obrigatoriamente vivos,
que podem ser representados por animais de laboratrio, ovos embrionados e/ou culturas de clulas.
Deve-se salientar que apenas o isolamento de um vrus em determinado hospedeiro no representa a
confirmao de que aquele vrus o agente etiolgico da doena atual.

Propagao viral em animais de laboratrio


A propagao viral em animais de laboratrio com a finalidade de diagnstico no tem sido
utilizada com frequncia, devido ao advento das culturas de clulas as quais fornecem uma opo
mais simples e prtica. O uso de camundongos, em geral, est limitado ao isolamento de arbovrus,
vrus da raiva e alguns Coxsackievrus do grupo A, para os quais camundongos recm-nascidos, com
24 h de vida, so inoculados por via intracerebral ou intraperitoneal, e observados por
aproximadamente 2 semanas para a verificao do desenvolvimento de sintomas clnicos antes de
serem sacrificados para a realizao de exames histopatolgicos dos rgos afetados e/ou de testes
sorolgicos para a identificao do vrus isolado.
Animais de grande porte no costumam ser utilizados rotineiramente para o isolamento de vrus
de seres humanos. Primatas no humanos, especialmente chimpanzs, so utilizados em alguns
laboratrios de pesquisa para o isolamento de vrus de seres humanos no cultivveis em outros
sistemas hospedeiros. Algumas espcies de macacos tambm so utilizadas em testes de
neurovirulncia de algumas vacinas, como a Sabin contra a poliomielite.

Propagao viral em ovos embrionados


At a dcada de 1950, os ovos embrionados constituram o sistema hospedeiro de escolha para a
propagao de muitos vrus. Desde ento, as culturas de clulas passaram a ser utilizadas

amplamente para a propagao viral. Entretanto, os ovos embrionados continuam sendo utilizados
para isolamento de vrus avirios, FLUV e para a produo de alguns tipos de vacinas virais.
A incubao artificial dos ovos embrionados deve ser feita em uma temperatura adequada, com
umidade em torno de 62% e circulao de ar. A umidade e a circulao de ar so importantes para
evitar a dessecao da membrana da casca, que serve como um sistema de troca de ar para o
desenvolvimento do embrio.
A escolha da via de inoculao (saco vitelino, cavidade amnitica, cavidade alantoica,
membrana corioalantoica ou embrio), assim como a idade do embrio, so determinadas pela
especificidade do vrus que se quer isolar a uma dada membrana. Assim, por exemplo, o material
clnico para a deteco do FLUV deve ser inoculado no saco amnitico; o material suspeito de conter
o vrus da caxumba deve ser inoculado em cavidade alantoica; e o material proveniente de leso de
lquido de vescula, supostamente contendo o vrus herpes simplex (HSV), deve ser inoculado na
membrana corioalantoica.
A observao da propagao viral em ovos embrionados pode ser realizada a partir da tcnica
de hemaglutinao (HA), no lquido amnitico ou alantoico, ou da visualizao de pocks (do grego,
pstulas), que so leses esbranquiadas e/ou hemorrgicas na membrana corioalantoica. A
identificao do vrus isolado pode ser feita por meio de reaes sorolgicas, utilizando-se soros
padro.

Propagao viral em culturas de clulas


O uso do cultivo celular para isolamento viral teve incio aps 4 importantes fatos: o emprego
das tcnicas asspticas cirrgicas; a descoberta dos antibiticos; o desenvolvimento de um meio de
cultura para manuteno de clulas in vitro e tcnicas de cultura celular em monocamadas, por Gey,
em 1930; e a demonstrao do cultivo de poliovrus e VV, em cultura celular por Enders e Weller.

Tipos de culturas celulares


difcil classificar as culturas de clulas com base na morfologia, porm, em geral, possvel
separ-las como clulas do tipo epitelial (epitelioides) e clulas do tipo fibroblsticas
(fibroblastoides).
As culturas de clulas (ou linhagens celulares) tambm so classificadas de acordo com a
capacidade de ancoragem (aderncia) a uma superfcie determinada, podendo crescer formando
monocamadas ou em suspenso. As clulas aderentes dependem da fixao base de frascos ou
placas de cultura para se proliferarem; nestes formam uma nica camada contnua sobre a superfcie
e representam a maioria das linhagens em estudo. J as linhagens em suspenso no dependem de
ancoragem e se proliferam suspensas no meio, como o prprio nome sugere.

As culturas de clulas rotineiramente utilizadas tambm podem ser classificadas de acordo com o
tipo de cultivo: culturas de clulas primrias, culturas celulares diploides, linhagens celulares
contnuas, culturas clonadas e estirpes celulares, as quais podem ser derivadas de muitas espcies de
animais, e que diferem substancialmente em suas caractersticas. Geralmente, so culturas
bidimensionais (2D), nas quais as clulas podem ser cultivadas tanto em suspenso quanto em
monocamadas.
As culturas de clulas primrias, tambm chamadas de culturas finitas, originam-se de clulas
desagregadas recentemente de determinados tecidos de um organismo e apresentam tempo limitado
de vida em cultura em geral, no mais que 5 a 20 ciclos de diviso celular. A maioria dos tecidos
normais d origem a esse tipo de cultura e, aps certo perodo, as clulas entram em senescncia e
morrem. Podem ser obtidas de sangue, rgos (rins, fgado, linfonodos, bao, timo, pncreas) e
organismos (embries), mediante desagregao enzimtica ou mecnica do tecido ou por meio de
lavados. Quando um cultivo primrio subcultivado (passagem ou repique), as clulas da primeira
passagem recebem o nome de cultivo secundrio.
Culturas de clulas primrias de diferentes origens, incluindo clulas de embrio de galinha e rim
de macaco, co, coelho ou hamster, tm sido usadas em todo o mundo para a produo de vacinas
produzidas com vrus atenuados ou inativados para uso em seres humanos por mais de 40 anos. O
sucesso no controle de doenas virais, tais como poliomielite, sarampo, caxumba e rubola, tornouse possvel por intermdio do uso de vacinas preparadas em culturas de clulas primrias a
experincia tem indicado que esses produtos so seguros e eficientes. Contudo, a tendncia atual a
substituio desses cultivos primrios por culturas celulares diploides, devido ao fato de a qualidade
e a sensibilidade das culturas primrias obtidas de diferentes animais serem variveis. Alm disso, a
dificuldade de obteno de culturas derivadas de primatas no humanos tem aumentado
principalmente devido contaminao por agentes infecciosos.
As culturas de clulas finitas (ou diploides) so estabelecidas a partir do subcultivo de clulas
primrias, geralmente derivadas de tecidos de origem animal, consistindo em uma populao
homognea de um nico tipo de clula, que pode dividir-se at 100 vezes antes de entrar em
senescncia. Essa cultura retm o nmero de cromossomas diploide a despeito de numerosos ciclos
de diviso celular.
A principal vantagem das culturas celulares diploides de origem humana ou smia em
comparao com as culturas de clulas primrias que podem ser bem caracterizadas e
padronizadas, e a produo pode ser baseada num sistema de banco de clulas. Vacinas preparadas
em duas linhagens celulares diploides diferentes, originadas de pulmo de embrio humano (p. ex.,
WI-38 e MRC-5), tm sido usadas extensivamente nas ltimas dcadas, e so consideradas seguras.
J as linhagens de clulas ditas contnuas, permanentes, ou imortais, consistem em um nico tipo
celular e tm a capacidade ilimitada de crescimento em cultura; o estabelecimento pode ser a partir

de tecidos humanos ou de animais. Elas frequentemente apresentam morfologia ou nmero de


cromossomas anormais (aneuploides). Essas linhagens so derivadas dos seguintes mtodos:
Subcultivo seriado ou cultivo primrio de clulas de tumor de origem humana ou animal, tais
como as clulas HeLa (carcinoma de tero humano)
Transformao de uma clula normal apresentando um tempo de vida finito, com um oncogene
viral; por exemplo, linfcito B transformado pelo vrus Epstein-Barr (cultura de clulas Daudi)
Transformao de uma clula normal por meio de um agente qumico mutagnico
Subcultivo seriado de uma populao de clulas normais, produzindo espontaneamente uma nova
populao de clulas com tempo de vida infinito
Fuso entre uma clula de mieloma com um linfcito B produtor de anticorpos.
Linhagens de clulas contnuas so agora consideradas um substrato alternativo para a produo
de muitas substncias biolgicas medicinais. Um sistema de banco de clulas de linhagem contnua
semelhante ao utilizado para clulas diploides pode gerar produtos biolgicos por um perodo
indefinido, com base em clulas bem caracterizadas e padronizadas. No entanto, muitas dessas
clulas expressam vrus endgenos e so tumorignicas, havendo o risco da formao de tumores
associados ao DNA celular residual, que pode codificar protenas transformantes e protenas
promotoras de crescimento.
As culturas clonadas (clones) tm origem na seleo clonal, que o estabelecimento de uma
populao de clulas derivadas de uma nica clula. Os clones podem ser derivados de uma
linhagem de clulas contnuas ou de uma cultura primria. Em ambos os casos, o propsito da
clonagem o mesmo: minimizar o grau de variao gentica e fenotpica dentro da populao de
clulas. Por outro lado, o termo estirpes celulares usado para descrever a populao de clulas
subcultivadas selecionadas com base na expresso de propriedades especficas, caractersticas
funcionais, ou marcadores.
Os pesquisadores tm reconhecido as limitaes das culturas de clulas 2D dado o fato de que
elas no reproduzem as caractersticas morfolgicas e bioqumicas que as clulas apresentam no
tecido original. Alternativamente, a metodologia de culturas de clulas tridimensional (3D) oferece
aos pesquisadores os meios para crescimento e diferenciao celulares em condies que
reproduzem o ambiente in vivo.
Uma grande vantagem das culturas de clulas 3D sua geometria bem-definida em comparao
com culturas tradicionais, sua semelhana mais prxima com a situao in vivo no que diz respeito
forma e ao ambiente celular. Forma e ambiente podem determinar a expresso gnica e o
comportamento biolgico das clulas.
Vrus podem ser isolados por inoculao de culturas em monocamadas ou em suspenso.
Suspenso de linfcitos usada para a propagao de alguns retrovrus (vrus linfotrpico para

clulas T de humanos [HTLV] e HIV), herpesvrus como o Epstein-Barr (EBV) e herpesvrus


humanos tipos 6 (HHV-6) e 7 (HHV-7).
Os fatores fundamentais para a escolha da linhagem celular para o isolamento viral so a
permissividade e a velocidade de replicao. Cada linhagem de clulas mostra permissividade
diferenciada a cada grupo ou membro de famlias de vrus, como possvel observar no Quadro 8.3,
no qual so exemplificadas algumas clulas utilizadas para o isolamento de vrus. Essa capacidade
para suportar a replicao viral deve-se, muitas vezes, presena de fatores e do tipo de atividade
celular que tm sido identificados como sendo importantes para a replicao de certos vrus, como
por exemplo, a presena de receptores virais na clula, fatores que facilitam o desnudamento viral,
fatores de transcrio, proteno-cinases, proteases, enzimas de replicao de DNA e fatores de
traduo.

Evidenciao da propagao viral em cultura celular


Observao do efeito citoptico
No que diz respeito observao da propagao viral em culturas de clulas permissivas, vrias
abordagens podem ser realizadas a fim de detectar a presena da propagao viral nas clulas
inoculadas.
O efeito citoptico ou CPE se refere a alteraes na morfologia em clulas individuais ou grupos
de clulas induzidas pela infeco viral, as quais so observadas ao microscpio ptico.
Dependendo do vrus e do tipo de cultura de clulas, o CPE observado na cultura pode ser
caracterizado pelo arredondamento celular, clulas refrteis, picnose, vacuolizao, granulao,
formao de clulas gigantes, degenerao granular onde o citoplasma torna-se refringente, formao
de sinccios que resultam da fuso de clulas, agregao, perda da aderncia, ou lise. Alguns
exemplos de CPE induzido por vrus esto apresentados na Figura 8.1.
Quadro 8.3 Exemplos de culturas de clulas utilizadas para a propagao de vrus.
Tipo de
cultura

Primria

Diploide

Clula

Origem

Vrus propagado

AGMK

Rim de macaco (Cercopithecus aethiops)

RVA, VZV, HAV

PRK

Rim de coelho

HSV

SIRC

Crnea de coelho

HIV-1, vrus da rubola

MRC-5

Pulmo fetal humano

HRV, vrus da raiva, HCMV

WI-38

Pulmo fetal humano

HRV, vrus da raiva, HCMV

DBS-FRhL-2

Pulmo fetal de macaco (Macaca mulatta)

HRV, vrus da rubola, EV

Contnua

LLC-MK2

Rim de macaco (Macaca mulatta)

HMPV, HAstV, HAV

Vero

Rim de macaco (Cercopithecus aethiops)

HSV, DENV, HCoV

HEp-2

Carcinoma de laringe humana

HRSV, HRV, EV

HeLa

Carcinoma de crvice uterino humano

HAdV, HRV, HSV

A539

Carcinoma de pulmo humano

HAdV, EV, VZV

MDCK

Rim de co

FLUVA

RVA = rotavrus espcie A; VZV = vrus da varicela-zoster; HAV = vrus da hepatite A; HSV = vrus herpes simplex; HIV-1 =
vrus da imunodeficincia humana tipo 1; HRV = rinovrus humano; HCMV = citomegalovrus humano; EV = enterovrus;
HMPV = metapneumovrus humano; HAstV = astrovrus humano; DENV = vrus da dengue; HCoV = coronavrus humano;
HRSV = vrus respiratrio sincicial humano; HAdV = adenovrus humano; FLUVA = vrus da influenza A.

Alguns tipos de efeitos citopticos do uma indicao sobre o vrus que foi isolado. Assim,
alguns enterovrus, como o poliovrus e Coxsackievrus, podem produzir efeitos citopticos
caracterizados pela total destruio das clulas que usualmente ocorre dentro das primeiras 12 a 24 h
aps inoculao; outros, como os adenovrus, que somente so replicados adequadamente em clulas
de origem epitelial, em geral, causam um efeito citoptico que consiste em arredondamento, aumento
de tamanho e agregao das clulas infectadas.
Muitos vrus como os HSV, VZV e vrus do sarampo, que comumente causam infeces em seres
humanos, podem induzir efeitos citopticos em uma ampla gama de clulas que so consideradas
permissivas a esses vrus. Esses efeitos, geralmente, so caracterizados pela presena de clulas
arredondadas ou multinucleadas, que aparecem 2 a 3 dias aps a infeco. Em geral, a presena de
HRSV pode ser reconhecida pelo desenvolvimento de clulas gigantes multinucleadas (sinccios) nas
culturas inoculadas aps 1 semana de incubao. Outros, como os rotavrus, so considerados
agentes exigentes, pois requerem condies especiais em termos de cultura. Em geral, o CPE desses
vrus caracterizado por focos de clulas redondas e refringentes similares a velas em chama.

Figura 8.1 Efeito citoptico (CPE) induzido por vrus em culturas de clulas. A. Cultura de clulas Vero no infectadas. B.
CPE causado pelo HSV-1 em clulas Vero. C. Cultura de clulas C6/36 no infectadas. D. CPE causado pelo DENV-3 em
clulas C6/36. E. Cultura de clulas MA-104 no infectadas. F. CPE causado pelo rotavrus de smio SA-11 em clulas MA104.

A replicao de certos vrus em cultura de clulas pode ser muito lenta. Nas ltimas dcadas,
foram desenvolvidos vrios sistemas para acelerar a evidenciao do isolamento desses vrus em
cultura de clulas, como o caso do sistema de shell vial, das linhagens celulares geneticamente
modificadas e culturas de clulas mistas.

Sistema de shell vial


A possibilidade de deteco da propagao de vrus em culturas de clulas no formato de shell
vial, antes do surgimento do CPE, foi demonstrada pela primeira vez por Gleaves e colaboradores,
em 1984. O mtodo utiliza centrifugao em baixa velocidade para favorecer a infeco das culturas

de clulas MRC-5 (fibroblastos de pulmo de embrio humano) pelo citomegalovrus humano


(HCMV), seguido por incubao para amplificao de protenas especficas do vrus (as quais so
localizadas no ncleo celular) e, finalmente, a deteco dessas protenas realizada por ensaio de
imunofluorescncia (IF), utilizando anticorpos especficos para uma protena nuclear do HCMV. Esse
sistema apresenta positividade de dias a semanas antes que o CPE do HCMV seja observado na
cultura de clulas tradicional.
A velocidade no tempo de deteco do vrus e a sensibilidade do sistema de shell vial para o
HCMV estimularam o desenvolvimento de sistemas similares para outros vrus, incluindo o HSV,
VZV, adenovrus, enterovrus e alguns vrus respiratrios.

Linhagens celulares geneticamente modificadas


O emprego de linhagens celulares geneticamente modificadas na rotina clnica para a deteco de
vrus a partir de material de paciente foi proposto por Stabell & Olivo, em 1992. Esses
pesquisadores utilizaram cultura de clulas BHK-21 (clulas de rim de hamster recm-nascido),
transformadas por um promotor ligado ao gene da -galactosidase de Escherichia coli, que ativado
pela sntese do HSV. A adio de um substrato para essa enzima, o 5-bromo-4-cloro-3-indolil--Dgalactosidase (X-Gal), resulta na formao de um produto colorido nas clulas infectadas. Essa
linhagem celular est disponvel comercialmente como parte de um kit para diagnstico, denominado
ELVIS (enzyme-linked virus-induced system). Este sistema apresenta vrias vantagens, incluindo a
rapidez. O resultado est disponvel em 24 h, aps a inoculao da amostra por centrifugao em
baixa velocidade, incubao (overnight), e tratamento com o substrato. Outra vantagem que a
leitura baseia-se no surgimento de cor, mas o CPE ainda pode ser visualizado ao microscpio. Esse
sistema conveniente para laboratrios que manipulam grande quantidade de amostras, e tem o
potencial de automatizao. O conceito de indicador vrus-especfico aplicvel a outros vrus de
DNA ou de RNA. Em 1995, Tebas, Stabell & Olivo desenvolveram um protocolo nesse formato para
teste rpido de sensibilidade do HSV a antivirais.

Culturas de clulas mistas


Outro sistema desenvolvido para acelerar a propagao viral em cultura de clulas o uso de
culturas mistas em que a monocamada celular preparada a partir de uma mistura de clulas, o que
torna possvel o uso de clulas permissivas para uma ampla variedade de vrus em uma nica
cultura. Esse sistema usado em combinao com a inoculao da amostra por centrifugao em
baixa rotao, o que favorece a infeco. A replicao do vrus na cultura amplifica o sinal e a IF
facilita a deteco rpida da propagao viral.
O sistema de cultura de clulas mistas tem sido desenvolvido para vrus presentes em alguns
espcimes clnicos especficos. A mistura rpida para vrus respiratrio (R-mix) uma combinao
de clulas ML (pulmo de marta) e clulas A549 (carcinoma de pulmo humano), para a deteco de

HRSV, vrus da parainfluenza humana (HPIV), FLUV A e B, e adenovrus humano (HAdV). Uma
mistura denominada A & H preparada pela combinao de clulas CV-1 (fibroblasto de rim de
macaco-verde africano, Cercopithecus aethiops) e clulas MRC-5 utilizada para a deteco de
HSV, HCMV e VZV. A mistura E & A envolve a combinao de clulas RD (rabdomiossarcoma) e
NCI-H292 (carcinoma de pulmo humano) e a mistura E & B, clulas BGMK (cultura derivada da
linhagem AGMK) e A549, so utilizadas para o isolamento de vrios enterovrus.
Por outro lado, a propagao de vrus que produzem pouco ou nenhum CPE visvel em culturas
de clulas pode ser evidenciada por tcnicas alternativas como, por exemplo, a observao de
corpsculos de incluso, que so alteraes mais discretas na arquitetura intracelular e so
discernveis ao microscpio ptico. O efeito altamente especfico para alguns vrus em particular,
de maneira que a presena de um tipo especfico de corpsculo de incluso pode fornecer o
diagnstico da infeco viral, como por exemplo, o corpsculo de Negri induzido pela replicao do
vrus rbico. A localizao dessas incluses, intranucleares ou intracitoplasmticas, caracterstica
do vrus infectante. Alguns exemplos de vrus e a localizao das incluses produzidas por estes
esto apresentados no Quadro 8.4.
Outras tcnicas como teste de hemaglutinao (HA), hemadsoro (Hd), interferncia viral (IV),
reaes sorolgicas (p. ex., IF) e deteco do cido nucleico viral tambm podem ser utilizadas
para a demonstrao da propagao viral aps a inoculao da cultura.
Quadro 8.4 Localizao de corpsculos de incluso, produzidos por alguns vrus.
Localizao do corpsculo
Vrus

Nuclear

Citoplasmtica

Herpes simplex

Varicela-zoster

Citomegalovrus

Adenovrus

Poliomavrus humano (JC e BK)

Parvovrus B19

Poxvrus

Sarampo

Parainfluenza

Raiva

Febre amarela

*Negativo.

Teste de hemaglutinao
Certos vrus so capazes de aglutinar hemcias de animais de diferentes espcies; esse fenmeno
denominado hemaglutinao (HA) viral. Os vrus se ligam diretamente aos receptores constitudos
de cido silico presentes na superfcie das hemcias. A ligao de partculas virais a estes
receptores resulta no agrupamento visvel dessas hemcias que se depositam no fundo da placa,
formando um tapete. Caso no haja a presena de vrus hemaglutinante no material pesquisado, as
hemcias iro depositar-se no fundo da placa em forma de boto (Figura 8.2). Assim, a
hemaglutinao viral no uma reao sorolgica, porque esta no envolve a ligao antgenoanticorpo. A capacidade de hemaglutinar restrita a alguns vrus, sendo importante a espcie do
animal de origem da hemcia.
A hemaglutinao viral usada em laboratrio de virologia para a deteco qualitativa e
quantitativa de vrus hemaglutinantes. Na forma quantitativa, a suspenso viral submetida a
diluies seriadas e testadas contra hemcias. A determinao da maior diluio em que ocorre a
hemaglutinao total das hemcias permite estimar o ttulo viral na amostra. O ttulo viral definido
como o inverso da maior diluio em que ocorre hemaglutinao total (Figura 8.3). Nessa diluio,
encontra-se a quantidade mnima de vrus necessria para que ocorra a hemaglutinao total; a
concentrao de vrus nesta diluio denominada uma unidade hemaglutinante (1UHA). Assim, se
ao realizar uma reao de HA para quantificar o ttulo viral em uma preparao, a maior diluio em
que ocorrer a hemaglutinao completa for 1:32, o ttulo dessa preparao igual a 32 e nessa
diluio, existe 1 UHA. Por conseguinte, na preparao original que est 32 vezes mais concentrada
temos 32 UHA (Figura 8.3). A determinao desse valor importante para a padronizao de
antgenos hemaglutinantes que sero utilizados na reao de inibio da hemaglutinao que ser
apresentada mais adiante nesse captulo.

Figura 8.2 Teste de hemaglutinao (HA). O teste de HA consiste na interao entre a hemaglutinina do vrus e o cido
silico presente na superfcie das hemcias. Quando se mistura uma suspenso de hemcias e partculas de vrus
hemaglutinantes, haver a formao de um agregado vrus-hemcias, que se deposita no fundo da placa em forma de
tapete. Na ausncia de vrus hemaglutinante as hemcias iro se depositar no fundo da placa em forma de boto.

Teste de hemadsoro
O teste de hemadsoro (Hd), que se refere capacidade de hemcias aderirem superfcie de
clulas infectadas por certos tipos de vrus, serve para detectar a replicao de vrus que expressam
hemaglutininas (protenas que se ligam aos receptores de cido silico na superfcie de hemcias) na
membrana celular, tais como o FLUV ou HPIV. No teste, uma suspenso de hemcias adicionada
cultura de clulas infectadas e a hemaglutinina expressa na superfcie das clulas infectadas durante o
processo de biossntese viral ir se ligar aos resduos de cido silico presentes na membrana das
hemcias (Figura 8.4).

Teste de interferncia viral


O teste de interferncia viral (IV) baseia-se no fenmeno em que a cultura celular infectada por
um vrus pode tornar-se resistente infeco por outro vrus para o qual, originalmente, era
permissiva. Para a realizao desse ensaio, uma cultura de clulas previamente inoculada com a

amostra desafiada com um vrus de referncia para o qual essa cultura sabidamente permissiva.
Uma segunda cultura do mesmo tipo (controle), a qual no foi inoculada com a amostra, desafiada
simultaneamente para demonstrar a capacidade de o vrus de referncia causar CPE na cultura. A
interferncia ser demonstrada se o vrus de referncia for propagado na cultura controle, mas no
propagar na cultura inoculada com a amostra. O vrus isolado pode ser identificado por reaes
sorolgicas (Figura 8.5).

Identificao do vrus isolado


Para a identificao do vrus isolado em culturas de clulas ou ovos embrionados, colhe-se o
sobrenadante da cultura e lquido alantoico ou amnitico dos ovos, para execuo de testes
sorolgicos clssicos, tais como teste de neutralizao, de fixao do complemento ou de inibio da
hemaglutinao, utilizando-se soros padro contra os vrus pesquisados. No caso de animais de
laboratrio, deve-se colher o crebro, os rgos ou os msculos infectados, para exames
histopatolgicos, ou sangue, para realizao de sorologia. possvel tambm a anlise dessas
amostras em microscopia eletrnica, buscando diretamente a partcula viral.

Figura 8.3 Exemplo de titulao viral por meio do teste de HA. Nesse exemplo uma preparao viral foi submetida a
diluies seriadas (1:2 a 1:256) e testada contra uma concentrao estabelecida de hemcias. A maior diluio em que
ocorreu hemaglutinao total foi 1:32; logo, o ttulo da preparao viral de 32 UHA. A diluio em que se encontra a
quantidade mnima de partculas virais suficiente para induzir hemaglutinao total (1 UHA) 1:32, visto que em
diluies maiores no ocorre a hemaglutinao (diluies de 1:64 at 1:256, formao de boto). UHA = unidades
hemaglutinantes.

Figura 8.4 Teste de hemadsoro (Hd). No teste de Hd ocorre a interao entre o cido silico presente na superfcie da
hemcia e a hemaglutinina viral presente na superfcie da clula infectada.

Figura 8.5 Teste de interferncia viral (IV). Esse teste baseia-se na capacidade de certos vrus interferirem com a
replicao de um segundo vrus na mesma cultura. A amostra suspeita de conter vrus inoculada em cultura de clulas e
incubada por 24 h; aps esse perodo, um segundo vrus, denominado vrus de referncia, que sabidamente apresenta
replicao rpida e citocida nessa cultura celular, inoculado na mesma cultura do material suspeito e em uma nova
cultura (controle). As culturas so novamente incubadas por 24 h e realizada a observao do efeito citoptico (CPE).
Caso o material suspeito seja positivo, o vrus presente nesse material ir impedir a replicao do vrus de referncia, no
sendo observado o CPE; caso o material seja negativo, o vrus de referncia ser propagado rapidamente e induzir CPE na
cultura de clulas.

Diagnstico sorolgico das infeces virais


As reaes sorolgicas so empregadas em Virologia com as seguintes finalidades:
Confirmar a suspeita clnica, diagnosticando laboratorialmente uma enfermidade causada por
vrus

Identificar o vrus isolado em cultura


Estudar epidemiologicamente o comportamento de uma virose em uma dada comunidade.
Os princpios bsicos do diagnstico sorolgico das infeces virais so os mesmos usados em
sorologias para outras doenas infecciosas. A infeco pela maioria dos microrganismos, incluindo
vrus, induz a formao de anticorpos especficos; estes, quando identificados no soro de um
indivduo, produzem evidncias de que ele foi infectado por um determinado agente infeccioso.
A deteco de anticorpos da classe IgM em uma nica amostra de soro do paciente possibilita o
diagnstico de infeco recente. A presena de IgG pode significar um contato prvio com o vrus ou
infeco recente, se for demonstrado aumento significativo (converso sorolgica) no ttulo de
anticorpos ( 4 vezes) entre duas amostras de soro (sorologia pareada), colhidas com um intervalo
de 15 a 20 dias.
Para o diagnstico das infeces virais, a sorologia usada frequentemente porque, muitas vezes,
o isolamento viral difcil, alm de no estar amplamente disponvel. A sorologia tambm til para
determinar o estado imunolgico do paciente; ou seja, verificar se o indivduo j foi infectado ou
imunizado contra certos vrus, por meio da pesquisa de anticorpos especficos contra esse vrus. A
deteco de anticorpos a nica opo para confirmar uma infeco aguda prvia, uma vez que o
agente infeccioso no est mais presente, permanecendo apenas os anticorpos como prova de que a
infeco ocorreu.
Em geral, a sorologia serve como um mtodo indireto para o diagnstico da infeco viral. No
sorodiagnstico, os anticorpos produzidos em vrias sndromes clnicas so identificados e
quantificados. Os testes sorolgicos tradicionais detectam primariamente imunoglobulinas da classe
G (IgG). A IgG o anticorpo de memria produzido em grandes quantidades durante a infeco e que
persiste por longos perodos ou mesmo toda a vida, aps a maioria das infeces virais. Alm disso,
a IgG a imunoglobulina predominante no soro, representando aproximadamente 76%, em
comparao com 16% de IgA, 8% de IgM, e menos de 1% de IgD e IgE. Devido ao excesso de IgG,
essa imunoglobulina usualmente detectada. A IgM a primeira imunoglobulina produzida, porm
em menor quantidade, e diminui rapidamente para nveis no detectveis, podendo ser detectada
juntamente com a IgG em testes tradicionais que medem anticorpos totais. Contudo, IgM e IgG no
so diferenciadas nesses mtodos. A IgA pode ou no ser detectada, sendo o seu surgimento, os
nveis e a sua durao menos previsveis que os da IgM e da IgG. A IgD e a IgE, cuja quantidade
mnima e provavelmente no detectada, ainda no tiveram o seu papel em infeces virais
devidamente elucidado.

Testes sorolgicos utilizados em Virologia


Teste de neutralizao

O teste de neutralizao (TN) est fundamentado no princpio de que vrus infecciosos, quando
interagem com o anticorpo especfico, so neutralizados e, por conseguinte, perdem a capacidade de
infectar clulas permissivas. O teste realizado em 2 etapas: na primeira, o vrus infeccioso e o soro
do paciente so misturados e incubados para que ocorra a formao do imunocomplexo (antgenoanticorpo); na segunda etapa, alquotas da mistura vrus-soro so inoculadas em um hospedeiro
permissivo, geralmente cultura de clulas. Aps incubao apropriada, a cultura examinada para a
observao do CPE. Se no soro do paciente houver anticorpos especficos contra o vrus pesquisado,
este ir se ligar ao vrus, neutralizando-o na primeira etapa, e o vrus no ir infectar a cultura de
clulas. Consequentemente, o CPE no ser observado. Caso os anticorpos do paciente no sejam
especficos para o vrus pesquisado, estes no se ligaro ao vrus na primeira etapa, o qual
permanecer infeccioso e ir infectar a cultura de clulas produzindo CPE (Figura 8.6).
O teste de neutralizao pode ser usado para identificao de vrus ou para avaliao do nvel de
anticorpos. Quando um vrus precisa ser identificado, uma suspenso desse vrus misturada com
uma suspenso de anticorpos especficos (soro padro). Para a deteco de anticorpos, uma
suspenso de um vrus conhecido misturada ao soro do paciente que contm os anticorpos de
especificidade desconhecida. O TN detecta anticorpos totais (IgM e IgG), sem discriminar a classe
da imunoglobulina. Dessa maneira, o diagnstico de uma infeco recente utilizando o TN para
pesquisa de anticorpos somente pode ser realizado pela demonstrao da converso sorolgica ou
soroconverso. Nesse caso, testam-se as 2 amostras de soro do paciente (soro da fase aguda e soro
da fase convalescente) simultaneamente, fazendo-se diluies seriadas dos soros para determinao
do ttulo de anticorpos (Figura 8.7). Se o soro da fase convalescente apresentar um ttulo de
anticorpos 4 vezes o da fase aguda, ou se somente forem detectados anticorpos no soro
convalescente, o paciente est apresentando uma infeco aguda ou recente. Caso seja detectada a
presena de anticorpos, mas no houver variao de ttulo entre os soros, diz-se que o paciente teve
contato prvio com o vrus pesquisado; contudo, este no o responsvel pela infeco atual.
Finalmente, se no forem detectados anticorpos contra o vrus pesquisado nos soros do paciente, dizse que este suscetvel para o vrus, pois no possui imunidade contra o mesmo.

Figura 8.6 Teste de neutralizao (TN). O teste baseia-se na capacidade de os anticorpos neutralizarem a infecciosidade
dos vrus. Pode ser usado para identificao de vrus, utilizando-se soro padro, ou para deteco de anticorpos no soro,
utilizando-se vrus infeccioso. Inicialmente, vrus e anticorpos so misturados e, posteriormente, a mistura inoculada em
cultura de clulas. Se os anticorpos conseguirem neutralizar a infecciosidade do vrus, este no ser capaz de infectar as
clulas e, por conseguinte, no haver a induo do efeito citoptico (CPE), caso o vrus no seja neutralizado, o CPE ser
observado.

Teste de inibio da hemaglutinao


No teste de inibio da hemaglutinao (HI), a capacidade de hemaglutinao de um vrus
bloqueada quando esse vrus reage com o anticorpo especfico. O teste de HI executado em 2
estgios. No primeiro estgio, o vrus hemaglutinante e o soro do paciente so misturados e
incubados. Se o soro do paciente possui anticorpos especficos para o vrus, haver a formao do
imunocomplexo. No segundo estgio, so adicionadas hemcias mistura do primeiro estgio; o
vrus complexado ao anticorpo no tem a capacidade de produzir a hemaglutinao. Quando o
anticorpo, no primeiro estgio, no especfico para o vrus, no h formao do complexo vrusanticorpo, e o vrus mantm a sua capacidade de induzir hemaglutinao. A tcnica aplicvel
apenas a vrus com capacidade hemaglutinante (Figura 8.8). Para a deteco de anticorpos, um vrus
hemaglutinante conhecido misturado com o soro do paciente. Se o soro inibir a hemaglutinao
pelo vrus, o anticorpo no soro detectado. O teste de HI tambm pode ser usado para identificao
de vrus; nesse caso, o vrus misturado com soros padro contendo anticorpos especficos. Se os
anticorpos inibirem a hemaglutinao, o vrus identificado. Assim como o TN, a reao de HI
detecta anticorpos totais (IgM e IgG) e o diagnstico de uma infeco por pesquisa de anticorpos
somente pode ser realizado pela sorologia pareada para a demonstrao de soroconverso (Figura
8.9).

Figura 8.7 Exemplos de titulao de anticorpos por meio de TN. Foram analisados soros da fase aguda (SFA) e da fase
convalescente (SFC) de um paciente para a deteco de anticorpos contra um determinado vrus. O ttulo de anticorpos do
soro definido como o inverso da maior diluio em que ocorreu a neutralizao do vrus (ausncia de CPE). O ttulo do
SFA foi 20 e do SFC, de 160; ocorreu soroconverso ou converso sorolgica (ttulo do soro da fase convalescente 4
vezes o ttulo do soro da fase aguda). Assim, diz-se que o paciente est apresentando uma infeco recente pelo vrus
testado. CC = controle de clulas no infectadas; CV = controle de vrus (clulas infectadas com o vrus usado na reao);
CSFA = controle de soro da fase aguda (clulas inoculadas com o SFA); CSFC = controle de soro da fase convalescente
(clulas inoculadas com o SFC).

Figura 8.8 Teste de inibio da hemaglutinao (HI). A ligao dos anticorpos hemaglutinina viral impede que esta
consiga interagir com o cido silico na superfcie da hemcia, inibindo assim o processo de hemaglutinao. Esse
fenmeno explorado no teste de HI. Inicialmente, vrus e anticorpos so misturados e posteriormente as hemcias so
adicionadas mistura. Se os anticorpos estiverem ligados hemaglutinina viral, no haver a formao do agregado vrushemcias; as hemcias iro depositar-se no fundo da placa em forma de boto. Se no ocorrer a ligao vrus-anticorpos,
a hemaglutinina viral estar livre para ligar ao cido silico da hemcia e haver a formao de um tapete de hemcias no
fundo da placa.

Teste de fixao do complemento


O teste de fixao do complemento (FC) baseia-se no princpio de que o complemento, um agente
ltico, ligado (fixado) a um complexo antgeno-anticorpo. A reao de FC realizada em 2 fases.
Na primeira fase, o soro, o antgeno e o complemento so misturados e incubados. Se o soro contiver
anticorpo especfico para o antgeno, o complexo antgeno-anticorpo ser formado e o complemento
ser fixado. Na segunda fase, um complexo formado por hemcia + anticorpo anti-hemcia, o qual
funciona como um complexo antgeno-anticorpo (sistema revelador), adicionado mistura. Se o
complemento for fixado na primeira fase, este no estar mais ativo ou disponvel para atuar no
complexo hemcia-anticorpo, e assim as hemcias permanecero intactas e no sero lisadas.
Consequentemente, a ausncia de hemlise indica que o antgeno e o anticorpo da primeira fase eram
especficos um para o outro.
Se, na primeira fase, o anticorpo no for especfico para o antgeno, no haver formao de
imunocomplexos, o complemento no ser fixado e permanecer livre e ativo. Quando for adicionado
o sistema revelador, o complemento ativo ir reconhecer o segundo imunocomplexo, ao qual ir se
fixar; isso ir ativar a cascata do complemento, resultando na lise das hemcias. A presena de
hemlise indica que o antgeno e o anticorpo da primeira fase no eram especficos um para o outro
(Figura 8.10).
Quando o teste de FC usado para identificao de vrus, o antgeno na primeira fase o
sobrenadante de clulas infectadas com o vrus, e os anticorpos presentes em soros padres so
especficos para vrus conhecidos. Quando a reao usada para a deteco de anticorpos, o
antgeno na primeira fase uma suspenso de um vrus conhecido, e os anticorpos a serem
pesquisados esto presentes no soro do paciente. A reao de FC detecta anticorpos totais (IgM e
IgG) e o diagnstico de uma infeco recente por pesquisa de anticorpos somente pode ser realizado
pela sorologia pareada (Figura 8.11).

Figura 8.9 Exemplos de titulao de anticorpos por meio do teste de HI. Foram analisados soros da fase aguda (SFA) e da
fase convalescente (SFC) de um paciente para a deteco de anticorpos contra um determinado vrus. O ttulo de
anticorpos do soro definido como o inverso da maior diluio em que ocorreu a inibio total da hemaglutinao (boto).
Tanto o ttulo do SFA quanto o do SFC foram 80; no ocorreu soroconverso, embora o paciente apresente anticorpos
contra o vrus pesquisado. Assim, diz-se que o paciente no est apresentando infeco recente, mas j esteve em
contato com o vrus pesquisado. CH = controle de hemcias; CV = controle de vrus (vrus hemaglutinantes + hemcias);
CSFA = controle de soro da fase aguda (SFA + hemcias); CSFC = controle de soro da fase convalescente (SFC +
hemcias).

Figura 8.10 Teste de fixao do complemento (FC). Este teste mede a capacidade de o complexo antgeno-anticorpo se
ligar (fixar) ao complemento e desencadear o processo de lise celular. O vrus misturado com anticorpo e complemento;
se o anticorpo estiver complexado ao vrus, o complemento ser fixado. Em seguida, adicionada uma mistura do
complexo formado por hemcias e anticorpos anti-hemcia. Caso o complemento tenha sido consumido pelo complexo
vrus-anticorpo, a mistura hemcia-anticorpo se deposita no fundo da placa em forma de boto. Caso no tenha ocorrido a
formao do complexo vrus-anticorpo, o complemento ser fixado ao complexo hemcia-anticorpo, provocando a lise das
hemcias.

Imunofluorescncia
A tcnica de imunofluorescncia (IF) utiliza anticorpos marcados com corantes fluorescentes
para revelar a formao de um imunocomplexo vrus-anticorpo. Os anticorpos marcados so
chamados de conjugados. O corante fluorescente usado mais frequentemente em Virologia o
isotiocianato de fluorescena (FITC), o qual produz uma fluorescncia verde-amarelada.

Imunofluorescncia direta
A imunofluorescncia direta (IFD) um mtodo usado para identificao de muitos antgenos
virais. Na IFD, um conjugado de especificidade conhecida adicionado a clulas infectadas por
vrus que esto fixadas em uma lmina de microscpio. Se o anticorpo especfico para o antgeno,
ocorre formao do complexo vrus-anticorpo, que visualizado pela fluorescncia observada ao
microscpio de fluorescncia. Se o conjugado no for especfico para o antgeno, no h formao
do imunocomplexo e a fluorescncia no observada (Figura 8.12A).

Imunofluorescncia indireta
A imunofluorescncia indireta (IFI) uma tcnica usada em laboratrio virolgico para a
identificao de antgeno ou deteco de anticorpo. O teste realizado em 2 etapas. Na primeira, o
soro do paciente adicionado a clulas infectadas fixadas a uma lmina de microscpio. Aps
incubao, as lminas so lavadas para remover anticorpos no ligados. Na segunda etapa, um
anticorpo anti-imunoglobulina conjugado com fluorescena adicionado. O tipo do conjugado
determinado pela espcie do anticorpo usado na primeira etapa. Por exemplo, se uma imunoglobulina
humana usada na primeira etapa, ento um conjugado anti-imunoglobulina de humano usado na
segunda etapa. Aps incubao e lavagem, o esfregao observado ao microscpio de fluorescncia.
Se o soro do paciente apresentar anticorpos especficos para o vrus fixado lmina na primeira
etapa, estes se ligaro ao antgeno e o conjugado ir se ligar ao complexo, possibilitando a
observao da fluorescncia. Caso o soro do paciente no contenha anticorpos especficos para o
vrus, no iro se ligar a este e o conjugado no se ligar ao complexo na segunda etapa, no sendo
observada fluorescncia. Essa tcnica pode ser usada para deteco de IgM ou IgG especficas para
um determinado vrus (Figura 8.12B).

Figura 8.11 Exemplos de titulao de anticorpos pelo teste de FC. Foram analisados soros da fase aguda (SFA) e soro da
fase convalescente (SFC) de um paciente para a deteco de anticorpos contra o determinado vrus. O ttulo de anticorpos
do soro definido como o inverso da maior diluio em que ocorreu a fixao do complemento (boto). O ttulo do SFA foi <
5 e do SFC foi < 5; no foram detectados anticorpos contra o vrus pesquisado. Assim, diz-se que o paciente nunca esteve
em contato com o vrus pesquisado sendo suscetvel infeco por esse vrus. CH = controle de hemcias; CCon =
controle de conjugado (sistema revelador + complemento); CSFA = controle de soro da fase aguda (SFA + sistema
revelador); CSFC = controle de soro da fase convalescente (SFC + sistema revelador).

A tcnica de IFI tem a vantagem de no ser preciso obter um antissoro conjugado com o corante
fluorescente para cada tipo de vrus, o que torna o diagnstico mais barato do que quando se utiliza
apenas a IFD. Alm disso, no existem comercializados antissoros-conjugados com o corante
fluorescente para alguns tipos de vrus.

Aglutinao passiva ou aglutinao do ltex


A aglutinao direta um mecanismo pelo qual antgenos livres so agrupados por ligao com
anticorpos especficos. A aglutinao passiva ou aglutinao do ltex (AL) semelhante
aglutinao direta; contudo, o antgeno artificialmente ligado a uma partcula carreadora, a qual, em
geral, uma partcula de ltex. Essas partculas so agrupadas por ligao com os anticorpos
especficos para o antgeno presente na sua superfcie.
O teste de aglutinao passiva usado para deteco de vrus ou antgenos virais. Para isso, o
componente artificialmente ligado ao carreador um anticorpo de especificidade conhecida. Essa
reao algumas vezes chamada de aglutinao passiva reversa. As partculas cobertas com
anticorpos so misturadas a uma suspenso contendo vrus e, quando os anticorpos ligados ao
carreador se ligam ao antgeno, ocorre a aglutinao, que visvel a olho nu (Figura 8.13A).
A reao de aglutinao passiva tambm usada em Virologia Clnica para deteco de
anticorpos. Para esse propsito, antgenos virais conhecidos so adsorvidos ao carreador e as
partculas so misturadas com soro de humano. Se o anticorpo presente no soro for especfico para o
antgeno viral, ligado ao carreador, haver aglutinao (Figura 8.13B).

Teste de imunoperoxidase
A reao envolve o uso de anticorpos conjugados com a enzima peroxidase. A colorao pode
ser direta ou indireta e realizada em uma sequncia semelhante da IFD ou IFI (Figura 8.14A e B).
A tcnica de imunoperoxidase (IP) requer uma etapa adicional, que consiste na adio de um
substrato. Nas reas em que o conjugado se liga ao imunocomplexo, ocorrer mudana de colorao
devido ao da enzima peroxidase no substrato. A preparao analisada ao microscpio ptico.

Teste imunoenzimtico
A reao imunoenzimtica (EIA ou ELISA) a base para muitos testes usados para a
identificao de antgenos ou a deteco de anticorpos. O sistema envolve anticorpos conjugados
com enzimas. O resultado do teste determinado por observao (avaliao qualitativa) ou medida
espectrofotomtrica (avaliao quantitativa) da mudana de cor, produzida pela ao da enzima
sobre o seu substrato.
O EIA, tambm denominado ELISA (enzyme linked immunosorbent assay), revolucionou o
diagnstico virolgico. O teste pode ser desenvolvido em diversos formatos para deteco de

antgenos ou anticorpos; o sistema envolve a deteco do imunocomplexo fixo em um suporte, usando


para isso um anticorpo conjugado a uma enzima. O resultado do teste determinado pela observao
ou medida espectrofotomtrica da colorao produzida pela reao da enzima sobre o substrato.
Assim, o teste envolve as seguintes etapas: formao do imunocomplexo (antgeno-anticorpo); adio
do conjugado (anticorpo-enzima); e revelao (adio do substrato-reao colorida). Diversas
enzimas so comumente utilizadas nos testes de EIA (Quadro 8.5); a mais utilizada a peroxidase
(H2O2) extrada do nabo (horseradish plant).

Figura 8.12 Teste de imunofluorescncia (IF). O teste detecta antgenos ou anticorpos fixados a uma lmina, utilizando um
sistema revelador (conjugado) que consiste em um anticorpo antivrus ou anti-imunoglobulina ligado a um corante
fluorescente. Na pesquisa de antgenos, o vrus fixado lmina e, em seguida, adicionado o conjugado (A teste de
IFD). Na pesquisa de anticorpos, inicialmente, o anticorpo capturado por interao com o antgeno viral fixado na lmina.
Em seguida, usado um sistema revelador que consiste em um anticorpo anti-imunoglobulina ligado a um corante
fluorescente (B teste de IFI). A leitura do resultado realizada em microscpio de fluorescncia.

Um dos componentes do imunocomplexo (antgeno ou anticorpo) fixado a um suporte slido


(placa, fita ou cassete); este processo denominado de sensibilizao do sistema. No teste para
deteco de anticorpos, um antgeno viral ligado ao suporte, ao passo que, para a identificao de
antgeno, um anticorpo especfico ligado ao suporte. Em seguida, adicionada a amostra-teste para
formao do imunocomplexo. No ensaio para a deteco de antgeno, o material-teste pode ser
originado de diversos espcimes biolgicos como, por exemplo, lavado de garganta, secrees,
fezes, plasma ou uma suspenso de clulas infectadas com vrus (Figura 8.15A); no ensaio para a
deteco de anticorpos, o material-teste o soro do paciente (Figura 8.15B). Aps a reao do
material-teste com a fase slida e a lavagem do sistema para a remoo do material que no reagiu, o
conjugado (anticorpo-enzima) adicionado. Aps a incubao e a lavagem, o substrato especfico da
enzima associado a um cromgeno (p. ex., tetrametilbenzidina TMB) adicionado. A enzima
presente no sistema ir reduzir o substrato e o produto de degradao do substrato ir oxidar o
cromgeno, resultando em uma reao colorida. Por exemplo, se a enzima utilizada no teste for
peroxidase e o cromgeno for TMB, o substrato adicionado ser H2O2; a peroxidase catalisa a
reao de desdobramento da H2O2 em H2O e O2. medida que a H2O2 reduzida, o cromgeno
oxidado, produzindo o aparecimento de cor azul. Caso a amostra seja negativa, o conjugado no ir
se ligar ao sistema e ser subsequentemente removido na etapa de lavagem. Consequentemente, o
cromgeno adicionado na etapa de revelao no ser oxidado e, portanto, no haver alterao de
cor da reao que permanecer incolor (Figura 8.15). Aps alguns minutos uma soluo de
interrupo (stopping solution), nesse caso uma soluo de H2SO4, adicionada para interromper a
reao. A adio da soluo de interrupo provoca alterao na colorao da reao, que se torna
amarela. Finalmente, o resultado do teste lido por medida da absorbncia utilizando
espectrofotmetro, em comprimento de onda adequado ao corante utilizado, nesse caso, 450 nm. No
Quadro 8.5 so mostrados exemplos de enzimas, substratos e solues de interrupo utilizados no
teste de EIA.

Figura 8.13 Teste de aglutinao do ltex (AL). Nesse teste, partculas de ltex so recobertas (sensibilizadas) com
antgenos ou anticorpos. As partculas sensibilizadas so misturadas ao material-teste. Caso haja a presena de vrus no
material colhido do paciente (A) ou anticorpos especficos contra o vrus pesquisado no soro do paciente (B), ocorrer
agregao das partculas de ltex, visvel a olho nu.

Figura 8.14 Teste de imunoperoxidase (IP). O princpio do teste de IP semelhante ao descrito para IF. Entretanto, nesse
teste, o conjugado um anticorpo ligado a uma enzima. A ligao do conjugado ao sistema revelada pela adio do
substrato especfico para a enzima. A leitura do resultado realizada pela observao do aparecimento de cor, observada
ao microscpio ptico. O teste pode ser utilizado para a pesquisa de antgenos (A) ou de anticorpos (B).

Teste imunocromatogrfico

O ensaio tambm referido como lateral flow immunochromatographic assay ou lateral flow
immunoassay, porque se baseia no fluxo lateral da amostra que ocorre por capilaridade em uma
membrana de nitrocelulose (Figura 8.16A). tambm denominado de gold-immunochromatographic
assay porque utiliza ouro coloidal ligado a um anticorpo como sistema detector. Anticorpos so
imobilizados em uma membrana de nitrocelulose formando linhas-teste (anticorpo antivrus) e
controle (anticorpo antidetector), nas quais atuam como anticorpos de captura. Para a realizao do
teste, a amostra adicionada a um local do cassete que contm um anticorpo especfico para o vrus
pesquisado conjugado a ouro coloidal (detector). Esse anticorpo diferente daquele usado na linhateste e se liga a um eptopo diferente no vrus. Se o vrus estiver presente na amostra, este ir reagir
com o conjugado (anticorpo-ouro coloidal), formando um imunocomplexo (vrus-conjugado). Esse
imunocomplexo ir migrar atravs da membrana de nitrocelulose por capilaridade e,
subsequentemente, ir reagir com o outro anticorpo vrus-especfico imobilizado na linha-teste do
cassete, produzindo uma banda visvel (devido concentrao do detector em um espao fsico
limitado), cuja densidade proporcional concentrao do vrus presente na amostra. Os conjugados
no ligados ao vrus continuam migrando at alcanar a linha-controle na qual iro reagir com
anticorpo antidetector. O teste considerado positivo se as duas linhas (teste e controle) tornam-se
visveis (Figura 8.16B); negativo se somente a linha-controle estiver visvel (Figura 8.16C); ou
invlido, se nenhuma linha se tornar visvel.
Quadro 8.5 Exemplos de enzimas, substratos e solues de interrupo utilizados no teste de EIA.
Alterao de cor
Enzima

Substrato/cromgeno

Comprimento de onda para


leitura (nm)

Soluo de
interrupo

Sem interrupo Aps interrupo

Sem
interrupo

Aps
interrupo

H 2O2/OPD

Verde/laranja

Laranja/marrom

450

492

H 2SO4 1,25M

H 2O2/TMB

Azul

Amarelo

650

450

SDS 1%

H 2O2/ABTS

Verde

Verde

414

414

Sem
interrupo

H 2O2/5AS

Marrom

Marrom

450

450

Sem
interrupo

H 2O2/DAB

Marrom

Marrom

NA

NA

Sem
interrupo

Fosfatase
alcalina

pnpp/pnpp

Amarelo/verde

Amarelo/verde

405

405

Na2CO3 2M

-galactosidase

ONPG/ONPG

Amarelo

Amarelo

420

420

Na2CO3 2M

Peroxidase

Urease

Ureia/bromocresol

Roxo

Roxo

588

588

Mertiolate a
1%

OPD = dicloridrato de O-fenilenodiamina; TMB = 3,35,5-tetrametilbenzidina; SDS = dodecil sulfato de sdio; ABTS = 2,2azino-bis [cido 3-etilbenzoltiazolina-6-sulfnico]-sal diamnio; 5AS = cido 5-aminossaliclico; DAB = 3,3- tetra-hidrocloreto
de diaminobenzidina; pnpp = paranitrofenil fosfato; ONPG = O-fenil -D-galactopiranosdeo.

Figura 8.15 Teste imunoenzimtico (EIA ou ELISA). No teste de EIA realizada uma reao colorimtrica utilizando-se
como sistema revelador um anticorpo conjugado a uma enzima, e o aparecimento de cor ocorre pela adio do substrato
especfico da enzima misturado a um agente cromognico. O teste pode ser realizado para a pesquisa de antgenos virais
ou anticorpos antivrus. Para a deteco de antgenos virais, o teste realizado em microplaca sensibilizada com
anticorpos especficos contra o vrus pesquisado e revelado pela adio do conjugado (anticorpo antivrus-enzima) e do
substrato associado ao cromgeno (A). Para a deteco de anticorpos, o teste realizado em microplaca sensibilizada
com o antgeno viral, e revelado pela adio do conjugado (anti-imunoglobulina-enzima) e do substrato associado ao
cromgeno (B).

Esse teste no requer o uso de instrumentos e conveniente para teste de amostras individuais,
com resultado disponvel em 5 a 20 min. Diversas verses comerciais esto disponveis,
particularmente para deteco de HRSV, FLUV, HAdV, HIV e rotavrus (RV). Alguns testes

disponveis no mercado fazem a deteco conjunta de mais de um vrus (p. ex., HAdV+RV ou
HRSV+FLUV). Em geral, a sensibilidade desse teste tem sido mais baixa comparado com IF, cultura
de clulas ou PCR. Contudo, os testes imunocromatogrficos de ltima gerao tm apresentado
maior sensibilidade em relao aos de primeira gerao.

Immunoblotting/Western blotting
Immunoblotting ou Western blotting (WB) um imunoensaio em suporte slido, que utiliza
antgenos virais imobilizados para detectar anticorpos contra protenas especficas. A tcnica usada
principalmente para confirmao ou teste suplementar, com o objetivo de verificar um resultado
obtido em outro teste. Kits comerciais esto disponveis para o diagnstico da infeco pelo HIV-1,
vrus da hepatite C (HCV) e HTLV. A principal vantagem do teste de immunoblotting a
possibilidade de visualizar a interao especfica do antgeno com o anticorpo. Esse teste
altamente sensvel e especfico, porm caro e pode apresentar uma avaliao subjetiva em alguns
casos.
O teste de immunoblotting mais comumente utilizado o Western blotting. Esse teste
amplamente utilizado para confirmar os resultados de EIA positivos para o HIV. O procedimento
envolve a separao das protenas virais usando o mtodo de SDS-PAGE (eletroforese em gel de
poliacrilamida contendo o detergente aninico duodecil sulfato de sdio SDS). As bandas
resultantes so transferidas para uma membrana de nitrocelulose, a qual cortada em tiras. Cada tira
serve como antgeno para um teste de Western blotting. Cada banda do antgeno presente na fita est
relacionada com uma protena do vrus intacto (Figura 8.17). Em seguida, o soro-teste (contendo
anticorpos) reage com as protenas presentes na membrana, formando o imunocomplexo (invisvel).
A presena do imunocomplexo demonstrada pela reao imunoenzimtica, usando-se anticorpo
anti-imunoglobulina humana marcado com uma enzima (conjugado) (Figura 8.18).

Figura 8.16 Teste imunocromatogrfico (lateral flow immunochromatographic assay). (A) Diagrama representativo do teste
imunocromatogrfico. A amostra-teste aplicada no cassete e migra por capilaridade atravs da membrana de
nitrocelulose at uma rea contendo anticorpos contra o vrus que se quer detectar, marcados com ouro-coloidal
(conjugado), formando o imunocomplexo que continuar migrando at a rea de captura, na qual ir se ligar a um anticorpo
de captura especfico para o vrus, formando uma linha visvel (linha T). Os conjugados no ligados a vrus continuaro
migrando at encontrar a linha contendo o anticorpo de captura controle em que se ligaro (linha C). (B) Exemplo de um
teste positivo; ambas as linhas, teste e controle, tornam-se visveis. (C) Exemplo de um teste negativo; somente a linha
controle torna-se visvel.

Figura 8.17 Teste de Western blotting (WB). Para a realizao do WB, protenas so separadas em um gel de
poliacrilamida e transferidas para uma membrana de nitrocelulose que ser utilizada como suporte para a deteco de
anticorpos. A reao revelada pela adio do conjugado formado por anti-imunoglobulina-enzima e do substrato
associado a um cromgeno.

Figura 8.18 Representao esquemtica do resultado de um teste de WB para diagnstico da infeco pelo HIV-1. Linha 1,
controle positivo; linha 2, controle negativo; linhas 3 a 6, soros positivos. Os nmeros esquerda representam o peso
molecular aproximado dos antgenos do HIV-1. Os critrios usados para interpretar um WB positivo envolvem a observao
de duas bandas p24, gp41 ou gp160/gp120.

Diagnstico molecular das infeces virais


Algumas tcnicas para a identificao de vrus no so imunolgicas e no dependem da ligao
de antgeno e anticorpo. Essas tcnicas baseiam-se na biologia molecular dos vrus, especificamente
na identificao de sequncias nicas do cido nucleico viral.
As tcnicas de biologia molecular tornaram-se imprescindveis como ferramenta para deteco
de doenas virais, monitoramento da carga viral, acompanhamento da terapia antiviral e genotipagem
de diversos vrus. No entanto, h que se ter cuidado com a interpretao dos resultados obtidos com
essas tcnicas para fins de diagnstico, pois apenas a deteco do genoma viral, algumas vezes, no
suficiente para diagnosticar uma infeco recente, pois o vrus detectado pode estar causando uma

infeco persistente produtiva assintomtica e no ser ele o agente etiolgico da doena que est
sendo pesquisada.
Em geral, essas tcnicas podem ser divididas em mtodos para deteco, genotipagem do genoma
viral, determinao da sequncia e quantificao de cido nucleico viral.
Os mtodos moleculares possibilitam aos laboratrios rapidez para detectar e identificar
previamente um patgeno de difcil cultivo ou aqueles que se apresentam em baixa quantidade na
amostra clnica. Uma das principais vantagens das tcnicas moleculares em relao aos testes
tradicionais a capacidade de estes reduzirem o tempo de deteco do agente, evitando o perodo de
janela imunolgica, tempo em que os testes sorolgicos no tm ainda sensibilidade para detectar a
soroconverso do paciente. Alguns vrus, como por exemplo, HIV e HCV, apresentam uma grande
janela imunolgica, na qual ficam indetectveis pelas metodologias tradicionais. Os testes
moleculares conseguem a diminuio desta janela; por exemplo, no caso do HIV, o teste de reao em
cadeia da polimerase associado reao de transcrio reversa (RT-PCR) capaz de diminuir a
deteco do vrus de 22 dias ps-infeco (resultado este obtido com um teste imunoenzimtico de
ltima gerao) para 11 dias. No caso do HCV, diminui de 40 dias para 15 dias.

Eletroforese em gel de poliacrilamida


A eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) utilizada para vrus de genoma segmentado,
principalmente rotavrus e reovrus, e consiste na separao dos segmentos genmicos virais pelo
tamanho molecular, utilizando gel de poliacrilamida. Esses segmentos podem ser visualizados aps
colorao do gel, geralmente por nitrato de prata. Este teste viabiliza a anlise de variaes no
genoma viral, alm de tornar possvel a observao da ocorrncia de infeces mistas (Figura 8.19).

Mtodos de amplificao do cido nucleico


Reao em cadeia da polimerase
A reao em cadeia da polimerase (polymerase chain reaction PCR) uma tcnica de
amplificao usada para sintetizar, in vitro, sequncias especficas de DNA. Inicialmente, um cido
nucleico-alvo (DNA ou RNA) isolado de tecidos, fluidos do paciente ou de cultura de clulas
infectadas. Se o cido nucleico-alvo for RNA, este deve ser convertido primeiramente em DNA
complementar (DNAc) por transcrio reversa, antes de comear o processo de amplificao (RTPCR). A partir da, o DNA amplificado enzimaticamente por PCR.
A PCR uma reao cclica que requer um molde de DNA, um tampo, os quatro
desoxinucleotdeos trifosfato dNTP (desoxiadenosina trifosfato, desoxitimidina trifosfato,
desoxicitidina trifosfato e desoxiguanosina trifosfato) , sequncias iniciadoras ou primers e a

enzima DNA polimerase. Os iniciadores so oligonucleotdeos com sequncias que so


complementares a sequncias especficas, que flanqueiam a sequncia-alvo do DNA que ser
amplificado. Os iniciadores determinam a especificidade e o tamanho do produto amplificado.
Quando os iniciadores se ligam ao DNA-alvo (hibridizao), a DNA polimerase, usando os dNTP
como substrato, inicia a replicao da sequncia-alvo (extenso). O tampo fornece as condies
adequadas para a atividade da DNA polimerase.

Figura 8.19 Eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) para a deteco de rotavrus, aps colorao com nitrato de
prata. Nessa tcnica, o cido nucleico viral extrado do espcime clnico e submetido eletroforese em gel de
poliacrilamida; a separao das bandas ocorre por diferena de peso molecular. utilizado principalmente para anlise de
vrus de genoma segmentado. Na figura, mostrada uma PAGE para anlise do genoma de rotavrus da espcie A. 1.
Amostra de rotavrus A perfil longo. 2. Amostra de rotavrus do grupo A perfil supercurto. 3. Amostra de rotavrus do grupo A
perfil curto.

Esse processo cclico repetido diversas vezes para amplificar o DNA original em progresso
exponencial. A reao realizada em um termociclador, cuja temperatura programada, aumentando
ou diminuindo, de acordo com as necessidades da PCR.
O produto amplificado denominado de amplicon. O amplicon pode ser detectado por
hibridizao com sondas especficas ou visualizado aps eletroforese em gel de agarose e colorao
com brometo de etdio.
Cada ciclo de PCR envolve 3 etapas. Na primeira, o DNA-alvo desnaturado por aquecimento
da mistura a aproximadamente 94C, por 1 min. Isso resulta na separao das fitas de DNA. Na
segunda, os reagentes so resfriados para uma temperatura entre 25 e 60C, aproximadamente, para
possibilitar a hibridizao dos iniciadores sequncia-alvo, nos stios especficos. Na terceira
etapa, a temperatura elevada para aproximadamente 72C, para tornar possvel a atividade tima

da polimerase. A DNA polimerase adiciona os nucleotdeos, resultando na duplicao e extenso da


sequncia-alvo (Figura 8.20).
Foram desenvolvidas diversas variaes da PCR possibilitando a deteco simultnea de
diversos patgenos, a automao do teste e a quantificao do produto amplificado, que so
apresentadas no Quadro 8.6. A seguir, sero descritas apenas algumas das metodologias correntes
desenvolvidas a partir da PCR inicial (PCR convencional).

Reao em cadeia de polimerase convencional no formato multiplex


Multiplex-PCR refere-se a reaes de PCR que incluem mais do que um conjunto de iniciadores,
possibilitando a deteco de mltiplos alvos, na mesma reao. A multiplex-PCR foi desenvolvida
com os objetivos de diminuir o custo da reao e aumentar a velocidade do diagnstico. J existem
protocolos de multiplex-PCR para deteco de vrus respiratrios, enterovrus, herpesvrus e muitos
outros. Tambm j existem protocolos para a deteco simultnea de vrus e protozorios (p. ex.,
vrus Epstein Barr (EBV) e Toxoplasma gondii) (Figura 8.21). Os produtos amplificados so
identificados de acordo com o tamanho do fragmento produzido na reao de PCR, visualizados aps
eletroforese em gel de agarose e colorao com brometo de etdio.

PCR em tempo real


A metodologia da PCR em tempo real (real time PCR) foi desenvolvida com o objetivo de
automatizar a PCR, tornando-a mais eficiente, rpida e segura. Nesse ensaio, possvel acompanhar
visualmente o progresso da amplificao do produto da PCR.
O acompanhamento do acmulo do produto amplificado em tempo real tornou-se possvel pela
utilizao de iniciadores, sondas ou produtos amplificados marcados com molculas fluorescentes.
Esses produtos marcados produzem uma mudana no sinal de fluorescncia aps interao direta ou
hibridizao com o produto amplificado. O sinal est relacionado com a quantidade do produto
amplificado presente durante cada ciclo de amplificao.
A curva ideal de amplificao da PCR em tempo real, quando plotada em um grfico de
intensidade de fluorescncia versus o nmero de ciclos da PCR, sigmoidal (Figura 8.22). As
amplificaes iniciais no podem ser observadas, pois a emisso de fluorescncia mascarada pelo
sinal de fundo (background). Contudo, quando h quantidade suficiente do produto amplificado, a
progresso exponencial do ensaio pode ser monitorada medida que as taxas de amplificao entram
na fase linear (FL). Em condies ideais, a quantidade de produto amplificado aumenta em uma razo
de 1 log10 a cada 3,32 ciclos. medida que os reagentes so consumidos, a reao entra em uma fase
de transio (FT) e, eventualmente, chega a uma fase de plateau (FP), na qual ocorre pouco ou
nenhum aumento na emisso de fluorescncia. O ponto em que a fluorescncia ultrapassa o limiar do
sinal de fundo chamado de limiar do ciclo ou ponto de ultrapassagem, e esse valor usado para

calcular a quantidade de produto durante a PCR em tempo real.

Figura 8.20 Reao em cadeia da polimerase (PCR). A PCR uma reao cclica de amplificao do DNA mediada por
uma polimerase DNA dependente. Inicialmente, o DNA-alvo aquecido a 94 a 96C/1 a 15 min, para desnaturao da fita
dupla. Em seguida, iniciam-se os ciclos de aquecimento (desnaturao)-hibridizao (ligao do alvo a iniciadores
especficos)-extenso (sntese de novas fitas). A quantidade do produto amplificado dobra a cada ciclo. Os ciclos so
repetidos 20 a 35 vezes ou mais e, ao final, feita uma etapa de 5 a 15 min de extenso. A reao realizada em um
termociclador e os produtos so analisados por eletroforese em gel de agarose. Caso a amostra-alvo seja RNA, realizada
inicialmente a sntese do DNA complementar (DNAc) utilizando a enzima transcriptase reversa.

Quadro 8.6 Exemplos de variaes da tcnica de PCR.


Nome

Mtodo

Vantagem

Desvantagem

Transcrio reversa associada


PCR (RT-PCR)

Na etapa inicial, o RNA


transcrito reversamente em
DNA, utilizando a enzima
transcriptase reversa

Possibilita a deteco de alvos


de RNA

Menor sensibilidade

Os iniciadores precisam ser


altamente especficos e os

Multiplex-PCR

Utiliza mltiplos pares de


iniciadores em um nico
tubo de reao

Possibilita a deteco
simultnea de mltiplos
alvos

diversos pares de iniciadores


precisam ser otimizados
para funcionar nas mesmas
condies

Touchdown PCR

Reduo progressiva da
Fornece ambiente vantajoso
temperatura de hibridizao
para a hibridizao de
dos iniciadores entre 3 e 5C
iniciadores de maior
acima do timo at 3 a 5C
afinidade no incio do ciclo,
abaixo, medida que os
reduzindo a amplificao de
ciclos progridem
contaminantes

Requer o uso de
termocicladores que
possibilitem gradiente de
temperatura

Hot-start PCR

Impede que as enzimas se


Reduz a produo de
tornem ativas at que sejam
background pela produo
alcanadas temperaturas
de produtos inespecficos
elevadas; pode utilizar
formados antes que a
modificadores ou protenas
temperatura tima seja
conjugadas ou barreira de
alcanada
cera

Requer reagentes especiais

Nested PCR

Duas reaes sequenciais de


PCR em que o segundo par
de iniciadores hibridiza em
regies internas no produto
da primeira reao

Aumenta o risco de
contaminao durante a
manipulao do produto da
primeira reao

In situ PCR (IS-PCR)

Reao de PCR realizada em


clulas fixadas com deteco Mostra a localizao do alvo
do produto por meio de
dentro da clula
microscpio

PCR em tempo real


quantitativo (Q-PCR)

Possibilita a quantificao do
alvo, reduz risco de
Observao dos resultados aps
contaminao, pois no h
Custo elevado
cada ciclo de extenso
necessidade de manipulao
do produto amplificado

Aumenta sensibilidade e
especificidade

Complexo, custo elevado

Figura 8.21 Representao esquemtica de uma eletroforese de produtos amplificados em uma multiplex-PCR, utilizando
gel de agarose corado com brometo de etdio. O esquema mostra o resultado hipottico de uma reao para deteco de
quatro vrus distintos. A identificao do vrus detectado feita pelo tamanho do fragmento amplificado. Linha 1 vrus
respiratrio sincicial humano (HRSV), 470 pb (pares de base); linha 2 metapneumovrus humano (HMPV), 601 pb; linha 3
vrus da influenza A (FLUVA), 305 pb; linha 4 adenovrus humano (HAdV), 400 pb. TM marcador de tamanho molecular,
variando de 100 a 1.500 pb.

A deteco de produtos da PCR em tempo real tem sido realizada at o momento, principalmente
por 3 mtodos. O sistema mais simples usado o que emprega o corante SYBR Green, o qual emite
fluorescncia quando se liga ao DNA de fita dupla (DNAfd). Quando o SYBR Green includo em
uma reao da PCR, a intensidade da fluorescncia proporcional quantidade do produto
amplificado (Figura 8.23A). Como o SYBR Green no se liga a um DNAfd especfico, o sinal
gerado tanto para produtos indesejveis, como dmeros de iniciadores, quanto para os produtos
esperados (Figura 8.23B). A discriminao entre os sinais pode ser obtida por meio da anlise das
curvas de dissociao, a qual tambm referida como anlise do melting point. Quando a
temperatura de dissociao (melting point) do DNAfd alcanada, o SYBR Green liberado e a
fluorescncia diminui. Essa temperatura determinada pela sequncia e pelo tamanho do produto da
PCR; assim, a distino entre o produto desejvel e o indesejvel facilmente realizada (Figura
8.23B). De maneira semelhante, possvel fazer a deteco simultnea de duas sequncias-alvo
(Figura 8.23C).
Um sistema de deteco com base na interao de sondas fluorescentes o chamado Taqman.
Este mtodo utiliza uma sonda que complementar ao segmento do produto da PCR pretendido,
localizada entre os iniciadores da reao; ela apresenta 2 pores fluorescentes: uma chamada de
apresentador (Reporter, R), localizada na extremidade 5, e a outra denominada capturador de
energia (Quencher, Q), localizada na extremidade 3. O segundo fluorocromo no deixa que a energia

luminosa usada para excitar a sonda chegue em quantidade suficiente para excitar o primeiro
fluorocromo (R). Durante a etapa de hibridizao do ciclo da PCR, a sonda com ambos os
fluorocromos est hibridizada ao DNA-alvo e, durante a etapa de extenso, a Taq polimerase, por
meio da sua atividade de 5-exonuclease, remove a sonda, liberando o fluorocromo apresentador,
viabilizando, assim, a emisso de sua fluorescncia. A fluorescncia proporcional quantidade do
produto da PCR (Figura 8.24).

Figura 8.22 Anlise da cintica da reao de PCR em tempo real. A curva ideal de amplificao da PCR em tempo real,
quando plotada em um grfico de intensidade de fluorescncia versus o nmero de ciclos da PCR, sigmoidal. Quando h
quantidade suficiente do produto amplificado, a progresso exponencial do ensaio pode ser monitorada medida que as
taxas de amplificao entram na fase linear (FL). medida que os reagentes so consumidos, a reao entra em uma fase
de transio (FT) e, eventualmente, chega a uma fase de plateau (FP), na qual ocorre pouco ou nenhum aumento na
emisso de fluorescncia. O ponto em que a fluorescncia ultrapassa o limiar do sinal de fundo chamado de limiar do
ciclo ou ponto de ultrapassagem (indicado pela linha pontilhada), e esse valor usado para calcular a quantidade de
produto durante a PCR em tempo real.

Outro sistema de deteco baseia-se no uso de sondas marcadas com 2 corantes fluorescentes que
interagem um com outro, seguindo o princpio da transferncia de energia de ressonncia fluorescente
(FRET). O sistema requer 2 sondas homlogas a pores adjacentes em uma das fitas do DNA
amplificado. As sondas so escolhidas de modo que a extremidade 5 de uma seja semelhante a
alguns nucleotdeos da extremidade 3 da outra. Essas extremidades adjacentes so capazes de emitir
fluorescncia, assim cada sonda funciona como um fluorocromo. O fluorocromo da extremidade 3
chamado de doador, e o da extremidade 5, de receptor. A propriedade desses fluorocromos que,
quando prximos, a excitao do doador conduz emisso de luz pelo receptor. Quando ambas as
sondas esto ligadas em suas sequncias-alvo, os dois fluorocromos esto prximos o suficiente para
que a excitao do receptor e a emisso de fluorescncia ocorram. A intensidade da fluorescncia
proporcional quantidade de produto da PCR (Figura 8.25).
A metodologia da PCR em tempo real representou uma contribuio significativa para o

diagnstico clnico devido rapidez com que os resultados podem ser produzidos. Essa rapidez
deve-se principalmente reduo do tempo dos ciclos de amplificao, eliminao da etapa de
deteco do produto aps a amplificao e ao uso de equipamento de alta sensibilidade para
deteco da fluorescncia.

Figura 8.23 Reao de PCR em tempo real utilizando o sistema SYBER Green. A. Esquema da reao de SYBER Green.
Quando o SYBER Green se liga ao DNA de fita dupla (DNAfd), ocorre emisso de fluorescncia. A intensidade da
fluorescncia proporcional quantidade do produto amplificado. B. Curva de melting. Exemplo de uma curva de melting
de uma reao de PCR em tempo real. Como o SYBER Green no se liga a um DNAfd especfico, o sinal gerado tanto
para produtos indesejveis (como dmeros de iniciadores) quanto para os produtos esperados. A temperatura de melting
(TM) do produto da PCR determinada pela sequncia e pelo tamanho do produto. Assim, possvel identificar o sinal de
amplificao do alvo desejado pela observao da curva de melting, em que cada produto amplificado vai apresentar um
pico de emisso de sinal de acordo com sua TM. As amostras positivas (sequncia-alvo) so agrupadas no pico 1 na
temperatura de aproximadamente 84C; o pico 2, formado na temperatura 64C, reflete os dmeros de iniciadores. C. A
anlise da curva de melting possibilita tambm a identificao de diferentes sequncias-alvo amplificadas
simultaneamente. No exemplo, mostrada uma reao em que foram amplificadas duas sequncias-alvo: a sequncia A,
com uma TM de aproximadamente 73C, e a sequncia B, com uma TM de aproximadamente 76C.

Comparado com a PCR convencional, esse ensaio apresenta vrias vantagens, tais como:
O produto da PCR monitorado dentro do tubo de reao, no h necessidade de um sistema de
deteco por separao (p. ex., gel de eletroforese)
O tempo para avaliar uma reao pode ser menor que 1 h
A chance de contaminao do produto amplificado por PCR em tempo real menor, uma vez que
no h necessidade do manuseio dos produtos amplificados
O uso de mltiplos corantes fluorescentes com comprimentos de ondas diferentes torna possvel a
deteco de mais de um produto por reao
A maior vantagem a possibilidade de quantificao, uma vez que a fluorescncia produzida
proporcional quantidade do produto amplificado.
As possveis desvantagens do uso da PCR em tempo real em comparao com a PCR
convencional seria a incompatibilidade de certas plataformas com algumas substncias fluorescentes,
assim como a restrio da capacidade da multiplex-PCR nos sistemas de tempo real disponveis no
momento. Alm disso, o custo do equipamento ainda proibitivo para laboratrios de pequeno porte.

Ensaios de amplificao de RNA


Foram desenvolvidos diversos ensaios para a amplificao direta do RNA. Esses ensaios de
amplificao com base na transcrio (transcription-based amplification) utilizam 3 enzimas, uma
transcriptase reversa (RT), uma ribonuclease (RNase) H e a T7 RNA polimerase-DNA dependente,
para amplificar a sequncia-alvo de RNA, em uma sria de reaes que mimetizam o esquema de
replicao dos retrovrus. A reao isotrmica e no requer instrumentos sofisticados. A
amplificao inicia-se com a produo de uma fita de DNA que complementar ao RNA-alvo,
utilizando um iniciador que apresenta uma sequncia promotora da T7 na terminao 5. O hbrido
RNA-DNA resultante convertido a DNA de fita dupla (DNAfd) por ao da RNase H e de um
segundo iniciador que tambm contm um promotor da T7 na terminao 5. O DNAfs resultante
funciona como molde para que a T7 faa a transcrio. O RNA recm-sintetizado funciona como
molde para os prximos ciclos da reao. Variaes dos ensaios de amplificao com base na
transcrio incluem o ensaio de amplificao mediado por transcrio (TAM, transcriptionmediated amplification), replicao autossustentada de sequncias (3SR, self-susteined sequence
replication) e amplificao a partir do cido nucleico especfico (NASBA, nucleic acid specific
based amplification). A reao de NASBA ser descrita com mais detalhes a seguir.

Figura 8.24 Reao de PCR em tempo real, utilizando o sistema Taqman. O mtodo utiliza uma sonda complementar ao
produto da PCR, a qual apresenta duas pores fluorescentes: apresentador (Reporter, R) e capturador de energia
(Quencher, Q). O segundo fluorocromo (Q) no deixa que a energia luminosa usada para excitar a sonda chegue em
quantidade suficiente para excitar o primeiro fluorocromo (R). Durante a PCR, a sonda com ambos os fluorocromos
hibridizada ao DNA-alvo, sendo posteriormente removida pela Taq polimerase. Isso libera o fluorocromo R, o que possibilita
a emisso de sua fluorescncia; esta proporcional quantidade do produto da PCR.

Figura 8.25 Reao de PCR em tempo real pelo sistema FRET. A hibridizao de sondas adjacentes resulta na
transferncia de energia de ressonncia fluorescente (FRET) devido interao entre os fluorforos doador (D) e receptor
(R). Quando ambas as sondas esto ligadas em suas sequncias-alvo, os dois fluorocromos esto prximos o suficiente
para haver a excitao do receptor e a emisso de fluorescncia. A intensidade da fluorescncia proporcional
quantidade de produto da PCR.

Reao de amplificao com base no cido nucleico especfico


A amplificao com base no cido nucleico especfico (NASBA, nucleic acid specific based
amplification) uma reao de amplificao de RNA ou DNA de fita simples que ocorre a 41C, na
qual usada uma transcriptase reversa aviria (AMV-RT), que apresenta tambm atividade de

polimerase DNA dependente, uma RNA polimerase de bacterifago (T7) e uma RNAse H. O
iniciador 1 hibridiza a um RNA ou DNA de fita simples e estendido pela AMV-TR para formar um
hbrido RNA-DNA ou DNA-DNA, seguido pela degradao da fita original de RNA pela RNAse H.
No caso do hbrido DNA-DNA, este aquecido a 100C/5 min, para a desnaturao das fitas. O
iniciador 2 hibridiza a fita simples de DNA e estendido pela AMV-RT. O DNA de fita dupla
resultante contm uma sequncia promotora da polimerase T7, a qual est codificada na sequncia do
iniciador 1, e serve como molde para a RNA polimerase T7 sintetizar RNA a partir das fitas
positivas do DNA. Esses RNA recm-formados servem como molde para a sntese do DNA
complementar pela AMV-RT. Esse ciclo amplifica a sequncia-alvo, e a incorporao e a
coamplificao de um controle interno facilitam a quantificao com a deteco do produto por
quimioluminescncia (Figura 8.26).

Mtodos de hibridizao
A tcnica baseia-se na identificao de sequncias especficas do cido nucleico viral utilizando
sondas marcadas. Sequncias complementares ao cido nucleico viral, marcadas com enzimas,
fluorescena, ou radioistopos, so comercializadas. Essas sequncias complementares marcadas so
chamadas de sondas e so capazes de se hibridizar a fitas complementares de DNA ou RNA. As
sondas podem ser usadas em diferentes formatos, em fase slida ou lquida.

Hibridizao in situ
No mtodo de hibridizao in situ, as clulas ou fragmentos de tecidos so fixados em lminas e
submetidos, mais frequentemente, ao aquecimento, para promover a desnaturao do cido nucleicoalvo, causando a separao das fitas. A seguir, a sonda adicionada, sendo hibridizada sequncia
complementar. A reao lavada para remover as sondas que no se hibridizaram e no caso de a
sonda estar marcada com uma enzima, o substrato adicionado. Aps a adio do substrato, o
esfregao examinado ao microscpio ptico para determinar se houve ou no hibridizao (Figura
8.27).

Dot blotting (DNA ou RNA), Southern blotting (DNA) e Northern blotting (RNA)
Essas so tcnicas de hibridizao para a pesquisa de cido nucleico. Na tcnica de dot blotting
ou slot blotting, a sequncia-alvo aplicada diretamente a uma membrana, sem necessidade de
separao prvia por eletroforese, e hibridizada com uma sonda marcada com radioistopo ou
enzima. O teste indicado para a anlise de um grande nmero de amostras, podendo ser realizado
diretamente do espcime clnico ou a partir do cido nucleico purificado com base na amostra. Os
testes de Southern (deteco de DNA) e Northern blotting (deteco de RNA) constituem

ferramentas valiosas para a pesquisa. Nesses testes, o cido nucleico inicialmente digerido por
enzimas de restrio e os fragmentos so separados por eletroforese e transferidos para uma
membrana de nitrocelulose. Posteriormente, esses fragmentos so hibridizados com sondas marcadas
com radioistopo ou enzima. Contudo, devido necessidade de pessoal especializado para a
realizao do teste e do tempo requerido para a obteno de resultados, esses mtodos no so
facilmente adaptveis aos laboratrios clnicos (Figuras 8.28 e 8.29).

Figura 8.26 Reao de amplificao com base no cido nucleico especfico (NASBA). A NASBA uma reao cclica de
amplificao a partir da transcrio do RNA que utiliza uma transcriptase reversa, uma ribonuclease e uma RNA
polimerase. Os iniciadores utilizados apresentam uma sequncia promotora da RNA polimerase. A reao isotrmica e
no requer instrumentos sofisticados e pode ser realizada para a amplificao de (A) RNAfs ou (B) DNAfd. TR =
transcriptase reversa.

Figura 8.27 Reao de hibridizao in situ. A tcnica detecta a presena de sequncias de DNA ou RNA especficas em
tecidos fixados a um suporte. Nesta reao, o DNA/RNA-alvo fixado a um suporte e hibridizado a sondas especficas
complementares ao alvo, marcadas com enzimas, corantes fluorescentes ou luminescentes.

Hibridizao em microarranjos (microarray hybridization)


A hibridizao de amostras de DNA-teste com sequncias gnicas especficas imobilizadas em
superfcies slidas (microarray, microchips ou microarranjos) tem se tornado uma ferramenta
importante no estudo de expresso gnica, anlise filogentica e na pesquisa de polimorfismo de
nucleotdeos.
Um DNA microarray (microarranjo de DNA) uma coleo de pontos microscpicos formados
por sequncias de DNA fixados em uma superfcie slida constituda de vidro, plstico ou silicone.
Os segmentos microscpicos de DNA fixados so denominados sondas (tambm chamados de
reporters). Milhares de sondas so ligadas ao suporte, formando um pequeno chip que ser utilizado
como plataforma para a realizao de reaes de hibridizao que possibilitaro a deteco da
sequncia ou sequncias-alvo no material analisado. As sequncias de DNA (ou DNAc) a serem
analisadas so marcadas com corantes fluorescentes e colocadas para reagir com as sequncias
fixadas na superfcie do microarranjo. Ao final da reao de hibridizao, o sistema lavado, as
amostras que no hibridizaram so removidas e a concentrao de DNA hibridizado medida pela

intensidade da emisso de fluorescncia. Dependendo da plataforma utilizada, a reao pode ser


realizada com um ou dois fluorforos. Os corantes fluorescentes Cy3 e Cy5 (corantes de cianina) so
comumente usados na marcao de DNA. Os DNA marcados e hibridizados so analisados em um
microarray scanner para a visualizao da fluorescncia aps a excitao com um raio laser de
comprimento de onda definido (Figura 8.30).
O uso de sondas representando todas as possveis variaes de sequncias de nucleotdeos
dentro da sequncia-alvo possibilita a caracterizao rpida e precisa da sequncia que est sendo
estudada. Tambm possvel a deteco de mltiplas sequncias variantes presentes no mesmo
espcime. A tecnologia de hibridizao em microarranjos tem o potencial para viabilizar a deteco
simultnea de mltiplas infeces causadas por diversos patgenos, virais ou no. A primeira
aplicao desse mtodo para diagnstico na Virologia foi para o rpido sequenciamento do HIV,
buscando mutaes que estejam associadas resistncia s drogas antirretrovirais. Em outra
aplicao, sequncias representativas de todos os outros vrus j sequenciados tm sido selecionadas
para criar um sistema capaz de descobrir um vrus ainda no conhecido. Esse ensaio foi muito til
para caracterizar o vrus da SARS (severe acute respiratory syndrome) como um novo coronavrus.
A tecnologia de microarranjos ainda no est disponvel para a rotina laboratorial de diagnstico,
porm possivelmente ser utilizada com esse fim.

Figura 8.28 Teste de dot blotting. Trata-se de um teste para pesquisa de biomolculas. No diagnstico virolgico, o dot
blotting geralmente usado para a deteco de cido nucleico. Para tal, a amostra aplicada diretamente em uma rea
delimitada (dot) de uma membrana de nitrocelulose e subsequentemente submetida reao de hibridizao com sondas
especficas.

Figura 8.29 Testes de Southern blotting e Northern blotting. Ambos os testes so reaes de hibridizao para a deteco
de DNA (Southern blotting) ou RNA (Northern blotting). O cido nucleico previamente digerido com enzimas de restrio;
os fragmentos so separados por eletroforese, transferidos para uma membrana e hibridizados a sondas especficas.

Figura 8.30 Esquema representativo de dois experimentos utilizando a reao de hibridizao em microarranjos. A.
Avaliao da expresso gnica de cultura de clulas PHFG (primary human fetal glial) infectadas com amostras de JCPyV
isoladas de pacientes com e sem leucoencefalopatia multifocal progressiva (PML). Os DNA das amostras-teste (X

clulas infectadas com uma estirpe de JCPyV isolada de paciente com PML; Y clulas infectadas com uma estirpe de
JCPyV de paciente sem PML) so marcados com corantes (Cy3 e Cy5), os quais emitem fluorescncia ao serem
excitados com raios laser em diferentes comprimentos de onda (Cy3 570 nm e Cy5 670 nm). Os DNA-teste marcados
so hibridizados ao microarray contendo sequncias-alvo (sondas) do DNA de clulas PHFG no infectadas. Cada ponto
representa um gene diferente. As amostras-teste so colocadas para hibridizar com essas sequncias conhecidas, com o
objetivo de detectar diferenas na expresso dos diversos genes durante a infeco pelo JCPyV, resultando ou no em
PML. O chip escaneado em dois diferentes comprimentos de onda, e as imagens so sobrepostas no computador. A
intensidade da fluorescncia medida e expressa nas cores verde (Cy3) ou vermelha (Cy5). Os pontos em amarelo
representam reas onde quantidades equivalentes de DNA de cada amostra foram fixadas e, portanto, apresentam igual
intensidade de cada cor (verde + vermelho = amarelo), significando que esses genes esto igualmente expressos nas
duas situaes. Os pontos em que h maior intensidade de uma ou outra amostra so predominantemente verdes ou
vermelhos. Assim, pontos verdes representam genes cuja expresso est aumentada na infeco com estirpes
associadas PML, ao passo que pontos vermelhos indicam o aumento da expresso de determinados genes em estirpes
virais no associadas PML. B. Identificao de patgeno viral causando infeco no sistema nervoso central (SNC).
Foram fixadas ao microarray sondas especficas para 13 patgenos virais associados infeco do SNC (herpes simplex
tipos 1 e 2 [HSV], varicela-zoster [VZV], Epstein-Barr [EBV], citomegalovrus humano [HCMV], herpesvrus humano tipos 6A
e 6B [HHV-6], herpesvrus humano tipo 7 [HHV-7], poliomavrus humano JC e BK [JCPyV e BKPyV], vrus do sarampo, vrus
da caxumba e enterovrus [EV]. O genoma viral foi extrado de amostra de liquor, amplificado por PCR e marcado com
corante de cianina 5 (Cy5). Em seguida, a amostra-teste foi hibridizada a um microarray contendo sequncias
especficas dos vrus pesquisados. A figura mostra os resultados obtidos para 3 pacientes: paciente 1 positivo para HSV2; paciente 2 positivo para EV; paciente 3 positivo para HCMV.

Mtodos de amplificao de sinal


Ensaio de captura de hbridos (hybrid capture assay HCA)
Testes de hibridizao esto disponveis comercialmente para a quantificao do HCMV e do
vrus da hepatite B (HBV). Nesses testes, sondas de RNA se ligam ao DNA-alvo do vrus, os
hbridos RNA-DNA resultantes so capturados por um anticorpo ligado a uma fase slida, e ento os
hbridos capturados so detectados usando anticorpo marcado com fosfatase alcalina e
quimioluminescncia. No formato quantitativo, so utilizados controles externos para produzir uma
curva de calibrao, que ser usada para determinar a concentrao de DNA na amostra-teste (Figura
8.31).

Ensaio de DNA ramificado (branched DNA bDNA)


Baseia-se na deteco de sinal em vez da deteco da amplificao da sequncia-alvo; pode ser
usado para RNA ou DNA. As amostras so adicionadas a uma microplaca sensibilizada com sondas,
que iro capturar a sequncia-alvo. Em seguida, so adicionadas outras sondas, as quais iro
hibridizar simultaneamente na sequncia-alvo e em uma sonda de DNA ramificado (bDNA). Essa
sonda de bDNA contm ramificaes que iro ligar-se a sondas conjugadas com fosfatase alcalina. A
deteco feita por incubao do complexo com um substrato quimioluminescente e posterior
medida da emisso de luz em um luminmetro. O sinal diretamente proporcional concentrao do

cido nucleico-alvo, uma vez que no h alterao no nmero de molculas-alvo. A quantificao do


DNA-alvo no espcime determinada por uma curva utilizando um padro externo (Figura 8.32).

Figura 8.31 Ensaio de captura de hbridos (HCA). Esse ensaio tem como base uma reao colorimtrica para detectar
DNA viral na amostra clnica de pacientes. Para isso, o DNA da amostra hibridizado a uma sonda de RNA e o hbrido
DNA-RNA capturado em uma microplaca. Em seguida, o DNA detectado pela adio de um anticorpo conjugado a uma
enzima e a um substrato luminescente, anticorpo esse capaz de se ligar ao hbrido DNA-RNA.

Figura 8.32 Ensaio de DNA ramificado (bDNA). O cido nucleico hibridizado a dois tipos de sondas: uma sonda de
captura est ligada ao suporte e serve para fixar o alvo superfcie da microplaca; a segunda sonda contm uma regio
complementar sequncia-alvo e a outra regio complementar sonda de DNA ramificado (bDNA). Cada molcula de
bDNA contm diversos stios de ligao sonda amplificadora marcada com fosfatase alcalina. A reao revelada por
adio de substrato luminescente.

Tipagem e comparao do genoma viral


A caracterizao molecular com o propsito de tipagem nem sempre relevante para o
tratamento do paciente, mas utilizado principalmente para estudos epidemiolgicos, investigao
da patognese e progresso da doena. Os mtodos mais utilizados so os seguintes:

Determinao da sequncia do cido nucleico viral


Uma vez que o genoma viral foi detectado, a determinao da sequncia pode ser realizada para
relacionar 2 ou mais estirpes virais na investigao da possibilidade de reao cruzada (HBV, HCV)

e para direcionar a terapia (HIV). Nos testes de genotipagem do HIV para determinao de
resistncia a antirretrovirais, a sequncia da transcriptase reversa e a da protease viral so
determinadas e comparadas com o vrus selvagem. Embora o potencial para os testes de resistncia
para HIV seja limitado pela falta de evidncias do benefcio clnico, custo e conhecimentos
necessrios para uma boa interpretao, com a elevao dos ndices de resistncia aos
antirretrovirais para o HIV, esses testes podem ter uma aplicao potencial em algumas reas como
escolha da primeira linha de terapia, adaptao da terapia, profilaxia ps-exposio e preveno da
transmisso vertical (Figura 8.33).

Reao de polimorfismo de fragmentos do DNA em gel de agarose aps eletroforese


(restriction fragment length polymorphism analysis RFLP)
O stio de clivagem do DNA por enzimas de restrio dependente da sequncia. A presena de
mutaes em um potencial stio de clivagem resulta em padres diferentes de fragmentao do
genoma quando esses fragmentos so separados em gel de agarose. A reao de RFLP requer grande
quantidade de DNA purificado direto da amostra ou amplificado inicialmente por PCR. Os
resultados so revelados como padres de migrao de bandas em um gel de agarose corado com
brometo de etdio. Uma limitao da tcnica o fato de uma mutao somente ser detectada se esta
ocorrer em um stio de reconhecimento da enzima usada. Como as enzimas de restrio apenas so
capazes de clivar DNA, para os vrus de RNA, necessrio realizar uma etapa de RT-PCR antes da
digesto enzimtica (Figura 8.34).

Southern blotting
A reao de Southern blotting uma modificao da reao de RFLP em que o DNA viral
digerido por enzimas de restrio e os fragmentos so submetidos a uma eletroforese em gel de
poliacrilamida, transferidos para uma membrana de nitrocelulose e hibridizados com sondas
marcadas com radioistopos contra todo o genoma ou apenas uma regio especfica. Esse teste j foi
descrito anteriormente (Figura 8.29).

Figura 8.33 Sequenciamento do genoma viral. O sequenciamento de cidos nucleicos baseia-se na sntese de uma fita de
DNA complementar feita por uma polimerase DNA dependente, na presena de sequncias iniciadoras complementares ao
alvo, 2-deoxinucleotdeos (dNTP) e 2,3-dideoxinucleotdeos (ddNTP), que funcionam como terminadores da sntese. Uma
vez obtida a sequncia complementar, feita a anlise computacional dos resultados, a qual possibilita a identificao e a
caracterizao do genoma-alvo.

Figura 8.34 Reao de polimorfismo de fragmentos de DNA em gel de agarose aps eletroforese (RFLP). O teste tem
como base o reconhecimento de sequncias especficas no DNA por enzimas de restrio. O DNA-alvo submetido
digesto com enzima de restrio e os fragmentos resultantes so separados por tamanho por meio de eletroforese em
gel de agarose. A presena de mutaes nos stios de reconhecimento da enzima possibilita a identificao de variantes
(ou mutantes). Na figura, mostrada uma situao fictcia em que 3 estirpes virais so analisadas: A, WT estirpe
selvagem; B e C, MT mutantes. O DNA viral foi digerido por enzimas de restrio e, posteriormente, submetido
eletroforese. Nota-se um perfil de migrao distinto entre a estirpe selvagem (que apresenta 2 stios de clivagem) e as
variantes B e C (com 1 e 3 stios, respectivamente).

Hibridizao reversa
A hibridizao reversa (RH, reverse hybridization; ou LIPA, line probe assay) baseia-se em um
sistema em que os produtos das amostras-teste amplificados na PCR so hibridizados em sondas
especficas fixadas em linhas paralelas em fitas de membrana de nilon. Em um teste desenvolvido
para tipagem de HCV, o RNA viral amplificado por RT-PCR com iniciadores biotinilados. Os
produtos da PCR so hibridizados a sondas em fitas, e os hbridos so detectados com estreptavidina
conjugada fosfatase alcalina. A reao do fragmento amplificado com uma sonda especfica resulta
na formao de linhas visveis na fita, possibilitando a identificao do subtipo de HCV (Figura
8.35).

PCR-ELISA ou DNA-EIA
Nessa tcnica, tambm conhecida como DEIA, o produto da PCR marcado com um reporter (p.
ex., digoxigenina); a seguir, esse produto desnaturado e hibridizado a sondas especficas

complementares a uma regio conservada da sequncia-alvo, que esto fixadas em uma microplaca.
Os hbridos so detectados com um anticorpo contra o reporter (antidigoxigenina) conjugado com
enzima e revelado por adio do substrato (ver teste de EIA) ou conjugado a um corante fluorescente
revelado por quimioluminescncia (ver teste de bDNA). Uma variao do formato do teste a
marcao do produto da PCR com um ligante (p. ex., biotina), a fixao do produto a uma placa
sensibilizada com avidina, e a hibridizao destes produtos a sondas especficas complementares a
uma regio conservada da sequncia-alvo e marcadas com um reporter. Finalmente, os hbridos so
detectados pela reao enzimtica ou quimioluminescncia (Figura 8.36).

Figura 8.35 Reao de hibridizao reversa (RH ou LIPA). Esta uma reao de amplificao em que sondas so fixadas
em linha a uma membrana de nilon. O genoma viral inicialmente amplificado por PCR usando iniciadores marcados
com biotina. Posteriormente, so hibridizados s sondas presentes na membrana e a reao revelada por adio de
estreptavidina e fosfatase alcalina.

Anlise do polimorfismo da conformao de DNA de fita simples


A substituio de um nico nucleotdeo suficiente para causar alterao na mobilidade de um
fragmento de DNA de fita simples em um gel de poliacrilamida neutro. Inicialmente, a conformao
de DNA de fita simples (single stranded conformation polymorphism SSCP) foi realizada a partir
dos fragmentos da reao de RFLP do DNA genmico da amostra-teste, desnaturados por tratamento
com lcali e submetidos eletroforese em gel de poliacrilamida neutro, sendo a mobilidade
comparada com uma amostra padro. Posteriormente, foram feitas modificaes para acomodar a

amplificao de segmentos especficos do genoma mutante e do padro por PCR, seguidas de


desnaturao e separao no gel. Se a mutao estiver presente no segmento do genoma que est
sendo testado, o segmento ir correr em uma posio diferente no gel em relao amostra padro.
Essa tcnica utilizada para anlise de adenovrus, parvovrus, HBV e HCV (Figura 8.37).

Ensaio da mobilidade do heterodplex


A mobilidade de heterodplex (heteroduplex mobility assay HMA) baseia-se na caracterstica
de fitas duplas de DNA migrarem, em gel no desnaturante, de acordo com a complementaridade
entre as fitas. Fitas apenas com pares A-T e C-G migram mais rapidamente que fitas de mesmo
tamanho contendo erros de pareamento. Heterodplex so formados quando duas molculas de DNA
de fita simples no idnticas, mas estritamente relacionadas, hibridizam. Tais molculas tero
distores por erros de pareamento e bases no pareadas, quando delees ou inseres acontecem.
Essas distores estruturais provocam um retardamento da migrao do heterodplex em relao ao
homodplex em eletroforese em gel de poliacrilamida. A extenso desse retardamento proporcional
ao grau de divergncia entre as duas sequncias. Quando as fitas que hibridizam so idnticas,
formam homodplex e migram com mais facilidade pelo gel de poliacrilamida, ao contrrio de
molculas heterodplex, que tm sua estrutura alterada. A divergncia entre as sequncias deve ser
maior que 1 a 2% e menor que 25 a 30%, para que haja um retardamento mensurvel. Na prtica,
improvvel que duas sequncias com mais que 35% de divergncia (ou menos que 65% de
similaridade) hibridizem e formem heterodplex (Figura 8.38).

Figura 8.36 Reao de PCR-ELISA (DNA-EIA). A. Exemplo fictcio de um teste de PCR-ELISA para a deteco de herpes
simplex (HSV) em liquor. As amostras-teste foram submetidas amplificao por PCR, utilizando iniciadores marcados
com digoxigenina (reporter). Os produtos foram fixados a uma microplaca sensibilizada com uma sonda especfica para
HSV. Em seguida, foi adicionado um anticorpo antidigoxigenina conjugado a uma enzima (conjugado anti-reporter).
Finalmente, foi adicionado o substrato da enzima associado a um cromgeno. Na amostra positiva para HSV, houve
aparecimento de cor; na amostra negativa, a reao permaneceu incolor. B. Exemplo fictcio de um teste de PCR-ELISA
para genotipagem de rotavrus da espcie A (RVA). As amostras-teste foram submetidas amplificao por PCR utilizando
iniciadores de consenso (marcados com biotina), para todos os gentipos de RVA. Os produtos foram fixados a uma
microplaca sensibilizada com avidina. Em seguida, foram adicionadas sondas especficas para o gentipo G1 de RVA,
ligadas digoxigenina (reporter). Finalmente foi adicionado o substrato da enzima associado a um cromgeno. Na amostra
positiva para RVA-G1, houve aparecimento de cor; na amostra negativa, a reao permaneceu incolor.

Figura 8.37 Reao de anlise do polimorfismo da conformao do DNA de fita simples (SSCP). O ensaio de SSCP
utilizado em Virologia para anlise de variantes virais. O teste baseia-se na mobilidade dos fragmentos de DNA de fita
simples; alteraes pontuais na sequncia nucleotdica do DNA induzem alteraes no perfil de migrao.

Quantificao do cido nucleico viral


A quantificao do cido nucleico viral, tambm chamada de determinao da carga viral, tem se
tornado um tema importante na Virologia Clnica devido sua utilizao como indicador de
prognstico, resposta terapia antiviral e risco de transmisso.

Figura 8.38 Ensaio de mobilidade do heterodplex (HMA). Nesse ensaio analisada a divergncia entre duas sequncias
de DNA pelo perfil de migrao de hbridos DNA-DNA por meio de eletroforese em gel de poliacrilamida. As amostras so
amplificadas por PCR, os produtos so desnaturados, misturados e hibridizados, resultando na formao de homodplex
(formados pelo pareamento de duas molculas de DNA de fitas simples idnticas) e heterodplex (formados pelo
pareamento de 2 molculas de DNA de fitas simples no idnticas). Os heterodplex migram mais lentamente na
eletroforese em virtude das distores da fita induzida pelos erros de pareamento. Na figura, mostrada uma anlise
fictcia para a identificao do sorotipo de duas (A e B) estirpes de adenovrus humano (HAdV) por HMA. O DNA viral foi
amplificado por PCR, desnaturado e hibridizado com uma amostra de referncia de HAdV do sorotipo 4. A amostra A
formou homodplex com o vrus de referncia indicando que pertence ao mesmo sorotipo; a amostra B formou
heterodplex com o vrus de referncia indicando divergncia entre as sequncias logo, no pertencem ao mesmo
sorotipo.

Potenciais indicaes
Indicador de prognstico
A quantificao do genoma viral como indicador de prognstico est bem estabelecida para HIV.
H demonstraes de que os nveis plasmticos de RNA viral so correlacionados aos estgios da
doena e que aqueles com baixos nveis de HIV-1 no plasma permanecem assintomticos e saudveis
por longos perodos. Demonstrou-se tambm que a carga viral logo aps a soroconverso pode
predizer a progresso da AIDS. A dosagem da carga viral tambm tem sido til em predizer a doena
por HCMV aps transplante, sendo considerada mais til que a determinao qualitativa. Alm
disso, a carga viral de HCMV um fator preditivo de sobrevida nos estgios avanados da AIDS. A
carga viral do EBV no plasma e sangue perifrico pode predizer o desenvolvimento de distrbios
proliferativos ps-transplante.

Avaliao da resposta teraputica


A quantificao do genoma viral como um indicador da resposta teraputica mais bem
compreendida em relao ao HIV, para o qual a terapia tem como meta a reduo dos nveis
plasmticos de RNA viral para nveis indetectveis pelo maior tempo possvel.

Avaliao do risco de transmisso viral


A quantificao do genoma viral para a avaliao do risco de transmisso, embora no seja
utilizada com frequncia no momento, pode se tornar importante no futuro. geralmente aceito que o
risco de transmisso de um vrus aumenta com nveis elevados de vrus nos fluidos corporais. Por
exemplo, a transmisso do HCV da me para o filho mais provvel de acontecer quando os nveis
maternos de RNA viral no sangue so maiores que 106 cpias do genoma/ml. Acredita-se que a
transmisso ocorra no momento do nascimento, e evidncias demonstram que os ndices de
transmisso so mais baixos em cesarianas em comparao com o parto normal.
A respeito da transmisso vertical do HIV-1, tem sido demonstrado que, embora
inconsistentemente, nveis elevados de RNA viral no plasma materno aumentam o risco de infeco

fetal, e isso consistente com a eficcia da zidovudina na reduo da transmisso materno-fetal do


HIV-1. Carga viral plasmtica elevada parece induzir a um maior risco de transmisso heterossexual
por via sexual.

Mtodos para a quantificao do cido nucleico viral


PCR competitiva e no competitiva
A PCR competitiva baseia-se na quantidade relativa de produto gerado a partir de uma
quantidade de sequncia-alvo em relao a uma quantidade conhecida de um DNA ou RNAcompetitivo introduzido em uma srie de alquotas iguais da amostra-teste. O DNA-competitivo
parecido com o DNA-alvo, porm, difere geralmente no tamanho do fragmento ou na composio do
cido nucleico, pela introduo de uma deleo interna ou rearranjo da sequncia. Isso serve como
um controle interno em todas as etapas da amplificao. A quantificao do DNA-alvo realizada
por determinao da concentrao na qual quantidades iguais dos produtos dos DNA, competitivo e
alvo, tenham acumulado e os sinais sejam idnticos. O sinal pode ser medido de vrias maneiras,
incluindo: colorao do produto da PCR por brometo de etdio; marcao do produto amplificado
com radioistopo; captura e anlise do gel por computao; uso de sondas marcadas com
fluorescncia ou quimioluminescncia; tcnicas colorimtricas envolvendo EIA ou, ainda,
cromatografia lquida (Figura 8.39).

Figura 8.39 Diagrama da quantificao de DNA em um teste de PCR competitivo quantitativo, utilizando quantidades
crescentes de um DNA-competidor. A quantificao do DNA-alvo realizada por determinao da concentrao na qual
quantidades iguais dos produtos dos DNA, competitivo e alvo, apresentem a mesma intensidade de banda e os sinais
sejam idnticos.

Na PCR no competitiva, utilizado um controle interno que apresenta o mesmo stio de ligao
do iniciador que o DNA ou RNA-alvo, mas difere na sequncia interventora usada para detectar o
produto amplificado. O controle interno adicionado em uma quantidade de nmero de cpias

conhecida. Com esse mtodo, a sequncia de ambos, alvo e controle interno, coamplificada com
igual eficincia e detectada por meio de sondas que apresentam stios diferentes de ligao. O
controle interno incorporado em todas as reaes para monitorar a eficincia da preparao e
amplificao da amostra e calcular a quantidade do cido nucleico detectado.

PCR em tempo real


A PCR em tempo real j foi descrita e discutida anteriormente. Atualmente, a metodologia de
escolha para a quantificao de cido nucleico. Este ensaio caracterizado por uma elevada
sensibilidade tcnica (< 5 cpias) e elevada preciso (< 2% desvio padro). A quantificao do
nmero de cpias do genoma presentes na amostra obtida aps anlise dos valores da amplificao
plotados em um grfico de intensidade de fluorescncia versus nmero de ciclos da PCR (Figura
8.23).

Metagenmica e descobrimento de novos vrus


As infeces virais representam uma ameaa constante para a populao humana. A despeito da
evoluo significativa do diagnstico virolgico nas ltimas dcadas, acredita-se que exista um
nmero significativo de patgenos virais ainda no identificados que podem potencialmente causar
novas doenas ou estar associados a doenas infecciosas conhecidas, cujo agente etiolgico ainda
no foi identificado. Existe ainda a ameaa real da adaptao de novos vrus espcie humana. Um
problema basal na descoberta de novos vrus a limitao da tecnologia disponvel. Claramente, ao
longo da histria, a descoberta de novos vrus est vinculada a grandes avanos tecnolgicos (ver
Captulos 1 e 2). Por muito tempo, nas estratgias para descoberta de novos vrus, utilizaram-se
tecnologias clssicas, tais como microscopia eletrnica, cultura de clulas e mtodos sorolgicos.
Embora essas abordagens tenham resultado na descoberta de diversos agentes, elas apresentam
limitaes metodolgicas; por exemplo, a necessidade de ttulos muito elevados de vrus para a
visualizao ao microscpio eletrnico, muitos vrus no propagam em cultura de clulas ou
apresentam requerimentos muito especficos quanto ao tipo celular e s condies de cultivo e a
necessidade de reagentes especficos para os testes sorolgicos.
O desenvolvimento dos testes moleculares de primeira gerao (p. ex., PCR convencional e
sequenciamento de Sanger) foi um marco fundamental para a descoberta de novos agentes. Entretanto,
estas metodologias ainda so limitadas, pois no existe uma sequncia universal do genoma viral,
semelhante ao RNA ribossomal 16S de bactrias, que possibilite a amplificao e/ou
sequenciamento de um vrus desconhecido.
Desde o ano 2000, a aplicao de metodologias de metagenmica levou acelerao do
processo de descoberta de novos vrus e, subsequentemente, sua associao ou no a doenas
infecciosas. A metagenmica a denominao dada anlise do pool genmico (metagenoma) do

grupo de microrganismos de um determinado ambiente por tcnicas independentes de cultivo.


A tendncia da Virologia Clnica moderna tem sido a substituio gradual dos mtodos
tradicionais de descoberta de vrus por novas tecnologias de biologia molecular. Contudo, as
tcnicas tradicionais e as novas metodologias para isolar, identificar e caracterizar vrus se
complementam na descoberta de novos vrus. Dois tipos de mtodos moleculares tm sido usados
para a descoberta de vrus: os sequncia-dependentes e os sequncia-independentes. A seguir, so
apresentados exemplos desses mtodos.

Hibridizao em microarranjos
Detalhes desta metodologia foram apresentados anteriormente neste captulo. Dois tipos de
protocolos da metodologia de hibridizao em microarranjos so usados na identificao de vrus. O
primeiro utiliza sondas curtas (sensveis a um nico erro de pareamento [mismatch]) para a deteco
de tipos ou subtipos de vrus conhecidos; por exemplo, na diferenciao dos herpesvrus humanos, na
genotipagem de rotavrus ou na deteco de vrus respiratrios. O segundo tipo de microarranjos
emprega sondas longas (60 a 70 pb), o que pode levar ocorrncia de erros de pareamento,
denominados virochip, virus chip ou panvirus DNA microarray. O espectro de vrus detectveis
nessa tcnica est teoricamente limitado disponibilidade de sequncias que podem ser includas no
chip. A aplicao dessa tecnologia resultou na descoberta de diversos vrus de seres humanos e de
animais. Em Virologia Humana, a aplicao da hibridizao em microarranjos possibilitou a
caracterizao do SARS-CoV vrus isolado em cultura de clulas Vero a partir de secreo
respiratria de um paciente com SARS; a descrio de um novo gamarretrovrus (XMRV, xenotropic
murine related virus) em tumor de prstata; e um novo cardiovrus relacionado com o vrus da
encefalomielite de murino (TMEV, Theilers murine encephalomyelitis virus) no trato
gastrointestinal de indivduos com diarreia.

PCR degenerada
Detalhes da metodologia de PCR foram apresentados anteriormente neste captulo. A PCR
baseia-se na hibridizao de iniciadores especficos complementares sequncia-alvo. Por essa
razo, o conhecimento prvio da sequncia do genoma do patgeno um pr-requisito para o
estabelecimento de um protocolo de PCR para diagnstico, o que limita o uso da metodologia na
descoberta de novos vrus. Uma alternativa a utilizao de iniciadores que hibridizam em regies
altamente conservadas na sequncia de vrus relacionados. Como essas regies quase nunca so
completamente conservadas, os iniciadores normalmente so degenerados (mistura de iniciadores
similares, mas no idnticos), o que possibilita a hibridizao com todas as variantes, ou as mais
comuns, da sequncia conservada. Tal metodologia tornou possvel a identificao de diversos vrus

incluindo o hantavrus Sin Nombre.

Amplificao sequncia-independente com um nico iniciador (SISPA, sequenceindependent single primer amplification)
Esse mtodo utilizado para amplificao e identificao de cido nucleico viral desconhecido a
partir de espcimes clnicos e ambientais. A SISPA foi originalmente descrita em 1991 para
identificao de cido nucleico de sequncias virais desconhecidas presentes em pequenas
quantidades na amostra. O mtodo original envolvia digesto do DNA por endonucleases, seguido de
ligao direta de uma sequncia denominada de adaptador nas duas terminaes da molcula de
DNA. A sequncia do adaptador torna possvel a amplificao por PCR por meio de um iniciador
complementar a esta. Aps a amplificao, esses fragmentos so visveis em um gel de agarose e
podem ser clonados e sequenciados. O protocolo original foi posteriormente adaptado para:
amplificao de RNA e DNA; aumento da concentrao de vrus na amostra por ultracentrifugao;
remoo de clulas e mitocndrias por filtrao e remoo de DNA contaminantes por digesto com
DNAse, que ir degradar DNA livre sem destruir o genoma viral protegido pelo capsdeo (DNAseSISPA) (Figura 8.40). Novos vrus de seres humanos e de animais foram descritos usando essa
metodologia; dentre os vrus de seres humanos descobertos inclui-se o vrus da hepatite E (HEV).

VIDISCA
A VIDISCA (virus discovery cDNA-amplified fragment length polymorphism, AFLP) uma
variao da DNAse-SISPA. As etapas iniciais do processo so as mesmas: ultracentrigufao,
tratamento com DNAse, purificao do cido nucleico, digesto do DNA por enzimas de restrio,
ligao a um adaptador e amplificao por PCR. Em seguida, realizada uma segunda reao de
PCR, utilizando todas as combinaes possveis de quatro iniciadores; cada iniciador contm 1 a 3
nucleotdeos adicionais na terminao 3 da sequncia dos iniciadores usados no primeiro PCR.
Existem 16 possveis combinaes (44) de iniciadores se cada iniciador for acrescido de somente 1
nucleotdeo; desse modo so realizadas 16 reaes da segunda PCR. Esse processo simplifica o
padro de bandas observadas na eletroforese em comparao com a DNAse-SIPSA, visto que cada
reao contm apenas 1/16 do nmero de fragmentos amplificados (Figura 8.40). O coronavrus
NL63 um exemplo de patgeno descoberto pela aplicao dessa estratgia.

PCR randmica/RAP-PCR
Este mtodo (PCR, random arbitrary primed) comumente utilizado para amplificao e
marcao de sondas com corantes fluorescentes para anlises de microarranjos; contudo, tambm

utilizado para a descoberta de novos vrus. A RAP-PCR no requer a etapa de ligao a um


adaptador ou a utilizao de um par de iniciadores (senso e antissenso) por reao; na RAP-PCR,
so utilizados 2 iniciadores em 2 reaes separadas. O iniciador utilizado na primeira reao
apresenta uma sequncia definida na terminao 5, seguida de uma sequncia hexamrica ou
heptamrica degenerada na terminao 3. A segunda reao realizada com um iniciador
complementar sequncia 5 do iniciador da primeira reao, possibilitando a amplificao do
produto da primeira PCR e subsequente caracterizao por sequenciamento. Atualmente, esta a
metodologia mais comumente usada na descoberta de novos vrus, tais como: poliomavrus humanos
KI e WU; bocavrus humanos 2 e 3 (HBoV-2 e HBoV-3); salivrus (SaliV); parechovrus humano
(HPeV-7); vrus do papiloma humano 116 (HPV116), entre outros.

Anlise de diferena representacional


A anlise de diferena representacional (RDA, representational difference analysis) combina a
hibridizao subtrativa com a amplificao genmica e identifica diferenas na sequncia entre duas
amostras relacionadas. A hibridizao subtrativa consiste na remoo de sequncias nucleotdicas
comuns das duas amostras, deixando as sequncias distintas intactas, com a amplificao do alvo. A
tcnica utiliza duas fontes de cido nucleico, denominadas teste ou tester e condutor ou driver, em
que apenas a amostra-teste contm a sequncia patognica. O DNA em ambas as amostras digerido
por endonucleases e sequncias adaptadoras so ligadas aos fragmentos de DNA somente da
amostra-teste. Os fragmentos digeridos das 2 amostras so misturados, desnaturados e hibridizados,
resultando em 3 tipos de molculas: teste/teste, teste/condutor, condutor/condutor. A seguir, feita a
etapa de amplificao utilizando iniciadores para as sequncias adaptadoras. A molcula teste/teste
ser preferencialmente e exponencialmente amplificada, j que apresenta as sequncias adaptadoras
nas 2 extremidades; a molcula teste/condutor, que contm apenas o adaptador em uma das fitas, ser
amplificada linearmente e, posteriormente, removida por digesto enzimtica; a molcula
condutor/condutor no contm o adaptador e no ser amplificada. Como a concentrao da molcula
teste foi significativamente aumentada com este processo, esta agora poder ser sequenciada e o
patgeno ser identificado (Figura 8.41). A RDA tem limitaes, pois precisa que as duas fontes
(teste e condutor) de DNA apresentem elevada similaridade nucleotdica. Contudo, a despeito das
limitaes, o uso da RDA possibilitou a identificao do herpesvrus humano tipo 8 (HHV-8), o vrus
torque teno (TTV) e as variantes do vrus da hepatite G (GBV-A e GBV-B).

Figura 8.40 Fluxograma geral da estratgia de DNAse-SISPA. A amostra inicialmente tratada para purificao do cido
nucleico viral. Se a amostra for constituda de DNA de fita simples (DNAfs), dever ser realizada a sntese da segunda fita;
se a amostra for de RNA, dever ser realizada a sntese do DNA complementar (DNAc) e a sntese da segunda fita. Uma
vez que tenha sido produzido o DNA de fita dupla (DNAfd), este ser digerido por enzimas de restrio. Os fragmentos
produzidos sero ligados a sequncias adaptadoras e submetidos amplificao por PCR; os produtos da PCR so
sequenciados diretamente ou clonados e, posteriormente, sequenciados. Uma variao desta metodologia utiliza uma
segunda reao de PCR com iniciadores modificados na terminao 3 (VIDISCA), reduzindo o nmero de fragmentos
amplificados por reao e simplificando a anlise (ver texto).

Amplificao em crculo rolante


A amplificao em crculo rolante (rolling circle amplification, RCA), tambm denominada de
multiple displacement amplification ou whole genome amplification, utiliza iniciadores randmicos
e a polimerase do fago phi29 (29). Essa enzima exibe elevado grau de processamento

(aproximadamente 70.000 nucleotdeos), atividade de correo (proofreading) e capacidade de


deslocar a fita recm-sintetizada e continuar o processo de sntese de novas fitas. Quando a enzima
completa um crculo no genoma viral, ela desloca a fita e continua o processo mltiplas vezes.
Iniciadores randmicos se ligam fita deslocada que agora usada como molde para novas fitas,
que, ao final, convertida em DNA de fita dupla (Figura 8.42). Os produtos da amplificao, longos
concatmeros lineares de fita dupla de genomas virais, podem ser digeridos por enzimas de restrio
e visualizados por eletroforese em gel de agarose e, subsequentemente, clonados e caracterizados
por sequenciamento. Os poliomavrus humanos tipos 6 (HPyV6) e 7 (HPyV7) e o HBoV-1 foram
descobertos por meio dessa metodologia.

Mtodos de sequenciamento
A maioria dos mtodos descritos anteriormente gera produtos que precisam ser definitivamente
identificados por sequenciamento. Os estudos iniciais de metagenmica de vrus utilizavam o mtodo
de Sanger (tambm denominado de mtodo de terminao de cadeia ou sequenciamento dideoxi), que
se baseia na sntese de uma fita de DNA complementar feita por uma polimerase DNA dependente, na
presena de 2-deoxinucleotdeos (dNTP) e 2,3-dideoxinucleotdeos(ddNTP); este ltimo funciona
como terminador da sntese. Uma limitao desse mtodo a necessidade de clonagem do genoma
viral antes do sequenciamento, embora tambm possam ser utilizados produtos de PCR.

Figura 8.41 Anlise de diferena representacional (RDA). So utilizadas 2 amostras: o teste (contendo o patgeno
pesquisado) e o condutor (amostras geneticamente relacionadas). O DNA digerido por enzimas de restrio; o teste
ligado a um adaptador. As duas amostras so misturadas, desnaturadas e hibridizadas, resultando na formao de 3 tipos
de molculas: teste/teste, teste/condutor, condutor/condutor. Essas molculas so submetidas amplificao por PCR,
utilizando um iniciador complementar sequncia do adaptador. A molcula teste/teste ser amplificada preferencialmente
e exponencialmente.

Atualmente, o mtodo de Sanger vem sendo parcialmente substitudo por novas tecnologias
comumente referidas como a prxima gerao de sequenciamento (next generation sequencing;
NextGen ou NGS) ou sequenciamento de alto rendimento (HTS, high throughput sequencing). O
termo aplicado a novas tecnologias de sequenciamento capazes de produzir sequncias centenas ou
milhares de vezes mais barato e mais rapidamente em comparao com as abordagens tradicionais.
Trs plataformas so amplamente utilizadas nos estudos de metagenmica: a 454 pyrosequecing
(Roche Applied Sciences), Solexa (Illumina) e SOLiD system (Applied Biosystems).

Plataforma 454 de pirossequenciamento


Essa plataforma tem como base o sequenciamento por sntese que utiliza um processo
denominado pirossequenciamento. Esse processo realizado por meio de uma reao complexa, que

inclui enzima (ATP sulfatase e luciferase) e substratos (adenosina 5-fosfossulfato e luciferina), de


maneira que o grupo pirofosfato liberado aps a adio dos nucleotdeos resulta na emisso de luz
detectvel. Assim, quando um nucleotdeo incorporado em uma cadeia nascente de DNA pela
atividade da DNA polimerase, o pirofosfato formado de modo estequiomtrico, resultando na
produo de ATP. O ATP produzido induz a converso enzimtica da luciferina e emisso de ftons.
No sistema 454, o DNA fragmentado e ligado a uma sequncia adaptadora biotinilada, e passa a
denominar-se linker. O complexo DNA/linker ento ligado a uma microesfera recoberta com
estreptavidina que ancora o DNA dentro de um microambiente contendo gua, leo e reagentes da
PCR. Cada fragmento amplificado inicialmente para produzir a sequncia-alvo para a reao de
sequenciamento; este realizado por hibridizao do iniciador ao linker, seguido da incorporao de
nucleotdeos pela DNA polimerase.

Plataforma solexa
Essa plataforma tambm baseia-se no sequenciamento por sntese, utilizando o processo de PCR
em fase slida para a amplificao do DNA-alvo. O mtodo utiliza a fragmentao do DNA-alvo e a
ligao dos fragmentos a sequncias adaptadoras. Os adaptadores ligados a um suporte slido atuam
como iniciadores para a DNA polimerase incorporar os nucleotdeos de terminao reversveis,
sendo cada nucleotdeo (G, C, A, T) marcado com um corante fluorescente diferente.

Figura 8.42 Amplificao em crculo rolante (RCA). O teste utiliza iniciadores randmicos e a polimerase do fago phi29
(29). Inicialmente, o DNA de fita simples (DNAfs) viral (preto) ligado a um adaptador (verde) fosforilado na terminao 3;
se a amostra for DNA de fita dupla (DNAfd), deve ser previamente desnaturada; se for RNA, deve ser produzido o DNAc e a
fita de RNA inicial deve ser removida por ao da RNAse. Em seguida, feita uma reao com uma ligase para circularizar
o DNA. ento realizada a amplificao utilizando iniciadores randmicos (marrom) e a polimerase 29 (magenta). Por
serem randmicos, os iniciadores vo hibridizar em diferentes stios do genoma simultaneamente, e a sntese iniciada
em todos esses stios. Quando a enzima completa um crculo no genoma viral, ela desloca a fita e continua o processo
mltiplas vezes. Como os iniciadores continuam presentes na reao, estes se ligam s fitas que foram deslocadas e elas
tornam-se moldes para a sntese de novos DNA. Os produtos finais so longos concatmeros de DNAfd, os quais sero
digeridos por enzima de restrio, liberando os monmeros de DNA viral, que podem ser clonados e sequenciados.

Plataforma SOLiD
No caso da plataforma SOLiD (supported oligonucleotide ligation and detection platform), o

preparo da amostra e amplificao por PCR semelhante plataforma 454: fragmentao do DNA,
ligao a um adaptador e fixao a uma microesfera. As microesferas so ento colocadas
randomicamente em um chip e o sequenciamento realizado por ciclos de hibridizao com
iniciadores e sondas marcadas com diferentes corantes fluorescentes.
A aplicao de metodologias de sequenciamento de alto rendimento para analisar bibliotecas de
DNAc foi utilizada na descoberta do poliomavrus de clulas de Merkel (MCPyV). No estudo, foi
utilizada uma estratgia denominada de subtrao digital de transcriptoma (DTS, digital
transcriptome subtraction), em que sequncias de RNA mensageiros foram isoladas de tecido
tumoral, seguido da subtrao computacional das sequncias do hospedeiro e alinhamento das
sequncias restantes.
No Quadro 8.7 so mostrados alguns exemplos de novos vrus que infectam seres humanos e que
foram descobertos por meio de metodologias moleculares e abordagens de metagenmica.
Quadro 8.7 Exemplos de novos vrus que infectam seres humanos, descobertos atravs de metodologias moleculares e
abordagens de metagenmica.
Vrus

Estratgia

ASFV-like

RAP-PCR e sequenciamento de alto rendimento

BFV

RAP-PCR e sequenciamento de alto rendimento

Cardiovrus TMEV-like

Hibridizao em microarranjos e sequenciamento de Sanger

Gamarretrovrus XMRV-like

Hibridizao em microarranjos e sequenciamento de Sanger

HBoV-1

RCA sequenciamento de Sanger

HBoV-2

RAP-PCR e sequenciamento de alto rendimento

HBoV-3

PCR degenerada e sequenciamento de Sanger

HCoSV

RAP-PCR e sequenciamento de Sanger

HCoV-NL63

VIDISCA e sequenciamento de Sanger

HEV

SISPA e sequenciamento de Sanger

HHV-8

RDA e sequenciamento de Sanger

HMPV

RAP-PCR e sequenciamento de Sanger

HPeV7

RAP-PCR e sequenciamento de Sanger

HPV116

RAP-PCR e sequenciamento de Sanger

HPyV6

RCA e sequenciamento de alto rendimento

HPyV7

RCA e sequenciamento de alto rendimento

KIPyV

RAP-PCR e sequenciamento de alto rendimento

Sali V

RAP-PCR e sequenciamento de alto rendimento

LUJV

RCA e sequenciamento de alto rendimento

MCPyV

DTS e sequenciamento de alto rendimento

MERS-CoV

RAP-PCR e sequenciamento de alto rendimento

Parvovrus 4

DNAse-SISPA e sequenciamento de Sanger

SAFV

DNAse-SISPA e sequenciamento de Sanger

SARS-CoV

Hibridizao em microarranjos e sequenciamento de Sanger

TSPyV

RCA sequenciamento de Sanger

WUPyV

RAP-PCR e sequenciamento de alto rendimento

RAP-PCR = random arbitrary primed PCR; RDA = representational difference analysis; RCA = rolling circle amplification;
SISPA = sequence-independent single primer amplification; VIDISCA = virus discovery DNA amplified fragment length
polymorphism; DTS = digital transcriptome subtraction; ASFV = african swine fever virus; BFV = Burkina Faso virus; TMEV
= Theilers murine encephalomyelitis virus; XMRV = xenotropic murine related virus; HBoV = bocavrus humano; HCoSV =
cosavrus humano; HCoV = coronavrus humano; HEV = vrus da hepatite E; HHV-8 = herpesvrus humano tipo 8; HMPV =
metapneumovrus; HPeV = parechovrus humano; HPV = vrus do papiloma humano; HPyV = poliomavrus humano; KIPyV
= poliomavrus humano KI; Sali V = salivrus; LUJV = Lujo vrus; MCPyV = poliomavrus humano MC; MERS-CoV =
coronavrus associado sndrome respiratria do Oriente Mdio; SAFV = vrus saffold; SARS-CoV = coronavrus associado
sndrome respiratria aguda grave; TSPyV = poliomavrus humano TS; WUPyV = poliomavrus humano WU.

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Introduo
Todos os anos, milhes de pessoas morrem no mundo por infeces causadas por vrus apesar do
grande avano da medicina moderna e da disponibilidade de algumas vacinas. De fato, a vacinao
possvel para a preveno de doenas causadas por alguns vrus, como o da hepatite B (HBV), da
varicela-zoster (VZV), da influenza A (FLUVA) e B (FLUVB), da febre amarela (YFV) e poliovrus
(PV); mas no para outros vrus, como o da hepatite C (HCV), vrus da imunodeficincia humana
(HIV), e para a maioria dos vrus que causam febres hemorrgicas.
O campo da terapia antiviral relativamente novo. Enquanto alguns antibiticos j estavam
disponveis para uso clnico no incio da dcada de 1940, o primeiro antiviral s foi licenciado na
dcada de 1960. Conceitualmente, muito mais fcil desenvolver um agente antibacteriano do que
um antiviral, porque as bactrias se multiplicam independentemente do hospedeiro, enquanto os vrus
so patgenos intracelulares que dependem da clula viva para realizarem o processo de biossntese
das partculas virais.
A busca por drogas com propriedades antivirais teve incio em 1955, quando Hamre e
colaboradores demonstraram que algumas tiossemicarbazonas inibiam o vrus vaccnia (VV)
cultivado em camundongos e ovos embrionados, com base nos estudos de Dormagk e colaboradores,
que mostraram a atividade dessa classe de substncias qumicas sobre o bacilo da tuberculose, uma
bactria de multiplicao intracelular. Posteriormente, em 1963, Bauer sintetizou uma nova
substncia, N-metil-isatin--tiossemicarbazona, tambm chamada metisazona ou Marboran (Figura
9.1), que foi eficaz na preveno e no tratamento da varola, tendo sido usada com xito em
epidemias do passado, na ndia, apesar de seus efeitos colaterais. Com o sucesso da vacina e a
consequente erradicao da varola no mundo, o uso da metisazona foi interrompido. No entanto, a
Organizao Mundial da Sade (OMS) tem enfatizado o desenvolvimento de novos frmacos para
preveno e/ou tratamento da varola devido ao risco de o vrus ser reintroduzido por atos de
bioterrorismo.
No incio da era da terapia antiviral, devido ao pouco conhecimento sobre a biologia molecular
dos vrus e toxicidade dos primeiros antivirais como a metisazona e anlogos nucleosdicos como a
iododesoxiuridina e a vidarabina, pensou-se que seria impossvel obter um agente antiviral sem

interferir no metabolismo celular.


Os anlogos nucleosdicos surgiram de extensos programas para a seleo de substncias
anticancergenas por sua capacidade de interferir na sntese do DNA celular. Assim, as primeiras
drogas antivirais baseadas nessa classe de substncias eram capazes de atuar no DNA viral, mas
tambm na sntese do DNA celular, com consequentes efeitos txicos para as clulas dos pacientes.
Por esse motivo, o surgimento de novos agentes antivirais esbarrava na dificuldade em obter
substncias com baixa toxicidade. No entanto, com a constatao de que o aciclovir praticamente
desprovido de toxicidade, aliado ao maior conhecimento sobre as diferenas existentes entre o
metabolismo celular e o ciclo de replicao de muitos vrus, finalmente passou-se a acreditar que
seria possvel a obteno de um antiviral seletivo.
A toxicidade das drogas antivirais provm do fato de que os vrus, embora possuam toda a
informao para a construo de novas partculas virais contida em seu genoma, quer seja ele de
DNA ou de RNA, no apresentam a capacidade de autorreplicao, necessitando de parte do aparato
bioqumico celular para que ocorra a sntese de seus componentes. No entanto, existem alguns
processos do ciclo de biossntese viral que so peculiares aos vrus e podem servir de alvos
especficos para as substncias antivirais. Como exemplo, pode-se citar o processo de entrada e
sada do FLUV das clulas, assim como a existncia de enzimas virais, como a timidino-cinase e a
helicase-primase dos herpesvrus, alm da transcriptase reversa e da protease do HIV, que so
fundamentais no ciclo de replicao viral.

Figura 9.1 Estrutura qumica do Marboran.

Na dcada de 1980, devido ao elevado custo com o desenvolvimento dos antivirais, os


pesquisadores decidiram concentrar os estudos nas viroses mais importantes epidemiologicamente:
viroses respiratrias, doenas causadas por herpesvrus e a sndrome da imunodeficincia adquirida

(AIDS). Atualmente, as pesquisas esto voltadas tambm para o combate a vrus emergentes e
reemergentes, como as estirpes avirias e sunas do FLUV, coronavrus SARS (SARS-CoV), alm
daqueles que podem ser manipulados para fins de bioterrorismo, tais como o vrus da varola e os
causadores de febres hemorrgicas. Tambm para o PV, existe um interesse atual no descobrimento
de um antiviral, uma vez que a vacina, embora eficiente no controle da poliomielite, no tem sido
capaz de erradicar a doena no mundo conforme se pensava com otimismo, inicialmente para o ano
2000. Com isso, observa-se um aumento acentuado tanto na pesquisa quanto na liberao de novos
antivirais.
Infelizmente, h poucos agentes profilticos ou teraputicos para os vrus, e os j disponveis
podem ser divididos em 3 grandes grupos:
Inibidores direcionados para um determinado alvo, como por exemplo, inibidores da protease do
HIV, que so desenvolvidos para um vrus especfico e podem estar sujeitos ao desenvolvimento
de resistncia; no agem em novos vrus emergentes ou que surjam por manipulao gentica;
alm de poderem apresentar efeitos colaterais no esperados
Vacinas, que tambm so direcionadas para um determinado vrus ou estirpe viral, precisam ser
administradas antes ou, em alguns casos, imediatamente aps a infeco para serem efetivas; no
esto disponveis para novos vrus emergentes e so difceis de produzir para alguns vrus como
o HIV
Interferons e outras drogas anti-inflamatrias ou imunomoduladoras, que so menos especficas
em termos de espectro de ao e atuam somente em alguns vrus, como HBV e HCV, alm de
apresentarem srios efeitos colaterais como consequncia da interao com o sistema
imunolgico e endcrino do organismo.
Para superar esses obstculos, um inibidor original foi desenvolvido e atua em um amplo
espectro de vrus, no apresentando toxicidade para 11 tipos de culturas de clulas de mamferos,
alm de ser adequado para administrao profiltica ou teraputica. Esse inibidor foi chamado de
DRACO (double-stranded RNA activated caspase oligomerizer) e foi desenhado para inativar os
vrus em clulas infectadas, de maneira seletiva e rpida, sem danificar as clulas no infectadas.
Para tanto, essa abordagem utiliza 2 processos. O primeiro envolve a deteco de RNA de fita dupla
na clula infectada; essa estratgia baseia-se no conhecimento de que praticamente todos os vrus
apresentam um RNA de fita dupla durante a biossntese, seja fazendo parte do prprio genoma ou
sendo transcrito em um intermedirio do ciclo replicativo. Por outro lado, as clulas no infectadas
somente produzem RNA de fita dupla com menos de 24 pares de bases que no so alvos dessas
molculas. O segundo mecanismo utiliza uma das ltimas etapas do processo de apoptose, no qual
complexos contendo molculas intracelulares sinalizadoras de apoptose se ligam simultaneamente a
mltiplas procaspases, que so clivadas e ativam caspases, que, por sua vez, clivam vrias protenas

celulares levando morte celular. Assim, um inibidor DRACO uma protena quimrica com um
domnio que se liga ao RNA de fita dupla e um segundo domnio que se liga em procaspases, que
ativam caspases, desencadeando o processo de apoptose da clula infectada quando 2 ou mais
DRACO se ligam no mesmo RNA de fita dupla. Esse inibidor apresenta um amplo espectro de ao e
eficaz contra muitas infeces virais, incluindo as produzidas por vrus que causam doenas
hemorrgicas, tais como: vrus Marburg e Ebolavrus Zaire, vrus da dengue, arenavrus Amapari e
Tacaribe, alm do FLUVA H1N1 e rinovrus humano (HRV). Embora ainda haja a necessidade de
muita pesquisa e realizao de testes clnicos, h grande possibilidade de que o inibidor DRACO
esteja disponvel para tratamento na prxima dcada.
Os potenciais candidatos a antivirais podem ser selecionados empiricamente a partir de grandes
programas de triagem, nos quais uma infinidade de substncias testada ao acaso ou por indicao
na medicina tradicional, como vem sendo feito desde a dcada de 1950. No entanto, a tendncia atual
a pesquisa racional utilizando simulao em computador que desenha e seleciona drogas com
potencial antiviral com base no conhecimento atual sobre as estruturas virais e a biologia molecular
dos vrus.

Breve reviso sobre a sntese de cidos nucleicos


Para melhor compreenso dos mecanismos de atuao das substncias antivirais, necessria
uma breve reviso sobre conceitos fundamentais na sntese de cidos nucleicos. Existem 2 tipos de
materiais genticos: DNA (cido desoxirribonucleico) e RNA (cido ribonucleico). Estes, por sua
vez, so constitudos por subunidades, os nucleotdeos, que so formados por uma base nitrogenada
(citosina, guanosina, adenosina ou timidina, no DNA, e uracila substituindo a timidina, no RNA) mais
um acar (ribose no RNA ou desoxirribose no DNA) e 3 fosfatos. Somente nessa forma eles so
incorporados cadeia que est sendo sintetizada. O conjunto formado pela base mais o acar
chama-se nucleosdeo. Os nucleosdeos so fosforilados por enzimas celulares chamadas cinases,
passando, ento, forma de nucleotdeos, que apresentam grupamento fosfato (Figura 9.2).
O processo no qual uma fita-molde copiada em uma nova fita chamado de transcrio, que
realizada graas participao de enzimas denominadas DNA ou RNA polimerases, dependendo da
fita gerada; e DNA ou RNA dependentes, dependendo da fita que serve de modelo. Esse processo
pode produzir novas fitas de DNA ou RNA. Quando a fita sintetizada um RNA mensageiro
(RNAm), ela precisa ser decodificada na forma de protenas. Tal processo chamado de traduo.

Figura 9.2 Constituintes do cido nucleico.

Stios de atuao de um antiviral


Os pesquisadores realizam estudos para encontrar molculas que possam inibir eventos
especficos dos vrus, sem interferir no metabolismo normal da clula. Essa tarefa no tem sido fcil,
mas existem etapas no ciclo replicativo dos vrus que podem ser utilizadas como potenciais alvos
dos agentes antivirais, tais como:
Interferncia na adsoro dos vrus, bloqueio de receptores celulares e fuso do envelope viral
com membranas celulares
Inibio do desnudamento e consequente impedimento da liberao do cido nucleico viral no
interior da clula
Inibio da transcrio inicial, tendo como alvo algumas enzimas virais, como as DNA e RNA
polimerases, alm de transcriptase reversa
Interferncia na traduo e no processamento de protenas virais que regulam o ciclo replicativo
Replicao (sntese de novos cidos nucleicos virais)
Inibio da transcrio tardia de cidos nucleicos virais e integrao do genoma do vrus ao
genoma da clula
Interferncia na traduo e no processamento de protenas virais estruturais, agindo no processo
de clivagem ou glicosilao
Interferncia no processo de montagem e maturao das protenas virais
Inibio do brotamento.
Na Figura 9.3 podem ser visualizadas as etapas da biossntese de um vrus hipottico e os stios
passveis de sofrerem a atuao dos antivirais. Exemplos de alvos para os agentes antivirais so
encontrados no Quadro 9.1.
A terapia combinada emprega drogas que possam atuar em dois ou mais estgios da replicao
viral e, atualmente, tem sido um recurso muito utilizado, principalmente no tratamento da infeco
pelo HIV, visando diminuir a toxicidade e reduzir a chance de seleo de mutantes resistentes.
Quadro 9.1 Exemplos de alvos para os agentes antivirais.
Alvo

Adsoro

Antiviral*

Vrus

Sulfato de dextrana, heparina

HIV-1, HSV

Anlogos peptdicos

Maioria dos vrus

Anticorpos neutralizantes

Maioria dos vrus

Amantadina e rimantadina

FLUV

Disoxaril

Picornavrus

Zidovudina (AZT)

HIV-1

Lamivudina

HIV-1 e HBV

Aciclovir

HSV e VZV

Iododesoxiuridina (IDU)

HSV

Trifluridina

HSV

Ganciclovir

HCMV

CMX-001

VV

Helicase-primase

AIC-316

HSV

Complexo terminase

AIC-246

HCMV

Sntese de RNA e RNAm virais

Ribavirina

HRSV

Integrao do genoma viral no genoma da clula

Raltegravir e elvitegravir

HIV-1

Sntese de protenas virais no estruturais

Fomivirsen

HCMV

Sntese de protenas virais e liberao de vrus

Interferon

HBV, HCV e HPV

Saquinavir e ritonavir

HIV-1

Boceprevir e telaprevir

HCV

Oseltamivir, zanamivir,
peramivir e laninamivir

FLUV

Nonoxinol-9

HIV-1

Enviroxima

HRV

Penetrao e desnudamento

Transcriptase reversa

Transcrio

Processamento de protenas virais


Liberao das partculas virais

Inativao da partcula viral

DNA polimerase

HIV-1 = vrus da imunodeficincia humana tipo 1; HSV = vrus herpes simplex; HBV = vrus da hepatite B; VZV = vrus da
varicela-zoster; HCMV = citomegalovrus humano; VV = vrus vaccnia; HRSV = vrus respiratrio sincicial humano; HCV =
vrus da hepatite C; HPV = vrus do papiloma humano; FLUV = vrus da influenza; HRV = rinovrus humano; RNAm = RNA
mensageiro. *Algumas drogas podem no ter sido ainda licenciadas para uso em seres humanos.

Figura 9.3 Interferncia dos antivirais nas etapas do ciclo de biossntese de um vrus. Os potenciais alvos dos agentes
antivirais podem ser: (1) interferncia na adsoro dos vrus, bloqueio de receptores celulares e fuso do envelope viral
com a membrana da clula; (2) inibio do desnudamento dos vrus; (3) inibio da transcrio inicial, tendo como alvo
algumas enzimas virais; (4) interferncia na traduo e processamento de protenas virais; (5) inibio da replicao de
novos cidos nucleicos virais; (6) inibio da transcrio tardia de cidos nucleicos virais e integrao do genoma do vrus
no genoma da clula; (7) interferncia na traduo e no processamento de protenas virais estruturais, agindo no processo
de clivagem ou na glicosilao; (8) interferncia na montagem e maturao das protenas virais; (9) inibio do brotamento.

Os antivirais podem ser utilizados profilaticamente, com o intuito de impedir a instalao de uma
infeco viral, como se fossem vacinas. A profilaxia com uma substncia antiviral apresenta um
efeito mais rpido do que a vacinao, considerando que se pode obter proteo com um antiviral em
um tempo to curto quanto 1 h aps a administrao. Nessa categoria, alm dos quimioterpicos que
interferem no ciclo de biossntese viral, incluem-se tambm algumas substncias chamadas virucidas,
porque inativam a partcula viral antes que ela alcance a clula-alvo. Essa abordagem est sendo
atualmente utilizada no preparo de pomadas ou gis para vrus que so transmitidos por via sexual,
tais como o HIV e o vrus herpes simplex (HSV). A outra forma de utilizao dos antivirais
teraputica, na qual o medicamento administrado logo aps a infeco ou depois da instalao dos
primeiros sinais clnicos, para impedir ou reduzir o espalhamento do vrus no organismo.

Etapas de desenvolvimento de um antiviral


Para que uma droga com potencial antiviral seja liberada para uso em seres humanos, so
necessrios vrios anos de estudo. As pesquisas so divididas em 2 fases: pr-clnica e clnica.
Todas as etapas necessrias ao desenvolvimento de um antiviral so avaliadas antes que um
quimioterpico receba a licena para ser utilizado comercialmente. No Brasil, a Agncia Nacional

de Vigilncia Sanitria (Anvisa), nos EUA, a Food and Drug Administration (FDA), na Europa, a
European Medicines Agency (EMA), alm de outros rgos em cada pas, concedem licena para
que um medicamento seja utilizado em seres humanos aps a anlise dos protocolos e resultados dos
testes de segurana e eficcia da droga candidata a medicamento. Inicialmente, a substncia
selecionada passa pela fase pr-clnica, quando so realizados testes em laboratrio utilizando
culturas de clulas mantidas in vitro, com a finalidade de avaliao da atividade citotxica e
antiviral. Nessa etapa, tambm so determinados os mecanismos de ao e uma vez que seja
comprovada sua atividade inibidora, com baixa toxicidade em cultura de clulas, os estudos
prosseguem utilizando-se, agora, animais. Nesse modelo, estabelecem-se as concentraes que no
so txicas para os rgos, alm de propriedades farmacolgicas, como absoro, metabolizao e
eliminao; determina-se a dose teraputica (relao entre o efeito txico e a dose efetiva), alm de
se detectarem possveis efeitos teratognicos (efeitos no embrio ou no feto) e a capacidade de
provocar carcinognese. Essa etapa demora, em mdia, de 3 a 4 anos para ser completada.
Para que haja prosseguimento nas pesquisas, com testes em seres humanos, os protocolos e os
resultados da primeira fase so submetidos avaliao no sentido de liberar a droga para a
realizao dos testes clnicos. Tendo sido aprovada, inicia-se a fase clnica, que consiste em 4 etapas
aps o protocolo ter sido aprovado por um Conselho de tica para Experimentao em Seres
Humanos. A etapa I realizada em voluntrios sadios e refere-se aos testes para observao do
metabolismo da droga e sua ao farmacolgica. Nessa etapa, o objetivo estabelecer a
concentrao a ser administrada, sua meia-vida no organismo e quais rgos so acometidos desde a
administrao at a excreo. Deve-se salientar que os estudos so realizados pelo mtodo duplocego, em que nem o mdico nem o voluntrio sabem quem est tomando o placebo ou a droga.
Na etapa II, so includos poucos pacientes para a confirmao do efeito antiviral. Ocorre a
coleta de dados importantes, como caractersticas demogrficas (idade, sexo, peso, raa), histria e
sinais da doena, com testes laboratoriais e isolamento do vrus realizados antes e depois da terapia.
Alm disso, determinam-se a melhor dose teraputica e a melhor via de administrao, assim como o
intervalo entre as doses.
A etapa III pode ser feita simultaneamente etapa II, mas, geralmente, inicia-se aps as
evidncias da eficincia da droga nos pacientes voluntrios. Nessa fase, incluem-se de centenas a
milhares de pacientes, que sero monitorados quanto segurana do medicamento quando usado por
um longo perodo de tempo. Estudos adicionais de farmacocintica e farmacologia so realizados,
assim como a verificao do efeito sobre neonatos, crianas e idosos, pacientes com disfuno renal,
heptica ou que estejam fazendo uso de medicamentos que possam interferir na droga.
Aps a concluso da etapa III, os resultados so novamente submetidos avaliao, e ser
decidido sobre a liberao ou no da droga para ser comercializada. Para que uma droga seja
considerada medicamento e chegue s prateleiras das farmcias, so necessrios de 10 a 12 anos de
pesquisa. Aproximadamente, 100.000 substncias passam pelos testes antivirais de triagem em

culturas de clulas antes que uma chegue a ser comercializada.


Algumas drogas no esto passando por todo esse processo, reduzindo o tempo para o
licenciamento, devido necessidade de novos medicamentos, principalmente voltados para o
tratamento de infeces produzidas pelo HIV, HCV, vrus respiratrios e vrus de febres
hemorrgicas.

Drogas antivirais disponveis para uso clnico


Conforme visto anteriormente, um antiviral pode atuar em diferentes etapas do ciclo de
biossntese viral desde a adsoro at a liberao dos vrus pelas clulas. Muitos antivirais
licenciados para uso em seres humanos so anlogos de nucleosdeos (Figuras 9.4 a 9.7) que
apresentam ao inibidora sobre algumas polimerases virais. Algumas dessas molculas so prdrogas que precisam passar forma nucleotdica pela ao de cinases celulares ou virais, que
adicionam fosfatos aos nucleosdeos, transformando-os, ento, em nucleotdeos. O mecanismo de
ao dos anlogos de nucleosdeos ou nucleotdeos por inibio competitiva, decorrente da ligao
preferencial da polimerase viral ao frmaco, em detrimento da ligao ao substrato natural, e/ou
bloqueio na sntese do cido nucleico por ligao irreversvel do anlogo enzima.
Neste captulo, sero focalizados apenas os antivirais que j receberam aprovao para serem
utilizados clinicamente e no existe nenhum comprometimento, por parte das organizadoras do livro
ou da editora, de indicao de qualquer deles. Deve-se ressaltar que, at o momento, nenhum
antiviral capaz de curar o paciente da virose. Esses quimioterpicos atuam diminuindo os sintomas
ou reduzindo a durao da doena, ou at mesmo melhorando a qualidade de vida do paciente.
No Quadro 9.2 esto relacionadas substncias liberadas at setembro de 2014; algumas delas
podem no ter sido licenciadas em todos os pases, como no caso da brivudina, que encontrada
somente em alguns pases da Europa. No Quadro 9.3 podem ser visualizadas as associaes de
antivirais licenciadas para uso em seres humanos.

Figura 9.4 Anlogos do nucleosdeo adenosina.

Figura 9.5 Anlogos do nucleosdeo citidina.

Figura 9.6 Anlogos do nucleosdeo timidina.

Figura 9.7 Anlogos do nucleosdeo guanosina.

Quadro 9.2 Antivirais licenciados at setembro de 2014.


Vrus (classe de inibidor)

FLUV

HSV

HSV e VZV

HCMV

HRSV

HBV, HCV, HPV e HHV-8

HCV

Antiviral

Nome comercial licenciado

Amantadina

Symmetrel

Rimantadina

Flumadine

Oseltamivir

Tamiflu

Zanamivir

Relenza

Peramivir*

Rapiacta, Peramiflu

Octanoato de laninamivir*

Inavir

Iododesoxiuridina

IDU, Stoxil

Trifluridina

Viroptic

Vidarabina

Ara-A

Brivudina**

Zostex, Brivirac, Zerpex

Aciclovir

Zovirax

Valaciclovir

Valtrex, Zelitrex, Herpestal

Fanciclovir

Famvir, Penvir

Ganciclovir

Cytovene, Cymevene

Valganciclovir

Valcyte

Cidofovir

Vistide

Fomivirsen sdico

Vitravene

Fosfonoformato sdico

Foscarnet, Foscavi

Ribavirina

Viramid, Copegus, Rebetol

IFN- 2a convencional

Roferon-A

IFN- 2b convencional

Intron-A

IFN- 2a peguilado

Pegasys

IFN- 2b peguilado

PegIntron

IFN- 2a peguilado + ribavirina

Pegasys/Copegus

IFN- 2b peguilado + ribavirina

PegIntron/Rebetol

HCV (inibidor da protease)

HCV (inibidor da RNA polimerase)

HBV (inibidor nucleosdico da TR)

Telaprevir

Incivek

Boceprevir

Victrelis

Simeprevir

Olysio

Sofosbuvir

Sovaldi

Daclatasvir

Daklinza

Lamivudina

Epivir

Entecavir

Baraclude

Telbivudina

Tyseka, Sebivo

Adefovir dipivoxil

Hepsera, Preveon

Fumarato de tenofovir disoproxil (TDF)

Viread

Doxorrubicina

Doxil

Zidovudina (AZT)

Retrovir

Didanosina (ddI)

Videx

Zalcitabina (ddC)

Hivid

Estavudina (d4t)

Zerit

Lamivudina (3TC)

Epivir

Abacavir (ABC)

Ziagen

Entricitabina

Emtriva

Nevirapina

Viramune

Delavirdina

Rescriptor

Efavirenz

Sustiva

Etravirina

Intelence

Rilpivirina

Edurant

Fumarato de tenofovir disoproxil (TDF)

Viread

Raltegravir

Isentress

Elvitegravir

-***

Dolutegravir

Tivicay

Saquinavir

Invirase, Fortovase (gel)

Indinavir

Crixivan

HBV (inibidor nucleotdico da TR)

HHV-8

HIV-1(inibidor nucleosdico da TR)

HIV-1(inibidor no nucleosdico da TR)

HIV-1(inibidor nucleotdico da TR)

HIV-1(inibidor da integrase)

Ritonavir

Norvir

Nelfinavir

Viracept

Lopinavir

Aluviran

Atazanavir

Reyataz

Amprenavir/fosamprenavir

Agenerase/Lexiva

HIV-1(inibidor no peptideomimtico da
protease)

Tipranavir

Aptivus

Darunavir

Prezista

HIV-1(inibidor da fuso)

Enfuvirtida

Fuzeon

HIV-1(antagonista do correceptor CCR5)

Maraviroc

Celsentri

HIV-1(inibidor peptideomimtico da
protease)

FLUV = vrus da influenza; HSV = vrus herpes simplex; VZV = vrus da varicela-zoster; HCMV = citomegalovrus humano;
HRSV = vrus respiratrio sincicial humano; HCV = vrus da hepatite C; HBV = vrus da hepatite B; HHV-8 = herpesvrus
humano tipo 8; HPV = vrus do papiloma humano; HIV-1 = vrus da imunodeficincia humana tipo 1; TR = transcriptase
reversa; AZT = zidovudina; 3TC = lamivudina; ABC = abacavir; IFN = interferon. *Licenciados apenas no Japo e Coreia do
Sul. **Licenciado em alguns pases da Europa. ***Licenciado apenas em associao ao Stribild.

Quadro 9.3 Associaes de antivirais licenciados at setembro de 2014.


Vrus

HIV-1

HCV

Antiviral

Nome comercial licenciado

AZT + 3TC

Combivir

ABC + 3TC

Epzicom, Kivexa

ABC + AZT + 3TC

Trizivir

Lopinavir + ritonavir

Kaletra

Entricitabina + TDF

Truvada

Entricitabina + TDF + efavirenz

Atripla

Entricitabina + TDF + rilpivirina

Eviplera/Complera

Entricitabina + TDF + elvitegravir + cobicistato*

Stribild

IFN- peguilado + ribavirina

Pegasys + Copegus**
PegIntron + Rebetol**

Simeprevir + IFN- peguilado + ribavirina

Olysio + Pegasys + Copegus***

Sofosbuvir + ribavirina

Sovaldi + Rebetol**

Sofosbuvir +IFN- peguilado + ribavirina

Sovaldi + Pegasys + Copegus***

HIV-1 = vrus da imunodeficincia tipo 1; HCV = vrus da hepatite C; AZT = azidotimidina; 3TC = lamivudina; ABC = abacavir;
TDF = fumarato de tenofovir disoproxil; IFN = interferon. *Frmaco potencializador; no apresenta efeito antiviral. **Duas

formulaes diferentes. ***Trs formulaes diferentes.

Drogas anti-influenza
Amantadina e rimantadina
A amantadina (Symmetrel) uma amina primria (1-amino-adamantana), um medicamento
usado na doena de Parkinson e que foi descoberto, por acaso, como sendo ativo na inibio do
FLUVA, mas no apresenta atividade para os FLUVB ou FLUVC. Vrios estudos clnicos tm
mostrado que a administrao profiltica durante a ocorrncia de um surto eficiente em 70 a 80%
dos indivduos. A rimantadina (Flumadine) tambm uma amina primria [1-(adamantan-1il)etano-1-amina], muito similar amantadina, com a adio de um grupamento metila (Figura 9.8).
A amantadina mostra-se eficaz quando administrada profilaticamente e pode ser til para
diminuir os sintomas da doena, quando administrada dentro de 48 h da infeco. No entanto,
apresenta efeitos colaterais de natureza neurolgica, tais como nervosismo, irritabilidade e insnia,
que cessam com a descontinuidade da medicao. A rimantadina mais potente que a amantadina e
apresenta menos efeitos txicos.

Figura 9.8 Aminas primrias anti-influenza.

A profilaxia recomendada somente para grupos de risco: idosos acima de 65 anos, diabticos e
pessoas com doenas crnicas cardacas e pulmonares.
A substituio de aminocidos no domnio transmembrana da protena M2 propicia o rpido
aparecimento de resistncia amantadina e rimantadina, sendo os vrus resistentes transmissveis a
contatos. Por esse motivo, no est sendo recomendado o uso desses antivirais nas atuais epidemias
de influenza.

Mecanismo de ao
Esses inibidores ligam-se ao canal de prtons formado pela protena M2 do FLUVA. O
mecanismo de como amantadina e rimantadina funcionam ainda controvertido; elas podem agir
bloqueando diretamente a protena M2, impedindo a passagem de ons pelo canal de prtons, ou
podem atuar alostericamente. Por outro lado, por serem bases fracas, indiretamente, tambm podem
elevar o pH endossomal; sem a concentrao ideal de ons H+ no interior do vrus, o peptdeo
fusognico do vrus no ativado, bloqueando a fuso do envelope viral com a membrana do
endossoma. Alm disso, a protena M1 no se dissocia do nucleocapsdeo, impedindo que ele migre
para o ncleo da clula, havendo bloqueio da transcrio e replicao viral (Figura 9.9). As
amostras de FLUV que apresentam mutao no gene da protena M2 ou da glicoprotena
hemaglutinina podem ser resistentes a esses agentes. Em algumas amostras de FLUVA,
principalmente de aves, a amantadina e a rimantadina atuam em estgios tardios da biossntese.

Oseltamivir e zanamivir
O fosfato de oseltamivir (Tamiflu) ou fosfato de 1-ciclo-hexeno-1-cido carboxlico, 4(acetilamino)-5-amino-3-(1-etilpropoxi)-etil ster, (3R-(3,4,5)) e zanamivir (Relenza) ou cido
5-(acetilamino)-4-[(aminoiminometil)-amino]-2,6-anidro-3,4,5-tridesoxi-D-glicero-D-galacto non-2ennico, so antivirais anlogos de cido silico (Figura 9.10) e, portanto, inibem a neuraminidase
viral na etapa de liberao das partculas virais. Eles tm a vantagem de agir em FLUVA e FLUVB,
sendo 100 vezes mais ativos do que a amantadina.
Essas drogas podem reduzir o tempo de durao da influenza A e B no complicada. Iniciando-se
o tratamento dentro de 1 dia ou 2, a medicao pode reduzir a gravidade e diminuir o tempo da
doena. Alguns estudos limitados sugerem que elas possam tambm evitar complicaes, como a
pneumonia bacteriana ou viral, ou a exacerbao de doenas crnicas. Se tomados aps 48 h do
aparecimento dos sintomas, esses antivirais no tm atuao.
O uso dessas medicaes como profilaxia no um substituto para a vacinao, mas um auxlio
para prevenir e controlar a gripe. Estudos realizados em comunidades de adultos sadios indicaram
que o oseltamivir e o zanamivir so eficientes para prevenir a infeco.
O oseltamivir apresenta como efeito colateral mais frequente problemas gastrointestinais, como
nusea e vmito (10%), mas foram descritos efeitos neuropsquicos, principalmente em crianas, no
Japo. O zanamivir administrado por inalao e apresenta efeitos colaterais principalmente em
pacientes com asma e doena pulmonar obstrutiva crnica (DPOC). Menos de 5% dos pacientes
apresentam diarreia, nusea, sinusite, bronquite, tosse, cefaleia e tonteira.
Para tratamento, ambas as drogas devem ser administradas durante 5 dias, preferencialmente at
48 horas a partir da data de incio dos sintomas. Dessa maneira, o tempo de doena reduzido para 1
ou 2 dias e a chance de transmisso do vrus diminui. Para a preveno, elas devem ser tomadas por

quem ainda no est doente, mas que entrou em contato com algum gripado. Nesse caso, a eficincia
de preveno de 70 a 90%. Principalmente as pessoas que sofrem risco de ter um quadro grave por
contrarem a infeco, como idosos e pacientes com comprometimento cardaco, devem fazer a
preveno. O tempo de administrao da medicao varia em cada caso.

Mecanismo de ao
A neuraminidase do FLUV desempenha um importante papel na sada dos vrus das clulas
infectadas e no movimento atravs do muco (ver Captulo 14). O oseltamivir e o zanamivir, por
serem anlogos de cido silico, inibem a neuraminidase viral, ligando-se ao seu stio ativo e
impedindo a clivagem de cidos silicos na superfcie das clulas e no envelope do vrus. Isso faz
com que a hemaglutinina viral se ligue a esses resduos, resultando em agregao de partculas
virais, na superfcie das clulas e consequente inibio da liberao de novos vrus (Figura 9.9).
Quanto mais similar aos anlogos de cido silico, maior a chance de seleo de mutantes
resistentes, o que acontece com o oseltamivir. Existe tambm outra diferena fundamental entre o
oseltamivir e o zanamivir que explica o padro de resistncia para esses antivirais: devido sua
maior cadeia hidrofbica, o oseltamivir requer uma rotao do resduo cataltico Glu276 da
neuraminidase viral para poder se ligar; enquanto o zanamivir, por apresentar uma cadeia menor, se
liga diretamente neuraminidase. Por exemplo, em um mutante N1 em que a neuraminidase
apresentou uma substituio na posio 274, na qual a histidina (His/H) foi trocada pela tirosina
(Tyr/Y), a rotao pode no ser necessria, provocando resistncia ao oseltamivir. Durante a
pandemia de 2009, estirpes do vrus H1N1 resistentes ao oseltamivir foram isoladas no mundo todo,
mesmo em pacientes no tratados. Felizmente, vrus resistentes ao oseltamivir so ainda sensveis ao
zanamivir, para o qual a resistncia tem sido escassamente relatada. No entanto, o zanamivir
apresenta o inconveniente de ser administrado por inalao, o que faz com que ele no possa ser
utilizado em pacientes com infeco grave pelo FLUV e em pacientes com asma ou DPOC. Para
diminuir esse problema, est sendo considerada a formulao endovenosa. Em 2013, o Ministrio da
Sade (MS) do Brasil divulgou um protocolo com indicaes da quimioprofilaxia para influenza,
relacionando:

Figura 9.9 Mecanismo de ao das drogas anti-influenza. Amantadina e rimantadina ligam-se diretamente ao canal de
prtons formado pela protena M2 do vrus da influenza A, bloqueando sua funo, ou provocando uma inibio alostrica.
Por outro lado, elevam o pH endossomal e, sem a concentrao ideal de ons H+ no interior do vrus, indiretamente, inibem
a fuso entre o envelope viral e a membrana do endossoma, pois o peptdeo fusognico do vrus no ativado. Alm disso,
a protena M1 no se dissocia do nucleocapsdeo, impedindo que ele migre para o ncleo da clula, havendo bloqueio da
transcrio e replicao viral. Oseltamivir, zanamivir, peramivir e octanoato de laninamivir inibem a neuraminidase viral,
deixando resduos de cido silico no clivados na superfcie das clulas e no envelope do vrus. Isso faz com que a
hemaglutinina viral se ligue a esses resduos, resultando em agregao na superfcie das clulas e consequente inibio da
liberao de novas partculas virais.

Pessoas com risco elevado de complicaes, no vacinadas ou vacinadas h menos de 2 semanas,


aps exposio a caso suspeito ou confirmado de influenza
Crianas com menos de 9 anos de idade, primovacinadas, que ainda no tomaram segunda dose
de vacina com intervalo de 1 ms para serem consideradas vacinadas

Pessoas com graves deficincias; profissionais de laboratrio, no vacinados ou vacinados h


menos de 15 dias, e que tenham manipulado amostras clnicas de origem respiratria que
contenham o FLUV sem uso adequado de equipamentos de proteo individual (EPI)
Trabalhadores de sade, no vacinados ou vacinados h menos de 15 dias, e que estiveram
envolvidos na realizao de procedimentos invasivos geradores de aerossis, ou na manipulao
de secrees de caso suspeito ou confirmado de influenza, sem o uso adequado de EPI
Residentes de alto risco em instituies fechadas e hospitais de longa permanncia, durante surtos
na instituio.
O MS disponibiliza os dois medicamentos no Sistema nico de Sade (SUS) e deve ser utilizado
o receiturio simples para a prescrio do medicamento. A dose de fosfato de oseltamivir para
adultos de 75 mg, 2 vezes ao dia, por 5 dias e, at o momento, no h evidncia cientfica
consistente para indicar o aumento da dose ou do tempo de utilizao do antiviral. A indicao de
zanamivir somente est autorizada em casos de impossibilidade do uso do fosfato de oseltamivir.
Gestantes esto no grupo de pacientes com risco para complicaes por influenza, tendo em vista
a maior mortalidade registrada nesse segmento populacional, especialmente durante a pandemia de
2009. Por esse motivo, devem ser tratadas, preferencialmente, com o fosfato de oseltamivir; este
tratamento no contraindicado na gestao, pois no h relatos de malformaes, com melhor
relao risco/benefcio.

Figura 9.10 Inibidores da neuraminidase do vrus da influenza.

Quadro 9.4 Posologia* para os antivirais oseltamivir e zanamivir.


Antiviral

Fosfato de oseltamivir**
(Tamiflu)

Faixa etria

Tratamento

Quimioprofilaxia

Adulto

75 mg, 12/12 h, 5 dias

75 mg, 1 /dia, 10 dias

15 kg

30 mg, 12/12 h, 5 dias

30 mg, 1 /dia, 10 dias

16 kg a 23 kg

45 mg, 12/12 h, 5 dias

45 mg, 1 /dia,10 dias

24 kg a 40 kg

60 mg, 12/12 h, 5 dias

60 mg, 1 /dia,10 dias

> 40 kg

75 mg, 12/12 h, 5 dias

75 mg, 1 /dia, 10 dias

< 3 meses

12 mg,12/12 h, 5 dias

No recomendada

3 a 5 meses

20 mg 12/12 h, 5 dias

20 mg, 1 /dia, 10 dias

6 a 11 meses

25 mg, 12/12 h, 5 dias

25 mg, 1 /dia, 10 dias

Adulto

10 mg: duas inalaes de 5


mg,12/12 h, 5 dias

10 mg: duas inalaes de 5 mg,


1 /dia, 10 dias

Criana 5 anos

10 mg: duas inalaes de 5


mg,12/12 h, 5 dias

10 mg: duas inalaes de 5 mg,


1 /dia, 10 dias

Criana maior
de 1 ano

Criana menor
de 1 ano

Zanamivir***(Relenza)

*Protocolo usado no Brasil. **O fosfato de oseltamivir no foi aprovado pela FDA para uso em crianas menores de 1 ano e
apenas foi liberado para profilaxia em uso emergencial nos EUA.***A indicao de zanamivir somente est autorizada em
casos de impossibilidade do uso do fosfato de oseltamivir (Tamiflu). (Fonte: Ministrio da Sade. Secretaria de Vigilncia
em Sade. Protocolo de tratamento de influenza, 2013; CDC, 2013)

Ainda em 2013, com base no perfil epidemiolgico da influenza no Brasil, o MS realizou, em


parceria com vrias sociedades mdicas, uma reviso do Protocolo de tratamento de Influenza,
com destaque para a importncia do tratamento dos casos de sndrome gripal (SG) e de sndrome
respiratria aguda grave (SRAG). Para tanto, foram revisadas e redefinidas algumas condutas a
serem institudas frente aos casos de infeco pelo FLUV e foram atualizadas as indicaes de
tratamento e quimioprofilaxia (Quadro 9.4).
Em geral, a quimioprofilaxia com antiviral no recomendada se o perodo aps a ltima
exposio a uma pessoa com infeco pelo vrus for maior que 48 h; para que seja efetiva, o antiviral
deve ser administrado durante a potencial exposio com FLUV e continuar por mais 10 dias aps a
ltima exposio. Considera-se exposio o contato com caso suspeito ou confirmado para influenza.
No Quadro 9.5 comparam-se amantadina, rimantadina, fosfato de oseltamivir e zanamivir.

Peramivir e laninamivir
O peramivir (Rapiacta R, Peramiflu) um anlogo do ciclopentano (Figura 9.10).
Quimicamente,

o
cido
(1S,2S,3R,4R)-3-[(1S)-1-(acetilamino)-2-etilbutil]-4-

(carbamidoilamino)-2-hidroxiciclopentanocarboxlico tri-hidratado e inibe a enzima neuraminidase


do FLUV. Foi licenciado pela FDA em outubro de 2009 sob autorizao de uso emergencial,
devido epidemia H1N1, para ser administrado em nica dose endovenosa em pacientes
hospitalizados somente nos casos em que outros antivirais no forem efetivos ou no esto
disponveis. O tratamento dura de 5 a 10 dias.
Quadro 9.5 Comparao entre amantadina, rimantadina, oseltamivir e zanamivir para tratamento e profilaxia da gripe.*
Antiviral
Propriedade

Amantadina**
(Symmetrel)

Rimantadina**
(Flumadine)

Zanamivir
(Relenza)

Oseltamivir
(Tamiflu)

Tipo de vrus inibido

FLUVA

FLUVA

FLUVA e FLUVB

FLUVA e FLUVB

Via de administrao

Oral (tabletes, cpsulas,


xarope)

Oral (tabletes, xarope)

P para inalao

Oral (cpsulas)

Faixa etria para


tratamento

1 ano

Adultos

5 anos

2 semanas

Faixa etria para


profilaxia

1 ano

1 ano

5 anos

1 ano

FLUVA = vrus da influenza A; FLUVB = vrus da influenza B. *Recomendao dos Centros para Controle de Doenas
(CDC) dos EUA. **Amantadina e rimantadina no so atualmente recomendadas. (Fonte: CDC, 2009, 2013)

O peramivir age contra os FLUVA e FLUVB. Esse antiviral foi desenvolvido pela metodologia de
desenho de novas drogas, com base em estruturas j conhecidas, e consiste em uma cadeia de
ciclopentano com um grupamento guanidil carregado positivamente e cadeias laterais lipoflicas. Os
estudos envolvendo pacientes adultos revelaram que o antiviral seguro e tem um perfil
farmacocintico que possibilita a administrao 1 vez/dia. O peramivir foi licenciado no Japo e na
Coreia e est na fase III de estudos nos EUA. A evidenciao de resistncia ainda est em
investigao.
O octanoato de laninamivir (Inavir) a pr-droga do laninamivir que tambm foi desenhada em
laboratrio a partir do conhecimento de estrutura e funo (Figura 9.10). Quimicamente, o
octanoato
de
D-glicero-D-galacto-non-2-enonicoacido-5-(acetilamino)-4[(aminoiminometil)amino]-2,6-anidro-3,4,5-tridesoxi-7-O-metil-9, que foi licenciado no Japo em
outubro de 2010. O uso restrito a adultos e administrado por inalao; apresenta atividade para o
FLUV sazonal e tambm para vrus resistentes ao oseltamivir. Estudos evidenciaram que o
laninamivir e a pr-droga octanoato de laninamivir apresentam especificidade para diferentes tipos
de neuraminidases do FLUV. Foi constatado tambm que esse inibidor se liga ao stio ativo da
neuraminidase de maneira peculiar, mas com alguma similaridade ligao do oseltamivir. Esses

dois antivirais ainda no esto disponveis no Brasil.

Mecanismo de ao
O peramivir e o octanoato de laninamivir se ligam competitivamente ao stio ativo da
neuraminidade do FLUVA por serem tambm anlogos de cido silico. Estudos com o peramivir
mostraram que ele capaz de inibir a atividade neuraminidsica de vrias estirpes de FLUVA e
FLUVB, incluindo o vrus H1N1 (influenza suna). A enzima neuraminidase promove a liberao dos
vrus da clula, clivando as ligaes entre o cido silico e o resduo de acar adjacente,
promovendo o espalhamento do vrus no trato respiratrio por diferentes mecanismos. Os inibidores
fazem com que essa funo da neuraminidase fique prejudicada (Figura 9.9).

Droga anti-HRSV
Ribavirina
A ribavirina (1--D-ribofuranosil-1,2,4-triazol-3-carboxamida), Virazole ou Viramid, foi
sintetizada em 1970 e, em 1972, utilizada como antiviral. estruturalmente parecida com o
nucleosdeo natural guanosina, com a diferena que o anel da base nitrogenada se encontra aberto na
ribavirina (Figura 9.7). Apresenta atividade para muitos vrus, tanto para os de DNA quanto para os
de RNA, e foi licenciada pela FDA, em 1986, para o tratamento de infeces pelo vrus respiratrio
sincicial humano (HRSV). administrada na forma de aerossol para tratamento de crianas com
broncopneumonia grave produzida pelo HRSV. Entretanto, tambm pode ser utilizada em adultos com
infeco grave pelo FLUV ou vrus do sarampo. Estudos tm mostrado que a administrao da
ribavirina por via oral ou endovenosa tambm pode ser til no tratamento da febre de Lassa e febres
hemorrgicas da Coreia e da Argentina. Atualmente, est sendo utilizada em associao ao
interferon- para o tratamento da hepatite C, conforme descrito mais adiante.

Mecanismo de ao
O amplo espectro de ao da ribavirina justifica-se pelos seus diferentes modos de atuao.
Sendo semelhante guanosina trifosfato, esse anlogo inibe a sntese de cidos nucleicos, alm de
impedir o capeamento de RNAm. A ribavirina tambm diminui as reservas celulares de guanina, pois
inibe a enzima monofosfato desidrogenase, que importante na via de sntese desse nucleotdeo. Por
outro lado, tambm inibe RNA polimerases.

Drogas anti-herpesvrus

Iododesoxiuridina e trifluridina
O inibidor iododesoxiuridina (5-iodo-2-desoxiuridina), IDU ou Stoxil, um anlogo da
timidina (Figura 9.6), que foi sintetizado por Prusoff, em 1959, e introduzido na terapia antiviral por
Kaufmann e colaboradores, em 1962. Para atuar como antiviral, ele precisa ser fosforilado por
enzimas celulares para ser transformado em sua forma ativa trifosfato. O IDU foi o primeiro
quimioterpico a ser usado no tratamento da ceratite herptica. Seus efeitos colaterais incluem
ceratite epitelial puntiforme, demora na cicatrizao do epitlio, conjuntivite folicular, obstruo
lacrimal e reao de hipersensibilidade. frequente a resistncia viral ao IDU, que percebida
clinicamente quando no h melhora da leso herptica. Pode ser usado sob a forma de pomada
oftlmica a 0,5%, 5 vezes/dia, durante 7 a 14 dias, ou colrio a 0,1%, 9 vezes/dia, durante 7 a 14
dias. Embora o IDU seja comercializado na forma de pomada oftlmica, alguns clnicos o
prescrevem para tratamento do herpes orofacial, mas a resposta no muito boa.
O antiviral trifluridina (5-trifluorometil-2-desoxiuridina), trifluortimidina, TFT ou Viroptic
(Figura 9.6) um anlogo da timidina que tambm fosforilado por enzimas celulares, para ser
transformado em sua forma ativa trifosfato. Ele utilizado no tratamento da ceratite herptica e, em
tratamentos prolongados, pode produzir reaes adversas semelhantes s do IDU, porm de menor
intensidade. Na formulao como colrio a 1%, deve ser usado 9 vezes/dia, durante 14 a 21 dias.

Mecanismo de ao
Os antivirais IDU e trifluridina so anlogos da timidina e seu mecanismo de ao ocorre pela
incorporao da forma trifosfatada no DNA viral, com consequente inibio da replicao viral pela
incorporao do anlogo, que no o substrato natural para a incorporao no cido nucleico que
est sendo sintetizado. No sendo seletivos, por serem fosforilados por enzimas celulares,
comprometem tambm o DNA celular, sendo muito txicos para serem administrados por outra via
que no seja a tpica.

Vidarabina
O antiviral vidarabina (9--D-arabinofuranosiladenina), ou Ara-A, um anlogo da adenosina
em que a ribose substituda pela arabinose (Figura 9.4). Surgiu em 1977, por meio de sntese
qumica, mas posteriormente verificou-se que naturalmente obtido de culturas de Streptomyces
antibioticus. Foi o primeiro antiviral licenciado para ser administrado por via endovenosa em casos
de encefalite herptica, embora, inicialmente, sua indicao tenha sido para tratamento de ceratite
herptica. Antes do aparecimento do aciclovir, a vidarabina foi responsvel pelo vertiginoso
decrscimo de casos fatais de encefalite produzidos pelo HSV em neonatos. A vidarabina tambm
no apresenta toxicidade seletiva, uma vez que as clulas no infectadas tambm metabolizam a
vidarabina. Alm da toxicidade, sua baixa solubilidade em solues fisiolgicas obriga

administrao por infuso lenta com grandes volumes de lquido. Alm disso, rapidamente
convertida a um metablito inativo por enzimas celulares. Como a vidarabina no necessita da
timidino-cinase para ser fosforilada, isso a torna eficaz em casos de resistncia aos demais
antivirais, como o aciclovir. Esse antiviral tem sido um dos medicamentos mais usados por via
endovenosa, de maneira semelhante ao foscarnet, para tratamento de infeces produzidas pelos HSV
e VZV resistentes ao aciclovir em pacientes imunodeficientes. Na formulao farmacutica de
pomada oftlmica, que no est disponvel no Brasil, recomendado o uso 5 vezes/dia, durante 14 a
21 dias.

Mecanismo de ao
A vidarabina, por ser um anlogo do nucleosdeo adenosina, assim como o IDU, passa forma
trifosfato por meio de enzimas celulares e, por esse motivo, tambm no apresenta toxicidade
seletiva. Dessa maneira, atua como um substrato para a polimerase viral, competindo com a
desoxiadenosina trifosfato (dATP), que o substrato natural para ser incorporado na fita que est
sendo sintetizada. Isso gera um DNA defeituoso, que fica desestabilizado, resultando na inibio
da sntese do DNA viral (e celular).

Brivudina
Quimicamente, o antiviral brivudina [(E)-5-(2-bromovinil)-2-desoxiuridina], um anlogo da
timidina (Figura 9.6). Tambm pode ser encontrado com a denominao de bromovinildesoxiuridina,
BVDU, Zostex, Brivirac ou Zerpex. Foi sintetizado em 1970, na Universidade de Birmingham,
Inglaterra, tendo sido demonstrado seu efeito inibidor sobre o HSV tipo 1 (HSV-1) e VZV pelo grupo
belga liderado por Erik De Clerck, em 1979. tambm um potente inibidor do vrus Epstein-Barr
(EBV) in vitro. Sua atividade deve-se ao grupamento (E)-bromovinil na configurao trans, que
crucial para a seletividade desse antiviral. A brivudina considerada um potente e seletivo antiviral,
mas no est licenciada no Brasil nem nos EUA, sendo encontrada na Alemanha e em outros pases
da Europa para tratamento do herpes-zoster. A vantagem da brivudina sobre o aciclovir, em relao
ao VZV, que esse antiviral age em concentraes nanomolares. Seu efeito adverso principal o
aparecimento de nusea durante o tratamento. Recomenda-se a administrao de 125 mg 1 vez/dia,
durante 7 dias, de preferncia iniciando at 3 dias seguintes ao aparecimento das manifestaes
cutneas ou 2 dias aps o aparecimento das vesculas do zoster.
O anlogo brivudina no inibe o HSV-2, porque a timidino-cinase desse vrus no capaz de
converter eficientemente a brivudina monofosfato para a forma difosfato, resultando em uma reduo
substancial da forma ativa, brivudina trifosfato, em clulas infectadas. No entanto, esse antiviral
pode ser usado como marcador para a diferenciao entre as 2 espcies de HSV

Mecanismo de ao

O antiviral brivudina fosforilado pela timidino-cinase viral, passando forma monofosfato e


difosfato. Em seguida, transformado na forma trifosfato por enzimas celulares, agindo como
inibidor competitivo em relao ao substrato natural desoxitimidina trifosfato (dTTP), sendo
incorporado ao DNA viral por meio da DNA polimerase. Essa incorporao afeta a estabilidade e a
funo do DNA viral, havendo em consequncia a inibio da replicao viral.

Aciclovir
O trabalho pioneiro de Gertrude Ellion e colaboradores levou sntese do aciclovir (9-[2hidroxietoximetil] guanina), Zovirax, que foi descoberto em 1970, mas somente foi introduzido
como antiviral em 1979, para o tratamento de infeces produzidas pelos HSV e VZV. O aciclovir
um anlogo da guanosina, que apresenta uma cadeia acclica em lugar da desoxirribose (Figura 9.7).
A forma trifosfato ativa encontra-se em concentraes 40 a 100 vezes maiores nas clulas infectadas
em comparao com as clulas sadias, inibindo a replicao do DNA viral e produzindo poucos
efeitos colaterais. Apresenta o melhor ndice teraputico (dose txica/dose efetiva) de todos os
antivirais, sendo praticamente desprovido de toxicidade, pois sua atuao se d quase que
exclusivamente nas clulas infectadas, j que precisa ser ativado pela timidino-cinase viral para
exercer seu efeito.
O aciclovir pode ser usado por via oral, endovenosa ou tpica. A apresentao oral pode ser na
forma de comprimidos, cpsulas ou suspenso. Esse antiviral deve ser administrado 2 a 5 vezes/dia,
durante 5 a 10 dias, dependendo da concentrao usada, comeando o mais cedo possvel, no
tratamento e profilaxia dos episdios de HSV mucocutneo, diminuindo a dor, o tempo de
permanncia do vrus na leso e o tempo de cicatrizao. No caso do tratamento supressivo da
recorrncia do herpes genital, devem-se administrar 400 mg, 2 vezes/dia, durante 12 meses (Quadro
9.6).
Na formulao como pomada, o aciclovir a 5% em propilenoglicol aplicado 4 vezes/dia,
durante 5 dias, nas leses mucocutneas localizadas. Observou-se cicatrizao mais rpida e
diminuio dos sintomas locais (dor, prurido, ardncia), e os efeitos foram melhores nos casos em
que se iniciou precocemente o tratamento. O aciclovir tpico recomendado para o herpes orofacial
e genital, tanto na primoinfeco quanto nas recorrncias, a fim de abreviar o tempo de cicatrizao
das leses e diminuir os sintomas locais (Quadro 9.6). Os melhores resultados so com a aplicao
precoce (at 8 h do incio dos primeiros sintomas). Nos casos relatados como insucessos, questionase o tempo de incio do tratamento (incio aps a instalao franca das leses) ou seleo de
mutantes resistentes.
Quadro 9.6 Drogas antivirais e posologia para tratamento de infeces por vrus herpes simplex e vrus da varicela-zoster.
Antiviral (via de

Vrus

Doena

administrao)

Aciclovir (EV)

Posologia*

Comentrios

5 mg/kg, 3/dia, 5 dias

Terapia EV preferida nos casos


graves com doena
disseminada (pacientes
imunocomprometidos); h
risco de nefropatia

400 mg, 3/dia, 5 a 10 dias


Aciclovir (oral)

800 mg, 2/dia, 5 a 10 dias


200 mg, 5/dia, 5 a 10 dias

Herpes mucocutneo
Aciclovir creme 5%

Herpes orofacial e herpes


genital

4/dia, 5 dias
500 mg, 2/dia, 3 dias

Herpes orofacial e
primoinfeco de herpes
genital e recorrncia

250 mg, 3/dia, 5 dias

Primoinfeco de herpes
genital

125 mg, 2/dia, 5 dias

Herpes genital recorrente

Aciclovir pomada 3%

5/dia, 7 a 14 dias

Herpes oftlmico

Aciclovir (oral)

400 mg, 5/dia, 7 a 14 dias

Valaciclovir (oral)

500 mg, 2/dia, 7 a 14 dias

Fanciclovir (oral)

125 mg, 2/dia, 7 a 14 dias

Encefalite herptica

Aciclovir (EV)

10 mg/kg, de 8/8 h, 2 a 3
semanas

Infeco neonatal

Aciclovir (EV)

10 mg/kg, de 8/8 h, 10 a 14 dias Risco de nefropatia

Aciclovir (oral)

400 mg, 2/dia, 12 meses (400


a 800 mg, 2 a 3/dia para
pacientes HIV-positivos)

Herpes genital recorrente

500 mg, 1/dia, 12 meses

Herpes genital com recorrncia


de < 9 episdios por ano

1.000 mg, 1/dia ou 500 mg,


2/dia, 12 meses

Herpes genital com recorrncia


de > 9 episdios por ano

Fanciclovir (oral)

250 mg 2/dia, 12 meses

Herpes genital recorrente

Aciclovir (EV)

10 a 12 mg/kg, de 12/12 h, 7
dias

Recomendado para pacientes


imunocomprometidos

600 a 800 mg, 5/dia, 7 a 10

Menos eficiente que valaciclovir


em virtude da baixa

Valaciclovir (oral)

Fanciclovir (oral)
HSV-1 e HSV-2
Ceratite herptica

Tratamento
supressivo

Valaciclovir (oral)

A administrao por via oral


controversa

Risco de nefropatia

VZV

Zoster

Aciclovir (oral)

dias

biodisponibilidade

Valaciclovir (oral)

1.000 mg, 3/dia, 7 dias

Prefervel para doena branda


ou localizada

Fanciclovir (oral)

500 mg, 3/dia, 7dias

EV = endovenosa; HSV-1 = vrus herpes simplex 1; HSV-2 = vrus herpes simplex 2; VZV = vrus da varicela-zoster. *Doses
para indivduos com funo renal normal.

Em pacientes imunocomprometidos, o aciclovir endovenoso (5 mg/kg, de 8/8 h, 5 dias) mostra-se


eficaz para diminuir a dor, abreviando o tempo de cicatrizao das leses e evitando formao de
novas vesculas (Quadro 9.6).
Em casos de encefalite, recomenda-se a dose de 10 mg/kg, de 8/8 h, com administrao
endovenosa durante 2 a 3 semanas.
Em pacientes com ceratite herptica, o aciclovir administrado na formulao de pomada a 3%,
para ser usado 5 vezes/dia, durante 7 a 14 dias.
Os efeitos colaterais do aciclovir, em geral, so leves e incluem nusea e diarreia. Somente no
caso de pacientes com grau insuficiente de hidratao ou com funo renal comprometida, pode
ocorrer um efeito adverso quando o aciclovir usado por via sistmica, que a alterao da funo
renal devido cristalizao e ao depsito do frmaco nos rins. Por sua potente seletividade e baixa
toxicidade , atualmente, o antiviral de escolha para o tratamento das diferentes formas de infeco
herptica produzida pelos HSV-1 e HSV-2, podendo ser usado tambm para infeces causadas pelo
VZV, mas com menor eficincia. Alguns estudos tambm mostraram que o aciclovir pode evitar a
recorrncia se for administrado no primeiro episdio de herpes genital.

Mecanismo de ao
Dentro da clula, o aciclovir fosforilado passando forma monofosfato, por intermdio da
timidino-cinase viral. A partir dessa primeira fosforilao, crucial para a seletividade do aciclovir,
enzimas celulares transformam-no em di (DP) e trifosfato (TP). Dessa maneira, o aciclovir-TP
compete com a desoxiguanosina-TP como substrato para a DNA polimerase viral, que ento o
incorpora na cadeia do DNA viral que est sendo sintetizada. Devido ao fato de o aciclovir no
apresentar a hidroxila (OH) na posio 3, necessria ligao de outros nucleotdeos, a sntese do
DNA interrompida (Figura 9.11). Alm disso, a DNA polimerase forma uma ligao irreversvel
com o aciclovir-TP, com inativao da enzima. No entanto, mutaes na timidino-cinase ou DNA
polimerase virais podem produzir mutantes resistentes ao aciclovir, que podem causar infeces
graves em pacientes imunocomprometidos, principalmente com AIDS.

Valaciclovir
O valaciclovir (Valtrex) uma pr-droga (Figura 9.7) do aciclovir e, por ser um ster de Lvalina, tem biodisponibilidade consideravelmente superior ao aciclovir, sendo absorvido com maior
eficincia e, por isso, so usadas doses mais baixas. Aps a administrao oral, o valaciclovir
convertido por esterases a aciclovir e valina, pelo metabolismo de primeira passagem no fgado.
Esse antiviral utilizado para tratamento de infeces orofaciais ou genitais pelo HSV, assim como
de herpes-zoster causado pelo VZV.

Figura 9.11 Mecanismo de ao do aciclovir. A timidino-cinase viral adiciona um fosfato ao aciclovir, que passa forma
monofosfato (MP). A partir dessa primeira fosforilao, passa a di (DP) e trifosfato (TP), por intermdio de enzimas
celulares. Desse modo, o aciclovir-TP compete com a desoxiguanosina-TP, no stio de ao da DNA polimerase viral, que
ento o incorpora na cadeia do DNA viral que est sendo sintetizada. Devido ao fato de o aciclovir no apresentar a hidroxila
(OH) na posio 3, necessria ligao de outros nucleotdeos, a sntese do DNA interrompida. Alm disso, a DNA
polimerase forma uma ligao irreversvel com o aciclovir-TP.

No tratamento da primoinfeco do herpes genital e no tratamento da recorrncia (Quadro 9.6),


um estudo com 1.170 pacientes mostrou que o uso de 500 mg de valaciclovir 2 vezes/dia, durante 3
dias, suficiente para a remisso das leses, enquanto o aciclovir precisa de 5 a 10 dias para surtir o
mesmo efeito com maior nmero de tomadas dirias. O valaciclovir tambm foi superior em tempo
de cura e em tempo de resoluo do episdio em 75% dos pacientes, alm de abortar o surgimento
de leses em 31% dos pacientes. A mdia de tempo de liberao de partculas virais no grupo
valaciclovir foi 50% menor que a do grupo placebo. Em pacientes imunocomprometidos, a posologia
recomendada de 2 comprimidos de 500 mg ou 1 comprimido de 1.000 mg, 3 vezes/dia, durante 7 a
14 dias. Durante o tratamento, o valaciclovir acelera a cicatrizao das leses e diminui a durao
da dor durante o episdio de herpes. Tambm diminui o tempo de shedding viral, perodo durante o
qual o vrus detectado na mucosa genital, sem causar sintomas, e pode ser transmitido para o
parceiro sexual.
No caso de ceratite herptica, recomenda-se a dose de 500 mg, de 12/12 h, durante 7 a 14 dias.
Quando o valaciclovir administrado assim que os primeiros sinais da leso herptica so
observados, como formigamento, coceira ou vermelhido, o medicamento pode ser capaz de evitar
completamente o desenvolvimento das vesculas dolorosas. Nos testes clnicos, o valaciclovir
preveniu o desenvolvimento de vesculas e lceras em 1/3 a mais de pacientes quando comparado ao
placebo, alm de reduzir a transmisso do vrus a contatos suscetveis.
O valaciclovir pode ser usado como tratamento supressivo visto que ensaios clnicos
comprovaram que esse frmaco previne ou retarda as recorrncias de herpes. No tratamento
supressivo, necessrio tomar 500 mg ou 1.000 mg do valaciclovir, dependendo da frequncia dos
episdios de recorrncia (Quadro 9.6). Os efeitos colaterais do valaciclovir, em geral, so leves e
podem incluir cefaleia ou nusea. Um estudo mostrou que o uso do valaciclovir em concentrao de
500 mg em dose nica diria usada no tratamento supressivo foi capaz de controlar o aparecimento
de recorrncia em 69% dos pacientes contra apenas 9,5% dos pacientes em uso de placebo.
Em pacientes imunocomprometidos, o tratamento do herpes simplex orofacial com valaciclovir
na concentrao de 1.000 mg, 2 vezes/dia, se mostrou to eficaz quanto com aciclovir 200 mg, 5
vezes/dia; porm o valaciclovir apresenta melhor posologia.
Com relao ao tratamento de herpes-zoster, o valaciclovir mostrou eficcia superior na
recuperao do paciente em comparao com o aciclovir: resoluo mais rpida da dor aguda
associada; menor tempo de durao das leses; menor incidncia de pacientes com dor ps-herptica

e menor incidncia de dor persistente por mais de 6 meses aps o episdio.

Mecanismo de ao
O valaciclovir apresenta o mesmo mecanismo de ao do aciclovir (Figura 9.11).

Fanciclovir
O fanciclovir (Famvir, Penvir) um derivado acclico da guanosina (Figura 9.7). Esse
antiviral uma pr-droga que metabolizada no fgado e intestinos e se transforma na forma ativa
penciclovir (2-amino-9-[4-hidroxi-3-(hidroximetil)butil]-6,9-di-hidro-3H-purin-6-ona), molcula
semelhante ao aciclovir. O fanciclovir bem absorvido por via oral e apresenta biodisponibilidade
melhor que a do aciclovir. indicado para o tratamento de infeces agudas por VZV; tratamento ou
supresso de herpes genital recorrente em pacientes imunocompetentes e tratamento de infeces
mucocutneas orofaciais recorrentes, em pacientes imunocompetentes. encontrado em comprimidos
na concentrao de 125 mg, 250 mg e 500 mg. No tratamento do herpes-zoster, a posologia de 500
mg, 3 vezes/dia, por 7 dias (Quadro 9.6). O tratamento deve ser iniciado o mais cedo possvel no
curso da doena, imediatamente aps o diagnstico. No caso de herpes genital, no primeiro episdio
de infeco, a posologia 250 mg, 3 vezes/dia, durante 5 dias. Para tratamento de infeces genitais
recorrentes, administrar 125 mg, 2 vezes/dia, durante 5 dias. Recomenda-se iniciar o tratamento
durante o perodo prodrmico ou o mais cedo possvel aps o incio das leses. Em pacientes
imunodeficientes, para o tratamento de infeco herptica recorrente orofacial ou genital, a dose
recomendada de 500 mg, 2 vezes/dia, durante 7 dias.
O fanciclovir capaz de reduzir o tempo de durao das leses herpticas, alm de diminuir a
dor. De modo semelhante ao valaciclovir e aciclovir, o fanciclovir tambm encurta o perodo durante
o qual o vrus detectado na mucosa genital; em alguns pases, aprovado para uso dirio como
tratamento supressivo no herpes genital, com administrao de 250 mg, 2 vezes/dia, durante 12
meses.
Em caso de ceratite herptica, pode ser administrado na dose de 125 mg, 2 vezes/dia, durante 7 a
14 dias (Quadro 9.6). Os efeitos colaterais do fanciclovir so leves, sendo os mais comuns, cefaleia
e nusea.
A indicao do uso de antivirais (aciclovir, valaciclovir ou fanciclovir) orais em algumas
manifestaes da doena ocular herptica ainda controversa. Parece existir uma concordncia em
se prescrever o antiviral oral nos casos de infeco primria extensa e grave, em casos selecionados
de ceratouvete, endotelite, iridociclite e trabeculite, pacientes imunocomprometidos, nas profilaxias
de pacientes com doena ocular herptica com alta frequncia de recorrncia e nos pacientes
submetidos a transplante de crnea. A dose recomendada de 400 mg, 5 vezes/dia, durante 7 a 14
dias, para o aciclovir; 500 mg, 2 vezes/dia, durante 7 a 14 dias, para o valaciclovir; e 125 mg, 2

vezes/dia, durante 7 a 14 dias, para o fanciclovir (Quadro 9.6).


O MS do Brasil, por intermdio do SUS, oferece apenas o medicamento aciclovir por meio do
Componente Bsico da Assistncia Farmacutica, e no disponibiliza o valaciclovir e o fanciclovir,
por considerar o aciclovir e o aciclovir sdico (injetvel) medicamentos de primeira escolha em
infeces causadas pelo HSV-1, HSV-2 e VZV, em pacientes imunocompetentes e
imunocomprometidos.

Mecanismo de ao
O fanciclovir apresenta o mesmo mecanismo de ao do aciclovir (Figura 9.11).

Ganciclovir
O ganciclovir (9-[1-3-desidroxi-2-propoxi]metilguanina), DHPG, Cymevene, Cytovene, um
anlogo da guanosina, semelhante ao aciclovir e ao fanciclovir (Figura 9.7). ativo contra todos os
herpesvrus, mas cerca de 100 vezes mais ativo contra o citomegalovrus humano (HCMV). A
infeco pelo HCMV a causa mais frequente de cegueira em pacientes imunodeficientes,
principalmente aqueles com AIDS (para mais informaes, ver Captulos 13 e 19).
O principal efeito adverso do ganciclovir a toxicidade para a medula ssea, com neutropenia,
anemia e diminuio de plaquetas, alm de sintomas gastrointestinais, como diarreia, nusea, vmito
e dor abdominal. Pode ocorrer tambm descolamento de retina, febre, cefaleia, insnia, parestesia e
neuropatia perifrica. Usado por via sistmica, induz neutropenia de leve a moderada em 54% dos
pacientes.
Devido sua elevada toxicidade, o ganciclovir foi licenciado apenas para o tratamento de
retinite causada por HCMV em pacientes aidticos, como profilaxia em pacientes submetidos a
transplantes de rgos ou medula, ou como tratamento se for verificada a ativao do HCMV nesses
indivduos.
Atualmente, j esto disponveis implantes oculares de ganciclovir (Vitravene) para tratamento
da retinite, que liberam o ganciclovir gradativamente e evitam a toxicidade sistmica.
A resistncia viral ao ganciclovir pode aparecer por diferentes mecanismos, entre os quais
mutao no gene da fosfotransferase UL97 ou mutao no gene da DNA polimerase viral.

Mecanismo de ao
O HCMV no apresenta timidino-cinase, portanto o ganciclovir monofosforilado por uma
fosfotransferase codificada pelo gene UL97 presente no genoma do vrus, com posterior fosforilao
por enzimas celulares. Na forma trifosfato, o ganciclovir incorporado ao DNA que est sendo
sintetizado, sendo um inibidor competitivo da incorporao da desoxiguanosina trifosfato (DGTP)
pela DNA polimerase viral. O ganciclovir no se liga irreversivelmente DNA polimerase como o

aciclovir, mas tambm interrompe a sntese do DNA por no possuir a OH no carbono 3. O


ganciclovir-TP inibe mais eficientemente a DNA polimerase do HCMV do que as polimerases
celulares, embora seja extremamente txico. A possibilidade de resistncia viral deve ser
considerada em pacientes que demonstrem pouca resposta clnica ou excreo viral persistente
(Figura 9.12).

Valganciclovir
De maneira semelhante ao valaciclovir, o valganciclovir (Valcyte) uma pr-droga por ser um
ster de valina (Figura 9.7). Seus efeitos txicos, portanto, so os mesmos do ganciclovir. Aps a
administrao oral, o valganciclovir rapidamente convertido em ganciclovir por esterases
hepticas e intestinais.
Seu uso recomendado na retinite causada por HCMV em pacientes aidticos, como profilaxia
em pacientes que iro ser submetidos a transplantes de rgos ou medula, ou como tratamento caso
seja verificada a ativao do HCMV nesses indivduos.
Tem sido proposto o uso de valganciclovir na sndrome da fadiga crnica, com resultados
satisfatrios em um nmero muito reduzido de pacientes, sendo ainda necessria a realizao de mais
pesquisas.
A dose recomendada para uso na retinite ativa de 900 mg, 2 vezes/dia, durante 21 dias. Em
dose de manuteno, o valganciclovir administrado 1 vez/dia, na mesma concentrao. No caso de
pacientes submetidos a transplante, a dose de 900 mg, 1 vez/dia, iniciado at o 10o dia aps o
transplante e continuado at o 100o dia.

Mecanismo de ao
O mecanismo de ao do valganciclovir o mesmo do ganciclovir (Figura 9.12).

Cidofovir
O cidofovir ou (S)-9-(3-hidroxi-2-fosfonilmetoxipropil)citosina (HPMPC, Vistide) um
anlogo nucleotdico da desoxicitidina monofosfato (dCMP) e foi o primeiro anlogo de nucleotdeo
a ser licenciado (Figura 9.13). Apresenta um amplo espectro de atuao e recomendado para o
tratamento de retinite causada pelo HCMV em pacientes com AIDS, que no apresentem alterao da
funo renal, retardando a progresso da retinite em pacientes que ainda no tenham sido tratados.
Apresenta meia-vida longa, o que faz com que possa ser administrado em doses menos frequentes (2
vezes/semana), no havendo, portanto, necessidade de implantao de cateter venoso. A
administrao do cidofovir retarda a progresso da retinite causada pelo HCMV. Porm, devido
sua nefrotoxicidade, administrado juntamente com probenecida e soro fisiolgico para hidratao.

Mecanismo de ao

O cidofovir precisa sofrer fosforilao por meio de cinases celulares que adicionam dois
fosfatos, convertendo-o em um derivado trifosfatado, que a forma ativa. Dessa maneira, a ativao
do cidofovir ocorre tanto em clulas infectadas quanto em sadias. O cidofovir trifosfato inibe
competitivamente a incorporao da desoxicitidina-trifosfato (dCTP) cadeia de DNA, ao se ligar
DNA polimerase, impedindo a adio dos nucleotdeos naturais. No entanto, s age como um
terminador de cadeia quando duas molculas do cidofovir so adicionadas sequencialmente ao
DNA do HCMV.

Fomivirsen sdico
O fomivirsen (Vitravene) um fosforotioato oligonucleotdico com 21 bases que inibe a
replicao do HCMV por um mecanismo antisense, e foi o primeiro antiviral apresentando esse
mecanismo, a ser aprovado pela FDA. utilizado no tratamento da retinite pelo HCMV em pacientes
imunocomprometidos, incluindo aqueles com AIDS. Devido sua estrutura qumica, resistente
degradao por nucleases.
A sequncia 5-GCG TTT GCT CTT CTT CTT GCG-3 antisense e se liga a uma regio do
RNAm viral. Est disponvel para injees intraoculares na concentrao de 6,6 mg/m. O
fomivirsen mais ativo que as outras drogas anti-HCMV disponveis, apresenta uma dosagem mais
conveniente e efetiva, mais seletivo e apresenta baixa incidncia de efeitos colaterais, mesmo
quando administrado sistemicamente. Na forma de implante, o fomivirsen superior ao ganciclovir.
Alm disso, potencializa o efeito do ganciclovir ou foscarnet quando usado em associao.

Figura 9.12 Mecanismo de ao do ganciclovir e do valganciclovir. GCV = ganciclovir; VGC = valganciclovir; MP =


monofosfato; DP = difosfato; TP = trifosfato.

Figura 9.13 Anlogo nucleotdico anti-HCMV.

Mecanismo de ao
A sequncia nucleotdica do fomivirsen complementar sequncia do RNAm referente ao gene
imediatamente inicial 2 (IE2) do HCMV. Essa regio do genoma codifica vrias protenas
responsveis pela regulao da expresso gnica essencial para a sntese do HCMV infeccioso. O
fomivirsen se liga ao RNAm e inibe a sntese de IE2 com consequente inibio da replicao viral.

Fosfonoformato
O fosfonoformato (Foscarnet) o sal sdico do cido fosfonofrmico e um anlogo do
pirofosfato (Figura 9.14). utilizado no tratamento da retinite por HCMV, em pacientes
imunodeficientes. A vantagem ser menos txico para a medula ssea do que o ganciclovir, e poder
ser usado concomitantemente com a zidovudina (AZT). Esse antiviral tambm prescrito para
pacientes que sofrem de leses invasivas e graves causadas por HSV e VZV resistentes ao aciclovir.
Devido sua baixa biodisponibilidade, a administrao do fosfonoformato torna-se difcil,
requerendo administrao endovenosa, por meio de bomba de infuso. Seu principal efeito colateral
a leso renal.

Mecanismo de ao
Diferentemente dos anlogos nucleosdicos, o fosfonoformato no precisa ser fosforilado ou
ativado por enzimas celulares ou virais. Ele se liga DNA polimerase do HCMV, no stio de ligao
do pirofosfato, inibindo, de maneira no competitiva, a ligao dos nucleotdeos. Uma hiptese para
esse mecanismo de inibio seria a de que o fosfonoformato formaria um intermedirio instvel com
os nucleotdeos, resultando na degradao do cido nucleico.

Doxorrubicina

A doxorrubicina a hidroxidaunomicina, uma antraciclina isolada de Streptomyces peucetius


var. caesius. uma droga citosttica, utilizada em vrias patologias por sua ao antineoplsica. A
doxorrubicina lipossomal um sistema alternativo de liberao da doxorrubicina, administrada por
infuso endovenosa, no tratamento de pacientes com sarcoma de Kaposi relacionado com a AIDS
(para mais informaes, ver Captulo 19). A doxorrubicina tambm usada em leucemias agudas
linfoblsticas e mieloblsticas; tumor de Wilms; neuroblastoma; mieloma mltiplo; sarcomas de
tecido mole; osteossarcomas; carcinomas de bexiga, mama, ovrio, tireoide, estmago e pulmo;
linfomas de Hodgkin e no Hodgkin; e sarcoma de Ewing.

Figura 9.14 Anlogo do pirofosfato.

Existem 3 apresentaes da doxorrubicina: convencional, lipossomal e associada ao


polietilenoglicol (PEG). Lipossomas so vesculas microscpicas compostas de uma bicamada
fosfolipdica, que so capazes de encapsular drogas ativas.
A associao da doxorrubicina com PEG (Doxopeg) somente deve ser utilizada caso o paciente
no responda ao tratamento com a doxorrubicina tradicional ou a outros quimioterpicos como
interferon. Caelyx o cloridrato de doxorrubicina encapsulado em lipossomas com
metoxipolietilenoglicol (MPEG) conjugado na superfcie. Esse processo conhecido como
peguilao e protege os lipossomas da deteco pelo sistema fagoctico mononuclear, o que prolonga
o tempo de circulao sangunea do medicamento.

Mecanismo de ao
A doxorrubicina se liga ao DNA, inibindo a sntese de cido nucleico viral e da clula. Estudos
sobre o mecanismo de atuao em estruturas celulares tm mostrado rpida penetrao celular e
ligao cromatina perinuclear, com rpida inibio da atividade mittica, com induo de
mutagnese e aberrao cromossomial. O mecanismo antineoplsico explicado pela intercalao na
dupla-hlice do DNA, formando um complexo ternrio com a topoisomerase II e com o DNA. A
estabilizao do complexo de clivagem inibe novas ligaes do DNA e provoca quebras na duplahlice. Tambm inibe diretamente a topoisomerase II, interage com as membranas celulares e
mitocondriais, perturba a transmisso de sinais intracelulares e forma radicais livres. Finalmente,
desencadeia o processo de morte celular por apoptose.

Drogas anti-HPV e anti-HHV-8


Interferon- convencional e interferon- peguilado
Interferons (IFN) apresentam natureza qumica glicoproteica. So descritos 3 diferentes tipos de
IFN: tipo I ( e ), tipo II () e tipo III (), com base nas caractersticas estruturais, tipo de
receptores requeridos e atividades biolgicas. Embora todos os tipos de IFN estimulem a resposta
imunolgica, contribuindo para a eliminao dos vrus, somente os IFN tipos I e III so diretamente
produzidos em resposta a uma infeco viral. At recentemente, foi aceito que o IFN tipo I era o
nico mediador precoce da resposta inata aos vrus, assim como regulador da subsequente resposta
do sistema imunolgico adaptativo. Mais tarde, verificou-se que havia um grupo de protenas
funcionalmente similares ao IFN tipo I, as quais foram denominadas IFN tipo III (IFN- ou IL-28/29).
Consequentemente, tanto o IFN tipo I quanto o tipo III compartilham a mesma propriedade de induzir
a clula a um estado antiviral (para mais informaes, ver Captulo 7). O IFN-, classificado
como tipo II, chamado de interferon imune e depende da estimulao de mitgenos e antgenos para
a sua produo pelas clulas do sistema imunolgico. Os IFN tipo I so reconhecidos no somente
por sua atividade antiviral, como tambm pela ao antitumoral, e por isso so usados tambm no
tratamento de vrios tipos de neoplasias.
Os IFN produzidos no organismo so chamados de endgenos, enquanto os que so administrados
durante um tratamento com finalidade antiviral so denominados exgenos. Os IFN utilizados como
quimioterpicos so IFN-, que podem ser produzidos em culturas de clulas e posteriormente
purificados, ou fabricados por tcnicas de engenharia gentica. Os primeiros IFN utilizados em seres
humanos apresentavam muitas impurezas oriundas da suspenso de clulas utilizadas na sua
preparao.
Existem 2 tipos de IFN exgenos utilizados na prtica teraputica: IFN- convencional (2a =
Roferon-A; 2b = Intron-A), e o IFN- associado ao polietilenoglicol: IFN- peguilado (2a =
Pegasys; 2b = PegIntron).
O IFN- recomendado no tratamento de pacientes portadores de verrugas genitais produzidas
pelos vrus do papiloma humano (HPV) e no tratamento dos tumores produzidos pelo vrus do
sarcoma de Kaposi (HHV-8). Alm disso, o IFN- utilizado no tratamento de pacientes portadores
de infeco crnica pelo HBV, ou portadores do HCV no estgio agudo ou crnico (o emprego do
IFN- para o tratamento das hepatites B e C ser abordado nos tpicos seguintes).
Para o tratamento das verrugas genitais, o IFN- administrado por meio de injees no local da
leso, sendo necessrias 3 injees por semana, durante 3 semanas, ou 2 injees por semana,
durante 8 semanas, dependendo do tipo de IFN.
O tratamento do sarcoma de Kaposi com IFN- apresenta resultados contraditrios. Pode ser
administrado por injeo local (o que alguns autores consideram ineficiente) ou por via sistmica,

com resposta parcial ou total em 30 a 70% dos casos, mas que envolve vrios efeitos colaterais.
Os efeitos colaterais relacionados com a administrao de IFN so: sintomas gripais (astenia,
cefaleia, dores musculares), fadiga intensa, insnia, depresso, anemia, dores nas articulaes,
disfuno da tireoide, hipertrigliceridemia e alteraes neuropsiquitricas, diferentes em cada
paciente. Alguns pacientes apresentam, ainda, retinopatia, alteraes auditivas e gastrointestinais,
enquanto outros no so acometidos por nenhum efeito colateral. A maior parte dos doentes consegue
completar o tratamento, porm em alguns casos, necessria a reduo das doses (20% dos
pacientes) ou a sua descontinuidade (5%).

Mecanismo de ao
Quando o IFN- se liga aos receptores presentes na membrana celular, ele ativa genes
especficos que so transcritos em RNAm, que, por sua vez, so traduzidos em protenas que
interferem na replicao viral. O IFN liga-se a receptores R1 e R2 na membrana das clulas,
ativando os genes para a produo de cinases celulares tirosino-cinase 2 (Tyk2) e Janus-cinase 1
(JaK1), que fosforilam 2 protenas denominadas STAT (signal transducers as well as activators of
transcription), STAT 1 e STAT 2, presentes no citoplasma. Essas protenas fosforiladas, juntamente
com outra protena celular IRF-9 (IFN regulatory factor-9), formam um complexo conhecido como
ISGF3 (IFN-stimulated genes factor 3), que translocado do citosol para o ncleo onde se liga em
promotores de genes celulares chamados ISRE (IFN-stimulated response elements), ativando a
transcrio de RNAm que daro origem a protenas antivirais, levando a um estado antiviral na
clula. Os principais efeitos antivirais do interferon so produzidos por 2 enzimas: 2, 5oligoadenilato sintetase, que ativa a endonuclease RNase L, que, por sua vez, degrada o RNAm viral;
e uma proteno-cinase especfica para o fator de iniciao ribossomal (eIF2a), que fosforila e inativa
o RNAm viral, ocorrendo, assim, a inibio da sntese de protenas virais (e celulares). Alm disso,
o IFN induz a produo da enzima ADAR1 (adenosine deaminase acting on RNA), a qual
desestabiliza RNA de fita dupla, transformando adenosina em inosina, levando edio
pstranscricional dos RNAm transcritos e consequente inativao desses RNA. Mais um papel dos
IFN o estmulo de outras protenas como a GTPase MX, que desfosforila GTP em GDP e induz a
liberao de xido ntrico nas clulas (Figura 9.15).

Drogas anti-HBV
As drogas licenciadas pela FDA para o tratamento da hepatite B crnica so: interferon-
convencional, interferon- peguilado, fumarato de tenofovir disoproxil, adefovir dipivoxil,
lamivudina, entecavir e telbivudina.
Os objetivos da terapia contra o vrus da hepatite B (HBV) em pacientes com hepatite crnica
so: tornar o nvel do DNA indetectvel, quando analisado pela reao em cadeia da polimerase

(PCR); e negativar o HBsAg. De maneira geral, a terapia est indicada para os pacientes com as
transaminases ALT (alanino-aminotransferase) e AST (aspartato-aminotransferase) elevadas e que
tenham o DNA do HBV detectvel. Pacientes com ALT/AST normais, mas que apresentem o DNA do
HBV, devem ter a terapia indicada com base na bipsia heptica com resultado de fibrose em estgio
2, ou atividade necroinflamatria significativa (para mais informaes, ver o Captulo 16).

Interferon- convencional
Alm de apresentar ao antiviral, o interferon (IFN)- convencional (2a = Roferon-A; 2b =
Intron-A) tambm tem ao sobre o sistema imunolgico do indivduo, com ao antiproliferativa e
imunomoduladora.
O Ministrio da Sade (MS) do Brasil recomenda o emprego de IFN- convencional para o
tratamento inicial da hepatite B crnica, por apresentar um perodo de tratamento definido, deixando
a lamivudina para pacientes que no respondem ao tratamento, embora esta seja de administrao
oral, de baixo custo e empregada como alternativa mais segura e eficaz devido aos significativos
efeitos colaterais e baixa resposta associados ao uso de IFN-.
A dose de IFN- recomendada 4,5 ou 5 milhes de unidades internacionais (UI) dirias durante
16 a 24 semanas, por via subcutnea. Como esquema alternativo, podem ser utilizadas 9 ou 10
milhes de UI, 3 vezes/semana, durante o mesmo perodo, e pela mesma via de aplicao. Pacientes
que no apresentarem soroconverso em 16 semanas (respondedores parciais e no respondedores)
devero ter seu tratamento prolongado at completar 24 semanas.
Estudos americanos e europeus demonstraram benefcio no emprego de IFN, tanto na preveno
do carcinoma hepatocelular (CHC) quanto na remisso da evoluo de doena heptica avanada.
Em todos os estudos de acompanhamento de pacientes tratados com IFN, por longo prazo, a
ampliao da sobrevida correlacionou-se com a faixa etria mais jovem, ausncia de cirrose e
resposta positiva ao tratamento: negativao do HBeAg, reduo do HBV-DNA e normalizao
bioqumica.

Figura 9.15 Mecanismo de ao do interferon (para detalhes ver texto).

Os pacientes com hepatite B crnica candidatos ao tratamento com IFN e outras drogas antivirais
so divididos em 3 categorias de acordo com o Protocolo clnico e diretrizes teraputicas para o
tratamento da hepatite viral crnica B e coinfeces, do MS (2011): indivduos virgens de
tratamento, no cirrticos, com HBeAg reagente; indivduos virgens de tratamento, no cirrticos,
com HBe no reagente; e indivduos virgens de tratamento cirrticos, com HBeAg reagente ou no
reagente.
Em pacientes que apresentem o HBeAg reagente, a carga viral (HBV-DNA) no critrio de
definio para o incio do tratamento, pois h alta probabilidade de o resultado do exame ser
superior a 105 cpias/m ou > 20.000 UI/m, sendo desnecessrio, portanto, realiz-lo nesse
momento.
Os indivduos virgens de tratamento, no cirrticos, com HBeAg reagente so considerados
respondedores se apresentarem a negativao do HBeAg e a soroconverso anti-HBe. Aps o

trmino do tratamento, devem ser monitorados com exames de ALT/AST a cada 6 meses e carga viral
anual. Por sua vez, aqueles que negativarem o HBeAg, mas no apresentarem soroconverso antiHBe, so considerados respondedores parciais. A persistncia do HBeAg at o final do tratamento
define o paciente no respondedor. Nesses casos, recomenda-se repetir as sorologias HBeAg e antiHBe aps 3 meses do trmino do tratamento; caso tenha ocorrido a soroconverso, o paciente
considerado respondedor sorolgico. Na ocorrncia de anti-HBe no reagente, independentemente da
presena do HBeAg, indicada a realizao do HBV-DNA. Caso o HBV-DNA seja < 104 cpias/m
ou < 2.000 UI/m, o paciente dever ser monitorado com o mesmo exame, a cada 6 meses; se HBVDNA for > 104 cpias/m ou > 2.000 UI/m, indica-se retratamento com fumarato de tenofovir
disoproxil (TDF). Caso exista contraindicao ao uso de TDF (como presena de insuficincia renal
ou comorbidades associadas ao risco de perda da funo renal), o uso de entecavir deve ser
considerado.
Nos indivduos virgens de tratamento, no cirrticos, com HBeAg no reagente, recomenda-se
primeiramente a dosagem de ALT/AST. Se as transaminases se apresentarem normais, recomenda-se
monitoramento e teste para HBV-DNA a cada 6 meses. Se o HBV-DNA for < 104 cpias/m ou <
2.000 UI/m, o tratamento no est indicado. O paciente deve ser monitorado com as transaminases e
HBV-DNA, a cada 6 meses. Se o HBV-DNA for 104 cpias/m ou 2.000 UI/m, est indicado o
tratamento independentemente da realizao da bipsia heptica. Se as transaminases se alterarem
durante o seguimento, deve-se solicitar HBV-DNA. Nesse caso, podem ocorrer 3 situaes: (1)
HBV-DNA < 103 cpias/m ou < 200 UI/m: no h indicao de tratamento. O paciente deve ser
monitorado com transaminases e HBV-DNA, a cada 6 meses; (2) HBV-DNA 103 ou 200 UI/m e <
104 cpias/m ou < 2.000 UI/m, considerar a realizao da bipsia. Caso o resultado demonstre
atividade inflamatria e/ou fibrose < A2 e/ou < F2, o paciente monitorado com as transaminases e
HBV-DNA, a cada 6 meses. Em caso de resultados com atividade inflamatria e/ou fibrose A2
e/ou F2, est indicado o tratamento; (3) HBV-DNA 104 cpias/m, est indicado o tratamento,
independentemente da realizao de bipsia heptica.
Em pacientes cirrticos, independentemente do HBeAg, a carga viral (HBV-DNA) no critrio
definidor do incio de tratamento, sendo, portanto, desnecessrio realiz-la nesse momento. Como j
existe cirrose, a realizao de bipsia heptica deve ser individualizada.
Os indivduos virgens de tratamento cirrticos com HBeAg reagente, independentemente da
classificao Child-Pugh, e pacientes com HBeAg no reagente com classificao Child-Pugh B e C
devem iniciar tratamento independentemente das transaminases e do HBV-DNA. Indivduos com
cirrose classificada como Child-Pugh B e C devem ter seu tratamento mantido e ser encaminhados
lista de transplante heptico. Indivduos cirrticos HBeAg no reagentes com cirrose Child-Pugh A
devem ser monitorados com ALT/AST e HBV-DNA semestralmente, podendo ser encontradas 2
situaes: (1) pacientes com ALT/AST normal e HBV-DNA < 103 cpias/m (200 UI/m) no tm
indicao de tratamento, devendo ser monitorados com HBV-DNA e ALT/AST semestralmente; (2)

para pacientes com ALT/AST alteradas e/ou HBV-DNA 103 cpias/m (200 UI/m), est indicado
o tratamento.

Mecanismo de ao
O mecanismo de ao do IFN foi descrito no tpico Drogas anti-HPV e anti-HHV-8 deste
captulo.

Interferon- peguilado
O interferon- peguilado (2a = Pegasys; 2b = PegIntron) o IFN convencional modificado,
que apresenta novas caractersticas, como a de poder ser aplicado apenas 1 vez/semana, mantendo
constante o seu nvel no sangue, o que teoricamente possibilita maior eficcia do tratamento. O
interferon peguilado (IFN-PEG) tem se mostrado mais eficaz e com menor ndice de efeitos
colaterais, j sendo usado rotineiramente no tratamento da hepatite C. No entanto, so necessrios
mais estudos para que possa ser utilizado tambm na hepatite B, j que os realizados at o momento
no mostraram vantagem significativa em relao ao IFN convencional.
Tanto o IFN- convencional quanto o IFN- peguilado apresentam atividade antiviral e
imunomoduladora, podendo ser utilizados no tratamento de pacientes com hepatite B, sejam eles
HBeAg-positivos ou HBeAg-negativos. Nos pacientes HBeAg-positivos, o declnio desse marcador
e a soroconverso, utilizando o IFN, podem ser alcanados com 12 meses de tratamento. No existem
estudos comparativos entre os dois tipos de IFN que possam indicar qual superior em cada caso
especfico, mas a vantagem do IFN-PEG reside no fato de ser de longa ao.

Mecanismo de ao
O mecanismo de ao do IFN foi descrito no tpico Drogas anti-HPV e anti-HHV-8 deste
captulo.

Fumarato de tenofovir disoproxil


O fumarato de tenofovir disoproxil (TDF, Viread) o fumarato de 9-[(R)-2[[bis[[(isopropoxicarbonil)oxi]metoxi]fosfinil]metoxi]propil]adenina (1:1) (Figura 9.16). uma
pr-droga do tenofovir disoproxil, um anlogo nucleotdico da desoxiadenosina monofosfato. O TDF
tem melhor potncia de inibio da replicao do HBV e maior rapidez de ao que o adefovir
dipivoxil (ADF), alm de apresentar melhor perfil de resistncia (Quadro 9.7). Sendo uma prdroga, o TDF hidrolisado e convertido na forma ativa tenofovir disoproxil nos intestinos.
A dose de TDF de 300 mg, administrada 1 vez/dia, por via oral. Em pacientes virgens de
tratamento, aps 1 ano de terapia com TDF, houve reduo de 4 a 6 log10 na carga viral dos
pacientes. Um estudo randomizado, duplo-cego, em pacientes HBeAg no reagentes previamente

experimentados com IFN e/ou anlogos de nucleosdeos, como a lamivudina ou entricitabina,


comparando TDF com ADF, demonstrou a supresso viral em 93% dos que receberam TDF e 63%
dos que receberam ADF. Tambm nos pacientes HBeAg reagentes, a proporo de supresso viral
foi estatisticamente superior no grupo TDF (76%) em relao ao grupo ADF (13%).
Durante o perodo da terapia, o paciente tem os marcadores HBsAg e anti-HBs avaliados a cada
24 semanas, e as transaminases a cada 12 semanas. O HBV-DNA deve ser solicitado na 12a e na 24a
semanas para avaliar a resposta viral precoce. Pacientes so considerados respondedores se
apresentam soroconverso para anti-HBs e indetectabilidade do HBV-DNA. Para pacientes
respondedores parciais ou no respondedores, recomenda-se investigar a no adeso ao tratamento
ou o surgimento de resistncia, que caso no seja evidenciada, a avaliao deve ser
preferencialmente realizada por especialistas no tratamento da hepatite B crnica.

Figura 9.16 Anlogos nucleotdicos anti-HBV.

Quadro 9.7 Resistncia cruzada das estirpes do HBV mais frequentes.


Estirpe viral

Lamivudina

Entecavir

Tenofovir

Adefovir

Vrus selvagem

M204I

L180M + M204V

A181T/V

N236T

L180M + M204V/I I169T V173L


M250V

L180M + M204V/I T184G


S202I/G

S = sensvel; R = resistente; I = intermedirio. (Adaptado de Fournier C, Zoulim F. Antiviral therapy of chronic hepatitis B:
prevention of drug resistance. Clin Liver Dis. 2007; 11:869-892)

O tempo de tratamento definido quando h soroconverso para anti-HBs. Para a suspenso do


tratamento, necessrio que se tenha alcanado a indetectabilidade do HBV-DNA durante 6 meses
aps a soroconverso. A partir da suspenso do tratamento, preciso monitorar as transaminases
trimestralmente e o HBsAg semestralmente.
Embora bem tolerado, o TDF pode causar nefrotoxicidade, embora com menor frequncia que o
ADF. Estudo de coorte prospectiva observacional em pacientes virgens de tratamento concluiu que
no houve evidncias de toxicidade renal quando o TDF foi utilizado em pacientes virgens de
tratamento.
Est em estudo uma pr-droga do TDF denominada fumarato de tenofovir alafenamida (TAF),
que parece ser promissora. Em comparao com 300 mg do TDF, 25 mg de TAF aumentam 7 vezes a
concentrao intracelular de tenofovir difosfato e diminuem 90% do TDF circulante no plasma, o que
reduz os efeitos colaterais como nefrotoxicidade e descalcificao dos ossos. Quando combinado
com cobicistato, uma dose efetiva de 10 mg pode ser utilizada.
O mecanismo de ao do TDF e dos demais ser descrito no final deste tpico.

Adefovir dipivoxil
O adefovir dipivoxil (Hepsera; Preveon) o 9-[2-[[bis [(pivaloiloxi)metoxi]-fosfinil]metoxi]etil]adenina, que uma pr-droga do adefovir (Figura 9.16), um anlogo nucleotdico da
desoxiadenosina monofosfato. Esse quimioterpico foi desenvolvido inicialmente para o tratamento
de pacientes infectados com HIV, mas foi verificada sua nefrotoxicidade nas doses empregadas para
esse fim, que era mais elevada do que a usada no tratamento da hepatite B. Apresenta uma potente
atividade contra o vrus da hepatite B (HBV), sendo indicado para pacientes adultos com hepatite B
crnica, quando constatada resistncia lamivudina. Quando utilizado em pacientes com doena
heptica compensada, o adefovir sozinho, ou administrado juntamente com a lamivudina, fornece uma
terapia antiviral eficaz para pacientes com HBV resistente lamivudina. A dose recomendada para
pacientes com funo renal normal de 10 mg/dia, por via oral, durante pelo menos 12 meses. Entre
os efeitos adversos mais comuns do adefovir esto cefaleia, cansao, nusea e diarreia. O adefovir
reverte a antigenemia em pacientes HBeAg-positivos em 12% dos casos, no primeiro ano de
tratamento, e 29 e 43% no segundo e terceiro anos, respectivamente, com mnima resistncia do
vrus. O tratamento com o ADV por 48 semanas produz a normalizao dos nveis das transaminases
em 72% dos pacientes que se tornaram HBeAg-negativos. A principal vantagem do adefovir em
relao lamivudina a baixa resistncia viral (Quadro 9.7).
O adefovir comprovadamente eficaz no tratamento das infeces produzidas por estirpes
selvagens e mutantes do HBV, alm de induzir menos resistncia viral que a lamivudina. Tambm tem

ao contra o vrus Epstein-Barr (EBV), citomegalovrus humano (HCMV) e vrus herpes simplex
(HSV). Em 2 anos, a resistncia do HBV ao adefovir de 2%, em comparao aos 40% da
lamivudina. utilizado por via oral, sendo recomendada uma dose de 10 mg/dia para adultos (doses
superiores a 30 mg/dia so nefrotxicas). Assim como para a lamivudina, a durao do tratamento
controversa. Em infeces por HBV selvagem, possvel a utilizao do tratamento at 6 meses aps
a soroconverso do HBeAg para o anti-HBe; no caso de vrus mutante, o tratamento tem durao
indeterminada. Os efeitos colaterais so incomuns, mas h o risco de leso nos rins
(nefrotoxicidade), especialmente em pacientes com cirrose descompensada (caso em que esse
medicamento no indicado). No h dados sobre a segurana do medicamento em gestantes ou
durante a amamentao.

Lamivudina
A lamivudina (Epivir) a 4-amino-1-[(2R,5S)-2-(hidroximetil)-1,3-oxatiolan-5-il]-2(1H)pirimidinona, um anlogo nucleosdico da citidina (Figura 9.5), de administrao oral e excelente
tolerabilidade, na dose de 100 mg/dia. Essa droga reduz os nveis de DNA do vrus da hepatite B
(HBV) em 4 log10 durante o tratamento de 12 semanas, com consequente melhora da inflamao
heptica e progresso da doena. Aps um perodo de tratamento de 48 semanas, proporciona
melhora na atividade inflamatria e fibrose, quando se observa a bipsia heptica. A lamivudina
praticamente isenta de efeitos colaterais (os mais importantes, embora incomuns, so a acidose
lctica e a pancreatite) e pode ser usada com segurana em pacientes com cirrose descompensada,
em lista de espera para transplante heptico, tendo sido demonstrada melhora significativa nos
parmetros de funo hepatocelular nesses indivduos. Pacientes que respondem mal ao IFN
costumam responder lamivudina; esta, no entanto, administrada por longos perodos, o que leva
ao aparecimento de linhagens virais resistentes (Quadro 9.7). A mutao no locus YMDD do
domnio C da polimerase responsvel pelo aparecimento de resistncia lamivudina, que ocorre
em torno de 15% no primeiro ano de tratamento, aumentando progressivamente com o passar do
tempo, e acometendo 56% dos pacientes aps 3 anos. A resistncia caracteriza-se por aumento do
HBV-DNA e das transaminases, porm deteriorao clnica s costuma ocorrer em caso de doena
heptica avanada. Mesmo que surja resistncia (observada pelo aumento na carga viral), se no
houver elevao de ALT ou piora histolgica, a lamivudina pode ser mantida. No entanto, se houver
sinais de piora da doena, h a possibilidade de substituir a medicao pelo adefovir.
Os efeitos adversos mais comuns so nusea, cefaleia e fadiga. A elevao assintomtica de
transaminases pode ser vista em 25% dos pacientes, durante ou aps a suspenso do tratamento. A
elevao assintomtica da amilase pode ocorrer, mas a pancreatite rara. A dose mais utilizada de
100 mg, por via oral, 1 vez/dia, durante 1 ano, mas no h consenso em relao ao perodo de
tratamento. H dados sugerindo o uso por tempo indeterminado.

Entecavir
O entecavir (Baraclude) a 2-amino-9-[(1S,3R,4S)-4-hidroxi-3-(hidroximetil)-2metilidenociclopentil]-3H-purin-6-ona, um anlogo do nucleosdeo guanosina (Figura 9.7).
Apresenta uma reduo de at 7 log10 nos nveis de DNA do vrus da hepatite B (HBV) em 48
semanas de tratamento. Tem ao tambm nas estirpes resistentes lamivudina, com padro de
segurana semelhante, tendo se mostrado superior (Quadro 9.7). O entecavir apresenta diminuio
mais acentuada da carga viral, melhor perfil de normalizao das transaminases e recuperao mais
rpida do fgado quando comparado com a lamivudina, mas a taxa de soroconverso do HBeAg no
apresenta muita diferena. Em um estudo, no foi observada nenhuma resistncia em 48 semanas de
tratamento.
Os ensaios clnicos que compararam o entecavir com a lamivudina demonstraram que o entecavir
superior em relao reduo do HBV-DNA e normalizao das ALT/AST, tanto em pacientes
HBeAg reagentes quanto em no reagentes, alm de uma tendncia de resposta histolgica, embora
sem diferenas estatisticamente significativas em ambos os grupos. Entretanto, entre os pacientes
HBeAg reagentes, no houve diferena de desempenho com relao perda do HBeAg e
soroconverso para o anti-HBe.
O entecavir est indicado para pacientes cirrticos virgens de tratamento, pois seu benefcio
mais limitado em pacientes experimentados com anlogos de nucleosdeos, como a lamivudina ou a
telbivudina.
Apresenta-se em comprimidos de 0,5 e 1,0 mg e, em pacientes virgens de tratamento, a dose
diria deve ser de 0,5 mg. Em pacientes cirrticos virgens de tratamento HBeAg reagentes, o tempo
de tratamento geralmente de 12 meses e estar definido no paciente respondedor sorolgico
mediante soroconverso para anti-HBe. Para a suspenso do tratamento, necessrio que se tenha
alcanado a indetectabilidade do HBV-DNA durante 6 meses aps a soroconverso. A partir da
suspenso do tratamento, preciso monitorar as transaminases trimestralmente e o HBeAg,
semestralmente. Aps 12 meses de tratamento, dever ser realizada a pesquisa do HBV-DNA e a
sorologia para os pacientes HBeAg reagentes, visando avaliar a resposta ao tratamento e a
soroconverso. Aps o tratamento, podem ocorrer as seguintes situaes: (1) respondedores
sorolgicos (HBeAg no reagente, anti-HBe reagente e HBV-DNA indetectvel), que sero
monitorados com ALT/AST a cada 3 meses e carga viral a cada 6 meses. O tratamento dever ser
interrompido aps 6 meses de negativao da carga viral; (2) respondedores parciais (HBeAg no
reagente, anti-HBe no reagente); (3) no respondedores aps 12 meses de tratamento (HBeAg
reagente, anti-HBe no reagente); neste caso, a terapia ser mantida, com realizao de HBV-DNA a
cada 6 meses. Se HBV-DNA for 103 cpias/m ( 200 UI/m), a conduta deve ser individualizada.
Ao ser constatada resistncia viral, os protocolos recomendam o resgate com a utilizao de
anlogos nucleotdicos (como o TDF). Todavia, considerando a complexidade do resgate, a

avaliao deve ser preferencialmente realizada por especialistas no tratamento da hepatite B crnica.
Se o HBV-DNA for < 103 cpias/m (< 200 UI/m), o esquema teraputico ser mantido at a
soroconverso, devendo o paciente ser monitorado com realizao de HBV-DNA e sorologias a cada
6 meses.
Em pacientes cirrticos HBeAg no reagentes, o tempo de tratamento, geralmente, de 12 meses
e estar definido no paciente respondedor sorolgico com soroconverso HBsAg/anti-HBs. Para a
suspenso do tratamento, necessrio que se tenha alcanado a indetectabilidade do HBV-DNA
durante os 6 meses aps a soroconverso. A partir da suspenso do tratamento, preciso monitorar
trimestralmente as transaminases e, semestralmente, o HBsAg. Aps 12 meses de tratamento, dever
ser realizada a pesquisa do HBV-DNA e, como o HBeAg no reagente, indica-se a avaliao da
soroconverso HBsAg para anti-HBs, a fim de avaliar a resposta ao tratamento. Podem ocorrer os
seguintes desfechos ao tratamento: (1) respondedores sorolgicos (HBsAg no reagente, anti-HBs
reagente e HBV-DNA indetectvel), pacientes que, aps 1 ano de tratamento com entecavir,
apresentarem soroconverso do HBsAg para anti-HBs e HBV-DNA indetectvel. Para suspenso do
tratamento, necessrio que se tenha alcanado a soroconverso e a indetectabilidade do HBV-DNA
durante 6 meses aps a soroconverso. Aps a suspenso do tratamento, deve-se monitorar
trimestralmente as transaminases e, semestralmente, o HBsAg; (2) respondedores parciais (HBsAg
no reagente, anti-HBs no reagente); (3) no respondedores aps 12 meses de tratamento (HBsAg
reagente, anti-HBs no reagente); neste caso, a terapia ser mantida, com realizao de HBV-DNA a
cada 6 meses. Se o HBV-DNA for 103 cpias/m ( 200 UI/m), a conduta deve ser
individualizada. Se o HBV-DNA for < 103 cpias/m (< 200 UI/m), o esquema teraputico ser
mantido at a soroconverso, devendo o paciente ser monitorado com realizao de HBV-DNA e
sorologias a cada 6 meses. Ao ser constatada resistncia viral, os protocolos recomendam o resgate
com a utilizao de anlogos nucleotdicos (como o TDF).
No havia dados publicados de resistncia ao entecavir em 4 anos de uso. Todavia, o resgate de
pacientes experimentados com entecavir deve ser realizado com a associao do TDF ao esquema de
tratamento.

Telbivudina
O antiviral telbivudina (L-desoxitimidina, LdT, Tyseka, Sebivo), a 1-[(2S,4R,5S)-4hidroxi-5-(hidroximetil)oxolan-2-il]-5-metil-1,2,3,4-tetrahidropirimidina-2,4-diona, um anlogo
nucleosdico L-ismero da timidina (Figura 9.6), inibibe a transcriptase reversa do vrus da hepatite
B (HBV), e foi liberado pela FDA em 2006 para o tratamento da hepatite B crnica. Alguns estudos
sugerem que a telbivudina ligeiramente mais eficiente do que a lamivudina na inibio da
replicao do DNA viral em pacientes HBeAg-positivos. Esse inibidor no est disponvel para uso
no Brasil.

Mecanismo de ao das drogas anti-HBV


O vrus da hepatite B (HBV) apresenta um genoma constitudo de DNA circular de fita
parcialmente dupla e a replicao ocorre de 2 maneiras: inicialmente, a DNA polimerase II celular, a
partir do DNA viral, sintetiza o DNAccc totalmente fechado, que transcrito em RNA pr-genmico
pela mesma enzima celular. Em seguida, o RNA convertido em DNA de fita dupla pela DNA
polimerase viral (transcriptase reversa), que d origem ao genoma dos novos vrus (para mais
informaes, ver os Captulos 4 e 16). Esse mecanismo de transcrio da polimerase do HBV
complicado e compreende uma troca de molde para que ocorra a sntese do DNA de fita dupla. Os
inibidores lamivudina, entecavir e telbivudina so anlogos dos nucleosdeos citidina, guanosina e
timidina, respectivamente, que competem com os desoxinucleotdeos naturais, aps passarem forma
ativa trifosfato, no stio ativo da DNA polimerase, impedindo a transcrio reversa (TR) do RNA
pr-genmico para formar o DNA viral. Esses antivirais tambm inibem a sntese do DNA viral ao
serem adicionados fita do DNA que est sendo sintetizado, funcionando como terminadores de
cadeia. O adefovir dipivoxil (ADV) e o fumarato de tenofovir disoproxil (TDF) so anlogos
nucleotdicos que atuam inibindo a transcrio reversa e tambm interrompem a sntese do DNA. Por
j serem anlogos nucleotdicos, esses dois antivirais apresentam vantagem sobre os anlogos
nucleosdicos. Eles so fosforilados forma trifosfato e competem com o nucleotdeo natural
desoxiguanosina trifosfato. Uma vez tendo sido incorporados na cadeia do DNA, terminam a sntese
e interrompem a transcrio reversa. O mecanismo de ao do IFN foi descrito no tpico Drogas
anti-HPV e anti-HHV-8 deste captulo.

Drogas anti-HCV
Para o tratamento da hepatite C, so utilizados: interferon- convencional, interferon- peguilado,
interferon- peguilado associado a ribavirina, boceprevir, telaprevir, simeprevir e sofosbuvir.

Interferon- convencional, interferon- peguilado, interferon- peguilado associado


ribavirina
O tratamento sempre deve ser considerado nos casos de hepatite C aguda, sendo necessrio um
esforo contnuo para diagnostic-la o mais precocemente possvel.
Em razo da lenta progresso da doena, o sucesso do tratamento normalmente considerado
quando ocorre a resposta virolgica sustentada (RVS), definida por nveis no detectveis de HCVRNA 6 meses aps o trmino do tratamento.
Vrios esquemas teraputicos tm sido propostos e avaliados para o tratamento da hepatite C
aguda. Os critrios para tratamento utilizados pelo MS do Brasil so para pacientes sintomticos ou
assintomticos. Para pacientes sintomticos, recomenda-se aguardar 12 semanas aps o incio dos

sintomas, no caso de no ter havido clearance viral espontneo (HCV-RNA negativo). Para pacientes
assintomticos, recomenda-se iniciar o tratamento imediatamente aps o diagnstico, em mdia 4
semanas aps a exposio, principalmente nas populaes de maior risco: pessoas expostas a
acidentes com instrumentos perfurocortantes, pacientes de hemodilise e usurios de drogas
endovenosas.
O tratamento da hepatite C crnica tem como objetivo controlar a progresso da doena heptica
por meio da inibio da replicao viral. De modo geral, a reduo da atividade inflamatria impede
a evoluo para cirrose e carcinoma hepatocelular (CHC). Os objetivos do tratamento so: conseguir
RVS; aumentar a expectativa de vida; melhorar a qualidade de vida; reduzir a probabilidade de
evoluo para insuficincia heptica terminal, que necessita de transplante heptico; e diminuir o
risco de transmisso da doena.
O Protocolo clnico e diretrizes teraputicas para hepatite viral C e coinfeces, do MS do
Brasil (2011), estabelece critrios de resposta virolgica para a avaliao do tratamento:
Resposta virolgica rpida (RVR): HCV-RNA quantitativo (carga viral) indetectvel (abaixo do
limite inferior de deteco) na 4a semana de tratamento
Resposta virolgica precoce (RVP): queda de pelo menos 2 log10 ou 100 vezes o valor do HCVRNA pr-tratamento (RVP parcial), ou indetectvel na 12a semana de tratamento (RVP total)
Resposta virolgica ao final do tratamento (RVF): HCV-RNA indetectvel ao final do tratamento
Resposta virolgica sustentada (RVS): HCV-RNA indetectvel na 24a semana de seguimento; aps
o trmino do tratamento
Recidiva virolgica (recidivantes): HCV-RNA indetectvel ao final do tratamento e HCV-RNA
detectvel 24 semanas (6 meses) aps o trmino do tratamento.
Para os pacientes com hepatite C crnica, o tratamento recomendado com IFN- convencional
(2a = Roferon-A; 2b = Intron-A) depende do gentipo do vrus, da carga viral e do estgio da
fibrose heptica, podendo durar de 6 a 18 meses, no caso de o paciente responder ao tratamento. Se
no estiver sendo eficaz aps 8 semanas, o tratamento ser interrompido. Em algumas pesquisas, foi
evidenciado que o IFN pode melhorar as funes do fgado e diminuir a fibrose, mesmo que aps o
tratamento o vrus no tenha sido totalmente eliminado. O consenso atual (o qual pode variar em
funo de cada caso e da avaliao mdica) de somente tratar com IFN os pacientes que tenham
anticorpos anti-HCV e RNA do HCV detectveis pela reao em cadeia da polimerase associada
transcrio reversa (RT-PCR); transaminases acima do dobro dos valores considerados normais,
confirmadas em 3 ou 4 exames no decorrer de 4 a 6 meses; e um resultado de bipsia com grau de
fibrose 2 ou superior.
Tambm est disponvel o IFN- peguilado (2a = Pegasys; 2b = PegIntron) para o tratamento
da hepatite C. O processo de produzir essa nova forma de IFN consiste em unir uma molcula dessa

droga ao polietilenoglicol (PEG); este envolve a molcula de IFN, fazendo com que o organismo no
o reconhea como um agente estranho. Assim, o processo de metabolizao do IFN retardado,
fazendo com que ele permanea mais tempo agindo antes de ser eliminado, diminuindo o nmero de
doses necessrias ao tratamento. Pesquisas dos laboratrios fabricantes tm mostrado que as
molculas de IFN peguilado (IFN-PEG) podem ter diferentes tamanhos, peso e eficcia e,
aparentemente, as molculas de maior tamanho parecem agir bem melhor para a supresso do vrus.
Uma das grandes vantagens do uso do IFN-PEG a diminuio dos efeitos colaterais, alm da
melhora na qualidade de vida do paciente, no que diz respeito utilizao do medicamento, uma vez
que o mesmo empregado em dose nica semanal, ao contrrio do IFN convencional, que deve ser
injetado em 3 doses semanais.
No Brasil, o esquema recomendado para tratamento e retratamento de pacientes infectados
cronicamente pelo gentipo 1 do HCV a associao de interferon- peguilado e ribavirina (IFNPEG+R), por 48 a 72 semanas.
Em ensaios clnicos randomizados, as taxas mdias de RVS alcanadas com IFN-PEG+R em um
primeiro tratamento esto em torno de 40 a 50% para o gentipo 1. Portanto, estima-se que
aproximadamente metade dos pacientes tratados com o esquema preconizado atualmente no
responda a essa terapia.
No retratamento do paciente utilizando IFN-PEG+R, aps falha virolgica prvia a esse
esquema, em mdia, mais de 80% dos pacientes retratados persistem com infeco pelo HCV,
permanecendo com risco de complicaes clnicas e morte.
Foi demonstrado que pacientes que respondem combinao IFN-PEG+R apresentam melhora
do padro histolgico das bipsias e, possivelmente, das complicaes da hepatite a longo prazo,
embora ainda faltem estudos prospectivos por longos perodos. Os resultados obtidos em pesquisas
com esse medicamento no Brasil so bastante animadores, o que est fazendo com que os clnicos
considerem que o uso dessa combinao uma maneira mais eficiente de conseguir a negativao do
vrus. Os maiores benefcios aparecem em pacientes com o gentipo 1; os gentipos 2 e 3 apresentam
boa resposta com o IFN convencional, o qual dever continuar como a primeira opo de tratamento.
Os efeitos colaterais so similares, porm como a aplicao semanal, somente no primeiro ou
segundo dia os mesmos so sentidos com maior intensidade, possibilitando ao paciente um melhor
estado fsico nos dias seguintes. Isso resulta em melhor disposio para continuar o tratamento at o
final do prazo, o que foi comprovado durante estudos. Cabe ressaltar que o ndice daqueles que
abandonam o tratamento por graves efeitos secundrios igual queles com IFN convencional, ou
seja, 12% dos tratados.
Recomenda-se a terapia combinada na seguinte dosagem: IFN-, 3 milhes de UI por via
subcutnea, 3 vezes/semana; IFN- 2a peguilado, 180 mcg ou IFN- 2b peguilado, 1,5 mcg/kg, por
via subcutnea, 1 vez/semana, associados ribavirina, 1.000 mg/dia, por via oral, em pacientes com

menos de 75 kg, e 1.200 mg em pacientes com mais de 75 kg. Infelizmente, at o momento, os


melhores resultados do tratamento so naqueles pacientes com a forma da doena que naturalmente
seria mais benigna.

Mecanismo de ao
O mecanismo de ao do IFN- encontra-se descrito no tpico Drogas anti-HPV e anti-HHV-8,
e o da ribavirina encontra-se no tpico Droga anti-HRSV deste captulo.

Boceprevir, telaprevir e simeprevir


Desde a descoberta do HCV, a falta de modelos para estudar sua patognese e ciclo replicativo
in vitro ou em animais prejudicou a pesquisa de quimioterpicos para esse vrus. Entretanto, mesmo
com o pouco conhecimento sobre o vrus, o interferon (IFN) convencional foi aprovado pela Food
and Drug Administration (FDA), nos EUA, para o tratamento da hepatite C, em 1991. Em seguida, a
otimizao da molcula do IFN forneceu o interferon peguilado (IFN-PEG) que, associado
ribavirina (R), tem sido de grande valia no tratamento dessa patologia. No entanto, somente 50% dos
pacientes desenvolvem resposta virolgica sustentada (RVS) quando tratados com a associao
dessas drogas. Com a introduo de sistemas celulares para o cultivo do HCV, novos antivirais
puderam ser desenvolvidos. Assim, em 2011, o boceprevir (Victrelis) e o telaprevir (VX950,
Incivek) foram licenciados pela FDA e pela EMA. Em 2012, eles foram liberados pela Anvisa
para uso no Brasil.
O boceprevir, quimicamente: (1R,2S,5S)-N-[(2)-4-ami no-1-ciclobutil-3,4-dioxobutan-2-il]-3{(2S)-2-[(tert-butilcarbamoil)amino]-3,3-dimetilbutanoil}-6,6-dimetil-3-azabiciclo[3.1.0]hexano-2carboxamida; e o telaprevir, quimicamente: (1S,3aR,6aS)-2-[(2S)-2-[[(2S)-2-ciclo-hexil-2(pirazina-2-carbonilamino)acetil]amino]-3,3-dimetilbutanoil]-N-[(3S)-1-(ciclopropilamino)-1,2dioxo-hexan-3-il]-3,3a,4,5,6,6a-hexa-hidro-1H-ciclopenta[c]pirrol-1-carboxamida,
foram
os
primeiros inibidores da protease para tratamento do HCV. Esses 2 antivirais apresentam molculas
diferentes (Figura 9.17) e atuam inibindo a enzima serino-protease NS3/4A do HCV, agindo
diretamente no ciclo replicativo do vrus. Devido seleo de mutantes resistentes, um ou outro
utilizado em associao ao IFN-PEG+R, constituindo assim uma terapia tripla. Com a introduo dos
inibidores da protease associados ao IFN-PEG+ribavirina, a taxa de pacientes com RVS aumentou
para 70%. A aprovao desses inibidores da protease para o tratamento da infeco pelo HCV foi
concedida exclusivamente para pacientes monoinfectados pelo gentipo 1 e com fibrose avanada
(Metavir F3 e F4) ou cirrose heptica compensada (Child-Pugh 6), de acordo com o Suplemento 1
do Protocolo Clnico e Diretrizes Teraputicas para Hepatite Viral C e Coinfeces Manejo do
paciente infectado cronicamente pelo gentipo do HCV e fibrose avanada, do Ministrio da Sade
(MS) do Brasil, em 2013.

Esse Suplemento foi elaborado com base nas aes do MS e na bibliografia internacional
(principalmente do Oxford Centre for Evidence-Based Medicine), a partir do relatrio de
recomendao da Comisso Nacional de Incorporao de Tecnologias (CONITEC-01), de julho de
2012, sobre os inibidores de protease (boceprevir e telaprevir) para o tratamento da hepatite
crnica C. As indicaes para os medicamentos boceprevir e telaprevir para pacientes virgens de
tratamento ou em retratamento so:

Figura 9.17 Inibidores da protease do HCV.

Administrar telaprevir para pacientes com cirrose heptica compensada (classificao histolgica
Metavir F4 ou evidncias menos invasivas de cirrose), e para pacientes Metavir F3 nulos de
resposta a tratamento prvio com IFN-PEG+R
O boceprevir pode ser considerado para pacientes com fibrose avanada (Metavir F3 e
F4/cirrose), de acordo com critrios de individualizao de tratamento, com base em relatrio
mdico detalhado, relao risco-benefcio e autorizao dos Comits Estaduais
Administrar boceprevir ou telaprevir em pacientes Metavir F3, exceto nulos de resposta ao
tratamento convencional, condicionado ao menor custo. No h indicao para a substituio de
um inibidor da protease por outro, devido ao risco de resistncia cruzada entre eles. Com
evidncia de falha teraputica, todo o tratamento dever ser suspenso.
A eficcia do boceprevir e do telaprevir no tratamento da hepatite C crnica (gentipo 1) foi
avaliada em um estudo com aproximadamente 1.700 e 2.290 indivduos adultos no tratados
previamente ou que apresentaram falha ao tratamento anterior com a associao IFN-PEG+R,

respectivamente. Nos ensaios clnicos, a adio, tanto do boceprevir quanto do telaprevir, ao


esquema contendo IFN-PEG+R aumentou significativamente as taxas de RVS em comparao com o
tratamento padro. Os principais eventos adversos associados ao uso do boceprevir foram anemia,
pele seca e disgeusia (alterao do paladar); os do telaprevir foram anemia, nusea, exantema,
diarreia, prurido e sintomas anorretais/hemorroidas.
O boceprevir encontrado na formulao de cpsulas de 200 mg. A posologia recomendada de
800 mg (4 comprimidos), administrados por via oral em intervalos de 8 h. A dose diria de 12
comprimidos em associao dose padro do IFN-PEG+R. O boceprevir deve ser iniciado aps 4
semanas de induo com IFN-PEG+R; seu tempo de uso pode variar de 24 a 44 semanas, de acordo
com a resposta virolgica (deteco do HCV-RNA) e com a presena de cirrose. No retratamento, o
tempo de tratamento varia entre 32 e 44 semanas.
O telaprevir encontrado na apresentao de comprimidos de 375 mg. A dose recomendada para
uso de 750 mg (2 comprimidos), administrados por via oral, com alimentos, em intervalos de 8 h,
na dose diria de 6 comprimidos sempre associados a IFN-PEG+R. O tempo de tratamento com o
telaprevir nessa terapia tripla de 12 semanas, independentemente do grupo de pacientes a ser
tratado. Entretanto, o tempo total de tratamento pode variar de 24 a 48 semanas, a depender da
presena de cirrose e do padro de resposta virolgica.
Em novembro de 2013, a FDA aprovou a droga simeprevir (Olysio), que tambm foi licenciada
no Japo e no Canad, mas ainda no est disponvel no Brasil. Simeprevir um inibidor derivado
do ciclopentano e pertence classe dos macrocclicos, Apresenta a seguinte frmula qumica:
(2R,3aR,10Z,11aS,12aR,14aR)-N-(ciclopropilsulfonil)-2-{[2-(4-isopropil-1,3-tiazol-2-il)-7metoxi-8-metil-4-quinolinil]oxi}-5-metil-4,14-dioxo-2,3,3a,4,5,6,7,8,9,11a,12,13,14,14a-tetradecahidrociclopenta[c]ciclopropa[g][1,6]diazociclotetradecino-12a(1H)-carboxamida (Figura 9.17). O
simeprevir tambm um inibidor da serino-protease NS3/4A do HCV e indicado para o tratamento
da hepatite crnica produzida por esse vrus em combinao com interferon peguilado (IFN-PEG) e
ribavirina (R). A eficcia desse antiviral foi estabelecida em pacientes infectados com o gentipo 1 e
doena heptica compensada (incluindo cirrose). O simeprevir est disponvel em cpsulas de 150
mg com prescrio 1 vez/dia, juntamente com alimentos. A durao do tratamento, em associao ao
IFN-PEG+R, de 12 semanas, seguido por mais 12 semanas usando somente IFN-PEG+R,
dependendo da resposta inicial. Esse inibidor foi 1.000 vezes mais ativo para a enzima viral do que
para 20 proteases de origem humana testadas in vitro.
Os efeitos colaterais que podem ocorrer so exantema e fotossensibilidade graves provocados
pela associao dos 3 medicamentos; nesses casos o tratamento deve ser descontinuado. O uso do
simeprevir no indicado para gestantes devido toxicidade embriofetal que ocorre pelo uso
concomitante com IFN-PEG e ribavirina. Embora j tenha sido liberado pela FDA, ainda se encontra
em fase de testes clnicos.

Mecanismo de ao
Por ser uma enzima multifuncional, a serino-protease NS3/4A do HCV tem atrado a ateno dos
pesquisadores, como alvo para o desenvolvimento de potenciais antivirais. Boceprevir, telaprevir e
simeprevir so inibidores peptideomimticos dessa enzima e foram descobertos pela abordagem do
desenho de drogas com base em estruturas j conhecidas. Atuam pela formao de uma interao
covalente com o aminocido serina na posio 139 da protease viral. Assim, boceprevir, telaprevir e
simeprevir inibem a serino-protease do HCV, impedindo-a de clivar a poliprotena precursora
necessria para a maturao e a infecciosidade da partcula viral.

Sofosbuvir
Em dezembro de 2013 a FDA aprovou o inibidor sofosbuvir ou Sovaldi (Figura 9.18), um
anlogo nucleotdico da uridina monofosfato que inibe a RNA polimerase (NS5B) do HCV. O
sofosbuvir apresenta vantagem em relao aos inibidores da protease pela baixa taxa de seleo de
mutantes resistentes responsveis por falha teraputica. Quimicamente, o propanoato de (S)isopropil-2-((S)-(((2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-dioxo-3,4-di-hidropirimidin-1(2H)-il)-4-flor-3-hidroxi4-metiltetra-hidrofuran-2-il)metoxi)-(fenoxi)fosforil-amino). A eficcia do sofosbuvir foi avaliada
em 6 estudos clnicos consistindo em 1.947 participantes que nunca tinham sido tratados ou que no
responderam a tratamento prvio, incluindo participantes coinfectados com HIV.
Os estudos tiveram como objetivo avaliar se havia negativao dos nveis de HCV no sangue
aps 12 semanas de tratamento (resposta virolgica sustentada). Os resultados obtidos nessas
avaliaes clnicas demonstraram que o sofosbuvir foi eficaz no tratamento de pacientes infectados
com os gentipos 1, 2, 3 ou 4, incluindo aqueles com carcinoma hepatocelular (CHC) aguardando
transplante de fgado, e tambm em coinfectados com o HIV-1. Por outro lado, pacientes que no
toleravam o tratamento com IFN ou que estavam aguardando transplante de fgado puderam ser
tratados com esse novo antiviral associado ribavirina.
A prescrio do sofosbuvir em associao ribavirina (R) somente ou ao interferon peguilado
(IFN-PEG) mais ribavirina (IFN-PEG + R), dependendo do tipo de infeco pelo HCV. A dose
recomendada de uma drgea de 400 mg por via oral, diariamente com ou sem alimentos. Para
pacientes com o gentipo 1 ou 4 recomendado o esquema com as 3 drogas por 12 semanas; para os
que apresentam o gentipo 2 ou 3, sofosbuvir associado apenas ribavirina por 12 ou 24 semanas,
respectivamente. O efeito colateral mais frequente na associao sofosbuvir + ribavirina fadiga e
cefaleia. A associao das 3 drogas causa fadiga, cefaleia, nusea, insnia e anemia.

Figura 9.18 Inibidores da RNA polimerase do HCV.

O sofosbuvir ainda no est disponvel no Brasil. Apesar de licenciado pela FDA, esse antiviral
ainda se encontra em fase de testes clnicos.

Mecanismo de ao
O sofosbuvir uma pr-droga que metabolizada e passa forma ativa 2-desoxi-2--flor-C-metiluridina-5-trifosfato que inibe a RNA polimerase viral. O trifosfato dessa molcula serve
como um substrato defectivo para a protena NS5B (polimerase viral) e, assim, age como inibidor da
sntese do RNA viral. Alguns anlogos nucleosdicos j haviam sido testados contra o HCV
anteriormente, mas apresentaram baixa eficcia, pois a primeira fosforilao no eficiente. O
sofosbuvir foi desenhado de maneira a evitar essa primeira etapa, uma vez que a molcula j
adicionada de um grupamento fosfato durante sua sntese. Grupamentos adicionais so ligados ao
radical fosfato para mascarar, temporariamente, as duas cargas negativas e facilitar a entrada do
inibidor na clula infectada.

Daclatasvir
Em 2014, o inibidor daclatasvir (Daklinza) foi licenciado na Europa e no Japo, em associao
a outras drogas para o tratamento de adultos com hepatite crnica provocada pelo HCV, gentipos 1,
2, 3 e 4, que apresentem doena heptica compensada. Quimicamente, o carbamato de metil N[(2S)-1-[(2S)-2-[5-[4-[4-[2-[(2S)-1-[(2S)-2-(metoxicarbonilamino)-3-metilbutanoil]pirrolidin-2il]-1H-imidazol-5-il]fenil]fenil]-1H-imidazol-2-il]pirrolidin-1-il]-3-metil-1-oxobutan-2-il].
O
daclatasvir (Figura 9.18) administrado com o sofosbuvir, e no precisa ser associado ao interferon

(IFN), reduzindo os efeitos colaterais. Alm disso, administrado por via oral, o tempo de
administrao mais curto quando comparado com esquemas que utilizam IFN + ribavirina e
apresenta atividade para pacientes que no respondem ao tratamento com inibidores de protease.
Estudos clnicos mostraram que o inibidor bem tolerado, com baixas taxas de abandono do
tratamento (<1%) devido aos efeitos colaterais e baixa percentagem de efeitos adversos graves
(4,7%).
Um estudo clnico realizado com 211 homens e mulheres infectados com o HCV revelou que a
associao daclatasvir + sofosbuvir foi eficaz mesmo em pacientes de difcil tratamento, para os
quais a tripla terapia convencional (telaprevir ou boceprevir, alm de IFN peguilado + ribavirina)
fracassou.
A dose recomendada de 60 mg de daclatasvir e 400 mg de sofosbuvir, com ou sem ribavirina,
durante um perodo de 3 a 6 meses. Os eventos adversos mais comuns foram fadiga, dor de cabea e
nusea.
At setembro de 2014, o daclatasvir ainda no havia sido liberado pela FDA e pela Anvisa.

Mecanismo de ao
O daclatasvir age, principalmente, na etapa de hiperfosforilao da poro NS5A da protena
NS5 inibindo a replicao viral. A NS5 tem funo de RNA polimerase-RNA dependente, essencial
para a sntese de novos genomas virais. Essa enzima catalisa a sntese de uma fita de RNA de
polaridade negativa complementar usando o genoma como molde e subsequente sntese da fita
positiva de RNA a partir da fita de RNA negativa intermediria. Devido aos mltiplos papis
desempenhados pela NS5, foi sugerido, por meio de um estudo de modelagem molecular, que esse
inibidor tambm possa interferir na etapa de montagem dos novos vrus.
No Quadro 9.8 esto relacionados os antivirais licenciados para tratamento das hepatites B e C.
Quadro 9.8 Drogas antivirais licenciadas para tratamento das hepatites B e C.
Vrus

HBV

Nome genrico

Nome comercial licenciado

Interferon- 2a

Roferon-A

Interferon- 2b

Intron-A

Interferon- 2a peguilado

Pegasys

Interferon- 2b peguilado

PegIntron

Fumarato de tenofovir disoproxil

Viread

Adefovir

Hepsera

Lamivudina

Zeffix, Heptovir

Tipo de inibidor
Imunomodulador

Imunomodulador

Anlogo nucleotdico inibidor da TR

Entecavir

Baraclude

Telbivudina

Tyseka, Sebivo

Interferon- 2a

Roferon-A

Interferon 2b

Intron-A

Interferon- 2a peguilado

Pegasys

Interferon- 2b peguilado

PegIntron

Interferon- 2a peguilado + ribavirina Pegasys/Copegus


HCV

Interferon- 2b peguilado + ribavirina PegIntron/Rebetol


Boceprevir

Incivek

Telaprevir

Victrelis

Simeprevir

Olysio

Sofosbuvir

Sovaldi

Daclatasvir

Daklinza

Anlogo nucleosdico inibidor da TR

Imunomodulador

Imunomodulador + anlogo
nucleosdico

Inibidor da protease viral

Inibidor da RNA polimerase

HBV = vrus da hepatite B; HCV = vrus da hepatite C; TR = transcriptase reversa.

Drogas anti-HIV-1
Inibidores da transcriptase reversa do HIV-1
A transcriptase reversa um heterodmero constitudo das subunidades p66/p51 que so alvos de
antivirais. Os inibidores anlogos nucleosdicos da transcriptase reversa (INTR) e os inibidores
anlogos nucleotdicos da transcriptase reversa (INtTR) agem no stio de ligao da enzima ao
substrato, atuando como substratos inibidores competitivos dos nucleotdeos naturais. Os inibidores
anlogos no nucleosdicos da transcriptase reversa (INNTR) agem no stio de ligao vizinho ao
stio ativo da enzima (inibio alostrica).

Inibidores anlogos nucleosdicos


Existem 7 INTR disponveis para o tratamento da infeco pelo HIV: zidovudina, didanosina,
zalcitabina, estavudina, lamivudina, abacavir e entricitabina. Todos tm o mesmo mecanismo de
inibio e seus efeitos txicos variam entre si. Os vrus isolados de pacientes tratados com os
anlogos nucleosdicos so frequentemente resistentes. No entanto, a resistncia tambm foi relatada
em pacientes que nunca foram tratados com os inibidores, devido mutao natural que ocorre na
transcriptase reversa (para mais informaes, ver Captulo 19).

Zidovudina
O inibidor zidovudina (AZT, azidotimidina, Retrovir) foi sintetizado em 1985, como parte de
um programa para a busca de substncias antineoplsicas, e foi aprovado pela FDA para tratamento
de pacientes com AIDS, em 1987. Esse anlogo penetra na clula por difuso passiva e foi o
primeiro antiviral disponvel para o tratamento desses pacientes, permanecendo como o
medicamento inicial de escolha para indivduos que nunca receberam tratamento anti-HIV-1. um
anlogo da timidina que possui um radical azido na posio 3 da desoxirribose (Figura 9.6). O
antiviral zidovudina um inibidor da transcriptase reversa (TR) viral, que compete com a
desoxitimidina trifosfato no stio ativo da enzima. Sendo fosforilado por cinases celulares, no
apresenta seletividade e acumula-se em clulas infectadas ou no, embora seja substancialmente mais
potente na inibio da TR que das polimerases celulares. No tratamento com zidovudina, recomendase uma dose de 300 mg, 2 vezes/dia. Atualmente, a zidovudina encontrada em associao a outros
medicamentos, como a lamivudina (Combivir), e associada lamivudina + abacavir (Trizivir),
administrados em um nico comprimido, como parte de uma estratgia teraputica para aumentar a
adeso ao tratamento pela diminuio do nmero de comprimidos dirios a serem ingeridos.
Devido sua toxicidade, a zidovudina provoca, frequentemente, anemia macroctica significativa
devido ao comprometimento da medula ssea, com neutropenia e/ou granulocitopenia, alm de
cefaleia, nusea, mal-estar, insnia, vmito, dor abdominal, diarreia, mialgia e febre.
A resistncia zidovudina ocorre devido a mutaes em seis cdons do gene pol, que codifica
para a TR do HIV.

Didanosina
O antiviral didanosina (ddI, didesoxiinosina, Videx) um anlogo da adenosina (Figura 9.4)
indicado para o tratamento da infeco avanada pelo HIV para pacientes que tenham sido
submetidos terapia prolongada com zidovudina, ou que tenham demonstrado intolerncia a essa
droga. rapidamente degradado em pH cido; portanto, necessria a administrao na forma de
comprimidos tamponados, 200 mg, 2 vezes/dia, ou 400 mg, 1 vez/dia, para pacientes com mais de 60
kg. No caso de pacientes com massa inferior, administrar 125 mg, 2 vezes/dia, ou 250 a 300 mg, 1
vez/dia. Pancreatite e neuropatia perifrica so as mais srias complicaes associadas
didanosina.

Zalcitabina
O inibidor zalcitabina (ddC, didesoxicitidina, Hivid) um anlogo da citidina (Figura 9.5) e
foi licenciado para uso em combinao com a zidovudina. Os efeitos colaterais mais evidentes so:
erupo cutnea, aftas na mucosa oral e febre; neuropatia perifrica tambm pode ocorrer. A
posologia de 0,75 mg, 3 vezes/dia.

Estavudina
O antiviral estavudina (d4T, Zerit) um anlogo da timidina (Figura 9.6) que estruturalmente
similar zidovudina, mas que parece ser muito mais bem tolerado. Causa menos efeitos colaterais,
mas pode ocorrer neuropatia perifrica em 20% dos casos. Para pacientes com mais de 60 kg,
administrar 40 mg, 2 vezes/dia; e com menos de 60 kg, 30 mg, 2 vezes/dia.

Lamivudina
O inibidor lamivudina (3TC, Epivir) um anlogo da citidina (Figura 9.5), que importante
por sua capacidade de modificar a resistncia zidovudina e produzir um efeito sinrgico quando
administrado concomitantemente, ou com d4T. Pode causar neutropenia e neuropatia perifrica,
embora negligenciveis, sendo o menos txico dos INTR at o momento. Durante o tratamento,
administrar 150 mg, 2 vezes/dia, ou 300 mg, 1 vez/dia. Se o paciente tiver menos de 50 kg, 2 mg/kg,
2 vezes/dia. Em associao zidovudina (Combivir), a posologia de 1 comprimido por dia,
contendo 300 mg de zidovudina e 150 mg de lamivudina. Existe tambm a associao lamivudina +
abacavir (Epzicom), administrada na forma de comprimidos contendo 600 mg de abacavir e 300
mg de lamivudina, para ser usada em dose nica diria.
A lamivudina tambm recomendada para tratamento da hepatite B, com o objetivo de suprimir a
replicao viral e reduzir a leso heptica, prevenindo a evoluo para cirrose e carcinoma
hepatocelular (ver tpico Drogas anti-HBV).

Abacavir
O abacavir (ABC, Ziagen) um anlogo nucleosdico carboxlico da guanosina (Figura 9.7),
ativado intracelularmente forma carbovir-trifosfato (CBV-TP) por um mecanismo diferente dos
demais anlogos. primeiro fosforilado a abacavir monofosfato, ento desaminado para passar a
carbovir monofosfato e, finalmente, fosforilado a carbovir trifosfato. A enzima responsvel pela
desaminao no a adenosina-desaminase nem a cido adenlico-desaminase, mas uma enzima
completamente diferente que parece ser bastante abundante nos tecidos. Quando o CBV-TP
incorporado ao DNA proviral, resulta em terminao da cadeia. Penetra no sistema nervoso central
do mesmo modo que a zidovudina, prevenindo, assim, problemas mentais como a demncia que
ocorre em pacientes aidticos. Tem a vantagem de ser menos txico para o sistema hematopoitico
do que o inibidor zidovudina. A dose de 300 mg, 2 vezes/dia. Seu efeito colateral a
hipersensibilidade, com sintomas respiratrios e/ou gastrointestinais, em geral com febre e sem
acometimentos de mucosas; inicialmente, os sintomas podem ser confundidos com uma virose.
encontrado tambm em associao lamivudina (Epzicom).

Entricitabina
O antiviral entricitabina (Emtriva, FTC) o enantimero () de um tio-anlogo da citidina, que

tem um tomo de flor na posio 5 (Figura 9.5), diferindo da lamivudina apenas pela adio do
flor na molcula. Os efeitos colaterais mais frequentes so cefaleia, diarreia, nusea, exantema e
despigmentao da pele. J foram relatados efeitos graves como acidose lctica e hepatotoxicidade
(hepatomegalia e esteatose). administrado em cpsulas, na dosagem de 200 mg, 1 vez/dia, ou
soluo oral, 240 mg (24 m), 1 vez/dia, podendo ser utilizado em crianas. O inibidor entricitabina
um dos componentes do Truvada (combinado com o TDF) e Atripla (combinado com o
efavirenz e o TDF). Tambm est presente no medicamento Complera/Eviplera em associao a
TDF e rilpivirina, alm de fazer parte do medicamento Stribild, uma associao de entricitabina +
TDF + elvitegravir + cobicistato. Essa associao chamada de quad (quadriplula), o que
favorece a posologia da medicao, diminuindo a quantidade de comprimidos que o paciente precisa
ingerir, melhorando a adeso ao tratamento. O cobicistato no apresenta atividade antiviral, mas age
como um frmaco potencializador para os antivirais.

Mecanismo de ao dos INTR


O genoma do HIV constitudo de um RNA de fita simples e por meio da enzima transcriptase
reversa (TR), codificada pelo vrus, esse RNA convertido em um DNA de duplo filamento, que
integrado ao genoma da clula infectada (para mais informaes, ver Captulo 19). Os anlogos
nucleosdicos so convertidos a anlogos nucleotdicos por enzimas celulares que os convertem na
forma ativa 5-trifosfato, para atuarem como um inibidor competitivo ou um substrato alternativo para
a polimerase. So chamados terminadores de cadeia, assim como o aciclovir, pois a sntese do
DNA cessa quando eles so adicionados porque no apresentam a hidroxila na posio 3, impedindo
a adio de novos nucleotdeos cadeia de DNA que est sendo sintetizada. Zidovudina, didanosina,
zalcitabina, estavudina e abacavir no apresentam o grupo 3-hidroxila, enquanto a lamivudina e
entricitabina, alm disso, possuem um acar modificado.

Inibidores anlogos no nucleosdicos


Existem 5 INNTR do HIV-1 (Figura 9.19), que sero apresentados a seguir.

Nevirapina
O antiviral nevirapina (Viramune), 11-ciclopropil-4-metil-5,11-di-hidro-6H-dipirido[3,2b:2,3-e][1,4]diazepin-6-ona (Figura 9.19), foi o primeiro INNTR a ser licenciado para a terapia do
HIV-1. Administrado com AZT+ddI , provavelmente, a combinao antirretroviral mais antiga. Tem
sido investigado desde 1993, e provou ser superior em doentes gravemente imunocomprometidos. A
atividade inibitria da nevirapina no por competio com os nucleosdeos trifosfatos naturais. A
transcriptase reversa do HIV-2 e as DNA-polimerases celulares no so inibidas pela nevirapina.
Esse anlogo mais eficiente na preveno da transmisso do HIV da me para o filho em
relao ao tratamento com AZT, sendo mais barato. Nesse caso, a me recebe uma dose antes do

parto e o filho recebe uma dose logo depois de nascer. O tratamento durante a gestao s pode ser
feito com AZT, e a administrao concomitante com a nevirapina torna-o mais eficiente. No caso de
conciliar as duas drogas, a gestante toma o AZT durante a gestao e, na hora do parto, uma dose de
nevirapina, a mesma que o beb recebe ao nascer.
A posologia do inibidor nevirapina de 200 mg, 2 vezes/dia. Os efeitos colaterais mais
evidentes so exantema do tipo eritema multiforme, hepatite, elevao de transaminases, febre,
nusea e cefaleia.

Figura 9.19 Inibidores no nucleosdicos da transcriptase reversa do HIV-1.

Delavirdina
A droga delavirdina (Rescriptor), N-[2-({4-[3-(propan-2-ilamino)piridin-2-il]piperazin-1il}carbonil)-1H-indol-5-il] metanossulfonamida (Figura 9.19), foi o segundo INNTR a ser licenciado
pela FDA, em 1997. Devido elevada quantidade de comprimidos, que precisam ser tomados 3
vezes/dia, e por ter sua absoro diminuda na presena de anticidos, a delavirdina atualmente
muito raramente prescrita. administrada em concentrao de 400 mg, 3 vezes/dia, e seus efeitos
colaterais incluem exantema, cefaleia e elevao das transaminases.

Efavirenz
O

inibidor

efavirenz

(Sustiva,

Stocrin),

(4S)-8-cloro-5-(2-ciclopropiletinil)-5-

(trifluormetil)-4-oxa-2-azabiciclo-[4.4.0] deca-7,9,11-trien-3-ona (Figura 9.19), foi o primeiro


INNTR que se mostrou to eficaz ou, provavelmente, at melhor que os inibidores da protease, em
doentes no tratados previamente. A posologia do efavirenz de 600 mg, 1 vez/dia. Apresenta muitos
efeitos colaterais, tais como: aparecimento de exantema, sintomas neurolgicos (confuso, alteraes
de pensamento, dificuldade de concentrao, despersonalizao), aumento de transaminases,
hiperlipidemia com aumento dos nveis de colesterol e teratogenicidade (em macacas).

Etravirina
O antiviral etravirina (Intelence), 4-[6-amino-5-bromo-2-[(4-cianofenil)amino]-pirimidin-4il]oxi-3,5-dimetilbenzonitrila (Figura 9.19), pertence classe das diarilpirimidinas, da segunda
gerao de INNTR, que foi licenciado pela FDA em 2008, tendo sido aprovado em 6 meses. um
INNTR prescrito para o tratamento de pacientes que j experimentaram outros INNTR e que
apresentaram resistncia a esses medicamentos. Os efeitos colaterais mais comuns so exantema e
nusea, que ocorrem em mais de 10% dos pacientes. O medicamento deve ser descontinuado caso
haja reaes graves na pele, tais como a sndrome de Stevens-Johnson, reaes de hipersensibilidade
e eritema multiforme. A posologia de 200 mg, 2 vezes/dia, sempre depois das refeies. No so
conhecidos os efeitos para uso peditrico ou em pacientes que nunca experimentaram o tratamento
antirretroviral.

Rilpivirina
A droga rilpivirina (Edurant), 4-{[4-({4-[(E)-2-cianovinil]-2,6-dimetilfenil}amino)pirimidin2-il]amino}benzonitrila (Figura 9.19), assim como a etravirina, uma diarilpirimidina que faz parte
da segunda gerao de INNTR. Apresenta maior potncia, meia-vida mais longa e menos efeitos
colaterais em comparao com os INNTR mais antigos, como o efavirenz. Esse antiviral foi
licenciado pela FDA em 2011, e tambm pode ser encontrado em associao aos inibidores
entricitabina e tenofovir, fazendo parte de um nico comprimido com o nome de Complera ou
Eviplera, que administrado 1 vez/dia. Rilpivirina foi aprovado para ser administrado a adultos
que nunca fizeram uso de antirretrovirais e que apresentem carga viral 105 cpias/m no incio do
tratamento. Est disponvel em comprimidos de 25 mg, administrados 1 vez/dia. Os efeitos colaterais
desse antiviral incluem depresso, hepatotoxicidade, nefrotoxicidade e lipodistrofia.

Mecanismo de ao dos INNTR


Por no serem anlogos nucleosdicos, os INNTR no so incorporados ao DNA viral, inibindo a
replicao do HIV-1 pela ligao no competitiva transcriptase reversa, em stios diferentes
daqueles utilizados pelo substrato (inibio alostrica). Em consequncia disso, o mecanismo de
resistncia para esses inibidores no o mesmo dos anlogos nucleosdicos, fazendo com que seja
til o seu emprego em associao a tais anlogos.

Inibidor anlogo nucleotdico


Tenofovir disoproxil
O tenofovir disoproxil, na forma de fumarato de tenofovir disoproxil (TDF, Viread) um
anlogo nucleotdico da guanosina (Figura 9.16) que atua na transcriptase reversa do HIV-1 e do
HBV. A posologia recomendada de 300 mg/dia. Em geral, bem tolerado e pouco associado a
efeitos adversos como diarreia, vmito e nusea; h alguns relatos de induzir insuficincia renal.
Pode ser encontrado em associao a entricitabina (Truvada) ou entricitabina + efavirenz
(Atripla), reduzindo a dose diria de antirretrovirais para 1 comprimido. Atualmente, tem sido
sugerido que esse medicamento possa ser prescrito para a preveno da infeco pelo HIV-1.

Mecanismo de ao
O mecanismo de ao do TDF foi descrito no tpico Drogas anti-HBV.

Inibidores da integrase do HIV-1


Raltegravir
O inibidor raltegravir (Isentress) foi licenciado em 2007 para ser usado em associao a outros
agentes. Estudos clnicos tm mostrado que esse antiviral pode reduzir a carga viral do HIV-1 no
sangue e aumentar o nmero de linfcitos T CD4+. Quimicamente, o sal monopotssico do N-[(4fluorfenil)metil]-1,6-di-hidro-5-hidroxi-1-metil-2-[1-metil-1-[[(5-metil-1,3,4-oxadiazol-2il)carbonil]amino]etil]-6-oxo-4-pirimidinacarboxamida (Figura 9.20). Deve ser administrado na
dose de 400 mg, 2 vezes/dia, e no requer a administrao simultnea do ritonavir como adjuvante
farmacolgico. Os efeitos adversos mais comuns so diarreia, nusea e cefaleia, podendo causar
comprometimento muscular em alguns pacientes. O raltegravir usado em pacientes virgens de
tratamento ou aqueles que j foram tratados com algum ARV, em combinao com outras drogas.
Diferentemente de outros ARV, o metabolismo do raltegravir no requer a participao de
enzimas do citocromo P450, que a primeira etapa do metabolismo de frmacos. Em vez disso, sofre
conjugao direta com o cido glicurnico.

Elvitegravir
O antiviral elvitegravir, quimicamente, 6-(3-cloro-2-florbenzil)-1-[(2S)-1-hidroxi-3-metilbutan2-il]-7-metoxi-4-oxo-1,4-di-hidroquinolina-3-cido carboxlico (Figura 9.20), um inibidor da
enzima integrase do HIV-1. Ele atua em associao ao cobicistato, que um frmaco potencializador
de seu efeito antiviral. No entanto, esse antiviral s foi licenciado para ser administrado na
quadriplula Stribild, que uma associao de TDF + entricitabina + elvitegravir + cobicistato. Os
efeitos colaterais mais comuns so nusea, diarreia, pesadelos e cefaleia. A posologia de 1
comprimido, 1 vez/dia.

Dolutegravir
O dolutegravir (Tivicay) uma carboxamida que inibe a integrase do HIV-1 e foi licenciado
pela FDA em 2013. Quimicamente, (4R,12aS)-N-(2,4-difluorbenzil)-7-hidroxi-4-metil-6,8-dioxo3,4,6,8,12,12a-hexa-hidro-2H-pirido[1,2:4,5] pirazino[2,1-b][1,3]oxazina-9-carboxamida (Figura
9.20).

Figura 9.20 Inibidores da integrase do HIV-1.

A posologia do dolutegravir de 1 comprimido de 50 mg, 1 vez/dia; ele pode ser usado em


adultos virgens de tratamento e em pacientes j tratados com outros antirretrovirais, mesmo aqueles
que foram tratados com outro inibidor da integrase. Caso o indivduo j tenha sido tratado com algum
inibidor da integrase, provavelmente, alguma resistncia j existe e, ento, recomendada a
administrao de 50 mg, 2 vezes/dia. Esse antiviral tambm pode ser administrado a crianas
maiores de 12 anos que pesem mais de 40 kg, mas que nunca tenham sido tratadas com outro inibidor
da integrase.
Em um estudo clnico, foi observado que o esquema contendo dolutegravir combinado com
Epzicom (abacavir +3TC), ou Atripla (TDF + entricitabina + rilpivirina) foi efetivo na reduo
da carga viral em pacientes virgens de tratamento, em comparao com o raltegravir.
Os efeitos colaterais mais comuns observados durante o tratamento incluem insnia e cafaleia.
Porm alguns graves efeitos podem ocorrer, como reaes de hipersensibilidade e hepatotoxicidade

em pacientes coinfectados com HBV ou HCV.


Alguns estudos tm demonstrado que o dolutegravir eficaz no tratamento de pacientes que so
resistentes ao raltegravir.
Resultados de um estudo comparando esse antiviral com efavirenz indicaram que o dolutegravir
reduz a carga viral e aumenta o nmero de linfcitos CD4+ em pacientes virgens de tratamento ou
tratados com outro inibidor da integrase.

Mecanismo de ao dos inibidores da integrase


A integrao do DNA do HIV-1 necessria e essencial para a manuteno do DNA viral na
clula infectada. O processo de integrao ocorre em vrias etapas, principalmente o processamento
endonucleoltico da terminao 3 do DNA viral, transferncia do DNA viral e posterior insero no
DNA celular. Os inibidores da integrase do HIV-1 foram projetados de maneira a se ligarem ao stio
cataltico da enzima no complexo integrase-DNA viral e quelarem dois ons Mg++ presentes no stio
ativo da enzima, com um efeito especfico na transferncia do DNA viral que ser inserido no DNA
celular. Assim, raltegravir, elvitegravir e dolutegravir impedem a insero do DNA proviral
transcrito pela trancriptase reversa, no DNA celular.

Inibidores da protease do HIV-1


Desde 1995, 8 inibidores peptideomimticos da protease do HIV-1 foram aprovados: saquinavir,
indinavir, ritonavir, nelfinavir, lopinavir, atazanavir e amprenavir, substitudo pelo fosamprenavir
(Figura 9.21), alm de dois inibidores no peptideomimticos: tipranavir e etanolato de darunavir
(Figura 9.22). Por apresentarem estrutura muito semelhante regio de clivagem presente na
poliprotena precursora das protenas estruturais do HIV-1, essas drogas impedem que a protease
viral realize o processamento e a clivagem dessa poliprotena, com consequente inibio da
maturao viral.

Inibidores peptideomimticos
Saquinavir
O inibidor saquinavir mesilato (Invirase, Fortovase), (2S)-N-[(2S,3R)-4-[(3S)-3-(tertbutilcarbamoil)-deca-hidroisoquinolin-2-il]-3-hidroxi-1-fenilbutan-2-il]-2-(quinolin-2ilformamido)butanodiamida, foi o primeiro inibidor da protease do HIV-1 a ser liberado pela FDA
(Figura 9.21). , provavelmente, o mais bem tolerado inibidor da protease do HIV pelo organismo.
Devido sua baixa biodisponibilidade, a FDA aprovou uma nova formulao em gel (Fortovase).
A posologia de 1.000 mg, 2 vezes/dia, em associao a ritonavir, 100 mg, ou lopinavir/ritonavir,
400/100 mg.

Ritonavir
O ritonavir (Norvir), 1,3-tiazol-5-il-metil-N-[(2S,3S,5S)-3-hidroxi-5-[(2S)-3-metil-2{[metil({[2-(propan-2-il)-1,3-tiazol-4-il]metil})carbamoil]amino}butanamido]-1,6-difenil-hexan-2il]carbamato (Figura 9.21), parece ser o mais potente inibidor da protease viral in vivo, mas
raramente administrado sozinho. Apresenta boa biodisponibilidade e quase sempre utilizado em
associao a outros antirretrovirais como adjuvante farmacolgico. Quando associado a AZT ou
3TC, apresenta boa diminuio da carga viral.

Figura 9.21 Inibidores peptideomimticos da protease do HIV-1.

Indinavir
O antiviral indinavir (Crixivan), (2S)-1-[(2S,4R)-4-benzil-2-hidroxi-4-{[(1S,2R)-2-hidroxi2,3-di-hidro-1H-inden-1-il]
carbamoil}butil]-N-tert-butil-4-(piridin-3-ilmetil)piperazinocarboxamida (Figura 9.21) reduz acentuadamente a carga viral no paciente, quando usado em
combinao com os inibidores nucleosdicos. No entanto, pode causar nefrolitase, dor abdominal,
nusea e vmito. administrado na forma de comprimidos contendo 800 mg, 3 vezes/dia, ou em
associao a ritonavir, bastando 100 a 200 mg, 2 vezes/dia.

Nelfinavir
O nelfinavir (Viracept), (3S,4aS,8aS)-N-tert-butil-2-[(2R,3R)-2-hidroxi-3-[(3-hidroxi-2metilfenil)formamido]-4-(fenilsulfanil)butil]-deca-hidroisoquinolina-3-carboxamida (Figura 9.21)
um inibidor que pode ser utilizado em adultos e crianas. Pelo fato de apresentar menor efeito
colateral, principalmente no que se refere ao aumento das taxas de triglicerdeos no sangue,
recomendado pelo MS do Brasil como primeira opo para tratamento, em associao a inibidores
nucleosdicos. Sua posologia de 1.250 mg, 2 vezes/dia, ou 750 mg, 3 vezes/dia.

Lopinavir
O lopinavir (Aluviran), (2S)-N-[(2S,4S,5S)-5-[2-(2,6-dimetilfenoxi)acetamida]-4-hidroxi-1,6difenil-hexan-2-il]-3-metil-2-(2-oxo-1,3-diazinan-1-il)butanamida (Figura 9.21) mais comumente
utilizado em associao ao ritonavir, recebendo o nome comercial de Kaletra, liberado para uso
em adultos e crianas acima de 6 meses de idade. Cada comprimido constitudo por 400 mg de
lopinavir e 100 mg de ritonavir, para ser ingerido 2 vezes/dia. Essa associao faz com que sejam
utilizadas pequenas concentraes do ritonavir, que inibe o metabolismo do lopinavir, promovendo
maior concentrao dessa droga no sangue e maior eficcia na inibio do HIV-1. Os efeitos
colaterais do Kaletra so diarreia, fadiga, cefaleia, nusea e, em alguns casos, aumento de lipdios
no sangue.

Atazanavir
O
atazanavir
(Reyataz),
metil
N-[(1S)-1-{[(2S,3S)-3-hidroxi-4-[(2S)-2[(metoxicarbonil)amino]-3,3-dimetil-N-{[4-(piridin-2-il)fenil]metil}butano-hidrazida]-1fenilbutan-2-il]carbamoil}-2,2-dimetilpropil]carbamato (Figura 9.21) foi o primeiro frmaco
aprovado para dose nica por dia (300 mg) em associao ao ritonavir (100 mg). A ocorrncia de
lipodistrofia e hipercolesterolemia muito menor com esse medicamento, mas pode causar ictercia,
devido ao aumento da bilirrubina total.

Amprenavir/fosamprenavir
O amprenavir (Agenerase) pode reduzir a carga viral para nveis significativamente baixos
quando administrado com outros antirretrovirais. Seus efeitos colaterais so nusea, diarreia, vmito,
erupo cutnea e dor abdominal. No entanto, parece no provocar lipodistrofia (acmulo de
gordura), causada pelos outros inibidores de protease. Sua fabricao foi descontinuada, dando lugar
ao
fosamprenavir
(Lexiva,
Telzir),
{[(2R,3S)-1-[N-(2-metilpropil)(4aminobenzeno)sulfonamida]-3-({[(3S)-oxolan-3-iloxi]carbonil}amino)-4-fenilbutan-2-il]oxi}cido
fosfnico (Figura 9.21) que a pr-droga do amprenavir. Recomendam-se 700 mg, 2 vezes/dia, em
associao a 200 mg de ritonavir.

Mecanismo de ao dos inibidores peptideomimticos


O HIV-1 liberado da clula infectada na forma imatura, ou seja, com os precursores das
protenas, que formam o capsdeo e enzimas, ainda no clivados (para mais informaes, ver
Captulo 19). Somente no meio extracelular que a protease viral, que faz parte da poliprotena
pr160, sofre autoativao e inicia o processo de clivagem das outras protenas que constituem a
prpria poliprotena pr160 (Gag-Pol) e a poliprotena pr55 (Gag), para, ento, o vrus se tornar
infeccioso. Os inibidores que mimetizam a protease do HIV-1 so desenvolvidos de modo que sua
estrutura qumica seja muito semelhante regio do substrato natural que clivado pela enzima.
Desse modo, a protease viral no cliva o substrato natural e o vrus no capaz de causar infeco.
O substrato natural para a protease do HIV contm uma ligao fenil-alanina/prolina, que as enzimas
de mamferos raramente clivam e essa caracterstica foi explorada no desenho dos inibidores
peptdicos.

Inibidores no peptideomimticos
Tipranavir
O tipranavir (Aptivus), N-{3-[(1R)-1-[(2R)-6-hidroxi-4-oxo-2-(2-feniletil)-2-propil-3,4-dihidro-2H-piran-5-il]propil]fenil}-5-(trifluorometil)piridina-2-sulfonamida (Figura 9.22) um
inibidor da protease do HIV que no mimetiza a sequncia peptdica a ser clivada pela protease
viral, pertencendo classe das sulfonamidas. Essa droga indicada quando h resistncia a vrios
inibidores da protease, sendo capaz de reduzir drasticamente a carga viral. Somente deve ser
prescrita a pacientes que j experimentaram outras medicaes antirretrovirais sem sucesso. A dose
recomendada de uma cpsula contendo 250 mg, 2 vezes/dia, coadministrada com 200 mg de
ritonavir. Deve ser ingerida juntamente com uma alimentao rica em gorduras. O tipranavir
associado ao ritonavir tem sido relacionado com hemorragia intracraniana no fatal e
hepatotoxicidade. Os efeitos colaterais mais comuns so diarreia, nusea, vmito, cefaleia, fadiga,
exantema e lipodistrofia.

Etanolato de darunavir
O etanolato de darunavir (Prezista), carbamato de [(1R,5S,6R)-2,8-dioxabiciclo[3.3.0]oct-6il]-N-[(2S,3R)-4-[(4-aminofenil)sulfonil-(2-metilpropil)amino]-3-hidroxi-1-fenil-butan-2-il]
com
etanol 1:1 (Figura 9.22), tambm no um inibidor peptideomimtico da protease do HIV-1. Foi
aprovado em 2006 pela FDA e, em 2007, pela EMA, para adultos com tratamentos prvios que no
responderam aos regimes teraputicos antirretrovirais e, posteriormente, para indivduos virgens de
tratamento. Para alcanar concentraes adequadas no organismo, o etanolato de darunavir deve ser
administrado simultaneamente com o ritonavir. A dose recomendada de 600 mg de darunavir (2
comprimidos de 300 mg) com 100 mg de ritonavir, 2 vezes/dia com a refeio, geralmente em
associao a outras drogas. Estudos mostraram que esse antiviral bastante ativo quando combinado
ao inibidor da fuso enfuvirtida. Acredita-se que o darunavir confira uma barreira resistncia viral
muito maior que outros inibidores da protease.

Figura 9.22 Inibidores no peptideomimticos da protease do HIV-1.

Os efeitos colaterais mais frequentes observados em pacientes que tomam darunavir so cefaleia,
diarreia, dor abdominal e vmito (5% dos casos). Por outro lado, 7% apresentam exantema de
gravidade varivel, incluindo alguns casos de eritema multiforme, sndrome de Stevens-Johnson ou
necrlise epidrmica txica. Os pacientes com alergia a sulfas no devem tomar darunavir, pelo fato
de ser um medicamento da classe das sulfonamidas. Alguns pacientes apresentaram elevao das
transaminases.

Mecanismo de ao dos inibidores no peptideomimticos


Tipranavir e darunavir, em semelhana aos inibidores peptideomimticos, tambm inibem o
processamento das poliprotenas precursoras Gag e Gag-Pol do HIV-1, atuando na aspartil-protease
do HIV-1, por se ligarem ao stio ativo da enzima, impedindo sua atividade cataltica, mesmo que sua

estrutura qumica no seja muito semelhante regio do substrato natural da enzima. Tanto o
tipranavir quanto o darunavir so molculas flexveis que apresentam forte interao com a
asparagina do stio ativo da protease viral, o que possibilita melhor atividade contra vrus
resistentes.

Inibidores de entrada do HIV-1


Inibidor da fuso | Enfuvirtida
O antiviral enfuvirtida (Fuzeon, T-20) um peptdeo (Figura 9.23) e foi o primeiro
medicamento licenciado pela FDA como inibidor da entrada do HIV-1. Ele foi selecionado a partir
de uma estratgia racional direcionada que explorou a capacidade de peptdeos inibirem a
replicao do HIV em culturas de clulas. Ao contrrio dos outros antirretrovirais, esse antiviral
mais bem tolerado. O efeito colateral mais comum uma reao na pele na rea em que injetado.
No entanto, outros efeitos no muito frequentes j foram relatados: reaes alrgicas, com nusea e
vmito, problemas renais, paralisia, exantema grave, falta de ar e infeco grave no local da injeo.
A dose recomendada de 90 mg (1 ml), 2 vezes/dia. Para crianas entre 6 e 16 anos, a dose
recomendada de 2 mg/kg, 2 vezes/dia (com um mximo de 90 mg).

Mecanismo de ao
O enfuvirtida impede a entrada do HIV-1 em linfcitos TCD4+, bloqueando a etapa final da fuso
do envelope do vrus com a membrana da clula, interagindo com a membrana celular e produzindo
um estado intermedirio de pr-grampo, fazendo assim uma ponte entre as duas membranas e
ligando-se nas duas terminaes da glicoprotena gp41 do envelope viral. Esse antiviral mimetiza os
36 aminocidos N-terminais da regio de homologia 2 de gp41 (HR2), e assim se liga a HR1,
impedindo a formao do feixe de 6 -hlices. A resistncia adquirida rapidamente durante o
tratamento e basta uma nica mutao na gp41 para diminuir radicalmente sua eficcia. Quase todas
as mutaes relacionadas com resistncia esto localizadas no stio de ligao desse peptdeo a
HR1.

Inibidor da adsoro do HIV-1 | Maraviroc


O antirretroviral maraviroc (Celsentri), 4,4-diflor-N-{(1S)-3-[3-(3-isopropil-5-metil-4H1,2,4-triazol-4-il)-8-azabiciclo[3.2.1]oct-8-il]-1-fenilpropil}ciclo-hexanocarboxamida
(Figura
9.24), uma pequena molcula que inibe a adsoro do HIV-1 por ser um antagonista da interao
entre o correceptor CCR-5 e a glicoprotena gp120 do envelope do HIV-1. O maraviroc
recomendado para ser administrado em associao a outros antirretrovirais, em pacientes infectados
com vrus com tropismo para esse correceptor, o que acontece com 50 a 60% dos pacientes j
recebendo tratamento antirretroviral. Alguns pontos devem ser considerados antes do incio do

tratamento com maraviroc: deve ser realizada a anlise da amostra viral do paciente para determinar
o tropismo pelo receptor; a prescrio no recomendada para pacientes com infeco mista ou
vrus com tropismo para o receptor CXCR4; a segurana e a eficcia no foram determinadas em
pacientes adultos virgens de tratamento, gestantes ou crianas.

Figura 9.23 Inibidor da fuso do HIV-1.

Figura 9.24 Inibidor da adsoro do HIV-1 ao correceptor CCR-5.

Seus efeitos colaterais potenciais mais graves so a hepatotoxicidade e o risco de eventos


cardiovasculares, mas a curto prazo, estes no foram verificados. Os efeitos mais comuns so tosse,
febre, problemas respiratrios, exantema, dor abdominal e tonteira. A dose recomendada para
adultos de 150, 300 ou 600 mg, 2 vezes/dia, dependendo da teraputica antirretroviral administrada
concomitantemente.

Mecanismo de ao

O maraviroc um antagonista do correceptor CCR5 que atua bloqueando a interao dessa


molcula com a glicoprotena gp120 do envelope do HIV. Ao se ligar especificamente em CCR5,
altera os domnios loop extracelulares, impedindo que a ala V3 de gp120 se ligue ao receptor.
Portanto, essa droga impede a entrada do HIV-1 nas clulas, bloqueando a rota mais importante para
a infeco viral, que a ligao do vrus ao correceptor. Dessa maneira, o HIV-1 no consegue
penetrar nas clulas suscetveis; no entanto, a seleo de mutantes resistentes ocorre rapidamente.
Na Figura 9.25 pode-se observar o ciclo de biossntese do HIV e as etapas em que os
antirretrovirais atuam.

Consideraes sobre a terapia antirretroviral no Brasil


A terapia antirretroviral (TARV) no consegue eliminar o vrus do organismo. Ela tem como
objetivo diminuir a morbidade e a mortalidade das pessoas vivendo com HIV/AIDS (PVHA),
melhorando sua qualidade e aumentando a expectativa de vida. No se utiliza a monoterapia no
tratamento de indivduos HIV-positivos devido ao rpido aparecimento de mutantes resistentes;
preconiza-se a TARV combinada, utilizando classes distintas de inibidores na tentativa de burlar o
fenmeno da resistncia viral.
Para iniciar o tratamento com os antirretrovirais (ARV), no existia um consenso at
recentemente. Evidncias de benefcios clnicos e de preveno da transmisso do HIV, somadas
disponibilidade de opes teraputicas mais cmodas e bem toleradas, estabeleceram novos
critrios para o incio da TARV.
Alguns estudos tm respaldado o incio mais precoce da TARV. Essas evidncias resultaram de
programas (ART-CC, NA-ACCORD, CASUAL, CASCADE) que avaliaram a evoluo para AIDS e
mortalidade em grandes coortes de indivduos virgens de tratamento, que iniciaram a TARV com
vrios nveis de linfcitos TCD4+. Alm disso, foram divulgados os resultados de um estudo com
casais heterossexuais sorodiscordantes (HPTN052); nesse estudo, foram includos 1.763 casais com
contagem de linfcitos TCD4+ entre 350 e 550 clulas/mm3 para incio imediato do tratamento ou
para inici-lo quando a contagem de linfcitos TCD4+ estivesse abaixo de 250 clulas/mm3. Durante
a avaliao, ocorreram 39 episdios de transmisso, dos quais 28 foram virologicamente vinculados
ao parceiro infectado. Por outro lado, apenas um episdio ocorreu no grupo de terapia precoce,
observando-se diminuio de 96% na taxa de transmisso quando o indivduo HIV-positivo iniciava
tratamento com contagem de linfcitos TCD4+ entre 350 e 550 clulas/mm3. Contudo, dados
cientficos disponveis a respeito dos benefcios clnicos de se iniciar o tratamento em indivduos
apresentando linfcitos TCD4+ acima de 500 clulas/mm3 no so conclusivos.

Figura 9.25 Stios de atuao das drogas anti-HIV-1. 1. Inibidor da adsoro do HIV ao correceptor CCR5. 2. Inibidor da
fuso. 3. Inibidores da trancriptase reversa. 4. Inibidores da integrase. 5. Inibidores da protease.

No Brasil, periodicamente, um grupo de especialistas se rene para estabelecer um esquema com


base na experincia nacional e na literatura mundial. Na terapia, necessrio levar em considerao
o estado clnico (presena ou no de sintomas), a quantificao das clulas TCD4+ e a de cpias de
RNA do HIV-1 (carga viral).
Alm do impacto clnico favorvel, o incio mais precoce da TARV tem reduzido a taxa de
transmisso do HIV. Todavia, deve-se considerar a importncia da adeso e o risco de efeitos
adversos a longo prazo.
A recomendao brasileira de incio precoce da TARV considera, alm dos benefcios
relacionados com a reduo da morbimortalidade em pacientes vivendo com HIV/AIDS, a
diminuio da transmisso do vrus e o impacto na reduo da tuberculose (a ativao da tuberculose
latente constitui a principal causa de bitos nesses pacientes no Brasil).
Em 2013, o Ministrio da Sade (MS) do Brasil divulgou novas orientaes no Protocolo
clnico e diretrizes teraputicas para manejo da infeco pelo HIV em adultos. No Quadro 9.9,
pode-se consultar as recomendaes do MS para o incio da TARV.
Atualmente, existem 27 drogas ARV licenciadas para o tratamento de pacientes HIV-positivos.
No Brasil, so disponibilizados 21 desses ARV, e segundo dados do MS, em dezembro de 2012, 313
mil pessoas recebiam gratuitamente os medicamentos. A relao inclui: 6 INTR (abacavir,

didanosina, estavudina, lamivudina, tenofovir e zidovudina) e uma associao lamivudina +


zidovudina; 3 INNTR (efavirenz, nevirapina e etravirina); 9 IP (atazanavir, darunavir, fosamprenavir,
indinavir, lopinavir associado ao ritonavir, nelfinavir, ritonavir, saquinavir e tipranavir), 1 inibidor
de fuso (enfuvirtida) e 1 inibidor da integrase (raltegravir). O ARV maraviroc (inibidor de entrada
do HIV), que estava previsto para fazer parte dessa lista, no havia sido includo at setembro de
2014.
A escolha do esquema antirretroviral deve considerar alguns fatores: eficcia e toxicidade
imediata e a longo prazo; presena de coinfeces e comorbidades; uso concomitante de outros
medicamentos; potencial de adeso; adequao rotina de vida do paciente; interao com a
alimentao e custo dos medicamentos.
A recomendao internacional, tambm utilizada no Brasil, que 3 ARV combinados sejam
utilizados, sendo 2 medicamentos da classe de inibidores anlogos nucleosdicos da transcriptase
reversa (INTR), de preferncia um com base purnica e outro com base pirimidnica, ou 1 INTR
associado a 1 inibidor nucleotdico da transcriptase reversa (INtTR), mais 1 inibidor no anlogo
nucleosdico da transcriptase reversa (INNTR), ou 1 inibidor da protease associado ao ritonavir
(IP/r). No Quadro 9.10, mostra-se o esquema para a terapia antirretroviral inicial, prefervel e
alternativo, utilizado no Brasil em 2013. Nesse esquema, observa-se a preferncia por 1 anlogo
nucleosdico (lamivudina; 3TC) + 1 anlogo nucleotdico (fumarato de tenofovir disoproxil; TDF) +1
inibidor anlogo no nucleosdico (efavirenz; EFV) da transcriptase reversa. O tratamento
complexo e h necessidade de acompanhamento mdico para avaliar as adaptaes do organismo ao
tratamento, seus efeitos colaterais e as dificuldades do paciente na adeso ao tratamento.
Quadro 9.9 Critrios para incio da terapia antirretroviral em pessoas vivendo com HIV/AIDS.
Todas as PVHA, independentemente da contagem de linfcitos TCD4+
Estimular incio imediato da TARV, na perspectiva de reduo da transmisso do HIV, considerando a motivao da PVHA
Sintomticos (incluindo tuberculose ativa), independentemente da contagem de CD4+
Iniciar TARV
Assintomticos
Linfcitos TCD4+ < 500 clulas/mm 3

Iniciar TARV
Recomendar incio de TARV na coinfeco HIV-HBV com indicao
de tratamento para hepatite B.
Considerar incio de TARV nas seguintes situaes:

Neoplasias no definidoras de AIDS, com indicao de


quimioterapia ou radioterapia

Linfcitos TCD4+ > 500 clulas/mm 3

Sem contagem de linfcitos TCD4+ disponvel

Doena cardiovascular estabelecida ou risco cardiovascular


elevado

Coinfeco HIV-HCV

Carga viral do HIV acima de 100.000 cpias/m

Na impossibilidade de se obter contagem de CD4+ , no se deve


adiar o incio do tratamento

Gestantes
Independentemente da contagem de linfcitos TCD4+

Iniciar TARV

PVHA = pessoas vivendo com HIV/AIDS; TARV = terapia antirretroviral. (Fonte: Departamento de DST, AIDS e Hepatites
Virais/Ministrio da Sade, 2013)

Quadro 9.10 Esquema para terapia antirretroviral inicial.


Dois inibidores da transcriptase reversa (1 anlogo nucleosdico* + 1 anlogo nucleotdico**) + 1
inibidor anlogo no nucleosdico*** da transcriptase reversa
*3TC + **TDF + ***EFV
Prefervel (primeira linha)

Contraindicao ao TDF :
1a opo AZT
2a opo ABC (contraindicao ao TDF e AZT)
3a opo ddI (contraindicao ao TDF, AZT e ABC)

Alternativo (quando o inibidor


anlogo no nucleosdico
no puder ser usado)

Dois inibidores da transcriptase reversa (1 anlogo nucleosdico* + 1 anlogo nucleotdico**) + 1


inibidor da protease com reforo farmacolgico do ritonavir****
*3TC + **TDF + ****LPV/r

*3TC = lamivudina; **TDF = fumarato de tenofovir disoproxil; ***EFV = efavirenz (1 opo); nevirapina (2 opo); AZT =
azidotimidina; ABC = abacavir; ddI = didanosina; ****LPV/r = lopinavir com reforo farmacolgico do ritonavir (Fonte:
Departamento de DST, AIDS e Hepatites Virais/Ministrio da Sade, 2013)

Com a introduo de novos medicamentos, essa combinao pode ser modificada. No entanto,
existem combinaes mais eficientes e outras que no podem ser efetuadas (p. ex., AZT + d4T; ddI +
ddC; d4T + ddC; indinavir + saquinavir; indinavir + nelfinavir). A associao de drogas base para
a terapia antirretroviral altamente eficiente (HAART, highly active antiretroviral therapy), que
usada no mundo todo para o tratamento da infeco pelo HIV-1.
O emprego da HAART no capaz de erradicar a infeco pelo HIV, mas diminui sua morbidade
e mortalidade, melhorando a qualidade e a expectativa de vida das pessoas que vivem com

HIV/AIDS. Definir o melhor momento para o incio do tratamento uma das decises mais
importantes no acompanhamento clnico, devendo ser considerados os riscos associados infeco
no tratada frente aos da exposio prolongada aos medicamentos.
A combinao da lamivudina com o fumarato de tenofovir disoproxil (3TC/TDF) apresenta a
vantagem de ser menos txica em relao lipodistrofia e ao comprometimento hematolgico quando
comparado a AZT, e possibilita dose nica diria. Porm o TDF causa diminuio da densidade
ssea e sua pior desvantagem a nefrotoxicidade, particularmente em diabticos, hipertensos,
negros, idosos e no uso concomitante de outros medicamentos nefrotxicos. Pacientes com doena
renal preexistente devem usar preferencialmente outra associao de INTR.
A associao zidovudina (AZT)/lamidudina (3TC) um esquema alternativo quando h
contraindicao ao uso do tenofovir. Est disponvel em coformulao nos servios de sade e o
paciente ingere um comprimido 2 vezes/dia. Por ser produzida no Brasil, apresenta menor custo
comparativo dentro da classe, o que favorece a distribuio a todos os que precisam de terapia.
A combinao da lamivudina com abacavir (3TC/ABC) uma alternativa para os pacientes com
intolerncia ou contraindicao aos esquemas com 3TC/TDF ou 3TC/AZT.
Os esquemas que incluem os INNTR, particularmente com efavirenz, possuem melhor perfil de
toxicidade, maior comodidade posolgica, maiores taxas de adeso ao tratamento a longo prazo,
elevada potncia de inibio da replicao viral, maior eficcia e maior durabilidade da supresso
viral, quando comparados a esquemas que utilizam inibidores da protease.
Por outro lado, os inibidores da protease do HIV potencializados com ritonavir (IP/r) oferecem
maior barreira resistncia que os INTR, INtTR ou INNTR, porque a resistncia a qualquer PI/r
resulta do acmulo de mutaes, enquanto apenas uma mutao de INNTR confere resistncia
completa ao efavirenz e ao nevirapina.
O INNTR recomendado para compor o esquema de terapia inicial o efavirenz, exceto em
gestantes. Quando houver contraindicao ou ocorrncia de evento adverso com esse ARV, a opo
preferencial o inibidor nevirapina. Quando no for possvel o uso deste, opta-se pelo lopinavir
associado ao ritonavir (lopinavir/r), que pode ser substitudo pelo atazanavir/r devido ao seu perfil
de toxicidade favorvel e eficcia na supresso viral. As desvantagens relacionadas com o emprego
do atazanavir so o seu elevado custo e o fato de no ser coformulado com o ritonavir.
Embora as taxas de sucesso da TARV sejam elevadas, com 80% dos pacientes tratados
apresentando carga viral plasmtica inferior a 50 cpias/m, durante o tratamento, pode ocorrer falha
teraputica com a no obteno ou no manuteno da carga viral em nveis indetectveis. Esses
pacientes, normalmente, necessitam de alteraes em seus esquemas ARV, sendo o novo tratamento
denominado terapia de resgate. Nesse caso, recomenda-se o acompanhamento do paciente
utilizando o teste de genotipagem, o qual otimiza a terapia de resgate; sua realizao logo aps a
falha teraputica orienta a mudana precoce do esquema antirretroviral, reduzindo a chance de

acmulo progressivo de mutaes e de ampla resistncia aos medicamentos.


No caso em que o paciente ainda no iniciou o tratamento, faltam evidncias que apontem que
exista benefcio na implantao rotineira da genotipagem no Brasil. O MS, no Protocolo clnico e
diretrizes teraputicas para manejo da infeco pelo HIV em adultos (2013), recomenda a
realizao da genotipagem pr-tratamento apenas para pessoas que tenham se infectado com um
parceiro em uso atual ou prvio de TARV, uma vez que a possibilidade de transmisso de mutaes
de resistncia mais provvel nessa situao. A genotipagem pr-tratamento tambm est indicada
para gestantes infectadas pelo HIV.
Os dados do Brasil sobre o padro de resistncia viral so discordantes devido s diferentes
metodologias ou a possveis diferenas de prevalncia regional. Em dois estudos, a prevalncia
nacional de mutaes de resistncia primria para qualquer classe de ARV foi de 8,1 e 12,3%. No
entanto, so necessrias mais pesquisas para determinar a realizao rotineira da genotipagem prtratamento.
A falha teraputica consequncia da falha virolgica, imunolgica e clnica, e pode ser
decorrncia de baixa adeso ao tratamento, inadequao do esquema teraputico, fatores
farmacolgicos ou resistncia viral. Na falha virolgica, o paciente continua com carga viral
detectvel por 6 meses aps o incio do tratamento ou volta a ter a carga viral detectvel depois de
se tornar indetectvel. A falha virolgica o principal parmetro para a alterao do esquema
teraputico. Ela reduz os benefcios em relao recuperao imunolgica, aumenta o risco de
progresso da doena e leva emergncia de resistncia aos ARV. Na falha imunolgica, 15 a 30%
dos pacientes que iniciam a TARV podem apresentar deficincia na recuperao dos nveis de
linfcitos TCD4+ (mesmo com supresso da replicao viral). Nesse caso, no se recomenda a
alterao na TARV quando h supresso da carga viral. A falha clnica pode ser decorrente da
recuperao imunolgica insuficiente, falha de quimioprofilaxia para infeces oportunistas ou
sndrome inflamatria de reconstituio imune. A ocorrncia de doenas oportunistas na ausncia de
falha virolgica no indica falha da TARV.
Quando a resistncia viral detectada, recomenda-se o teste de genotipagem para iniciar a
terapia de resgate. A genotipagem apresenta as seguintes vantagens: possibilita a escolha de
esquemas antirretrovirais com maior chance de supresso viral aps a identificao das mutaes
que levaram resistncia; propicia o uso de medicamentos ativos por perodos mais prolongados;
evita trocas desnecessrias de antirretrovirais; evita a toxicidade adicional por medicamentos que
no so efetivos; e melhora a relao custo-benefcio.

Associao de drogas anti-HIV-1


Para que a terapia antirretroviral tenha sucesso, necessrio que o paciente tome mais de 95%
das doses prescritas. Devido elevada toxicidade dos ARV e ao complicado esquema de

administrao da medicao, muitos pacientes abandonam o tratamento ou o fazem de maneira


incorreta. Por esse motivo, atualmente, as indstrias farmacuticas tm concentrado esforos no
sentido de associar 2 ou mais drogas em um mesmo comprimido ou cpsula, com o objetivo de
aumentar a adeso ao tratamento. Esto disponveis algumas combinaes de ARV (ver Quadro 9.3):
Truvada (entricitabina + tenofovir); Atripla (efavirenz + entricitabina + tenofovir); Combivir
(lamivudina + zidovudina); Epzicom (abacavir + lamivudina); Trizivir (abacavir + lamivudina +
zidovudina); Complera/Eviplera (tenofovir + entricitabina + rilpivirina); Stribild (tenofovir +
entricitabina + elvitegravir + cobicistato). A maioria dessas combinaes ainda no est disponvel
no Brasil.
Stribild foi o primeiro medicamento com a associao de 4 componentes, chamado quad
(quadriplula). Em 2012, o medicamento Truvada, que j era utilizado para o tratamento da
infeco pelo HIV-1, tambm foi licenciado para uso na preveno da infeco, depois que Grant e
colaboradores demonstraram que esse medicamento era capaz de prevenir a transmisso do HIV
entre homossexuais do sexo masculino.
O cobicistato estruturalmente relacionado com o ritonavir, mas no tem qualquer ao direta
sobre o HIV-1. Ele funciona como um frmaco potencializador que aumenta a atividade dos
inibidores de integrase, assim como a dos inibidores de protease.
No caso de indivduos que se contaminam acidentalmente com o HIV-1, os antirretrovirais
tambm podem ser administrados profilaticamente, na tentativa de impedir a soroconverso, que
pode ocorrer em 0,3% dos casos. No entanto, a melhor profilaxia para a exposio ocupacional ao
HIV continua sendo o respeito s normas de biossegurana. A quimioprofilaxia deve ser iniciada em
um perodo de 2 h e continuar a ser administrada durante 4 semanas aps o acidente. Recomenda-se o
acompanhamento sorolgico do indivduo no momento do acidente, em 6 semanas, 12 semanas e 6
meses aps a exposio. Se possvel, deve ser realizada a pesquisa do HIV pela RT-PCR, para a
deteco do genoma viral, que informar de imediato se houve a infeco viral. A ltima reviso
internacional contendo os procedimentos para a profilaxia das infeces por exposio ocupacional
ao HIV foi em 2005; desde ento, muitas modificaes ocorreram nos esquemas contendo ARV, e
novas drogas foram introduzidas no esquema teraputico. No Brasil, o MS ainda no disponibilizou o
protocolo atualizado a ser seguido para a profilaxia das exposies ocupacionais. Em 2011, os
Centros para Controle de Doenas (CDC) dos EUA solicitaram ao U. S. Public Health Service uma
atualizao do Updated U.S. Public Health Service Guidelines for the Management of
Occupational Exposures to HIV and Recommendations for Postexposure Prophylaxis, de 2005.
Assim, foram realizados vrios simpsios com a participao de muitos especialistas devido
complexidade da anlise dos dados considerando que h um nmero pequeno de indivduos
submetidos ao tratamento devido ao baixo risco de infeco (0,3%). Alm disso, o nmero de drogas
ARV aumentou e so muitos os efeitos colaterais. No Quadro 9.11 pode-se consultar o esquema
recomendado pelo U. S. Public Health Service, em 2013, para a quimioprofilaxia em exposio

ocupacional ao HIV-1, embora o esquema preferencial e alguns ARV, principalmente em associao,


no estejam disponveis ainda na rede pblica do Brasil.

Perspectivas de novos antivirais


A necessidade de novas drogas para o tratamento da hepatite C tem incentivado a pesquisa nessa
rea e est seguindo os passos da pesquisa com os antirretrovirais, quando comeou h 20 anos. J
esto em testes adiantados de pesquisa mais de 16 anlogos nucleosdicos direcionados contra a
RNA polimerase NS5B do HCV, tais como 2-desoxi-2-fluorcitidina; 2-desoxi-2-flo r-2Cmetilcitidina; 4-azidocitidina; 2-C-metilcitidina e seu ster de 3-O-L-valina (valopicitabina), entre
outros. As estratgias futuras tambm esto direcionadas para a combinao de quimioterpicos,
como vem sendo feito com a terapia antirretroviral. Alm disso, vrios outros inibidores da protease
NS3/A4 viral, diferentes do telaprevir e boceprevir, j licenciados, tm sido identificados como
potenciais candidatos para a terapia anti-HCV.
Quadro 9.11 Quimioprofilaxia em exposio ocupacional ao HIV.
Prefervel*
Raltegravir 400 mg, 2 vezes/dia + Truvada 1 vez/dia (TDF* 300 mg + entricitabina 200 mg)
Alternativo**
Raltegravir
Darunavir + ritonavir
Etravirina
Rilpivirina
Atazanavir + ritonavir
Lopinavir/ritonavir (Kaletra)

TDF + entricitabina (Truvada)


TDF + 3TC
AZT + 3TC (Combivir)
AZT + entricitabina

*Esse esquema pode ser substitudo apenas pelo Stribild (elvitegravir + cobicistato + TDF + entricitabina). **Deve
combinar um ou dois ARV da coluna da esquerda com dois ARV anlogos nucleosdicos/nucleotdicos da coluna da direita.
(Fonte: U. S. Public Health Service, 2013.)

Inibidores da helicase-primase dos herpesvrus abrem as portas para uma interessante vertente na
pesquisa por novos antivirais. Um desses inibidores o AIC316 que est na fase II de testes contra o
HSV-1 e 2. Esse inibidor mostrou atividade reduzindo o shedding viral (transmisso sem sintomas)
no herpes genital de maneira dose-dependente. Em um estudo comparativo, todas as amostras
clnicas foram sensveis ao inibidor, com exceo de uma amostra qu