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Coordenadores:

WILLIBALDO SCHMIDELL
URGEL DE ALMEIDA LIMA
EUGNIO AQUARONE
WALTER BORZANI

BIOTECNOLOGIA
INDUSTRIAL
VOLUME 11

ENGENHARIA
BIOQUMICA

EDITORA EDGARD BLCHER LTDA.

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Este conjunto de quatro volumes, reunidos sob o ttulo amplo de BIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL, o resultado do trabalho de um grupo de profissionais
com vistas atualizao da coleo BIOTECNOLOGIA, cuja publicao foi iniciada
em 1975 e terminada em 1983.
A experincia acumulada e as muitas mudanas ocorridas nestes ltimos vinte
anos, ao lado da indiscutvel e crescente importncia das aplicaes da BIOTECNOLOGIA em diversos setores de produo de bens e servios, justificam plenamente - assim pensam os Coordenadores e o Editor desta nova Coleo - esta
primeira atualizao, principalmente pelo fato de se destinar ao ensino em cursos
de graduao.
Nosso primeiro objetivo, nesta Apresentao, tomar conhecimento do que,
hoje, se entende por BIOTECNOLOGIA, e do que vem a ser BIOTECNOLOGIA
INDUSTRIAL.
A demarcao ntida do campo de atuao de qualquer ramo do conhecimento
sempre tarefa muito difcil, para no dizer impossvel.
Tanto isto verdade que, com certa freqncia, tratados relativos a um dado
setor do conhecimento atacam diretamente o exame de uma srie de temas sem
tentar esboar, preliminarmente, um quadro que, em largos traos, indique os
objetivos e as ap!jcaes do que vai ser estudado.
Tal maneira de agir, principalmente em cursos de graduao, no nos parece
aconselhvel. Julgamos importante, no incio dos. estudos, a apresentao de um
panorama que d, aos alunos, tima idia, ainda que no bem definida, daqueles
objetivos e aplicaes.
No nos parece que seja imprescindvel transcrever, aqui, todas as propostas
de "definio" do que se deva entender por Biotecnologia. Algumas delas sero
suficientes para que seja possvel alcanar nosso objetivo.
Iniciaremos com a proposta que o Prof. Antonio Paes de Carvalho, em seu
trabalho intitulado "Patentes para a Biotecnologia", apresentou, em dezembro de
1993, em reunio realizada na Academia Brasileira de Cincias:

"Entende-se por Biotecnologia o conjunto de conhecimentos, tcnicas e mtodos,


de base cientfica ou prtica, que permite a utilizao de seres vivos como parte
integrante e ativa do processo de produo industrial de bens e servios".

VI

O Office of Technology Assessment, por sua vez, "definiu" Biotecnologia como


sendo:

"O conjunto de processos industriais que englobam processos biolgicos".


Por outro lado, a Union Internationale de Chimie Pure et Applique, conceituou Biotecnologia como:

"Aplicao da Bioqumica, da Biologia, da Microbiologia e da Engenharia Qumica


aos processos e produtos industriais (incluindo os produtos relativos sade, energia
e agricultura) e ao meio ambiente".
Finalmente, o Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientfico e Tecnolgico
(CNPq), em seu Programa Nacional de Biotecnologia, "definiu" Biotecnologia hos
seguintes termos:

"A utilizao de sistemas celulares para obteno de produtos ou desenvolvimento


de processos industriais".
. As poucas tentativas de definio aqui transcritas mostram, nitidamente, que
a Biotecnologia tem por base vrios ramos do conhecimento que poderiam ser
classificados de FUNDAMENTAIS (como, por exemplo, Bioqumica, Fisiologia,
Gentica, Microbiologia, Virologia, Botnica, Zoologia, Ecologia) ao lado de outros
que poderiam ser agrupados sob a denominao genrica de ENGENHARIAS (principalmente a Engenharia Qumica).
Trata-se, portanto, de um campo de trabalho tipicamente multidisciplinar, o
que torna absolutamente imprescindvel a efetiva colaborao de profissionais
atuantes em diferentes setores do conhecimento .
. Destaque-se, porm, que essa atividade multidisciplinar no deve ser entendida como resultante de uma simples justaposio de profissionais, cada um deles
com sua formao especializada e preocupado apenas com sua rea especfica.
Importa que seja, de fato, um trabalho de vrios profissionais efetivamente
integrados, de modo que cada um deles tenha conhecimento, obviamente no
aprofundado, dos princpios e das tcnicas dos campos de atuao dos demais.
Assim, apenas para citar um exemplo, caso um microbiologista participe de um
grupo que estuda a otimizao de um dado processo, desejvel que tenha alguns
conhecimentos, mesmo que superficiais, a respeito das estratgias empregadas para
a modelagem matemtica. Vice-versa, o especialista ein modelagem deve efetuar
um esforo adicional para compreender as caractersticas do sistema microbiano
em estudo, a fim de incorpor-las ao modelo. Somente desta form a atividade
multidisciplinar efetivamente existir e poder ser mais eficiente.

VIl

Se verdade, por um lado, que a Biotecnologia s passou a ser considerada


altamente prioritria h relativamente pouco tempo, tambm verdade, por outro,
que processos biotecnolgicos vm sendo utilizados na produo de vrios bens,
principalmente alimentos, desde a mais remota antigidade. Basta, neste particular, fazer referncia ao preparo de bebidas fermentadas a partir de cereais na
Babilnia e no Egito (8.000 a 6.000 anos a.C.), produo de po, utilizando
fermentos, no Egito (4.000 anos a.C.) e produo de vinhos na Grcia (2.000 a.C.).
A Biotecnologia encontra muitas aplicaes importantes nas seguintes reas
de atividade:
Agricultura
Pecuria
Sade
Preservao do meio ambiente
Indstria
Suas aplicaes na indstria constitutem o objetivo primordial da Biotecnologia Industrial. A Fig. 1, adaptada de um artigo publicado pelo Prof. Rainer
Jonas, uma boa representao grfica da "localizao" da Biotecnologia Industrial e de sua interao com outros ramos do conhecimento.

Figura I cimento.

Representao esquemtica da interao da Biotecnologia Industrial com outros ramos do con he-

VIII

Convm, finalmente,,ressaltar que, como ocorre em outros campos de trabalho,


as reas de aplicao da Biotecnologia, anteriormente apontadas, no so "gavetas"
estanques. H entre elas, freqentemente, fortes interaes. Apenas para citar um
exemplo, considere-se o caso de uma dada vacina, desenvolvida na rea da Sade.
Na etapa final de produo dessa vacina em larga escala surgiro, muito provavelmente, problemas de cunho tecnolgico e de engenharia que podero tomar imprescindvel a efetiva participao da Biotecnologia Industrial na busca das solues
mais adequadas.
A presente Coleo consta de quatro volumes. No primeiro- FUNDAMENTOS - renem-se, como o prprio nome claramente indica, temas fundamentais
indispensveis ao estudo de processos biotecnolgicos. O segundo- ENGENHARIA BIOQUMICA- focaliza os principais problemas de engenharia envolvidos
naqueles processos, ao lado de assuntos correlatos de mbito mais geral, mas importantes na produo em larga escala. Os dois ltimos volumes - PROCESSOS
FERMENTATIVOS E ENZIMTICOS e BIOTECNOLOGIA NA PRODUO DE
ALIMENTOS - foram dedicados descrio e discusso de processos biotecnolgicos de importncia industrial.
Todos os temas foram tratados partindo-se do pressuposto de que a obra se
destina, primordialmente, a cursos de graduao. A bibliografia indicada no final
de cada captulo poder servir como ponto de partida pra os que pretenderem um
exame mais aprofundado de um ou outro tpico.
Os Coordenadores, o Editor e, seguramente, tambm os Autores, agradecem
todas as sugestes relativas estrutura da Coleo ou de qualquer de suas partes,
bem como a identificao de falhas ou incorrees, infelizmente sempre possveis,
que lhes sejam encaminhadas pelo leitor.

Literatura Recomendada
1) Ancies, W. & Cassiolato, J.E. Biotecnologia: seus impactos no setor industrial.
CNPq, Braslia, 1985.
2) Haelm, H. Bioqumica de las fermentaciones. Aguilar S.A. de Ediciones, Madri,
1956.
3) Jonas, R. GBF -Scientific Annual Report (pp. 35-46). Alemanha, 1990.
4) Paes de Carvalho, A. Patentes para a Biotecnologia. Apresentad Academia
Brasileira de Cincias em 6.12.1993.

IX

ACID

Cuando la coleccin "Biotecnologia", editada por los profesores Eugnio


Aquarone, Walter Borzani y Urgel de Almeida Lima, apareci en 1975, caus un
hondo impacto entre los biotecnlogos latinoamericanos. Se trat de la primera
obra sobre el tema escrita y publicada en nuestra regin y represent una
contribucin especialmente valiosa al estudio y ensefianza de esa pujante disciplina.
"Biotecnologia" const originalmente de tres volmenes: Tecnologia das
Fermentaes, Tpicos de Microbiologia Industrial y Engenharia Bioqumica, a los cuales
se sum en 1981 Corroso Microbiolgica y luego Alimentos e Bebidas produzidos por
Fermentao en 1983. Ahora, pasados ya ms de veinte afios, losmismos editores,
com la participacin del profesor Willibaldo Schmidell, nos brindam la oportunidad
de apreciar y disfrutar la nueva coleccin "Biotecnologia Industrial" como una
sucesora natural de "Biotecnologia". El contenido de la nueva obra h sido
totalmente renovado y actualizado en concordancia com los notables avances
experimentados por el conocimiento en esta rea en las ltimas dcadas,.induyendo
las modernas tcnicas de la ingeniera gentica y el uso de microorganismos recom
binantes en bioprocesos.
La nueva coleccin est dividida en cuatro volmenes que abarcan los mas
variados tpicos relacionados com la biotecnologa industrial: Fundamentos, Ingeniera
Bioqumica, Procesos Fermentativos y Enzimticos y Biotecnologa en la Producccin de
Alimentos. En total son 74 captulos escritos por distinguidos especialistas brasileros,
conteniendo informacin actualizada acerca tanto de los aspectos bsicos como de
los aplicados de la utilizacin de clulas microbianas y no microbianas para
finalidades productivas.
El Volumen 1, Fundamentos, entrega un completo panorama del estado del
conocimiento en microbiologa, gentica, bioqumica y enzimologa, finalizando
com un panorama de las aplicaciones industriales de la biotecnologa, abriendo as
el camino a los prximos volmenes. En el Volumen 2, Ingeniera Bioqumica, se
exponen los principales aspectos relacionados com la cuantificacin de los procesos
microbianos y enzimticos y el disefio y operacin de los equipos de proceso
requeridos en una instalacin industrial. El Volumen 3~ Procesos Fermentativos y
Enzimticos, presenta y discute la aplicacin de los microorganismos a la produccin
de una amplia gama de metabolitos y enzimas de inters prctico, el uso de enzimas
como biocatalizadores industriales y la aplicacin de los procesos microbianos a
diversos sectores industriales y a la descontaminacin de efluentes lquidos y
resduos slidos. Finalmente, el Volumen 4, Biotecnologa en la Produccin de Alimentos,

w.......__ _ _ , ____ _ ._ _

detalla la aplicacin de la biotecnologa a una amplia variedad de industrias de ese


importante sector.
Por su estructura y contenido, y por la indiscutible autoridad de sus editores
y autores, estoy cierto que Biotecnologia Industrial est destinada a constituirse en
una obra insustituble para la ensefi.anza universitaria de pre y post-grado, as como
tambin en una valiosa fuente de consulta para el biotecnlogo en la industria.

L _________

Fernando Acevedo
Profesor
Escuela de Ingeniera Bioqumica
Universidad Catlica de Valparaso
Valparaso, Chile

- - - - - - - , - - -- - - - - -

-------------------

XI

au a
Adalberto Pessoa Junior
Professor Doutor
Universidade de So Paulo
Faculdade de Cincias Farmacuticas
Departamento de Tecnologia
Bioqumica-Farmacutica
Av. Prof. Lineu Prestes, 580-Bloco 16
05508-900, So Paulo, SP, Brasil
Aberto Colli Badino Jr.
Professor Adjunto I
Universidade Federal de So Carlos
Departamento de Engenharia Qumica
Caixa Postal, 676
13565-905, So Carlos, SP, Brasil
Antonio Bonomi
.Pesquisador Coordenador
Instituto de Pesquisas Tecnolgicas do
Estado de So Paulo S.A.
Diviso Qumica
,
Agrupamento de Biotecnologia
Caixa Postal, 0141
01064-970, So Paulo, SP, Brasil
Beatriz Vahan Kilikian
Professora Associada
Universidade de So Paulo
Escola Politcnica
Departamento de Engenharia Qumica
Caixa Postal, 61548
05424-970, So Paulo, SP, Brasil
Deise Maria Fontana Capalbo
Pesquisadora
Empresa Brasileira de Pesquisa
Agropecuria
EMBRAPA/CNPMA
Rodovia SP 340, km 127,5
Caixa Postal, 69
13820-000, Jaguarina, SP, Brasil
- --,. - ... ----

------~----

----- -------------------, .. - -. -- -- - ---- --

Haroldo Hiss
Pesquisador Cientfico
Insituto Butant
Av. Vital Brasil, 1500
05503-900, So Paulo, SP, Brasil
Iracema de Oliveira Moraes
Professora Tular
Universidade de Guarulhos
Centro de CinCias Exatas e
Tecnolgicas
Praa Teresa Cristina, 1
07033-070, Guarulhos, SP, Brasil
Joo Carlos Monteiro de Carvalho
Professor Doutor
Universidade de So Paulo
Faculdade de Cincias Farmacuticas
Departamento de Tecnologia
Bioqumica-Farmacutica
Av. Prof. Lineu Prestes, 580-Bloco 16
05508-900, So Paulo, SP, Brasil
Jos Geraldo da Cruz Pradella
Pesquisador
Instituto de Pesquisas Tecnolgicas do
Estado de So Paulo S.A.
Diviso Qumica
Agrupamento de Biotecnologia
Caixa Postal, 0141
01064-970, So Paulo, SP, Brasil
Josef Emst Thiemann
Pesquisador Snior
Biobrs S.A.
Avenida C, 1413- Distrito Industrial
Caixa Postal, 377
39404-004, Montes Claros, MG, Brasil.

r. .
XII

Luiz Carlos Urenha


Pesquisador
Instituto de Pesquisas Tecnolgicas do
Estado de So Paulo S.A.
Diviso Qumica
Agrupmento de Biotecnologia
Caixa Postal, 0141
01064-970, So Paulo, SP, Brasil

Pedro Srgio Pereiralima


Pesquisador
. Instituto de Pesquisas Tecnolgicas do
Estado de So Paulo S.A.
Diviso de Mecnica e Eletricidade
Agrupamento de Sistemas de Controle
Caixa Postal, 0141
01064-970, So Paulo, SP, Brasil

Manuel Filgueira Barrai


Pesquisador
Instituto de Pesquisas Tecnolgicas do
Estado de So Paulo S.A.
Diviso Qumica
Agrupamento de Biotecnologia
Caixa Postal, 0141
01064-970, So Paulo, SP, Brasil

Rafael Almudi Villen


Professor Associado
Centro Universitrio do Instituto Mau
de Tecnologia
Escola de Engenharia Mau
Departamento de Engenharia Qumica
e de Alimentos
Praa Mau, 1
09580-900, So Caetano do Sul, SP,
Brasil

Maria Cndida Reginato Facciotti


Professora Titular_
Universidade de So Paulo
Escola Politcnica
Departamento de Engenharia Qumica
Caixa Postal, 61548
05424-970, So Paulo, SP, Brasil

Sunao Sato
Professor Titular
Universidade de So Paulo
Faculdade de Cincias Farmacuticas
Departamento de Tecnologia
Bioqumica-Farmacutica
Av. Prof. Lineu Prestes, 580-Bloco 16
05508-900, So Paulo, SP, Brasil

Maria Filomena de Andrade Rodrigues


Pesquisadora
Instituto de Pesquisas Tecnolgicas do
Estado de So Paulo S.A.
Diviso Qumica
Agrupamento de Biotecnologia
Caixa Postal, 0141
01064-970, So Paulo, SP, Brasil

Urgel de Almeida Lima


Professor Pleno
Centro Universitrio do Instituto Mau
de Tecnologia
Escola de Engenharia Mau
Departamento de Engenharia Qumica
e de Alimentos
Praa Mau, 1
09580-900, So Caetano do Sul, SP,
Brasil .

Michele Vitolo
Professor Titular
Universidade de So Paulo
Faculdade de Cincias Farmacuticas
Departamento de Tecnologia
Bioqumica-Farmacutica
Av. Prof. Lineu Prestes, 580-Bloco 16
05508-900, So Paulo, SP, Brasil

Vanildo Luiz Del Bianchi


Professor Doutor
Universidade Estadual Paulista
Intituto de Bioci~cias, Letras e
Cincias Exatas
Rua Cristovo Colombo, 2265
15054-000, So Jos do Rio Preto, SP,
Brasil

XIII

Walter Borzani

Willibaldo Schmidell

Professor Pleno

Professor Titular

Centro Universitrio do Instituto Mau


de Tecnologia
Escola de Engenharia Mau
Departamento de Engenharia Qumica
e de Alimentos
Praa Mau, 1
09580-900, So Caetano do Sul, SP,
Brasil

-.,...__.___

Universidade de So Paulo
Escola Politcnica
Departamento de Engenharia Qumica
Caixa Postal, 61548
05424-970, So Paulo, SP, Brasil

XV

caN
1

ENGENHARIA BIOQUMICA: UMA APLICAO SUl GENERIS


DA ENGENHARIA QUMICA .................................................................................... 1

Literatura recomendada ........................... :...................................................... 3


2

MICRORGANISMOS E MEIOS DE CULTURA PARA UTILIZAO


INDUSTRIAL ..................................................................................................................... 5
2.1
Introduo .............................................................................................................. 5
2.2
Fontes de microrganismos de interesse ................... .......................................... 7
2.3
Caractersticas desejveis de microrganismos e meios de cultura
para aplicao industrial ............................................................................. :..... 10
2.4
Consideraes finais ............................................................ ............................... 18
Referncias bibliogrficas : ... 18
ESTERILIZAO DO EQUIPAMENTO ............................................................... 19
3.1
Introduo ............................................................................................................ l9
3.2
Terminologia e modo de atuao ..................................................................... 20
3.3
Esterilizao por agentes fsicos .............................. ......................................... 25
3.4
Esterilizao e desinfeco por agentes qumicos ......................................... 33
Referncias bibliogrficas ..................................................... :............................ 38
ESTERILIZAO DE MEIOS DE FERMENTAO POR
AQUECIMENTO COM VAPOR . ...............:: ............................................................ 39
4.1
Introduo ............................................................................................................ 39
4.2
Descrio sumria dos processos de esterilizao por calor mido ........... 40
4.3
Cintica da destruio trmica de microrganismos ....................................... 45
4.4
Destruio de nutrientes do meio corno conseqncia da esterilizao .... 51
4.5
Consideraes geris a respeito do clculo do tempo de esterilizao ...... 53
4.6
Clculo do tempo de esterilizao por processo descontnuo ..................... 56
4.7
Clculo do tempo de esterilizao por processo contnuo ........................... 60
Literatura recomendada .................................................................................... 62
ESTRILIZAO DE AR. : ~!: ........... 63
5.1
Introduo ...............................:.............................. .............................................. 63
5.2
Aerossis microbianos ........................................................................................ 64
5.3
Arnostradores ...................................................................................................... 65
5.4
Mtodos para a esterilizao de ar ................................................................... 75
5.5
Consideraes finais .....................................:..................... :............................... 90
Referncia.s biliogrficas .................................................................... ................ 90

XVI

CINTICA DE PROCESSOS FERMENTATIVOS . ............................................. 93


6.1
Introduo ................................................ ;........................................................... 93
6.2
Parmetros de transformao ' 95.
6.3
Clculo das velocidades .................................................................................. 101
6.4
A curva de crescimento microbiano ............................................................... 103
6.5
Classificao dos processos fermentativos ................................................... 107
6.6
Influncia da concentrao do substrato sobre a velocidade
especfica de crescimento ............................ .................................................... 110
Apndice ............................................................................................................ 114
Referncias bibliogrficas ..................................................... ........................... 121

MODELAGEM MATEMTICA E SIMULAO DE PROCESSOS


FERMENTATIVOS . ..................................................................................................... 123
7.1
Introduo .......................................................................................................... 123
7.2
Formulao dos modelos matemticos de processos fermentativos ........ 124
7.3
Ajuste de parmetros do modelo formulado ............................................... 148
7.4
Avaliao do modelo matemtico .................................................................. 164
7.5
Simulao de processos fermentativos .......................................................... 172
Referncias bibliogrficas ........................................... ,........... ......................... 175
BIORREATORES E PROCESSOS FERMENTATIVOS . ................................. 179
8.1
Introduo .......................................................................................................... 179
8.2
Classificao dos biorreatores : 180
8.3
Formas de conduo de um processo fermentativo .................................... 185
8.4
Exemplos de comparao de desempenho de biorreatores ....................... 189
Referncias bibliogrficas ............................................................................. ... 190
FERMENTAO DESCONTNUA. ... ..............:.................................................... 193
9.1
Introduo .......................................................................... ................................ 193
9.2
Inculo ................................................................................................................ 194
9.3
Mosto ................................................ .. ...................................... .......................... 196
9.4
Classificao ........................................................................... ........................... 199
9.5
Nmero de domas ............................................................................................ 200
Referncias bibliogrficas .........:......................... : 204
FERMENTAO DESCONTNUA ALIMENTADA . ...................................... 205
10.1
Introduo ::.................................... 205
10.2
Aplicaes .......................................................................................................... 207
10.3
Classificao .. ................................... :................................................................ 210
10.4
Modelos matemticos ...................... ................................................................. 212
Referncias bibliogrficas ................................................................................ 216
FERMENTAO SEMICONTNUA ..................................................................... 219
11.1
Definio .............................................. ............. :................................................ 219
11.2
Produtividade do processo semicontnuo .................................................... 220
11.3
Comentrios finais ... ..................... .................................................................... 222
Referncias bibliogrficas ................................................................................ 222
FERMENTAO CONTNUA . ............................................................................... 223
12.1
Conceitos bsicos .................................... .......................................................... 223
12.2
Vantagens e desvantagens do p rocesso contnuo em relao
ao descontnuo .................................................................................................. 224

10

11

12

L ____ _ _

XVII

12.3
12.4

Formas de operao no sistema contnuo ............... .......................... ;........... 225


Formao de produtos no sistema contnuo ....... .......................................... 242
Referncias bibliogrficas ............................................................:................... 245

13

FERMENTAO EM ESTADO SLIDO.......................................................... 247


13.1
Introduo .......................................................................................................... 247
13.2
Histria do processo da FSS ........... ........... ................................................. ..... 248
13.3
Microrganisrhos comumente utilizados ............................ ,........................... 250
13.4
Substratos: caractersticas e composio ....................................................... 250
13.5
Reatores para fermentao semi-slida ......................................................... 254
13.6
Controles do processo .................................. .. .................................................. 259
13.7
Vantagens e desvantagens ............................................................................... 264
13.8
Exemplos de casos : 266
Referncias bibliogrficas ................................................................... ............. 270
AGITAO E AERAO EM BIORREATORES . ........................................:.. 277
14.1
A importncia da transferncia de oxignio ............................................. ;... 277
14.2
Sistemas para a transferncia de oxignio .................................................... 279
14.3
Concentrao de oxignio dissolvido em soluces saturadas ................... 281
14.4
Transferncia de oxignio e respirao microbiana ..................................... 284
14.5
Transferncia de oxignio em sistemas agitados e areados ........................ 308
14.6
Consideraes finais ......................................................................................... 329
~)
R:ferncias bibliogrficas ................................................................................ 329
L!..?/ VARIAAO DE ESCALA. ...................,.................................................................... 333
15.1
Introduo .......... ,...........................:.................................................................... 333
15.2
Critrios para a ampliao de escala ....................................... ...................... 336
15.3
Comparaes entre critrios para a ampliao de escala ......... ;................. 348
15.4
Reduo de escala ................................................ ;........... .'................ ~ ............... 351
15.5
Consideraes finais ....................................................................................:.... 352
Referncias bibliogrficas ................................................... ~ ...~ ........................ 353
16 REATORES COM CLULAS IMOBILIZADAS . .........................................:.... 355
16.1
Introduo ...... ,................................................... ................................................ 355
16.2
Mtodos de imobilizao ................................................................................. 356
16.3
Tipos de biorreatores empregados .............................. ,.................................. 360
16.4
Aspectos relativos ao transporte de massa ................................................... 363
16.5
Processos que utilizam clulas imobilizadas ................................................ 366 .
16.6
Concluses ......................................................................................................... 370
Referncias bibliogrficas .................................................... :........................... 371
17 REATORES COM ENZIMAS IMOBILIZADAS ............................................... 373
17.1
Introduo .. ,.......................................;.......................................... ;.................... 373
17.2
Reatores enzimticos ..................................................... :................................... 374
17.3
Exemplos de processos enzimticos ........................ ,..................................... 388
Referncias bibliogrficas ........................................... ;.. :................................. 395
18 AUTOMAO E CONTROLE DE PROCESSOS FERMENTATIVOS . ... 397
18.1
Introduo ................................................................................ .......................... 397
18.2
Principais instrumentos para monitorao ein linha de processos
fermentativos ................................ ..................................................... ................ 398

... .

-- --------

-~-

- ----- - - --- -.- ---- --- --.........,- -- -- - - ~ -- ---~- --~ -- -~-

...

------

---- --- --

'..

XVIII

18.3

19

20

OPERAO DE INSTALAES INDUSTRIAIS DE


FERMENTAO . ........................................ :.............................................................. .425
19.1
Princpios gerais para operao ...................................................................... 425
19.2
Condies gerais para a execuo de um processo fermentativo ............. 426
19.3
Operao de uma indstria ............................................................................. 429
19.4
Operao de um processo frmentativo assptico ...................................... 434
19.5
Exemplo de operao de indstria de fermentao ................................... .435
Bibliografia ........................................................................................................ 439
CONSTRUO DE EQUIPAMENTOS DE FERMENTAO . .................. 441
20.1
Introduo .......................................................................................................... 441
20.2
Caractersticas bsicas de reatores para cultivo de bactrias ou
clulas animais .................................................................................................. 442
20.3
20.4
20.5
20.6
20.7

21

22

Controle aplicado a processos fermentativos ............................................... 411


Referncias bibliogrficas ........................................................ ........................ 423

Construo do fermentador ............................................................................ 448


Cultivo de clulas animais .............................................................................. 468
Obteno e manuteno das condies de esterilidade e
biossegurana ......................................................................................................470
Vlvulas e purgadores de vapor .... ................................................................ 480
Outros tipos de reatores ................................................................................... 485
Bibliografia .................................................................................................... .... 489

PURIFICAO DE PRODUTO~ BIOTECNOLGICOS . ............................493


21.1
Introduo ..............................:.........:...................................................... :........... 493
21.2
Classificao ......................................... :............................................................. 494
21.3
Rompimento de clulas microbianas ............................................................. 501
21.4
Precipitao ....................................................................................................... 504
21.5
Ultrafiltrao ..................................................................................................... 507
21.6
Extrao em sistemas de duas fases aquosas ............................................... 507
21.7
Cromatografia ............................ .......... ............................................................. 510
21 .8
Tratamentos finais ............................................................................................514
21.9
Rotinas analticas .................................................. ............................................ 515
21.10 O processo integrado de purificao ............................................................. 518
Referncias bibliogrficas ...................................................................~. ~ .......... 520
ASPECTOS ECONMICOS . .................................................................................. 523
22.1
Introduo .......................................................................................................... 523
22.2
Consideraes sobre as diferentes variveis e suas relaes
existentes em todo o estudo econmico ............................ :........................... 523
22.3
Anlise de viabilidade econmica ......................................... :....................... 528
22.4
Aspectos econmicos de processos fermentativos ...................................... 530
22.5
Mtodos de avaliao de investimento ...........................;............................. 535
Bibliografia ........................................................................................................ 541

I
L__.__ --------~----------

------------------=-========~~~~=-=-=-===~~==============
Walter Borzani

Durante a Segunda Grande Guerra (1939-1945), os ento "Aliados" concentraram esforos considerveis na consecuo de um objetivo muito especfico:
transferir para escala industrial o processo de laboratrio, ento conhecido, de
produo de penicilina por fermentao .
Ao lado de profissionais j de longa ~ata envolvidos no estudo de atividades microbianas, passaram ento a atuar engenheiros qumicos, com vistas soluo de questesbastante complexs inerentes desejada ampliao de escala.
Foi nesse perodo que nasceu o ramo da Engenharia Qumica que, mais tarde, por suas peculiaridades, receberia o nome de Engenharia Bioqumica.
Neste praticamente meio sculo de existncia, esse novo ramo da Engenharia Qumica progrediu rapidamente, conduzindo a muitos resultados de indiscutvel importncia-prtica.
O objetivo da Engenharia Bioqumica a aplicao dos conhecimentos da
Engenharia Qumica na soluo de problemas que se apresentam na implantao
de processos biotecnolgicos em larga escala, e em sua otimizao.
Segundo AIBA, HUMPHREY e MILLIS: "Biochemical engineering is concerned with conducting biological processes on an industrial scale, providing the
links between biology and chemical engineering. The authors believe, moreover,
that the heart of biochemical engineering lies in the scale-up and management of
cellular processes".
BAILEY e LLIS, por sua vez, dizem: "Processing of biological materiais and
processing using biological agents such as cells, enzymes or antibodies are the
central domain of biochemical engineering. Success in biochemical engineering requires integrated knowledge of governing biological properties and principies
and of chemical engineering methodology and strategy. (...) Reaching this objective clearly requires years of careful study and practice" .
Convm citar que o primeiro livro dedicado Engenharia Bioqumica foi
publicado em 1958, por STEEL.

Engenharia bioqumica: uma aplicao sui generis da engenharia qumica

Os problemas que se apresentam no mbito da Engenharia Bioqumica so,


com alguma freqncia, de difcil soluo, dadas as peculiaridades e a complexidade dos sistemas em que se desenvolvem os processos biotecnolgicos.
O estudo de vrios desses problemas constitui o principal objetivo deste volume, mas parece-nos aconselhvel, neste primeiro captulo, comentar alguns deles, com a nica finalidade de dar, aos alunos, uma idia das questes que sero
examinadas.
Comecemos tecendo alguns comentrios a respeito dos balanos materiais
em processos fermentativos. A clula microbiana responsvel pela transformao
que nos interessa em um dado processo realiza, alm dessa transformao, um
grande nmero de outras reaes com o objetivo, para ela absolutamente primordial, de manter-se viva e multiplicar-se. Isso pode dificultar o estabelecimento de
balanos materiais, alm de afetar o rendimento do processo considerado. O conhecimento das provveis vias metablicas que se desenvolvem nas clulas , neste particular, de grande auxlio, fornecendo muitas vezes informaes que
indicam a maneira mais adequada de conduzir o processo que nos interessa.
O fato inevitvel, apontado hpouco, de a clula ter a nica "preocupao"
de manter-se viva e multiplicar-se, tambm pode acarretar srios problemas no estudo da cintica da transformao que se tem em vista, uma vez que a velocidade
de formao do produto que nos interessa pode ser profundamente afetada pelas
velocidades de outras reaes integrantes do metabolismo do microrganismo. Isso
pode dificultar o estabelecimento de modelos matemticos, cuja importncia na
otimizao e no controle de processos j foi constatada muitas vezes.
A manuteno de um razovel grau de "homogeneidade" no reator, para que
todos os agentes da transformao se encontrem, pelo menos aproximadamente,
nas mesmas condies (temperatura, pH, concentraes de substncias do meio),
outro problema a ser considerado, principalmente em reatores industriais.
Consideremos, agora, a operao de esterilizao de grandes volumes de
meio, operao esta muito freqente em indstrias de fermentao. Como proceder: eliminar os microrganismos por filtrao do meio ou destru-los por aquecimento? Se a esterilizao por aquecimento tiver sido escolhida, que processo ser
utilizado: o descontnuo ou o contnuo? Que temperatura de esterilizao ser
adotada e qual o correspondente tempo do tratamento trmico? Quais sero as dimenses dos equipamentos e os controles necessrios em cada caso?
O meio, uma vez esterilizado, ser encaminhado ao fermentador onde ser
transformado pela ao das clulas microbianas. Aqui nos depararemos com muitas alternativas. Sero utilizados microrganismos em suspenso no meio ou clulas imobilizadas em suportes inertes? Que processo de fermentao ser utilizado:
o descontnuo, o semicontnuo ou o contnuo? Com ou sem recirculao do microrganismo? Se for escolhido o processo descontnuo, ser o descontnuo simples
ou o descontnuo alimentado? Se o processo adotado for o semicontnuo, que frao de meio fermentado ser periodicamente retirada do reator e substituda por
igual volume de meio novo? No caso de se ter optado pelo processo contnuo,
adotar-se- um nico reator de mistura, vrios reatores de mistura ligados em srie, ou um reator pistonado? Quais sero as dimenses e o form~to do reator?
Como controlar as condies de fermentao? Como adicionar alguns nutrientes:

Engenharia bioqumica: uma aplicao sui generis da engenharia qumica

todos de uma s vez no preparo do meio, ou de maneira programada durante o


andamento do processo?
No caso de se tratar de um processo enzimtico contnuo com enzimas imobilizadas, lanar-se- mo de um reator de leito fixo, ou de leito fluidizado?
Outro tpico a ser lembrado, o da ampliao da escala de trabalho ("scale-up"): se bons resultado~ foram obtidos, em certas condies, em um reator de
pequena capacidade, como operar um reator industrial para que os mesmos resultados sejam alcanados?
Finalmente, para no alongarmos demasiadamente estes comentrios, nunca
ser demais ressaltar a importncia de que se reveste a escolha dos processos que
sero utilizados, tanto na separao dos produtos e subprodutos, como no tratamento, ou no aproveitamento dos resduos.
A soluo adequada de muitas das questes com que se defronta a Engenharia Bioqumica passa, necessariamente, pelo estabelecimento de modelos matemticos, como se constatar ao longo deste Volume. Parece-nos oportuno, por esse
motivo, ressaltar a utilidade desses modelos, valendo-nos de um artigo publicado
por FREDRICKSON e colaboradores em 1970:
"1. Models serve to correlate data and so provide a concise way of
thinking about a system or process.

2. Models allow one- within limits- to predict quantitatively the performance of a system or process.-Thus~ they can reduce the amount of
experimentallbor necessary to design and/ or optimize a process.
3. Models help to sharpen thinking about a system or process and can
be used to guide one's reasoning in the design of experiments, to isolate important parameters and elucidate the nature of the system r process. That is to say,' the combinations of mathematical modelling and
experilllen_~~l research often suggests new experiments that need to be
done."

Literatura recomendada
(1) AIBA, S., HUMPHREY, A.E. & MILLIS, N .F. Biochemical Engineering.
University of Tokyo Press, Tquio, 1973.
(2) BAILEY, J.E. & OLLIS, D.F. Biochemical Engineering Fundamentais.
McGraw-Hill Book Company, Nova York, 1986.
(3) SIMON, P. & MEUNIER, R. Microbiologie Industrielle et Gnie Biochimique. Masson et Cie., diteurs, Paris, 1970.

Willibaldo Schmidell

2.1 - Introduo
O objetivo central do presente captulo reside na descrio das caractersticas gerais que microrganismos e meios de cultura devem apresentar, a fim de ser
possvel utiliz-los em uma operao industrial de grande porte, ou seja, executada em biorreatores com volumes de dezenas de milhares de litros.
Apesar de se procurar mencionar, ao longo do texto, alguns exemplos, no
h a preocupao em de$crever caractersticas particularmente importantes para
um determinado processo fermentativo, pois isto tornaria o tema extremamente
longo, alm de apresentar uma importncia questionvel, tendo em vista o escopo
geral do presente captulo.
Retomando as idias j abordadas no Captulo 9 (Vol. 1), na Figura 2.1 encontra-se um esquema geral de um processo fermentativo, na qual buscou-seressaltar alguns pontos essenciais, que permitem um incio de discusso dentro do
objetivo acima traado.
Conforme se pode observar na Figura 2.1, o sucesso de um dado processo
fermentativo depende muito de uma correta definio de quatro pontos bsicos: o
miCrorganismo, o meio de cultura, a forma de conduo do processo fermentativo
e as etapas de rec\lperao do produto.
Na verdade, esses quatro pilares de um processo fermentativo interagem
enormemente, sendo necessrio buscar defini-los de forma conjunta, levando em
considerao aspectos biolgicos e econmicos, o que torna bastante complexa
esta adequada definio. Para tornar clara essa idia, pode-se mencionar que sempre se pretende empregar meios de cultura baratos, mas deve-se lembrar que o
microrganismo deve encontrar neste ineio condies adequadas para realizar a
converso pretendida.

......._____ -

----- --- --~----- -.------~-- - -

- ------

'

--

..

Microrganismos e meios de cu~ura para utilizao industrial

Em termos de formas de conduo do processo fermentativo, seria difcil


imaginar a produo presente de etanol no Brasil (algo como 15 bilhes de litros
por ano), caso no se operasse os biorreatores em sistema descontnuo alimentado,
ou mesmo contnuo, porm com o reciclo das clulas. Da mesma forma, o grande
avano alcanado pela digesto anaerbia no tratamento biolgico de guas resi.durias, deveu-se muitssimo ao surgimento dos reatores contnuos operados com
fluxo ascendente e reciclo interno de clulas.

Matrias-primas

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Figura 2.1 - Esquema geral de um processo fermentativo

As operaes finais para a recuperao do produto (operaes de


"downstream"), so igualmente da mais alta importncia. Sabe-se ' que a melhor
forma presentemente para a recuperao do etanol, aps uma fermentao alcolica, a operao de destilao, mas ela incide significativamente no custo do produto final, em virtude da energia necessria para a sua execuo. No entanto, a
importncia de uma adequada definiao das operaes de recuperao do produto, fica mais clara quando se aborda a produo de produtos de alto valor agregado, como a produo de antibiticos, enzimas, ou outras protenas (insulina,
hormnios de crescimento, vacinas etcJ P'ra esses casos, as operaes de recuperao do produto podem ser responsveis por 50 a 70% do custo do produto final,
indicando, claramente, a sua importncia em termos de uma adequada definio.
Os aspectos relacionados com a forma de conduo de biorreatores, assim
como as operaes de recuperao de produtos, sero abordados em vrios captulos do presente volume .
._,

Fontes de microrganismos de interesse

Cabe, portanto, conforme salientado anteriormente, abordar alguma reflexo sobre microrganismos e meios de cultura que podem ser eventualmente empregados em uma operao industrial.

2.2 - Fontes de microrganismos de interesse


Microrganismos que possam ter interesse industrial, podem ser obtidos basicamente das seguintes formas:
isolamento apartir de recursos naturais
compra em colees de culturas
obteno de mutantes naturais
obteno de mutantes induzidos por mtodos convencionais
obteno de microrganismos recombinantes por tcnicas de
engenharia gentica.
O isolamento de microrganismos a partir de recursos naturais, tais como
solo, gua, plantas etc., sempre foi uma atividade de grande importncia para a
obteno de novas linhagens de interesse industrial.
Trata-se de uma atividade que envolve muito trabalho experimental, significando um custo relativamente elevado, porm pode conduzir ao isolamento de linhagens melhor produtoras de um dado produto, mas, mais importante do que
isto, pode conduzir descoberta de novos produtos, o que confere a esta possibilidade uma relevncia inquestionvel.
Cumpre lembrar que as grandes eni.presas produtoras de antibiticos, ou enzimas, mantm programas de isolamento de linhagens de recursos naturais, justamente com o objetivo de incrementar a produo de certos produtos, ou com o
objetivo de encontrar linhagens produtoras de novos antibiticos por exemplo.
dar() ql.!e o isolamento de linhagens deve ter incio com certas premissas,
definindo-se o que se pretende obter, pois o simples isolamento poder levar
disponibilidade de um nmero inimaginvel de culturas, o que dificulta a convergncia para o processo ou o produto que se pretende produzir.
A compra em colees de culturas presentemente bastante vivel, tendo
em vista a existncia de muitas colees de culturas em vrios pases. Nesse
sentido, STANBURY et al. 1 listam nada menos do que 11 colees de culturas em
vrios pases, podendo-se ainda acrescentar a Agricultura! Research Service
Culture Collection (EUA), tambm conhecido como NRRL Culture Collection
(http:/ /nrrl.ncaur.usda.gov) e a Coleo de Culturas Tropical {Campinas - SP;
http:/ /www.cct.org.br). O contato com essas colees atualmente muito facilitado, podendo-se utilizar os recursos da Internet para tal tarefa.
de se esperar que o microrganismo utilizado para a produo de um dado
antibitico no estar disponvel em uma coleo de culturas, sendo, com muita
freqncia, oriundo de programas de melhoramento gentico.
Como se sabe, quando uma dada clula prolifera, h sempre uma pequena
possibilidade de surgimento de mutantes naturais, os quais podem ser isolados e
ensaiados objetivando a verificao de sua potencialidade de produo. Conforme

Microrganismos e meios de cultura para utilizao industrial

se ver adiante, essas alteraes naturais no so, de forma alguma, interessantes


do ponto de vista de um processo fermentativo, mas eventualmente podem gerar
novas linhagens que apresentem interesse prtico.
No entanto, aguardar o surgimento de mutantes naturais de interesse prtico, poder significar o dispndio de muito tempo, razo pela qual prefere-se, h j
vrias dcadas, lanar mo de mtodos que forcem o aparecimento de clulas inutadas, como o caso de submeter suspenses de clulas ou esporos a radiaes ultravioleta ou a substncias qumicas mutagnicas, como a nitrosoguanidina. Ao se
permitir essa exposio ou contato, ocorre uma drstica destruio da maioria das
clulas, recuperando-se, a seguir, aquelas que sobreviveram, verificando-se se
mutaram na direo desejada.
Essa tcnica para a obteno de mutantes obviamente aleatria, tratando-se de recuperar as clulas sobreviventes em meios ou condies especficas, de
forma a dirigir este isolamento para as clulas que se pretende. Tais programas de
mutao/seleo costumam ser bastante dispendiosos, mas levaram a vrias condies de sucesso descritas na literatura.
Um caso bem relatado foi a significativa melhora de linhagens de Penicillium
chrysogenum para a produo de penicilina. De fato, na dcada de 40 obtinha-se
teor de penicilina no caldo fermentado da ordem de 100 unidades/ cm3, passando-se a obter, j por volta de 1976, teores da ordem de 51.000 unidades/cm 3 J
acrscimos da ordem de 4 vezes foram obtidos entre 1970 e 1985 em uma determinada empresa, 1 o que indica que este progresso costuma-~er muito estimulante, especialmente quando se parte de linhagens naturais. Incrementos semelhantes
foram obtidos na empresa Squibb Indstria Qumica S.A., no perodo de 1975 a
1992, conforme relatado por SCHMIDELL; FERNANDES. 2
Tais progressos realmente significativos costumam ser atribudos apenas a
esses programas de mutao/seleo, mas conveniente lembrar o necessrio trabalho de adaptao do meio de cultivo, da forma de conduzir o processo.fermentativo e as alteraes nas etapas de recuperao do produto, a fim de propiciar o
real surgimento das vantagens, em nvel de produo industrial, da nova linhagem selecionada. 2
Finalmente, nas ltimas dcadas, as tcnicas de engenharia gentica (vide
Vol. 1, Cap. 4), tambm designadas por tcnicas ou tecnologia de DNA recombinante, sem dvida trouxeram um imenso avano nas possibilidades de se obter clulas mais produtivas, ou clulas produtoras de substncias que normalmente no
produzem. Como se sabe, ao lado dessas possibilidades, igualmente trouxeram
vrias reflexes e inquietudes, cujo teor no ser abordado no presente captulo.
A introduo de fragmentos de DNA de certas clulas em outras, via vetores
como os plasmdeos, permite a obteno de clulas alteradas geneticamente, porm de forma muito mais dirigida do que as metodologias convencionais anteriormente mencionadas, sendo possvel de ser executada no apenas com microrganismos, mas igulmente com clulas animais e vegetais.
Para se ter uma idia da potencialidade dessas tcnicas, imaginemos que se
conhea a seqncia metabl~ca que leva ao acmulo de um dado produto de interesse, por exemplo o produto P na seqncia genrica:

Fontes de microrganismos de interesse

A~B~C~D~

... ~P

Um estudo mais aprofundado dessa seqncia, atravs da determinao das


concentraes dos compostos intermedirios (B, C, D etc.), pode levar determi~
nao da reao limitante da seqncia (aquela que determina a velocidade do fluxo metablico em estudo, por exemplo a reao C 4 D) e, portanto, da enzima
responsvel pela reao especfica (enzima c). As etapas seguintes so a identificao do gene que codifica 'para a sntese dessa enzima, introduzir este gene em
plasmdeos e volt-los clula produtora. Com esse procedimento, aumenta-se o
nmero de cpias do gene responsvel pela sntese da enzima, o que permite aumentar a velocidade da reao limitante, pela presena de uma maior concentrao da enzima responsvel (no caso, a enzima c).
Essa estratgia foi empregada, por exemplo, no incremento da produo de
cefalosporina C por CephaZosporiuni acremonium. 1
Ainda, uma etapa intermediria poderia ser imaginada. Uma vez identificada a enzima responsvel pela catlise da reao limitante, esta enzima poderia ser
manipulada, atravs do conhecimento de sua estrutura e alterao de determinados aminocidos, por tcnicas de engenharia de protenas, objetivando obter uma
nova protena com atividade aumentada. O gene correspondente a essa nova enzima seria, ento, introduzido na clula produtora, conforme acima descrito.
A potencialidade dessas tcnicas realmente enorme, pois, uma vez solucionado o problema de uma dada reao limitante, outra reao da seqncia metablica passar a ser limitante, o que permite imaginar a realizao de igual estratgia para esta nova reao. Claro est que tais procedimentos no so de simples
execuo, pois inclusive exigem um amplo conhecimento do material biolgico
utilizado, mas apresentam um enorme interesse prtico.
Conforme mencionado, as tcnicas de DNA recombinante tambm podem
ser aplicadas para tornar clulas produtoras de substncias que naturalmente no
so por elas produzidas, ,em virtude da ausncia de codificao gentica para tanto. Nesse caso, genes de certas clulas so transferidos, via vetores adequados, a
outras clulas, como o caso de introduzir a codificao para a sntese de glicoamilase de Aspergillus em clulas de Saccharomyces cerevisiae, o que passa a permitir
a realizao da fermenta~o alcolica de matrias~primas amilceas, pela levedura
alterada geneticamente. 3'
Com esse objetivo, a tecnologia do DNA recombinante tem sido empregada
para a obteno de protenas heterlogas de alto valor agregado, em particular
para uso em sade humana, como o caso da produo de hormnio de crescimento humano, insulina, interferons, Fator VIII (tratamento da hemofilia) etc.
Como microrganismos receptores da codificao gentiea empregam-se bactrias
(Escherichia coZi, Bacillus subtiZis), leveduras (Saccharomyces cerevisiae) ou fungos filamentosos (Aspergillus niger). Igualmente so empregadas clulas animais (exem.:.
pio: BHK - "Baby Hamster Kidney"), particularmente para a produo de protenas mais complexas e de maior valor agregado, o que explica o crescente interesse
das grandes empresas do setor no cultivo de clulas animais.
Presentemente, inclusive possvel imaginar o emprego de um pequeno nmero de microrganismos, bem conhecidos em termos de necessidades nutricionais
e caractersticas de crescimento, como o caso de Escherichia coZi ou Saccharomyces
cerevisiae, para a sntese de uma grande variedade de protenas, no lugar de se ter
como problema o cultivo de uma linhagem para cada composto a ser produzido.

IO

Microrganismos e meios de cultura para utiliza~ industrial

Claramente isso pode contribuir pa~a uma certa simplificao dos processos produtivos, desde que se consiga obter os mutantes adequados.

2.3 - Caractersticas desejveis de microrganismos e meios


de cultura para aplicao industrial
Conforme j anunciado, no presente item pretende-se apresentar algumas
caractersticas gerais que microrganismos e meios devem apresentar, a fim de que
seja possvel o estabelecimento de processo produtivo em larga escala. Buscar-se-
enunciar as caractersticas desejveis de microrganismos e, em seguida, aquelas
relacionadas aos meios de cultivo, lembrando, no entanto, que o desempenho de
um dado microrganismo depende muito da composio do meio de cultura em
que colocado.
Como se pretende expor caractersticas gerais, quando da anlise de um
dado processo fermentativo, possvel que algumas destas caractersticas no se
apliquem, enquanto outras,no abordadas no presente texto, podero ser de grande importncia. No entanto, espera-se estabelecer certas reflexes que permitam
essa anlise crtica.

2.3. I - Caractersticas desejveis de microrganismos


Para uma aplicao industrial, espera-se que os microrganismos apresentem
as seguintes caractersticas gerais:

apresentar elevada eficincia na converso do substrato em produto;


permitir o acmulo do produto no meio, de forma a se ter elevada concentrao do produto no caldo fermentado;
no produzir substncias incompatveis com o produto;
apresentar constncia quanto ao comportamento fisiolgico;
no ser patognico;
no exigir condies de processo muito complexas;
no exigir meios de cultura dispendiosos;
permitir a rpida liberao do produto para o meio.
As duas primeiras caractersticas sero discutidas conjuntamente, pois, apesar de serem distintas, concorrem para o mesmo objetivo geral de extrema importncia.
[)e fato, uma clula deve permitir elevada converso do substrato em produto,
pois, com muita freqncia, as matrias-primas incidem pesadamente no custo do
produto final, podendo-se mencionar uma incidncia de 38 a 73% do custo total de
produo como sendo devido s matrias-primas, em particular a fonte orgnica
de carbono.1
Por outro lado, sempre desejvel que o microrganismo permita um elevado
acmulo do produto no meio, sem sofrer inibio mais acentuada em virtude deste
acmulo, pois isto concorre para uma reduo nos custos de recuperao, os quais
tambm podem ser muito acentuados.
Tome-se como exemplo o caso da fermentao alcolica, aqui representada
simplificadamente pela equao qumica final (glicose em anaerobiose sendo convertida em etanol e gs carbnico):

Caractersticas desejveis de microrganismos e meios de cuaura para aplicao industrial

II

.....

C 6 H 12 6

2C 2 H 5 0H+ 2C0 2

Como se pode observar, o fator estequiomtrico igual a 0,511, ou seja, cada


grama de glicose convertida gera 0,511g de etanol, sendo que o Saccharomyces cerevisiae, normalmente empregado nesta fermentao, com freqncia permite obter
um rendimento da ordem de 90% deste valor estequiomtrico, o que torna este microrganismo o mais importante para Tealizar esta converso, lembrando que vrios
outros tambm podem acumular etanol, a partir da glicose, porm no com este
rendimento to elevado.
Obviamente, no se consegue manter um processo de fermentao alcolica
obtendo-se 100% de rendimento, pois as clulas tm de proliferar, o que significa a
sntese de muitos outros compostos intermedirios, sendo o acmulo de etanol a
via metablica que permite a gerao de energia na forma de ATP (gliclise). Claro est que esse um ponto fundamental, pois a matria-prima incide em algo
como 60% do custo do etanol e, desta forma, baixos rendimentos tornariam invivel a produo deste produto de baixo valor agregado.
Por outro lado, sabe-se que quando se atinge 8 a 10% (em volume) em etanol
no vinho fermentado, j ocorre uma clara inibio da levedura, o que faz com que
a velocidade da converso do acar em etanol fique prejudicada, razo pela qual
procura-se no ultrapassar estes valores, pelo menos na produo de lcool combustvel (no se est aqui comentando o caso de bebidas alcolicas).
Isso significa a necessidade de destilar um lquido que contm apenas 10%
de etanol, o que - alm do dispndio de energia - ainda ir gerar 90% de resduo
na forma de vinhaa, que necessita encontrar um destino adequado.
O ideal seria encontrar leveduras mais resistentes ao etanol, porm sem que
{ ocorra queda n. a velocidade da fermentao alcolica (sem queda na produtividade), o que no tarefa simples.
De qualquer forma, fica claro que a converso da matria-prima em produto
j muito elevada, o que no permite visualizar grandes incrementos, lembrando,
novamente, a necessidade de manter a viabilidade celular para que a fermentao
no seja interrompida.
Uma situao bem diversa a que ocorre com os processos aerbios, por
exemplo,na produo de enzimas ou antibiticos. Nesse caso, a converso do acar pode ser representada esquematicamente da seguinte forma:

Acar + 0 2 ~ clulas + C0 2 + H 20 + Intermedirios + Produto


Nesse caso, por se operar em aerobiose, a quantidade de clulas geradas costuma ser muito intensa, em relao ao acar consumido, ao lado de uma quantidade relativamente pequena do produto alvo (antibitico ou enzima). Se, por um
lado, o custo da matria-prima incide menos 'pesadmente no custo do produto final, as operaes de recuperao do produto so necessariamente mais onerosas
(chega-se a valores da ordem de 70%), mas o produto alvo de mais alto valor
agregado.
Assim, ao se encontrar linhagens que cresam relativamente menos, ou que
acumulem menos compostos intermedirios, possvel visualizar grandes incrementos na sntese do produto, conforme mencionado anteriormente para o caso
da produo de penicilina.

12

Microrganismos e meios de cultura para utilizao industrial

Mesmo permitindo o acmulo do produto no meio, a clula produtora deve,


ainda, contar com a caracterstica de no produzir substncias que sejam incompatveis
com o produto, pois isto pode levar a uma situao de desinteresse pelo processo
produtivo.

Esse o caso, por exemplo, de se estar interessado na produo de uma dada


enzima, ou protena, mas se utilizar uma linhagem que tambm seja uma boa produtora de proteases extracelulares. Assim, ao se produzir a enzima, separar as clulas e armazenar o produto, pode-se ter uma reduo sensvel da atividade
enzimtica em virtude da ao das proteases.
Um exemplo adicional, mais especfico, sobre a produo de glicoamilase
por Aspergillus. Como se sabe, a glicoamilase a enzima que hidrolisa o amido gerando glicose, sendo pois de muito interesse em vrias aplicaes, destacando-se o
preparo de xaropes de glicose para a indstria de alimentos. Ocorre que alguns
microrganismos produtores de glicoamilase tambm sintetizam a transglicosidase, enzima esta que, quando na presena de glicose, volta a polimeriz-la, gerando
molculas que no so mais hidrolisadas pela glicoamilase.
Na realidade, a presente caracterstica desejvel em uma clula pode ser
bem mais generalizada. Um microrganismo ideal, quanto ao aspecto agora abordado, deve produzir o mnimo de outras substncias, ao mesmo tempo em que
sintetiza o composto pretendido. Isso leva a uma maior disponibilidade de nutrientes para a sntese do produto (voltando-se discusso anterior), mas tambm
permite vislumbrar uma maior facilidade na recuperao deste produto. '
Uma outra caracterstica, da mais alta importncia, refere-se estabilidade fisiolgica da linhagem a ser empregada industrialmente. Isso significa que no basta que se tenha uma linhagem hiperprodutora de uma dada substncia de
interesse, mas que se conhea as tcnicas mais adequadas para a sua conservao
e, mais ainda, que ela se mantenha como excelente produtora da substncia de interesse ao longo de todas as etapas envolvidas desde sua proliferao em nvel de
laboratrio, germinadores e biorreator principal (Fig. 2.1).
Assim sendo; o constante estudo dessas formas de conservao maiS adequadas das linhagens tarefa das mais importantes, mantendo-se, na indstria,
aquelas realmente de interesse, assim como o imediato descarte dos lotes que demonstrem alguma tendncia atenuao quanto ao acmulo do produto no meio.
Para a clula h sempre a tendncia em otimizar o crescimento, em detrimento da
sntese do produto, motivo pelo qual no basta verificar, em termos de metodologias de conservao, se a clula cresce, mas se ela continua a acumular o produto
de maneira eficaz.
Conforme j mencionado anteriormente, quando uma clula prolifera, h
sempre alguma probabilidade de ocorrerem mutaes naturais. Em um processo
fermentativo tpico, normalmente parte-se de uma massa muitopequena de clulas nas etapas iniciais de preparo do inculo (Fig. 2.1), chegando-se a biorreatores
de dezenas de milhares de litros, contendo concentraes celulares com freqncia acima de 10 g de matria seca de clulas/L, o que significa gerar, em termos de
massa de matria seca, algo em torno de toneladas de clulas. Isso mostra claramente a necessidade de se operar com material gentico que seja estvel, a fim de
se contar com clulas competentes em termos de acmulo do produto._
O emprego de linhagens relativamente instveis, pode, inclusive, limitar o
emprego de sistemas de fermentao mais eficientes, como os processos contnuos,

Caractersticas desejveis de microrganismos e meios de cu~ura para aplicao industrial

13

pois poder ocorrer, ao longo do tempo, a seleo de clulas que privilegiem o


crescimento em detrimento do acmulo do produto.
O fenmeno da atenuao do acmulo do produto de interesse pode ocorrer
tanto com linhagens naturais como, em especial, com as linhagens mutadas. Na literatura1 est bem documentada a viabilidade de se produzir lisina pOr mutantes
auxotrficos, em processo contnuo, apenas quando se empregam mutantes auxotrficos em dois aminocidps e no em apenas um, a fim de evitar os mecanismos
de controle da clula e obtr o acmulo intenso do aminocido de interesse. Nessa
condio, mais difcil o retorno s caractersticas da linhagem original, em virtude de uma maior alterao a que a clula foi submetida.
Clulas recombinantes, por via da introduo de plasmdeos, igualmente
podem ser instveis em virtude da inexistncia de replicao do plasmdeo para
.as clulas filhas, ou mesmo devido destruio do plasmdeo na prpria clula
hospedeira, ou ainda expulso desse plasmdeo. necessrio lembrar que a introduo de novas codificaes genticas pode, eventualmente, significar um nus
adicional para a clula, a qual est interessada em aprimorar o seu crescimento.
Inclusive, a integrao de uma codificao gentica contida em um plasmdeo ao
cromossomo da clula, o que poderia conferir a desejada estabilidade, pode ainda
no resultar na obteno de uma hiperprodutora, em virtude da existncia de um
nmero limitado de cpias do gene de interesse.
A operao de biorreatores de grande porte, conforme mencionado anteriormente, do ponto de vista tcnico e econmico, praticamente exige o emprego de
microrganismos no patognicos, os quais possam ser manuseados sem riscos ambientais, particularmente nas etapas seguintes em relao ao trmino do processo
fermentativo. Mesmo durante a fermentao, caso se manuseasse microrganismos
patognicos em reatores de dezenas de milhares de litros, os cuidados teriam de
ser bastante -aumentados, particularmente com os gases efluentes, o que incidiria
em custos adicionais.
O cultivo de patogil.icos efetuado, por exemplo, para a produo de vacinas, em reatores_le pequeno porte (da ordem de centenas ou poucos milhares de
litros), porm confinados em cmaras asspticas, tomando-se precaues necessrias para a rio ocorrncia de contaminao do meio ambiente. Isso, logicamente,
significa custo adicional, o qual pode ser justificado no caso de produo de vacinas, mas tornaria invivel a produo de uma enzima ou mesmo um antibitico.
A obteno de clulas recombinantes de Escherichia coZi, via a introduo de
plasmdeos, sempre algo muito atraente, pois esta uma das bactrias mais conhecidas presentemente, mas encontra resistncias em termos de uma utilizao em
instalaes de grande porte, justamente por ser uma enterobactria. Essa uma das
razes (no a nica), pelas quais hoje se prefere partir de clulas de leveduras, ou
fungos filamentosos no patognicos, ou mesmo de clulas animais, a fim de se obter recorribinantes. Apesar disso, ainda existem discusses a respeito da disposio
final dessas clulas recombinantes, conforme mencionado anteriormente.
Um microrganismo tambm no deve exigir condies de processo muito complexas, por motivos claros de economicidade da produo, sendo que dentro deste tpico muitos aspectos podem ser abordados.
Como se sabe, sempre existem valores timos d0 pH e da temperatura, por
exemplo, em termos do acmulo do produto. No entanto, tambm se sabe que o
~--- --

_._ _______

------ - ---

-- -------- --

- --- ----

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14

I
I

Microrganismos e meios de cu~ura para utilizao industrial

controle preciso do pH e da temperatura apenas possvel em reatores de bancada, sendo que em reatores de grande porte (dezenas de milhares de litros), dever
ocorrer uma certa heterogeneidade ao longo da altura do reator, de forma que a
clula dever manter o seu desempenho, apesar de uma certa flutuao nos valores destas grandezas tomadas como exemplo. Em outras palavras, o ideal que o
microrganismo tenha uma faixa de valores timos dessas grandezas e no valores
pontuais, particularmente no que se refere ao acmulo do produto.
Nessa direo, so igualmente muito interessantes os microrganismos que
conseguem manter um bom desempenho, quando cultivados em baixas concentraes de oxignio dissolvido. Como ficar claro no captulo sobre transferncia de
oxignio, a necessidade de manuteno de altas concentraes de oxignio dissolvido traz problemas bastante srios no tocante a um maior dispndio de energia,
em virtude de uma maior agitao e aerao do meio. Nesse sentido, os microrganismos que crescem de forma aglomerada (forma miceliar, por exemplo), so sempre mais complicados, pois a concentrao de oxignio no meio de cultivo ter de
ser mais elevada, a fim de que as clulas mais internas destes aglomerados tenham
acesso a este oxignio, quando comparadas s clulas que crescem isoladamente.
J foi abordado anteriormente a inconvenincia em operar corh linhagens
que excretem quantidades exageradas de protenas para o meio, mas ainda h
uma questo adicional, pois a gerao de espuma freqentemente se atribui presena de protenas no meio de cultivo, situao ainda mais complexa para os processos aerbios, devido necessidade de aerar e agitar.o contedo do bioi:-reator.
Em geral, a gerao de espuma pode ocorrer no incio de um processo fermentativo aerbio, quando se empregam meios de cultivo contendo extratos de
carne ou de levedura, ou gua de macerao de milho ("com steep liquor"), e nas
etapas mais avanadas de um processo em virtude da presena de protenas. Isso
causa srios problemas, como a necessidade de empregar um menor volume til
do reator, a fim de ter condies de controlar a espuma, alm da freqente necessidade de empregar antiespumantes que, alm de onerarem o produto final, ainda
podem causar dificuldades nas etapas de recuperao do produto e uma reduo
na transferncia de oxignio, o que exige o aumento da agitao e da aerao,
agravando a situa.o. Assim, .importante a seleo de microrganismos que excretem poucas protenas juntamente com o produto desejado.
As caractersticas que um meio de cultivo devem apresentar sero discutidas no prximo subitem mas, neste momento, convm mencionar que o microrganismo selecionado para um processo industrial no deve exigir meio de cultura
extremamente oneroso, por questes claramente de econorrlia do processo produtivo. Essa a razo pela qual um maior conhecimento das necessidades nutricionais
de uma linhagem estudo de vital importncia, objetivando o fornecimento dos
nutrientes apenas necessrios. Em algumas circunstncias esse desconhecimento
leva necessidade da adio de certas substncias, como extrato de levedura, extrato de carne, peptona etc., as quais costumam ser bastante dispendiosas.
Particularmente na rea de produo de vacinas, costuma-se utilizar meios de
cultura bastante complexos e.onerosos, assim como nos cultivos envolvendo clulas
animais, mas aqui, novamente, os volumes de reao so relativamente pequenos e
os produtos gerados podem ser considerados como de alto valor agregado.
t Fina lmenhte: codmo com muita freqnc ia lh
magina-s e a proddul~bo defip~ oduto.s
ex race1u 1ares, a to o o interesse em que a 1in agem se1eciona a t ere act e rapt-

L.~--- - ------------------- --- -~-

Caractersticas desejveis de microrganismos e meios de cultura para aplicao industrial

I5

damente o produto para o meio, de onde ele ser recuperado nas etapas seguintes ao
processo fermentativo .
Alm do aspecto ligado a uma eventual inibio do prprio microrganismo,
pela reteno de um dado produto do metabolismo, ainda cumpre lembrar que,
com freqncia, a primeira etapa de recuperao do produto significa a separao
do microrganismo (por centrifugao ou filtrao), trabalhando, a seguir, com o lquido isento de clulas e estas descartadas. Assim, se algum produto ainda permanece associado s clulas, ser perdido.
Sabe-se que a reteno de certos produtos pelas clulas depende de uma srie de fatores, tais como: da linhagem empregada, da composio do meio de cultivo e das condies impostas (pH, temperatura etc.).
Nessa direo, um exemplo interessante foi o apresentado por AGUERO et
al} trabalhando no estudo da produo de glicoamilase por Aspergillus niger
NRRL 337 e Aspergillus awamori NRRL 3112, sendo esta segunda linhagem, sem
dvida, melhor produtora que a primeira. Esses autores indicaram que, a pH 4, o
A . niger reteve cerca de 30% da atividade associada s clulas, enquanto que o A.
awamori apenas algo em torno de 10%, indicando que a linhagem melhor produtora tende a ser mais eficiente na excreo. do produto de interesse. J a pH 6, as clulas de A. niger retiveram cerca de 70% da atividade enzimtica, enquanto que
nas clulas de A. awamori esta reteno foi da ordem de 40%, em relao atividade total (soma da atividade enzimtica extracelular, encontrada no caldo, e a atividade intracelular, ou seja, a atividade encOntrada nas clulas - atividades
enzimticas expressas por unidade de volume de amostra), mostrando de forma
clara a influncia do pH na eficincia da capacidade de excreo das clulas. Ainda, indicaram que as atividades totais obtidas com cada uma .das linhagens atingiram valores muito prximos, tanto a pH 4 como 6, indicando .que o pH interferiu
na excreo, mas no na sjntese propriamente dita.
Esses resultados indicam a necessidade de se verificar, com a devida ateno, a reteno do produto de interesse pelas clulas, quando se procura efetuar
trabalhos de seleo de linhagens, ou se esteja estudando diferentes condies de
cultivo, mesmo que o interesse resida na recuperao de produtos extracelulares.
Caso contrrio, corre-se o risco de descartar linhagens, ou condies de cultivo,
que poderiam ser potencialmente interessantes.

2.3.2 - Caractersticas desejveis de meios de cultivo


Conforme j comentado no incio do item 2.3, sempre muito difcil mencionar as caractersticas de microrganismos, sem associ-los a um determinado meio
de cultivo. Dessa forma, as caractersticas acima indicadas, na verdade em muitos
casos, dependem do meio utilizado, de maneira que se poderia repetir, no presente item, caractersticas como permitir o acmulo de produto no meio, no permitir
a sntese de substncias incompatveis com o produto etc. Claramente isso no teria um maior interesse, alm de tornar-se montono, preferindo-se descrever algumas caractersticas mais especficas, mas que agora, obviamente, dependero do
microrganismo a ser utilizado. Igualmente, no ser apresentada uma discusso
item a item, mas ser efetuada uma abordagem mais geral.

16

Microrganismos e meios de cultura para utilizao industrial

Algumas caractersticas gerais, que devem ser consideradas, so:


ser o mais barato possvel;
atender s necessidades nutricionais do microrganismo; '
auxiliar no controle do processo, como o caso de ser ligeiramente tamponado, o que evita variaes drsticas de pH, ou evitar uma excessiva formao de espuma;
no provocar problemas na recuperao do produto;
os componentes devem permitir algum tempo de armazenagem, a fim de
estarem disponveis todo o tempo;
ter composio razoavelmente fixa;
no causar dificuldades no tratamento final do efluente.
Todas essas so caractersticas importantes, destacando-se o custo do meio
de cultura, que deve ser o menor possvel, desde que atenda s necessidades do
microrganismo selecionado.
Justamente essa combinao de atender s necessidades nutricionais do microrganismo, a fim de que o produto possa ser sintetizado, e ser minimamente
oneroso, que, com freqncia, acaba por causar certas complicaes, que merecem ser mais detidamente discutidas.
Como se sabe, os microrganismos utilizam como fonte de carbono, e freqentemente de energia, diversos acares, tais como:..glicose, sacarose, frutose,
ou ainda polissacardeos, como o amido e a celulose. Como fonte de nitrognio
{ so freqentemente utilizados sais, como o (NH4 hS0 4 (o qual costuma provocar
redues significativas do pH e, em alguns casos, fenmenos de inibio pelo sulfato), o (NH4 ) 2HP04 , ou aminocidos, ou a uria (a qual permite reduz,ir os problemas de controle do pH). Como fonte de fsforo utilizam-se os fosfatos solveis,
como o monoamnio fosfato (MAP), ou o diamnio fosfato (DAP), os quais passam a ser fontes de nitrognio e fsforo simultaneamente. Ainda, necessita-se adicionar outros elementos, como: Na, K, Ca, Fe, Cu, Mg, Mn, Co etc., em
concentraes freqentemente muito reduzidas, na forma de seus sais solveis.
Meios de cultura constitudos apenas por essas substncias costumam ser
chamados de meios definidos, ou meios sintticos, cuja composio qumica
sempre muito bem conhecida e pode ser reproduzida a qualquer instante. Por essa
razo, para as clulas que apresentam bom desempenho em meios desse tipo, espera-se a ocorrncia de um sistema produtivo muito estvel, alm de, em geral,
no apresentarem problemas quanto recuperao e purificao do produto final.
Esses meios, mesmo sendo mais onerosos, podem ser preferidos, caso realmente
permitam uma maior economia nas etapas de recuperao do produto.
No entanto, para uma grande variedade de linhagens, h a necessidade da
adio de certos "fatores de crescimento", ou seja, alguns aminocidos especficos
ou vitaminas (como biotina, tiamina, riboflavina etc.). Claro est que, quando se
conhecem essas necessidades especficas, o que nem sempre o caso, possvel
adicionar essas substncias puras, a fim de manter o meio em sua forma mais definida, mas o custo destes meios pode tornar-se invivel, particularmente para ins, talaes de grande porte, a menos que isto signifique um enorme ganho

Caractersticas desejveis de microrganismos e meios de cultura para aplicao industrial

17

econmico na recuperao do produto, ou preserve alguma caracterstica fundamental deste produto, necessariamente de alto valor agregado.
Alternativamente, para suprir as necessidades de linhagens mais exigentes
e, em geral, com caractersticas nutricionais mal conhecidas, pode-se adicionar
certos materiais complexos como: extrato de levedura (autolisado de leveduras),
extrato de carne, extrato de malte, peptona (hidrolisado de protenas) etc. Esses
materiais (individualmente ou adicionados .conjuntamente) permitem introduzir
no meio de cultura os fatores faltantes em um meio definido, mas, alm de onerosas, so complexas e de composio varivel ao longo do tempo de armazenagem
e na dependncia do fabricante e do lote empregado. Assim, pode-se imaginar a
ocorrncia de oscilaes no processo fermentativo, alm de possveis dificuldades
nas operaes de recuperao do produto final, dependendo das caractersticas
deste produto e das operaes de recuperao.
freqente observar-se, n~s trabalhos bsicos de isolamento ou seleo de
linhagens, o emprego de meios contendo quantidades muito grandes desses extratos ou hidrolisados (vrios gramas por litro, ou mesmo dezenas de gramas por litro). Dessa forma, no desenvolvimento do processo produtivo, uma das tarefas
iniciais verificar a possibilidade da obteno de iguais desempenhos, porm em
meios isentos desses materiais, ou com a adio de quantidades mnimas, tendo
em vista o custo envolvido.
Na direo dos meios mais complexos e, igualmente, menos onerosos, razo
pela qual so empregados na maioria dos processos fermentativos em grande escala, cumpre mencionar o uso de matrias-primas naturais, tais como caldo de cana-de-acar, melaos, farinhas diversas (farinha de trigo, milho, soja, cevada),
gua de macerao de milho ("com steep liquor") etc.

Essas matrias-primas so de composio qumica desconhecida, podendo-se conhecer os teores dos acares disponveis, nitrognio, fsforo, mas no se
conhecem os teores dos sais minerais, pois certamente h sempre um nmero muito grande de constituintes. Meios de cultura contendo esses materiais naturais
com freqncia so completados com alguns sais (particularmente contendo nitrognio e fsforo).
Claro est qu~ a composio qumica estar na dependncia de uma srie de
fatores, tais como solo, variedade do vegetal, safra, clima, processamento durante
a colheita e estocagem etc. Esses fatos indicam j a expectativa de que possam
ocorrer oscilaes no processo fermentativo que emprega essas matrias-primas,
alm de obrigarem as empresas produtoras de antibitico$, ou enzimas a manterem instalaes piloto para o ajuste da composio do meio a cada novo lote de
matria-prima que a empresa recebe (particularmente aquelas que usam a gua de
macerao de milho), a fim de evitar maiores surpresas nos biorreatores de grande
porte.
Inclusive essas matrias-primas naturais podem causar problemas adicionais
na recuperao e purificao do produto final, assim como problemas nos tratamentos das guas residurias.
No entanto, ainda continuam a ser as matrias-primas preferidas em grande
nmero de casos, pela simples razo de serem as mais baratas.

18

Microrganismos e meios de cultura para utilizao industrial

2.4 - Consideraes finais


A definio adequada do microrganismo a ser empregado, assim como do
meio de cultura para este microrganismo, etapa fundamental para o sucesso de
um processo fermentativo. No entanto, sempre importante lembrar que a definio de um processo fermentativo mais adequado, assim como as preocupaes
com a recuperao do produto, so etapas da mais alta importncia.
Em alguns casos, o emprego de microrganismos disponveis em colees de
cultura pode levar ao desenvolvimento de processos produtivos que sejam atraentes. necessrio lembrar, no entanto, que presentemente se dispe de muitos recursos para o aprimoramento de linhagens produtivas, o que torna os processos
fermentativos cada vez mais promissores.
Essas consideraes trazem tambm um importante alerta sobre a constante
necessidade de desenvolvimento do processo produtivo j instalado, justamente
por essa grande variedade de desenvolvimentos possveis. Presentemente bastante difcil imaginar que uma dada empresa disponha do microrganismo "timo", ou do meio de cultura "otimizado". da mais alta importncia que essa
empresa continue a busca por melhores condies, em termos de microrganismo e
meio; caso contrrio, poder ser ultrapassada por outras com ofertas de produtos
de menor custo, ou melhor qualidade.

Referncias bibliogrficas
(1) STANBURY, P.F.; WHTAKER, A.; HALL, S.J. Principies of fermentation Technology. 2.ed. Reino Unido, Elsevier Science Ltd., 1995.
(2) SCHMIDELL, W.; FERNANDES, O.L. O aspecto evolutivo dos processos
industriais biotecnolgicos. Revista Politcnica, n. 209, p. 31-3, 1993.
(3) SANTOS, M.G.G.R.; ABOUTBOUL, H.; FARIA, J.B.; SCHMIDELL, W.;
SCHENBERG, A.C.G. Genetic improvement of Saccharomyces for et,hanol production from starch. Yeast, v. 5 (Spec. Iss.), p. 11-15, 1989.
(4) ABUD, A.K.S.; TAVARES, L.B.B.; FACCIOTTI, M.C.R.; SCHMIDELL, W.;
FARIA, J.B.; SCHENBERG, A.C.G. Avaliao do comportamento cintico da levedura Saccharomyces cerevisiae recombinante L36 em biorreator: influncia do mtodo de preparo do inculo. In: XI Simpsio Nacional de Fermentaes, So Carlos
(SP), 1996. Anais, v.1, p. 1-6, 1996.
(5) AGUERO, J.M.Z.; MACEDO, G.R.; FACCIOTTI, M.C.R.; SCHMIDELL,
W. Influncia do pH na sntese liberao de glicoamilase por Aspergillus awamori
NRRL 3112 e Aspergillus niger NRRL 337. Revista de Microbiologia, v. 21, n. 4, p.
355-60, 1990.

19

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I~V~ -r-~11111; 111-1-V

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Luiz Carlos Urenha


Jos Geraldo da Cruz Pradella
Maria Filomena de Andrade Rodrigues

3.1 - Introduo
Esterilizar um equipamento significa eliminar todas as formas de vida de
seu interior ou superfcie. Em alguns processos biotecnolgicos industriais, a eliminao parcial da populao microbiana dos equipamentos suficiente para garantir a qualidade que se deseja no produto. Por exemplo, nos processos onde
inibidores de crescimento so produzidos (fermentao alcolica, produo de vinagre/ cido actico, cido lctico ou antibiticos e outros biocidas, etc.) o teor de
inibidor impede em maior ou menor grau o crescimento de vrios microrganismos. Na indstria de laticnios, os processos de pasteurizao destroem a maior
parte, mas no todos os microrganismos presentes. 1' 2 A pasteurizao empregada quando uma assepsia mais rigorosa destruiria propriedades importantes do
alimento e seus subprodutos .

Assim, desenvolveram-se processos de desinfeco que no esterilizam, mas


garantem a assepsia adequada. Essa situao comum na indstria de alimentos,
onde a eliminao de microrganismos patognicos levada a efeito por processos
no esterilizantes. Nesses casos, a populao de microrganismos que no eliminada mantida sob controle pela imposio de condies que impedem seu desenvolvimento, como refrigerao ou aplicao de inibidores de crescimento (sais,
acares em altas concentraes, condimentos, preservantes qumicos, biocidas,
biostticos, etc.).
Os processos de produo de bens destinados sade humana ou animal e
os de alimentos enlatados esto entre os mais restritivos com respeito presena
de contaminantes. Nesses casos, a simples presena de uma nica clula de contaminante pode pr a perder todo um lote do produto.
Para lidar com essas situaes, desenvolveu-se uina srie de tcnicas para alcanar o tipo adequado de assepsia. Esse assunto ser abordado no item 3.2.

20

Esterilizao do equipamento

A esterilizao de equipamentos feita pela aplicao de mtodos fsicos ou


qumicos. Os mtodos fsicos mais freqentes so o calor seco, calor mido, radiao ultravioleta, radiao com partculas ionizantes (gama) e ultra-som. Os mtodos qumicos consistem na limpeza do equipamento com lquidos ou gases que
matam os microrganismos ou danificam irreversivelmente sua capacidade reprodutiva (hipoclorito, fenis, formaldedo, xido de etileno, oznio, dixido de enxofre, etc.).
Reatores bioqumicas e tubulaes so, geralmente, esterilizados pela apliw
cao de calor mido (vapor saturado).
Equipamentos destinados ao processamento de produtos de fermentao
(bombas, filtros, centrfugas, misturadores, separadores, colunas cromatogrficas,
homogeneizadores, etc.) so preferencialmente esterilizados por calor mido. Nos
casos em que isto no possvel, empregam-se agentes qumicos adequados.
Material de laboratrio utilizado durante o processo esterilizado por calor
mido (autoclaves), seco (fornos) e mais raramente por radiao ultravioleta.
Meios de cultura so esterilizados por calor mido. Nos casos em que a inativao trmica de nutrientes do meio significativa (cultura de clulas animais,
vegetais ou de insetos, por exemplo) emprega-se a filtrao em membranas ou cartuchos esterilizantes para remover fisicamente os microrganismos.
O ar para o processo fermentativo esterilizado por filtrao em cartuchos
esterilizantes.
Embalagens so em geral esterilizadas por radiao gama, calor mido, ou
por lavagem com produtos qumicos adequados.
Os mtodos de esterilizao agem destruindo ou comprometendo estruturas
microbianas, como paredes celulares, cidos nuclicos, etc., ou inativando enzimas, protenas, etc.
O nmero de microrganismos que sobrevive em qualquer estgio de uma esterilizao depende diretamente do nmero inicialmente presente. Portanto, onde
for necessrio aplicar esterilizao, a limpeza e uma baixa carga inicial de microrganismos interferem fortemente na severidade do processo a ser aplicado. 3

3.2 - Terminologia e modo de atuao


3.2.1 - Esterilizao
Esterilizao o processo fsico ou qumico que destri ou inativa todas as
formas de vida presentes em um determinado material, especialmente microrganismos incluindo bactrias, fungos - tanto em suas formas vegetativas como esporuladas - e vrus. O termo esterilizao possui um significado absoluto e no
relativo, ou seja, uma substncia ou material no pode ser parcialmente estril.
Um material estril totalmente isento de qualquer organismo ativo. Essa condio deve se manter indefinidamente. 3A' 5' 6

Terminologia e modo de atuao

2I

3.2.2 - Desinfeco
Desinfeco um processo menos rigoroso de eliminao de microrganismos, envolvendo usualmente o uso de um agente qumico, denominado desinfetante ou germicida, geralmente lquido e temperatura ambiente ou moderada. A
desinfeco no implica necessariamente na eliminao de todos os microrganismos, sendo direcionada aos mais prejudiciais, principalmente em sua forma vegetativa, que menos resistente que a forma esporulada.
Antissptico um desinfetante, aplicvel em seres animados (humanos e
animais) para eliminar microrganismos patognicos.3
A Tabela 3.1 apresenta uma relao dos principais termos tcnicos relacionados a processos de desinfeco, com seus significados.

3.2.3 - Modo de ao dos agentes esterilizantes


Agentes esterilizantes podem ser classificados como agentes fsicos oU qumicos. Esses agentes podem induzir, por diferentes mecanismos, a formao de
substncias qumicas letais no interior das clulas e/ ou alteraes em molculas
essenciais para a manuteno e sobrevivncia celular, levando morte do microrganismo.
A morte celular pode ser causada por uma ou mais leses. Na clula viva
normal existem inmeros alvos possveis de leso celular, tais como: (a) enzimas,
responsveis pelos processos metablicos; (b) membrana citoplasmtica, que mantm a integridade do contedo celular, controlando o transporte de substncias
entre a clula e seu meio externo, alm de ser tambm o local de algumas reaes
enzimticas; (c) parede celular, que proporciona rigidez e resistncia mecica aos
microrganismos e participa de alguns processos fisiolgicos. Uma leso em qualquer um desses nveis pode desencadear alteraes que levam morte celular.
Alternativamente, um dano irreversvel a um gene, responsvel pela codificao
de alguma niima essencial, tambm pode levar morte celular.
A seguir descreveremos como agem os principais agentes esterilizantesY'6
Calor mido
A temperatura elevada, associada ao alto grau de umidade, representa um
dos mtodos mais efetivos para a destruio dos microrganismos. O calor mido
mata os microrganismos, principalmente pela desnaturao irreversvel de suas
protenas, destruindo portanto elementos essenciais para a sobrevivncia e multiplicao celular, como enzimas e membranas celulares.
A resistncia das protenas ao calor uma funo da hidratao da clula.
Quanto maior a quantidade de gua, mais facilmente esta entrar nos domnios
internos das molculas de protena, causando mudanas conformacionais irreversveis.
Alm das protenas, os carboidratos tambm sofrem alteraes sob o tratamento de calor, sendo muitas vezes caramelizados e gerando produtos txicos.
Essa degradao exerce, portanto, um papel importante na esterilizao.

22

Esterilizao do equipamento

Tabela 3.1 - Principais termos tcnicos utilizados em processos de assepsia e seus significados
SIGNIFICADO

TERMO

"'{="

1:;':
Esterilizao

Remoo de todas as formas de vida


de um objeto ou material.

Desinfeco

Remoo ou destruio dos organismos vivos capazes de causar danos


ou infeces.
Agente qumico capaz de promover
desinfeco.

Desinfectante ou germicida

_}

~i

~-~\ =

~( 1j

~
~-

! --, '

Agente qumico aplicvel em pessoas


ou animais, com capacidade de eliminar microrganismos patognicos.

Antissptico

Remoo de microrganismos patognicos ou indesejados.

Assepsia

..
:!
~;

,-.1
'
~;
~::.:

if

Tratamento trmico (geralmente 62C


por 30 min, seguido de resfriamento :?;'
brusco) para reduo drstica no nmero de microrganismos - presentes c}T"
.:,.'[
em alimentos, normalmente leite,
-u
seus derivados, e bebidas enlatadas
.
~?
ou engarrafadas.
~
?
:;:;,
Processo de esterilizao capaz de
.v
eliminar esporos altamente resisten~
tes ao calor. Consiste em manter, o
material a 100C por vrios minutos,
resfri-lo a temperatura ambiente e
incub-lo por cerca de 24 h. O proce- ~
dimento repetido vrias vezes. Du- r~
rante a incubao, os esporos passam
forma vegetativa, onde so suscep!.:~
tveis destruio durante o aqueci.iJ
mento seguinte.
~l

Pasteurizao

Tindalizao .

~
-'.;~t;~

Agentes capazes de causar a morte


de microrganismos.

Biocidas

!
li

Biostticos
'h--

'

.~, ~._,_

"'.rt!>.::':.;,

. , ... ...,.~-..... -

. .-s.:J...:.:;,;.; . .

.,,,..,....,..,_.-

,;,..

.:;-<;.;.r

~""

Agentes capazes de impedir a repro- :WJ


duo de microrganismos, sem neces- I~
.,li~~ig_J!l~~t~-~-!~-:.
. .ow-_. ...,
. los.;. . _ .,F
..;:;.._..;:;;
..:..:.:.u....,. ..&

..-

11

:!
1

Na esterilizao por vapor sob presso (por exemplo, nas autoclaves), esta
tem duas funes principais: uma delas est relacionada com a transferncia de
calor, que favorecida pela condensao ocorrida no material, levando a um rpi-

l_ ___ :~a~ento-:e~e~~er:~ra-( di~s~:_:e ~alor)-~utra- amanuten~o:u_~: __ _


_

Terminologia e modo de atuao

23

menta do nvel de hidratao no interior das clulas, favorecendo portanto a


coagulao das protenas.
Calor seco
O calor seco destri os microrganismos atravs da oxidao de seus constituintes qumicos . A esterilizao por calor seco muito mais lenta e menos eficaz
que por calor mido. Ao contrrio do calor mido, nesse tipo de esterilizao o calor transferido muito lentamente e o nvel de hidratao das clulas tende a diminuir, conferindo urna certa proteo s protenas.
Apesar de a esterilizao pelo calor seco ser principalmente um processo de
oxidao, no se pode afirmar que a ao do calor seco seja restrita a isto, pois
nem sempre o que ocorre uma esterilizao apenas por calor seco. Dependendo
do contedo de gua na clula, pode oorrer tambm a coagulao de protenas.
Irradiao por luz ultravioleta (UV)
A radiao UV absorvida por muitas substncias celulares, mas de modo
mais significativo pelos cidos nuclicos, onde geralmente ocorrem as leses. O seu
efeito letal proporcional dose de radiao aplicada. A regio do espectro de UV
com ao esterilizante de 220 a 300 nrn, muitas vezes chamada de regio "abitica".
Existe urna relao entre os comprimentos de onda germicidas e aqueles absorvidos por cidos nuclicos ou seus constituintes. Compostos corno as purinas e
pirirnidinas, absorvem UV a aproximadamente 260 nm, bem prximo da radiao
mais efetiva que 253,7 nrn. Os aminocidos aromticos, corno o triptofano, fenilalanina e tirosina, absorvem UV a 280 nrn. .
Dentre os componentes dos cidos nuclicos, os fosfatos de acares no absorvem significativamente UV acima de 220 nrn. As pirirnidinas so muito mais
sensveis ao UV do que as purinas, por isto os efeitos letais e de rnutagnese nos sistemas biolgicos so atribudos a transformaes fotoqumicas das bases de pirirnidina. A ao esterilizant do UV ocorre primeiramente pela produo de ligaes
cruzadas entre pirirnidinas adjacentes na mesma fita de DNA (cido desoxirribonuclico), formando drneros. Essa reao ocorre principalmente entre resduos de timina, formando drneros de tirnina, levando perda da integridade do DNA
bacteriano (Fig. 3.1). Essas ligaes podem causar erro de leitura do cdigo gentico, resultando em mutaes que prejudicam funes vitais do organismo e conseqentemente causando a morte celular. Existem mecanismos de reparo, pelos quais
a integridade do DNA pode ser recuperada, dependendo do nvel de leso.

uv
Timinas
Figura 3.1 - Formao do dmero de timina

Dmero de .timinas

24

Esterilizao do equipamento

Dmeros mistos de citosina-timina e citosina-citosina tambm foram identificados em DNA de organismos irradiados. Apesar de serem menos freqentes,
tambm podem apresentar efeitos letais.
ORNA tambm pode sofrer ao do UV, que gera dmeros de hidratos e
uracila, que podem causar inativao do RNA.
I
Vrios fatores podem influenciar na sensibilidade microbiana a UV. Destacam-se o pH, o estado fisiolgico das clulas (a maior atividade na fase logartmica de crescimento) e a constituio gentica.
Radiao ionizante
As radiaes ionizantes eletromagnticas so principalmente alfa (a), beta
(p), gama (y), raios X, raios catdicos, alm de prtons, nutrons e eltrons de alta
energia. Esse tipo de radiao pode causar uma grande variedade de efeitos fsicos
e bioqumicas em microrganismos. O principal alvo que leva perda de viabilidade a molcula de DNA.
Na radiao ionizante, um tomo emite eltrons de alta energia, que ionizam sua molcula. O eltron ejetado e absorvido por outro tomo, criando uma
cadeia de ionizaes na substncia irradiada. Essa atividade excita grupos qumicos no DNA, causando a produo de radicais qumicos altamente reativos, os
quais podem alterar grupos qumicos e at quebrar as fitas de DNA, causando
mutaes.
A morte celular resulta da formao de uma cadeia de ionizao numa poro significativa do DNA. Geralmente, a sensibilidade dos diferentes organismos
a radiaes ionizantes varia com o volume de DNA. Em geral, formas multicelulares so mais sensveis radiao ionizante do que organismos unicelulares,
xido de etileno
xido de etileno (EtO) um ter cclico que mata as clulas, agindo como
agente alquilante. A sua ao consiste na substituio de um tomo de hidrognio
(atravs de umareao de alquilao) de grupos funcionais de protenas, cidos
nuclicos e outras molculas (carboxila livre, amino oti sulfidrila) pela molcula
de EtO aberta (CH 2CH2 0-) como exemplificado na Figura 3.2. Essa reao resulta
no bloqueio dos grupos ativos das molculas. No caso das protenas, ocorre a desnaturao.

xido de etileno

Enzima inativada

Figura 3.2 - Reo de alquilao entre o xido de etileno e uma enzima

Esterilizao por agentes tlsicos

25

Glutaraldedo
O glutaraldedo age na superfcie das clulas, onde ocorrem interaes glutaraldedo-protenas, gerando diversos produtos. Essa interao aumenta com a
elevao do pH, mas os produtos formados so estveis hidrlise cida.
O glutaraldedo reage principalmente com os grupos amina livres das protenas da camada de peptoglicana das bactrias, o que interfere no transporte de
aminocidos de baixo peso molecular. Em vrios microrganismos ocorre a aglutinao celular, devido formao de ligaes intercelulares.

3.3- Esterilizao por agentes fsicos


Os principais agentes fsicos esterilizantes so: calor seco, calor mido, radiao ultravioleta, radiao gama e sonicao. Cada um deles encontra aplicao em
diferentes partes de um processo de assepsia.

3.3.1 -Esterilizao por calor mido


O agente de uso mais freqente o calor mido, fornecido por vapor de gua
saturado. A facilidade de obteno, de manuseio, sua eficcia e custo relativamente
baixo explicam o uso freqente. O vapor obtido em caldeiras e distribudo por
dutos de ao galvanizado ou ao inoxidvel, isolados termicamente. Pelas altas
temperaturas e presses nas caldeiras, o vapor considerado estril. No entanto,
em alguns casos mais crticos, utiliza-se filtrao em cartuchos esterilizantes imediatamente antes da entrada do vapor no processo.
Tubulaes e reatores (fermentadores), vazios ou carregados com meio de
cultura, so usualmente esterilizados por calor mido.
Esterilizao de reatores vazios
A esterili:zao de reatores vazios consiste em injetar vapor diretamente em
seu interior e promover inicialmente a expulso de todo o ar presente. Aps a expulso do ar, o reator fechado e injeta-se vapor at que a temperatura e presso
internas sejam adequadas, comumente 121 oc e 1 atm. A partir desse momento, e
por todo o tempo de esterilizao, novas injees s so necessrias para manter
constantes a presso e temperatura. Terminada a esterilizao, a entrada de vapor
fechada e ar esterilizado deve ser injetado, para evitar que o resfriamento e a
conseqente condensao do vapor presente no interior do reator gere vcuo, o
que poderia provocar danos ao equipamento ou promover a entrada de ar externo
contaminado, por eventuais pequenas fissuras em soldas, vazamentos em vlvulas, etc. Aps o resfriamento e estabilizao da presso interna, o meio de cultura
esterilizado externamente, por esterilizao contnua ou no, pode ser carregado e
a utilizao do tanque ser iniciada.
Esterilizao de reatores com meio de cultura
A esterilizao de reatores como meio de cultura (esterilizao descontnua)
feita em trs etapas. Durante todo o processo de esterilizao, uma agitao mnima deve ser fornecida ao meio de cultura.

26

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Esterilizao do equipamento

Inicialmente, circula-se vapor pela serpentina ou camisa at que a temperatura do meio de cultura seja maior que 96 a 97C. Durante essa etapa, a cabea do
tanque deve receber vapor fluente para expulso do ar de seu interior. Ao mesmo
tempo, as vlvulas, filtros e tubulaes de entrada e sada do reator tambm so
esterilizadas por vapor fluente.
Na etapa seguinte, injeta-se vapor diretamente no meio de cultura at que
este atinja 100C. A partir desse momento, o reator completamente fechado e a
injeo de vapor continua at que a temperatura e presso internas sejam adequadas (por exemplo 121 C e 1 atm).
Atingido esse patamar, a injeo direta de vapor pode ser cortada e o controle de temperatura e presso mantidos atravs da serpentina ou camisa pelo tempo
necessrio.
O resfriamento feito pela circulao de gua fria na serpentina ou camisa.
Quando a temperatura atingir a marca dos 100C, deve-se injetar ar esterilizado
no tanque para evitar formao de vcuo pela condensao do vapor presente.
A injeo direta de vapor provoca um aumento no volume de meio de cultura de cerca de 10 a 15%, em funo da condensao. Por essa razo, o meio de cultura deve ser preparado concentrado, tendo em vista sua posterior diluio pelo
condensado.
O tempo de esterilizao funo das condies do prprio reator e do processo. Se um reator usado sempre com o mesmo micrOrganismo, e se ele estiver
em bom estado (perfeitamente limpo, sem fissuras, sem vazamentos em vlvulas
ou conexes de sensores), 20 a 40 minutos a 121 oc e 1 atm devem ser suficientes
para sua esterilizao. Se for um reator multipropsito, utilizado com bactrias ou
fungos formadores de esporos altamente resistentes ao calor, ele deve passar por
assepsia qumica antes da esterilizao por vapor. Nesse caso, a manuteno a
121 oc e 1 atm deve se estender por um tempo que pode ser maior que 60 minutos,
desde que no prejudique o meio de cultura.
Uma etapa crtica a de aquecimento do meio de cultura desde a temperatura ambiente at atingir 96 a 97C, quando o processo feito por serpentinas ou camisa. Nesse caso, uma relao adequada entre a rea de serpentina ou camisa e o
volume de meio de cultura favorece o rpido aquecimento. As Figuras 3.3 e 3.4
apresentam curvas de aquecimento de meio de cultura em reatores de volume til
2
200 1 e 2.000 1 respectivamente. O tanque de 200 1 apresenta 6,5 m de rea de troca
3
2
trmica por m de meio de cultura. O tanque de 2.000 1 apresenta 1,8 m de rea de
3
troca trmica por m de meio de cultura.
Reatores com esterilizao programvel
Equipamentos mais sofisticados, completamente automatizados, trazem incorporada a funo de esterilizao em seu software de controle. Nesse caso, para
proceder operao de esterilizao, basta um comando do operador num painel
ou em um rnicrocomputador de controle. Em geral, pode-se escolher. o tempo e a
temperatura de esterilizao. Esses equipamentos so disponveis em qualquer capacidade, desde os de bancada at os industriais.

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-'----------- - --- ------ ----- --- ~------- - ~-- --------------- - ------- ------ - --- ----

.....____

Esterilizao por agentes fisicos

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CURVA DE AQUECIMENTO
fermentado r de 200 L
120
100

80

60

C1l

a.
E
C1l
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40
20

5.

15

10

20

25

30

Tempo (min)
2

Figura 3.3 - Formato do tanque de 200L teis (6,5 m serpentina/m de meio de cultura), e curva de aquecimento.

Caso a auto-esterilizao seja feita por injeo de vapor diretamente no meio


de cultura, deve-se considerar a diluio de 10 a 15% provocada pela condensao
do vapor.
A injeo direta de vapor pode, em alguns casos, provocar a formao de espuma em grande quantidade no reator. Se o problema for crtico, a esterilizao
deve ser levada a cabo apenas atravs da camisa ou serpentina.2
Esterilizao em autoclaves
A esterilizao por calor mido de reatores de pequeno porte (at cerca de
30 L) e de vidrarias e outros materiais, inclusive meio de cultura, em geral feita
em autoclaves. A Figura 3.5 apresenta simplificadamente um reator sendo esterilizado em uma autoclave .
-

28

Esterilizao do equipamento

o
o
o
o

o
o
o
o

CURVA DE AQUECIMENTO
fermentado r de 2.000 L

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60

90

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150

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Tempo (min)

Figura 3.4 - Formato do tanque de 2.000 L teis (I ,8 m2 serpentina/m 3 de meio de cultura), e curva de aquecimento

Existem autoclaves das mais diversas dimenses, e em geral so verticais


ou horizontais. Nas verticais (como na figura), a porta de acesso localiza-se na
parte superior. As horizontais podem ter uma ou duas portas de acesso. O
aquecimento para gerao de vapor pode ser eltrico (mais comum) ou a gs. O
vapor pode tambm ser gerado externamente numa caldeira e em seguida injetado na autoclave. Algumas autoclaves de grande porte podem ter sistemas internos para circulao do vapor e operarem continuamente, em vez da
operao tradicional por ciclos.
A operao simples. Se o vapor gerado internamente, a primeira providncia completar o nvel de gua at a marca indicada pelo fabricante. Em seguida, o
material ou equipamento a ser esterilizado colocado na autoclave e a porta fechada. O vapor gerado ocupa todo o espao interno e deve fluir para o exterior, por
uma vlvula de descarga, expulsando assim todo o ar contido na autoclave e nos
materiais e equipamentos presentes. Aps a expulso do ar (10 a 20 minutos, em
geral) a vlvula de descarga fechada e a presso e temperatura internas devem

Esterilizao por agentes ffsicos

29

subir at a temperatura e presso de esterilizao (geralmente, 121 C e 1 atm).


Atingida a condio de esterilizao, o sistema de aquecimento ou a entrada de
vapor devem ser controlados para manter estveis a presso e temperatura. A etapa de resfriamento inicia-se com o desligamento do aquecimento ou fechamento
da entrada de vapor. A autoclave s deve ser aberta aps a temperatura chegar
prxima da ambiente, j que uma despressurizao brusca pode provocar danos
aos sensores colocados nq interior dos reatores, como sondas de pH e de oxignio
dissolvido.
Vlvula de
segurana

MANMETRO

Auto clave

Fermentador

Figura 3.5 - Esterilizao de reator em autoclave

Erlenmeyers com meio de cultura, pipetas graduadas, tubos de ensaio, etc., em


geral so esteriliZados por 15 a 30 minutos. Reatores necessitam uma esterilizao por
mais tempo (40 minutos a 1 hora), j que no so agitados durante a esterilizao e o
seu centro demora para atingir a temperatura adequada. A Figura 3.6 apresenta a
curva de aquecimento em autoclave de um reator com volume til de 10 litros. O sensor de temperatura foi colocado prximo ao centro geomtrico do reator. Pode-se notar que cerca de uma hora aps o termmetro da autoclave indicar a temperatura de
121 C, o centro do reator ainda no havia atingido esta temperatura.
A esterilizao em autoclave no altera significativamente o volume dos lquidos presentes nos frascos ou reatores.

3.3 .2 - Alguns detalhes de projeto de reatores esterilizveis por


calor mido
A Figura 3.7 apresenta alguns pontos a serem considerados quando se projeta um reator a ser esterilizado por calor mido {vapor saturado).
A entrada de ar para o reator (1) deve conter um filtro esterilizante adequado
(2) . Toda a linha, incluindo o filtro, deve ser esterilizada por vapor saturado (V).

1/

I.,,

30

Esterilizao do equipamento

O reator deve ser dotado de uma vlvula de segurana e uma quebra-vcuo


(3), para evitar pressurizao ou despressurizao (vcuo) excessivas que possam
danificar o equipamento durante o processo de esterilizao ou de fermentao.
Curva de aquecimento em autoclave

120

100

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90

100

Tempo (min)

Figura 3.6 - Curva de aquecimento em autoclave vertical de um reator com volume til de I O lrt:ros. O ponto a indica o momento em que o termmetro da autoclave marcou 121 C. O ponto b indica o momento em que a temperatura da autoclave passou a ser controlada em 121

oc.

11
12

10

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o
o
o

o
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o
o
8

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Figura 3.7 - Alguns detalhes a serem considerados no projeto de reatores esterilizveis por calor mido.

Esterilizao por agentes ffsicos

3.1

A linha de exausto de gases tambm deve conter um filtro esterilizante


adequado (4), que evite tanto a contaminao do reator por microrganismos do
ambiente como a contaminao do ambiente por microrganismos e aerossis originados no reator.
O sistema de agitao do lquido deve preferencialmente ser colocado na
parte superior do reator. Dessa maneira, o selo que permitir a vedao do orifcio
por onde penetra o eixo ~5) dever ser projetado para reter apenas gases. Quando
for mais conveniente a colocao do eixo pelo fundo do reator, o sistema de selagem dever ser capaz de reter lquidos. Em geral, selos para gases so mais
eficientes e de manuteno mais simples.
As linhas de inoculao (6), amostragem (7), e esgotamento (9) devem tambm ser esterilizadas pela passagem de vapor saturado. A de amostragem deve
ser esterilizada aps cada retirada de amostra.
Um procedimento comum para esterilizao descontnua do reator o seguinte: (a) o reator recebe o meio de cultura e aplica-se uma agitao baixa; (b)
aquece-se o meio atravs da serpentina ou camisa (8, 10) at cerca de 96 a 97C; (c)
simultaneamente ao item b, injeta-se vapor pelas linhas de entrada superior de ar
(11) e de inoculao (6), deixando o vapor fluir pela linha de exausto (4) e se possvel pela vlvula de segurana (3); (d) inicia-se a aplicao de vapor vivo ao tanque pela linha de entrada inferior de ar (12) e, se necessrio, pelas linhas de esgotamento do tanque (9) e de amostragem (7); (e) quando o meio de cultura atingir
100C, as vlvulas de exausto, de segurana, de entrada superior de ar (12) e de
inoculao (6) so fechadas; (f) quando a temperatura e presso internas atingirem
as indicadas para esterilizao (em geral, 121 C e 1 atm), as vlvulas de entrada
inferior (12), de esgotamento do tanque (9) e de amostragem (7) devem ser fechadas; (g) manter a presso e temperatura de esterilizao pelo tempo necessrio
atravs da aplicao de alor pela serpentina ou camisa; (h) atingido o tempo necessrio, iniciar o resfriamento pela aplicao de gua fria atravs da serpentina
ou camisa; (i) quando a temperatura do meio de cultura atingir 100C, iniciar a
pressurizao do tanque com ar estril (1, 11), o suficiente para evitar formao de
vcuo no reator; (j) quando a temperatura atingir 'cerca de 85C, abrir a vlvula de
exausto de gases (4); (k) continuar o resfriamento do tanque at a temperatura
desejada.
A manuteno peridica do reator deve incluir a limpeza e eventual substituio de todas as vlvulas que tenham contato direto com o reator ou com as linhas esterilizadas (ar, inculo, amostragem, exausto, descarga, etc.). Outros pontos sensveis so o sistema de selagem do eixo do agitador e as soldas e conexes
do reator. Pequenos vazamentos em vlvulas, selos, conexes e soldas podem ser
detectados, fechando-se todas as sadas do reator e pressurizando-o com ar at
cerca de 1 atm. Fecha-se o ar e verifica-se se a presso mantidapor perodos longos (24 h). Caso haja perda de presso, deve-se buscar e corrigir os vazamentos.
Vazamentos na serpentina ou camisa podem ser detectados, secando-se totalmente o reator e circulando-se gua sob presso no sistema de aquecimento/resfriamento por um perodo longo (24 h). Se houver vazamento, aparecer
gua no interior do reator.

E~erilitao do equipamento

32

3 .3 .3 - Esterilizao por calor seco


A esterilizao por calor seco empregada para vidrarias, ;metais e slidos
resistentes ao calor. levada a efeito em fornos ou estufas que atingem temperaturas superiores a 150C.
Na ausncia de umidade, a transferncia de calor mais lenta e os microrganismos apresentam maior resistncia inativao. Dessa forma, os tempos de exposio ao calor devem ser muito maiores (cerca de 3 a 4 horas), para garantir a
2
eficincia da operao de assepsia.

3.3.4- Esterilizao por radiao ultravioleta


Radiao ultravioleta utilizada para esterilizar materiais slidos, como vidrarias, utenslios metlicos, embalagens, etc.
Os raios ultravioleta agem diretamente sobre o DNA e RNA, alterando a estrutura dessas molculas e provocando danos ao processo de manuteno e diviso celular. Em funo do tempo de exposio, esses danos normalmente levam os
microrganismos morte.
Ultravioleta jamais deve ser usado na presena de pessoas ou animais.
A fonte de ultravioleta normalmente uma lmpada emissora dessa radiao. A emisso diminui com o tempo, exigindo um controle sobre o tempo de vida
til dessas lmpadas.
A esterilizao feita simplesmente expondo os materiais radiao em ambiente fechado, pelo tempo adequado (vrias horas). Como a capacidade de penetrao da radiao ultravioleta muito baixa, apenas a superfcie do material
exposto eo ar ao redor so esterilizados.

3.3.5- Esterilizao por radiao gama


Rdiao gama, em geral produzida por cobalto 60 ou csio 137, tem poder
de penetrao extremamente alto. O bombardeio de microrganismos por gama
gera grande quantidade de alteraes nas molculas de DNA, danificando-as, em
geral irreversivelmente. Adicionalmente, inmeras molculas internas aos microrganismosso ionizadas (a gua, por exemplo), dando origem a espcies txicas al4
tamente reativas, como os perxidos e vrios radicais livres. Essas molculas .
desestruturam o equilbrio bioqumico dos microrganismos, mesmo esporulados.
Os materiais expostos radiao gama no guardam resqucios radiativos,
da ser um mtodo seguro de esterilizao.
O bombardeio com radiao gama deve ser feito em cmaras especiais, em
geral muito grandes. Uma vez posta em operao, no mais possvel impedir a
emisso da radiao, de forma que essas cmaras operam continuamente.
A esterilizao feita colocando-se o material a ser esterilizado em um continer, que por sua vez colocado em uma esteira que circula pelo interior da cmara de irradiao. O material pode entrar e sair da cmara vrias vezes, at
atingir o nvel de irradiao adequado.
-

- - - --- -------

-------------- -------------- -- ------------ -

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--- ---- --- -

Esterilizao e desinfeco por agentes qufmicos

33

Dada a complexidade do mtodo, apenas materiais como vidrarias, metais, e


materiais slidos como ps, solo, alimentos, sementes, embalagens, etc. so submetidos a esse processo de esterilizao.
A unidade de medida da irradiao no SI o gray. Materiais pouco contaminados so submetidos a doses de 10 a 30 quilograys. Materiais mais
contaminados requerem doses maiores, como 50 a 75 quilograys. O microrganismo mais resistente radiao chama-se Deinococcus radiodurans e exige cerca de 60
. quilograys para ser inativado. Esporos de Clostridium botulinum demandam 5 a 22
quilograys para serem inativados. O gray substituiu a unidade rad, muito utilizada. Na converso, 1 gray corresponde a 100 rad.

3.4- Esterilizao e desinfeco por agentes qumicos


3.4.1 -Germicidas qumicos
A utilizao do calor mido , de longe, a tcnica mais utilizada para proporcionar a esterilizao e a desinfeco de equipamentos dentro de uma indstria de fermentao.
Os agentes qumicos de esterilizao e desinfeco so utilizados quando
equipamentos de operaes unitrias ou componentes de uma instalao industrial
no admitem esterilizao pelo vapor de gua saturado. Isso pode ocorrer em virtude da incompatibilidade dos materiais de construo desses componentes com
temperaturas elevadas (por exemplo, filtros; bombas, centrfugas, secadores, vlvulas, linhas de transferncias de fluidos e equipamentos de medio, etc.).
Nesses casos, para atingir o grau de sanitizao necessrio a um dado processo, faz-se uso de agentes sanitizantes lquidos denominados germicidas qumicos. Diferentemente da esterilizao pelo calor, essas substncias agem
temperatura ambiente, necessitando entretanto tempos maiores de contato para
produzir o efeit() _d esejado. Alm disso, sua capacidade sanitizante est fortemente
relacionada a fatores ligados s propriedades fsicas do material a ser tratado (material plstico ou metlico, superfcie lisa ou rugosa, porosidade do material, ausncia ou presena de locais de difcil acesso) e s caractersticas qumicas do
ambiente (pH, presena de matria orgnica contaminante, formao de filmes e
depsitos no material, dureza da gua utilizada na diluio do princpio ativo,
presena de resduos de sabo). Todos esses fatores podem afetar negativamente o
processo de esterilizao ou desinfeco, e somente a prtica pode dar ensejo a um
procedimento padronizado que conduza a um nvel de sanitizao adequado a
um determinado processo industrial.
Em razo dos grandes problemas advindos das infeces em ambientes hospitalares, especialmente pelo fato do surgimento de linhagens bacterianas patognicas resistentes, responsveis por doenas como a tuberculose, meningite e
pneumonia e de vrus como o da hepatite B e o HIV, promotor da SIDA/ AIDS
(Sndrome da Imunodeficincia Adquirida), um grande trabalho de pesquisa e de
regulamentao vem sendo dedicado ao uso de germicidas qumicos no controle
dessas infeces. Como conseqncia, o uso desses compostos tem se transformado em um mtodo bastante conveniente e efetivo de esterilizao e desinfeco e

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...

34

Esterilizao do equipamento

um grande nmero de formulaes comerciais surgiram no mercado. At o incio


dos anos 90, havia nos Estados Unidos, registrados na EP A (Environmental Protection Agency), uma das agncias americanas responsveis pelo registro e legislao sobre o uso desses produtos, cerca de 14.000 formulaes comerciais com ao
germicida.
Baseado na experincia prtica, possvel estabelecer-se uma ordem de resistncia dos microrganismos exposio aos germicidas qumicos (Tabela 3.2).

Tabela 3.2 - Ordem descendente de resistncia a germicidas qumicos e nvel de atividade requerido
para esterilizao (adaptado de Favero; Bond 7).

TIPO DE MICRORGANISMO

BACTRIA ESPORULANTE
Bacillus subtilis
Clostridium sporogenes

NVEL DE ATIVIDADE
REQUERIDO

Alto

MICOBACTRIA
Mycobacterium tuberculosis
var. bovis

Alto a intermedirio

VRUS PEQUENOS OU NO LIPDICOS


poliovrus
rhinovrus

Alto a intermedirio

FUNGOS
Trichophyton spp.
Cryptococcus spp.
Candida spp.

Intermedirio a baixO

BACTRIA VEGETATIVA
Pseudomonas aeruginosa
Staphylococcus aureus
Salmonella choleraesuis

VRUS MDIOS OU LIPDICOS


vrus da Herpes simplex
Citomegalovr~s .

Baixo

Baixo

Esterilizao e desinfeco por agentes qumicos

35

Essa tabela mostra que as bactrias formadoras de esporos, exemplificadas


aqui por Bacillus subtilis e Clostridium sporogehes, so as mais resistentes aos germicidas, enquanto que, em ordem descendente de resistncia, os vrus de tamanho
mdio ou que possuem componentes lipdicos em sua composio tendem geralmente a possuir a mais baixa resistncia aos germicidas.
Esporos bacterianos necessitam alto nvel de atividade germicida para serem destrudos. Essa condo pode ser conseguida com a utilizao de solues
aquosas de glutaraldedo, perxido de hidrognio de 6 a 30% e produtos que contm mistura a baixas concentraes de cido peroxiactico e perxido de hidrognio (0,1% e 1,0%, respectivamente).
O dixido de cloro (Cl0 2 ) pode ser usado a concentraes variadas. Porm,
por ser .fortemente oxidante, seu uso limitado, devido ao efeito altamente corrosivo em superfcies de metal ou de plstico. O uso de formaldedo em solues
aquosas de 6 a 8% efetivo, embora haja controvrsias devido ao seu possvel efeito carcinognico.
Germicidas de nvel intermedirio no necessariamente causam a destruio
de esporos bacterianos, mas devem possuir a caracterstica de inativar Mycobacterium tuberculosis var. bovis, assim como fungos, vrus lipdicos ou no lipdicos e
bactrias vegetativas.
Exemplos desses germicidas so solues hidroalcolicas 70 a 90% de etanol
ou isopropanol, compostos clorados com cerca de 500 a 5.000 ppm de cloro livre,
soluo aquosa de perxido de hidrognio 3a 6%, algumas preparaes fenlicas
e os iodophors (preparaes que conseguem carrear 12 concentrao de 40 a 50
ppm de iodo livre).
Os germicidas qumicos de nvel baixo so capazes de destruir formas vegetativas de bactrias, a maioria dos fungos (mas no todos), assim como vrus que
contm lipdios em sua composio.

Esses germicidas no conseguem inativar Mycobacterium tuberculosis var. bovis nem tampouco bactrias esporuladas. Exemplos desses desinfetantes so as
formulaes de compostos quaternrios de amnio concentrao de 0,1 a 0,2%.
Como foi dito, a prtica de desinfeco/esterilizao industrial utilizando-se germicidas qumicos depende de uma srie de fatores ambientais, que devem ser levados em conta quando do estabelecimento do protocolo de sanitizao
de um determinado equipamento. De uma maneira geral, um ciclo de desinfeco
I esterilizao qumic de um equipamento contm as seguintes etapas:
a) desmontagem do equipamento (se for o caso);
b) limpeza dos componentes, procedendo-se remoo de todo tipo de resduos de meio de cultura, biomassa e produtos, fazendo uso de detergentes, se necessrio;
c) lavagem dos componentes com gua com baixo teor de dureza para remoo dos detergentes utilizados;
d) montagem do equipamento e introduo da soluo aquosa do germicida, propiciando o tempo de exposio preestabelecido para a ao germicida requerida;

e) drenagem da soluo germicida do sistema;

ij
36

Esterilizao do equipamento

f) remoo dos resduos do germicida atravs de circulao cuidadosa de


gua ou outro fluido estril.
A Tabela 3.3 descreve algumas utilizaes tpiCas de germicidas qumicos.
Existem disponveis no comrcio vrias preparaes com caractersticas semelhantes s descritas nessa tabela. No Brasil, a regulamentao e recomendao do uso
de um germicida particular realizada por organismos como o INCQS (Instituto
Nacional de Controle de Qualidade em Sade). A Tabela 3.3, pretende, dessa maneira, ser meramente didtica.

Tabela 3.3 - Utilizao tpica de germicidas qumicos


(N.A.=nvel de atividade, sol.aq.=soluo aquosa)
GERMICDA
QUMICO

ATIVIDADE E
CARACTERSTICAS

UTILIZAO
TPICA

Compostos quaternrios de
amnio sol. aq. at 0,2%

Bactrias vegetativas, gramnegativas, podem ser resistentes, N.A. baixo

Limpeza geral e manuteno

Compostos fenlicos, sol.


aq. at 5%

Pode ser ativo at contra vrus no lipdicos, N.A. baixo


a intermedirio

Desinfeco de reas de laboratrio e produo

Sol. aq. etanol ou isopropanol a 70%

Bactrias vegetativas, fungos e amplo espectro de vrus, N.A. intermedirio

Desinfeco de materiais
por imerso na soluo

Sol. aq: 0,5% cloro livre

Amplo espectro, pode inativar bactrias esporuladas, limitao de uso pela atividade corrosiva, N.A.
intermedirio

Desinfeco de equipamentos, reas de laboratrio e


produo

Sol. aq. Formaldedo 4 a 8%

Amplo espectro, pode inativar bactrias esporuladas,


potencial carcinognico,
irritante, N.A. intermedirio
a alto

Desinfeco de equipamentos

Sol. aq. Formaldedo 8% e


etanol ou isopropanol a 70%

Amplo espectro, ao contra


micobactrias e bactrias esporuladas, potencial carcinognico, irritante, N.A. alto

Esterilizao de equipamentos, dependendo do tempo


de exposio

Sol. aq. glutaraldedo 2% e


surfactante

Amplo espectro, ao contra


micobactrias e bactrias esporuladas, iritante, N .A. alto

Esterilizao de equipamentos, dependendo do tempo


de exposio

Formulaes contendo perxido de hidrognio 6 a 10%

Amplo espectro, ao contra


micobactrias e bactrias esporuladas, N.A. alto

Esterilizao de equipamentos, dependendo do tempo


de exposio

Esterilizao e desinfeco por agentes qumicos

37

Assim, recomenda-se fortemente utilizar as formulaes comerciais disponveis no mercado, segundo a orientao do fabricante, de acordo com seu registro
nos rgos governamentais competentes.
Desde que as operaes preliminares de limpeza das partes a serem desinfetadas ou esterilizadas tenham sido feitas cuidadosamente, o tempo de exposio para
se atingir um determinado nvel de destruio microbiana em um dado equipamento
vai depender fundamentalmente do germicida escolhido e das caractersticas da populao microbiana remanescente, ou seja, tipo e nmero de microrganismos presentes. Embora a temperatura seja um fator relevante nos processos de destruio
microbiana, no estamos levando isto em conta, pois supe-se que o procedimento de
desinfeco I esterilizao seja realizado temperatura ambiente.
O tempo necessrio para se atingir um determinado nvel de sanitizao,
dessa forma, varia bastante. Uma simples desinfeco, com a qual se pretenda destruir a populao ativa de bactrias vegetativas, a maioria dos fungos e os vrus lipdicos, rode ser conseguida utilizando-se etanol 70% em gua em cerca de 10
8
minutos. Uma populao de esporos de bactrias aerbias bastante elevada (10
esporos) pode ser destruda em 60 minutos com exposio a uma soluo de per8
xido de hidrognio a 10%. Por outro lado, uma soluo de formaldedo 8% e isopropanol 70% pode levar at cerca de 18 h para a eliminao de uma alta
7
populao de esporos bacterianos.
A escolha de um germicida qumico particular vai se basear, dessa maneira,
no nvel de desinfeco requerido pelo processo e em aspectos econmicos.

3 .4. 2 - Agentes gasosos


Agentes gasosos no o mtodo de escolha em indstrias de fermentao,
sendo rara, para no dizer inexistente, sua utilizao para esterilizao e desinfeco de equipamentos. A assepsia de salas e laboratrios, porm, comumente realizada com vapores de formaldedo.
Os agentes de esterilizao gasosos mais importantes so os seguintes: xido
c!e etileno, xido de propileno, formaldedo e betapropiolactona.
O primeiro utilizado principalmente na esterilizao dos mais diversos
itens hospitalares, artigos plsticos de laboratrio e outros materiais. O processo
se d em cmaras especiais Sf!melhantes a autoclaves de esterilizao por vapor. A
cmara carregada com os itens a serem esterilizados, onde a seguir insuflada
uma mistura gasosa do agente ativo e um gs inerte como co2 ou freon (fluoroclorocarbono). Aps um determinado tempo de exposio, a mistura gasosa drenada da autoclave e esta cuidadosamente limpa pela passagem de ar, para
9
eliminao total de resduos do xido de etileno.
10
O xido de propileno utilizado na esterilizao de alimentos.
Vapores de formaldedo e betapropiolactona so utilizados principalmente
para desinfeco de cmaras, salas e ambientes onde assepsia desejvel.
A resistncia de bactrias vegetativas e esporuladas, vrus e fungos aos mtodos de esterilizao por gases bastante varivel, e depende do agente utilizado, sua concentrao, umidade relativa do ambiente e temperatura do processo.
6
Por exemplo, uma populao de 10 esporos de Bacillus subtilis v ar. niger pode ser
. ...... - ----- - ------ -- - --- -.-.- ..... -- ~ -' ... _....

......_____

38

Esterilizao do equipamento

inativada -a 50% de umidade, 47,5C e 500 ppm de xido de etileno, em cerca de 50


minutos. Outros microrganismos possuem resistncias menores ao xido de etileno.
Detalhes a respeito da utilizao de gases como agentes desinfetantes e esten'1'tzantes po d em ser encontra d os em 1'tteratura sob re o assunto. 10'11

Referncias bibliogrficas
(1) BAILEY, J.E.; OLLIS,D.F. Biochem. Engineering FundamentaiS. McGraw-Hill Book
Company, Nova York. 1986.965 p.
(2) SCRAGG, A.H. Bioreactors in Biotechnology. A Practical Approach. Ellis Horwood, Nova York. 1991. 328 p.
(3) RICHARDS, J.W. Introduction to Industrial Sterilization. Academic Press, Londres.
1968. 173 p.
(4) BLOCK, S.S. Disinfection, Sterilization, and Preservation. Lea and Febiger, 2nd
edition, Filadlfia. 1991. 1162 p.

(5) REDDISH, G.F. Antiseptics, Disinfectants, Fungicides, and Chemical and Physical
Sterilization. Lea and Febiger, 2nd edition, Filadlfia. 1957. 953 p.
(6) QUESNEL, L.B. Sterilization and Sterility. In: Bullock, J.; Kristiansen, B. Basic Biotechnology. Academic Press, Londres. (1987). 545 p.
(7) FAVERO, M.S.; BOND, W.W. Chemical Disinfection of Medicai and Surgical Materiais. In: Block,S.S. Disinfection, Sterilization, and Preservation. Lea and Fabiger, 2nd edition,
Filadlfia. 1991. Chapter 35, pp.617-641
(8) WARDLE, M.D.; RENNINGER, G.M. Biocidal effect of hydrogen peroxide in spacecraft bacterial isolates. Appl. Microbiol.,30, 710-711, 1975.
(9) PARISI, A.P.; YOUNG, W.E. Sterilization with Ethylene Oxide and other Gases, In:
Block,S.S. Disinfection, Sterilization, and Preservation. Lea and Febiger, 2nd edition, Filadlfia. 1991. Chapter 33, p. 580-595.
(10) ALGUIRE, D.E. Effective sterilization with 100% ethylene oxide. Bul. Par. Drug
Assoc.,17,1-8,1963.
(11) CHAIGNEAU, M. Strilisation et Dsinfection par les Gaz. Maisonneuve Editeur,
Saint-Ruffine. 1977. 329 p.

--

39

-........----......_____.SftiUBZ.A~O-DE=IIIEIOS-=~:
A -.:=----~-~DE=-F-ERNIENTA"-lJ=P-OR-=---~-=,
-G~u~~IMENH=c-GM::VAP-OR~
---------- --------------------------------------------------------- -J. .

Walter Borzani

4.1 - Introduo
Em muitos processos fermentativos, a presena de microrganismos estranhos (e, s vezes, de vrus) denominados, genericamente, "contaminantes", pode
levar a prejuzos considerveis.
.
No caso da produo de penicilina, por exemplo, os contaminantes podem
produzir penicilinase, enzima que decompe a penicilina, resultando meios fermentados com baixa ou mesmo nula concentrao do antibitico.
Outro exemplo que merece citao o da fermentao acetona-butanlica. A
bactria responsvel por sse processo pode ser rapidamente destruda por vrus
bacterifagos, paralisando completamente a fermentao.
Outras vezes os contaminantes afetam negativamente o processo, principalmente pelo fato de consumirem nutrientes do meio, competindo assim com os microrganismos responsveis pela fermentao desejada. o que acontece, por
exemplo, na produo de enzimas, vitaminas, antibiticos, etanol, etc.
H, porm, casos em que a presena de contaminantes pouco ou nada interfere no processo. Assim, por exemplo, na fermentao ltica de hortalias, no tratamento biolgico de resduos, na produo de vinagres, na lixiviao bacteriana
de minrios, a boa marcha do processo assegurada pelas prprias condies de
trabalho, sendo dispensvel eliminar eventuais contaminantes.
Entre os dois casos extremos, isto , aqueles processos em que a presena de
contaminantes compromete seriamente o resultado, e aqueles em que os contaminantes praticamente no interferem no bom andamento da fermentao, h um
grande nmero de situaes intermedirias.
Em resumo, o grau de eliminao de contaminantes com o objetivo de obter
bons resultados depende de cada caso. Informaes pormenorizadas a respeito
desse assunto sero fornecidas, quando necessrio, no Volume 3 desta Coleo, ao
se estudar vrios processos fermentativos industriais.

..

... .J

40

Esterilizao de meios de fermentao por aquecimento com vapor

No podemos deixar de lembrar que, s vezes, a operao de eliminao total de contaminantes pode inviabilizar economicamente o processo, como o caso
da fermentao para produo de etanol a partir de caldo de cana-de~acar.
No presente captulo examinaremos apenas os processos de destruio de
contaminantes por aquecimento com vapor, tambm chamados "esterilizao por
calor mido".

4.2 - Descrio sumria dos processos de esterilizao


por calor mido
Consideraremos aqui apenas os dois processos mais importantes de esterilizao de meios em escala industrial, utilizando-se vapor como fluido de aquecimento: o processo descontnuo (tambm chamado processo de batelada) e o
processo contnuo.
No processo descontnuo, o meio quase sempre colocado no fermentador e, a seguir, aquecido com vapor. Nessas condies, esterilizam-se simultaneamente o meio e o fermentador. O aquecimento do sistema pode ser
efetuado, quer borbulhando-se diretamente vapor no meio ( o chamado aquecimento com "vapor direto"), quer passando-se vapor por uma serpentina mergulhada no meio ou por uma camisa que envol_ve o fermentador ( o
aquecimento com "vapor indireto") . Em qualquer dos casos, o meio agitado
mecanicamente, a fim de assegurar, tanto quanto possvel, a mesma temperatura em todos os pontos do sistema.
O aquecimento com vapor direto acarreta, obviamente, diluio do meio (da
ordem de 10 a 15%), como conseqncia da condensao do vapor injetado.
Na esterilizao descontnua distinguem-se nitidamente trs fases (ver Figs.
4.1, 4.9 e 4.10):
a) aquecimento, que eleva a temperatura inicial do meio (sempre prxima da temperatura de preparo do meio) at temperatura de esterilizao (geralmente da ordem de l20C);
b) esterilizao, na qual a temperatura mantida aproximadamente
constante durante um intervalo de tempo adequado, chamado tempo
de esterilizao;
c) resfriamento, quando, com auxlio de gua fria passando pela serpentina ou pela camisa, a temperatura reduzida at se atingir a temperatura de fermentao.
A rigor, a destruio trmica dos microrganismos no se d apenas na fase
chamada "esterilizao". No aquecimento, e tambm durante o resfriamento, enquanto a temperatura for superior denominada "temperatura mnima letal" (da
ordem de 80 a 100C), tambm h destruio de microrganismos (ver Fig. 4.1) .
Voltaremos a examinar esse assunto mais admte.

Descrio sumria dos processos de esterilizao por calor mido

1..

4I

-----------~--

II

Ti

Algumas horas

Tempo

Figura 4.1 - Representao esquemtica da variao de temperatura do meio durante sua esterilizao por processo descontnuo. 1: Aquecimento. 11: Esterilizao. 111: Resfriamento. Te: temperatura de esterilizao. Ti: temperatura
inicial. T t: temperatura final do meio esterilizado = temperatura de fermentao. T m: temperatura mnima letal.
tempo de esterilizao.

e:

Se, por um lado, a esterilizao descontnua apresenta a vantagem de esterilizar simultaneamente o meio e o fermentador, reduzindo assim os perigos de contaminao nas operaes de transferncia do meio para a dorna, ela apresenta, por
outro lado, algumas srias desvantagens, a saber:
a) manuteno do meio em temperaturas relativamente altas (acima de
100C), por perodos bastantes longos (da ordem de algumas horas), favorecendo
o desenvolvimento de reaes qumicas no meio com possveis alteraes indesejveis em sua composio (decomposio de nutrientes, por exemplo);
b) elevados consumos de vapor (no aquecimento) e de gua (no resfriamento), conseqentes da eficincia relativamente baixa do sistema de troca de calor;
c) problemas de corroso ocasionados pelo contato prolongado do fermentador com o meio aquecido;
d) tempo "no produtivo" relativamente elevado, uma vez que o fermentador utilizado apenas como um tanque de esterilizao durante o processo de
destruio dos contaminantes.
Passemos agora ao exame da esterilizao por processo contnuo, representado esquematicamente na Figura 4.2.: o meio recentemente preparado enviado,
pela bomba B, ao trocador de calor TCl (de tubos, ou de placas), onde atua como
fluido de resfriamento do meio j esterilizado e ainda quente; desse trocador de
calor, o meio, agora preaquecido, mistura-se com vapor enviado ao injetor I onde
a temperatura sobe quase instantaneamente, at alcanar a temperatura de esterilizao; a essa temperatura, praticamente constante, o meio percorre o tubo de re-

42

Esterilizao de meios de fennentao por aquecimento com vapor

teno ou de espera TE (quase sempre termicamente isolado), dimensionado de


modo a que o tempo de residncia do meio no tubo seja igual ao tempo de esterilizao; o meio j esterilizado, mas ainda a uma temperatura muito alta, passa pela
vlvula de reduo de presso V e vai, em seguida, ao trocador de calor TCl j citado; deste ltimo, o meio esterilizado encaminhado a um segundo trocador de
calor (TC2), onde sua temperatUra reduzida at alcanar o valor desejado; o fluido de resfriamento no trocador TC2 gua fria. Tratando-se, pelo que foi descrito,
de aquecimento com vapor direto, haver diluio do meio, da ordem de 10 a 15%.
O mosto esterilizado, e j na temperatura de fermentao, ento enviado
ao fermentador.
Vapor
p

TE

--------------------------------- -------,
I
I

,--------------------------------------

---------------------------------------.
I

Fermenta dor

TC1

TC2

---- ----- ------- +--------~-- --------------- +---------'

'-------+---- -------------

Agua

Meio
B

Figura 4.2 - Representao esquemtica de um esterilizador contnuo. B:.bomba. TC I e TC2: trocadores de calor.
1: injetor de vaj)or. T: termmetro. P: manmetro. TE: tubo de reteno ou de espera. V: vlvula de reduo de presso.

A Figura 4.3 mostra, esquematicamente, a variao da temperatura do meio


durante a esterilizao contnua. Nesse caso, a destruio de microrganismos durante o aquecimento e durante o resfriamento pode ser desprezada.

- - - - - - - - -- - ------ -- ------------- -- ------ - - -

-~- --~
.
--- --- ~ - -.....,.---

-- -------

Descrio sumria dos processos de esterilizao por calor mido

43

Alguns minutos

Tempo

Figura 4.3 - Representao esquemtica da variao de temperatura do meio durante sua esterilizao por procesSo contnuo. Ti: temperatura inicial. Tt : temperatura final do meio esterilizado= temperatura de fermentao. Te:
temperatura de esterilizao. Tm: temperatura mnima letal. 8: tempo de esterilizao.

Na esterilizao contnua, o aquecimento do meio at temperatura de esterilizao tambm pode ser efetuado com vapor indireto, substituindo-se o injetor
de vapor I (Figura 4.2) por um trocador de calor. Neste caso, no haver diluio
do meio.
A Figura 4.4 representa, de maneira esquemtica, um tubo de espera.
Um tubo de espera omo o representado na Figura 4.4, desde que adequadamente projetado (o nmero de ramos em U deve ser sempre maior que o necess-
rio, para assegurar a esterilizao do meio), permite, por um lado, a execuo de
eventuais reparos sem interromper o processo e, por outro, alterar, dentro de certos limites, o tempo de permanncia do meio na temperatura de esterilizao sem
variar a vazo.
Seguem alguns valores numricos relativos s condies de operao dos esterilizadores contnuos:
a) vapor de aquecimento: vapor saturado com presso de 6,8 a 8,5 atm;
b) bomba de recalque do mosto n~o esterilizado: podem ser utilizadas bombas centrfugas, rotativas ou de pisto;
c) dimetro do tubo de espera: 4 a 12 polegadas (10 a 30 em, aproximadamente);
d) tempo de enchimento do fermentador: no superior a 8 h;
e) velocidade do meio no tubo de espera: 3 a 60 cm/s, sendo mais utilizado o
intervalo de 6 a 12 em/ s;
f) nmero de Reynolds no tubo de espera: 36.000 a 80.000;
g) temperatura de esterilizao: 130 a 165C.

44

Esterilizao de meios de fermentao por aquecimento com vapor

____ _.

..,. ____ _
..,.

____ _

Figura 4.4 - Representao esquemtica de um tubo de espera. A: meio temperatura de esterilizao. B: tubos
verticais. C: tubos em U dispostos em planos horizontais. D: meio esterilizado. As setas indicam o percurso do meio
no tubo de espera com os registros I , 2 e 3 fechados .

Para se colocar em funcionamento um aparelho de esterilizao contnua, procede-se do seguinte modo: em primeiro lugar injeta-se em todo o sistema, incluiTI.do o
fermentador, vapor a 1 atm (aproximadamente 121 oq durante 2 horas; a seguir, injeta-se ar esterilizado no fermentador de modo a nele se ter uma sobrepresso de 0,3
atm; regulam-se ento as c<;>ndies de trabalho utilizando-se gua em vez do mosto;
quando as condies estiverem ajustadas, comea-se a bombear o meio a ser esterilizado; uma vez eliminada toda a gua existente no aparelho, abre-se o registro para o
fermentador, que ento carregado com meio esterilizado.
O processo contnuo de esterilizao apresenta, em relao ao descontnuo,
algums vantagens, a saber:
a) por se trabalhar a temperaturas mais elevadas, e tambm por serem muito
rpidas as operaes de aquecimento e resfriamento do mosto, o tempo de permanncia do meio em alta temperatura relativamente pequeno (da ordem de 5 a 15
min), o que acarreta menor destruio de nutrientes (como veremos mais adiante);
como conseqncia deste fato, a prtica tem mostrado, em vrios casos, que a fermentao de um meio esterilizado por processo contnuo apresenta rendimento
substancialmente maior do que o obtido na fermentao do meio esterilizado por
processo descontnuo (5 a 6 vezes maior na produo de riboflavina, e cerca de 10
vezes maior na produo de vitamina B12, por exemplo);
b) pelo fato de ser de dimenses relativamente pequenas, o tubo de espera
pode ser construdo com ligas especiais, evitando a contaminao metlica (muitas vezes prejudicial fermentao) do mosto que poderia resultar do ataque da
parede do tubo pelo meio;

____ _________ ________ .

- - -------.

------~- ------------- -- --- -.

..

--

Cintica da destruio tnnica de microrganismos

45

c) quando o meio apresenta densidade ou viscosidade relativamente alta,


como no caso de mostos de cereais, o processo contnuo dispensa os motores de
potncia elevada que seriam necessrios para o acionamento dos agitadores no
processo descontnuo de esterilizao;
d) economia de vapor, e de gua de resfriamento, em relao ao processo
descontnuo, desde que os trocadores de calor e o isolamento trmico da tubulao sejam adequadamente dimensionados;
e) os esterilizadores dmtnuos podem ser tambm utilizados nos processos
de cozimento e sacarificao de matrias.:.primas amilceas.
Importa, contudo, no esquecer que as viabilidades tcnica e econmica do
processo contnuo dependem das dimenses e do regime de trabalho dos fermentadores da instalao industrial.

4.3 - Cintica da destruio trmica de microrganismos


A velocidade de destruio pelo "calor mido" de microrganismos presentes em um dado meio depende de vrios fatores, a saber:
a) do microrganismo (gnero, espcie, linhagem; idade da cultura, existncia
ou no de esporos);
b) do meio (composio, pH, presena de slidos em suspenso);
c) da temperatura.
Imaginemos um experimento em que um determinado microrganismo, em
suspenso em um dado meio, mantido a uma temperatura constante e superior
temperatura mnima letal. Se durante o ensao determinarmos o nmero de microrganismos vivos existentes no sistema, como a temperatura superior mnima letal esse nmero de microrganismos vivos ser uma funo descrescente do
tempo. A experincia mostra que, com boa aproximao, os resultados podem ser
representados como indica ,a Figura 4.5,

z
E

Figura 4.5 - Representao esquemtica da variao do nmero de microrganismos vivos (N) aps um tempo t de
manuteno do meio a uma temperatu ra letal constante T N 0 =nmero de microrganismos vivos no instante t = O.
- ___ _ _ _ _ _ _ _j

46

Esterilizao de meios de fermentao por aquecimento com vapor

Isso nos mostra que, do ponto de vista cintico, a destruio do microrganismo se comporta como se fosse uma reao de primeira ordem, isto :
(4.1)

dN
-=-k N
dt

sendo N o nmero de microrganismos vivos existentes no meio aps um tempo t


de aquecimento do sistema a uma dada temperatura constante. A constante k denominada constante de velocidade de destruio trmica do microrganismo.
O valor de k depende dos fatores citados no incio deste item. Para um dado
microrganismo em um dado meio, k depender apenas da temperatura.
Sendo N 0 o nmero de microrganismos vivos no instante t =O, a eq. (4.1) nos
d:
(4.2)

lnN=lnN 0 -k t

equao esta que nos permite, a partir de valores experimentais resultantes de medidas de N para diferentes valores de t, calcular a constante k do microrganismo
em estudo, no meio considerado, na temperatura ensaiada.
A ttulo de exemplo, consideremos os valores da Tabela 4.1, obtidos de experimentos realizados com esporos de Bacillus stearothermophilus, suspensos em soluo tampo de pH = 7,0, temperatura de 105C.

Tabela 4.1 - Destruio trmica de esporos de Bocillus steoro thermophilus a Iosoc.

t (minutos)

25

8,5. 104

50

3,5. 104

100

6,0 _103

200

2,0. 102

~
.

~I~
~ ~;

..

>

~'-

..

250
~

40
-

.-

li: ~-

-~-..'-~

~t

_;- - ... "?}:':"'..~!~J~ .

A partir dos valores da Tabela 4.1, por regresso linear obtemos (ver Fig.

4.6), no intervalo de tempo 25 mina 250 min:


ln N

12,1626- 0,0341 t
(r= -0,9998)

sendo r o coeficiente de correlao. Nesse caso, o valor de k 0,0341 min- 1


Se o experimento tivesse sido realizado no a 105C, .mas a 121 oc, valores de
k prximos de 3 min - 1 poderiam ser obtidos, dependendo da variedade do Bacillus
i

j~-----------

Cintica da destruio trmica de microrganismos

47

stearothermophilus utilizada (ver Fig. 4.8). A influncia da temperatura no valor de


k ser considerada mais adiante.
12

z
E

o
o

100

200

300

t (min)

Figura 4.6- Representao grfica dos resultados da Tabela 4.1 .

Mostra a experincia que os esporos so bastante mais resistentes destruio trmica do que as clulas vegetativas.
Alm disso, observa-se que no h, nesse caso, obedincia, eq. 4.2 no intervalo de tempo inicial de exposio d suspenso de esporos temperatura considerada, como indica a Figura 4.7. No cabe, neste livro, o exame desse problema.
Considerando-se, porm, que a destruio trmica de esporos , na prtica, sempre realizada em temperaturas elevadas (pelo menos l20C), e considerando-se
que, nessas temperaturas, o desvio da curva experimental em relao eq. 4.2.
geralmente pequeno, pode-se, para fins de clculos de interesse industritl, considerar aplicvel a expresso 4.2.
No estudo da destruio trmica de microrganismos, costuma-se definir um
outro parmetro: o tempo de reduo decimal, indicado por D . o tempo necessrio para reduzir o nmero de microrganismos a 1/10 do valor inicial (em outras
palavras, para destruir 90% dos microrganismos vivos existentes). Se na equao
4.2 fizermos N = 0,1 N 0 , teremos, de acordo com a definio de tempo de reduo
decimal, t = D. Logo:
ln(0,1N 0 )=lnN 0 -kD

e, portanto:
D= 2,303

(4.3)

48

Esterilizao de meios de fermentao por aquecimento com vapor

z
E

Figura 4.7- Representao esquemtica de curvas de destruio trmica de esporos a diferentes temperaturas
(Tl , Tz e T 3)

No caso do exemplo indicado na Tabela 4.1, teremos:


D=67,5min
isto , temperatura de 105C, 90% dos microrganismos presentes no meio considerado sero destrudos em 67,5 min.
A eq. 4.3 mostra, ainda, que os fatores que afetam o valor de k afetam tambmD.
'
Uma vez fixados o microrganismo e o meio, vejamos de que maneira a temperatura afeta o valor de k. D11as equaes foram propostas com o objetivo de correlacionar k e a temperatura, a saber:
a) Equao de Arrhenius
k=Aexp(-a I RT)

(4.4)

onde A uma constante emprica, R a constante universal dos gases perfeitos, T


a temperatura absoluta e a a denominada energia aparente de ativao de destruio trmica do microrganismo (ou simplesmente energia de ativao de destruio do microrganismo).
b) Equao de Bigelow
k =A' exp (!) T')

(4.5)

onde A'e!) so constantes empricas e T' a temperatura medida em C ou em F.

-- -- ----------------- - - - ------ ----------- -

Cintica da destruio trmica de microrganismos

49

As eqs. 4.4 e 4.5 conduzem, respectivamente, a:

a 1
lnk=lnA---

(4.6)

lnk=lnA'+PT'

(4.7)

R T

Conhecendo-se os valores de k para diferentes temperaturas, as eqs. (4.6) e


(4.7) permitem calcular, por regresso linear, os valores das constantes nelas indicadas. Em particular, a equao 4.6 nos dar o valor da energia de ativao a.
A Figura 4.8 mostra a influncia da temperatura no valor da constante de
velocidade de destruio trmica de esporos de Bacillus stearothermophilus. Observe-se a obedincia eq. 4.4. Neste exemplo, os valores experimentais representados na Figura 4.8 conduzem a um valor de a igual a 68,7 kcal/mol. Para muitos
microrganismos encontram-se valores de a entre 65 e 85 kcal/mol.

";"c

0,5

I.>tt.

0,1
0,05

255

260

265

10 5/T (K- 1) .

Figura 4.8 - Influncia da temperatura (T) na constante de velocidade de destruio trmica (k) de esporos de Bacil-

lus stearothermophilus.

Se aplicarmos as equaes de Arrhenius e de Bigelow a um mesmo microrganismo, no mesmo meio e mesma temperatura, teremos:
. Aexp(-a I RT) =A'exp(P T')
Logo:

, 1
A
a
1
T =-ln----

.______

A'

PR

(4.8)

.
50

Esterilizao de meios de fermento por aquecimento com vapor

Lembrando que A, A', a,~ e R so constantes, a eq. 4.8 nos diz que T' varia
linearmente com 1IT, o que um absurdo, uma vez que T' (expressa em oq
igual a T-273. Acontece, porm, que a equao 4.8 permite, com boa aproximao,
calcular T' em funo de T, desde que no se considerem intervalos de temperatura muito amplos. Assim, por exemplo, no intervalo de 100 a 160C, a seguinte
equao pode ser obtida por regresso linear:
(4.9)

T' = 532,9 -1,620(10 5 I T)


(r = -0,9992)

onde T' a temperatura em C, T a temperatura absoluta e r o coeficiente de


correlao.
Se considerarmos apenas o intervalo de 120 a 160C, que do ponto de vista
de aplicaes prticas o mais importante, teremos:
T' = 552,4 -1,701 (10 5 I

T)

(4.10)

(r =- 0,9995)

A Tabela 4.2 mostra, para vrios valores de T, os valores de T' calculados


por T-273 e pelas eqs. (4.9) e (4.10).
Tabela 4.2 - Aplicao das equaes 4.9 e 4. 1O.
T' (OC)
T (K)

..

T-273

Eq. 4.9

373

100

98,6

::_

383

110

109,9

.'C I

393

120

120,7

119,6

tf

403

130

130,9

130,3

413

140

140,6

140,5

.f
:.

423

150

149,9

150,3

433
-e

160

:,.,.

,_:;. _{"-

....<;<.."'.:F...:,.,

Eq. 4.10

158,8
.,.....,,;::. -.

.:: ....;::4> . .

159,6

'

.~

::

"'

~'*

L\t.l

r~~

~tJ:: ~ :;:;,1i~~ JJ-'1.: :r J1

Explica-se, portanto, levando-se em conta os erros experimentais que afetam


os valores de k (principalmente os inerentes s medidas dos nmeros de clulas
vivas), a possibilidade de cqrrelacionar k com a temperatura, tanto pela eq. 4.4
quanto pela 4.5.

i
... . .

-----~ --- --- ----------

--- -----------------------------

- -

- ------------- -------- ----- - - . --------------- --.----- - - - ---------------------:--;--- - ,-------------------- - ----

Destruio de nutrientes do meio como conseqncia da esterilizao

5I

4.4 - Destruio de nutrientes do meio como conseqncia


da esterilizao
O aquecimento de um meio com o objetivo de destruir microrganismos nele
existentes acarreta, simultaneamente, alteraes em sua composio. Reaes indesejveis (como por exemplo, decomposio de vitaminas e reaes entre glicose
e aminocidos), cujas vlocidades aumentam com a temperatura, podem prejudicar a posterior atividade dos microrganismos da fermentao, conduzindo a rendimentos ou produtividades menores do que os esperados.
A temperatura escolhida para a esterilizao do meio desempenha, nesse
particular, papel relevante. A experincia mostra que, quanto mais elevada for a
temperatura escolhida para se conseguir a destruio de uma dada quantidade de
microrganismos do meio, menor ser a destruio de nutrientes existentes nesse
meio e, conseqentemente, melhores sero os resultados obtidos na fermentao
posterior. Isso uma conseqncia do fato de ser a energia de ativao da destruio trmica dos microrganismos (65 a 85 kcal/mol) maior que a da destruio trmica de nutrientes. A Tabela 4.3 mostra valores da energia de ativao de
destruio trmica de alguns nutrientes.
Tabela 4.3 - Energia de ativao de destruio trmica de alguns nutrientes.
Energia de ativao

Substncia

...

(kcal/mol)

1.::.

Vitamina C

23,1

{"t:

cido flico

16,8

Vitamina 812

23,1

~~

14,6

..

Vitamina A
. ~

--

f,.,., .. _;,;

,.

Vitamina B1
..
..;;.,.,

- ..

-.

'"""-.;..,........,........

~~

-_,...

26,0
'

~.

ir
"!'

~~i

.. ~~ :..cJ;,~

Por sua importncia prtica, tanto na esterilizao de meios de fermentao


como na esterilizao de alimentos, essa afirmativa deve ser demonstrada.
Consideremos um dado volume de meio contendo N 0 microrganismos vivos, nmero esse que deve ser reduzido a N 1 < N 0 Seja 50 a concentrao de um
nutriente termolbil no meio, antes do tratamento trmico. Suponhamos que esse
tratamento trmico seja realizado a duas temperaturas constantes TI e T2 , com T2 >
TI. Sejam:

i:..:

ti = tempo para reduzir.o nmero de microrganismos vivos de N o a N 1, quando a temperatura TI;


.
t 2 = tempo para reduzir o nmero de microrganismos vivos de No a Nfl quando a temperatura T
ki = constante de velocidade de destruio dos microrganismos temperatura TI;

52

Esterilizao de meios de fermentao por aquecimento com vapor

k2 = constante de velocidade de destruio dos microrganismos temperatu-

ra Tz;

a = energia de ativao de destruio dos microrganismos;


5 1 = concentrao final do nutriente aps o tratamento do meio temperatura T 1;
5 2 = concentrao final do nutriente aps o tratamento do meio temperatura T 2;

k 1' =constante de velocidade de destruio do nutriente temperatura T1;


kz' = constante de velocidade de destruio do nutriente temperatura T2;
a' =energia de ativao de destruio do nutriente.
A eq. 4.2 nos permite calcular t 1 e t 2 :

1
N0
t 2 = - l n kz

Nf

Logo:
(4.11)

Mas, pela eq. 4.4, temos:


(4.12)

k 2 =Aexp(-a

I RT2 )

(4.13)

Substituindo-se, na eq. 4.11, os valores de k 1 e k 2 dados pelas eq. 4.12 e 4.13,


teremos:
(4.14)

Vejamos, agora, o que aconteceu com a concentrao do nutriente. Admitin.do, apenas para simplificar a demonstrao, que a destruio trmica do nutriente seja de primeira ordem, teremos:

53

Consideraes gerais a respeito do clculo do tempo de esterilizao

(4.15)

Pela equao de Arrhenius:

Logo, a eq. 4.15 nos d:

!.1_ =ln (5 0 I 51) exp(~. T2- T1,J


t2
(5 0 I 52)
R T1 T2

(4.16)

As expresses 4.14 e 4.16 permitem, ento, escrever: "

(a

T1
T1 T2

exp - T 2
R

J=ln (5 0 I 5 1) exp (a'- T


(5 0

I 52)

T1.
T1 T2
2 -

tf

Lembrand? que a >a', teremos:

:.~

Ficando assim demonstrado que a concentrao final do nutriente no tratamento trmico do meio, temperatura T 2 , maior do que a concentrao final do
nutriente no tratamento trmico do meio temperatura T 1 < T 2 , isto , a destruio do nutriente . menor quando o meio termicamente tratado a temperatura
mais alta.

4.5

Consideraes gerais a respeito do clculo do tempo


de esterilizao

J vimos que a eq. 4.2 nos d:


(4.17)

54

Esterilizao de meios de fermentao por aquecimento com vapor

expresso esta que nos permite, conhecido o valor de k, calcular o tempo necessrio para reduzir o nmero de microrganismos vivos de N 0 at N.
A aplicao dessa equao a clculos de tempos de esterilizao no to
simples como pode parecer primeira vista.
O primeiro problema que se apresenta, decorre do fato que os meios de fermentao a esterilizar no possuem uma nica espcie de microrganismo a ser
destruda. Nos meios utilizados na prtica encontramos microrganismos vivos
pertencentes a diferentes gneros e espcies, alguns esporulados e outros no, que
devem ser eliminados para assegurar a inexistncia de contaminantes na fermentao posterior. Lembrando que o valor de k depende do microrganismo, a aplicao da eq. 4.17 torna-se praticamente impossvel. Contorna-se esse problema escolhendo-se um microrganismo de referncia conhecido, altamente resistente ao calor, e admitindo-se que todos os microrganismos existentes no meio a ser esterilizado apresentem uma resistncia destruio trmica igual do microrganismo
de referncia. bastante freqente a escolha do Bacillus stearothermophilus esporulado como microrganismo de referncia.
O segundo problema que surge ao tentarmos aplicar a eq. 4.17 a casos reais
reside no fato de a constante de velocidade k depender, tambm, do meio e da
temperatura. Uma vez escolhido o microrganismo de referncia, preciso, portanto, conhecer os valores de k desse microrganismo em suspenso no meio a ser esterilizado e a diversas temperaturas, o que pode, com freqncia, implicar na realizao de experimentos preliminares de determinao de k. Como primeira aproximao, quando no se conhecem valores de k, pode-se admitir k:.::::: 1 ~in- 1 (a 121 C)
e a :.: : : 75 kcal/ mol.
O terceiro problema a ser considerado conseqente do fato de, nos meios a
esterilizar, as clulas microbianas a serem destrudas poderem se encontrar na forma de aglomerados, ou ainda protegidas por partculas slidas em suspenso no
meio. Isso acarreta um verdadeiro aumento da resistncia dos microrganismos
destruio trmica, aumento esse de quantificao muito difcil.
Finalmente, outro problema na aplicao da eq. 4.17 ao clculo do tempo de
esterilizao decorre da prpria definio de esterilizao. De fato, lembrando que
a esterilizao a operao que tem por finalidade destruir todos os microrganismos vivos existentes no meio, o nmero final de microrganismos vivos dever ser
N =O e, neste caso, a eq. 4.17 deixa de ser aplicvel.
Esse ltimo problema pode, porm, ser resolvido a partir da definio de
probabilidade de falha de uma esterilizao. Sendo:
E, = nmero total de operaes de esterilizao realizadas nas mesmas condies;
E1 = nmero de operaes de esterilizao que falharam, isto , que no conduziram a um meio esterilizado.
Define-se probabilidade de falha (P) dessa esterilizao pela relao:
(4.18)

55

Consideraes gerais a respeito do clculo do tempo de esterilizao

Multiplicando-se por 100 essa ltima frao, a probabilidade de falha ser


expressa em porcentagem.
Suponhamos, para facilitar a exposio, que uma dada esterilizao apresente probabilidade de falha igual a 0,03 (ou 3%). Isso significa que, de 100 partidas
de meio tratadas termicamente nas mesmas condies, sero obtidas, em mdia,
97 partidas esterilizadas e 3 partidas no esterilizadas. Se indicarmos por N0 o nmero de microrganismos vivos em cada partida de meio a esterilizar, o nmero de
microrganismos nas 100 partidas de meio a esterilizar ser 100 N0 Acontece, nesse
caso, que 3 partidas no se encontravam esterilizadas aps o tratamento trmico
do meio. Se considerarmos que a condio necessria e suficiente para que falhe a
esterilizao de uma partida de meio que nele exista, aps o tratamento trmico,
um microrganismo vivo, o nmero final de microrganismos vivos nas 100 partidas
ser, no mnimo, igual a 3 (um .em cada partida em que a esterilizao falhou).
Aplicando-se a eq. 4.17 ao conjunto das 100 partidas, teremos:
t=.!_ln 100No =.!_ln No
k
3
k
0,03
De um modo geral, sendo P a probabilidade de falha, podemos escrever:
1
N0
t=-lnk
p

(4.19)

Para fixar idias, consideremos o seguinte exemplo numrico: um dado volume de meio a esterilizar contm 2,5.10 1 0 microrganismos vivos; o valor de k 3,4
1
min - ; calcular os tempos .de esterilizao para que as probabilidades de falha sejam iguais a 0,1 (ou 10%), 0,01 (ou 1%) e 0,001 (ou 0,1 %). Aplicando-se a equao
4.19, teremos:
a) para P = 0,1 (10%)

t = __!_ ln _2;_,5__10_1_0 = 7,7 min


3,4
0,1
b) para P = 0,01 (1%)
t

=_!_ -ln2,51010
.
---'----- = 84 ffi1n
3,4
0,01
f

c) para P = 0,001 (0,1 %)

t = __!_ ln 2,5 1010


3,4
0,001

= 9,1 min

56

Esterilizao de meios de fermentao por aquecimento com vapor

4.6 - Clculo do tempo de esterilizao por processo


descontnuo
Suponhamos que na esterilizao descontnua de um dado volume de meio,
a curva da Figura 4.9 represente a variao da temperatura do meio com. o tempo.

I
I
I
I
I
_ _ _ _ _l _ _ _ _ _ _ _ L_

I'
I
I
I
I
I

II
I
I
I
I
I

II
I
I
I
I
I

J/'p
II
I
I
I
I
I

---r----~-------r-r-----

1
I
I
I
I
I
I
I
I
I

I
I
I
I
I
I
I
I
I

I
I
I
I
I
I
I
I
I

I
I
I
I
I
I
I
I
I

Tempo

Figura 4.9- Variao de temperatura do meio com o tempo, durante sua esterilizao por processo descontnuo.
Te: temperatura de esterilizao. Tm: temperatura mnima letal. T f: temperatura final do meio esterilizado =temperatura de fermentao. T 0 : temperatura inicial do meio a esterilizar. N 1 : nmero de clulas vivas no instante t 1 . P: probabilidade de falha.

Para calcularmos o tempo de esterilizao (9) precisamos conhecer:


a) o nmero inicial de clulas vivas no meio (N1);
b) a probabilidade de falha (P);
c) as curvas de aquecimento e de resfriamento do meio;
d) a temperatura mnima letal (Tm);
e) a temperatura de esterilizao (Te);
f) a variao de k com a temperatura.
Na Figura 4.9, N 2 e N 3 so, respectivamente, os nmeros de microrganismos
vivos no fim da fase de aquecimento e no incio da fase de resfriamento. Como veremos logo mais, N 2 e N 3 no precisam ser conhecidos.
Tanto no aquecimento como no resfriamento, o valor de k varia como conseqncia da variao da temperatura. Nesses casos, a eq. 4.1 nos dar:

Z6 6
57

Clculo do tempo de esterilizao por processo descontnuo

a) no aquecimento:
N

t2

N2

t,

(4.20)

l n -1 =Jkdt
1

b) no resfriamento: ,
(4.21)

3
ln=Jkdt
p
t
3

Essas integrais podem, por exemplo, ser calculadas do seguinte modo: escolhem-se diversos valores de t na fase de aquecimento (ou de resfriamento); para
cada valor escolhido de t, a curva de aquecimento (ou de resfriamento) nos d a
temperatura correspondente; mas para cada valor da temperatura, lembrando que
a variao de k com a temperatura conhecida, calcula-se o correspondente valor
de k; teremos, deste modo, a variao de k com o tempo no aquecimento (ou no
resfriamento); tendo-se k = f(t), podemos calcular as integrais das eqs. 4.20 e 4.21.
Sendo k. o valor de k na temperatura de esterilizao, podemos ento escrever:
N
12
1
ln=
dt
N2 I 1

Jk:

. 1,

3
1n=Jkdt

I
3

Logo:
N

12

I,

ln pl =ke 9+ Jk dt+ Jkdt


11

(4.22)

13

A eq. 4.22 nos permite calcular e.


A ttulo de exemplo numrico, consideremos o clculo do tempo de esterilizao de um mosto, sendo dados:
a) volume do mosto= 100m3 (10 5 litros);
b) concentrao de microrganismos vivos no mosto= 7,2 10 9 clulas/litro;

58

Esterilizao de meios de fennentao por aquecimento com vapor

.c) temperatura de esterilizao = l20C;


d) temperatura mnima letal = 80C;
e) probabilidade de falha= 0,001 (ou 0,1 %);
f) curvas de aquecimento e de resfriamento= ver Fig. 4.10;
g) variao de k (em min- 1) com a temperatura T' (em 0 C):

k =6,04 10-11 . e 0 , 200 T'(equao de Bigelow)

120 /

(4.23)

T'
e

Resfriamento

120

T'm

80

f:-

40

40

Aquecimento

40

80

40

80

t (min)

Figura 4.1 O - Curvas de aquecimento e de resfriamento do meio (exemplo numrico).

A partir das curvas da Figura 4.10 e da equao que relaciona k com a temperatura T', montamos as Tabelas 4.4 e 4.5, que nos permitem representar graficamente a variao de k com o tempo (ver Fig. 4.11)
Tabela 4.4 - Valores de k durante o aquecimento do meio (exemplo numrico).

t (min)

T' ( 0 C)

k (min- 1)

20

75

0,0002

30

87

0,0022

40

97

0,016

50

105

0,080

60

112

0,32

70

116

0,72

80

120

1,60

"'

...

~.a..':':

.. . 6'

::t

.~.-

.::.. ;..;

.
~~.~

~
!~

~
.

~~.
.

r--:~

59

Clculo do tempo de esterilizao por processo descontnuo

Tabela 4.5- Valores de k durante o resfriamento do meio (exemplo numrico).

t (min)
T ' (0 C)
k (min-1)
~-----------------r----------------~----------------~1 ;

120

114

1,60

o/.1
''

0,48

:t.,.. ~

Ir-------------------~--------------------~-------------------; '

t-------------------~--------------------~----~--------------11

109

- ;'

0,18

1 ~:

105
6
0,080
~ ~-
ll------------------r------------------+--------------------11.... :
101
8
0,036

:i:'

lr-------.10--------r-------9-7------~-------0-,0-16-------i~~

15

88

0,0026

20

80

0,0005

ll------------------~----------------r--------------~11~

. ,""!

1,6

1,6
Resfriamento

Aquecimento

1,2

1,2

i::

.E
?;!

80

0,8

0,8

20

Jk dt

fok dt

24

0,4

0,4

o
20

60

40
t (min)

80

8
t (min)

Figura 4.11 -Variao de k durante o aquecimento e o resfriamento do meio (exemplo numrico).

i...___ --- --.

Teremos ento:
N 1 =10 5 -7,2-10 9 =7,2 10 14
p =0,001 .

ln (N 1 I P) = 41,12

. 12

i::
.E
?;!

60

Esterilizao de meios de fermentao por aquecimento com vapor

80

Jkdt~19,40

(ver Fig. 4.11; fase de aquecimento)

24

20

Jk dt ~3,23

(ver Fig. 4.11; fase de resfriamento)

o
Substituindo esses valores na equao 4.22, calculamos e:
41,12 = 1,60 e+ 19,40 + 3,23

e = 11,6 min ~ 12 min


Suponhamos, agora, que tivssemos:
a) concentrao de microrganismos vivos no mosto= 4,3 102 clulas/litro;
b) probabilidade de falha= 0,1 (10%).
Nesse ltimo caso:

p = 0,1
ln(N 1 I P)=19,88
A equao 4.22 nos daria, ento:
19,88 = 1,60 e+ 19,40 + 3,23
9=-1,7min
Esse resultado indica que, nesse ltimo exemplo numrico, o aquecimento e o resfriamento so mais que suficientes para conseguirmos a esterilizao
desejada.

4. 7 - Clculo do tempo de esterilizao por processo


contnuo
Lembrando que, no processo contnuo, tanto o aquecimento quanto o resfriamento do meio so muito rpidos, as integrais representadas nas eqs. 4.20 e 4.21
podem ser desprezadas, e o clculo do tempo de esterilizao e se resume na aplicao da equao:
------- - ---~-- - - --------

--- - - -- - -

--~

Clculo do tempo de esterilizao por processo contnuo

Nl
ln-=k
p
e

61

.e

Voltemos ao exemplo numrico citado no item anterior, mas com temperatura de esterilizao igual a 130C. Teremos, pela eq. 4.23:
ke = 11,8 min -l
Logo, o valor de e ser':
41)2 =11,8-e
:. e =3,5min
Resta-nos, finalmente, considerar o dimensionamento do tubo de espera.
Sejam:
V= volume de meio necessrio para encher um fermentador;
te = tempo de carga do fermimtador;
p = massa especfica do meio temperatura de esterilizao;
J..l =viscosidade do meio temperatura de esterilizao;
e = tempo de esterilizao = tempo de residncia do meio no tubo de espera;
Re = nmero de Reynolds no tubo de espera;
D = dimetro interno do tubo de espera;
v = velocidade de meio no tubo de espera;
L= comprimento do tubo de espera.
Os valores de V te, p, J..l, e, so conhecidos e, alm disso, sabemos que Re e v
devem estar compreendidos nos intervalos 36.000 a 80.000 e 3 a 60 em/ s, respectivamente.
Interessa-nos calcular D e L, lembrando que o valor de D deve estar contido,
aproximadamente, no interv~lo 10 a 30 em.
Sendo F = V I te a vazo do meio no tubo de espera, podemos escrever:
rr.D 2
4

F=--V

.. D

z V=-4 F

(4.24)

Re = Dv p

:.D V= JJ.Re

(4.25)

rr.

Por outro lado:

J..l

As equaes 4.24 e 4.25 nos do:


D=4 Fp __!_
(4.26)
rr.JJ. Re
Para cada valor de Re, a eq. 4.26 permite calcular D e, ento, a eq. 4.24 nos
d o correspondente valor de v. Considerando que L ~v e, calculamos o correspondente valor de L.
~ ----

!1
l

62

Esterilizao de meios de fermentao por aquecimento com vapor

A ttulo de exemplo numrico, imaginemos um caso no qual:


3
V= 100m3 = 1,00.10 8 cm

te= 4 h= 1,44.10 4 S
p = 1,06 g/cm

3
3

J.l = 0,55 cp = 5,5.10- p

e= 3,5 min = 2,1.10 2 s


A partir dos valores de V e te calculamos a vazo do meio:
F=V !te =6,94 10 3 cm 3 /s

Com esses valores numricos, poderemos calcular D, v e L para cada valor


de Re (ver Tab. 4.6).
A escolha do valor de D (e do correspondente L) depender, obviamente,
dos dimetros de tubos existentes no mercado, dos preos desses tubos, de alguma caracterstica peculiar do meio, e de outros requisitos ou limitaes inerentes
ao projeto global. Por segurana, o projeto poder prever, no tubo de espera, um
"tubo em U" (ver Figura 4.4) suplementar.
Tabela 4.6- Valores do dimetro (D) e do comprimento (L) do tubo de espra, e da velocidade (v) do meio no
tubo de espera para diferentes valores do nmero de Reynolds (Re ), no exemplo numrico considerado.

D (em)

Re

L (m)

v (cm/s)

,:_

40000

42,6

4,87

10,2

50000

34,1

7,60

16,0

60000

28,4

10,96

23,0

70000

24,3

14,97

31,4

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Literatura recomendada
(1) AIBA, S., HUMPHREY, A.E. & MILLIS, N .F. Biochemical Engineering. University of Tokyo Press, Tquio, 1973.
(2) BAILEY, J.E . & OLLIS, D.F. Biochemicai Engineering Fundamentais. McGraw-Hill
Book Company, Nova York, 1986.
(3) BLAKEBROUGH, N . Biochemicai and Bioiogicai Engineering Science. Academic
Press, Nova York, 1967 e 1968.
(4) SIMON, P. & MEUNIER, R. Microbioiogie Industrielle et Gnie Biochimique. Masson et Cie., diteurs, Paris, 1970.
(5) SOLOMONS, G.L Materiais and Methods in Fermentation. Academic Press, Londres, 1969.

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63

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_______________________
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Willibaldo Schmidell

5.1- Introduo
Como se sabe, os processos qumicos industriais podem ser divididos, de
uma forma simples e global, em processos inorgnicos, orgnicos e biolgicos.
Assim, um processo qumico industrial biolgico aquele no qual o processo de
converso da matria-prima em produto repousa basicamente em um fenmeno
biolgico.
Esse tipo de indstria apresenta uma srie de caractersticas prprias,
pois freqentemente trata-se de fazer crescer um certo microrganismo ou, de
forma mais geral, uma dada clula, seja microbiana, animal ou vegetal. Esse
fato exige a pres,ena, desde o projeto da planta at sua operao em regime, de
uma mentalidade prpria e particular em relao existente na indstria qumica no biolgica.
tambm fato conhecido, que at a Segunda Guerra Mundial no s~ dispunha de tecnologias adequadas para a conduo de processos fermentativos em
grande escala e em condies de assepsia, motivo pelo qual no havia a possibilidade de se fabricar produtos tais como antibiticos, vitaminas, enzimas, etc.
Os produtos elaborados por processos fermentativos eram aqueles cuja gerao, no caldo em fermentao, tornassem o meio no adequado para a proliferao de possveis contaminantes, determinando, desta forma, uma proteo natural
ao meio (etanol, acetona, cidos orgnicos, etc.).
O grande avano observado durante a Segunda Guerra Mundial foi exatamente o desenvolvimento dessas estratgias que permitiram a conduo de processos em larga escala em condies de assepsia, em particular a possibilidade
, de se efetuar a esterilizao de grandes volumes de ar, necessrio aos processos
biolgicos aerbios.
Apenas para se ter uma idia da importncia da: esterilizao do ar, imagine-se a necessidade de fornecer ar esterilizado para um reator de 100m3 a uma va-

64

:l

!.

Esterilizao de ar

zo especfica de 0,5 min- 1 (ou, como freqentemente mencionado, 0,5 v.v.m., ou


seja, volume de ar por volume de meio por minuto). Esse problema, que nada tem
de extraordinrio, sendo mesmo bastante freqente, pode ser resumido necessidade de se esterilizar 50 m 3ar/min.
Admitindo-se uma contaminao do ar ambiente da ordem de 103 partculas/m3 (vide item seguinte), caso no houvesse a esterilizao do ar, introduzir-se-iam no reator 5x10 4 partculas/min. Lembrando que um processo
fermentativo pode freqentemente ocorrer durante 50 ou 100 horas, isto significaria introduzir um total de 3x10 8 partculas contendo microrganismos, ao longo de
100 horas de fermentao.
Esse exemplo torna claro que no se poder obter sucesso nesse processo,
caso o acmulo do produto desejado dependa da ao isolada do microrganismo
responsvel pela sntese deste produto.
Na verdade, caso se trate de um processo descontnuo de fermentao, os
instantes mais problemticos so os instantes iniciais do processo, pois a se tem
baixa concentrao do microrganismo produtor e alta concentrao de substratos,
o que significa alta potencialidade de contaminao do sistema. J nos instantes
mais avanados tem-se uma alta concentrao do microrganismo responsvel pelo
processo produtivo e uma baixa concentrao de substratos, o que torna o caldo
em fermentao menos suscetvel a contaminaes. Isso no significa que se possa
conduzir o process<;> de forma menos atenta, pois a ocrrncia de contaminaes
que produzam substncias que destruam o produto gerado pode _comprometer o .
processo, como o caso de contaminaes com clulas produtoras de proteases
em um processo de produo de uma dada enzima.
Claro est que o nvel de preocupao com a esterilizao do ar depende da
maior ou menor suscetibilidade do_processo quanto a cntaminantes. Caso o meio
de cultivo, ou as condies impostas ao reator (pH, temperatura), sejam extremamente seletivos, os cuidados podem ser atenuados, mas ainda assim a ocorrncia
de contaminaes pode interferir negativamente no que se refere obteno de altos rendimentos, o que geralmente no compensa a economia que se tenha feito, e
que no mais permita uma operao assptica eficiente.
No presente captulo pretende-se descrever certas particularidades sobre os
aerossis microbianos, indicar formas para se estimar a concentrao de microrganismos suspensos no ar, apresentar as formas mais freqentes e disponveis para
se executar a esterilizao do ar, sempre com a principal preocupao no fornecimento de ar esterilizado para processos fermentativos aerbios.

5.2 - Aerossis microbianos


As espcies microbianas suspensas no ar atmosfrico, assim como sua concentrao, podem ser extremamente variveis, dependendo de uma srie de fatores. Pode-se encontrar microrganismos de maiores dimenses, como bolores
(fragmentos de hifas) e leveduras, assim como espcies de menores dimenses
como bactrias ou seus esporos. Esses microrganismos so provenientes do solo,
ou de plantas, ou ainda de cursos de gua, sendo postos ein suspenso pela
---- -- - - - --- - - -------. -

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Amestradores

65

movimentao do ar ambiente, sendo os de menores dimenses freqentemente associados a partculas de poeira.


A simples meno desses fatos j indica que, dependendo do clima de urna
dada localidade, ou mesmo de um dia para outro em urna mesma localidade, po- ,
dern-se encontrar diferentes concentraes de microrganismos suspensos no ar,
assim corno distintas espcies de microrganismos suspensos. De fato, ao se efetuar
a contagem de microrgni~rnos no ar em um ambiente livre de radiaes solares e
com umidade relativa elevada, muito provavelmente obtm-se concentraes elevadas de clulas vegetativas. Ao contrrio, urna determinao feita aps longa exposio luz solar forneceria urna contagem preferencial de espcies mais
resistentes, corno os esporos de bactrias. Analogamente, a concentrao de microrganismos suspensos no ar drasticamente reduzida aps um perodo de chuvas e extremamente elevada aps. um perodo de ventos fortes.
Essas informaes permitem refletir sobre o local de onde se deve proceder
captao de ar para processo. Esse local de captao no deve ser entendido
corno aleatrio, pois podemos estar captando ar de locais II).Uito contaminados,
corno seria o caso de se localizar a entrada de ar do sistema de compresso muito
prxima do solo, ou ainda voltada para locais particulares e sujeitos a um maior
nvel de contaminao.
No prximo item se buscar descrever sistemas para a determinao da concentrao de microrganismos suspensos no ar, mas j se pode afirmar que, apesar
das possveis variaes em urna mesma localidade, ao se efetuar estas deterrnina.es por longos perodos (um ano por exemplo), obtm-se valores mdios relativa-
mente prximos. Assim, AIBA et al. 1 indicam, para a atmosfera de Tquio, urna
concentrao mdia de microrganismos de 12x103 partculas/rn3, enquanto que
GADEN;HUMPHREY 2 indicam, para Londres, um valor de 3 a 9x103 partculas/rn3
PARIS et al. 3 chegaram a urna concentrao mdia de 1 a 3x103 partculas/rn3,
no que se refere atmosfera da capital de So Paulo, aps realizarem amostragens
durante o perodo-de um ano e em diversas localidades. '
Deve-se salientar que as diferenas observadas entre esses diversos dados
disponveis na literatura so devidas s prprias caractersticas do fenmeno, conforme discutido anteriormente, mas tambm em virtude do emprego de diferentes
rnetodologias na quantificao.
Quanto s dimenses dos microrganismos suspensos no ar, pode-se considerar corno representativos valores da ordem de 0,5 a 1,0 !JID, ou seja, dimenses de
bactrias ou seus esporos. Por outro lado, as partculas de poeira, que freqentemente transportam os microrganismos, apresentam dimetros freqentemente superiores a 4 J.liD, sendo que os esporos normalmente no esto associados a estas
partculas de poeira. 4

5.3 - Amestradores
A determinao da concentrao de microrganismos suspensos no ar atmosfrico realizada atravs do uso de dispositivos designados genericamente por
arnostnidores. Esses instrumentos no so apenas importantes por realizarem essa
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66

Esterilizao de ar

tarefa, como tambm so empregados para a verificao da efetiva esterilizao


do ar destinado ao processo, ou na quantificao de eventuais contaminantes e.m
reas ditas estreis (salas de cirurgia).
Essas so as razes pelas quais reveste-se de importncia o conhecimento de
alguns detalhes sobre .os tipos de amestradores que podem ser empregados, assim
como sua forma de operao e limitaes.
De uma forma geral, todos os amestradores operam de maneira semelhante,
pois o princpio bsico deles consiste em reter, de alguma forma, os microrganismos suspensos em um determinado volume de ar, dando-se, a seguir, condies
para que estas clulas proliferem, de maneira a tornar possvel a contagem de colnias, para a quantificao dos contaminantes no volume de ar amostrado.
Tendo em vista essa descrio geral, pode-se concluir que:
a) dependendo da forma empregada para reter os microrganismos, no se
pode assegurar que esta reteno seja total, podendo-se inclusive imaginar que
haja distintas eficincias de coleta para diferentes amestradores;
b) ainda na dependncia da forma de reter os microrganismos, pode-se tambm imaginar a possibilidade da ocorrncia de destruio de certas espcies;
c) lembrando que clulas microbianas suspensas no ar podem estar associadas a partculas de poeira, podendo ocorrer a existncia de mais que uma clula
por partcula, por mais que se busque desagregar estes conjuntos, sempre difcil
afirmar que uma colnia tenha tido, obrigatoriamente, origem em uma nica clula. Essa , inclusive, a razo pela qual os resultados so freqentemente expressos
em nmero de partculas, ou de nmero de colnias por unidade de volume de ar
amostrado;
d) conforme indicado, a etapa final da determino consiste em contar colnias que se desenvolveram em um dado meio de cultura e, tendo em vista a
grande variedade de microrganismos suspensos no ar, torna-se difcil eleger um
meio no qual se possa afirmar que todas as espcies se desenvolvam em um dado
intervalo de tempo.

Uma primeira conseqncia dos fatos acima apontados/ reside n<J'dificuldade em comparar resultados obtidos pelo uso de diferentes amestradores, ou com
um mesmo amestrador~ porm operado de formas distintas.
Outra conseqncia clara a impossibilidade de se obter a concentrao, total ou absoluta, de microrganismos suspensos no ar atmosfrico.
Uma forma de minorar esses problemas, especialmente quando se deseja
efetuar testes de efetividade de esterilizao de um dado sistema, por exemplo de
um dado filtro, consiste em preparar uma suspenso de um dado microrganismo
em ar, previamente submetido esterilizao. Esse ar, artificialmente contaminado com o microrganismo usado como marcador, passado atravs do filtro, determinando-se a concentrao (ou o nmero) de microrganismos no ar antes e aps o
elemento filtrante, desde que tambm se conhea o volume de ar amostrado, medindo-se a vazo de ar e o tempo do ensaio. Pode-se assim quantificar a eficincia
de reteno (TJ) do filtro em teste:
. TJ =

~N

z X 100

. (5.1)

Nl
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- .... ..... ... ...___.il

Amestradores

67

onde: N 1 =concentrao de microrganismos no ar antes da passagem pelo filtro


.(partculas ou colnias por unidade de volume) e
N 2 = concentrao de microrganismos no ar aps a passagem pelo filtro,_
(partculas ou colnias por unidade de volume).
.
O fato de se conhecer o microrganismo empregado para esse tipo de determinao, significa que se conhece perfeitamente o aspecto dl.s colnias que se
quer contar (formato, apar&ncia, cor), alm de se conhecer o meio de cultura e as
condies mais adequadas para a sua proliferao.
Vrios microrganismos tm sido empregados para a realizao desses testes,
tais como Serratia marcescens,S Pseudomonas diminuta 6'7 e esporos de Bacillus subtilis
var. niger. 4 Obviamente esses microrganismos so de pequenas dimenses, como
o caso do Pseudomonas diminuta, que apresenta dimetros de 0,3 por 0,8 J.Lm. 7
Pretende-se, a eguir, apresentar algumas caractersticas de alguns amostradores mais freqentemente empregados. Convm salientar que na literatura h a
descrio de um nmero elevado de amostradores, sendo freqente que um pesquisador, ao trabalhar sobre. o tema, acabe por desenvolver o seu prprio sistema,
ou propondo variaes sobre os existentes. Isso resulta na gerao de dados que
so de difcil comparao, a no ser que se empregue sistema idntico.

5.3.1 - I!Tlpinger
O impinger um dos amostradores mais conhecidos e sobre o qual h inuitas referncias. Existem, inclusive, inmeras verses desse amostrador, sendo um
exemplo tpico o indicado na Figura 5.1, extr_ada do trabalho de TYLER; SHIPE, 8
sendo conhecido como "all-glass impinger" (AGI).

13cm

Figura 5.1 - "All-glass impinger" (AGI). (I) Entrada do ar; (2) Sada do ar (bomba de vcuo).
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68

Esterilizao de ar

Esse amostrador consta de um recipiente de vidro que contm 10 mL do lquido coletor, que pode ser gua destilada, ou determinadas solues como a soluo gelatina-fosfato, constituda de gelatina (2 g/L) e Na 2HPQ4 (4 g/L), qual se
adiciona 0,01 mL de leo de oliva esterilizado, a fim de evitar a formao de espuma. Antes do incio da amostragem, todo o conjunto deve ser esterilizado.
Ao se iniciar a amostragem do ar, liga-se a abertura 2, indicada na Figura
5.1, a uma bomba de vcuo, de forina a reduzir a presso no interior do recipiente.
Dessa forma, o ar entrar no amostrador atravs da abertura 1, borbulhando no lquido coletor atravs do tubo de vidro, o qual capilar em sua parte final para
gerar bolhas de pequeno dimetro. Espera-se, portanto, que os microrganismos
existentes no ar fiquem retidos no lquido.
Terminada a tomada de amostra, o frasco agitado, a fim de promover a desagregao dos eventuais aglomerados de clulas, determinando-se, ento, a concentrao de microrganismos no lquido coletor, atravs dos mtodos usuais de
diluies e contagem de colnias em placas.
Conhecendo-se a vazo de ar e o tempo de amostragem, conhece-se o volume de ar amostrado, tendo-se, portanto, todos os dados necessrios para o clculo
da concentrao de microrganismos neste ar.
Uma das vantagens desse amostrador consiste no fato de Iio ser necessrio
o uso de medidor de vazo de ar, uma vez executada a calibrao do aparelho,
pois o tubo capilar funciona como um "orifcio crtico". Essa expresso "orifcio
crtico" significa uma condio de trabalho na qual a relao entre as presses reinantes nas extremidades do tubo capilar suficiente para produzir velocidade do
ar igual do som. Essa velocidade no mais ultrapassada, mesmo que a presso
do lado do vcuo diminua ou oscile abaixo desse valor crtico. Para o ar, a relao
de presses de 0,53, significando que se a amostragem for efetuada de um ambiente presso de 1 atm, a presso do lado do vcuo dever ser inferior a 0,53 atm,
podendo inclusive oscilar entre valores abaixo deste e, mesmo assim,' a vazo permanecer constante. 9 Assim, uma vez construdo o instrumento, ele deve ser submetido a uma calibrao, para se conhecer a vazo de ar que ele pe/mite, com a
devida preciso.
No caso do AGI utilizado por TYLER; SHIPE, 8 a vazo de ar era de 12,5 L/min
e a distncia da extremidade livre do capilar ao fundo do frasco era de 4 mm. Esse
impinger apresentou uma eficincia de reteno de esporos de Bacillus subtilis superior a 99%, em comparao com os dados obtidos com um amostrador de algodo (vide a seguir) considerado como absoluto, apesar de se saber que ocorre
destruio de clulas neste tipo de amostrador.
Em vista desses fatos, os mesmos autores puderam imaginar que haveria reteno de microrganismos no tubo de admisso de ar, assim como poderia ocorrer
a destruio de clulas, em virtude da excessiva velocidade com que as partculas
so lanadas no meio, podendo, inclusive, haver choque contra o fundo do frasco.
Para demonstrar a ocorrncia de reteno no tubo de admisso 'do ar, TYLER
et al. 10 empregaram aerossol contendo cristal violeta, sendo que aps certo tempo
de amostragem efetuavam uma lavagem no tubo de admisso, determinando a
concentrao daquele corante atravs de um colormetro. Demonstraram que no

Amostradores

69

apenas ocorre essa reteno, como tambm que ela depende do tamanho da partcula, observando que para partculas de 20 Jlm ocorre praticamente reteno total.
Um dos mtodos empregados pelos autores para a determinao da destruio de clulas vegetativas durante a amostragem, consistiu no uso de clulas
marcadas radiativamente. Para tanto, usaram uma suspenso de Serratia marcescens previamente cultivada em meio glicosado contendo fsforo ou enxofre radioativos. Aps a amostragen( determinavam o nmero de partculas no lquido
coletor atravs de um contador Geiger e as clulas viveis pela tcnica usual de
contagem de colnias em placas.
Uma vez constatados esses problemas com o AGI, SHIPE et al. 11 desenvolveram um outro tipo de amestrador, que recebeu a designao de amestrador Shipe,
indicado na Figura 5.2.
2

Figura 5.2 - Amostrador Shipe. (I) Oriffcio crtico (entrada do ar); (2) sada do ar (bomba de vcuo).

11

Esse outro tipo de instrumento consiste em um erlenmeyer de 125 mL, sendo


a entradado ar feita atravs de um "orifcio crtico". Ele opera de forma similar ao
AGI, colocando-se no erlenmeyer 25 mL do lquido coletor e ligando-se a sada de
ar a uma bomba de vcuo. Devido entrada do ar em alta velocidade ser efetuada
na superfcie do lquido, isto provoca um movimento circular do lquido coletor,
sendo importante a localizao do orifcio de entrada, a fim de evitar uma excessiva umidificao das paredes do frasco.

70

Esterilizao de ar

Como se pode observar, o amostrador Shipe no conta com o tubo de entrada, e ainda lana as partculas contra a superfcie do lquido coletor que est em
movimento. Isso evita a mencionada reteno e tambm reduz :a possibilidade de
destruio de clulas vegetativas, sendo que testes comparativos indicaram cerca
de 23% a mais de clulas viveis no amostrador Shipe, em relao ao valor obtido
no AGI.
Os detalhes expostos acima servem para ilustrar os cuidados na construo e operao desses amostradores, para se poder obter resultados satisfatrios e reprodutveis, mesmo no caso de se utilizar aerossis contendo clulas
conhecidas.

5.3.2 - Amostragem por filtrao


Existem vrios amostradores cujo princpio bsico da amostragem a filtrao, sendo, portanto, distintos dos amostradores mencionados. Consistem em fazer
passar o ar atravs de um elemento filtrante, o qual dever reter os microrganismos
suspensos. Posteriormente, pode-se colocar esse material filtrante em suspenso em
um volume conhecido de um lquido adequado, procedendo-se a uma agitao vigorosa, a fim de propiciar a passagem dos microrganismos retidos para o lquido.
Finalmente, efetua-se a determinao da concentrao de microrganismos no lquido, pelas tcnicas usuais de diluies e contagem em placas. Conhecendo-se o volume de lquido sabe-se o nmero total de microrganismos retidos e, novamente,
conhecendo-se a vazo do ar amostrado e o tempo de amostragem, tm-se todos os
elementos para o clculo da concentrao de clulas no ar.
Alternativamente, pode-se aps a passagem do ar atravs do elemento filtrante dar condies para que as clulas proliferem no prprio coletor; efetuando-se ento a contagem de colnias. Esse procedimento, quando possvel, evita o trabalho
adicional de suspender as clulas em um lquido para posterior contagem.
Um amostrador tpico dessa categoria o amostrador de algodo, esquematizado na Figura 5.3. Aps a sua montagem ele deve ser submetido a esterilizao,
preferencialmente por meio de calor seco (estufa), a fim de evitar o umedecimento
das fibras e a conseqente perda de eficincia de reteno de microrganismos.
A amostragem realizada conectando-se a extremidade 2 (Fig. 5.3) a uma
bomba de vcuo, intercalando-se um sistema para a medida da vazo de ar. Aps o
tempo de amostragem, o chumao de algodo retirado do amostrador e assepticamente transferido para um recipiente contendo um volume conhecido de gua esterilizada. Procede-se, ento, a uma vigorosa agitao, objetivando a passagem dos
microrganismos retidos nas fibras para o lquido, efetuando-se a determinao da
concentrao de microrganismos no lquido por contagem de colnias em placas.
Esse amostriidor apresenta uma srie de inconvenientes, como a dificuldade
em suspender os microrganismos retidos, alm de provocar a destruio de clulas vegetativas, conforme apontado por TYLER; SHIPE.8 Alternativamente pode~se
eiilpregar l de! vidro, mas de ' qualquer maneira a obteno de altas eficincias de
coleta depende de se ter o material fltrante muito bem compactado, de forma a se
observar uma perda de carga, no leito filtrante, relativamente elevada e da ordem
de 0,5 kg* /em.

-~- ----- ----__.

Amestradores

71

13 em

Figura 5.3 - Amostrador de algodo. (I) Entrada do ar; (2) Safda do ar (bomba de vcuo).

Uma forma mais conveniente de se efetuar amostragens por filtrao consiste no emprego do amostrador proposto pela Millipore Ind. e Com. Ltda. Esse
amostrador consiste em urri suporte em ao inoxidvel, o qual abriga membranas
Millipore de 4Zmm de dimetro e poros de 0,22 J..lm ou 0,8 J..lm, devendo ser previamente esterilizado. O sistema dispe de uma bomba de vcuo, que succiona o
ar, obrigando-o a passar atravs da membrana e t:mbm atravs de um orifcio
crtico,. a .Jim de se ter uma vazo constante e conhecida. Terminada a amostragem, a membrana deve ser retirada assepticamente e colocada sobre a superfcie
de um meio de cultura em pequenas placas de Petri. Aps tempo adequado de incubao, contam-se as colnias que aparecem sobre a membrana, obtendo-se, assim, a concentrao de microrganismos no ar amostrado. PARIS et al} cujos
resultados foram meru::ionados anteriormente, efetuaram determinaes com o
emprego desse tipo
amostrador.
Ao que tudo indica, o desenvolvimento de amostradotes que operam por filtrao atravs de membranas, teve seu incio com o trabalho de TQRLONI;
BORZANI,12 empregando um sistema cujo elemento filtrante qmsistia em papelfiltro Whatman 40 e 42. Esse original sistema, esquematizado na Figura 5.4, era
constitudo de um funil de alumnio, ao qual se adapta uma folha de papel-filtro
apoiado em uma grade de ao inoxidvel. Entre a grade e a folha de papel colo
ca-se uma camada de algodo hidrfilo.

de

72

.Esterilizao de ar

entrada __
do ar

Figura 5.4 - Amostrador de papel filtro.

12

Aps a esterilizao do sistema, ao se efetuar a passagem de ar atravs da


folha de papel-filtro, o que poderia ser feito acoplando-se um segundo cone aps
o elemento filtrante e este ligado a um orifcio crtico e a uma bomba de vcuo, os
microrganismos devem ficar retidos sobre esta folha. Terminada a amostrl,gem, o
sistema pode ser desmontado, adicionando-se a seguir um meio de cultura ao algodo hidrfilo, de forma a permitir, aps um certo perodo de incubao, a contagem de colnias surgidas na superfcie do papel-filtro.
A partir dos resultados obtidos pelos mencionados pesquisadores, 12 com o
amostrador proposto pode-se estimar a concentrao de microrganismos no ar atmosfrico da cidade de So Paulo como estando entre 4 a 6x10 3 partcttlas/m3, valor este perfeitamente de acordo com os dados anteriormente mencionados.

5.3.3 - Amestradores de fenda ou orifcio


O princpio bsico de funcionamento desses amostradores consiste em se fa- .
zer com que o ar amostrado incida, a uma dada velocidade, sobre a superfcie de
um meio de cultura slido, havendo, em virtude de uma brusca mudana de direo do ar, o choque das partculas suspensas que no acompanham as linhas de
corrente, ocasionando a reteno destas partculas nesta superfcie.
A Figura 5.5 mostra esquematicamente o amostrador de fenda desenvolvido
por Bourdillon e descrito por TORLONI. 9 Como se nota, consta de uma placa de Petri, contendo um meio de cultura slido preso a um disco horizontal giratrio, estando todo este conjunto no interior de uma caixa metlica, provida de uma janela
que permite fechament hermtico. O ar entra por um tubo vertical que possui, na
extremidade inferior, uma fenda atravs da qual as partculas em suspenso no ar

Amestradores

73

so lanadas contra a superfcie coletora. Uma vez esterilizado todo o conjunto, a


sada de ar conectada a uma bomba de vcuo, intercalando-se um sistema para a
medida da vazo de ar.

!
3

Figura 5.5 - Amostradorde fenda. (I) Placa de Petri; (2) Disco giratrio; (3) Tubo e fenda (entrada do ar); (4) Sada
do ar para o medidor de vazo e bomba de vcuo; (5) Caixa metlica.

Durante o perodo de amostragem, o disco gira com velocidade angular regulvel, em funo da contaminao do ar que se est tomando como amostra, podendo-se imaginar valores desde 0,1 rpm at cerca de 2 rpm.
Aps a amostragem, a placa de Petri retirada do amestrador, fechada em
condies de assepsia e incubada. Decorrido um intervalo de tempo adequado,
conta-se -o nmero de colnias que parecem sobre o meio de cultura. Conhecendo-se a velocidade de rotao da placa; a vazo de ar e o nmero de colnias sobre
o meio, ou parte de sua superfcie, tm-se todos os elementos para quantificar a
contaminao do ar amostrado.
Note-se que no h como proceder desagregao dos aglomerados de clulas, o que tambm ocorre com os sistemas, anteriormente descritos, nos quais se
efetua a contagem diretamente sobre a superfcie coletora. Isso significa que cuidados devem ser observados, especialmente quando se trabalha com aerossis de
microrganismos definidos, a fim de evitar a presena de aglomerados, que podem
ser aleatoriamente desfeitos sobre a superfcie coletora durante a amostragem, gerando contagens igualmente aleatrias.
Os autores tambm indicaram que a eficincia de reteno de aerossis depende da vazo do ar, assim como da distncia da fenda ao meio de cultura. De-'
terminaram um valor mximo de 95% de reteno, quando empregavam vazes
superiores a 28 L/mine 2 mm de distncia da fenda ao meio. Essa reteno dimi-----------

74

Esterilizao de ar

nua sensivelmente quando se reduzia a vazo do ar, sendo que obtiveram retenes inferiores a: 70%, operando corri urna vazo da ordem de 56 L/rnin e urna
distncia de 6 rnrn entre a fenda e o meio slido.

Para amostragens muito prolongadas pode ocorrer ainda o inconveniente da


perda de gua do meio de cultura slido, com a conseqente abertura de fendas
no meio, o que inutilizaria o ensaio efetuado.
Apesar dos inconvenientes e cuidados apontados no que se refere a esse tipo
de arnostrador, ele apresenta certas vantagens sobre os demais. De fato, pode-se
imaginar a realizao de teste de um determinado sistema para a esterilizao do
ar, corno por exemplo o teste de um determinado material filtrante, determinando
de forma contnua a eficincia de esterilizao ao longo do tempo de operao do
sistema. Pelo emprego de urna suspenso de um dado microrganismo conhecido,
marca-se no meio de cultura a posio da fenda no instante inicial. Aps a incubao, pode-se proceder contagem do nmero de colnias existentes em determinados setores da placa, os quais correspondero a certos intervalos de tempo
conhecidos, desde que se conhea a velocidade de rotao da placa. Corno se conhece a vazo, sabe-se o volume de ar amostrado em cada setor da placa e, portanto, a
correspondente concentrao de microrganismos no ar que passou pelo elemento
filtrante em teste. Pode-se, assim, determinar a variao da eficincia de reteno
em funo do tempo de amostragem, ou de operao do sistema de esterilizao.
evidente que outros amestradores tambm perrni~ern esse tipo de determinao, porm executada de forma intermitente, pois a cada amostragem h a necessidade de substituio do sistema de coleta do arnostrador, para a realizao da
contagem de partculas. No caso do arnostrador em questo, isso:no necessrio,
bastando providenciar a substituio da placa, aps um giro completo, por outra
esterilizada.
Na verdade, esses testes de sistemas de esterilizao de ar, destinados a processos ferrnentativos, so de grande importncia, tendo em vista a ne~ssidade de
alta confiabilidade.
Um sistema desse tipo foi empregado por AIBA et al.,5' 13' 14 para a realizao
de testes em filtros de materiais fibrosos e filtros de placas porosas, empregando
porm um orifcio no lugar de urna fenda. Na Figura 5.6 encontra-se esquematizado o sistema empregado pelos mencionados pesquisadores, observando-se que o
ar passa por medidores de vazo e, aps a nebulizao de urna suspenso do microrganismo utilizado corno marcador (no caso Serratia marcescens), ele vai para os
amestradores. Quando a vlvula A estiver aberta, a B deve estar fechada, efetuando-se, nestas condies, a determinao da concentrao de microrganismos no ar
a ser filtrado. Feito isso fecha-se o registro A e abre-se oB, perrnitindo~se que o ar
atravesse o filtro.
Encontram-se naliteratura vrios outros esquemas imaginados para a realizao de testes de efetividade de sistemas para a esterilizao do arY15 Deve-se,
no entanto, acrescentar que testes em linha deveriam ser executados, efetuando-se
amostragens peridicas, ou at mesmo contnuas, de ar esterilizado ao longo do

Mtodos para a esterilizao de ar

75

tempo em que o processo fermentativo esteja ocorrendo, a fim de verificar a eficincia da esterilizao do ar, tendo em vista os altos custos envolvidos na perda
de partidas em virtude de contaminaes. Isso normalmente no realizado, assim como outras medidas nessa direo, o que torna sempre muito difcil a descoberta das causas de contaminaes em processos.

Derivao
para ensaio
em branco

Cmara
de vidro
esterilizada

Placa de Petri

t
Rotmetro
Termmetro de
bulbo sec'o
e mido
Compre~
de ar

Rotmetro

----.....L.-_....:;;._ __.

Figura 5.6 - Sistema de teste de materiais filtrantes , empregando

u~ amestrador de fenda.5

5.4 - Mtodos para a esterilizao de ar


A esterilizao de ar pode ser realizada por diversos processos. No entanto,
a filtrao , sem dvida, a soluo mais conveniente, motivo pelo qual se dar a
ela maior nfase . .

5.4.1 - Esterilizao por aquecimento


Sabe-se que a resistncia destruio de microrganismos, quando submetidos ao calor seco, bem superior quando comparada resistncia ao calor mido.
Por esse motivo, a esterilizao do ar pelo calor seco exige temperaturas relativamente elevadas, assim como tempos de permanncia nestas temperaturas tambm
elevados. Ainda, o transporte de microrganismos por partculas slidas de poeira,
em virtude da possibilidade de alguma proteo trmica, acaba contribuindo para
a necessidade de condies de esterilizao mais drsticas.

76

Esterilizao de ar

Quando se raciocina em termos de aplicao industrial, constituda de reatores de grande porte, h a necessidade de vazes de ar bastante elevadas (observe o
que foi descrito na Introduo). Isso dificulta imaginar o aquecimento de todo
esse ar para atingir essas elevadas temperaturas, assim como impossvel projetar
tubos de reteno ou de espera suficientemente longos, a fim de se contar com os
tempos de residncia prolongados a essas temperaturas.
Devido a esses problemas, a esterilizao de ar por calor seco encontra apenas aplicao para pequenas instalaes, como caso da esterilizao do ar para
equipamentos de laboratrio ou escala piloto. Acrescente-se, ainda, que com o
surgimento de sistemas de esterilizao muito confiveis, como o caso das membranas filtrantes (vide adiante), a esterilizao por aquecimento tornou-se alternativa muito pouco utilizada.
Para se ter uma idia mais concreta a respeito da possibilidade do uso dessa
tcnica, pode-se citar o trabalho de DECKER et al./ 6 que determinaram as condies de esterilizao, trabalhando com esporos de Bacillus globigii e usando um esterilizador de ar por resistores eltricos. Os resultados obtidos pelos citados
pesquisadores encontram-se na Tabela 5.1.
Tabela 5.1 -

Esterilizao de ar por calor seco. Ensaios com esporos de Bacillus globigii.


Temperatura CC)

Tempo de permanncia* (s)

218

24

246

10

274

..

300
:;;;...-~

*Para destruio superior a 99,9999%

l:a'ltl.oi."

o.:

r.

-~

).~

-~

3
r:~

16

Conforme pode ser observado, apenas temperaturas relativamente elevadas


permitem tempos de exposio da o:r:.d em de alguns segundos, o que claramente limita a utilizao dessa tcnica, em se tratando de elevadas vazes de ar.
Em virtude da facilidade de construo e de controle, a esterilizao de ar
por aquecimento atravs de resistores eltricos ainda encontra possveis aplicaes, para o caso de ar de exausto de cmaras asspticas, especialmente quando
se trabalha com microrganismos patognicos, ou para o fornecimento de ar esterilizado para instalaes de laboratrio ou plantas piloto de pequenas dimenses.
O processo consiste em forar a passagem do ar atravs de resistores eltricos, onde o ar aquecido e, atravs de sistema adequado, obrig-lo a permanecer
o tempo necessrio a altas temperaturas. Um exemplo desse tipo de equipamento
7
o proposto pela New Brunswick Sei. Co./ que permite vazes de at 200 litros
de ar/min, o que poderia satisfazer a necessidade de um reator de 100 litros aerado com at 2 min. tambm possvel esterilizar o ar que sai do reator, fazendo-o
passar por um segundo sistema, o que pode ser de interesse quando se trabalha
com patognicos.

--------~- --~

Mtodos para a esterilizao de ar

77

Na Figura 5.7 encontra-se um desenho esquemtico de um equipamento desse


tipo, observando-se que o ar ao entrar no sistema preaquecido pelo ar que deixa o
equipamento, sendo, a seguir, conduzido para o contato direto com os resistores,
atingindo temperaturas da ordem de 370C. O ar esterilizado, alm de trocar calor
com o ar que entra, ainda resfriado por gua em uma serpentina adicional.

Resistncias

Controle de
temperatura

Resfriamento

Sada de a=r--~

Figura .S.7 - Equipamento para a esterilizao de ar por aquecimento atravs de resistores eltricos.

17

Todo o trajeto do ar deve ser inicialmente esterilizado por vapor. Quando


em operao, o sistema controlado por pa res termeltricos que comandam vlvulas solenides, que apenas permitem a passagem do ar para o. tanque, ou a descarga de gases para a atmosfera, caso a temperatura das cmaras de esterilizao
_se mantenha em valores adequados.
Um aspecto interessante a ser abordado neste momento, em se tratando de
reatores de grande porte, diz respeito necessidade de se comprimir o ar que en2
viado aos reatores, at presses efetivas da ordem de 3 kg* I cm , a fim de vencer
uma srie de perdas de carga como a existente nos filtros para a esterilizao do
ar, no dispersar do ar no fundo do reator, altura da coluna lquida de meio de cultivo e a sobrepresso mantida na "cabea" do reator (da ordem de 0,2 a 0,5
kg* /em\ a fim de evitar a entrada do ar ambiente que proporcionaria contaminaes (entende-se por "cabea" do reator o volume interno acima do lquido) .
........._____

... .

- ----- - -----------

------ - . __ __,_ ---. -- -- - -- -- ---- ----- ----- ---------

78

Esterilizao de ar

Essa compresso obrigatria do ar provoca inevitavelmente um aquecimento do ar, atingindo-se valores que no so desprezveis. Assim, um compressores~
tacionrio, tipo helicoidal, provoca, para uma vazo de ar de 170 m 3 /min e
descarga a 3 kglcm 2, um aquecimento do ar de 20C a cerca de 180C, alm de ser
necessria uma certa filtrao do ar, na entrada do compressor, para evitar um
maior desgaste de suas partes mveis.
Justamente por esse motivo necessria a instalao de um sistema deresfriamento do ar aps a compresso, para evitar a circulao do ar aquecido, assim
como evitar a introduo de ar quente nos reatores, o que complicaria o controle
de temperatura, alm de possivelmente causar gradientes de temperatura ao longo da altura da coluna lquida em fermentao : Esse resfriamento efetuado logo
sada do compressor, de forma que o ar permanece aquecido por um pequeno
intervalo de tempo (freqentemente inferior a 1 segundo).
Conforme j mencionado, temperaturas inferiores a 200C so pouco efetivas para a obteno de ar esterilizado. Sabe-se, no entanto, que as temperaturas citadas so suficientes para inativar clulas vegetativas, apesar do baixo tempo de
permanncia, restando desta maneira os esporos e as clulas que possam estar
protegidas de alguma forma . Por outro lado, caso se imaginasseatingir temperaturas da ordem de 300C, a fim de obter ar esterilizado em poucos segundos de
permanncia (videTab. 5.1), significaria, dependendo do tipo de compressor e da
vazo de ar necessria, comprimir o ar a presses bem mais elevadas (da ordem
de 10 a 12 kg* I cm2 ), o que traria um encarecimento ex~essivo tanto do equipamento, quanto no que se refere ao consumo de energia, no sendo portanto uma soluo de interesse.
PARIS et ai} efetuaram a determinao da concentrao de microrganismos
aps a compresso e o resfriamento do ar, determinaes estas efetuadas em uma
instalao industrial dotada de um compressor helicoidal, operando, vazo de
145m3 lmin e presso de descarga de 2,5 kg* I cm2, o que permitia atingir cerca de
160C. Esses autores obtiveram valores mdios da ordem de 1 a 2 partculas/m3 .
Assim sendo, a reduo observada . extremamente significativa, quando
comparada ao valor da concentrao de microrganismos suspensos no ar (vide
item 5.2), o que sugere que o ar, aps a compresso em instalaes de grande porte, deve ser manuseado com certos cuidados, tendo em vista sua razovel desinfeco, evitando~se que novamente venha a ser contaminado pelo ar atmosfrico.
Outra sugesto seria efetuar, quando possvel, o resfriamento do ar ein local n\ais
prximo de sua utilizao final e no imediatamente aps a compresso, aumentando-se o tempo de residncia a altas temperaturas.
Existe, inclusive, meno na literatura a respeito da conduo de processos
fermentativos com sucesso, sem a presena de sistemas para a esterilizao do ar,
contando-se apenas com essa destruio de contaminantes durante a compresso.18 Isso, de forma alguma, deve significar que essa idia deva ser generalizada e
que seriam dispensveis os sistemas adicionais para a esterilizao do ar, especialmente quando se est diante de processos de longa durao e empregando condies e meios de cultivo pouco seletivos. _
- ~---

------ ______

_....

Mtodos para a esterilizao de ar

79

5.4.2 - Esterilizao por radiaes


Teoricamente, muitos tipos de radiaes podem ser utilizadas para a esterilizao do ar. Entretanto, o emprego de urna determinada radiao deve levar em
conta urna srie de importantes fatores, tais corno: a eficincia na destruio de
microrganismos, o custo envolvido na obteno da radiao, a periculosidade ou
os efeitos colaterais de sua '.Itilizao. Assim excluem-se para esse tipo de aplicao as partculas a., prtons e nutrons, por serem excessivamente dispendiosos
quanto sua obteno e aplicao prtica, o mesmo ocorrendo com as radiaes y.
Quando se visa a esterilizao de ar, apenas as radiaes ultravioleta encontram aplicao prtica. Em virtude de seu baixo poder de penetrao, os raios ultravioleta necessitam de tempos de exposio relativamente longos, fato este que,
novamente, impede o uso deste tipo de radiao para a esterilizao de ar para um
processo ferrnentativo.
Em se tratando do fornecimento de ar esterilizado para cmaras asspticas,
imaginou-se instalar lmpadas ultravioleta em certos trechos do duto que leva o
ar para a cmara. No entanto, mesmo para esse caso, dependendo das dimenses
dessa cmara, as vazes de ar j podem ser muito elevadas, no permitindo tempo
suficiente de exposio ao ultravioleta, havendo, assim, a necessidade da instalao de sistemas adicionais (filtros) para a efetiva esterilizao do ar.
Com freqncia observa-se a i'nstalaode lmpadas ultravioleta no interior
de salas asspticas, especialmente sobre os locais de trabalho, visando a esterilizao do ar circundante e das superfcies das mesas e instrumentos empregados (por
exemplo, no preenchimento assptico de medicamentos). Corno o ar que se introduz nessas cmaras previamente esterilizado e corno se procl,lra manter o ar o
menos movimentado possvel, o emprego da radiao ultravioleta, para este caso,
mais efetivo.

5.4.3 :. .: Esterilizao por filtrao


A esterilizao do ar por filtrao , sem dvida, a soluo mais adequada
para a obteno de altas vazes de ar esterilizado, em virtude dos baixos custos
envolvidos nesta operao, alm de se dispor, presentemente, de filtros bastante
confiveis. Por esses motivos, a filtrao encontrada em praticamente todas as
instalaes industriais, tendo tambm dominado as aplicaes em instalaes de
pequeno porte, corno o caso de instalaes piloto ou de laboratrio.
Historicamente, muitos materiais filtrantes foram empregados, tais corno
carvo, algodo ou papel. Posteriormente esses materiais foram substitudos por
outros materiais fibrosos, corno o caso de filtros de l de vidro. Estes ltimos encontraram enorme aplicao, constituindo-se na soluo mais adequada at rneados .ou o final da dcada de 70.
Mesmo no incio dos anos 70 surgiram os filtros de materiais sinterizados,
corno o vidro, metais (bronze, ao ,inoxidvel) e materiais cermicos, aparecendo
tambm os filtros de membranas ou placas porosas de materiais polirnricos, tais
corno o nilon, o teflon ou steres de celulose.

80

Esterilizao de ar

De fato, era possvel prever, em meados da dcada de 70, que os filtros de


membranas polirnricas porosas poderiam dominar essa operao/ 9 o que de fato
acabou ocorrendo, havendo urna gradual substituio dos filtr.os de l de vidro
pelos filtros de membranas hidrofbicas, especialmente a partir de meados da dcada de 80.
Mencionando-se o passado e o presente, poder-se-ia tambm imaginar que,
no futuro, possivelmente se passe a empregar membranas seletivas, ou seja, membranas que alm de esterilizar o gs a ser introduzido no reator, tambm possam
provocar um enriquecimento do gs em oxignio. 20 Na verdade, o principal objetivo da aerao, em reatores aerados e agitados, consiste na transferncia do oxignio da fase gasosa para a fase lquida, no tendo sentido a introduo no reator de
enormes quantidades de nitrognio. Assim, o uso de membranas polimricas
(corno o polietileno ou o silicone), alm do possvel emprego de membranas lquidas, poder significar um enorme avano nesse campo, corno j ocorre presentemente no cultivo de clulas animais.
Antes de se passar ao detalhamento dos filtros disponveis, convm alertar
q'!le, qualquer que seja o sistema de esterilizao do ar que se pretenda empregar,
deve-se prever um filtro para cada reator, no se devendo optar, no projeto da instalao, por um sistema centralizado de esterilizao, seguido da distribuio do
ar para os vrios reatores. Esse procedimento centralizado no conveniente, independentemente das dimenses dos reatores e, portanto, das vazes de ar necessrias, pois coloca-se em risco todo o conjunto de reatores, caso ocorra a falha do
sistern de filtrao. A eventual economia que se possa fazer, quanto ao investimento inicial, no justifica o risco que se ir correr ao longo da operao da planta.

5.4.3.1 - Filtros de materiais fibrosos


Apesar de se observar urna aplicao industrial menos intensa, os filtros de
materiais fibrosos, particularmente os filtros de l de vidro, ainda so ,encontrados
em algumas instalaesi razo pela qual sero descritos no presente item.
Nesses filtros observa-se que os poros ou interstcios e~.1tre as firtras, atravs
dos quais ocorre a passagem do ar, so de dimenses maiores do que o dimetro
das fibras, empregando-se normalmente fibras com dimetro mdio da ordem de
3 f.lnl, ou at mesmo fibras de 19 f.lnl.
Por esse motivo a reteno dos microrganismos suspensos no ar no ocorre
apenas por impacto direto, ou reteno mecnica, havendo a participao de diver-
sos outros mecanismos para a observada eficincia global da camada fibrosa filtrante.19Tarnbrn por essa razo a operao designada corno filtrao em profundidade, pois as partculas so retidas ao longo de toda a altura da camada filtrante.
Na Figura 5.8 encontra-se o desenho esquemtico de um filtro de l de vidro, assim corno alguns detalhes necessrios para sua instalao.
Corno se observa, consiste simplesmente num recipiente, normalmente em
ao inoxidvel, com dimenses da ordem de 2 a 3 rn de altura e 1 a 1,5 rn de dimetro, dimenses estas que so variveis, dependendo da quantidade de l de vidro que deve acomodar. Na parte inferior conecta-se a tubulao de entrada do ar
e, na partesuperior, a de sada para o ferrnentador.
.

--~ - -

____.

-- ---.- .. - .. __

Mtodos para a esterilizao de ar

81

Ar

esterilizado

Entrada
do ar

Salda de
condensados .

Figura 5.8 - Esquema de um filtro tradicional de l de vidro para a esterilizao do ar.

A camada filtrante ocupa a parte central do recipiente, apresentando dimenses variveis dependendo de uma srie de fatores, tais como vazo de ar e dimetro do recipiente (a eficinia de coleta de aerossis depende da velocidade de
passagem do ar atravs do leito filtrante e, portanto, depende da vazo do ar e do
dimetro do recipiente), compactao da camada filtrante (massa de fibras novolume de filtrao), dimetro da fibra e eficincia de reteno desejada. 19 Apenas
para se ter uma idia a respeito da espessura de um leito filtrante desse tipo, podem-se mencionar alturas da ordem de 1,3 a 1,8 m .
A camada de l de vidro sustentada por uma grade de ferro e comprimida
por uma segund~_ grade, colocada na parte superior da camada filtrante . Aps o
preenchimento do recipiente com a l de vidro, coloca-se a tampa que veda perfeitamente o sistema. Nessa tampa existem hastes que servem para fixar a grade superior, impedindo que ocorra a movimentao da camada filtrante, quando
submetida a elevadas vazes de ar.
O preenchimento do filtro com a l de vidro deve ser feito de forma muito
cuidadosa, procurando-se distribu-la uniformemente em todo o volume disponvel, buscando evitar a ocorrncia de zonas contendo menos fibras, o que propiciar a formao de caminhos preferenciais para a passagem do ar. Obviamente esses
caminhos preferenciais, com menor perda de carga, podero comprometer a eficincia do filtro. Nesse sentido, um cuidado todo especial deve ser dedicado
zona prxima s paredes do recipiente, local especialmente propcio para a formao destes caminhos preferenciais.

Justamente para diminuir a possibilidade de formao de cminhos preferenciais, busca-se trabalhar com camadas filtrantes bastante compactadas e, por isso
mesmo, de menor espessura (menor altura da camada filtrante). Ainda, no caso de
serem necessrias camadas filttantes muito espessas, pode-se providenciar a colocao de grades intermedirias ao longo da altura do leito filtrante .

......_______ - - - -- -- --- ---- ~ ~---------------~------~----~------------~.-------------

82

I
!

j_

Esterilizao de ar

A fim de evitar o deslocamento de fibras, h a possibilidade do uso de l de


vidro embebida em resinas e cornpactada em mantas de pequena espessura (por
exemplo, mantas de cerca de 0,5 em de espessura). O emprego dessas mantas torna o leito filtrante bem menos espesso, em virtude da maior compactao, obtendo-se urna camada filtrante bem mais regular.
Essas mantas so colocadas em recipientes corno o esquematizado na Figura
5.8, se bem que de menores dimenses, sendo tambm comprimidas corno no caso
anterior. Para evitar o problema da zona perifrica, existem sistemas de vedao
atravs de flanges, de forma a impedir a passagem do ar.
Quando se trabalha com filtros de l de vidro, sempre se busca fazer com
que o ar passe atravs da camada filtrante a urna temperatura superior ambiente, de forma a manter a camada aquecida e evitar a condensao de umidade. Sabe-se que urna camada fibrosa umedecida apresenta urna menor eficincia de
reteno de aerossis, provavelmente em virtude de urna menor contribuio do
rnecani~rno de reteno devido atrao eletrosttica (cargas eltricas distintas
entre aerossis e as fibras, causando atrao que contribui para o choque das partculas contra as fibras e sua reteno).
Por esse motivo, o ar aquecido pela compresso normalmente resfriado de
forma a passar pelo leito filtrante a 40 ou 50C. Alternativamente pode existir na
parte inferior do recipiente, que contm o leito filtrante, um conjunto de resistores
eltricos, com a finalidade de aquecer o ar. Esses resistores podem tambm ser
empregados para a esterilizao do filtro por calor seco, empregando-se, para esta
finalidade, temperaturas da ordem de 180 a 200C durante 2 horas.
Corno seria de se esperar, antes de iniciar o fornecimento de ar para o reator,
o filtro deve ser submetido a urna esterilizao, a fim de evitar que microrganismos aderidos s fibras possam ser arrastados para o tanque.
Apesar de existir a possibilidade de executar essa esterilizao por calor
seco, conforme mencionado acima, o que evita o umedecimento das fibras, na
maioria das instalaes esta operao executada atravs de vapor saturado,
empregando-se vapor a urna presso efetiva de 1 kg* I crn 2 durante 2 h, ou vapor
a 3 kg* I crn 2 durante 1 h. Nesse caso~ fecha-se a comunicao entre o filtro e o reator e o registro de entrada do ar, introduzindo-se o vapor pela parte superior do
recipiente (vide Fig. 5.8), deixando-se o registro de sada de condensados inicialmente aberto. Aps a completa expulso do ar, operao esta de fundamental
importncia para o sucesso da esterilizao, fecha-se esse ltimo registro, permitindo que as condies mencionadas sejam atingidas.
Terminada a esterilizao, passa'-se ar aquecido atravs da camada filtrante,
a fim de secar completamente b leito fibroso, obtendo-se desta forma o filtro erri
condies de operao.
A esterilizao pelo vapor pode causar urna certa contrao do leito filtrante; especialmente no caso de filtros cjue tenham sido pouco cornpactados. Para
esse caso, antes de iniciar o fornecimento de ar estril para o processo, convm
proceder-se abertura do recipiente e observao da camada, cornpletando.;se
com quantidade adicional de l de vidro, caso seja necessrio. Obviamente o filtro

deve ser submetido a urna nova esterilizao.

Mtodos para a esterilizao de ar

83

Alm desse problema, existem outros associados ao uso de vapor. Normalmente o filtro deve ser esterilizado ao final de cada processo fermentativo, de forma a se iniciar o processo seguinte em perfeitas condies de segurana. Com isso
os filtros so esterilizados com muita freqncia (da ordem de uma vez por semana), ocorrendo uma deteriorao da l de vidro, a qual vai se tornando opaca e
quebradia, havendo um ntido aumento da perda de carga e diminuio da eficincia de coleta da camaida filtrante (formao de canais preferenciais). Esses fatos tambm ocorrem com as fibras impregnadas com resinas.
A ocorrncia de fibras quebradias causa tambm o arraste de pequenos pedaos de fibras, juntamente com a corrente de ar. A perda de eficincia, o aumento
da perda de carga e esse arraste, obrigam a se providenciar a troca completa da camada filtrante aps algum tempo de operao. Esse tempo depende das condies
de utilizao do filtro, mas pode-se citar, como intervalo razovel, a troca do leito
filtrante a cada 4 meses, quando se executa uma esterilizao do filtro por semana.
Essa operao de troca do material filtrante sempre complicada na indstria, pois, como se deve contar com um filtro para cada reator e freqentemente
dispe-se de vrios reatores, se estar manuseando l de vidro com muita freqncia, o que no apreciado pelos operrios incumbidos desta tarefa, aumentando as possibilidades de uma operao no adequada, o que coloca em risco a
conduo assptica do processo.
Todos esses problemas permitiram o surgimento de filtros mais adequados,
no caso os filtros de membranas polimricas~ porosas, que sero abordados no item
seguinte. Tais filtros encontram hoje grande aplicao, conforme j salientado anteriormente .
.Por essa razo no se pretende, no presente texto, apresentar mais detalhes
sobre os vrios mecanismos de coleta de aerossis por materiais fibrosos, assim
como no sero detalhad'os os procedimentos para o dimensionamento dos filtros
de l de vidro. Tais detalhes podem ser encontrados, caso o leitor tenha necessidade, no texto anterior a respeito desse tema. 19

5.4.3.2 - Filtros de membranas


Os filtros de membranas microporosas, elaboradas a partir de materiais polimricos, em geral apresentando carac.t ersticas hidrofbicas, pr>porcionam areteno dos aerossis microbianos na superfcie do elemento filtrante, havendo
portanto a reteno apenas por impacto qireto das partculas contra o filtro, o qual
apresenta poros de dimenses menores do que os microrganismos a serem retidos. Normalmenteutilizam-se membranas com poros de 0,2 ou 0,22 ~m, ou ainda
membranas de 0,45 ~m. Essa a razo pela qual esses filtros so tambm chamados de filtros absolutos.
Na realidade, no incio do surgimento de alternativas aos filtros de materiais
fibrosos, uma srie de outros materiais foram empregados, como o caso de metais
sinterizados (como o bronze e o ao inoxidvel), materiais cermicos e vidro sinterizado. No entanto, com o decorrer do tempo; praticamente os materiais polimricos dominaram esse tipo de aplicao, encontrando-se especialmente filtros
esterilizantes elaborados a partir do politetrafluoretileno (PTFE _,__ "teflon"). 21

-----

..

------------- -,---- --- -.---.-- ---.. .. .

84

Esterilizao de ar

O emprego de materiais polimricos hidrofbicos aspecto de importncia,


pois estes filtros tambm devem ser esterilizados por vapor, antes do incio da
operao de esterilizao d_o ar, havendo ainda a possibilldade da presena de
umidade no ar a ser esterilizado.-Assim; essa gua no deve permanecer no filtro,
pois isto poderia causar o crescimento de microrganismos na superfcie do elemento filtrante, colocando em risco a obteno de ar esterilizado, alm de provocar um certo bloqueio passagem do ar pelos poros, o que significaria um
aumento inconveniente da perda de carga.6
Normalmente, esses filtros so fornecidos na forma de discos, ou, mais freqentemente, para o caso de filtros para a esterilizao do ar para instalaes de
grande porte, na forma de cartuchos contendo a membrana filtrante montada so~
bre uma estrutura de polipropileno. A Figura 5.9 ilustra a proposta desses filtros
na forma de discos ou, cartuchos.

'

Figura 5.9 - Filtros de membranas polimricas mieroporosas(gentileza de CUNO INC. - Com. lntertech do Brasil

Ltda.)
~
. ~ ---- ---~-

______ _______ _
.

:..

.,.

~-.- -

- --- ---- -------

Mtodos para a esterilizao de ar

85

Conforme se pode observar, os elementos filtrantes so acomodados no interior de recipientes em ao inoxidvel, sendo que estes recipientes so construdos
a fim de abrigar um nmero varivel de elementos esterilizantes e, ainda, de dimenses distintas. Como se nota na Figura 5.9, o recipiente maior destinado a
abrigar vrios cartuchos, cada um deles montados unindo-se trs cartuchos de
25,4 em (10") de comprimento. O ar entra e sai pela parte inferior do recipiente,
sendo que a entrada feita pela parte externa dos cartuchos, sendo o ar forado a
atravessar o elemento filtrante, saindo pela parte interna dos cartuchos.
Tratando-se de filtros absolutos, em princpio, a reteno dos microrganismos independe da velocidade de passagem do ar, ao contrrio dos filtros de camadas fibrosas, mas o aumento da velocidade superficial do ar acarreta um
aumento da perda de carga no elemento filtrante. Alm disso, velocidades excessivas podem provocar vibraes inconvenientes, compromtendo os sistemas de
vedao.
O dimensionamento de um sistema: de filtrao tarefa bastante simplificada, pois sabendo-se a vazo mxima de ar a ser empregada no processo (lembrando sempre a necessidade de se prever .um filtro para cada reator), pode-se
especificar um ntJ.mero adequado de elementos filtrantes (cartuchos), que devero
ser acomodados no filtro, definindo desta forma uma rea adequada de passagem
deste ar, a fim de se ter baixa velocidade superficial e, portanto, baixa perda de
carga no filtro (lembrando, tambm, que a presso do ar, na descarga do compressor, deve ser suficiente para vencer a coluna:. lquida no interior do reator, a sobrepresso na cabea do reator e, ainda, as perdas de carga distribudas nas vlvulas
e tubulaes). Dessa forma, essa perda de presso no filtro deve ser a mnima possvel, atravs da manuteno de v~locidades relativamente baixas (Q = V5 .S, onde:
Q=vazo de ar, V5 =velocidade superficial do ar e S=rea do(s) elemento(s) filtrante(s) para a passagem do ar).
As vrias empresas capacitadas para fornecerem esse tipo de filtro j dispem de propostas adequadas para as necessida~es de uma determinada planta,
indicando-se nas Figuras 5.10 e 5.il alguns dados a respeito desta perda de presso, em funo da vazo de ar, para elementos filtrantes de 25 em (10") ou 100 em

(40") de comprimento, respectivamente. 22


Conforme fica evidente nessas figuras, as perdas de carga so realmente reduzidas, e o aumento do comprimento do elemento filtrante, o que significa aumentar a rea de passagem do ar, permite o emprego de vazes mais elevadas
com menores perdas de carga. Observa-se, tambm, em ambas as figuras, que um
aumento da presso de entrada do ar para uma mesma vazo, acarreta uma menor
perda de presso, o que devido a um aumento da densidade do gs com o aumento da presso.
A Figura 5.12 permite uma idia simplificada a respeito da forma de instalar
um filtro de membrana em uma linha de fornecimento de ar esterilizado para .um
biorreator. Normalmente, com a finalidade de aumentar a vida til do filtro, sugere-se a instalao de pr-filtros, construdos com materiais mais grosseiros e de
baixo custo, a fim de retirar do ar partculas de poeira de maiores dimenses .

...________

--

---~---------~--,--.----~-~----- ----

- - --- - - -

86

Esterilizao de ar

Perda de carga (mbar)

600

r-------~~~------~----------------.

500
400
300
200
100

50

100

150

200

250

Vazao de ar (Nm

300

%>

350

400

Figura 5.1 O - Perda de carga em funo da vazo de ar (expressa em metros cbicos de ar, nas condies normais,
2
por hora), para filtro tipo cartucho de I O", da Millipore Co.

400

Perda de carga (mbar)

300

200

100

tO O

200

300

400

Vaza o de ar (Nm

500

600

%>

700

800

Figura 5.11 - Perda de carga em funo da vazo de ar, para fiH:ro tipo cartucho de 40" de comprimento, da Millipore~.n

Como se pode observar, deve-se prever a entrada de vapor a fim de esterilizar o filtro, devendo este vapor ser devidamente filtrado, para evitar o acmulo
de slidos na superfCie do elemento filtrante. Nos instantes iniciais, a vlvula de
dreno do recipiente que contm o filtro (detalhe 1 na Fig. 5.12), deve ser mantida
aberta para a expulso do ar, para que se possa atingir a temperatura adequada de
esterilizao. Tambm, aps a esterilizao, passa-se ar peio sistema, permitindo
que este ar saia pelo dreno de linha (detalhe 2 na Fig. 5.12), a fim de drenar a gua
que tenha ficado retida. Finalmente, pode-se fechar esse dreno e abrir a vlvula
que comunica o filtro com o reator.
o

Mtodos para a esterilizao de ar

87

Vlvula

Reator
FiHro
absoluto

Figura 5.12 - Esquema geral para a instalao de um filtro de membrana polimrica (absoluto).

No se procede esterilizao de pr-filtros.


Os filtros existentes no mercado so bastante resistentes esterilizao, havendo menes da possibilidade de efetuar algo como 150 esterilizaes a 145C
por 30 min. Novamente, supondo-se a execuo de uma esterilizao por semana,
isto significaria algo como 3 anos de operao. No entanto, encontram-se sugestes na literatura6' 15'23 segundo as quais se deve providenciar a troca dos elementos
filtrantes uma vez por ano, o que significaria algo como 50 esterilizaes. Claramente h a possibilidade de operaes mais prolongadas, mas deve ocorrer um
aumento da perda de presso nos elementos filtrantes, aumento este que depende
da qualidade do ar que chega membrana esterilizante.
A troca dos elementos esterilizantes muito simples, . requerendo pouco
tempo para a sua realizao. No entanto, tal operao deve ser efetuada com todo
cuidado, a fim de no se ,danificar a membrana filtrante, alm de posicionar adequadamente os anis de vedao do sistema. Aps a operao de troca de cartuchos, deve-se efetuar testes de manuteno de presso interna, a fim de verificar a
existncia de vazamentos, assim como recomendvel a realizao de testes de
efetiva obteno de ar esterilizado, atravs do uso de amostradores.
As diversas empresas fornecedoras desse tipo de filtros, normalmente garantem a integridade dos seus produtos, pois efetuam testes antes da entrega do
material, de forma que falhas eventuais, mais freqentemente, so atribudas a um
manuseio no adequado dos elementos filtrantes.
5.4.3.3 - Filtros HEPA
Os filtros HEP A ("High Efficiency Particulate Air") so os filtros especialmente empregados em cmaras asspticas, ou reas limpas. So placas de acetato
de celulose, apresentando 24 uma eficincia de 99,97% na remoo de partculas de
dimetro mdio 0,3 ,.tm, ou ainda elaborados a partir de fibra de vidro, apresentando21 eficincia superior a 99,97% na remoo de partculas superiores a 0,5 ,.tm.
Normalmente esses filtros so montados com vrios elementos filtrantes separados por folhas de alumnio, de forma a se obter uma grande rea para a passa-

88

Esterilizao de ar

gem do ar e, desta forma, possibilitar o uso de ventiladores, evitando a necessidade


de compressores, em virtude da baixa perda de presso atravs do leito filtrante .
Conforme salientado, esses filtros so empregados especialmente em cmaras asspticas, registrando-se que presentemente predominam as chamadas
cmaras de fluxo laminar, ou seja, cmaras nas quais a velocidade de circulao
do ar baixa, de forma a se contar com um fluxo em regime laminar. Dessa forma,
imagina-se que os contaminantes gerados no interior da cmara possam ser retirados deste ambiente pelo prprio fluxo de ar, impedindo que um fluxo turbulento
possa causar um acmulo de contaminantes.
Um exemplo de uma cmara desse tipo est indicado na Figura 5.13, a
qual ilustra um sistema com circulao vertical de ar. O ar penetra pelo teto da
cmara, saindo pelo piso da mesma, circulando a uma velocidade da ordem de
50 cm/s. 24
filtro HEPA

ventilador

grade

pr-filtro

ventilador

24

Figura 5. 13 - Cmara assptica com fluxo laminar vertical de ar.

Existem muitas outras idias a respeito do assunto, conforme o tipo de trabalho a ser executado. Assim, existem cmaras de fluxo horizontal, nas quais o ar
entra por uma das paredes e sai pelo lado oposto.
Em uma cmara de fluxo laminar, no se deve contar com a presena de um
nmero exagerado de equipamentos, ou mesmo de pessoas circulando, pois fcil
compreender que qualquer obstculo provoca turbilhes no ar, no se obtendo um
fluxo em uma determinada direo.
Por esse motivo, nas cmaras onde se execut a embalagem de produtos
com assepsia, no se podeimaginr um fluxo laminar em toda a cmara, em virtude de suas dimenses. Em alguns casos, tanto quanto possvel, introduz-se no interior de uma cmara convencional, no local onde se executa uma determinada
operao mais delicada, um gabinete ou capela de fluxo laminar, o que torna a
operao mais segura.
Tais capelas de fluxo laminar de ar, So presentemente muito comuns em laboratrios que manuseiam culturas puras de microrganismos, ou mesmo para a
-- - - - - - - - - - - - - - - ; --

-- - .--

- - - - - .-'--------------- --___,.

Mtodos para a esterilizao de ar

89

execuo de transferncias de meios de cultura previamente submetidos esterilizao. Na Figura 5.14 indica-se um esquema geral de uma capela desse tipo. 24
Em instantes anteriores utilizao da capela, recomenda-se efetuar uma
desinfeco das superfcies, empregando-se etanol ou outras solues desinfetantes, permitindo-se ainda que a capela permanea fechada durante algum tempo e,
adicionalmente, ligando-se uma lmpada ultravioleta para a desinfeco do seu
interior. Ao iniciar a oper~o assptica, desliga-se a lmpada ultravioleta, aciona-se a circulao do ar, tomando-se sempre a precauo de evitar um excesso de
movimentao no interior da capela.
O conceito de fluxo laminar encontrou vrias aplicaes, havendo diferentes
sistemas operando em distintas condies, como o caso de operar com velocidades de circulao do ar muito baixas, da ordem de 0,1 m/s e at 0,075 m/s. 25
ventilador

vidraa
corredia

ventilador
Figura 5.14 - Capela de fluxo laminar.

24

Pode-se, inclusive, contar com cmaras de fluxo laminar portteis, ou seja,


que podem ser facilmente deslocadas pp.ra locais da indstria onde seja necessria
uma dada operao assptica. Essas cmaras so fechadas por uma cortina de material plstico, havendo no teto um sistema de distribuio do ar. Esse ar fornecido por uma unidade colocada ao lado da cabine, unidade esta que contm o filtro
HEPA. Dessa forma o ar circula verticalmente, saindo pela parte de baixo das cortinas. Quando adequadamente operados, esses sistemas portteis permitem a obteno de ambientes protegidos, em princpio em qualquer lugar da indstria.

...._____

.. - - - ..

---------------- -

----------- --------

----

- ... ... .

90

Esterilizao de ar

5.5 - Consideraes finais


Conforme descrito anteriormente, a esterilizao do ar para processos ferrnentativos que exigem urna rigorosa conduo em condies de assepsia, sem dvida encontrou soluo mais adequada com o surgimento dos filtros de
membranas polirnricas hidrofbicas, que substituram os filtros de l de vidro
anteriormente empregados.
No entanto, . deve-se lembrar que esses filtros devem ser adequadamente
projetados, evitando-se o emprego de velocidades excessivas de ar atravs da
membrana esterilizante, a fim de se contar com baixas perdas de presso. Igualmente, deve haver todo o cuidado com a instalao, buscando urna efetiva vedao do sistema, para que no ocorra contato entre o ar esterilizado e o ar
atmosfrico (perfeita vedao do recipiente que contm os cartuchos, perfeita instalao dos cartuchos no recipiente, empregar cartuchos ntegros, utilizar registros apropriados no trajeto do ar esterilizado, etc.). sempre til o emprego de
pr-filtros, os quais devero ser substitudos com urna maior freqncia, a fim de
ampliar o tempo de operao da membrana esterilizante.
Deve-se, inclusive, lembrar que tanto os pr-filtros corno os filtros devero
ser substitudos, havendo a necessidade de um fcil acesso ao sistema, a fim de
que esta operao possa ser rpida e efetuada com segurana.
No caso dos processos ferrnentativos contnuos, nos quais espera-se operao ininterrupta por vrias semanas, interessante a instalao de dois filtros em
paralelo para cada reator. Dessa forma, pode-se providenciar a esterilizao de
um filtro aps certo tempo de operao (urna ou duas semanas, por exemplo), sem
interromper o processo.
Finalmente, cumpre destacar a expectativa do surgimento de novos materiais
que permitam: a operao de separao dos contarninantes do ar atrno~frieo, mas
tambm proporcionem um enriquecimento desse gs, permitindo a passagem preferencial do oxignio, o que j possvel conforme salientado no textt>; seria porm desejvel que pudessem ser aplicveis em instalaes de grande porte.

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L_ ___- - -- - -- -- ----------~--- -- ---------- --,---------------- ------- - - --- ------ -----------,-- ---- - - -

.,., ..

----- ----- ~ - ____.

93

Haroldo Hiss

6.1 - Introduo
O estudo cintico de um processo fermentativo consiste inicialmente na anlise da evoluo dos valores de concentrao de um ou mais componentes do sistema de cultivo, em funo do tempo de (ermentao. Entende-se como componentes, o microrganismo (ou a biomassa), os produtos do metabolismo (ou metablitos) e os nutrientes ou substratos que compem o meio de cultura.
Tais valores experimentais de concentrao (X, P e S respectivamente),
quando representados em funo do tempo, permitiro os traados das curvas de
ajuste, conforme ilustrad'o na Figura 6.1 e indicados por X=X(t), P=P(t) e S=S(t).

Xo
So

~~~~------~--~

~,

.. o

Figura 6.1 - Curvas de ajuste dos resultados de uma experincia idealizada de fermentao. X, P e S so as concentraes do microrganismo, do produto e do substrato residual no meio, respectivamente.
~------------ -

---

----- ~ ----

--

----- --- - - ---

94

Cintica de processos fermentativos

Dentre os produtos formados, escolhe-se para o estudo cintico, o produto


de interesse econmico. Quanto aos substratos, adota-se o denominado substrato
limitante (comentado no subitem 6.2.3).
Quando as concluses sobre um cultivo forem baseadas unicamente em dois
valores de X, S 0\1 P (como comum, por exemplo, sobre valores finais e iniciais),
no se pode afirmar que um estudo cintico do processo tenha sido realizado;
necessrio, outrossim, o conhecimento dos valores intermedirios, que permitam
definir os perfis dts curvas ou a forma matemtica destas, para uma anlise adequada do fenmeno sob o ponto de vista cintico.
Assim, tais perfis representam o ponto de partida para a descrio quantitativa de uma fermentao como, por exemplo, a identificto da durao do processo, geralmente baseada no instante em que X e P apresentam valores mximos
(Xm e Prrv na Fig. 6.1).
Uma vez que esses valores representam parte de um conjunto de dados, necessrios ao dimensionamento de uma instalao produtiva, fica evidente que sem
o conhecimento da cintica torna-se invivel a transposio de um experimento de
laboratrio para a escala industrial.
Alm desse aspecto, cabe mencionar que a cintica possibilita tambm uma
comparao quantitativa entre as diferentes condies de cultivo (pH, temperatura, etc.), por intermdio de variveis, como: as velocidades de transformao (subitem 6.2.1) e os fatores de converso (subitem 6.2.3), obtidos tambm a partir das
curvas de ajuste X = X (t), P = P (t) e S =S (t).
Afirmar que um determinado valor de pH, por exemplo, melhor que um
outro, equivale a dizer que o fator de converso (substrato em produto, por ~xem
plo) maior no primeiro que no segundo caso. O mesmo pode ser afirmado quan~
do se comparam os desempenhos de cultivos sob diferentes temperaturas,
diferentes variedades de uma dada espcie de microrganismo, diferentes composies de meio, etc.
Convm frisar, entretanto, que os critrios de comparao entre diferentes
condies so relativos, isto , dependem do que se espera obter de um determinado processo fermentativo. Assim, quando o tempo de durao da fermentao for
de primordial importncia por razes econmicas, as produtividades (subitem
6.2.1) devem ser empregadas como referncias numricas, em vez de algum fator
de converso.
Outro aspecto que merece ateno que os mtodos comumente utilizdos
para a medida da concentrao celular X, a saber: turbidimetria ou espectro~oto
metria, biomassa seca, nmero total de clulas, nmero de clulas viveis ou unidades formadoras de colnias, volume do sedimento obtido por centrifugao,
teor de um componente celular etc., representam uma informao muito simples
do que ocorre em um fenmeno biolgico.
O microrganismo ou agente ativo promove a transformao dos componentes do meio em produtos, graas s atividades de milhares de enzimas que, por
sua vez, so sintetizadas pelo prprio microrganismo. Sendo essas snteses controladas pelo meio externo (fenmenos de induo e represso), torna-se.assim muito
difcil, seno impossvel, identificar qual medida ou medidas so realmente representativas da transformao em estudo.

Parmetros de transformao

95

Essa dificuldade ocorre mesmo nos sistemas mais homogneos, quando o


meio de fermentao for lmpido, com as clulas isoladas umas das outras e quando s uma dada espcie de microrganismo estiver suspensa no meio aquoso.
A questo se complica ainda mais quando o sistema for constitudo por uma
cultura mista e, alm disto, contiver slidos em suspenso (alm do microrganismo), como nos processos biolgicos de tratamento de resduos domsticos e industriais. Nesse caso, medidas de slidos suspensos volteis, durante tal processo,
so adotadas como uma avaliao indireta da biomassa presente. Os substratos a
serem decompostos so simplesmente avaliados pelas determinaes conhecidas
como demandas qumica e biolgica de oxignio (DQO e DBO, respectivamente).
Outros sistemas de fermentao, onde as medidas de biomassa so problemticas, compreendem: clulas suspensas em meio aquoso, porm sob forma de
flocos ou clulas filamentosas; clulas imobilizadas na superfcie de materiais
inertes ou biodegradveis contidas no biorreator; clulas na presena de meio, conhecido como semi-slido, onde a matria-prima constituda por .m,aterial amilceo, por exemplo. Neste ltimo caso, a presena do microrganismo, traduzida pela
concentrao de algum componente do mesmo (como protena total), no pode ser
interpretada como se a clula estivesse suspensa no meio aquoso.
Finalmente, se o material a ser transformado pelo microrganismo (substrato)
for parcialmente insolvel no meio aquoso, como hidrocarbonetos lquidos ou slidos, polmeros, minrios, etc., a concentrao do substrato no possui significado. Juntamente com essa varivel ser necessrio avaliar a rea de interface do
material insolvel com o meio aquoso, bem como a sua variao, medida que o
microrganismo promove a degradao do mesmo. Trata-se de um aspecto at agora no resolvido satisfatoriamente, a despeito de alguns mtodo's propostos. 1

6.2 -:-

Pa~metros

de transformao

6.2.1 - As velocidades instantneas de transformao


A Figura 6.1 ilustra as definies das velocidades instantneas de crescimento ou reproduo do microrganismo, consumo de substrato e formao de produto, traduzidas respectivamente pelas seguintes expresses, para um tempo t:

~ --

dX
dt

(6.1)

rx=-

(6.2)

dP
dt

(6.3)

fp = -

-- -----

-~ - -

-----

____

---- ----- -------- ___,

.:__ ___-- ....

--...--,.....-.-.-------------- - - --

----- ----~---- ---;---- ------- ------ -.:-

... - - --------------- --- ------------- .... - -.

-- - -- -- -

96

Cintica de processos fermentativos

Tais velocidades, traduzidas pelos valores das inclinaes das tangentes s


respectivas curvas (Fig. 6.1) so tambm conhecidas como velocidades volumtri3
cas de transformao, cujas unidades correspondem a (massa) x (comprimentor x
1
(tempor
No item 6.3 apresentado um exemplo de clculo dessas velocidades.
Uma definio especial de velocidade, cujo interesse prtico est na avaliao do desempenho de um processo fermentativo, a produtividade em biomassa, definida por:

- Xm -Xo
Px-

(6.4)

tf

Os termos dessa equao, definidos na Figura 6.1, mostram que a produtividade representa a velocidade mdia de crescimento referente ao tempo _total ou final de fermentao, tf.
A mesma definio pode ser aplicada concentrao do produto, denominada produtividade do produto:
(6.5)

onde tfp no necessariamente igual a tf. A concentrao inicial do produto geralmente desprezvel frente ao valor final ou mximo, Pm

6.2.2 - As velocidades especficas de transformao


Devido ao fato de que a concentrao microbiana X aumenta durante um
cultivo descontnuo, aumentando conseqentemente a concentrao do complexo
enzimtico responsvel pela transformao do substrato S no produto P, mais
lgico analisar os valores das velocidades instantneas (eqs. 6.6, 6.7 e 6.8) com relao referida concentrao microbiana, ou seja, especificando-as COwJll respeito
aovalor de X em um dado instante, conforme indicam as expresses:
(6.6)

(6.7)

___,.)= -1 dP(Jlp
--X dt

(6.8)

Essas so denominadas velocidades especficas de crescimento,_consumo de


substrato e formao de produto respectivamente, tendo sido GADEN 2 o autor
destas definies.
----~------------------------------~-~

Parmetros de transformao

97

6.2.3 - Os fatores de converso e os coeficientes especficos


de manuteno
Com referncia Figura 6.1, considerando um determinado tempo t de fermentao, os correspondentes valores de X, Se P podem ser relacionados entre si,
atravs dos fatores de converso definidos por:
~

'

~ ~~ ~ -X -Xo
~,,~,."'::is -s

,J
"'-

Yfti>
=
" '))!_

X-X

(6.9)
'

(6.10)

Y~'rs = - o
t'..t1;>_
5 -S

(6.11)

P-Po
P-P
0

Se tais fatores permanecerem constantes durante cultivo, o que no ocorre


com freqncia, as trs expresses ~nteriores podem ser aplicadas tambm no
tempo final de fermentao, ond ~-X~, ~~ S d , resultando:

(6.12)

- Xm -Xo
p -P

X/ P-

Yr;s

(6.13)

Pm -Po

(6.14)

so

Eliminando-se a grandeza X 0 , pela combinao das eqs. (6.9) e (6.12), obtm-se:


~

Yi!X:/S = x ms~x ..

(6.15)

'

como uma forma alternativa para a definio deste fator . A'eq: (6.15) poder ser
conveniente para a avaliao de Y X I S' tendo em vista que as medidas de
X 0 apresentam, na maioria dos casos, erros experimentais mais elev ados do
queXm:;
Entretanto, nem sempre o substrato se esgota completamente quando a concentrao celular apresentar seu valor mximo, podendo ainda existir uma

~mais

...___--:- --.---- --- ---.

------.,......------- - -~.:...---...,..-~-~- ....~---~--..-------------- -

----------------------------- -----.--- ------ ---

'

- - ------- --------- -- ------

98

,.
;

. Cintica de processos fennentativos

concentrao residual daquela sbstncia no meio de cultura, ao trmino da fermentao. Isso ocorre porque medida que o microrganismo se reproduz, so
formados produtos do metabolismo que inibem o crescimento celular, sem mencionar o prprio substrato, que pode dificultar a atividade microbiana (item 6.6).
O fator de converso Y XIS foi originalmente definido por MON00,3 tendo
sido til na anlise de alguns processos.como, por exemplo, na produo de protenas unicelulares a partir de carboidratos ou hidrocarbonetos. Desde que seu
valor seja conhecido, possvel calcular o valor de X, a partir de um valor conhecido de S e vice-versa.
Igualmente tl o emprego do referido fator na definio do substrato, denominado limitante.
Como o prprio nome indica, o valor da sua concentrao inicial S0 que
definir a concentrao mxima Xm da populao microbiana. Em outras palavras,
em uma outra experincia de um cultivo descontnuo, onde a concentrao S0 seja
inferior precedente, porm com concentraes idnticas dos demais componentes (incluindo a concentrao inicial da biomassa, X0 ), resultar um valor de Xm
proporcionalmente menor, no final do cultivo. '
Isso equivale a colocar a expresso (6.12) sob a forma:

r---.. . -....,.

\. .

---~ \~)= Yx;s S' + X 0

(6.16)

No decurso de um cultivo descontnuo, sob condies especiais (meio tamponado, concentrao de S no muito elevada, agitao perfeita do meio), possvel verificar experimentalmente a constncia do valor de Y XIS com o auxlio da
expresso (6.15) sob a forma:
----._,
.
.
(' (
., ~, . .
~- !
'E5\'xm\ Y XI S :,~ )
(6.17)
.._

--

, _.

"

.,

.'

Uma representao dos valores experimentais de X, em funo dos valores


experimentais de S, dever resultar em uma reta, com coeficiente angular igual
Y XIS e a ordenada na origem igual Xm.
As mesmas consideraes se aplicam aos demais fatores (eqs. 6.10 e 6.11).
Contudo, se Y XIS' Y XIP ou Y p IS no forem constantes, ento somente seus
valores instantneos devero ser levados em conta, ou seja:

dX

Yx;s =--

(6.18)

dX
Yx;P = dP

(6.19)

dP
Yp; s = - -

(6.20)

-S

-S

-- --- --.-

----------

99

Parmetros de transformao

Considerando as definies de velocidades (eqs. 6.1, 6.2 e 6.3) e velocidades


especficas (eqs. 6.6, 6.7 e 6.8), resultam as seguintes relaes:

rx
rs

Jlx

rx

(6.22)

rp

Jlx
Jlp

rp

Jlp

(6.23)

rs

Jls

(6.21)

Yx;s =.- = Jls

Yx; r = - = -

Yr; s = - = -.

Ainda, dessas expresses ou das igualdades (6.9),(6.10) e (6.11), tem-se:

y XI S

= y X/P . y P/ S

(6.24)

Em fermentaes industriais, dificilmente so observados valores constantes


desses fatores de converso. Embora dependam da espcie do microrganismo,
com relao a um determinado substrato, no dependem somente da natureza
deste; os demais componentes do meio tambm exercem influncia sobre tais converses, bem como o tempo de mistura e a transferncia de oxignio do sistema de
agitao do biorreator.3
Alm dessas influncias, h de se considerar o fenmeno em que as clulas
utilizam a energia de oxidao do substrato, no somente para o crescimento, mas
tambm para finalidades de maimteno.
Em outras palavras,' um determinado consumo de substrato (5 0 -S), no produzir sempre um aumento proporcional na biomassa (X-X0 ), sendo que uma
parcela da energia, proveniente daquele consumo, destinada manuteno das
funes vitais do microrganismo.
Essas funes vitais compreendem: o trabalho osmtico para manter os gradientes de concentrao de substncias entre o interior da clula e o seu meio ambiente, as modificaes de componentes celulares que requeiram energia e a mobilidade celular.
4
Esse conceito, introduzido por PIRT, atravs do consumo especfico para
manuteno m:

m = (rs)m

(6.25)
X
onde (rs)m a velocidade de consumo de substrato devida a manuteno, permite
combin-lo -c om o balano material

(6.26)
no que resulta

L ._. ... . . . . . . . . .. . . -.--------.---.--.---~---~----------~- . .---- ---------..------ - ----.__. . . . . . . . ._

I 00

Cintica de processos fermentativos

rs =(rs)c +m X

(6.27)

onde (r5)c se refere ao consumo do substrato, destinado somente ao crescimento


ou reproduo microbiana. r 5 o consumo global observado, tl como definido
pela expresso (6.2).
Com a definio de um novo fator de converso:

rx
,
Y. X/S = -

(6.28)

(rs)c

e sua introduo na eq. (6.27), tem-se


rs

rx

= - ,-+mX

(6.29)

Yx;s

ou, de acordo com as eqs. (6.6) e (6.7):


Jls

Jlx
=--+m
YX:;s

(6.30)

Note que se m=O, Y'x;s coincide com a definio de Yx;s da eq. (6.21). Esse
fator, definido pela eq. (6.28) algumas vezes denominado fator de converso
"verdadeiro".
Se Y'x;s em forem constantes, a relao entre Jls e Jlx dever ser linear. Esta
- nova definio do fator de converso, aliada ao coeficiente especfico de manuteno, mais geral do que a eq. (6.21), possibilitando assim que ~m maior nmero
de processos fermentativos apresentem valores constantes de Y'x;s em.
Uma generalizao mais ampla ainda, 5 pode ser introduzida no balano da
eq. (6.26), ao ser considerada mais uma parcela de consumo de substrilto, ou seja,
na formao de produto, (rg)p:
(6.31)

onde (rs)cp e (rs)!nP so as velocidades de consumo de substrato para o crescimento e manuteno, respectivamente levando em conta a formao de produto.
Introduzindo:
, - rp
Y P/S - - -

(6.32)

(rs}p

e um novo coeficiente especfico de manuteno

mp

(rs)mP
X

bem como um novo fator de converso para o crescimento

(6.33)

Clculos das velocidades

"
rx
Y XI S = - - -

I OI

(6.34)

(rs)cp

resulta, com a (6.31):

.
rx
rp
' 's =--+--+mp X
Yx;s

(6.35)

Yr;s

ou, com as equaes 6.6, 6.7 e 6.8:


f.lx
f.lr
f.ls =--+--+mp
Yx;s Yr;s

(6.36)

Uma regresso linear mltipla com trs variveis {f.ls, f.lx e f.! r) poder ser
verificada, se os fatores e o novo coeficiente mp forem constantes ou se este ltimo
for desprezvel.

Pode-se, enfim, estender o balano com a incluso de termos adicionais,


referentes a outros produtos do metabolismo (incluindo aqueles presentes nos
gases de sada do biorreator), cujos valores experimentais sejam conhecidos, resultando com isto novos valores dos fatores de converso e do coeficiente de
manuteno.
Do exposto, verifica-se assim que as concluses a respeito de um determinado cultivo dependem muito da quantidade de dados experimentais disponveis
sobre o sistema.

6.3 - Clculos das velocidades


Pelas definies apresentadas nos subitens 6.2.1 e 6.2.2, conclui-se que os
clculos das velcidades e velocidades especficas ' de transformao necessitam,
em primeiro lugar, dos traados das curvas a partir dos pontos experimentais (Fig.
6.1).

Esses traados ou ajustes podem ser realizados manualmente, com programas de computador ou atravs de curvas representadas por equaes conhecidas.
Iniciaremos pelas consideraes referentes aos traados manuais, ficando os
comentrios dos ajustes com equaes para o final deste item.
O traado manual exige um bom conhecimento do processo em estudo.
Como uma experi~ncia inicial, deve-se ter em mente que para um grande nmero
de casos os perfis apresentados na Figura 6.1 so caractersticos, isto , as curvas
de formao do microrganismo (X= X(t)) e do produto (P = P(t)) exibem a forma
"S" ou sigmoidal crescente, enquanto a do substrato residual no meio (S = S(t)) se
caracteriza pelo perfil em "S" decrescente.

~cu:::~~:;;~::~:_n_:_mx_:=,-~_~.:~~_:_:~;~~:~~::.ocoinci:r, isto,:m:s

I
l
!

_.J

I 02

Cintica de processos fermentativos

100+" - - -

40

80

20

::::J

s
0..

o
x

40
3

20
2

4
s 6
Tempo (h)

10

Figura 6.2 - Resultados obtidos em uma fermentao alcolica. S, concentrao de acar; P, concentrao de
etano!; X, concentrao de levedura (expressa em gramas de matria seca por litro), segundo BORZANI. 6

Para exemplificar o clculo das velocidades (eqs. 6.1, 6.2 e 6.3) e velocidades
especficas (expresses 6.6, 6.7 e 6.8), esto representados na Figura 6.2 os resultados experimentais obtidos em uma fermentao alcolica descontnua. 6
'
Para t = 5 horas, por exemplo, a velocidade de consumo de acar calculada pela inclinao da reta tangente AB curvaS= S(t), a saber:
_ dS = 100-70 = 30g I L = 7, 9 g I L. h
dt 7,1-3,3
3,8h

onde os valores numricos de cada parcela co.r respondem s coordenadas dos


pontos arbitrrios A e B, escolhidos sobre a reta.
De modo semelhante, para as velocidades de produo de etanol e crescimento da levedura, no instante t = 5 h tem-se, respectivamente:

dP = 20-0,0 =20giL = 4 ,0giLh


dt 8,3-3,3
5,0h

dX
dt

4,0-2,0
6,2-1,8

2 ,0giL =045 IL h
4 4h
g
I

calculadas com as coordenadas dos pontos arbitrrios sobre as retas C,D e E,F respectivamente.

A curva de cresdmento microbiano

I03

Por outro lado, para t = 5,0 h tem-se X= 3,5 g/L (Figura 6.2). Assim, os valo- res das velocidades especficas de consumo de acar, produo de etanol e crescimento da levedura, no instante t = 5 h, sero, respectivamente:

J.l. 5

= 7,9 =2 3h-1
i
3/5
I

-4,0 -llh-1

Jlp - 3,5-

- 0,45- o13h-1
e J.l.x- 3,5 - '

Esses clculos, aplicados em cada instante de fermentao, permitem determinar as formas das funes J.l.s = J.l.s (t), J.l.p = J.l.p (t) e J.l.x = J.l.x (t), cuja utilidade ser
comentada no item 6.5.
Cumpre frisar que o clculo das mesmas depende no somente dos ajustes
manuais efetuados (Fig. 6.2), mas tambm do traado das retas tangentes, em um
dado instante t do cultivo,
Essa ltima operao, to subjetiva quanto os ajustes manuais, pode ser efetuada por outros mtodos, que devem atenuar as discrepncias entre os resultados de clculo de um mesmo conjunto de dados experimentais, provenientes de
operadores diferentes.
O leitor interessado poder consultar a bibliografia especfica a respeito dos _
mtodos grficos para o traado das tangentes/o mtodo geomtrico 8 e os ajustes
baseados em equaes, cujas derivadas possibilitam tambm os clculos das velocidades de transformao e velocidades especficas.9' 10 Os critrios estatsticos
. para a escolha dessas equaes, 11 ' 12' 13 bem como os erros que afetam as medidas
dessas velocidades, 14' 15' 16 so encontrados na literatura.
No final deste captulo, encontra-se no Apndice um exemplo de clculo
atravs do mtodo geomtrico} com auxlio de uma planilha eletrnica.

6.4 - A curva de crescimento microbiano


Aps a inoculao de um meio de cultura, favorvel ao desenvolvimento do
em estudo, sob temperatura controlada e agitao adequada, observa-se um comportamento nos valores da concentrao celular, conforme indica
a Figura 6.3.
As seguintes fases no crescimento so observadas:
Fase 1 -Conhecida como fase "lag" ou de latncia, que se segue imediatamente aps a inoculao do meio com o microrganismo em questo. Trata-se de
um perodo de adaptao durante o qual a clula sintetiza as enzimas necessrias
ao metabolismo dos componentes presentes no meio.
Purante essa primeira fase, no h reproduo celular e, assim, X = X0 =
constante.
A durao dessa fase varia principalmente com a concentrao do inculo (e .
portanto com o valor de X0 ), com a idade do microrganismo (tempo de pr-cultivo) e com o seu estado fisiolgico.

mi~rorganismo

./

i-_-~ - - -- ---- ---- ----- - ---- --- -~ -----~~-- -----------'----~----------:- - - --------c~----------- ----- --- ---

--------------:--:----:-----

I 04

Cintica de processos fennentativos

X ..................................................
m

X .......................................
d

Xc ............................ .

X;,

Xo

2" i

xm <rr-"'---

xc : :

-~ r r
l

:~

.
B

+I
o

Figura 6.3 - Curva de crescimento do microrganismo em cultivo descontnuo, representada em ordenadas lineares
(A) e semilogartmica (8). As sete fases esto descritas no texto.

Com efeito, se as clulas forem pr-cultivadas em um meio de. composio


diferente, o tempo referente ao fenmeno de induo pod ser aprecivel; caso
.
.
contrrio, possvel que tal fase no exista.
Fase 2 -:- Essa a fase de transio (Fig. 6.3) em que se observa o incio da reproduo microbiana propriamente dita.
H um aumento gradual, tanto da velocidade de reproduo (eq. 6.1) como
da velocidade especfica de crescimento (eq. 6.6), onde nem todos os microrganismos completam a fase anterior simultaneamente. No fim dessa fase, a populao
inteira comea a se dividir em um intervalo regular mdio de tempo (eq. 6.41).
Fase 3 - denominada fase logartmica ou exponencial onde a velocidade
especfica de crescimento (J..tx =J..tm) constante e mxima. Nessas circunstncias, a
eq. 6.6 permite concluir que a velocidade de crescimento diretamente proporcional concentrao X, isto :

dX

-=J..t X
dt
m

(6.37)

A curva de crescimento microbiano

I O5

Uma integrao da equao 6.37, entre o incio dessa fase (de coordenadas
(ti, Xi), Fig. 6.3) e um instante arbitrrio t, compreendido entre ti e te resulta em:
'
X
ln11
o(t- t 1.o)
(6.38)
X - = rm
I

ou
(6.39)
Desse modo, pela expresso 6.38, uma representao sem:ilogartmica da
concentrao celular com o tempo de cultivo dever resultar em uma reta (Fig.
6.3.:B), vlida at te, tambm denominado tempo crtico.
Ao lado da velocidade especfica f.!m, a fase exponencial tambm caracteriz~~a freqentemente pelo tempo de ge:ao tg, que o intervalo de tempo necessano para dobrar o valor da concentraao celular.

Aplicando esta definio na eq. 6.38, tem-se:


2X
l n - -1
X-

:::::11

rm

t g

(6.40)

ou
ln2

0,693

tg

tg

(6.41)

f.!m=--=--

Da equao (6.41), conclui-se que o tempo de gerao constante, pelo fato


de f.!m ser constante nesta fase.
Para certas bactrias o tempo de gerao relativamente curto, como no
caso da Escherichia coli, que pode apresentar um valor da ordem de 20 minutos na
temperatura de cultivo em 37C. Outras bactrias, do tipo termfilas, cultivadas a
55C, chegam a apresentar um tempo de gerao de cerca de 15 minutos.
Para as leveduras, o valor mnimo est compreendido entre 1,5 e 2 horas.
Uma interpretao para a existncia da fase logartmica ou exponencial de .
crescimento, apresentada no subitem 6.6.1.
Fase 4 - Conhecida como fase linear de crescimento, por apresentar a veloci-
dade de reproduo constante(rx = rk, na eq. 6.1). Essa fase pode ocorrer sem a prvia existncia da fase logartmica, como o caso de microrganismos filamentosos,
onde h limitado no tfra~dsporh~ de nutrient~s ddo ~~i~pdara o inf terio(dr da cludla. d
1ntegran o a re en a equao a partu o rmcw essa ase e coor ena as
(te, Xc), Fig. 6.3) e um instante arbitrrio t, compreendido entre te e td, tein-se:

lo..__~- - - ....... --- -- .... - -------- -- .--------------- - ----------'------~---- ............ ............... ' .. ----... --- . .. - c ........ --- - - --

-- --- - - - - -

I
l

(64~-- J

I06

Cintica de processos fennentativos

ou
(6.43)
Da equao 6.43, deduz-se que a concentrao celular X uma funo linear
do tempo de cultivo t (Fig. 6.3-A), justificando-se assim a denominao de crescimento linear para esta fase.
Contrariamente fase exponencial antes comentada, a velocidade especfica
de crescimento no constante na fase linear, conforme se pode deduzir das equaes 6.6 e 6.43:

2_ dX=~=
X dt

rk
rk

t+Xc

-rk

(6.44)

te

De acordo com essa equao, a velocidade especfica decresce com o aumento da concentrao celular e, portanto, com o tempo t de cultivo.
A existncia do crescimento linear indica, conforme mencionado, a presena
de certas limitaes no transporte de nutrientes interface microrganismo-meio
como, por exemplo, com respeito ao oxignio dissolvido no meio.
REUSS e WAGNER10 verificaram que um aumento no coeficiente volumtri-
co de transferncia do oxignio dissolvido, entre o meio e a citada interface, provocava o desaparecimento do crescimento linear.
Outro caso de limitao do transporte de nutrientes ao microrganismo ocOrre quando este se desenvolve na forma de um biofilme, imobiliz~do na superfcie
da parede do reator, ou sobre partculas slidas em suspenso, empregadas como
suporte.
Modelos que interpretam o crescimento celular nesses _sistemas so encontrados na literatura.10

Fase 5 - Desacelerao. Devido ao esgotamento de um ou mais componentes


do meio de cultura, necessrios ao crescimento e, tambm, devido ao acmulo de
metablitos inibidores, ambas as velocidades (de crescimento, eq. 6.1 e especfica,
eq. 6.6) diminuem at se anularem, no tempo tf.
Durante essa fase, o tempo de gerao aumenta no decurso do cultivo, pois
nem todos os microrganismos se reproduzem em intervalos regulares de tempo.
Fase 6- Estacionria. Nessa fase, X atinge o valor mximo e constante Xm
(Fig. 6.3), onde h um balano entre a velocidade de crescimento e a velocidade de
morte do microrganismo, ocorrendo tambm modificaes na estrutura bioqumica da clula.
Fase 7- Declnio ou lise. O valor da concentrao celular dimiimi a uma velocidade que excede a velocidade de produo de clulas novas.
Pode-se observar, s vezes, entre a fase anterior e a de declnio, um perodo
de transio apresentando uma diminuio logartmica na referida concentrao. Ocorre, durante o declnio, uma "lise" celular, autlise ou rompimento dos
microrganismos, provocado pela ao de enzimas intracelulares.

Classificao dos processos fermentativos

I 07

6.5 - Classificao dos processos fermentativos


Os comportamentos relativos das funes f.1 = f.l(t), fornecem a base para
uma importante classificao dos processos fermentativos proposta por GADEN 2
(subitem 6.2.2).
As Figuras 6.4, 6.5 e 6.6 representam, esquematicamente, a variao das velocidades especficas para t;rs tipos caractersticos de fermentaes .
No primeiro caso (Fig. 6.4), as velocidades especficas de consumo de acar
(f.ls) ~a produo de etanol (f.lp), apresentam perfis semelhantes, correlacionando-se
assim muito bem. A veloc;idade especfica de crescimento (f.lx) do microrganismo
apresenta, aproximadamente, o andamento das outras duas curvas. Diz-se ento que
a formao de produto (o metablito primrio) est associada ao crescimento.
Essa configurao representa o caso em que o produto formado (o metablito primrio) est diretamente ligado s reaes do catabolismo ou decomposio
do substrato (os acares) .

Consumo de
acar

Crescimento
Tempo

Figura 6.4 - Variao das velocidades especficas em uma fermentao alcolica.

As produes de certas vitaminas e aminocidos tambm se enquadram nesse tipo de cintica de fermentao.
No segundo caso (Fig. 6.5), observam-se duas fases distintas: uma 1- fase,
onde a velocidade especfica de consumo do acar est diretamente relacionada
de crescimento do microrganismo, no havendo praticamente formao do produt~ (cido ctrico); uma segunda fase, em que h uma boa semelhana entre os perfs das trs velocidades especficas e que portanto se correlacionam bem. Esse o
caso conhecido como formao do produto parcialmente associada ao cresCimento; sua formao no est diretamente ligada ao caminho metablico produtor de
energ"ia.

. I 08

Gntica de processos fermentativos

Produo
de cido

&;::::

Q)

c.
C/)

Q)
Q)

-o
ro
-o
c:;

Tempo
Figura 6.5 - Variao das velocidades especficas em uma fermentao ctrica.

<+=
'
Q)

o.
Ul

Q)
Q)

'C
. lll
'C

"
o

Tempo
Figura 6.6 - Variao das velocidades especficas em uma fermentao penicilnica. Curva I -produo de antibitico; curva 2 - consumo de acar; curva 3 - consumo de oxignio; curva 4 - crescimento do microrganismo.

Alm da produo do cido Ctrico por fermentao, pode-se incluir a do cido ltico comopertencente a este grupo.
Neste particular foi obtida uma expresso emprica por LUEDEKING; PIRET/7 que relaCionaram a velocidade especfica de formao do cido ltico (J.lp),

Classificao dos processos fermentativos

I 09

com a velocidade especfica de crescimento do microrganismo (~x), na produo


descontnua desta substncia pelo Lactobacllus delbrueckii em pH consta_t1te, a saber:

.
Jlp=a~x+~

(6.45)

Essa equao, onde 0; e ~ so constantes empricas funes do pH, indica a


existncia de dois mecanismos de produo de cido ltico: um deles associado
reproduo de bactrias (representado pela parcela a ~ x) e outro independente
do crescimento do microrganismo (representado pelo termo~).
Finalmente, no terceiro caso, se enquadram as fermentaes complexas, aqui
exemplificadas pela produo de penicilina (Fig. 6.6). A mxima velocidade especfica de produo do antibitico ocorre quando as demais velocidades especficas, indicadas na Figura 6.6, sofreram uma reduo significativa. No comeo da
fermentao predominam transformaes produtoras de energia com formao de
biomassa, sendo que o antibitico formado quando o metabolismo oxidativo se
encontra atenuado.
Obviamente, nesse grupo de fermentaes no h uma associao clara entre as referidas velocidades que permita estabelecer alguma relao cintica definida, como no caso da eq. (6.45). O produto formado historicamente denominado como metablito secundrio.
Alm dos antibiticos, as toxinas microbianas pertencem a esse grupo.
importante frisar que esta classificao no enquadra, de um modo absoluto, um determinado processo fermehtativo em um dos trs grupos antes citados.
Como exemplo, merece ser comentado novamente o caso da fer~entao alcolica onde, dependendo das condies de operao, a produo do etanol poder no estar inteiramente associada reproduo do microrganismo e ao consumo
de acar, enquadrando-se' assim no segundo caso 18 (Fig. 6.5) em vez de no primeiro (Fig. 6.4).
Caso semelhante observado na produo do butanodiol por Klebsiella pneumoniae, em cultivo contnuo 19 a partir da glicose onde, dependendo do valor da velocidade especfica de crescimento (abaixo ou acima de 0,18 h-l),o processo do
tipo inteiramente associado ao crescimento ou independente do mesmo, respectivamente.
Outra classificao, baseada nas associaes entre formao do r,roduto com
mic~~mismos em reproduo ou no, devida a KONO; ASAI/0' 2 ' 22 que apresentam trs grupos caractersticos:
processos em que a formao de produto est associada apenas atividade de clulas em reproduo como, por exemplo, na produo de sorbose.
processos em que a formao de produto est associada atividade de todas as clulas, em reproduo ou no, citando-se como exemplo a produo de cido ltico.
processos em que a formao de produto est associada apenas atividade das clulas que no se reproduzem, como no caso da produo de cido ctrico e novobiocina.

ii

......_____ _ .. ------------------ ---------------,----'----------- ---:- ---- -----.-- --- - - - - - - - - - ---------- :- - . ; ; __ :li

I IO

Cintica de processos fermentativos .

. 6.6 -

6.6. I -

Influncia da concentrao do substrato sobre


a velocidade especfica de crescimento
A equao de Monod: interpretao da fase exponencial
de crescimento

A seguinte equao emprica, proposhipor MONOD/3 tem sido comumente


empregada para explicar a relao entre a concentrao 5 do substrato limitante
no meio, com a velocidade especfica ~xde reproduo do microrganismo:
. (6.46)
onde ~m representa a mxima velocidade especfica de crescimento ou reproduo, e K5 a constante de saturao, cujo significado ser comentado a seguir.
Na Figura 6.7 est representada a eq. de Monod. O significado de Ks pode
ser deduzido fazendo-se 5 = Ks na eq. (6.46). Resulta imediatamente que: ~X =
~m/2, isto ~ a referida constante representa a concentrao do substrato na qual a
velocidade especfica de crescimento a metade do seu valor mximo.

~m

---------- ----- ----- - ----------------- ~ --- -

0,10

o~.--.-.-.~.-r-.-.--.-.----

Figura 6.7 -

0,50

S(mg/L)

1,00
.

Equao 6.46 para Jlm = O, 14 h-1 e Ks = 0,60 mg/L (valores hipotticos).

Esta condio est assinalada na Figura 6.7 onde, para Ks = 0,60 mg/L,
tem-se ~X= ~m/2 = 0,07 h~l.
A expresso de Monod formalmente igual expresso de Michaelis-Menten (captulo 7, volume I).
No incio do cultivo, onde 5 alto, o microrganismo apresenta uma velocidade especfica prxima mxima, podendo a mesma situar-se nesta regio
durante uma boa parte do processo, mesmo que o metabolismo celular provoque
uma diminuio aprecivel no valor de S.
--- -- - ----~-____.

Influncia da concentrao do substrato sobre a velocidade especfica de crescimento

III

_
Quanto menor for o valor da constante de saturao K5, tanto mais amplo
ser este " patamar" quase horizontal da curva e que se encontrar mais prximo
do valor de f.lm, conforme ilustra a Figura 6.8 (curva A).
Embora, a rigor, pela equao 6.46, nunca seja atingido o valor de f.lm, por
mais alta que seja a concentrao inicial S, na prtica, os valores experimentais podem ser considerados como tal, tendo em vista os erros que afetam os valores cal. culados da velocidade espe.cfica de crescimento. 15' 16 .
.
Nessas circunstncias, a curva apresentada pela velocidade especfica de
crescimento em funo do tempo (Figura 6.9), poder apresentar um trecho mximo constante (AB), aps um curto perodo inicial de transio ou adaptao do
microrganismo ao meio.
Essa fase inicial do crescimento (O a 4 horas, Fig. 6.9), corresponde fase 1
("lag") e fase 2 (de transio) da Figura 6.3, no previstas pela expresso de Monod.
A citada expresso (6.46) considera f.lx elevado e prximo do valor mximo,
logo que o microrganismo colocado na presena de um meio, com uma concentraap inicial de substrato relativamente elevada. O microrganismo , nessas circunstncias, considerado adaptado.
Uma baixa constante de saturao Ks implica em uma maior durao da fase
exponencial, conforme ilustra a Figura 6.8: para Ks = 0,60 mg/L, os valores de f.lx
logo se distanciam de f.lm, medida que o substrato vai sendo consumido; para K5
= 0,030 mg/L, f.lx praticamente igual f.lm para uma mesma variao de S (entre
1,20 e 0,50 mg/1).
Assim, a durao do "patamar" AB (Fig.-6.9), depender da magnitude desta
constante de saturao,

----------------------------------------------------A

0,10

~mn-

--- --------------- --- :

'

'
KsA

""

Kss
1,00

0,50
S(mg/L)

. Figura 6.8 - Equao 6.46 para os valores hipotticos de: Jlm =O, 14 h- 1, K5 = 0,60 mg/l. (curva 8), Ks
mg/l.(curva A).

~ --- -- -.. ------ ---- -- -----~---- - --: ____ ____ _:

__~~---------~-- - ---- ~ ~--~,-------.-----------------

=0,030

-- --- ....... . ------------------:--

.. :... ~ _j

I 12

Cintica de processos fermentativos.

flx

tg
(h)

(h-1)
50

0,10

o~----~~~--~~o

12

t (h)

Figura 6.9 - Variao da velocidade especfica de crescimento (1-lx) e do tempo de gerao (tg),
no cultivo descontnuo.

6.6.2 - Outros modelos


A expresso de Monod (eq. 6.46) um modelo que no leva em conta o efeito inibidor, tanto pelo substrato como pelo produto formado. Essa, porm, no
a nica interpretao referente a uma tal condio ideal de cultivo.
Outras equaes foram propostas 10 e que merecem ser citadas:
equao de Teissier

(6.47)

Moser

(6.48)

Contois e Fujimoto

Powell

fl x

= ~ m . -(K_s_+_K_o_)_+_S

(6.48)

(6.50)

H pelo menos mais seis outras expresses, propostas por outros autores,
tambm citadas na mesma referncia 10 e que no levam em conta ofenmeno da
inibio.
A ausncia da inibio , na verdade, uma situao pouco comum na prtica, principalmente durante um cultivo descontnuo, onde h um crescente acmulo de metablitos que acabam interferindo desfavoravelmente sobre o metabolismo e crescimento microbianos.
O problema poderia ser atenuado se fosse, por exemplo, utilizado um valor
inicial relativamente baixo da concentrao de substrato e que assim resultasse em
baixas concentraes de produtos inibidores.

Influncia da concentrao do substrato sobre a velocidade especfica de crescimento

I 13

Essa , entretanto, uma alternativa pouco interessante do ponto de vista industrial, onde baixas concentraes de produtos acarretariam custos elevados, na
fase posterior de separao e purificao da substncia de interesse.
Nessas circunstncias, a inibio pelo substrato um fenmeno que no
pode ser ignorado.
O efeito do substrato se manifesta quando um valor alto da concentrao
inicial S pode, ao invs de proximar flx de flm (como nas Figs. 6.7 e 6.8 ), provocar
um efeito contrrio, ocasionando uma inibio no crescimento celular.
Este fenmeno est ilustrado na Figura 6.10, onde se pode verificar que a expresso de Monod (eq. 6.46) somente se aplica para valores relativamente baixos
de S, menores ou iguais a K 5 . Acima deste, onde a inibio pelo substrato se manif~s~, a curva tende para flm at um certo valor de S, para depois se afastar, a partu .deste valor.

,...m

- - - - - :...

=- -=- --- -

ks

..J k~ . kl,s

k.s

.I

Figura 6.10 - Cintica de inibio pelo substrato (curva A) e sem inibio(---; eq. 6.46).

Com o objetivo de explicar essa reduo na velocidade especfica de crescimento (!lx), provocada pelos altos valores iniciais da concentrao de substrato
(S), uma modificao na expresso de Monod (eq. 6.46), foi proposta:10
S
KI,s
flx =flm. Ks +S KI,S +S

(6 .51)

Nessa nova expresso, que traduz o andamento da curva A (Fig. 6.10), K 5 a


constante de saturao definida pela eq. (6.46).
K1 5 , por outro lado, a constante de inibio pelo substrato que se refere,
como K~, ao valor de S para o qual flx = flm/2, porm para um valor de S que provoque a inibio, sendo assim superior ao correspondenteS da equao de Monod.
Para uma melho; compreenso da influncia do valor de K1,5 sobre o efeito
inibidor do substrato, oportuno analisar o fator K1,5 / (K1,5 + S), da equao 6.51
sob a forma:
1
1+ -

(6.52)

s-

Kr,s
-------- -.-

----~----~----

---

~--

----- ----

I 14

' .

''

Cintica de processos ferrnentativos

Se K1,s >> S, ento: SI K 1,s =O e a equao anterior se reduz unidade. Conseqentemente a eq. 6.51 se transforma na 6.46, no existindo assim o efeito inibidor do substrato sobre o crescimento.
Em outras palavras, um valor relativamente alto dessa constante (K1,5 ) requer igualmente valores muito altos de S para que o efeito inibidor se manifeste
(eq. 6.52, menor do que um), ou seja, a inibio pelo substrato poder ser pouco
pronunciada. Inversamente, valores baixos de K1,5, representam um substrato
muito inibidor perante uma dada espcie de microrganismo.
Quanto inibio pelo produto, um equacionamento semelhante foi realizado por JERUSALIMSKY e NERONOV A: 10 .

Kl,P

f.lx =f.lrn. K +S Kl,P +P

(6.53)

sendo que as consideraes prvias, referentes eq. (6.52), tambm se aplicam


nesta expresso, mas levando em conta unicamente o efeito inibidor pelo produto,
representado pela sua concentrao P, n,o meio. Mais informaes sobre as expresses (6.51) e (6.53), assim como outros modelos de inibio, podero ser encontrados na literatura. 10

Agradecimentos
O autor agradece aoEngenheiro (Mestre em Engenharia Qumica) Andreas
Karoly Gombert pela elaborao do Apndice e Engenheira (Mestre em Engenharia Qumica) Jlia Baruque Ramos, pelo trabalho de datilografia.

Apndice

Andreas Karoly Gombert

.
Para ilustrar uma forma bastante prtica e simples de calcular velocidades
especficas a partir de dados experimentais de cultivos de clulas, ser apresentada uma planilha em Microsoft Excel que contm as equaes do mtodo geomtrico de clculo de derivadas proposto por LE DUY; ZAJIC. 8 O objetivo no
apresentar detalhes sobre esse mtodo, mas apenas ilustrar como o mesmo pode
ser utilizado; para obter detalhes do mtodo, sugere-se consultar a referncia
original.

Apndice

I I5

A) Apresentao da planilha
No artigo original escrito por LE DUY; ZAJIC,8 apresentada uma sub-rotina
em Fortran para o clculo de velocidades especficas. No entanto, em funo da facilidade e praticidade no uso de planilhas eletrnicas, como o caso do Microsoft
Excel, torna-se bem mais simples calcular velocidades especficas lanando mo
--~deste tipo de planilha. No Quadro 6.1, so apresentadas as equaes de uma plani, lha que executa o clculo de velocidades especficas.
Alguns cuidados devem ser tomados para o bom funcionamento da planilha:
1) A primeira linha de equaes diferente das outras. A partir da segunda linha
de equaes, existe repetio das mesmas. Portanto, basta copiar a segunda linha de equaes para o nmero de linhas que forem necessrias ao nmero de
dados de entrada disponveis.
2) Deve-se manter uma linha em branco aps a ltima linha de entrada de dados,
sendo esta a forma utilizada pela planilha para que possa ser calculada aderivada no ltimo ponto.

3) A coluna B dever conter sempre dados de concentrao celular. A coluna C


poder conter dados de concentrao celular, caso se deseje calculara velocidade especfica de crescimento; dados de concentrao de substrato, caso se
deseje calcular a velocidade especfica de consumo de substrato; dados de concentrao de produto, caso se deseje calcular a velocidade especfica de formao deste produto.
4) Aps a entrada das equaes (conforme Quadro 6.1), pode-se iniciar a utilizao da planilha, devendo-se utilizar apenas as colunas A, B e C para entrada de
dados numricos. A velocidade especfica para cada instante aparecer automaticamente na coluna E.
5) Os dados de 1-ls aparecero com sinal negativo na planilha, por causa do sinal
negativo da derivada dS I dt. No entanto, como 1-ls deve assumir valores positivos, deve-se fazer a correo necessria, multiplicando-se os valores obtidos
na plri.~lha por -1.
Sugere-se acompanhar o seguinte exemplo de caso para verificar o bom funcionamento da planilha.
,.

B) Exemplo de caso: dados de um cultivo descntnuo de Saccharomyces cerevisiae


Na Tabela 6.1 so apresentados os dados de concentrao celular, de substrato e de produto obtidos num cultivo descontnuo de Saccharomyces cerevisiae.24
Esses dados, obtidos ao longo do cultivo a cada 4 horas e sujeitos a alguma flutuao experimental, devem ser ajustados a uma tendncia que represente bem o fenmeno em questo, ajuste este que pode ser denominado "alisamento". O
alisamento dos pontos experimentais, que pode ser realizado por ajuste manual
em papel milimetrado ou pelo ajuste por uma ou mais equaes polinomiais, deve
ser feito anteriormente ao clculo das velocidades especficas de crescimento, de
consumo de substrato e de formao de produto. Os dados resultantes do alisamento dos pontos apresentados na Tabela 6.1 encontram-se na.Tabela 6.2 (no caso,
foi feito um ajuste por polinmios de 4. o grau) .

I 16

Cintica de processos fermentativos

Tabela 6 ..1 - Dados experimentais de um cultivo descontnuo de S. cerevisiae. 24

Tempo (h)

X (g/L)

S (g/L)

p (g/L)

0,91

106,9

0,0

0,91

106,9

0,0

1,61

96,8

6,2

12

2,42

83,6

15,0

16

3,59

59,9

23,5

20

4,71

31,6

34,3

24

5,51

10,6

42,2

ro'Jol'

~t

'~1
1

.' ';:J

i
.

'

...,_

~~f, ;.
~-,

~
....:.

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....,,

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"

'

..

....

. 1~-~

\i'

Tabela 6.2 - Dados resultantes do alisamento de dados experimentais de um cultivo descontnuo


de S. cerevisiae (ver Tabela 6. 1).

Tempo (h)

X (g/L)

S (g/L)

p (g/L)

0,00

15

3,31

65,7

21,8

106,9

0,00

16

3,60

59,2

24,4

0,89

106,9

0,00

17

3,89

52,5

27,0

0,91

106,3

0,04

18

4,18

45,7

29,6

0,97

105,6

0,68

19

4,45

38,9

1,07

104,6

1,59

20

4,71

32,2

34,4

1,19

103,1

2,76

21

4,95

25,9

36,6

1,35

101,1

4,17

22

5,17

20,0

38,6

1,52

98,6

5,80

23

5,35

14,8

40,3

1,73

95,6

7,65

24

5,49

10,5

41,7

10

1,95

91,9

9,68

25

5,57

7,4

42,7.

11

2,20

87,7

11,9

26

5,57

7,0

42,8

12

2,46

82,9

14,2

27

5,57

7,0

42,8

13

2,73

77,6

16,7

28

5,57

7,0

42,8

14

3,01

71,9

19,2

Tempo (h)

X (g/L)

S (g/L)

0,89

106,9

0,89

.P (g/L)

32,1

-----~--- .
.

- -- -- , , . .

"~""'~

Apndice

/ -

I 17

importante observar que o intervalo de tempo entre dois pontos consecutivos resultantes do alisamento, os quais sero utilizados no clculo das_velocidades especficas, deve ser adequado ao caso em estudo. No presente exemplo,
foram utilizados dados de 1 em 1 hora, pois verificou-se que este intervalo suficiente para que fossem obtidas boas curvas de velocidades especficas.
Utilizando os dados da Tabela 6.2 para o clculo de velocidades especficas,
obtm-se os dados constarites da Tabela 6.3. Para ilustrar o aspecto da planilha no
momento de sua utilizao, apresentado no Quadro 6.2 o clculo das velocidades especficas de crescimento (dados de concentrao celular na coluna C) .

Tabela 6.3 - Velocidades especficas de um cultivo descontnuo de S. cerevisiae .


Tempo (h)

J.lx (h-1)

J.ls (h-1)

J.1p (h-1)

Tempo (h)

J.lx (h-1)

J.ls (h-1)

J.lp (h-1)

0,00

0,00

0,00

15

0,09

1,92

0,79

0,00

0,11

0,00

16

0,08

1,83

0,72

0,01

0,33

0,02

17

0,07

1,74

0,67

0,04

0,58

0,32

18

0,07

1,63

0,61

0,08

0,85

0,78

19

0,06

1,52

0,54

0,10

1,11

0,96

20

0,05

. 1,38

0,48

0,12

1,43

1,07

21

0,05

0,42

0,12

1,63

1,12

22

0,04

1,23
1,07

0,35

0,12

1,78

1,14

23

0,03

0,87

0,29

0,12

1,90

1,12

24

0,02

0,64

0,21

10

0,12

2,01

1,09

25

0,01

0,12

0,07

11

0,12

2,03

1,03

26

0,00

0,03

0,01

12

0,11

2,04

0,97

27

0,00

0,00

0,00

'

0,00

t.

13

0,10

14

0,10

.t

-f:

' :,.

2,01

0,92

1,97

0,85

....... i'l'l.,..., -,;- ~-..-:':i\wr-, ;. -:

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0,00

0,00

28

~-

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--- - --

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.l.

l.,,"~-~-

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'

l~t:
:~~
-~

'

_;. ,.

I 18

Cintica de processos fermentativos

Quadro 6.1 - Organizao da planilha para clculo de uma determinada velocidaae especfica
(observe tambm o Quadro 6.2).
A) Para deixar um espao razovel para a caracterizao dos clculos que sero efetuados, imagina-se a entrada
de dados a partir da linha 8 da planilha:

Clula da Planilha

Dados de entrada

Tipo

AS

tempo (h)

texto

8S

X (g/L)

texto

:i>A
...,,

CS

M (g/L)

texto

DS

dM/dt

texto

llM

texto

''
M:

~~
~
f :'I

:"'j

~
i~
. r,

ES
FS

texto

GS

mAB

texto

HS

mBC

texto

IS

dCX

texto

JS

mNO

texto

KS

nNO

texto

LS

mMO

texto

MS

nMO

texto

-~

- >
'"

'~
Aj,
r~
:l~

~
~
-~

-r~

~l
,,.,

I~
C

~~-

1~--------------+---------------~---------------i

1~------:
--:------~r-------:x-~-~------_,----~-:-:-:-::--. . ~--~~
~
1~------------~------------~--------~.~
----~~J
PS

dX/dt

texto

!C:;;.&. .&i~$.;.~.-;.". ;;i::~,._ ":..:)!1Z.~~~~~'~fl; ~.!:~''"'' ~~

B) Para os clculos relativos ao primeiro ponto, o mtodo obtm a derivada traando uma reta entre o segundo
e o primeiro ponto, devendo-se, portanto, entrar com os seguintes dados na linha 9:

Clula da
Planilha

Dados de entrada

Tipo

A9

tempo inicial

nmero

89

concentrao celular inicial

nmero

C9

concentrao inicial do composto M

nmero

09

= +(ClO -

C9) I (AlO - A9)

equao

E9

= +09/89

equao

F9

nmero

---~------'--------------------- ---- ------ --- --------------------

--------- . - -..-. -~

Apndice

I 19

C) Para os demais pontos, o clculo feito atravs das equaes abaixo (esto indicadas as entradas da linha I0).

Quando da utilizao da planilha, aps a entrada dos dados numricos (resultantes do alisamento) nas colunas
A, B e C, deve-se preencher as colunas D a P copiando as clulas da linha IOat a ltima linha de entrada de
dados:

1 ,

Clula da
Planilha

Dados de entrada

Tipo

AlO

segundo dado de tempo

nmero

BlO

segundo dado de cone. celular

nmero

C lO

segundo dado de cone. do composto M

nmero

010

=SE (ABS (GlO-HlO) <=0,001 ; IlO;PlO)

equao

ElO

=+DlOIBlO

equao

FlO

=+F9+1

equao

GlO

=+ (Cl0-C9)

H lO

=+ (Cll-ClO)

110

=SE (A11<>0;0,5* (GlO+HlO); (Cl0-C9)

JlO

=SE ( (Cll-Cl0)<>0; (AlO-All)

KlO

=0,5* (ClO+Cll)- (Jl0*0,5* (Al0+A11) )

LlO

=SE ( (Cl0-C9) <>0; (A9-Al0)

MlO

=0,5* (C9+Cl0)- (L10*0,5* (A9+Al0) )

equao

NlO

= (KlO-MlO) / (LlO-JlO)

equao

010

=+LlO*NlO+MlO

equao

PlO

=SE (All<>O; (NlO-AlO)

I (A10-A9)

equao

I (All-AlO)

equao

I (Al0-A9))

I (Cll-ClO) ;99000000000)

I (Cl0-C9) ; 99000000000)

I (Cl0-010); (C10-C9) I (Al0-A9))

equao
equao
equao
equao

equao

I
.I

L.

-- - -- --

- --. .- --- ----

---- --- . --------- ---- ---- ------------- ---------- -- ------

Quadro 6.2 - Exemplo de clculo de velocidade especfica de crescimento para dados de um cultivo
de S. cerevisiae.
A
1
2

E
F
G
K
I H
I I
I L
I L
Planilha para o clculo de velocidades especficas pelo mtodo proposto por LE DUY; ZAJIC8

tempo (h)

X(g/L)

M(g/L)

dM/dt

0,00
0,00

1
2
3
4
5
6
7

0,89
0,89

0,00 .

10
11
12
13
14
15
16

0,89
0,89

0,00
0,01
0,04
0,08
0,10
0,12
0,12
0,12
0,12
0,12

2
3
4
5
6
7

8
9
10
11
12
13
14
15
16
17

0,89
0,91
0,97
1,07
1,19
1,35
1,52
1,73
1,95
2,20

0,01
0,04
0,08
0,11
0,14

17
18
19
20

0,89
0,91
0,97
1,07
1,19
1,35
1,52
1,73
1,95
2,20
2,46
2,73
3,01
3,31
3,60
3,89
4,18

2,46
2,73

0,26
0,27

0,11
0,10

3,01
3,31
3,60
3,89
4,18

4,45
4,71
4,95
5,17
5,35
5,49
5,57
5,57
5,57
5,57

4,45
4,71
4,95
5,17
5,35
5,49
5,57
5,57
5,57
5,57

0,29
0,29
0,29
0,29
0,28
0,26
0,25
0,23
0,202
0,16
0,11
0,04
0,00
0,00
0,00

0,10
0,09
0,08
0,07
0,07
..
0,06
0,05

33
34
35
36
37

27
28
29
30
31
32 .

Entrar somente com os dados de temp_o (coluna A), de concentrao celular (coluna B) e de concentrao do coml"'sto M
(clulas, substrato ou produto), cuja velocidade especfica de consumo ou de produo se desea determinar (coluna C):

23
24
25
26

Exemplo de aplicao; dados de um cultivo descontnuo de S. cerevisiae

3
4
5
6
7

21
22

18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28

0,16
0,19
0,21
0,23
0,25

11m

8
9
10
11
12
13

0,12

.,

0,05
0,04
0,03
0,02 ..
0,01
0,00
0,00
0,00

14
15
16
17
18
19
20
2L
22
23
24
25
26
27
28
29

mAB

mBC

dCX

mNO

nNO

mMO

nMO

t(c)

exc r

dX/dt

0,00

0,00
0,02
0,06

0,00

1E+11
-50,00
-16,67

1E+11

0,10
0,12
0,16

0,08
0,11

-1E+11
125,90
59,27
46,02
46,96
41,90
45,55
42,10
45,02
44,08
46,56
48,89

-5E+10
-1E+11
125,90
59,27
46,02
46,96
41,90
45,55
42,10
45,02
44,08
46,56

#DIV /0!
1,50
2,00
1,99
-{),57
2,43
-9,95
3,08
-13,49
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-16,16

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50,90
25,96
26,!'4
51,68
26,69
104,08
27,43
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37,13
108,71

#DIV /0!
0,01
0,04
0,08
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0,25

-16,36
-16,58
-1,72
47,07
#DIV /0!

109,48
110,30

0,26
0,27

57,22
-105,39

0,00
0,02
0,06
0,10
0,12
0,16
0,17
0,21
0,22
0,25
0,26
0,27
0)8
0,30
0,29
0,29
0,29
0,27
0,26
o,24
0,22
0,18
0,14
0,08
0,00
0,00
0,00

0,01
0,04

0,17
0,21

0,14
0,17
0,19

-10,00
-8,33
-6,25
-5,88
-4,76

0,22
0,25
0,26

0,22
0,24
0,26

-4,55
-4,00
-3,85

0,27

0,27

-3,70

0,28
0,30
0,29
0,29
0,29
0,27

0,28
0,29
0,30
0,29
0,29
0,28

0,26
0,24
0,22
0,18
0,14
0,08
0,00
0,00
0,00
0,20

0,27
0,25
0,23
0,20
0,16
0,11
0,04
0,00
0,00
0,00

-3,57
-3,33
-3,45
-3,45
-3,45
-3,70
-3,85
-4,17
-4,55
-5,56
-7,14
-12,50
1E+11
lE+ll
1E+11
-5,03

51,08
51,49
56,90
60,64
64,38
72,83
79,58
90,25
102,79
130,26
173,28
311,78
-3E+12
-3E+12
-3E+12
73,16

1E+11
-50,00
-16,67
-10,00
-8,33
-6,25
-5,88
-4,76
-4,55
-4,00
-3,85
-3,70
-3,57
-3,33
-3,45
-3,45
-3,45
-3,70
-3,85
-4,17
-4,55
-5,56
-7,14
-12,50
lE+ll
1E+11
1E+11

48,89
51,08
51,49
56,90
60,64
64,38
72,83
79,58
90,25
102,79
130,26
173,28
311,78
-3E+12
-3E+12
- 3E+12

33,10

-49,75

47,36
33,28
33,11
27,20
27,10
25,85
25,50
IIDlV /OI
#DIV /0!
27,50

-102,57

0,29
0,29
#DIV /0!
0,29
0,28
0,26

-48,42
-47,70
-20,84
-20,30
-11,39
-6,97
IIDIV/0!
IIDIV /0!
-65,08

0,25
0,23
0,20
0,16
0,11
0,04
IIDIV/01
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0,00

- -

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Referncias bibliogrficas

121

Referncias bibliogrficas
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L ._ _ _ _ _ --- - - - - - - - - - - ------------~---- - - --- - - - - - --- - - - - - - -----

-.l

122

Cintica de processos fennentativos

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- - ~--- ----------_ .-....,.......~--- - - - - - --

- - - - - .-~-----:----=-'-

123
I

Antonio Bonomi
Willibaldo Schmidell

7 .I - Introduo
Apesar de a engenharia bioqumica compreender diferentes tipos de processos, englobando transporte de calor e massa e recuperao de produtos, incluindo
vrios constituintes e fenmenos dominantes, _a pesquisa em modelagem matemtica reportada na literatura tcnica especializada refere-se basicamente s reaes
biolgicas e, recentemente, s reaes que ocorrem no interior das clulas. Dessa
forma, a modelagem matemtica de processos fermentativos pode ser definida
como a tentativa de representar, atravs de equaes matemticas, os balanos de
massa para cada componente no biorreator, associados s complexas transformaes bioqumicas que ocorrem no processo e s velocidades com que essas transformaes se processam. Em razo da complexidade do processo real (que envolve
leis fsico-qumicas, bioqumicas e genticas), somad s limitaes matemticas, os
modelos so baseados, geralmente, na idealidade e, em geral, fornecem uma repre1
sentao fiel de apenas algumas das propriedades do processo. A formulao de
um modelo matemtico deve, segundo os autores, possuir um comprom~timento
entre grau de complexidade razovel e soluo (esforo computacional) economicamente desejvel. Por sua vez, a simulao do processo corresponde sua anlise (por exemplo, s':la otimizao) atravs da utilizao do modelo matemtico
proposto.
Do ponto de vista da engenharia bioqumica, o desenvolvimento da modelagem matemtica dos processos fermentativos permite atingir, entre outros, os seguintes objetivos: organizar informaes desconexas a respeito dos
fenmenos biolgicos num conjunto coerente; pensar (e calcular) logicamente
a respeito de quais componentes e interaes so importantes num sistema
complexo; descobrir novas estratgias para explicar b comportamento das clulas submetidas a determinados ambientes; corrigir falhas eventualmente

124

Modelagem matemtica e simulao de proc~ssos fermentativos

existentes no entendimento convencionado de determinados fenmenos e, finalmente, entender as caractersticas qualitativamente essenciais de determinados processos. 2
O objetivo principal da modelagem matemtica e simulao, como ferramenta do desenvolvimento tecnolgico de processos fermentativos, prever o
comportamento dinmico e estacionrio do processo, inclusive em condies no
testadas empiricamente, possibilitando a determinao das condies operacionais economicamente timas do sistema, auxiliando no projeto e ajuste de algoritmos de controle, no qual o modelo matemtico formulado passa a ser parte
integrante do mesmo. 3
Os processos fermentativos incorporam uma srie de caractersticas que os
diferenciam dos processos qumicos, o que pode explicar as dificuldades encontradas na formulao de modelos matemticos que representem adequadamente estes processos, ao contrrio do que ocorre com os processos qumicos
convencionais. Entre essas caractersticas podem ser citadas as seguintes: baixas
concentraes e baixas velocidades de reao, como resultado da utiliZao de um
meio diludo; complexidade da mistura reagente e capacidade do sistema (clulas
microbianas) de sintetizar seu prprio catalisador; conhecimento insuficiente de
vrios dos fenmenos limitantes das velocidades de produo e falta de sensores
para automao on-line; problemas de esterilidade, segurana e eventualmente da
toxicidade dos processos fermentativos. 4
Neste captulo sero apresentados os principais tipos de modelos empregados para representar os processos fermentativos, destacat:tdo as estratgias
empregadas na formulao dos modelos matemticos conhecidos como fenomenolgicos, no estruturados, bem como as metodologias utilizadas no ajuste
desses modelos a um conjunto de experimentos realizados . Posteriormente, sero introduzidas e aplicadas tcnicas estatsticas, que permitem discriminar diversos modelos ajustados, definindo sua validade. Finalmente,
ser discutida
.
brevemente a utilizao dos modelos matemticos visando otimizar um processo, atravs da definio de uma funo objetivo e o emprego de diversas tcnicas de otimizao.

~ 7.2

- Formulao dos modelos matemticos de processos


fermentativos

Inicialmente, deve-se reconhecer que, num processo fermentativo, esto envolvidos dois sistemas que interagem continuamente: a fase biolgica (ou bitica)
composta pela populao microbiana ou pela cultura de clulas animais ou vegetais e a fase ambiental (ou abitica) ou o meio de cultura, como comumente conhecido e que contm os substratos e produtos do processo. A Figura 7.1 resume
os principais parmetros, fenmenos e interaes que influenciam o comportamento cintico de uma populao microbiana ou de clulas na presena do seu
meio de cultura. 5

---~---"--- ---'- .. -----~

Fonnulao dos modelos matemticos de processos fennentativos

AMBIENTE

POPULAO

(meio de cultura)

(clulas)

Multicomponentes

..

Nutrientes/Substratos

Reaes em soluo
Equilbrio inico

Multicomponentes
Heterogeneidade entre
clulas

Produtos

M ultirreaes
Controle interno

pH, T, ... variveis


Propriedades reolgicas
variveis (viscosidade)

125

Calor

Sistema multifase (G-L;


L-L; G-L-L; G-L-S)

Adaptabilidade

Sistema estocstico
Interaes Mecnicas

No uniformidade

Variaes genticas

Figura 7 .I - Esquema das principais caractersticas da interao populao microbiana/clulas animais ou vegetais

e o meio de cultura.

As clulas consomem nutrientes e convertem substratos do ambiente em


produtos. As clulas geram calor, que dissipado para o meio e, em contrapartida, a temperatura do meio define a temperatura das clulas. Interaes mecnicas
ocorrem atravs de presso hidrosttica, de efeitos do fluxo do meio para as clulas, de choque entre partculas (clulas ancoradas em suportes) e de mudanas na
viscosidade do meio em funo do acmulo de cl~las e de produtos metablicos.
H .que se considerar ainda que as caractersticas de operao do processo
fermentativo empregado, tais como:
batelada, contnuo, batelada alimentada, etc.;
submerso e semi-slido;
alta densidade celular (reciclo, imobilizao de clulas, etc.);
entre outras, permitem interferir na relao populao microbiana - ambiente, no
sentido de controlar e, se possvel, aumentar as velocidades e os rendimentos desta interao.
Pelo exposto, fica claro que num desenvolvimento de processo, quando se
utilizam as tcnicas de modelagem matemtica e simulao para o projeto e dimensionamento de biorreatores otimizados, dever-se- analisar, da forma mais
abrangente e integrada possvel, os principais fenmenos que caracterizam as interaes populao microbiana- meio ambiente- tipo de processo fermentativo. A seguir listamos alguns desses fenmenos caractersticos:

...__

__

- -----

- ...

--------------------------------:----- - -.------- -- - - - - - - '

126

Modelagem matemtica e simulao de processos fermentativos

influncia da "histria" da populao microbiana no processo (fase lag e


de adaptao, mutaes, perda de viabilidade, etc~);

influncia da composio do meio de cultivo nas velocidades de crescimento ou de produo da populao microbiana (um nico ou mltiplos
substratos limitantes, substratos inibitrios, substratos que provocam os
fenmenos de induo e represso, etc.);
consumo de substratos para crescimento e tambm, na maioria dos casos,
para manuteno da vjabilidade celular;
gerao de produtos associada ou no ao crescimento celular;
transferncia de substratos do meio para o interior das clulas e de produtos da clula para o meio;
velocidades de respirao em processos aerbios (transferncia de oxignio da fase gasosa para a fase lquida atravs da agitao e aerao
do biorreator);
tipo de processo (submerso ou semi-slido, batelada ou batelada alimentada ou contnuo, com e sem reciclo, clulas imobilizadas ou livres, uma
ou mltiplas fases de processo, etc.);
influncia de variveis fsico-qumicas no processo (temperatura~ pH,
presso interna do biorreator, viscosidade, densidade, umidade do meio
de cultivo, umidade relativa do ar, etc.);
influncia das variaes na sntese dos componentes celulares- necessidade de incluir "estrutura" nos modelos matemticos dos processos;
homogeneidade ou heterogeneidade do processo;
influncia das condies operacionais na morfologia da populao microbiana.
Admite-se, idealmente, que a modelagem de uma fermentao deveria predizer o r~sultado das milhares de transformaes qumicas que ocorrem pela
ao de uma populao microbiana, ou de uma cultura de clulas animais ou vegetais. Sem dvida, uma descrio completa de todas as vias e intera~es metablicas pertinentes ao desenvolvimento microbiano seria extremamente complexa e mesmo impossvel. Felizmente, sabe-se que, ao menos na rea das cincias
exatas, muitos problemas podem ser estudados usando uma mdia das vrias
propriedades das diversas entidades em questo. Nesse sentido, importante
lembrar que o modelo ainda pode ser vlido se somente um nmero limitado de
mecanismos governantes so considerados em detalhe. Portanto, na elaborao .
de modelos de processos fermentativos so, geralmente, introduzidas simplificaes, de maneira a se obter modelos passveis de serem manuseados e generalizados.6
.

7.2.1 - Classificao dos modelos matemticos de processos


fermentativos
Vrios autores apresentam classificaes para os diversos tipos de modelos
comumente usados em engenharia bioqumica. 5' 6' 7 Iniciaremos essa ~lassificao
pela definio de dois grandes grupos de modelos matemticos de processos fermentativos, definidos a seguir.

~~
.. - - - - --'------'---. __

___.......

Formulao dos modelos matemticos de processos fermentativos

127

Modelos fenomenolgicos: baseiam-se na formulao de hipteses e correlaes tericas ou empricas para explicar os fenmenos e o comportamento das variveis do processo observados experimentalmente;
Modelos entrada-sada: estabelecem relaes empricas para correlacionar o
efeito de lr'ariaes nas variveis de entrada ou manipulveis (caso, por exemplo,
das concentraes iniciais em sistemas operados em batelada ou das concentraes e vazes de alimenta~o nos sistemas operados de forma contnua) nos valores das variveis de sada ou medidas do processo (caso do perfil de
concentraes possveis de serem medidas no interior do biotreator, ou no seu
efluente, ao longo do tempo).
7.2.1.1. Modelos fenomenolgicos
Um modelo fenomenolgico constitudo por um conjunto de relaes matemticas entre as variveis de interesse do sistema em estudo.
desejvel que os modelos sejam, na medida do possvel, fundamentais, ou
seja, baseados nas equaes de conservao de massa, energia e quantidade de movimento e em princpios fsico-qumicos, uma vez que isto confere maior confiana
em interpolaes e extrapolaes, quando comparado com modelos puramente
empricos. Entretanto, mesmo em modelos fundamentais, freqente que o clcu.
lo de um ou mais parmetros seja baseado em equaes empricas.
Na formulao de um modelo matemtico fenomenolgico convencional
so, normalmente, utilizadas equaes que podem ser classificadas em:
equaes de balano ou de conservao (de massa, energia, quantidade de
movimento), baseadas em princpios fsico-qumicos f';lndamentais;

equaes de velocidade, que podem ser: (a) equaes' de velocidade de


transporte de massa, energia e componentes ou espcies qumicas, atravs
das fronteiras do 's istema considerado ou (b) equaes de velocidade de
gerao ou consumo de espcies dentro do sistema; as equaes de velocidade so normalmente equaes empricas, construdas a partir do conhecimento advindo de ensaios realizados no laboratrio;
equaes termodinmicas, que relacionam propriedades termodinmicas
do sistema (presso, temperatura, densidade, concentrao), por exemplo,
equaes de estado e relaes de equilbrio termodinmico (como o caso
da lei de Henry para transferncia de oxignio da fase gasosa para a fase
lquida).

~-

Enquanto as equaes de balano, de velocidade de transporte e termodinmicas so passveis de pdronizao atravs de estudos tericos de fenmenos de
transporte e termodinmica aplicados h dcadas na engenharia qumica, as equaes de velocidade de transformao, ou equaes cinticas, so especficas para
os processos fermentativos e constituem os chamados modelos cinticos.
Freqentemente, em processos com clulas livres; as informaes sobre a cintica de fermentao so obtidas a partir de ensaios em laboratrio realizados em
reatores operados de forma descontnua, descontnua alimentada ou contnua. Na
proposio de um modelo Cintico para um processo fermentativo, diversos nveis

L . . . - - - --- .- - - - - - ------------- - - - - --- - - :- - -----'-- - ,_. ._ _ _ _ _ _ _- - - - --- -:- - . . . -

---- - - --- - - - - . -- - - -------

128

Modelagem matemtica e simulao de processos fermentativos

de detalhamento podem ser adotados. Algumas das aproximaes, permitem simplificar a representao da cintica dos processos ferrnentativos:
consideranili>-se que, na formulao do meio de cultura, todos os componentes, rri.enos um nmero preestabelecido, esto em concentraes
suficientemente elevadas (mas no inibitrias), de modo que apenas as
concentraes destes outros componentes, previamente escolhidos, sejam
limitantes e/ ou inibitrias-para a velocidade do processo; eventualmente,
necessrio incluir no equacionarnento outros componentes do meio, por
exemplo, um produto inibidor que se acumula no meio de cultura ao longo do processo;
considerando-se, em geral, que alteraes em outras variveis detectadas
num experimento de um processo tpico no afetam significativamente a
cintica no intervalo de tempo escolhido para a modelagem; alm disso,
controles do biorreator podem regular e manter constantes alguns parmetros do ambiente, por exemplo, pH, temperatura e concentrao de oxignio dissolvidO';
introduzindo-se no modelo, se necessrio, urna descrio rnulticornponente e rnultivarivel da populao rnicrobiana ou de clulas, para representar adequadamente o comportamento cintico desejado.
Os modelos cinticos de processos ferrnentativos podem ser classificados,
quanto ao nmero de componentes usados na representao celular, em dois tipos, conforme se detalha a seguir.
Modelos no estruturados: o material celular representado por urna nia varivel, por exemplo, a massa celular ou o nmero de clulas, sem considerar variaes . de componentes intracelulares, ou usar tais variaes ria previso do
comportamento cintico do processo;
Modelos estruturados: as clulas so descritas com maiores detalh~s, considerando, por exemplo, componentes intracelulares, perrnitindo~descrever o estado
das clulas e sua adaptao s mudanas do meio ambiente.

Quanto heterogeneidade da populao rnicrobiana, os modelos cinticos


tambm so classificados em duas categorias, descritas a seguir.
Modelos no segregados: a populao celular considerada homognea, isto ,
todas as clulas apresentam o mesmo comportamento;
Modelos segregados: as clulas so consideradas discretas, corno indivduos
de urna populao heterognea, com distribuio de idade, de tamanho e de pro-
priedades celulares.
Obviamente, os modelos segregados e estruturados oferecem urna descrio
mais detalhada do comportamento cintico do processo ferrnenhitivo que os no
segregados e os no estruturados, mas custa de maior complexidade e maior esforo computacional requerido- em muitos casos a qualidade e a reprodutibilidade dos resultados obtidos no justificam a complexidade e a perda de
generalidade introduzida.
possvel encontrar na literatura algumas tentativas de generalizar a modelagem matemtica de processos ferrnentativos, utilizando proposies no estru. ,

__

___...

'
Formulao dos modelos matemticos de pr~sso5 fermentativos

129

turadas de modelos, visando a utilizao em mdulos da etapa de fermentao em


simuladores de processo. 8 Verifica.:se, entretanto, que essas proposies, por no
acoplarem etapas de ajuste de parmetros e de otimizao de processo, so extremamente limitadas, urna vez que exigem do usurio um conhecimento aprofundado do processo o que, geralmente, no ocorre;

7.2.1.2 - Modelos entraqa-sada

....'
~

Denomina-se modelo entrada-sada de um processo correlao que permite calcular urna ou mais respostas do sistema (suas sadas), a partir de um nmero
definido de variveis de entrada medidas. O principal exemplo de modelos entrada-sada, muito estudado hoje para representar sistemas complexos (caso dos processos ferrnentativos), so as redes neurais. Essas redes foram concebidas a partir
de urna analogia com o funcionamento do crebro humano. Neste, a informao
processada em unidades chamadas neurnios. Cada neurnio recebe a informao proveniente de inmeros outros neurnios atravs de terminais de entrada
chamados dendritos. Essas informaes so sintetizadas no ncleo e, se forem
suficientemente fortes, produziro um sinal que se propaga atravs do axnio at
seus terminais de sada, chamados de sinapses. Finalmente, estas se ligaro a urna
nova camada de neurnios.
As redes neurais artificiais tm urna estrutura anloga descrita, sendo que
a sntese das informaes de entrada feita por urna ponderao dos diversos sinais, atravs de ajustes de coeficientes e urna posterior transformao no linear,
comumente do tipo sigrnide. H diversas proposies de corno interconectar os
diversos neurnios, cada urna definindo urna arquitetura de rede. A escolha de
qual arquitetura, bem corno o nmero de neurnios e de camadas intermedirias,
ser feita sempre ernpiricarnente a partir dos resultados fornecidos pela rede. 9
A rede passa a descrever o sistema corretamente quando o erro entre o resultado medido e o_calculado por ela, a partir dos mesmos dados de entrada, estiver dentro do especificado. Para urna predio correta 'necessrio que se
fornea antes rede um conjunto casado entrada-sada, onde se faro ajuste dos
coeficientes descritos anteriormente. Esse ajuste, que terncorno critrio a rninirnizao do erro medida-predio, tambm designado por fase de treinamento. Finda essa etapa, faz-se sua validao submetendo-se anlise um conjunto de dados
ainda no apresentados rede.
Devido ao escopo introdutrio do presente captulo, no se pretende
apresentar em detalhe a aplicao de redes neurais modelagem de processos
ferrnentativos. O leitor interessado poder encontrar na literatura vrias aplicaes: SYU; TSA0/ 0 na modelagem do crescimento de clulas em processo batelada; WILLIS et al., 11 na modelagem da produo de penicilina via fermentao;
BHAT et al., 12 no controle de urna torre de destilao; ZORZETT0, 13 na utilizao
de redes neurais hbridas para modelar a: etapa ferrnentativa do processo de
produo de vitamina C e SIMUTIS et al./ 4 na utilizao de diferentes redes neurais para representar fases distintas da fermentao alcolica na produo de
cerveja.

L~. . .,.- - ------ -----~------ . ------ ---~-~-- - -------------.--. ---- - -- -- - - - ---- ----_-

!(

130

Modelagem matemtica e simulao de processos fermentativos

7.2.2 - Formulao dos modelos fenomenolgicos no estruturados


O primeiro passo na formulao de um modelo matemtic fenomenolgico
o estabelecimento das variveis de estado d processo, isto , aquelas variveis
que definem em cada instante o estado do sistema (por exemplo, concentraes de
substratos e produtos). Inclui-se tambm na definio do estado de um processo
fermentativo a capacidade (velocidade) das clulas presentes de executar suas
funes vitais, quais sejam: o crescimento ou morte celular, a gerao de produtos
e o consumo de substratos. Em sistemas mais complexos o estado de processos
fermentativos pode incluir a frao de clulas que preservam a capacidade de gerar um determinado produto (capacidade esta introduzida, por exemplo, atravs
de tcnicas de engenharia gentica e que pode ser perdida em funo da instabilidade do microrganismo gerado), a concentrao de um substrato necessrio ao
crescimento celular e que gerado pela ao de uma enzima introduzida no processo, a ao de populaes mistas de clulas, entre outros fenmenos.
Para estudar a dinmica de um processo fermentativo, deve-se buscar:
. identificar os processos que alteram o estado das populaes envolvidas
(crescimento celular, reproduo celular, manuteno da viabilidade celular, morte celular, lise celular, motilidade celular, alteraes morfolgicas
das clulas, como o caso da formao de esporos e finalmente os processos fsicos que incluem entre outros a aderncia das clulas a superfcies
slidas);
identificar os fenmenos ambientais que afetam as velocidades de alterao do estado das populaes;
identificar como as velocidades de alterao do estado das populaes so
afetadas;
identificar como o ambiente afetado pelos processos de alterao do estado das populaes.

7.2.2.1 - Equaes de balano

As equaes de balano do processo devem ser formuladas para cada varivel de estado e para o volume de controle do sistema em estudo. Para os processos
fermentativos realizados em biorreatores homogneos, o volume de controle corresponde ao prprio volume til do biorreator.
Como a formulao e detalhamento das equaes de balano ser vista nos
captulos que tratam dos biorreatores, ser apresentada apenas a equao geral do
balano a ttulo de reviso:

Velocidade de
acmulo no volume
de controle

Velocidade de
entrada no volume
de controle

Velocidade de
sada do volume
de controle

Fonnulao dos modelos matemticos de processos fennentativos

I 3I

Termos de entrada:
fluxo global atravs das fronteiras geomtricas;
difuso atravs das fronteiras geomtricas (importante apenas para biorreatores heterogneos, onde os volumes de controle so infinitesimais);
transporte atravs das fronteiras entre fases (caso do transporte de oxignio da fase gasosa para a fase lquida);
I
gerao dentro do volume de controle (geralmente crescimento celular e
produo de produtos metablicos).
Termos de sada:
fluxo global atravs das fronteiras geomtricas;
difuso atravs das fronteiras geomtricas;
transporte atravs das fronteiras entre fases;
consumo dentro do volume de controle (geralmente morte celular ou consumo de substratos).
Dessa forma, para um processo fermentativo homoneo, as equaes de balano podem ser escritas na seguinte forma generalizada: 5
1 d (Vy)

--- =

dt

Lrger - Lrcons + Dye - yDy

(7.1)

onde: V ... volume de controle;


y ... concentrao da varivel de estado no biorreator;
rger ... velocidades de 9erao do componente representado pela varivel de
estado;
rcons ... velocidades de consumo do componente representado pela varivel
de estado;
D ... vazo especfica de alimentao;
Ye ... concentrao na alimentao;
r ... relao entre a vazo de alimentao e de retirada do biorreator.
Em funo dos balanos de conservao de massa, os modelos matemticos
fenomenolgicos de processos fermentativos podem ser constitudos pelos seguintes tipos de equaes:
equaes algbricas: neste caso, os modelos representam apenas os estados
estacionrios de sistemas homogneos;

equaes diferenciais ordinrias: neste caso, os modelos representam o comportamento dinmico de sistemas homogneos ou os estados estacionrios de
sistemas heterogneos numa nica direo do espao;
equaes diferenciais parciais: neste caso, os models representa!Jl o comportamento dinmico de sistemas heterogneos.

132

Modelagem matemtica e simulao de processos fermentativos

7.2.2.2 - Identificao do sistema de reaes metablicas


Inicialmente, para a construo das equaes de balano de massa do processo e posteriormente na elaborao das equaes cinticas, que representam a
influncia das variveis de estado nas suas velocidades de gerao e de consumo,
fundamental identificar o sistema de reaes metablicas inerente ao processo
em estudo. 16' 17 Por sistema de reaes metablicas entende-se o conjunto simplificado de reaes que permite correlacionar os substratos consumidos aos produtos
gerados (entre os quais est includa a populao microbiana).
Considere-se, a ttulo de exemplo, um processo fermentativo no qual foram
identificadas, a partir de um conjunto de experimentos realizados, 6 variveis de
estado: a concentrao celular (X), as concentraes de 3 substratos (5 1, 5 2 e 5 3) e
as concentraes de 2 produtos (P1 e P 2). Pode-se formular 3 proposies de modelo de reaes metablicas, conforme indicado a seguir.

Proposta 1
Nesta proposta assume-se que o substrato 5 1 consumido pela populao
microbiana para crescer e, juntamente com o substrato 5 2, produzir o produto metablico P 1; o substrato 53 consumido pela populao microbiana para produzir o
produto P 2 Os parmetros k1 a k4 representam os coeficientes estequiomtricos
desse sistema de reaes metablicas, que ilustrado a seguir:
k 1S 1 ~X

kzSl + k3S2 ~ P1
k4S3~P2

Nas propostas 2 e 3, detalhadas a seguir, so apresentadas outras duas alternativas para o sistema de reaes metablicas representativas do processo.

Proposta 2
k 1S 1 + k 2S 2 ~X
k 3S 1 + k 4 S 2 + k 5S3 ~ P1
k6S3~P2

Proposta 3
k 1S1 + k 2S 2 + k 3 S 3

~X

k4S1 + ksSz ~ P1
k 6 S 3 ~P2

Para as 3 propostas de modelo de reaes metablicas elaboram~se. os balanos para os 3 substratos.

!~ j

Formulao dos modelos matemticos de processos fermentativos

13 3

Proposta 1:
dS

dX

dP

1
-=
- - - - - - - - -1

dt

Y x/51 dt

(7.2)

Y Pl/51 dt

dS
dt

Yp 1152

dP
dt

dS 3

dP2

dt

YP2/S3

dt

1
- 2= - - - -

(7.3)

l
(7.4)

-=----

e integrando as eqs. (7.2) a (7.4) do instante "O" at o instante "i" correspondente a


um ponto experimental, obtm-se:

Proposta 2_:
dS

dX

dP

Yx/51

dt

YPl/51

dt

dX

dP

1
-=
- - - - - - - - -1

dt

dS

2
1
-=
---------

dt

Y x/52 dt

(7.8)

'

(7.9)

Y Pl/52 dt

',

dS 3

dP1

dP2

-=--------

dt

Y Pl/53 dt

(7;10)

Y P2/S3 dt

e integrando, novamente, as eqs. (7.8) a (7.10) do instante "O" at o instante "i"


correspondente a um ponto experimental, obtm-se:
(7.11)

~~- ~ -

......

-- .. -~-- -

-- --

'

'\
i

134

Modelagem matemtica e simulao de processos fermentativos

Proposta 3:
dS

dX

dP

1
-=
= - - - - - - - - -1

dt

dS

Y x/ 51 dt

dX

dP

2
-=
= - - - - - - - - -1

dt

dS

Y x/52 dt

dX

Y X/53 dt

(7.15)

Y Pl/52 dt

dP

3
-=
= - - - - - - - -2

dt

(7.14)

Y Pl/ 51 dt

(7.16)

Y P2/ 53 dt

e integrando, mais uma vez, as eqs. (7.14) a (7.16) do instante "O" at o instante "i"
correspondente a um ponto experimental, obtm-se:

Para cada proposta e para cada uma das 9 eqs. lineares (7.5) a (7.7), (7.11) a
(7.13) e (7.17) a (7.19), obtidas para as 3 propostas de modelo metablico formuladas, calcula-se a regresso linear ou multilinear, dependendo do caso, obtendo-se os coeficientes de correlao para cada ensaio e para o conjunto de ensaios
disponveis. Escolhe-se, como a mais apropriada, a proposta que apresenta o melhor conjunto de coeficientes de correlao, analisando as duas situaes (por ensaio e global).

Formulao dos modelos matemticos de processos fermentativos

13 5

EXEMPLO NUMRICO

Ser desenvolvido ao longo deste captulo, como estudo da modelagem matemtica de processos fermentativos, a modelagem do processo de produo de
etanol a partir de hidrolisado de mandioca. 18' 19
Nesse processo foram identificadas 3 variveis de estado: a concentrao de
leveduras (X), a concentra9 de etanol (P) e a concentrao de substrato limitante, a glicose de hidrolisado do amido de mandioca (S). So apresentados na Tabela
7.1 os dados experimentais obtidos em 4 ensaios realizados no laboratrio, num
biorreator operado em batelada, partindo de diferentes concentraes iniciais de
acares redutores.' Observe-se que esses dados experimentais foram ligeiramente
modificados, em relao aos originais (reportados nos trabalhos referenciados),
com o intuito de tornar mais didticos alguns aspectos dos exemplos apresentados
ao longo deste captulo.
EXEMPLO NUMRICO-ETAPA 1

Considerem-se duas propostas de modelo de reaes metablicas para representar o processo em estudo:

Proposta 1:

k 1 S~

k 1 S~P

Nessa primeira proposta, considera-se que a glicose consumida pela levedura para crescer e para produzir etanol.

Proposta 2: k 3 S ~ P
Nessa segunda proposta, as leveduras no consomem glicose para o seu
crescimento (crescem a partir de outra fonte de carbono no limitante no processo
e portanto no includa como varivel de estado caso, por exemplo, do extrato de
levedura).
.
Elaborando os balanos de massa do substrato S para as 2 propostas de modelo metablico, obtm-se:

Proposta 1: .S = -aflX - MP
Proposta 2:

.S =-eM

Realizando a regresso multilinear para balano de massa obtido com a


Proposta 1 e a regresso linear para a Proposta 2 com os dados experimentais
apresentados (Tab. 7.1), obtm-se o resultado sintetizado na Tabela 7.2. Essas
regresses so realizadas considerando, em cada instante de tempo "i", o substrato consumido e as clulas e produto produzidas desde o instante "O" at o
instante "i".

- - ------------ --- .,.- -

. - .. ----- - c-------- - -- -- - - -- - --- ---- ------ -.......... ,..

~- - - -- - ----

136

Modelagem matemtica e simulao de processos fermentativos

Tabela 7.1 - Dados experimentais() do processo de produo de etano! a partir de hidrolisado de mandiocaExemplo numrico.

Ensaio 2

Ensaio 1

t (h)

X (g/L)

p (g\L)

S (g/L)

t (h)

X (g/L)

p (g/L)

S (g/L)

0,0

0,378

1,92

20,8

0,0

0,845

2,44

85,1

1,0

0,652

2,54

17,6

1,0

1,08

2,88

76,8

2,0

1,17

3,54

14,8

2,0

' 1,88

3,54

76,3

3,0

1,54

4,65

10,3

3,0

2,98

5,34

74,8

4,0

1,84

5,96

5,80

4,0

3,92

7,52

56,9

5,0

2,36

6,64.

2,34

5,0

5,77

10,5

42,2

6,0

2,20

7,19

0,512

6,0

7,14

17,6

28,8

7,0

2,23

6,74

0,088

7,0

10,6

22,8

7,65

8,0

10,3

24,7

0,198

9,0

7,70

24,4

0,002

Ensaio 3

Ensaio 4

t (h)

X (g/L)

p (g/L)

S (g/L)

t (h)

X (g/L)

0,0

0,410

2,71

136

0,0

1,12

- 2,02

227

1,0

0,819

2,78

130

1,0

1,29

2,56

236

2,0

1,14

3,06

131

2,0

2,29

2,90

221

3,0

1,72

3,43

134

3,0

2,68

3,82

213

4,0

2,57

4,78

130

4,0

4,36

4,44

198

5,0

4,01

6,78

120

5,0

6,18

6,69

198

6,0

4,68

8,34

106

6,0

7,70

9,31

195

7,0

6,60

11,7

100

7,0

11,1

11,3

178

8,0

9,51

15,4

69,8

8,0

13,6

15,2

160

9,0

12,6

23,0

47,5

9,0

18,3

21,0

123

10,0

12,3

28,1

18,3

10,0

18,6

31,2

76,4

11,0

14,2

38,2

0,812

11,0

22,3

39,4

46,2

12,0

15,2

37,7

0,003

12,0

29,9

53,8

11,9

13,0

25,2

54,4

0,054 .

p (g/L)

S (g/L)

(*) Dados experimentais foram gerados considerando um erro experimental aleatrio obedecendo uma
distribuio normal (mdia = 0,0 e desvio padro = I ,0) de I 0% para as medidas de X e 5% para as medidas de S e P.

Fonnulao dos modelos matemticos de procssos fennentativos

137

Pelos resultados obtidos, verifica-se que a Proposta 1 a mais adequada,


pois todos os coeficientes de correlao obtidos para cada ensaio so melhores ou
iguais (caso do Ensaio 1), o mesmo ocorrendo com o coeficiente de correlao obtido quando considerado o conjunto dos 4 ensaios. A discrepncia dos valores de
a e b obtidos para o Ensaio 1 (estimativas de 1/Yx;s e 1/Yp;s respectivamente) em
relao aos outros 3 ensaios explicada pelo erro experimental introduzido nos
dados. Urna possvel estimativa preliminar dos valores de Yx;s e Yp;s num futuro
ajuste de um modelo matemtico aos dados apresentados na Tabela 7.1, sero os
valores de a e b ajustados na regresso obtida com o conjunto de 4 ensaios. Deve-se destacar que, na presente anlise, considerou-se que o erro experimental e as
ineficincias do processo esto distribudas entre X e P, o que explica porque o valor de Yp;s obtido no o valor estequiorntrico 0,511.
Tabela 7.2 - Resultado das regresses multi linear e linear para as 2 propostas do Exemplo numrico - Etapa I.
ENSAIO

PROPOSTA I

PROPOSTA2

.S=-a.X-btl.P

.S=-ctl.P

a = 0,745; b = 3,66

c= 3,95

R= 0,992

R= 0,992

a = 2,31; b = 2,94

c= 3,90

R= 0,987

R= 0,983

4
...

Global
r~"i

_\.;,.

':'i:.
r
th
#f

.~,C;

.:-rJ)
.')

f]~

R= 0,994

c= 4,11
R= 0,989

J)l
1 ~11

a = 2,39; b = 3,19

c= 4,53

I ~(

R= 0,993

R= 0,988

a = 2,81; b = 2,88

c= 4,33

R= 0,993

R= 0,987

~~
~~

a = 2,73; b = 2,84

..
~'!=

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1 ~1.

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....~.

' ":1 ~ .

~ ~.

~)):': r.~

7.2.2.3 - Equaes cinticas


Conforme j indicado anteriormente, na construo das equaes cinticas
que reside toda a dificuldade e, portanto, toda a arte da formulao dos modelos
fenomenolgicos dos processos ferrnentativos. So as equaes cinticas que indicam corno as variveis de estado do processo em estudo interferem nas velocidades de crescimento e morte celular, de gerao de produtos metablicos e de
consumo de substrato.
Para formular os modelos cinticos, a partir de dados experimentais, necessrio executar trs etapas bsicas, descritas a seguir.

Tratamento dos dados experimentais


Entende-se por tratamento dos dados experimentais, medidos em laboratrio, a correo ou transformao dos mesmos buscando adequ-los anlise dese-

138

Modelagem matemtica e simulao de processos ferrnentativos

jada. Quando os ensaios so conduzidos em processos batelada e contnuo, a


volume constante, deve-se trat-los, por exemplo, desprezando pontos experimentais que apresentem erros grosseiros, podendo-se, geralmente, trabalhar na anlise dos dados experimentais com base nas concentraes dos componentes (ou
seja, as prprias variveis de estado medidas). Em processos fermentativos, onde
se obtm altas concentraes celulares de microrganismos em biorreatores, so
empregados processos operados em bateladas sucessivas ou bateladas alimentadas (volume varivel) e, neste segundo caso, costuma-se tratar os dados, medidos
em concentrao, transformando-os em massa. Para o clculo das velocidades especficas e dos fatores de converso, utiliza-se, efetivamente, a massa consumida
ou produzida ao longo do processo. Normalmente, quando realizada uma correo dos valores medidos, corrige-se apenas o volume do reator considerando ovolume evaporado, alimentado, da amostragem e da adio de cido ou base para o
controle de pH. Contudo, no considerado que, com a retirada de meio para
amostragem, ocorram modificaes no estado do processo, pois as massas de todos os componentes do biorreator (substratos, produtos e clulas) so alteradas.
Para tanto, necessita-se corrigir os valores experimentais das variveis de
estado, reproduzindo uma situao de ausncia de perturbaes, ou seja, a situao na qual nenhuma massa de produto, substrato e clula estivesse sendo retirada. Por meio de balanos de massa, aplicados a cada varivel de estado inerente
ao processo, obtm-se os valores em massa destas variveis, j devidamente corrigidos. TAKANO et al. 20 mostram em seu trabalho que, quando ocorrem grandes
perturbaes do sistema, deve-se corrigir os dados experimentais antes de proceder ao clculo das velocidades especficas e dos fatores de converso, pois o erro
destes parmetros do processo torna-se significativo, podendo causar problemas
quando da formulao e do ajuste dos parmetros do modelo matemtico, ou
quando estes parmetros do processo forem utilizados para o projeto do biorreator em escala industrial.
Uma vez tratados os dados experimentais, procede-se identificao do sistema de reaes metablicas, obtendo-se uma primeira estimativa do~ fatores de
converso, conforme ilustrado na Etapa 1 do exemplo numrico.

Clculo das velocidades especficas


Nessa etapa so calculadas as velocidades especficas de crescimento e de
gerao de produtos necessrias para identificar o comportamento cintico da populao microbiana; o clculo das velocidades especficas de consumo dos substratos limitantes do processo importante para identificar possveis consumos
desses substratos para manuteno. O clculo das velocidades especficas de crescimento e produo o primeiro passo para uma boa formulao ajuste de um
modelo matemtico de processos fermentativos. Sua importncia reside fundamentalmente em dois aspectos:
formulao de relaes cinticas que, juntamente com os balanos de massa, so a base para a construo do modelo;
obteno de estimativas preliminares dos parmetros por meio de simplificaes e linearizaes do modelo a serem usadas, posteriormente, como
ponto de partida nas metodologias para ajuste de parmetros/l

Fonnulao dos modelos matemticos de processos fennentativos

IJ 9

Dessa forma, caracteriza-se a importncia do clculo cuidadoso das velocidades especficas de crescimento e de produo de produtos metablicos a partir
dos dados experimentais, clculo este que dificultado pela forte influncia que
pequenas alteraes das variveis exercem sobre o clculo da sua velocidade. A
seguir so listadas as etapas de uma metodologia que pode ser empregada para o
clculo da velocidade especfica de crescimento. 22
(a) Deteco da fase de l:rescimento exponencial. Traa-se o grfico (ln X) vs. (t)
para diferentes limites iniciais e finais de tempo, determinando-se, atravs do melhor
coeficiente de correlao, o incio e a durao da fase exponencial de crescimento; o
coeficiente angular da melhor correlao fornecer o valor de 1-lm - velocidade especfica mxima de crescimento.
(b) Aprimoramento da curva de (X) vs. (t). Recuperando-se os valores de X que
satisfazem a regresso linear escolhida na etapa anterior, aprimora-se a curva de
(X) vs. (t) durante a fase exponencial.
(c) Clculo da velocidade especifica de crescimento. Com a nova curva (X) vs. (t)
obtm-se a curva da velocidade especfica de crescimento, utilizando-se um dos
trs mtodos descritos a seguir:
Mtodo de ajuste polinomial. Ajusta-se um polinmio de grau n no tempo aos
valores de X disponveis, obtendo-se, desta forma, a funo de X com o tempo. Anlises visuais e quantitativas (atravs do coeficiente de correlao) definem o grau do polinmio a ser ajustado. Obtido o polinmio, sua derivada
fornece os valores da velocidade de crescimento, permitindo o clculo das
velocidades especficas no instante. 23

Mtodo "splne". Existem diferentes mtodos ditos "spline" na literatura tcnica. Um dos mtodos "spline" que pode ser empregado ajusta um polinmio de grau n a um intervalo de dois pontos de X, incorporando um nmero
de pontos " frente" do intervalo a ser definido; alm disto, o mtodo obriga
a que a derivada do polinmio _a justado no intervalo anterior seja igual derivada do polinmio ajustado no novo intervalo, no ponto de interseco
(caracterstica dos mtodos "spline"). Atravs de testes visuais define-se o
grau do polinmio a ser ajustado, bem como o nmero de pontos " frente"
includos no ajuste. 24

Mtodo geomtrico. Esse mtodo calcula a circunferncia que passa por trs
pontos (o valor de X correspondente ao instante de tempo no qual se quer
calcular a velocidade de crescimento, o anterior e o posterior). A derivada
calculada pela tangente circunferncia no ponto 25 -vide; neste mesmo volume, o Adendo ao Captulo 6: Cintica de Processos Fermentativos .
Para o clculo das velocidades especficas de gerao de produtos metablicos, utiliza-se um procedimento semelhante ao descrito para o clculo da
velocidade especfica de crescimento. .evidente que, quando a gerao do
produto no totalmente associada ao crescimento, no possvel realizar as

I'

~ :~~i:,~~=~;~d~;~~i!::I::~:~-~rescm.en.to,.na medida em .qu~~~ exiSte... --~

140

Modelagem matemtica e simulao de processos fermentativos

EXEMPLO NUMRICO-ETAPA 2
Ser exemplificado o clculo da velocidade especfica de crescimento para o
Ensaio 1, cujos dados foram fornecidos na Tabela 7.1. Sendo que 'o Ensaio 1 , dos
quatro ensaios fornecidos, aquele em que a quantidade de produto formada menor, ser tambm o ensaio com possibilidade de apresentar o mais prximo de
uma fase exponencial de crescimento. A seguir, sero aplicadas as trs etapas descritas anteriormente para o clculo da velocidade especfica de crescimento.
(1) Determinao da fase exponencial de crescimento- regresso linear dos
dados de (ln X) vs. (t)- Figura 7.2.
Ensaio 1

0,5

><

.f:

-0,5

-1

=0,5649 X- 0,9795
R2 =0,9996

-1,5
Tempo (h)

Figura 7.2 - Definio da fase exponencial de crescimento para o Ensaio I (X= concentrao celular em g/L) . .

Para a definio da fase exponencial de crescimento assumiu-se que ela tem


incio no instante t =O h, na medida em que o Ensaio 1 foi realizado com 50 baixo,
portanto, sem inibio pelo substrato. Assumiu-se tambm como desprezvel a fase
de adaptao.
.
A Tabela 7.3 apresenta o resultado da determinao da fase exponencial de
crescimento.

Tabela 7.3 - Resultados da determinao da fase exponencial de crescimento para o Ensaio I (Tabela 7.1 ).

Durao da fase exponencial


(h)

llm (h-

0,565

0,9998

0,480

0,989

I~

1~.
:

"l;:

0,402

0,975

0,358

0,973

~:"

i;~;-.~:

.:t~:"' ~~t.i,k,;i

. ~ ...

~~

.'!.:..:. rtcc <-:--!..:-'" ~ 'P~'"' -;;~.:,_.,~~ar. ~,~,.J.: D

Pelos resultados apresentados na Tabela 7.3, evidente que uma possvel


fase exponencial para o Ensaio 1 tem a durao de 2 h e uma estimativa preliminar
.
de flm 0,565 h -1.

Formulao dos modelos matemticos de processos fermentativos

14 I

(2) Determinao da curva de (X) vs. (t), obtendo-se um melhor detalhamento ao longo da fase exponencial, utilizando sua definio (regresso linear) obtida
na etapa anterior. O grfico de (X) vs. (t) apresentado na Figura 7.3.
3
2,5
:::::;-

:9
><

2
1,5
1
0,5

o
o

Tempo (h)

Figura 7.3 - Grfico de X em funo do tempo, onde () representa, alm dos valores experimentais, os valores
obtidos da definio da fase exponencial (Fig. 7.2) e(-) representa a curva traada visualmente.

(3) A partir dos dados de (X) vs. (t) obtidos com base na curva traada na Figura 7.3, obtido o grfico de (/l) vs. (t), utilizando o mtodo geomtrico, descrito
anteriormente, utilizando a planilha apresentada no Adendo ao Captulo 6 deste
volume. A Figura 7.4 apresenta o resultado dos valores de ll calculados, verificando-se a concordncia da fase exponencial previamente definida, com o valor
de Jl = llm (patamar da Fig. 7.4).
0,7
0,6

0,5

:'
..--

:(

0,4
0,3
0,2
0,1

Tempo (h)

Figura 7.4 - Grfico da velocidade especfica de crescimento calculada a partir da curva de X (Fig. 7 .3) utilizando o
Mtodo Geomtrico2s.

Identificao dos fenmenos .


Nessa etapa busca-se definir os principais fenmenos que interferem no processo produtivo em anlise: limitaes e inibies por substratos, principalmente
no que se refere existncia e ao nmero de substratos limitantes e/ ou inibidores,
tipo de produto gerado- existncia ou no de associao com o crescimento, entre
outros.

142

Modelagem matemtica e simulao de processos fermentativos

Uma vez obtidos grficos que permitem analisar o comportamento das velocidades especficas de crescimento, de gerao de produto metablico e de consumo de substratos, possvel identificar os principais fenmenos l serem includos
na construo de um modelo matemtico no estruturado de processos fermentativos. O Quadro 7.1 sintetiza os modelos cinticos mais empregados para representar os fenmenos comumente identificados em processos fermentativos, alguns
dos quais j foram abordados em detalhe no Captulo 6: Cintica de Processos Fermentativos.
EXEMPLO NUMRICO- ETAPA 3
Com o intuito de exemplificar a identificab dos fenmenos, necessria
construo do modelo matemtico, ser identificado qual tipo de inibio do crescimento celular pelo produto (etanol) ocorre na fermentao alcolica utilizada
como caso estudo neste Captulo. A Tabela 7.4 apresenta os dados de f.lx e P obtidos (por interpolao) para os ensaios definidos na Tabela 7.1, no instante em que
a quantidade de 5 residual no biorreator igual para todos os 4 ensaios - foram
consideradas duas situaes 5 = 20,0g/L e 10,0 g/L.
Quadro 7 .I - Modelos cinticos no estruturados, descritos na literatura, para representao
de diversos fenmenos identificados em processos fermentativos.

(1) Crescimento num nico substrato limitante:


(MONOD)

- J.lrnsn
f.lx- K~ +Sn

f.l x =

(MOSER)

26

(7.20)

27

(7.21)

(CONTOIS)

J.lrnS

28

(7.22)

K 5 X+S

(2) Morte celular:


(SINCLAIR; KRISTIANSEN) 15 (7.23)

f.lct =-Kct

(3) Crescimento num nico substrato limitante e inibidor:


1-lx =

l-las

K +5+s

K-

(ANDREWS/

(7.24)

143

Formulao dos modelos matemticos de processos ferrnentativos

Quadro 7.I - (continuao)

(WU et al/

(7.25)

(4) Crescimento com mltiplo substrato limitante (uso preferencial de 51):

(5) Crescimento com mltiplo substrato limitante (uso simultneo de 5 1 e

(MEGEE et al.)

(TSAO; HANSON)

32

33

(7.27)

(7.28)

(6) Consumo do substrato limitante para manuteno:

(PIRT)

Jl s

=--

Y x/ s J.l X

+m +Ll
s

S -5*
K * +S - S *

max - - - -

J.l s

34

(ZENG; DECKWER)

(7.29)

35

(7.30)

(7) Produo de produto metablico associado e no associado


ao crescimento:
(LUEDEKING; PIRET modificado) 36 (7.31)

144

Modelagem matemtica e simulao de processos fermentativos

Quadro 7.1 -(continuao)

(8) Produo de produto metablico inibitrio:

(7.32)

K'

f.!=~
p
P
K'+SK'+P
s
p

(AIBA; SHODA)

37

(7.33)

(7.34)

f.!

f.!~S

P-

K's +5

e-KP
p

(AIBA et al.)

38

(7.35)

(7.36)

f.! P

f.!~S

K~ +S

(1 - P:n J
p

(GHOSE; TYAGI)

onde: f.!x .. ... velocidade especfica de crescimento


f.!ct .. ... velocidade especfica de morte
f.!p ..... velocidade especfica de produo
f.!s ..... velocidade especfica de consumo de substrato
S, Sv 5 2, 5 3 concentraes de substratos limitantes
5* .... . concentrao de S para manter f.!x
X ..... concentrao celular
P ..... concentrao de produto
Yx/s ... fator de converso de substrato em clulas
m ..... consumo de substrato para manuteno
f.!m, K., n, Kct, f.!a, K;, f.!m1' f.!mz, K.v K.z, K.3,
f.!o, f.!I, f.!z, l1f.! :;ax, K*' O., J3m, K~., KP, f.!~'
~
. 't"lCOS
, K'p, Pmt P'rn ... . .. param
K s,
e t r os Cine

39

(7.37)

145

Formulao dos modelos matemticos de processos fermentativos

Tabela 7.4 - Valores de llx e P quando Sresidual = 20 e IOg/L


,_

Sresidual = 20,0 g/L

Ensaos
p (g/L)

f.!x (h-

Sresidual
1

= 10,0 g/L

p (g/L)

f.!x (h-

2,12

0,565

4,78

0,255

1&',0

0,219

21,2

0,161

30,0

0,129

33)

0,0901

50,5

0,0523

54,7
-

4
-~-

'

'

"'

--

'

'-

'-

,.

'.:r,..

0,0364
. ,.
--.-

,,.

As Figuras 7.5 a 7.7 apresentam a representao das formas linearizadas das


3 diferentes alternativas de modelo para a inibio do crescimento celular pelo
produto consideradas neste Captulo (vide Quadro 7.1).

(1) Inibio hiperblica: 37


1
1
1
- = - + --- P
1-L x 1-Ls 1-Ls*K p

(7.38)

onde

(2) Inibio exponencial: 38


(7.39)

(3) Inibio linear: 39

11

r- x

=li-

r-s

1-Ls P
p

(7.40)

Pelos resultados apresentados nas Figuras 7.5 a 7.7, evidehte que o modelo
cintico de inibio do crescimento microbiano pelo produto, que representa adequadamente os dados experimentais de fermentao alcolica, o modelo de ini
_
bio exponencial38 (Fig. 7.6).

146

Modelagem matemtica e simulao de processos fermentativos

(B) S = 20 g/L

(A) S = 10 g/L
30
25

y = 0,4773x- 1,4723

R2

20

:2
....... .

.f

25

= 0,8937

;s

15

R2

= 0,9277

15

10

10

y = 0,3597x - 0,745

20

5
20

oo

60

40

20

p (g/L)

60

40

p (g/L)
37

Figura 7.5 - Tentativa de representao da inibio pelo produto atravs do modelo hiperblico.

(A) S,esidual

I 0,0 g/L e (B) S,esidual

= 20,0 g/L.

(B) S = 20 g/L

(A)S=10g/L
3,5

3,5

2,5
2

'

1,5

~
.E:

2,5
2
1,5
1

y = 0,0397x + 1 ,094
R2=

0 ,5
00

0,9897
40

20

y = 0,0486x + 0,5484
R2 = 0 ,9933

0,5
00

60

20

p (g/L)

60

40

p (g/L)
38

Figura 7.6 - Tentativa de representao da inibio pelo produto atravs do modelo exponencia1.

(A) S,. ,;dual

I 0,0 g/L e (B)

Sresidual

= 20,0 g/L.

(A) S = 10 g/L

(B) S
0,6

0,3

0,25

y =-0,0044x + 0,2615

0,5

R2 = 0,9612

0,4

0,2

,s

0,15

,s

0,3

0,2

0,1

=20 g/L

y =-0,0101 X+ 0,496
R2 = 0,8325

0,1

0,05

60

20

o
o

-0,1

p (g/L)

20

40

p (g/L)

Figura 7.7 - Tentativa de representao da inibio pelo produto atravs do modelo linear

(A) S,.,;dual = I 0,0 g/L e (B) S,.,;dua = 20,0 g/L.

39

60

Formulao dos modelos matemticos de processos fermentativos

147

7.2.2.4 - Modelos fenomenolgicos no estruturados com culturas mistas

A existncia de mltiplas populaes de microrganismos num processo fermentativo provocar o aparecimento de interaes, nas quais uma populao
exercer algum efeito sobre as outras. Considerando duas espcies microbianas A
e B, trs tipos de interaes podero ocorrer entre elas: um efeito positivo(+) (benfico), um efeito negativo(-) ou um efeito neutro (0). O Quadro 7.2 ilustra as diferentes alternativas de interaes entre as diversas populaes microbianas
presentes num processo fermentativo.
A formulao dos modelos no estruturados com culturas mistas segue a
mesma estratgia j apresentada para os modelos com culturas puras, sendo a bvia e nica dificuldade adicional a necessidade de medir e identificar os fenmenos inerentes a cada populao integrante do sistema. O leitor interessado poder
encontrar mais detalhes sobre modelos no estruturados com culturas mistas em
FREDRICKSON; TSUCHIYA.

Quadro 7.2 - Diferentes interaes entre populaes microbianas.

Populao microbiana
Tipo de interao

Neutralismo

Mutualismo

Competio
Comensalismo

Parasitismo ou Predao

+
+

Amensalismo

7.2.3 - Modelos fenomenolgicos estruturados


Entende-se por crescimento balanceado o crescimento microbiano no qual a
velocidade de produo de um componente da biomassa por unidade de biomassa
constante, igual para todos os componentes da biomassa e igual velocidade especfica de crescimento da prpria biomassa. Somente nessa condio de crescimento que a formulao de modelos no estruturados perfeitamente
justificada. Na prtica o crescimento balanceado s ocorre no estado estacionrio
em fermentaes contnuas e durante a fase exponencial de crescimento em fer-

II

- .. J

148

Modelagem matemtica e simulao de processos fennentativos

mentaes em batelada. Dessa forma, na maioria dos casos, a caracterizao da


atividade biolgica simplesmente pela concentrao total de biomassa insuficiente para uma representao adequada de dados experimentais pelo modelo matemtico formulado. 40' 41 ' 42 Vrios experimentos tm mostrado que a composio da
biomassa de uma populao microbiana varia em resposta a alteraes nas condies do ambiente. Variaes na composio da biomassa so acompanhadas por
alteraes na natureza de processos subcelulares. Essas variaes na atividade da
biomassa por unidade de concentrao de biomassa podem ser causadas por:
perda de plasmdeos;
induo e represso de genes;
variao no contedo de RNA da clula microbiana;
variao no contedo enzimtico da clula microbiana;
acmulo de materiais de reserva da clula microbiana;
alteraes morfolgicas, por exemplo ramificao de organismos filamentosos, relao volume/superfcie de clulas de leveduras e bactrias, etc.
Essas variaes na atividade e composio da biomassa microbiana requerem uma descrio mais complexa do metabolismo celular e uma estratgia mais
estruturada para modelar a cintica microbiana. Em geral, muito difcil obter experimentalmente um conhecimento mecanstico, a respeito do metabolismo celular, para o desenvolvimento de um modelo estruturado "realista". A estimativa de
parmetros pode ser muito difcil e a aplicao de mtodos numricos complexos
pode facilmente levar a resultados sem significado fsico. Por esse motivo, modelos estruturados de processos fermentativos raramente so utilizados com vistas
utilizao no projeto de biorreatores e na implementao de uma estratgia de
controle.
Alm das dificuldades acima expostas, um cuidado adicional deve ser tomado na formulao dos modelos estruturados, quando da montagem das equaes
de balano para os componentes intracelulares - deve ser considerado um termo

de diluio do componente provocado pelo crescimento celular. 43


No sero apresentados mais detalhes dos modelos estruturados de processos fermentativos, em funo da sua complexidade e das questes prticas j
apontadas, que dificultam sua utilizao. O leitor interessado poder encontrar na
literatura especializada excelentes revises e textos que lhe permitiro aprofundar
seus conhecimentos nessa categoria de modelos.43

7.3 - Ajuste de parmetros do modelo formulado


Em um processo fermentativo, conduzido num biorreator homogneo, o
modelo formulado, conforme detalhado no item anterior, representado por
equaes matemticas do tipo equaes diferenciais ordinrias de condio inicial
(EDO). O ajuste do modelo aos dados feito pelo clculo do melhor conjunto de
parmetros, que tornam mnima a diferena entre os dados previstos pelo modelo
e os dados experimentais.
O problema de estimao de parmetros em EDO pode ser resolvido, em
princpio, por duas abordagens distintas:44

Ajuste de parmetros do modelo formulado

149

diferenciao dos dados experimentais, para obteno direta dos valores


das velocidades de reao; neste caso, transforma-se o problema em um de
estimao com equaes algbricas- o chamado "mtodo diferencial";
dependendo do modelo, as equaes podem ser linearizadas, facilitando a
obteno dos parmetros (vide item 7.3.1);
integrao analtica (quando o modelo simples) ou numrica das EDO
do modelo, ajustando-se o modelo aos dados diretamente medidos- o
chamado "mtodo integral indireto" (vide itens 7.3.2 e 7.3.3).
A primeira tcnica conceitualmente simples, mas apresenta um inconveniente bastante srio na operao de diferenciao de dados experimentais. Essa
operao costuma ampliar drasticamente os erros experimentais, levando a valores pouco confiveis das derivadas, especialmente se o conjunto de dados no for
denso e se a disperso dos dados no for pequena. A segunda tcnica conceitualmente mais adequada, mas requer maior esforo computacional.

7.3.1 - Linearizao do modelo


Essa tcnica, conceitualmente simples, de ajuste de parmetros de um modelo matemtico de um processo fermentativo, exige a diferenciao dos dados experimentais, obtendo-se valores das velocidades especficas de crescimento e/ ou
produo. Se for tomado como exemplo um crescimento microbiano num biorreator operado em batelada e que obedece cintica de Monod, obtm-se o seguinte
modelo matemtico:
(7.41)

dS

dt = ; Yx;s

dX

dt

(7.42)

Nesse modelo existem 3 parmetros a serem ajustados a um conjunto de dados experimentais: Jlm, K 5 e Yx;s Esse ajuste pode ser obtido atravs de 2 regresses lineares. A primeira correlaciona o inverso da velocidade especfica de
crescimento (1/J.t)o com o inverso da concentrao de substrato (1/5) 0 no instante
inicial, conhecido como o grfico de Lineweaver-Burk, onde o coeficiente angular
igual a (K5 /Jlm) e o coeficiente linear a (1/J.tm) (Fig. 7.8) .
Geralmente, sugere-se construir o grfico de Lineweaver-Burk a partir de
valores iniciais de 1 I Jl e 1 I S obtidos para diferentes ensaios (nos quais determinada a velocidade especfica de crescimento inicial para diferentes valores de S no
instante inicial), visando reduzir possveis efeitos inibitrios de produtos metablicos gerados durante o crescimento microbiano, na velocidade especfica calculada. claro que, se o intuito for determinar a existncia ou no desses efeitos,
interessante traar o grfico de Lineweaver-Burk a partir de um ou mais ensaios,
mas considerando relaes entre 1/Jl e 1/S em diferentes tempos de crescimento.

L ___ _

I S

Modelagem matemtica e simulao de processos fermentativos

A partir do grfico da Figura 7.8 possvel obter a estimativa dos valores de


1

Jlm e Ks.
25~--------------------------~

20
~

15

.!
..... 10
y = 1,7112x + 3,3244
R2 = 0,992

o+--------.-------.---------l

10

15

1/S (Ug)

Figura 7.8 - Grfico de Lineweaver-Burk para o clculo de 1-lm e Ks para o crescimento em batelada segundo o modelo cintico de Monod. Os dados do grfico so apenas ilustrativos, no refletindo valores obtidos experimentalmente.

Jlm

1
=0 301 h-1
3 3244
1

'

Ks =1 17112 *Jlm =01515g/L


A segunda regresso linear para ajuste dos parmetros do modelo proposto
correlaciona os dados disponveis de X produzido em relao ao consumo de S
para diferentes intervalos de tempo. O coeficiente angular dessa correlao igual
ao parmetro Yx;s (Fig. 7.9).
A regresso linear representada no grfico da Figura 7.9 permite obter o va.
lor de Y x;s:

Yx;s = 01545g I g

obtido
sendo que o coeficiente linear da regresso deveria ser nulo; o valor 0 076
reflete imprecises do modelo e erro experimental inerente a dados obtidos em laboratrio.
1

120
100
::J

80

60

'

><

40

y = 0,545x + 0,076

20

R2 = 0,991

100

200

300

SO- Si (g/L)

Figura 7.9 - Grfico para obteno de Yx;s Os dados do grfico so apenas ilustrativos, no refletindo
valores obtidos experimentalmente.

Ajuste de parmetros do modelo formulado

I5 I

DOWD; RIGGS 45 avaliaram estatisticamente qual a melhor forma de linearizar a equao de Michaelis-Menten para a cintica enzimtica, aplicvel, por analogia, ao ajuste do modelo de crescimento segundo Monod. Propuseram 3 formas
diferentes de linearizao:
(7.43)

(7.44)

(7.45)

Nesse estudo estimativas de K5 e J.lm, obtidas a partir de "dados experimentais"


(construdos introduzindo um erro aleatrio em dados simulados), so comparadas em cada caso com os seus valores verdadeiros (utilizados na simulao para
obteno dos dados sem erro), de modo que o comportamento das transformaes
(7.43) a (7.45) foi avaliado. O resultado dessa anlise pode ser assim sintetizado:
obter estimativas de J.lm e K5 pelo mtodo de Lineweaver-Burk (3." transformao) eram destacadamente as menos confiveis, qualquer que fosse o erro
na determinao de J.t;
.
plotar (SI J.l) contra (S) ligeiramente melhor do que plota~ (J.t) contra (J.t/ S),
quando o erro nos valores de J.l pequeno, mas o inverso ocorre quando o
erro de J.l grande (situao que geralmente ocorre nos processos fermentativos);
plotar (J.t) contra (J.t/ S) tem a vantagem adicional de avisar o pesquisador
quando os seus dados desviam da relao terica visto que, normalmente,
este ajuste exagera esse desvio;
utilizar a transformao de Lineweaver-Burk leva obteno de um bom
ajuste, mesmo com pontos no confiveis - esta pode ser a justificativa
para a popularidade desta transformao.

EXEMPLO NUMRICO- ETAPA 4


Ajuste para o modelo de fermentao alcolica 18.1 9 a partir de hidrolisado de
mandioca em um sistema batelada. O modelo matemtico no estruturado, proposto aps a identificao dos principais fenmenos envolvidos no processo (vide
discusses nas etapas 2 e 3), composto pelas eqs. (7.46) a (7.50).
(7.46)

'I

r 'r
I

I I

:i
I,

'l

I 52

Modelagem matemtica e simulao de processos fermentativos

dS=
dt

{1

1 )

(7.47)

--flxX +--flpX

Yx;s

Yr;s

dP

(7.48)

-=flpX
dt
onde:

(7.49)

fl p =

flraS

-K' P

(7.50)

52 e "

K 5' +5+K~
I

A seguir ser exemplificada a obteno da estimativa preliminar dos parmetros atravs da linearizao e simplificao do modelo, e seu ajuste aos dados
experimentais (Tab. 7.1).

(1) Estimativa de KP e K~

A partir das equaes (7.49) e (7.50), obtm-se:

(7.51)

(7.52)
onde: f.!: e fl~ so os termos funes de Sem flx e f.!p, quando S constante.
Para um valor de S constante, por exemplo, S = 10g/L (utilizando o mesmo procedimento exemplificado na Etapa 3 para identificao do tipo de inibio pelo produto) so traados os grficos de ln(f.!x) vs. P (Fig. 7.6(A)- Etapa 3)
e ln(f.!p) vs. P (Fig. 7.10) com os dados de flx, flp e P correspondentes a esse valor
de S nos 4 ensaios disponveis. Os coeficientes angulares das retas ajustadas
so as estimativas de KP e K~. Pela metodologia proposta, torna:-se evidente
que a estimativa obtida ser to mais precisa quanto maior for o nmero de ensaios disponveis.

153

Ajuste de parmetros do modelo formulado

0,8 . , - - - - - - - --

-----,

0,7
0,6
~ 0,5

0,4
0,3

0,2

.0,
1

y = 0,0142 X + 0,0219
R2 = 0 ,9674

o+----.~~~~~-~

20

40

60

p (g/L)

Figura 7 .I O - Grfico para obteno da estimativa de K~ .

(2) Estimativa de 1-lxa, K5, 1-lPa e K ~


Para um ensaio com valores de 5 suficientemente baixos (Ensaio 1, por
exemplo), possvel desconsiderar a existncia dos termos de inibio das velocidades especficas de crescimento e produo pelo substrato (eqs. 7.49 e 7.50, termos 5 2 I K; e 5 2 I Ki). Dessa forma, possvel linearizar essas equaes.
e -KPP
Ks 1
1
--=---+-1-l x
1-lxa 5 1-l xa

(7.53)

Ks

e -K~P
1 1
- - = - - - + -1-lp
1-l Pa 5 1-l Pa

(7.54)

Com os valores de KPe K~ estimados no item ,anterior, possvel traar os grficos de (e-K PP I 1-lx) vs. (1/5)- Fig. 7.11(A) e (e -KPP /~-t p ) vs. (115)- Fig. 7.11(B),
com os dados de P, 5, 1-lx e 1-lP disponveis para o Ensaio 1. Os coeficientes lineares e
angulares das retas ajustadas fornecero as estimativas de 1-lx., K5, 1-lPa e K ~.

(A)
160
140
120
)(
~ 100
a..
a.
80
60
a.
)(
40
Ql
20

(B)

70

60

fl-~
Q.OJ
li:::--

40

l~

n.

a.

)(

Ql

y = 8,3514x + 2,2624
R2 = 0,9975

10

50
30
20

y = 3,3837x + 0,9144
R2 = 0,9978

10
20

1/S (Lig)

1/S (Lig)

Figura 7 .li - Grficos para obteno das estimativas de (A): f.!x. e

10

Ks e (B): f.!ra e K~.

20

Modelagem matemtica e simula~o de processos fermentativos

154

(3) Estimativa de Ki e Ki

Para um ensaio com valores de S suficientemente elevados (incio do Ensaio


4, por exemplo), possvel desprezar os valores de K5 e K~ nas equaes das velocidades especficas (eqs. 7.49 e 7.50). Dessa forma, possvel linearizar essas equaes.
e ~KP P

f.lx

Kifl xa

---

1
S+-

(7.55)

f..lxa

e -K~ P
1
1
--=--5+f.lp

Kif-lPa

(7.56)

flPa

Com os valores de Kp e K~ estimados anteri9rmente, possvel traar os grficos de (e -K.P I f.l x) vs. S - Figura 7.12(A) e (e -K.P I f.lp) vs. S - Fig. 7.12(B) com
os dados de P, S, f.lx e f.lp disponveis para valores elevados de S no incio do Ensaio
4. Os coeficientes angulares das retas ajustadas fornecero as estimativas de Ki e
Ki, considerando os valores de f.lxa e f.lra estimados novamente atravs dos coeficientes lineares das retas ajustadas.

(B)

(A)
3

;s

2,5

><

1,5

11..

a.

:I.

~Oi
~:c;

...!.,..

iCl

a.

~~

Q)

y = 0,0037 X + 1 ,6498
R2 = 0,9541

0,5

100

200

300

a.
X

Q)

4
3,5
3
2,5
2
1,5
1
0,5 .

S (g/L)

/.

y = 0,0123x + 0,6599
R2= 0,9151

100

200

300

S (g/L)

Figura 7.12 - Grficos para obteno das estimativas de (A): K; e (B): K .

(4) Estimativa de Y x1s e Yp1s

Na construo do modelo assumiu-se que Yp 15 um parmetro fixo e igual a


0,511 (converso estequiomtrica de glicose em etanol) . Dessa forma, todas as
"ineficincias" do sistema estaro includas no valor de Yx 1s estimado. A estimativa de Y x1s obtida correlacionando o L1X produzido com o l1Sx consumido (substrato consumido para produzir X, obtido descontando do total de substrato
consumido o substrato consumido para produzir P) para os 4 ensaios disponveis.

Ajuste de parmetros do modelo formulado

155

A Figura 7.13 apresenta o grfico de (L1X) vs . (L1Sx), cujo coeficiente angular da reta
que passa pela origem, fornece a estimativa de Yx;s
A Tabela 7.5 apresenta o resultado da estimativa dos parmetros para o modelo matemtico da fermentao alcolica do hidrolisado de mandioca operada em batelada, ajustado preliminarmente aos dados experimentais disponveis (Tab. 7.1).
i

~
-9

><
'

8.

35

30
25
20
15
10
5

y = 0,2158

R2 = 0,9399

100

50
(S 0

150

S;).(g/L)

Figura 7.13 - Grfico para obteno da estimativa de YXJS

7.3.2 - Integrao analtica do modelo


Essa tcnica para estimativa de parmetros s aplicvel para casos em que
o modelo matemtico bastante simples, permitindo uma integrao analtica do
seu sistema de equaes diferenciais ordinrias. ONG46 desenvolveu o ajuste de
parmetros para um crescimento microbiano num biorreator operado em batelada
e que obedece cintica de Monod (eqs. 7.41 e 7.42).
Integrando a eq. (7.42) obtm-se:
(7.57)

X=X 0 +Yx;s (5 0 -S)

Substituindo as eqs. (7.41) e (7.57) na eq. (7.42), rearranjando e integrando,


obtm-se:

Ks+
dS=-J.lm Jdt
s o S[Xo +Yx; s(So -S)]
Yx; s o

!1n~ = b
t

50

{In

[1 + a(S 0

S)]} _ d

(7.58)

(7.59)

onde:
Yx;s
a=-Xo

(7.60)

156

Modelagem matemtica e simulao de processos fermentativos

b =1 + _(X_o_+_Yx--';-_sS_o_)
Yx;sKs

(7.61)

d = llm (Xo + Y x;sSo)

(7.62)

Yx; sKs

Portanto, b e d podem ser obtidos por regresso linear (da eq. 7.59) desde que
se conhea a.
Tabela 7.5 - Estimativa preliminar dos parmetros do modelo obtidos por linearizao e simplificao do modelo.

Parmetro

Valor estimado

llxa (h-1)

0,524(a)

J.lra (h-1)

1,305(a)

Ks (g/L)

3,69

K's (g/L)

3,70

Ki (g/L)

446

'

K'1 (g/L)

53,7

l5.

KP (L /g)

0,0442

K'p (L /g)

0,0142

Yx/s (g/g)

0,216

'"

Yp/s

I;'
I

I'<"
~ ~~

0,511 (fixo)

(g/g)

,.

(a) Mdia dos valores estimados quando da estimativa

..

de K5 ,

K~
..

e Ki, Kj.

'
' .,;

-.

"

Estatisticamente, uma regresso linear pode ser avaliada pelo valor do coeficiente de correlao r, dado por:
(7.63)

onde: n ... nmero de pares de pontos (x, y) a serem ajustados


ln [1 +a(5 0 - S)]
X= - - - - - - = - - t

(7.64)

Ajuste de parmetros do modelo formulado

ln (S- 5 0 )
y=--_____;;-

I 57

(7.65)

A soluo do ajuste de parmetros do modelo (J..lm, K5 e Yx;s) reduz-se, ento,


soluo do seguinte problema de otimizao: "Minimizar a funo objetivo: -r2 =
f (a), sujeita s condies a > Oe eq. (7.64) e (7.65)".
Os valores de b e d sb obtidos pelas equaes:
b = (nLxy- LXLY)
nLx 2 -(LX) 2

d = (Ly- bLx)

(7.66)

(7.67)

Assim como o mtodo de ajuste do modelo por linearizao, esse mtodo


por integrao tambm deve ser utilizado com muito cuidado, pois tambm resume o problema de estimativa de parmetros numa linearizao por transformao de variveis. H alguns srios inconvenientes em usar transformaes de variveis, entre os quais podemos destacar:
as faixas de variaes de logaritmos (por exemplo, utilizados na transformao de variveis) podem ser muito diferentes das faixas de variaes
das variveis de origem (no caso dos logaritmos, muito menores);
ao utilizar a equao linearizada, o que estar sendo minimizado a diferena quadrtica (quando esta for a forma de clculo dos resduos) entre a
forma transformada "experimental" e a calculada; os parmetros assim
obtidos no sero 'necessariamente timos em relao aos desvios da varivel original;
.

- -.

as variveis transformadas podem no preservar as propriedades da distribuio de erros das variveis originais do problema, o que pode constituir uma objeo muito sria sobre a validade do procedimento.
47

AUGUSTO et al. tentaram utilizar o ajuste de parmetros por regresso linear


a partir da integrao do modelo, aplicado ao crescimento microbiano obedecendo
cintica de Andrews, sem conseguir bons resultados pelos motivos expostos acima.
7.3.3 - Integrao numrica e ajuste por regresso no-linear

A estimao de parmetros recai, na grande maioria dos casos, em problema ~


de regresso no-linear, envolvendo o uso de mtodos numricos de minimizao
da funo objetivo atravs de procedimentos iterativos. 48 No caso do ajuste de parmetros, a funo objetivo a ser minimizada reflete o resduo calculado entre os
valores experimentais e os valores simulados das variveis de estado. Os problemas freqentemente encontrados ao efetuar regresses no-lineares so:
aproximao numrica de derivadas parciais;

158

Modelagem matemtica e simulao de processos fermentativos

obteno de uma estimativa inicial adequada dos parmetros;


existncia de mnimos locais na funo objetivo, isto , a funo resduo
apresenta diversos valores mnimos, que atraem a soluo do mtodo
de regresso empregado, dificultando a convergncia para o mnimo
absoluto;
a prpria escolha da funo objetivo mais adequada (mnimos quadrados,
mxima verossimilhana, etc.);
interao entre parmetros, o que pode levar a grandes intervalos de confiana dos parmetros.
Este ltimo problema ainda mais acentuado quando o modelo contm expresses hiperblicas, e este freqentemente o caso em processos fermentativos
-por exemplo, modelos derivados da expresso de MONOD. 49
Entre os mtodos disponveis para resolver problemas de ajuste de parmetros por regresso no-linear podem ser citados: 50' 51

Mtodos de ordem "0". Mtodos que no exigem o clculo das derivadas


das EDO em relao aos parmetros do modelo. O mtodo de ordem "O"
mais utilizado o de Nelder & Mead ou mtodo dos poliedros flexveis.
Mtodos de 1." ordem. Mtodos que necessitam do clculo das derivadas das
EDO em relao aos parmetros do modelo. Os mtodos de t. ordem
mais conhecidos so os de Gauss-Seidel, Gradiente e Marquardt, 52 sendo
este ltimo o mais empregado no ajuste de parmetros de modelos matemticos pela sua alta eficincia computacional.
Entretanto, o mtodo de Nelder & Mead tem se mostrado mais efetivo em
comparao ao mtodo de Marquardt, quando o nmero de parmetros a serem
estimados muito grande, cas c:,ios modelos matemticos de processosfermentativos. Por es~e motivo, ser detalhado apenas o mtodo de Nelder & Mead de otimizao para estimativa de parmetros por regresso no linear.

7.3 .3. 1 - Mtodos dos poliedros flexveis (NELDER & MEAD?'


H muito tempo sabe-se que determinar o mnimo de funes de n variveis
pelo conceito mais simples- caso do estabelecimento de uma rede de pontos em
e valorando-se a funo em cada ponto desta rede, ou a busca de um mnimo
atravs de movimentos randmicos - extremamente ineficiente. O mtodo de
Nelder & Mead um mtodo simplex geomtrico flexvel, conhecido como o mtodo dos poliedros flexveis. O mtodo dos poliedros flexveis minimiza uma funo de n variveis independentes, usando (n+l) vrtices de um poliedro no espao
En ~ Cada vrtice definido por um vetor x (neste caso, por um conjunto de parmetros). O vrtice em
que fornece o maior valor da funo objetivo (neste caso
o maior resduo entre as variveis calculadas e as variveis experimentais) projetado atravs do centro de gravidade dos vrtices remanescentes. Melhores (menores) valores da funo objetivo so obtidos, substituindo, sucessivamente, o ponto
com maior valor de f(x) por pontos melhores, at se obter o mnimo de f(x).

I 59

Ajuste de parmetros do modelo formulado

Sejam:
i=1, ... ,n+1
i-simo vrtice em

e no k-simo estgio da busca

[!~k) ] valor da funo objetivo no vrtice <k)

!~~)2

centro de gravidade de todos os vrtices excludo !hk)

x<k) .

- n+2,J

=_!_~(~x~k))-x<~>]
n L. IJ
hJ

j = 1, ... , n

(7.68)

i=l

onde o ndice "j" designa cada coordenada do vrtice.


O procedimento para obter um vrtice em En no qualf(x) tem um valor "melhor", envolve 4 operaes descritas a seguir.
(1)

Reflexo: Refletir !hk) atravs do centro de gravidade !~~)2


x<k) = x<k) +a(x(k) - x<k))

-n+3

- n+2

-n+2

(7.69)

-h

onde a > O ... o coeficiente de reflexo.

x<k) =x(k) +y(x(k) -x(k ) )

-n+4

- n+2

-n+3

(7.70)

-n+2

onde y > 1 ... o coeficiente de expanso.


Se f [!~:_>4 ]<f [!\k) 1 substituir!~) por !~l 4 e continuar do passo (1) com k =

k+l. Caso contrrio, substituir!~) por !~l 3 e continuar do passo (1) com k = k+l.
~-.

- -o- - ----

-----

--,--~-- ---

- --:--- -- --------- -- -........ ,, ______ .. - . .--.

_______j

I 60

Modelagem matemtica e simulao de processos fermentativos

(3) Contrao: Se f L!.~:l ]>f [!~k) 1 para todo i =t h, contrair o vetor (!hk) - !~:)2 ), cal-

culando:

x(k)
-n+S

x(k)
-n+2

+ A(x(k) _ x(k)
1-' -h

-n+2

(7.71)

onde O < p < 1 ... o coeficiente de contrao.


Substituir !hk) por !~:ls e continuar do passo (1) com k = k+l.
(4) Reduo: Se /[!~::3 ]> f[!hk)] reduzir todos os vetores (!~k) -!\kl),
n+1, por um fator de meio, a partir de !\k), calculando:
x\k) =x(k)
-1

-1

+0 S(x\kl -x(k))
I

-1

-1

i=

1, ... , n+1

i=

1, 2, ... ,

(7.72)

e continuar do passo (1) com k = k+l.


O critrio usado por Nelder & Mead para trmino da busca, consiste em verificar se:

(7.73)

isto , a convergncia ocorre se a raiz quadrada da mdia dos quadrados das diferenas entre a funo objetivo calculada em cada vrtice e a funo objetivo calculada no centro de gravidade for menor que um determinado valor s. A Figura 7.14
apresenta um fluxograma que ilustra a aplicao do mtodo dos poliedros flexveis
para a soluo de um problema de otimizao.
Os valores de a, p e y recomendados por Nelder & Mead so: a = 1, p = 0,5 e
y = 2. Na prtica observa-se, entretanto, que seria necessrio ajust-los caso a caso.
PICCOLI et al. 53 estabeleceram os seguintes valores ao ajustar modelos com 9, 13 e
24 parmetros: a= 1,0, p = 0,8 e y = 1,5.
47
Trabalho recente de AUGUSTO et al. buscou comparar a aplicao do mtodo de regresso no-linear sem clculo de derivadas (poliedros flexveis de Nelder
& Mead), e com clculo de derivadas (Marquardt), ao ajuste dos parmetros de
dois modelos de processos fermentativos. Para um processo descontnuo de crescimento microbiano com um nico substrato limitante e inibitrio (modelo com 4
parmetros), a metodologia de Marquardt levou a um ajuste satisfatrio para um
maior nmero de casos (por "caso" entendem-se diferentes formas de clculo do
resduo e diferentes estimativas iniciais dos parmetros) em relao ao mtodo
dos poliedros flexveis; no que se refere ao tempo de processamento, o mtodo de
Marquardt, como era de se esperar, mostrou ser muito mais eficiente na grande
maioria dos casos testados. Para um processo que, alm dos fenmenos descritos
no caso anterior, apresenta tambm a formao de um produto metablico associado e no associado ao crescimento, e que inibe o processo (modelo com 8 par-

Ajuste de parmetros do modelo fonnulado

161

metros), quando a mesma forma de clculo dos resduos for empregada, o mtodo
dos poliedros flexveis produziu um maior nmero de ajustes satisfatrios em relao ao mtodo de Marquardt. Como os modelos matemticos de processos fermentativos tm, geralmente, um nmero de parmetros maior do que 8, a metodologia apresentada para ajuste, por regresso no linear, dos parmetros (poliedros
flexveis), est de acordo com este resultado.

maior F.O. = Pior vrtice


menor F. O. = Melhor vrtice

Parmetro
0,1 <Beta< 0,9

Substituir o pior vrtice


pelo vrtice da reflexo

FIM

Figura 7.14 - Fluxograma ilustrativo do mtodo dos poliedros flexveis

li
Um aspecto que se tem mostrado crucial no ajuste de parmetros por diferentes mtodos de regresso no linear o da definio da funo objetivo, isto ,

j
-l

..J

162

Modelagem matemtica e simulao de processos fermentativos

a forma de calcular o resduo entre os valores calculados pelo modelo e os valores


experimentais. 54 A Tabela 7.6 apresenta vrias formas possveis para o clculo dos
resduos entre os valores calculados e os valores experimentais indicando, quando
for o caso, os problemas observados quando da sua utilizao. Na Tabela 7.6 so
indicadas as frmulas para clculo dos resduos que apresentaram melhores resultados. Sabe-se, entretanto, que a melhor frmula para clculo do resduo depende
do mtodo de ajuste e tambm da estimativa inicial dos parmetros empregada.
Tabela 7.6 - Diferentes frmulas para clculo dos resduos .
Frmula de clculo

Nmero

Variveis com elevado valor absoluto privilegiadas no ajuste.

R= Lli

R = L ( _jfj__jfj_r
-

-yY

(yi )m

Problemas na utilizao

(y; )m

Tendncia a ajustar melhor as variveis prximas aos valores mximos.

R=L(Yi:Y;r
i
Yi

Resduos muito elevados para valores muito pequenos da varivel


calculada

R=L(yi-Yir
i
Yi

Resduos muito elevados para valores muito pequenos da varivel


experimental.

R=
5

[ J
y~ -yi

~ <y?')

Resduos elevados para valores


muito pequenos e diferentes das
variveis calculada e experimental.

Idem frmula "5", R s calculada


quando Yi > e(yi )m

R =:E /r -1/ +:E/a -1/


(r e a so calculados para cada varivel e para cada ensaio)

R =/r -1/+ /a-1/


(r e a so calculados com todas as
variveis normalizadas e todos os
ensaios ajustados por uma nica
reta.)

R ... resduo
Yi ... valor experimental da varivel
Yi ... valor calculado da varivel
(yi)m ... mximo valor da varivel experimental
r ... coeficiente de regresso linear entre as variveis experimentais e calculadas
a ... coeficiente angular combinado entre as variveis experimentais e calculadas.

'

Ajuste de parmetros do modelo formulado

163

EXEMPLO NUMRICO-ETAPA 5
Nessa etapa do exemplo apresentado o ajuste, por regresso no-linear,
utilizando o mtodo dos poliedros flexveis, do modelo matemtico (eqs. 7.46 a
7.50- etapa 4 do exemplo numrico) da fermentao alcolica de hidrolisado de
mandioca em um sistema batelada. O modelo ajustado simultaneamente ao conjunto de 4 ensaios experimentais, ilustrados na Tabela 7.1.
O ajuste global dos ehsaios 1 a 4 (Tabela 7.1) ser realizado pelo mtodo de
regresso no-linear de ordem "O" - mtodo dos poliedros flexveis, utilizando
um software desenvolvido em linguagem Fortran. As principais caractersticas do
ajuste realizado e o resultado obtido so listados a seguir.

(1) Parmetros do mtodo:


a= 1,0
f3 = 0,8
y = 1,5
e< 10-5 (convergncia).
(2) Parmetros ajustados: 9 (J.tx., J.lr., K5,

K~,

Ki, Kj, KP,

K~,

Yx 15 ).

(3) Parmetros fixos do modelo: 1 (Yr 15 ).


(4) Estimativa inicial dos parmetros empregada: resultado do ajuste preliminar
dos parmetros (Tab. 7.5).

(5) Frmula de clculo do resduo empregada: "frmula 6" (Tab. 7.6).


(6) Valor do resduo com a estimativa preliminar dos parmetros - condio
inicial do programa de ajuste:
Resduo= 24,1
Coeficiente angular da regresso linear entre todos os valores calculados e
experimentais = 0,923
Coeficiente de correlao da regresso linear entre todos os valores calculados e experimentais= 0,928.
(7) Resultado do ajuste obtido:
Nmero de iteraes = 971
Resduo = 1,43
Coeficiente angular da regresso linear entre todos os valores calculados e
experimentais = 1,00
Coeficiente de correlao da regresso linear entre todos os valores calculados e experimentais = 0,990.
Valores dos parmetros (Tab. 7.7)
A Figura 7.15 ilustra a qualidade de ajuste obtido para o Ensaio 4. Para os
outros 3 ensaios o resultado semelhante, como pode se:r atestado pelo valor do
resduo obtido.

'!!ri
lj

fi

I
~

J:j
1
j

li
J:J

fl
r1

''i

11

I!

I'

ii
[I

lj

'

164

Modelagem matemtica e simulao de processos fermentativos

Tabela 7.7 - Valores dos parmetros do modelo obtidos por regresso no -linear aplicando o mtodo
dos poliedros flexveis.
Valor estimado

Parmetro
1
)

0,672

2,08

K5 (g/L)

6,16

..j

Ks (g/L)

7,88

fl

K; (g/L)
Ki (g/L)
KP (l/g)

347,

37,4

~i

J..lxa (K

J..lpa (h-

I'
)!

0,0153
0,215

Yx;s (g/g)

,.,,,.... , '"'}.:!? 15 (g/ g)

..

"'

0,0436

K~ (l/g)

, ..

~i.....
.

'

..

0,511 (fixo)

..

;.,,;r;,

'"'''

'.\;'_- ~-

' . _;(" -,'.1.1;::.1

7.4 - Avaliao do modelo matemtico


A ltima etapa do processo de formulao e ajuste de um modelo matemtico fenomenolgico consiste na realizao de uma anlise estatstica que visa validar o modelo, seguida da identificao da necessidade de realizar novos
experimentos no laboratrio, para aprimorar o conhecimento do processo, visando melhorar a qualidade do modelo.
Ensaio 4

:::J

:
[l_

70
60
50
40
30
20
10

250
200
150

:::J

100

(/)

50
5

10

15

Tempo (h)
Figura 7 .I S - Resultado do ajuste global dos ensaios (Tab. 7 .I) utilizando o mtodo dos poliedros flexveis ilustrado
para o Ensaio 4. Os pontos indicados so os pontos experimentais (+ X , .. P, S) e as curvas foram traadas utilizando o modelo (equaes 7.46 a 7.50) com os parmetros indicados na Tab. 7.7.

7.4. I - Anlise estatstica


O ajuste dos parmetros do(s) modelo(s) proposto(s) a um conjunto de ensaios
experimentais normalmente avaliado e considerado satisfatrio ou no, por
simples inspeo visual do conjunto de ensaios, alm da anlise do resduo mnimo obtido (conforme descrito no item anterior deste captulo). Essa avaliao

Avaliao do modelo matemtico

165

tanto mais vlida, na medida em que for levada em conta a falta de reprodutibilidade e o grande erro experimental inerente aos processos biolgicos. Apesar dessa
constatao, importante submeter os ajustes obtidos a uma anlise estatstica especfica, com dois objetivos bsicos:
verificar se possvel discriminar um ou mais modelos propostos em relao aos outros, nos casos em que foi possvel ajustar mais de um modelo
matemtico ao conjri.nto de dados experimentais disponveis (teste do x2
de Bartlett);
verificar se o(s) modelo(s) remanescente(s) representam adequadamente o
conjunto de dados experimentais disponveis (teste F e teste de randomicidade).
7.4.1 . 1 - Teste do X2 de BARTLETI55
Para saber se h modelos no adequados, entre um conjunto de modelos
ajustados, testa-se a homogeneidade das estimativas do erro experimentat ou
seja, testa-se se o valor da varincia de algum modelo estatisticamente diferente
dos demais. Isso feito usando o teste do x2, calculando o x ~ale atravs da frmula
de Bartlett:
2

2
Xcalc =

1+

onde:

ln(s ) ~)d. f.L - ~)d.f. )i (st)


i=l
i=l
1
! - 1 _ m 1
3(m -1) i=l (d.f.L ~(d.f.)i

(7.74)

sf ... estimativa da varincia do Modelo "i"

y <k) ... valor experimental


y~k) ... valor calculado (Mod."i")
52 estimativa combinada da varincia
m

L(d.f.)isf
52 = .: . i=-=1_ __
m

L:<d.f.)i
i=l
(d.{); = n- p; ... graus de liberdade Modelo "i';
n ..... nmero de pontos experimentais

I
I

.I

'U

166

Modelagem matemtica e simulao de processos fermentativos

Pi .... nmero de parmetros Modelo "i"


m ..... nmero de modelos ajustados.
Se X~ale > x~ab (a, m - 1) ... o modelo ao qual corresponde o maior valor de s ~
descartado, e assim sucessivamente, at restar apenas 1 modelo; o valor de
X~ab(a, m-1) obtido em tabelas estatsticas 56 onde o nvel de significncia escolhido (geralmente 5%).
Se x ~ale <X ~b (a, m -1) ... nenhum dos modelos pode ser descartado; faz-se
novos experimentos, at ser possvel definir a no adequao de algum modelo
pelo critrio do x2
7.4.1.2 - Teste F51
A anlise estatstica realizada no item anterior no garante que o(s) modelo(s) aprovados representem satisfatoriamente o conjunto de ensaios ajustados.
Para obter esse resultado utiliza-se o Teste F, que se baseia na obteno do chamado "erro experimental", obtido a partir de uma srie de repeties do mesmo ensaio (ensaio padro). Essa estimativa do "erro experimental" deve levar em conta,
entre outros, a falta de reprodutibilidade de processos fermentativos (devida principalmente influncia da "histria" da populao microbiana), a dificuldade em
manter condies homogneas dentro do biorreator e os prprios erros analticos
e de amostragem corriuns na atividade laboratorial. Para a avaliao do erro experimental, deve ser feito um certo nmero de experimentos repetidos, em pelo menos uma condio experimental.
Assim, definindo~se Fcaic como a relao entre o erro obtido pela falta de
ajuste e a estimativa do erro experimental, obtm-se para a formulao do Teste F:
(7.75)

onde: s~ ... estimativa da varincia do erro do Modelo

n ... nmero de pontos por varivel


v ... nmero de variveis (concentraes de clulas, produtos e substratos)
(nv) c ... nmero de pontos ajustados (para todos os ensaios e variveis)
p ... nmero de parmetros do Modelo
yij valor da varivel calculado pelo Modelo
y ij ... valor experimental da varivel.

Avaliao do modelo matemtico

167

s; ... estimativa da varincia do erro experimental


v

LL(Yii

-yJ 2

i=l j=l

=------

(nv)e-v

(nv)e ... nmero de pontos experimentais (para todos os ensaios repetidos

yi

...

e variveis)
mdia da varivel para os ensaios repetidos.

Como o valor da distribuio F, Ftab[a,(nv)c -p,(nv)e -v]~1 (quando a=


5%, (nv)c ~ oo e (nv)e ~ oo) 56 uma vez que (nv)c e (nv)e so, normalmente elevados,
ento para que o modelo represente adequadamente os dados experimentais ajustados (ou, em outras palavras, no apresente falta de ajuste), necessrio que:
ou

7.4.1.3 - Teste de randomicidade 57


O teste de randomicidade til na verificao de eventuais tendncias no
ajuste de um modelo matemtico a um conjunto de dados experimentais. Os resduos verificados entre os dados experimentais e os dados do modelo podem ser
positivos ou negativos, mas se eles so verdadeiramente aleatrios, o sinal dos
mesmos deve mudar de maneira randmica. Essa randomicidade, ou ausncia da
mesma, pode ser detectada visualmente plotando, por exemplo, os resduos versus
a varivel independente (tempo), ou versus as variveis dependentes (variveis de
estado). A seguir, revisaremos alguns conceitos estatsticos necessrios para o entendimento do teste.
Distribuio normal: distribuio contnua de probabilidades, tambm chamada de distribuio gaussiana; dada por:

_ - 1- e -(y-y)' /2cr
f( y) -

(7.76)

cr-fbr

onde:

y ... mdia da distribuio


cr ... desvio padro da distribuio.
Varivel Z: varivel padronizada correspondente a y; que possui mdia O e

desvio padro 1 e, portanto, dada por:

y-y

Z=-cr

(7.77)

168

Modelgem matemtica e simulao de processos fermentativos

Nvel de significncia: ao testar uma hiptese, a probabilidade mxima com


que desejamos arriscar um erro do tipo 1 (rejeitamos a hiptese quando ela deveria ser aceita) chamada nvel de significncia do teste; na prtica costuma-se
adotar um nvel de significncia de 0,05 ou de 0,01, embora outros valores possam
tambm ser usados; no caso do teste de randomicidade ser adotado um valor de
0,05 para o nvel de confiana.
Regio crtica: conjunto de valores de Z exteriores ao intervalo de -1,96 a
1,96.

Regio de aceitao: conjunto de valores deZ interiores ao intervalo de -1,96 a


1,96.
A randomicidade dos resduos entre os valores das variveis calculadas, utilizando o modelo ajustado e os valores experimentais quantificada, medida e
testada segundo o procedimento descrito a seguir.
Definindo: N 1 . nmero de resduos positivos (Ycalc > Yexp);
N 2 nmero de resduos negativos (Ycalc < Yexp);
R ... nmero de vezes que a sequncia de resduos muda de sinal.
A distribuio de R ento aproximada pela distribuio normal. A mdia e
o desvio padro desta distribuio so calculados atravs das eqs. (7.78) e (7.79),
apresentadas a seguir.
(7.78)

(7.79)

2N 1 N 2 (2N 1 N 2 -N 1 -N 2 )
2

(N 1 +N 2 ) (N 1 +N 2 -1)

A forma padronizada (Z) da varivel (R) dada ento pela eq. (7.80)

Z=R-R

(7.80)

crR

sendo distribuda com mdia Oe desvio padro 1.


Para testar a hiptese de que os desvios so randmicos, Z comparada com
a distribuio normal padro. Se o valor de Z muito baixo, b modelo inadequado; por outro lado, se o valor deZ muito alto, os dados experimentais contm oscilaes que precisam ser consideradas pelo modelo. Se o valor de Z cair na regio
de aceitao, ento a hiptese de randomicidade pode ser aceita. Dessa forma,
existem 3 casos possveis exemplificados a seguir.
Caso Randmico: N 1 = 21; N 2 = 30; R= 29; R= 25,7; crR = 3,42
Z = 0,965 (dentro da regio de aceitao)- ajuste satisfatrio.

Avaliao do modelo matemtico

169

Caso Oscilante: N 1 = 26; N 2 = 25; R = 50; R = 26,5; crR = 3,5


Z = 6,7 (fora da regio de aceitao) .
primeira vista, esse seria um bom ajuste. Entretanto, um exame mais criterioso detectaria urna oscilao padro do resduo em relao a zero. A adio de um termo que introduza comportamento oscilatrio ao modelo em
questo, poderia melhorar consideravelmente o ajuste do modelo aos dados
experimentais.
Caso positivo/negativo: N 1 = 32; N 2 = 19; R= 3; R= 24,8; crR = 3,3
Z = -6,6 (fora da regio de aceitao).
Clara tendncia dos resduos de positivo para negativo ou vice-versa, detectada pelo fato de R ser baixo. Por exemplo, para baixos valores da varivel
independente, o resduo positivo e para altos valores da varivel independente, o resduo negativo. O modelo deve ser corrigido para minimizar
essa distoro.
EXEMPLO NUMRICO-ETAPA 6
Nessa etapa apresentada a anlise estatstica do modelo ajustado (Etapa 5)
para a fermentao alcolica de hidrolisado de mandioca em um sistema batelada
ao conjunto de 4 ensaios (Tab. 7.1).
Na medida em que existe um nico rnoqelo ajustado aos dados experimentais, sero aplicados apenas os testes estatsticos para verificar a adequao deste
modelo.
(1) Teste F. Para aplicar o Teste F calculada a estimativa do erro do modelo
ajustado na Etapa 5 deste exemplo numrico (Tab. 7.7 e Fig. 7.15). Calcula-se a estimativa da varincia do erro do modelo (s~) comparando os valores das variveis
de estado obtidas pelo modelo ajustado em relao aos dados experimentais disponveis:
v

LLlij- Yij)

3023,74

i=l j=l

(nv)c = 135 (nmero total de variveis de estado medidas nos 4 ensaios)

p = 9 (parmetros ajustados do modelo)


s2
C

= 3023,74 = 24 0
135-9

Na medida em que no se dispe de urna medida precisa da estimativa do


erro experimental, urna vez que no foram fornecidas repeties de um mesmo ensaio, a partir das quais esta estimativa seria obtida, a aplicao do teste F ser modificada, calculando-se o erro experimental que, se existente, garante que o
modelo ajustado representa adequadamente os dados experimentais disponveis.

.L

170

Modelagem matemtica e simulao de processos fermentativos

Para tanto obtm-se, a partir dos valores das variveis de estado medidas experimentalmente, a somatria do quadrado de todas elas:

(nv)e = 135
v= 3 (nmero de variveis de estado)

e a estimativa da varincia do erro experimental (s;) dada ento, por:


2

8e

58155& 2

=_1_3_5___3_

onde t ... estimativa do erro experimental.


Como necessrio para que o modelo seja adequado para representar os dados experimentais disponveis, que s~ < s;, ento:

t>

24,0 * (135- 3)

>o 074

581555

'

O resultado obtido indica que, se o erro experimental dos dados disponveis


for maior do que 7,4%, o modelo ajustado adequado, segundo o teste F modificado. Na medida em que 7,4% um erro experimental baixo para variveis medidas
em processos fermentativos (principalmente se for levada em conta a falta de reprodutibilidade inerente a estes processos), conclui-se que modelo ajustado
adequado.
(2) Teste de Randomicdade. Para aplicar o teste de randomicidadE!, descrito
em detlhe neste captulo, verifica-se o nmero de resduos <Ycak - Yexp) positivos e
negativos alm do nmero de vezes em que o resduo troca de sinal (nesta anlise,
considerou-se o resduo "O" equivalente a uma troca de sinal em relao aos resduos
positivos e negativos). Vrias formas de aplicao desse mtodo so possveis- na
presente etapa do exemplo numrico verifica-se a randomicidade das 3 variveis
de estado do processo (X, P e S) separadamente, considerando-se, na anlise de
cada uma a seqncia de 4 ensaios da Tabela 7.1. Repete-se o teste para as 3 variveis de estado de forma conjunta, ainda seguindo a seqncia de ensaios da Tabela 7.1. A Tabela 7.8 apresenta o resultado dessa anlise.
Pelo resultado apresentado na Tabela 7.8, pode-se concluir -na medida em
que o valor deZ caiu na regio de aceitao (-1,96 < Z < 1,96) em todos os casosque a hiptese de randomicidade dos desvios entre os valores das variveis de estado do processo calculadas pelo modelo e os valores medidos experimentalmente
pode ser aceita, indicando, mais uma vez, a adequao do modelo formulado e
ajustado.

17 I

Avaliao do modelo matemtico

Tabela 7.8 - Resultados do teste de randomicidade.

Teste por varivel de estado

N 1 =24

Teste conjunto

N 1 = 26

N 1 = 14

N 1 =64

N 2 = 16

N 2 =114

N 2 = 25

N 2 =55

"O"= 5

"O"= 5

"O"= 6

"O"= 16

R= 18

R= 16

R= 17
R =18,9

R= 53
R= 60,2

R= 20,2
<JR

= 2,99

z = -0,736

R =19,2
<JR

= 2,83

<JR

z = -1,13

z = -0,67

..
..
7.4.2 -Projeto de experimentos
~ - ~ ~

.:;1:,

-'

..:.:.

'

= 2,83

,.

,,

\,

:~.

<JR

': ..

= 5,4

z = -1,33
-~,~::

., '': . :. : . _,'.'. '

'
.

-~

: ,~

1~1

.\..i
~;;

i~
~.

-i" : ..

Esta tcnica relaciona o procedimento para estimar parmetros e o trabalho


experimental de obteno das medidas a serem usadas naquele procedimento,
bem como na prpria proposio e principalmente confirmao dos modelos matemticos.
"Projetar" um experimento significa escolher, de forma organizada e sistemtica, as condies experimentais que sero usadas nos experimentos, visando
um dado objetivo.
Esse planejamento de experimentos pode ser feito a priori, como no projeto
fatorial, ou seqencialmente (e iterativamente) com os experirpents, como no
projeto seqencial.
No projeto de experimentos, o que se procura fazer otimizar o trabalho experimental, ou seja, minimizar o nmero de experimentos necessrios para se obter uma dada informao. Portanto, procura-se diminuir o esforo de
experimentao e os custos envolvidos na sua execuo (sejam estes realizados em
laboratrio, em planta piloto ou no equipamento industrial). A tcnica permite
tambm planejar experimentos sob condies tais que levem a uma melhora na informao procurada.
O mais utilizado dentre esses projetos o planejamento fatorial, seja como
um planejamento fatorial completo, quando o nmero de variveis do processo a
serem testadas relativamente pequeno, ou como um planejamento fatorial fracional, quando o nmero de variveis maior. 58 ' 59 ' 60 Essa tcnica no ser detalhada
neste texto, pois existem vrias publicaes especializadas que tratam esse assunto em grande profundidade, e a sua utilizao no apresenta qualquer especificidade para o caso dos processos fermentativos. 61
O projeto seqencial feito iter:ativamente com a experimentao, ou seja, a
escolha das condies do prximo experimento feita a partir da anlise de todos

I
I

I
li

-.(~;:~;~sq~!~e~~~~:c~~:~~:1~~~e::~~i~~~~~~::::,:::.~=~~~~?o~:::~. . . - J

172

Modelagem matemtica e simulao de processos fennentativos

mao obtida em cada ensaio adicionada s informaes anteriores e toda a anlise refeita, para projetar o novo experimento. O objetivo a ser buscado pode ser:
a discriminao entre modelos rivais;
a estimao precisa dos parmetros de um dado modelo.
Na elaborao de um modelo matemtico so testados vrios possveis modelos cinticos para os processos em estudo, buscando-se aquele que melhor represente as condies reais na faixa operacional de interesse. Para o modelo
cintico mais adequado, busca-se ento que seus parmetros sejam estimados com
a mxima preciso possvel.
As ferramentas estatsticas envolvidas em um projeto seqencial de experimentos so: .
um critrio de projeto, isto , como escolher adequadamente as condies
do prximo experimento;
um critrio de parada, ou seja, quando o programa de experimentos pode
ser interrompido em virtude de j se ter atingido o objetivo desejado.
As tcnicas de projeto seqencial de experimentos foram aplicadas principalmente no estudo da cintica de reaes catalticas heterogneas. No entanto,
tm sido pouco exploradas no mbito dos processos fermentativos, onde poderiam ser muito teis, dado o grande esforo envolvido na parte experimental
do estudo destes processos. 62
Exemplos de aplicao dessas tcnicas, apresentadas por FROMENT;
BISCHOFF;51 FROMENT; HOSTEN55 e HIMMELBLAU, 50 entre outros, mostram uma
reduo significativa (em torno de 50%) no nmero de experimentos necessrios
para a discriminao entre modelos rivais ou para a estimao precisa dos parmetros.

7.5 - Simulao de processos fermentativos


Simular, nada mais do que utilizar os modelos gerados, de man~ira que os
mesmos reproduzam o comportamento real do sistema, com vistas sua otimizao e ainda permitam extrapolaes vlidas deste comportamento. A simulao
por computador pode ser de dois tipos, conforme definido a seguir.
Simulao analgica. feita por meio de circuitos eletrnicos. Tem como vantagem a facilidade com que resolve equaes diferenciais, produzindo uma sada
em forma grfica. Tem como grande desvantagem a velocidade de processamento
lenta. Foi muito utilizada nas dcadas de 50 e 60. 63
Simulao digital. feita por meio de computadores digitais. Tem como grande vantagem em relao analgica a velocidade de processamento e uma grande
capacidade de memria. Torna possvel a abordagem de problemas muito mais
sofisticados. Tem como desvantagem a necessidade de se implementar ou criar
tcnicas numricas de integrao, diferenciao, convergncia, etc. Atualmente,
todo o trabalho de simulao , praticamente, feito em computadores digitais.
Dessa forma, quando algum se refere simulao em computador, est sempre
se referindo simulao digital. 63

Avaliao do modelo matemtico

173

Do ponto de vista do problema matemtico a ser resolvido, existem dois tipos bsicos de simulao, descritos a seguir.
Simulao esttica. Simulao esttica refere-se a sistemas que esto operando em regime permanente, isto , independentes do tempo. Por exemplo, a simulao ou o projeto de uma planta de processo ou de um equipamento (biorreator),
operando em regime contnuo, so realizados em regime permanente, ou seja,
atravs de uma simulao es1ttica.
Simulao dinmica. Neste caso, a preocupao com a representao de sistemas que variam no tempo. Normalmente, trabalha-se com equaes diferenciais or-
dinrias no tempo para biorreatores operando em batelada ou durante o transiente
de sistemas contnuos; pode-se trabalhar, ainda, com equaes diferenciais parciais
no tempo e no espao, quando analisado o comportamento de biorreatores tubulares ou mesmo de biorreatores completamente heterogneos.
Evidentemente, a qualidade da simulao realizada vai depender dos seguintes aspectos:
qualidade dos modelos utilizados na simulao;
confiabilidade das propriedades fsicas e biolgicas empregadas na formulao dos modelos;
bom senso na seleo dos mtodos numricos a serem empregados, bem
como com a anlise dos resultados de uma simulao - muitas vezes os
modelos so confiveis, as condies operacionais so adequadas, mas um
problema numrico qualquer gera res~ltados inconsistentes.

7.5.1 - Tcnicas matemticas


Na simulao de processos fermentativos homogneos e heterogneos, existem 4 tcnicas matemticas de clculo numrico largamente empregadas e que so
adequadas para resolver a maioria dos problemas a serem enfrentados:
mtodos de soluo de equaes algbricas no lineares (mtodos de convergncia);64
65
mtodos de soluo de sistemas de equaes algbricas no lineares;
mtodos de soluo de sistemas de equaes diferenciais ordinrias de 1.
ordem - problemas de valor inicial/6
mtodos de soluo de sistemas de equaes diferenciais parciais - mtodo de colocao ortogonal. 57
Por fugirem do escopo deste captulo, no sero detalhadas essas tcnicas, mas
o leitor interessado poder encontrar as informaes necessrias sua adequada utilizao na soluo de problemas de simulao, nas referncias apresentadas:

7.5.2

Otimizao de processos fermentativos

Muitas vezes a etapa de fermentao a crtica no estabelecimento dos parmetros econmicos de um processo biotecnolgico; entretanto, isto nem sempre
verdadeiro, o que complica sobremaneira a definio da funo objetivo a ser otimizada. Entende-se por funo objetivo a representao atravs de uma funo
matemtica do objetivo a ser buscado na operao do processo em estudo. Po-

iI

'1

-- .. ~-

174

Modelagem matemtica e simulao de processos fennentativos

de-se, ento, definir uma funo com objetivo tcnico (maximizar a produtividade, por exemplo) ou econmico (maximizar o lucro, por exemplo) ou, ainda, mis67
turando critrios tcnicos e econmicos. Uma vez definida essa,funo, preciso
um mtodo de otimizao de funes (ou otimizao de parmetros ou otimizao esttica), para obter-se um ponto mximo ou mnimo. Existem vrios mto68
dos de otimizao descritos e periodicamente melhorados na literatura. Esses
mtodos podem, ou no, fazer uso de derivadas (da funo objetivo ou do modelo) em relao s variveis de otimizao, sendo usualmente preferidos os mtodos que no usam derivadas -chamados mtodos de pesquisa direta- pela facilidade da sua execuo. Nesta categoria de mtodos de otimizao destaca-se o
mtod~ dos poliedros flexveis de Nelder & Mead, j utilizado para o ajuste de
parmetros.
EXEMPLO NUMRICO-ETAPA 7
Nessa etapa apresentada a otimizao da produtividade da fermentao
alcolica de hidrolisado de mandioca operada num sistema em batelada, utilizando o modelo ajustado no Etapa 5.
No caso do sistema operado em batelada as variveis operacionais possveis
de serem manipuladas, com vistas a maximizar a produtividade, so as concentraes iniciais de clulas e substrato, fixada a concentrao inicial de produto produzido durante a fase de preparo do inculo. Entretanto, uma anlise do processo,
a partir do seu modelo, permite concluir que a produtividade, funo objetivo escolhida, monotonicamente crescente com a concentrao inicial de clulas, isto ,
a produtividade do processo cresce indefinidamente com o aumento de X0 Na
medida em que, operacionalmente, existem limitaes quanto concentrao inicial de clulas que pode ser empregada, sero considerados valores fixos de X0 (X0
= 2,0 g/L) e P 0 (P0 = 2,0 g/L) e variaremos apenas 5 0 na busca do valor mximo da
produtividade.
Dessa forma, o problema de otimizao proposto resolvido, integrando o
sistema de equaes diferenciais, que compem o modelo do processo para diferentes valores de 5 0, at se obter a produtividade mxima correspond~nte a cada
operao. A Figura 7.16 apresenta o resultado dessas simulaes, sendo possvel
concluir que a produtividade mxima do processo estudado de 5,26 g/L.h, obtida numa operao com 5 0 = 260,0 g/L.
6

oc
~

5
4

Q)~

Q).c:

-o ....I

:~

~s

"5

r
/

"O

0..

o
o

200

400

600

S0 (g/L)

Figura 7.16 - Produtividade em etanol em funo da concentrao inicial de substrato num processo em batelada.

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processos biotecnolgicos. In: SINAFERM - Simpsio .Nacional de Fermentaes, agosto,
Uberlndia, MG. Anais em CD-ROM.
(68) EDGAR, T.F. and HIMMELBLAU, D.M., 1989. Optimization of Chemical Processes. McGraw-Hill, Inc., Nova York.

179

- -- - -- - -------------- - - - -- - -

Willibaldo Schmidell
Maria Cndida Reginato Facciotti

8.1 - Introduo
Denominam-se "biorreatores", "reatores bioqumicas", ou ainda "reatores
biolgicos", os reatores qumicos nos quais ocorrem uma srie de reaes qumicas catalisadas por "biocatalisadores". Esse~ .biocatalisadores podem ser enzimas
ou clulas vivas (microbianas, animais ou vegetais). Assim, logo de incio, pode-se
classificar os biorreatores em dois grandes grupos:
Grupo 1: Biorreatores nos quais as reaes ocorrem na ausncia de clulas
vivas, ou seja, so tipicamente os "reatores enzimticos";
Grupo 2: Biorreatores nos quais as reaes se processam na presena de
clulas vivas".
Embora no seja totalmente generalizado, h alguns autores, porm, que utilizap:t a denominao "reatores bioqumicas" para se referirem apenas ao primeiro
grupo, restringindo assim a denominao "reatores biolgiCos" apenas aos reatores que operam com clulas vivas.
Com relao aos reatores com clulas vivas, pode-se afirmar que os mais
amplamente conhecidos e com uso bastante difundido, so os reatores com microrganismos, os quais vm sendo empregados desde a dcada de 1940 para a produo industrial de uma grande diversidade de produtos, tais como enzimas,
antibiticos, vitaminas, cidos orgnicos, solventes, ou ainda no tratamento de resduos orgnicos industriais ou domsticos.
Embora se fale globalmente em "reatores com microrganismos", muito importante destacar que, do ponto de vista da engenharia, dependendo do tipo de
microrganismo utilizado, tais reatores podem ter caraCtersticas bastante distintas
no que se refere aos fenmenos de transporte que ocorrem no reator (calor, massa
e quantidade de movimento). Assim, por exemplo, reatores que operam com orga-

I 80

Biorreatores e processos fermentativos

nismos unicelulares como bactrias e leveduras possuem, em geral, um comporta~


menta reolgico bastante distinto .daqueles que empregam fungos filamentosos
(bolores).
Deve~se mencionar ainda os biorreatores que operam com elevadas concen~
traes celulares ("high cell density cultures"), o que propicia altas velocidades de
converso do substrato em produto. Um exemplo dessa situao a fermentao
alcolica, na qual se opera com cerca de 30g clulas/litro de meio (matria seca).
Particularmente, no caso de biorreatores que empregam microrganismos i"ecombi~
nantes, em virtude de uma possvel baixa produo especfica da protena heter~
Ioga de interesse, busca~se operar com concentraes celulares da ordem de
lOOg/L/ o que e?<ige condies especiais de operao.
Outro campo de recente desenvolvimento o cultivo de clulas animais e ve~
getais, tendo alcanado rpido progresso nos ltimos dez anos, constituindo~se hoje
num dos grandes temas de aplicao da Biotecnologia Moderna. Assim, pode~se ci~
tar o emprego de biorreatores com clulas animais para a produo de uma srie de
produtos ligados sade humana e animal, tais como vacinas virais, anticorpos
monoclonais, hormnios e fatores de crescimento.2' 3' 4 No que se refere s clulas ve~
getais, h exemplos de produo de princpios ativos de medicamentos, como mor~
fina e quinina, e outros produtos de utilizao na indstria cosmtica.5 Os reatores
que empregam clulas animais ou vegetais, em geral possuem vrias particularida~
des, tendo em vista as diferentes caractersticas apresentadas por este tipo de clu~
las em relao s clulas microbianas, destacando~se entre elas a elevada
sensibilidade ao cisalhamento, caracterstica que, em casos extremos, leva nec~ssi~
dade da utilizao de biorreatores no~convencionais, como reatores "air~lift", ou
ainda os reatores com membranas, nos quais no se tem agitao mecnica e, canse~
qentemente as tenses de cisalhamento so menores. 6' 7

8.2 - Classificao dos biorreatores

Encontram~se

indicadas na literatura vrias formas possveis de classificar


os biorreatores, como por exemplo:
quanto ao tipo de biocatalisador (clulas ou enzimas);
quanto configurao do biocatalisador (clulas/enzimas livres ou imo~
bilizadas);
quanto forma de se agitar o lquido no reator.
Dentre as vrias classificaes encontradas nos livros~textos que abordam o
tema biorreatores, uma das mais abrangentes a de KLEINSTREUER, 8 que apresen~
ta. uma classificao mista, com base no tipo de biocatalisador empregado (enzi~
ma, microrganismo aerbio ou anaerbio) e na configurao deste (livre,
imobilizado ou confinado entre membranas).
Considerando~se, pois, as vrias propostas usualmente encontradas, pro~
pe~se no presente captulo uma classificao mista, a qual pretende ser mais
abrangente que as anteriormente citadas, conforme esquematizado a seguir.

Classificao dos biorreatores

18 I

CLASSIFICAO GERAL DOS BIORREATORES


(I) Reatores em fase aquosa (fermentao submersa)

(1.1) Clulas/enzimas livres


Reatores agitados .p1-ecanicarnente (STR: "stirred tank reactor")
Reatores agitados pneumaticamente .
Coluna de bolhas ("bubble colurnn")
Reatores "air-lift"
Reatores de fluxo pistonado ("plug-flow")
(1.2) Clulas/enzimas imobilizadas em suportes
Reatores com leito fixo
Reatores com leito fluidizado
Outras concepes
(1.3) Clulas/enzimas confinadas entre membranas
Reatores com membranas planas
Reatores de fibra oca ("hollow-fiber")
(11) Reatores em fase no-aquosa (fermentao semi-slida)
Reatores estticos (reatores com bandejas)
Reatores com agitao (tambor rotativo)
Reatores.com leito, fixo
Reatores com leito fluidizado gs-slido
Conforme se pode verificar, a partir da classificao proposta, h uma grande variedade de configuraes possveis para os biorreatores mas, no entanto, pode-se afirmar que os mais amplamente empregados so os reatores agitados
mecanicamente (STR), conhecidos tambm como reatores de mistura, constituindo
cerca de 90% do total de reatores utilizados industrialmente.
A capacidade dos biorreatores bastante varivel, conforme o processo
em questo, podendo-se distinguir trs grandes grupos no que se refere escala
de produo industrial. Reatores da ordem de algumas centenas de litros at 1 a
2 rn 3 de capacidade, so empregados no cultivo de microrganismos patognicos,
ou para o crescimento de clulas animais ou vegetais, em geral objetivando a
produo de produtos ligados rea de sade. Urna escala intermediria, na
qual se opera com reatores da ordem de algumas dezenas de metros cbicos at
100 a 200 rn 3; especialmente empregada na produo de enzimas, antibiticos e
vitaminas. Finalmente, para processos q ue exigem poucos ou at mesmo nenhum cuidado de assepsia, como o caso da fermentao alcolica ou do trata'--

----

-------..- - - -- - '

182

Biorreatores e processos fermentativos

rnento biolgico de resduos, pode-se atingir reatores com alguns milhares de


metros cbicos de capacidade. 9
Conforme indicado na Figura 8.1(a), o reator do tipo STR consiste em um
tanque cilndrico, no qual so comuns relaes entre a altura e o dimetro de 2:1
ou 3:1. 10 Normalmente o reator equipado com chicanas ("baffles"), cuja funo
evitar a formao de vrtice durante a agitao do lquido. O agitador montado num eixo central ao ferrnentador, possuindo, ao longo de sua altura, urna srie de turbinas, as quais podem ser de diferentes tipos, sendo porm a mais
amplamente utilizada a turbina de ps planas ("flat blade"), tambm conhecida
corno turbina "Rushton". As razes que fazem com que este tipo de turbina seja
a mais amplamente empregada em processos ferrnentativos, sero discutidas
adiante, no Captulo 14.
Os reatores agitados pneumaticamente se caracterizam basicamente pela
ausncia do agitador mecnico, sendo a agitao do lquido efetuada apenas
pelo borbulharnento de um gs (normalmente ar) no reator. Corno conseqncia
da ausncia do agitador mecnico, resultam, nesse tipo de reator, menores tenses de cisalharnento, o que os torna atraentes para o cultivo de clulas animais e
vegetais. 6' 7
H na literatura urna considervel diversidade de nomenclaturas para designar os reatores agitados pneumaticamente, no havendo urna clara diferenciao entre eles. Segundo MERCHUK, 11 a diferenciao bsica entre os reatores
coluna de bolhas ("bubble colurnn") e os reatores "air-lift", que nestes ltimos
tem-se urna movimentao cclica do fluido, bem definida, atravs de dispositiyos
e arranjos internos construdos especialmente para este propsito, enquanto que
na coluna de bolhas tem-se um movimento aleatrio do lquido no reator. As Figuras 8.1(b) e 8.1(c) ilustram esquematicamente tais tipos de reatores, os quais possuem urna grande variedade de configuraes. 12' 13' 14 Convm ainda mencionar que
os reatores tipo coluna de bolhas so freqentemente chamados de reatores tipo
torre, enquanto que os reatores "air-lift" so designados "loop reactors".
Nos reatores de fluxo pistonado ("plug-flow"), conforme indicado esquematicamente na Figura 8.1(d), o inculo e o meio de cultura so misturados na entrada do sistema, sendo que idealmente a cultura flui com urna velocidade constante,
sem ocorrer mistura longitudinal ("backrnix"). 15' 16 H, portanto, urna variao da
concentrao dos nutrientes e das clulas ao longo do comprimento do reator, sendo este sistema comparvel a um processo contnuo realizado em mltiplos e stgios, com um elevado nmero de reatores ligados em srie, conforme ser visto no
Captulo 12.

Conforme indicado na classificao geral dos biorreatores, apresentada anteriormente, possvel dispor de reatores nos quais o biocalisador se encontra
imobilizado em um suporte inerte, corno, por exemplo, alginato, K-carragena, pec
tina, ou ainda materiais cermicos, vidro, slica e outros. 17
A finalidade bsica do emprego de clulas imobilizadas num biorreator a
manuteno de elevadas concentraes celulares, podendo-se atingir, conseqentemente, elevadas produtividades no processo em questo. Dependendo da movi-

Classificao dos biorreatores

183

rnentao relativa das partculas ("pellets"), distinguem-se os reatores de leito


fixo, onde a movimentao praticamente inexistente, e os de leito fluidizado,
onde h urna movimentao intensa das partculas, sendo qe a fluidizao do leito pode ser provocada pela injeo de ar, ou de um gs inerte, ou ainda pode ser
obtida por urna corrente de recirculao de lquido no reator. As Figuras 8.1(e) e
8.1(f) ilustram as configuraes mencionadas. Deve-se mencionar, ainda, o desenvolvimento recente de alguns biorreatores que empregam clulas e enzimas
co-imobilizadas, corno descrito por exemplo no trabalho de GIORDANO, 18 no qual
se empregou a co-imobilizao de glicoarnilase e clulas de Saccharomyces cerevisiae para a produo contnua de etanol.
Por sua vez, os reatores com lminas de membranas planas e os reatores de
fibra oca ("hollow-fiber"), caracterizam-se por manterem as clulas confinadas entre membranas semipermeveis ("entrapped biocatalyst"), as quais permitem o
fluxo de lquido, mas no a passagem de clulas. ~ Esse tipo de reator normalmente prev a separao entre os fluxos de nutrientes e produtos metablicos,
conforme se pode visualizar nas Figuras 8.l(g) e 8.l(h), o que permite imaginar
urna primeira operao de separao do produto desejado, podendo contribuir
para a simplificao das etapas de purificao do produto ("downstrearn").
Corno ocorre a passagem de nutrientes e produtos atravs de membranas,
esse tipo de reator costuma ser designado por "reator de perfuso". No entanto,
o termo reator ou sistema de perfuso, tem sido empregado de forma mais genrica, incluindo a situao de um reator STR com reciclo externo de clulas por filtrao em membranas, ou ainda, simplesmente designando ti.rn reator com
clulas irnobilizadas.21
Nesse tipo de reatores com membranas, as tenses de cisalharnento so mnimas, inferiores quelas obtidas nos reatores "air-lift", o que os torna indicados
para utilizao com alguns tipos de clulas animais extremamente sensveis ao cisalharnento. Comparativamente aos tpicos reatores com clulas imobilizadas em
suportes inertes, fein-se neste tipo de reatores menores obstculos difusionais, podendo-se igualmente rnan~er elevadas concentraes celulares. 22 Particularmente,
o reator de fibra oca consiste em um feixe de fibras capilares de material semipermevel, no interior das quais ocorre escoamento laminar do meio de cultura, permanecendo as clulas retidas na regio anular entre as fibras, conforme indicado
na Figura 8.l(h).
Todos os tipos de reatores mencionados at o presente so ditos reatores em
fase aquosa, ou seja, empregados nos processos de fermentao submersa. Entretanto, h ainda os reatores em fase no-aquosa, empregados para os processos de
fermentao semi-slida, os quais se caracterizam pela ausncia de "gua livre",
podendo o teor de umidade variar de 30 a 80%, dependendo das caractersticas de
reteno de gua do substrato slido empregado, embora o processo semi-slido
apresente urna srie de dificuldades, especialmente no que se refere ao controle
das condies de operao; por outro lado, este processo apresenta urna srie de
aspectos interessantes, os quais podem torn-lo, em alguns casos, mais econmico
do que o tradicional processo subrnerso. 23' 24 Dentre os itens que necessitam de um
maior desenvolvimento, encontra-se o estudo de novas concepes de reatores
19 20

184

Biorreatores e processos fermentativos

para a fermentao semi-slida, encontrando-se na literatura um grande nmero


de trabalhos nos quais se emprega o "reator de bandejas" ("stationary trays"), o
qual bastante limitado no que se refere s condies de transferncia de oxignio
e controle das condies ambientais. Nesse sentido possvel obter-se uma melhoria, quando se procede agitao do meio de cultivo, por exemplo, empregando-se tambores rotativos. 25' 26 Mais- recentemente, foram propostos os reatores de
leito fixo ou de leito fluidizado gs-slido/7' 28 nos quais se promove a passagem
de ar ou de um gs inerte atravs de um leito de partculas slidas. No caso do leito fluidizado, a vazo do gs suficientemente elevada, de maneira a propiciar a
suspenso dos slidos na corrente gasosa, promovendo desta maneira, uma melhor condio de transferncia de massa no sistema (nutrientes, oxignio) e ainda
auxiliando no controle da temperatura.

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Produto

Figura 8.1 - Tipos de biorreatores (a) STR; (b) coluna de bolhas; (c) "air-lift"; (d) "plug-flow" ; (e) com clulas imobilizadas (leito fixo); (f) com clulas imobilizadas (leito fluidizado); (g) reator com mell)branas planas; (h) "hollow-fiber".

Formas de conduo de um processo fermentativo

185

Conforme visto no presente item, h uma grande diversidade possvel de


biorreatores a serem empregados em um determinado processo fermentativo, sendo que a melhor opo depender das caractersticas do processo em questo, bem
como do microrganismo utilizado.
Convm salientar que alguns dos tpicos abordados no presente item sero
melhor detalhados em outros captulos, tais como:
Captulo 13: Fermentao em estado slido
Captulo 16: Reatores com clulas imobilizadas
Captulo 17: Reatores com enzimas imobilizadas
No item seguinte pretende-se mostrar que existem numerosas opes quanto forma de conduo do processo, ou seja, quanto forma de operao de um
dado biorreator, e que a forma ideal de operao, isto , aquela que conduzir a
um desempenho timo do processo, ser funo novamente das partiCularidades
do material biolgico empregado.

8.3 - Formas de conduo de um processo fermentativo


Quando se pensa em executar um processo fermentativo, normalmente se
imagina preparar um certo meio de cultura que seja adequado nutrio e desenvolvimento do microrganismo, bem como ao acmulo do produto desejado; colocar este meio de cultura em um biorreator (fermentador); adicionar o
microrganismo responsvel pelo processo biolgico (inocular) e aguardar que o
processo ocorra, Aps um determinado tempO de fermentao, imagina-se retirar
o caldo fermentado do reator e executar as operaes unitrias necessrias para a
recuperao do produto.
A descrio acima aquela tpica de um processo descontnuo simples, ou
descontnuo tradicional, q~e tamb, m designado como processo em batelada.
No entanto, essa descrio tambm tpica de pessoas no ligadas Engenharia Bioqumica, ou com experincia em processos fermentativos, pois, sem
querer recair em_afirmaes dotadas de extremo exagero, pode-se dizer que existem infinitas formas de se conduzir um reator biolgico, dependendo das caractersticas prprias do microrganismo, meio de cultivo e dos objetivos especficos do
processo que se pretende executar.
Inclusive, ao se imaginar o descontnuo com nica alternativa para a conduo do processo fermentativo, pode-se incorrer no engano de concluir, precocemente, sobre a inviabilidade do processo produtivo, em virtude de sua baixa
produtividade.
Com base nessas consideraes iniciais, fica clara a necessidade de uma
maior reflexo sobre os reatores biolgicos, tendo em vista sua enorme flexibilidade de operao, bem como sua incidncia imediata quanto economicidade de um
dado processo fermentativo.
Pode-se afirinar que, a partir da dcada de 1950, ocorreu um maior desenvolvimento da rea de reatores, encontrando a mesma, desde ento, um formidvel avano, sendo responsvel pelo sucesso de muitos processos fermentativos,
obviamente ao lado dos demais desenvolvimentos das reas mais bsicas, como
por exemplo a microbiologia destes processos.

~;-.

186

Biooeatores e processos fermentativos

No objetivo do presente texto abordar todas as formas de operao de um


biorreator, mesmo porque isto seria invivel, tamanha a diversidade hoje observada, dependendo das caractersticas prprias de cada processo. O que se pretende
abordar as formas mais gerais, entendendo que tal estratgia permitir as particularizaes que se fizerem necessrias.
Com essa idia em mente, pode-se dizer que, de uma forma geral, um reator
biolgico pode ser operado das seguintes formas:
-Descontnuo
com um inculo por tanque
com recirculao de clulas
- Semicontnuo
sem recirculao de clulas
com recirculao de clulas
- Descontnuo alimentado
sem recirculao de clulas
com recirculao de clulas
-Contnuo
executado em um reator (com ou sem recirculao de clulas)
executado em vrios reatores (com ou sem recirculao de clulas)
O processo descontnuo simples, ou seja, aquele efetuado com um inculo
por tanque, j foi descrito no incio deste item. No entanto, cabe ainda acrescentar
que esse processo o mais seguro quando se tem o problema de manuteno de
condies de assepsia, pois ao final de cada batelada imagina-se que o reator dever ser esterilizado juntamente com o novo meio de cultura, recebendo pm novo
inculo, o qual poder sofrer todos os controles necessrios, a fim de assegurar a
presena nica do microrganismo responsvel pelo processo.
Deve-se salientar que o conhecimento do processo descontnuo simples significa o conhecimento bsico da cintica do processo, sendo, portanto, de extremo
interesse, no se recomendando o estudo dos reatores alternativos sem que se domine razoavelmente bem o descontnuo, mesmo porque as demais alternativas
pressupem este conhecimento cintico. Nessa direo, o Captulo 6 justamente
dedicado ao estudo da cintica de processos fermentativos .

Por outro lado, no nvel de aplicaes prticas, pode-se dizer que, para um
processo fermentativo razoavelmente evoludo, dificilmente ele ser conduzido
como um reator descontnuo simples, havendo com muita freqncia alguma elaborao adicional. O descontnuo ser sempre a base para as comparaes de eficincias atingidas nessas elaboraes, mas a sua baixa eficincia estimula o
surgimento das formas alternativas.
A primeira dessas alternativas , quando o microrganismo permite, recircular as clulas, ou seja, ao se encerrar a batelada efetua-se a separao das clulas

Formas de conduo de um processo fennentativo

187

por centrifugao ou mesmo sedimentao no interior do prprio reator, enviando


apenas o lquido fermentado para a recuperao do produto. Com isso se busca
evitar o preparo de um novo inculo para cada batelada, o que sempre significa
custo adicional para o processo, alm de significar tambm um certo tempo para a
obteno de altas concentraes celulares no reator, bem como consumo de substrato para isto. Essa estratgia de operao freqentemente designda como batelada repetida.
Assim, a idia de se recircular as clulas, mesmo para um processo descontnuo, .possvel e mesmo interessnte, desde que se possa manter as condies de
assepsia, e igualmente se possa manter o microrganismo suficientemente ativo
para a sntese do produto.
Se um processo descontnuo entendido como um sistema fechado, devido
s suas caractersticas, um processo contnuo, por outro lado, o exemplo tpico
de um sistema aberto. No processo contnuo procura-se estabelecer um fluxo contnuo de lquido atravs do reator, ou reatores dispostos em srie. Claro est que,
caso o processo assim o exija, o meio a ser introduzido no reator deve ser devidamente esterilizado, assim como se deve manter as condies de assepsia nestas
operaes de alimentao e retirada do.produto fermentado.
A opo pela operao de um sistema contnuo, constitudo por vrios reatores em srie, no qual a alimentao de um dado reator da srie o efluente do
reator anterior, visa freqentemente o estabelecimento de diferentes condies
nos vrios biorreatores da srie. Inclusive, nessa opo de operao, abre-se a possibilidade de distribuir a alimentao do meio de cultura inicial entre reatores da
srie, o que pode justamente contribuir para o aparecimento destas diferentes condies entre os vrios reatores.
Ainda, o reator contnuo permite visualizar o reciclo de clulas. De fato, o lquido fermentado, efluente de um dado reator, pode ser submetido a um sistema
de separao dos microrganismos (por sedimentao, centrifugao ou ,separao
por membninas), -s quais podem ser retornados ao volume de reao, sendo o lquido enviado para a recuperao do produto. Em .se tratando de reatores em srie, essa operao pode ser efetuada em qualquer reator da srie, retornando-,se o
microrganismo para o fermentador mais adequado, evidenciando, assim, a enorme flexibilidade de operao disponvel.
O reator descontnuo alimentado ("fed batch") aquele no qual se imagina
inicialmente introduzir o inculo, o qual dever ocupar uma frao do volume til
da ordem de 10 a 20%, iniciando-se ento a alimentao com o meio de cultura,
empregando uma vazo adequada, sem ocorrer a retirada de lquido fermentado.
Essa operao prolonga-se at o preenchimento do volume til do reator, quando
ento inicia-se a retirada do caldo fermentado para a recuperao do produto.
Essa forma de operao tpica da rea de Engenharia Bioqumica, e foi praticamente desenvolvida para os processos fermentativos, sendo muito pouco freqente para os reatores qumicos no biolgicos.
A descrio acima para o reator "fed batch", consiste- na verdade- na forma mais simples de operao deste reator. Pode-se imaginar a separao das clulas e retorn-las ao volume de reao, a fim de se iniciar um novo perodo de

188

Biorreatores e processos fennentativos

alimentao, o que evita o preparo de um novo inculo. A idia acima tambm sugere que se alimente o reator com vazo constante, o que no necessariamente
obrigatrio.
As alternativas mencionadas indicam a grande flexibilidade de operao,
que tambm se observa para o "fed batch", a exemplo do reator contnuo.
No entanto, cumpre destacar que se pode ainda, ao terminar o preenchimento do reator, proceder-se retirada de uma certa frao do lquido fermentado, iniciando-se ento um novo perodo de alimentao. Essa alternativa
freqentemente indicada na literatura como descontnuo alimentado repetido.
Novamente convm esclarecer que esse estilo de conduo do reator depende fundamentalmente das caractersticas do microrganismo, que dever permanecer suficientemente ativo no sistema. Caso o microrganismo apresente .sintomas de
atenuao quanto sua capacidade de sntese do produto, o processo dever ser
interrompido, para se reiniciar com um novo inculo.
Assim, fcil compreender que o interesse por um processo contnuo, ou
descontnuo alimentado repetido, depende da possibilidade de se prolongar ao
mximo o tempo de operao, mantendo-se o processo em condies de elevado
desempenho, quanto ao produto desejado e isento de contaminaes.
Finalmente, o sistema de reao semicontnuo, diferencia-se do descontnuo
alimentado, pelo fato de se retirar o lquido fermentado e se proceder ao preenchimento do reator empregando-se uma vazo muito elevada, de forma a se imaginar
que o reator esteja sendo preenchido instantaneamente. Ao final do novo perodo
de fermentao, procede-se novamente retirada de uma dada frao do volume
(30 a 60%, por exemplo) e se preenche o reator instantaneamente.
'
Na verdade, como- do ponto de vista prtico- trabalhando-se com reatores
de dezenas de milhares de litros, este preenchimento dificilmente pode ser efetuado instantaneamente, com freqncia acaba-se recaindo no reator descontnuo alimentado, motivo pelo qual alguns autores no utilizam a designao de
semicontnuo. De qualquer maneira, trata-se de uma tcnica distinta, n~ qual est
embutida a idia da operao por choques de carga de substrato, o que pode ser
interessante em algumas situaes, como na produo de enzimas sujeitas ao controle por induo.

Da mesma forma, um reator descontnuo alimentado, dependendo da vazo


empregada, que po_ssibilite um certo acmulo do substrato limitante quando do
trmino do perodo de alimentao do reator, pode ter seu tempo de fermentao
concludo em sistema descontnuo, a fim de que o substrato residual possa ser totalmente consumido.
Essas ltimas consideraes pretendem alertar para as possibilidades de utilizao de misturas de conceitos (descontnuo, contnuo, descontnuo alimentado),
a fim de se conseguir o mximo de desempenho de um dado sistema biolgico.
Elas tambm reforam a idia sobre a enorme flexibilidade que se dispe para a
operao de um biorreator.
Alguns processos tradicionais servem como exemplo dessa afirmao, omo
o caso da fermentao alcolica executada segundo o processo Melle-Boinot.
Nesse processo; ao trmino de UII).a fermentao, o vinho centrifugado, retornan-

Exemplos de comparao de desempenho de biorreatores

189

do-"se as clulas ao reator aps tratamento adequado. A seguir inicia-se a alimentao do mosto a ser fermentado (na verdade, a introduo do inculo e a alimentao de mosto ocorrem simultaneamente desde o incio do processo), operando-se
grande parte do tempo na forma de um reator descontnuo alimentado. Quando
as dornas encontram-se preenchidas, aguarda-se tempo suficiente para o consumo
dos acares fermentescveis, operando-se, portanto, na forma descontnua.
Os sistemas de tratamento de resduos tambm podem ser considerados
como exemplo, pois os enormes volumes de reao, freqentes nesta rea, exigem
que sejam preenchidos de forma controlada segundo o sistema descontnuo alimentado, mesmo que sua operao em regime seja obrigatoriamente em sistema
contnuo. Freqentemente a operao em descontnuo alimentado importante,
pois espera-se atingir o completo preenchimento do reator contando-se com um
sistema biolgico equilibrado, a fim de se poder iniciar a operao contnua em
condies de estabilidade (ausncia de matria orgnica acumulada, ou de produtos intermedirios no completamente convertidos a gs ou biomassa).
Cabe, finalmente, comentar que as diferentes formas de operar um certo biorreator so, em princpio, aplicveis a qualquer tipo de reator dentre os mencionados
no item 8.2, ficando esta flexibilidade mais ou menos evidente, dependendo do tipo
de reator considerado.
Analogamente ao indicado no item anterior, vrios conceitos aqui introduzidos sero melhor detalhados em captulos seguintes, tais como:
Capt_ulo 9: Fermentao descontnua
Captulo 10: Fermentao descontnua alimentada
Captulo 11: Fermentao semicontnmi.
Captulo 12: Fermentao contnu

. .. .,8 .4 - Exemplos de comparao de desempenho de biorreatores


Encontram-se na literatura alguns trabalhos recentes, os quais apresentam
estudos comparativos do desempenhei de biorreatores, como por exemplo, o trabalho de MANOLOV, 29 relativo produo de ribonuclease por Aspergillus clavatus,
onde se empregou um reator tipo coluna de bolhas com clulas imobilizadas, tendo-se obtido produtividades em enzima significativamente superiores ao se conduzir o processo tanto na forma de bateladas repetidas, bem como na forma contnua, em comparao com o descontnuo tradicional.
Da mesma forma, o trabalho de Guo et al.,30 sobre a produo de alfa-amilase por Bacillus subtilis em reator "air lift", indica a obteno de uma produtividade em enzima cerca de 5 vezes superior do descontnuo, quando se operou o .reator na forma contnua com elevados valores da vazo especfica de alimentao.
Por sua vez, o artigo de MOSER 31 apresenta dados comparativos na produo
de etanol, em reatot:: agitado operado de forma contnua (CSTR) e em reator tubular ("plug-flow"), indicando situaes em que se obtm produtividades mais elevadas para o reator tubular em relao ao CSTR.

190

Biori-eatores e processos fermentativos

J no trabalho de MULLIGAN et al.32 encontram-se dados comparativos sobre a


produo de lactato de amnio por Streptococcus cremoris, em sistema contnuo em
mltiplos estgios, com ou sem reciclo de clulas, em relao ao descontnuo.
Pode.;.se citar ainda o artigo de BAYER et al./3 relativo produo de cefalosporina em reatores "air lift", comparando-se o desempenho deste reator com
aquele obtido em reator agitado mecanicamente (STR).
O trabalho de RANE et al./ 4 por sua vez, compara a produo de cido ctrico
por Candida lypolitica em reator tipo STR, operando-se o mesmo na forma contnua
com reciclo de clulas e na forma descontnua alimentada.
Deve-se mencionar ainda os trabalhos de SCHMIDELL; F ACCIOTII/5
37
38
6
FACCIOTTI et al./ KILIKIAN e TONS0, os quais se referem ao estudo da sntese
de amiloglicosidase por Aspergillus sp em diferentes tipos de processos, como o
descontnuo simples, contnuo, semicontnuo e descontnuo alimentado, em reator
tipo STR, buscando-se comparar as produtividades em enzima obtidas. Assim, verificou-se a possibilidade de obteno de uma produtividade em glicoamilase cerca de 2,5 vezes superior no processo contnuo em relao ao descontnuo, ao se
empregar elevados valores da vazo especfica de alimentao. 35 J no caso do reator semicontnuo, dependendo da frao de corte empregada, bem como da concentrao de polissacardeo alimentada no instante de realizao dos cortes,
conseguiu-se obter produtividades em enzima aproximadamente o dobro da obtida no descontnuo, mantendo-s~ praticamente a mesma atividade enzimtica no
caldo. 36 J no caso do reator descontnuo alimentado, verificou-se igualmente a
possibilidade de obteno de uma produtividade em enzima cerca do dobro da
obtida no descontnuo mas, diferentemente do processo semicontnuo, em decorrncia do aumento da atividade enzimtica no caldo fermentado/ 7 o que altamente interessante do ponto de vista das operaes de recuperao e purificao
da enzima ("downstream'').
Assim, conforme se verifica a partir dos exemplos citados, a forma de operao do biorreator de fundamental importncia no desempenho de um determinado processo fermentativo, devendo-se destacar, ainda, que todos os trabalhos
acima mencionados so relativamente recentes (de 1989 a 1996), indicando, portanto, uma grande atualidade do tema abordado no presente captulo.

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(Mestrado), Escola Politcnica, Universidade de So Pa':llo.

193

I. '

Joo Carlos Monteiro de Carvalho


Sunao Sato

9.1 - Introduo
As fermentaes descontnuas clssicas, ou simplesmente, fermentaes
descontnuas, vm sendo utilizadas pelo homem desde a Antigidade e, ainda
hoje, so as mais empregadas para obteno d~ vrios produtos fermentados. So
tambm conhecidas por fermentaes por batelada ou processo descontnuo de

ferme;::!.:'~do de operao pode ser descrito assim' no instante inicial a soluo

nutriente esterilizada no fermentador inoculada com microrganismos e incubada, de modo a permitir que' a fermentao ocorra sob condies timas. No decorrer do processo fermentativo nada adicionado, exceto oxignio, no caso de
processos aerbic;:; (na forma de ar), antiespumante, e cido ou base para contro1
le do pH.
Terminada a fermentao, descarrega-se a dorna, e o meio fermentado segue
ara
os
tratamentos finais. Ento, deve-se lavar adorna, esteriliz-la e recarreg-la
P
com mosto e inculo. Algumas variaes dessa definio, no entanto, podem ocorrer e sero comentadas no item "Classificao".
.
Conclui-se, pela descrio acima, que se no houver adio de solues para
controle. do processo, nem perda de lquido por evaporao, o volume no decorrer
da fermentao permanece constante, o que pode ser considerado mais uma das
caractersticas do processo descontnuo de fermentao.
A fermentao descontnua pode levar a baixos rendimentos e/ ou produ tividades, quando o substrato adicionado de uma s vez no incio da fermentao
exerce efeitos de inibio, represso, ou desvia o metabolismo celular a produtos
que nfo interessdam. Alm disso,dapresednta "tempos mo~tosf", ou seja, tempos em
que o ermenta or no est sen o usa o para o processo ermentativo propriamente dito, tais como tempo de carga e descarga de doma e perodo correspon-

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194

Fermentao descontnua

Por outro lado, apresenta menores riscos de contaminao (se comparados


com processos contnuos de fermentao), grande flexibilidade de operao, devido ao fato de poder utilizar os fermentadores para a fabricao de diferentes produtos, a possibilidade de realizar fases sucessivas no mesmo recipiente, condio
de controle mais estreito da estabilidade gentica do microrganismo, assim como
a capacidade de identificar todos os materiais relacionados quando se est desenvolvendo um determinado lote de produto, o que vital para a indstria farmacutica.2
.
Ademais, o mais utilizado na indstria de alimentos. Alguns dos alimentos e bebidas produzidos por esse processo fermentativo so iogurte, chucrute, picles, cerveja, vinho, entre outros.
Neste captulo abordaremos alguns itens que julgamos oportuno destacar,
quais sejam: inculo, mosto, classificao das diferentes modalidades de processo
descontnuo, bem como o nmero de domas de uma indstria de fermentao.

9.2 - lnculo
Chama-se inculo, p-de-cuba ou p-de-fermentao um volume de suspenso de microrganismo de concentrao adequada capaz de garantir, em condies
econmicas, a fermentao de um dado volume de mosto. 3
Para que se obtenha um inculo com capacidade produtiva elevada, deve-se
dar condies para que o microrganismo desejado seja propagado, que incluem
desde sua manuteno at a propagao propriamente dita.
H muitas tcnicas para o armazenamento de microrganismos, 4' 5 send que
cada uma delas pode ser indicada levando em conta a cepa do microrganismo e as
condies laboratoriais disponveis para mant-la. Tm por finalidade conservar a
cepa vivel e com capacidade produtiva, mantendo-a, portanto, dentro do possvel, com o mnimo de divises celulares, 1 uma vez que, quando estas ocorrem, h
possibilidade de haver mutaes .. Algumas delas so: secagem de micrm;ganismos
em terra, areia, slica ou outro material slido, conservao em gar inclinado ou
outras que limitem o metabolismo e respirao microbiana (aqui se incluem congelamento em congeladores ou em nitrognio lquido, e manuteno de esporos
ou clulas em gua) e remoo da gua de clulas ou esporos por liofilizao e manuteno do material seco sob diferentes condies. A recuperao do microrganismo feita de diferentes maneiras, dependendo da tcnica que se adotou para
preserv-lo.1' 4
To importante a manuteno da cepa, que muitas empresas de fermentao
possuem centros especializados que tm esta funo, distribuindo os microrganismos
para suas fbricas localizadas nacionalmente ou, mesmo, internacionalmente. Paralelamente, fazem testes de viabilidade, de estabilidade gentica, alm de empregar metodologias para melhoramento gentico. Dessa forma, garantem a qualidade e a
reprodutibilidade das cepas microbianas, o que no significa que as fbricas no tenham o seu prprio controle na propagao desses microrganismos.
Durante a fase de propagao do inculo deve-se tornar cuidados especiais
de modo a evitar contaminao, pois comprometeria a produo industrial. Nessa

lnculo

195

fase, em processos aerbios, um foco potencial de contaminao o ar fornecido


ao sistema, o qual deve ser esterilizado.
Quando o microrganismo produtor uma espcie mutante, se ele for auxotrfico, deve-se garantir o suprimento de substncias requeridas para crescimento no meio durante a propagao do inculo. 6 Alm disso, deve-se acompanhar se
os microrganismos continuam com capacidade produtiva durante a fase de propagao, pois mutaes no so sempre estveis e eles podem perd-la, deixando de
apresentar capacidade produtiva.
O volume de inculo introduzido no fermentador de produo est comumente ao redor de 10% de sua capacidade til. No entanto, pode variar de 0,5 a
50%, como assinala BORZANe Afirma, ainda:, que a tcnica de preparo do inculo
compreende duas fases: a de laboratrio e a industrial (ver Fig. 9.1) .

.~/g~ ~~~~~~
Cultura
pura

Volume de
meio = V1

'
lncubaao

Volume de
meio= V2 >V1

11

Volume de
-~

!.

laboratrio

------------- - ---- ~ ------- ~--- :------------------------------i"-----Fase

industrial

~1

li
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-----+Doma

I'ii{'
~~
!::

I!

tl:i

Volume de
meio= V4>V3

;;[i!'

Volume de
meio= V5 >V4

Figura 9.1 - Representao esquemtica do preparo do inculo.

A partir da cultura estoque, propaga-se o microrganismo por meio de metodologia conveniente. Normalmente na fase inicial passa-se do meio slido, em
condies asspticas, para um tubo de ensaio contendo meio lquido .e sterilizado,
adequado para o desenvolvimento microbiano. Aps incubao por um determi-

:ri

:~

~~

fl
~

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. . _._____. . --...,......... -- -.. . __. .. . . . . .. . . _,__., _-~. --.-. _!

196

Fermentao descontnua

nado tempo, que depende do tipo de microrganismo cultivado (pois cada espcie
microbiana possui velocidade de crescimento diferente), transfere-se o contedo
desse tubo a frascos apropriados para agitadores rotativos ou reCprocos- "shakers"- contendo meio esterilizado (podem ser erlenmeyers lisos ou chanfrados,
sendo que estes so utilizados quando se tm microrganismos mais exigentes
quanto aerao).
Aps incubao, transfere-se a suspenso microbiana para frascos maiores
contendo meio nutriente esterilizado. O nmero de transferncias vai depender
do volume til do pr-fermentador (germinador). Todas as transferncias devem
ser feitas em condies asspticas (cujos cuidados variam com o processo fermentativo que se deseja realizar) e os frascos devidamente fechados, mas permitindo
entrada de ar para microrganismos aerbios, de modo a evitar contaminao. Dependendo do volume do fermentador de produo, poder ser necessrio mais de
um germinador.
A cada passo, os organismos devem crescer rapidamente, sendo as transferncias feitas na fase logartmica de crescimento. Apenas na fase que corresponde
ao inculo que ser adicionado ao fermentador de produo, pode-se deixar que a
cultura atinja a fase de declnio de velocidade de crescimento, caso seja interessante iniciar a fase de produo com clulas de um estgio mais avanado da curva de
crescimento microbiano .
. Sugestes para relao entre volume que receber a suspenso microbiana e
o volume desta nas vrias etapas de propagao de inculo so da ordem de 10
vezes/ 20 vezes, 8 mas h indicaes para valores possveis de 100 a 200 vezes. 6' 9
Muito importante, pois, desenvolver um protocolo para a propagao do
in culo. PARTON; WILLIS 4 apresentam casos interessantes, mostrando que determinados autores conseguiram o aumento de produo de um metablito secundrio quando utilizaram. um pr-fermentador para inocular o fermentador de
produo, em vez de utilizar inculo oriundo de cultivo em agitador rotativo.
Tambm relataram que outros autores conseguiram produzir mais c]ulas num
cultivo para obteno de biomassa quando utilizaram, como inculo do fermentador de produo, clulas na fase logartmica de crescimento, em vez daquelas em
estado de autlise. Assim, o protocolo para propagao, desenvolvido para cada
processo, indicar qual a melhor metodologia para se obter o inculo no menor
tempo possvel e que leve a maiores rendimentos e/ ou produtividades no processo industrial.

9.3 - Mosto
Como j se sabe, cada microrganismo possui condies timas de cresCimento tais como: temperatura, pH, nvel de oxignio dissolvido, entre outras. O meio
de cultivo, por sua vez, tem influncia marcante nesse processo. Em microbiologia, chamado de meio de cultura. Aqui, na rea de fermentaes industJ;iais,
chamado de mosto ou meio de fermentao. Deve possuir nutrientes requeridos
para o crescimento celular, que PIRT, 10 parte das fontes de energia, classifica nos
seguintes grupos: a) fontes dos elementos "principais" -C, H, O e N; b) fonte
dos ~lementos "secundrios" -'--'- P, K, S, Mg; c) vitaminas e hormnios; d) fontes

Mosto

197

de "traos" de elementos, ou seja, requerimentos de elementos em quantidades


mnimas para o crescimento microbiano (por exemplo, Ca, Mn, Fe, Co, Cu, Zn so
freqentemente essenciais para o crescimento microbiano).
Na formao de um meio de fermentao (mosto) deve-se levar em conta a
necessidade desses nutrientes, lembrando que o meio, alm de propiciar o desenvolvimento microbiano, deve favorecer a formao do produto que se deseja.
W ANG et al. 11 sugerem! que a formao de um meio de cultivo leve em conta
a composio celular, o requerimento energtico e a necessidade de substncias
especficas.
A composio elementar de uma clula microbiana depende de muitos fatores, como condies de cultivo, espcie do microrganismo, e at mesmo do substrato utilizado para seu crescimento. Porm, a ttulo de orientao, apresentada
na Tabela 9.1 a composio elementar tpica de um microrganismo.
Tabela 9.1 - Composio elementar tpica de microrganismos.

11

ELEMENTO

PORCENTUAL DA CLULA SECA

Carbono

50

Nitrognio

7-12

Fsforo

1-3
0,5-1,0

Enxofre

198

.Fermentao descontnua

Portanto, sua quantidade no meio de cultivo ser uma funo de quanto se


deseja produzir de microrganismo, ou de produto, levando em conta a relao estequiomtrica entre substrato e quantidade possvel de se produzir de clulas ou
de produto. No entanto, conveniente lembrar que no se pode ter um mosto com
concentraes elevadas de substrato, pois, nestas condies, pode se tornar inibitrio para o crescimento microbiano. Quanto ao oxignio, de importncia fundamental s clulas aerbias, considerado como um nutriente especial devido s
suas particularidades, ser comentado em separado (Captulo 14).
Sabendo quais os componentes que devem estar presentes num meio, pode-se lanar mo de dois procedimentos para obt-lo: a partir de extratos de plantas ou animais, chamados de meios "naturais" (suco de uva, leite, gua de
macerao de milho, etc.), ou a partir da elaborao de meios quimicamente definidos, chamados de meios "sintticos". Com a finalidade de elucidar efeitos nutricionais, medida do possvel, estes devem ser os escolhidos, pois aqueles tm a
desvantagem de seremde composio indefinida e varivel. 10 Por outro lado, podem ser meios bastante ricos e que geralmente no necessitam de complementao para sua utilizao como mosto.
Do ponto de vista industrial, vrios fatores devem ser considerados.12 O custo do substrato pode ser crucial, devendo tambm ser levada em conta a quantidade de carbono disponvel, bem como as exigncias para sua fermentao (por
exemplo, o fornecimento de oxignio ao sistema deve ser aumentado, caso utilize
um substrato de cadeia carbnica em menor grau de oxidao, como na utilizao
de hidrocarbonetos como fonte de carbono). O custo o fator limitante da utilizao de meios sintticos em escala industrial. Outros fatores incluem: suprimento
do substrato (a maioria das empresas opta por comprar o substrato no mercado
aberto, com possibilidade de comprar de vrios fornecedores), disponibilidade
(onde se considera se a matria-prima sazonal ou no e a possibilidade de seu
armazenamento), variabill.dade na composio da matria-prima, condies de
armazenamento, dificuldades de esterilizao do mosto, fermentescibil\dade (aqui
se deve lembrar que uma aparente no fermentescibilidade no necessariamente
uma restrio se microrganismos alternativos puderem ser encontrados), exigncia de tratamentos para tornar o substrato presente na matrii:1-prima fermentescvel (por exemplo, num processo de fermentao alcolica com levedura como
inculo, materiais amilceos devem ser hidrolisados a fim de se obter acares de
pequena cadeia carbnica, que sero fermentados) e comportamento do mosto durante e aps a fermentao (por exemplo, produo excessiva de espuma e possibilidade de reciclar gua residuria). Ainda .importante destacar que o melhor
substrato para uma indstria no necessariamente o melhor para outra que produz o mesmo produto, pois cada uma tem seu microambiente, onde o custo de
transporte, combustvel e potncia, disponibilidade de gua, entre outras, d~ter
minam a escolha do substrato.
Alguns dos substratos e/ou matrias-primas, possveis para utilizao em
cultivos microbianos, so: acares, melaos, soro de leite, celulose,. amido, resduos como liquor sulftico e ga de macerao de milho, metanol, etanol, alcanos, leos e gorduras, etc.

Classificao

199

9.4 - Classificao
Em escala industrial, muitos processos so adaptados com vistas a otimizar
a produo. O processo descontnuo, por sua vez, tambm foi sendo adaptado de
modo a atender ao objetivo de diferentes indstrias. BORZANI3 classifica os processos descontnuos em trs grandes grupos: aqueles em que cada dorna recebe
um inculo, processos com recirculao do microrganismo e processo por meio de
cortes.

O primeiro grupo consiste na inoculao de uma dorna com um microrganismo que foi propagado a partir de uma cultura pura, como j comentado anteriormente. Oferece poucos riscos de contaminao se a propagao do inculo foi
feita em boas condies de assepsia. Nas fermentaes em que o meio rico e o
microrganismo altamente suscetvel a contaminao, a utilizao deste processo
indicada, a menos que o substrato adicionado de uma s vez no incio da fermentao leve a resultados insatisfatrios.
Os processos com recirculao do microrganismo, como o prprio nome indica, reaproveitam como inculo o microrganismo da batelada anterior. Para tanto, ou se espera que o microrganismo sedimente no fermentador (como o caso de
cervejarias), ou se centrfuga o meio fermentado, separando assim as clulas e reutilizando-as. Esse procedimento comum em destilarias de lcool. No entanto,
como h tendncia de aumentar o nmero de contaminantes a cada nova batelada,
as usinas normalmente empregam uma metodologia com vistas a elimin-los.
Consiste num tratamento do leite de lvedo (suspenso de leveduras altamente
concentrada, obtida a partir da centrifugao do meio fermentado) com gua e cido sulfrico. Deixado nessas condies, sob agitao por 2 a 3 horas, proporciona
a eliminao de contaminantes, bem como de clulas que j se apresentem em fase
de degenerao.
O ltimo grupo da classificao apresentada assim descrito: 3 "Na fermentao por meio de cortes, opera-se do seguinte modo: inicia-se o trabalho inoculando-se uma dorna (que ser chamada de dorna A) com p-de-cuba; quando a
fermentao atinge um estgio apropriado, passa-se parte do contedo do fermentador A para um fermentador vazio (que ser chamado de dorna B) e, em seguida,
enchem-se as duas dornas com meio a fermentar. Essa operao recebe o nome de
corte. Diz-se que a dorna A foi cortada para a dorna B ou, ainda, que B recebeu um
corte de A" .
Esses cortes podem ser feitos na fase de crescimento mais intenso quando se
deseja propagar o inculo, ou aps o trmino do processo fermentativo.
A sucesso de cortes pode acarretar srias quedas no rendimento, principalmente quando se trabalha com meio no esterilizado. Alm disso, o nmero de
cortes sucessivos no pode ser. previsto, sendo que o controle do rendimento poder indicar em que momento deve-se suspender o trabalho por meio de cortes e
se iniciar nova fermentao com inculo novo. 3
No entanto, a produo de cada produto tem suas particularidades e a experincia adquirida ao longo do tempo na fbrica leva o pessoal a decidir quais as
modificaes que devem ser feitas no processo, aumentando, dia aps dia, o rendimento e/ ou a produtividade do mesmo.

I .

200

Fermentao descontfnua

9.5 - Nmero de dornas


Tendo em vista o alto custo de um fermentador, bem como o espao que
ocupa, desnecessrio justificar a importncia para uma empresa determinar o
nmero de fermentadores que necessita para produzir o que deseja.
BORZANe sugeriu uma metodologia para o clculo do nmero de fermentadores, a qual pode ser utilizada como caminho para se chegar ao nmero ideal de
fermentadores numa empresa que trabalha com processo descontnuo e que ser
transcrita a seguir. As pequenas modificaes, em relao a seu trabalho original
publicado, so, basicamente, algumas passagens matemticas que sero aqui apresentadas.
Consideremos uma instalao de fermentao, funcionando por processo
descontnuo, que deva fornecer, de maneira ininterrupta, lquido fermentado ao
setor encarregado dos tratamentos finais. Suponhamos, ainda, para simplificar,
que no esteja sendo utilizado o processo de cortes. Sejam dados:
F = vazo mdia de lquido fermentado que deve ser fornecido ininterruptamente ao setor de tratamentos finais;
t 1 = tempo necessrio para que o contedo de uma dorna fermente completamente;

V= capacidade til de cada dorna;


D =nmero de domas, de capacidade til V, necessrio para garantir a
vazo F de lquido fermentado;
td = tempo necessrio para se descarregar uma dorna;
te = tempo necessrio para se' limpar e carregar uma dorna.
O valor da vazo F depende dos seguintes fatores:
a) da quantidade de produto final que se deseja obter na unidade de tempo;
b) do rendimento dos tratamentos finais que devem conduzir ao produto
desejado;

c) da concentrao do produto final no lquido fermentado que, pr sua vez,


funo do processo de fermentao.
Se indicarmos com Ma massa de produto final que interessa prpduzir em
um tempo t, com r o rendimento dos tratamentos finais e com C a concentrao de
produto final no lquido fermentado, teremos:
t, l/ { 1,1' ) J;

Vjf

MJ

F=~
C tr

4
/ )

ft\,

J: : ) 5 ~t MMe ?
I

O valor mdio de t1, por sua vez, depende do /;ocesso de fermentao, enquanto que o tempo de descarga td ~o?e-se-r~lcu~o por:
, t,d =V
~ -

IF

(9.1)

. A capacidade til de cada dorna, ~ -prtica, no pode ser escolhida de maneira completamente arbitrria. H fabricantes que fixam os tamanhos de domas .

Nmero de domas

20 I

que podem oferecerdentro de sua linha normal de trabalho. H, por outro lado,
experincia relativamente pequena na construo de fermentadores de grandes
capacidades (diversas centenas de metros cbicos), principalmente nos processos
que exigem borbulhamento de ar e agitao mecnica. Torna-se muito difcil estabelecer, nesse caso, recomendaes gerais. A experincia j adquirida no funcionamento de instalaes anlogas constitui critrio mais seguro de escolha de um
valor adequado de V dentr~ os possveis.
O valor de te (tempo necessrio para limpar uma doma descarregada e carreg-la novamente) varia de caso para caso. Quando se pretende, no dimensionamento de uma instalao, calcular o nmero de domas, toma-se como ponto de
partida:

te =td
Essa igualdade, totalmente arbitrria, facilita a avaliao de D e pode ser,
em muitos casos, obedecida na prtica industrial. Feitas essas observaes iniciais,
necessrias para que se possam interpretar com cautela os resultados obtidos no
clculo de D, passemos a esse clculo.
Consideremos uma doma, que ser chamada de doma nmero 1, em incio
de trabalho; no intervalo de tempo te= td, ela ser limpa e carregada; decorrido
um intervalo de tempo t1, o lquido nela contido estar completamente fermeptado
e, aps outro intervalo de tempo td, ela seencontrar vazia e em condies de reiniciar seu ciclo de trabalho. Para que no haja interrupo de fornecimento de material fermentado ao setor dos tratamentos finais, quando terminar a descarga da
doma nmero 1 dever existir uma outra (que ser indicada por doma nmero 2)
pronta para ser descarregada. Quando a doma nmero 2 tiver sido descarregada,
dever existir uma terceira em condies de iniciar sua descarga. Essa seqncia
de operaes pode ser visualizada na Figura 9.2.

Figura 9.2 - Cronograma de funcionamento de dornas em umprocesso descontnuo. (I) Incio do preparo da dorna; (2) fim da carga; (3) fim da fermentao; (4) fim da descarga.

202

Fermentao descontnua

Dever existir, portanto, um intervalo de tempo td separando o incio de ftmcionamento de duas dornas consecutivas. Nessas condies, tomando-se convencionalmente como instante zero oincio de trabalho da dorna nmero 1, a doma D
dever comear a funcionar no instante (D-l)td. Por outro lado, com-india a Figura 9.3, a doma D dever iniciar seu funcionamento no instante td + tf. Logo, podemos escrever:
(D -1) ;td =td +tf

(D;;:: 3)

:.D=2+tf /td
:. D = 2 +(F tf

I V)

(9.2)

expresso que nos permite calcular o nmero de domas, desde que conheamc_>s F,
V e tf.

(4) ------------------ - - -

(3) ---------------------

:------f--------------'

n"1
(2)

----------------'

Figura 9.3 - Cronograma de funcionamento das domas nmero I e nmero D. (I) Incio do preparo da doma; (2)
3
fim da carga; (3) fim da fermentao; (4) fim da descarga.

Ao procurarmos dimensionar uma instalao, os valores de F e de t so conhecidos, mas os de V podem variar em intervalos muitos mplos. Surge, portanto, a necessidade de escolher um valor de V para podermos dar andamento ao
projeto que nos interessa.
Desde que no exista um critrio que nos leve a atribuir a V determinados
valores, poderemos, com o objetivo de iniciar o dimensionamento que temos
em vista, calcular o chamado nmero econmico de dornas, definido como sendo
o nmero de dornas de custo total mnimo capaz de atender s necessidades da
instalao. Esse nmero econmico, indicado por E, pode ser calculado como
segue: sendo p o custo de um fermentador de capacidade til V, vlida a
equao emprica

Nmero de domas

p=kVa

203
(9.3)

sendo k e a dois parmetros que dependem das condies econmicas locais no


momento considerado, e O< a< 1. Indicando com P o custo de D fermentadores,
temos, combinando as Eqs. (9.2) e (9.3):

(9.4)

Derivando essa equao e igualando a derivada a zero, obtm-se o ponto de


mnimo (menor valor de P), caso em que D , por definio, igual a E.
Como os termos k, F, t1 e a so constantes, pode-se substitu-los por K, que
uma constante fruto das operaes que envolvem as constantes acima. Portanto,
chega-se a:

P = K DI (D- 2)a

(9.5)

Derivando a Eq. 9.5, tem-se:

dP
dD

KDa(D-2)a- 1 -(D-2)a K
(D -2)2a

Considerando (dP!dD) =O, obtm-se:

D =E= 2 I (1- a)

(9.6)

Substituindo a Eq. 9.6 na Eq. 9.2, calcula-se a capacidade til de cada um dos
E fermentadores (V.). Ou seja,
Ve =Ftf (1-a)l2a

(9.7)

Pode-se tambm avaliar o nmero econmico de dornas, sem determinar os


parmetros da correlaq emprica (Eq. 9.3), da seguinte maneira: tendo-se uma
lista de preos de domas de diversas capacidades, calcula-se, para cada valor de V
desta lista, o correspondente D pela Eq. 9.2; tendo-seDe o preo unitrio, calcula-se o preo das D dornas; escolhe-se ento, entre os diversos valores calculados,
o valor de V, e conseqentemente de D, que tenha conduzido ao custo total mnimo.
Convm salientar que o valor de E poder no atender a outros requisitos
do processo. Quando tal fato acontecer, escolher-se- ento um valor de D que satisfaa a esses outros requisitos e que se situe to prximo de E quanto possvel.
Finalizando, as dimenses comumente utilizadas industrialmente para alguns processos fermentativos so apresentadas na Tabela 9.2.

204

Fermentao descontfnua

Tabela 9.2 - Dimenses de fermentadores para alguns processos fermentativos

VOLUME DO FERMENTADOR (m

PRODUTO

Enzimas de diagnstico, substncias


para biologia molecular.

1-20

....~-~
~~

40-80

Algumas enzimas e antibiticos.


:

Penicilina, antibiticos aminoglicosdicos, proteases, amilases, transformao de esterides, aminocidos.

100-150
450
.. .. ::;

:~

Aminocidos (cido glutmico).


;..:;.t~~~-.f, ~

'\;; ..... '-1

,,

,.

.L

1. . :

- :: ~ i,,~'

Referncias bibliogrficas
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AQUARONE, E. Enge"'haria Bioqumica. So Paulo, Edgard Blcher, 1975. v. 3, p.l05-11.
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LILLY, M.D. Fermentation and Enzyme Technology. Nova York, John Wiley & Sons,
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---

205

Joo Carlos Monteiro de Carvalho


Sunao Sato

I O. I - Introduo
Vrios processos fermentativos tm sido desenvolvidos em funo de diferentes aplicaes. Um desses, que tem importncia tanto em escala industrial
como em nvel de pesquisa, o processo descontnuo alimentado, tambm conhecido como processo por batelada alimentada ou, simplesmente, fermentao descontnua alimentada.
Embora a utilizao desse processo venha desde cerca de 1900 para regular
crescimento de Saccharomy~es cerevisiae} os primeiros . a utilizarem o termo "cultura por processo descontnuo alimentado" a ttulo de catalogao foram YOSHIDA
et al.,Z para se referirem a uma fermentao descontnua continuamente alimentada com meio nutriente.

F
mosto

Figura I O. I - Esquema ilustrativo do modo de operao


de uma fermentao descontnua alimentada.

. ..

- - ....

inculo

~- ------- - -- - - - - -"~---~~--- - . ---~~- ~ - ------~-- ------- - --~------- --------'-----'

206

Fermentao descontnua alimentada

Basicamente, o processo descontnuo alimentado definido como uma tcnica em processos microbianos, onde um ou mais nutrientes so adicionados ao
fermentador durante o cultivo e em que os produtos a permanecem at o final da
fermentao. Em alguns casos, todos os nutrientes so gradualmente alimentados
dorna 3 (Fig. 10.1). Adicionalmente, outros ~utores 1 A estendem esse conceito para
o acrscimo de aditivos, tais como precursores de produtos. A vazo de alimentao pode ser constante ou variar com o tempo, 5 e a adio de mosto pode ser de
forma contnua ou intermitente. Mudana de volume pode ou no ocorrer, dependendo da concentrao de substrato e da taxa de evaporao do sistema.
Devido flexibilidade de utilizao de diferentes vazes de enchimento de
dornas com meio nutriente, possvel controlar a concentrao de substrato no fermentador, de modo que, por exemplo, o metabolismo microbiano seja deslocado para
uma determinada via metabli,_ca, levando ao acmulo de um produto especfico:
Cada condio de trabalho pode levar a diferentes perfis de concentrao
no s de substrato, mas tambm de clulas e produto. Uma representao esquemtica de um comportamento possvel para o processo pode ser observada nas Figuras 10.2 e 10.3. Num cultivo, sabe-se que crescente o nmero de
microrganismos ao longo do tempo, o que leva ao aumento da massa celular na
dorna. No entanto, a concentrao de microrganismos pode ter um perfil decrescente durante o perodo correspondente ao enchimento da dorna (Fig. 10.2). Isso
pode ocorrer, pois a concentrao celular no depende somente da massa de microrganismos, mas tambm da variao de volume decorrente da adio de mosto
dorna. Por outro lado, deve-se lembrar que, aps a fase de enchimento da dorna,
o processo passa a ter caraCterstica de processo descontnuo clssico (sem entrada
ou sada de fluido da dorna) e a fermentao termina no instante a partir do qual a
massa de produto na dorna permanece constante (Fig. 10.3).

X.

TE

TF

Figura I 0.2 - Massa celular (Mx) e concentrao celular (X) em funo do tempo para um proceso descontnuo alimentado (curvas hipotticas, pois X, por exemplo, poderia ser constante ou crescente no perodo de enchimento da
doma).

207

Aplicaes

Deve-se salientar que parte do desenvolvimento do processo descontnuo


alimentado tem se dado empiricamente em escala industrial,6 e estas informaes,
quase sempre determinantes da viabilidade da produo industrial, constituem
segredo industrial e dificilmente so divulgadas .

. ' v'

,Vf

Figura I 0.3 - Volume de meio (V), concentrao de substrato (S) e massa de produto (Mp) na doma em funo do
tempo para um processo descontnuo alimentado (curvas hipotticas, neste caso, com vazo constante de alimentao).

Ao longo deste captulo, abordaremos alguns casos onde a aplicao do processo descontnuo alimentado possa ser indicada, bem como uma classificao e
alguns modelos matemticos para represent-lo.

I 0.2 - Aplicaes
Antes de 1940 a maioria dos processos fermentativos envolvia a converso
de carboidratos a outros compostos orgnicos simples. Seguindo o sucesso da
aplicao das fermentaes, descontnuas alimentadas para produo de levedura,
tentou-se a utilizao destas (com adio de um ou mais componentes necessrios
ao metabolismo do microrganismo) para a produo de glicerol, acetona, butanol,
cido ltico e outros materiais, resultando, em muitas ocasies, em um melhor
controle do processo de fermentao e mais eficientes utilizaes dos componentes do meio. 4
Esse xito se deve a inmeros fatores, discutidos amplamente na literatura,
que podem agir isoladamente ou em conjunto para os mais diversos tipos de produtos e/ ou clulas obtidos por fermentao .
Algumas das finalidades ao se empregar as fermentaes descontnuas alimentadas so relacionadas a seguir.
I 0.2.1 - Minimizao dos efeitos do controle do metabolismo celular

Para que um microrganismo tenha sua sobrevivnciagarantida no meio ambiente, ele tem necessariamente de ser eficiente, ou seja, no deve desperdiar
energia. Devido a isso, dispe de mecanismos regulatrios em seu metabolismo,
que previnem que no haja superproduo de um determinado produto ou sntese
de uma enzima desnecessria, entre outros. A utilizao do processo descontnuo

.[
----- ~-

- ---- -- -

- -- - --- --- - ~ ______ _:._.L

208

Fennentao descontnua alimentada

alimentado de fermentao pode ser til quando se procura contornar alguns desses mecanismos.
Em microrganismos, glicose ou outras fontes de carbono rapidamente metabalizveis reprimem a expresso de genes qU:e codificam enzimas relacionadas ao
metabolismo de outras fontes de carbono. Esse fenmeno conhecido como represso catablica. 7 Muitas enzimas, especialmente aquelas envolvidas em caminhos catablicos, esto sujeitas a essa regulao repressiva. Uma importante
tcnica p~ua superar represso catablica na biossntese de enzimas a cultura por
batelada alimentada em que a concentrao de glicose no meio em fermentao
mantida baixa, onde o crescimento restringido, e a biossntese de enzima desreprimida.3,8
Na produo de levedura de panificao procura-se minimizar o efeito glicose atravs da utilizao de diversas tcnicas de alimentao de domas/ mantendo-se baixos os nveis de concentrao de acar no meio em fermentao.
Evitando que esse substrato seja deslocado para produo de etanol, aumenta-se a
eficincia de transformao da fonte de carbono em clulas.
Muito ligado represso catablica est um mecanismo de regulao denominado induo. Tambm chamado de desrepresso, uma vez que os genes que
. codificam a sntese de enzimas induzidas esto usualmente reprimidos e, em presena de um substrato e/ ou indutor, so desreprimidos, liberando a sntese da
respectiva enzima. Diversas enzimas do catabolismo tm sua biossntese regulada
desse modo. 10 Por exemplo, em processos fermentativos cujo produto seja uma
protena recombinante, a induo de proteases se d quando ocorre a diminuio
da concentrao de nitrognio no meio. 11 Trabalhando com E. coli recombinante
para produo de somatotropina bovina, YOON et al. 11 conseguiram evitar que
esta fosse degradada por proteases, por meio da adio de extrato de levedura
como fonte de nitrognio orgnica, o que evitou a induo (desrepresso) dos genes que controlam a formao de proteases.
Represso catablica tambm tem influncia na produo de metablitos secundrios. Glicose tem efeito repressor na formao de alcalides de ergot, cefalosporina C, indolmicina, bacitracina, estreptomicina, neomicina, novobiocina,
penicilina, entre outras. 10 Tambm nesses casos a utilizao do processo descontnuo alimentado com a finalidade de manter baixas concentraes de glicose pode
ser indicada, em vez de se utilizar uma fonte de carbono que no seja repressora.
Como normalmente as maiores velocidades de crescimento microbiano
ocorrem com valores de concentrao de substrato no meio em fermentao maiores que aqueles onde os efeitos de represso catablica so minimizados, h sugesto que se conduza o processo fermentativo em duas fases: a primeira, onde se
fornea mais substrato e se obtenha o aumento da biomassa e outra, onde se diminua o fornecimento de substrato de fal.forma a lintar a concentrao de substrato
e a velocidade do crescimento celular, de modo que haja desrepresso e a enzima
e/ou produto desejado seja produzido. 8 Essa tcnica permite, portanto, que alguns processos fermentativos, principalmente aqueles em que a formao de produto no seja associada ao crescimento, sejam estendidos, trabalhando por um
perodo maior com as clulas em condies onde ocorra a produo do produto
desejado.

Aplicaes

209

Outro mecanismo de regulao que a clula rnicrobiana possui, especialmente til no anabolisrno, a ,inibio por "feedback" (retroinibio). Muitas enzimas biossintticas so inibidas por produtos finais.10 Um meio de reduzir a
formao de produtos finais indesejveis (que exercem inibio e/ ou represso
das enzimas que levam formao do produto desejado) trabalhar com rnutantes auxotrficos (rnutantes nutricionais), controlando a alimentao do nutriente
requerido para seu crescimento. Essa tcnica comumente utilizada na produo
industrial de arninocidos. 3
I 0.2.2 - Preveno da inibio por substrato ou precursores

Nutrientes tais corno metano!, etanol, cido actico e compostos aromticos inibem o crescimento de microrganismos, mesmo a concentraes relativamente baixas.3 Por outro lado, qualquer fonte nutriente pode se tornar inibitria,
dependendo de sua concentrao no meio, do m icrorganismo e das condies de
fermentao. Por exemplo, muitos pesquisadores concordam, de um modo geral,
que a inibio pelo substrato comea a ~er significativa para valores superiores a
100 g/L em fermentaes alcolicas com Saccharomyces cerevisiae e glicose corno
.
1mente, em rnmtas
.
ferrnentaoes,
d eve-se a d Icwnar
..
su b strato. 121314
' ' Ad.Icwna
precursores para se obter maior quantidade de produto, os quais, muitas vezes, so
txicos para a microrganismo a partir de determinadas concentraes no caldo de
cultivo.
Em todos esses casos, o controle da vazo de alimentao permite que se
evite o trabalho em condies inibitrias, melhorando a produtividade e/ou rendimento desses processos ferrnentativos .
I 0.2,3 - Minimizao da formao de produtos de metabolismo txicos

A produo de produtos de metabolismo txicos particularmente crtica


em processos onde se deseja a obteno de altas densidades celulares. Alguns dos
casos onde se visa tais nveis de concentraes ceh.~lares so fermentaes com microrganismos recornbinantes e com clulas animais, urna vez que, geralmente, esses agentes de fermentao produzem pouco produto . O aumento do nmero de
clulas compensaria essa deficincia. Para se conseguir tal objetivo necessrio
restringir a velocidade de crescimento devido a limitaes de transferncia de oxignio, bem corno transferncia de calor. 15 Em E. coZi, fonte de carbono em excesso,
mesmo em aerobiose, leva formao de cido actico 16 (inibidor de crescimento),
que de certa forma est relacionada ao aumento da velocidade de crescimento do
rnicrorganisrno. 11 Por outro lado, no cultivo de clulas animais, os produtos txicos mais comuns so lactato e arnnia. 17
Em ambos os casos acima, o controle da velocidade de fornecimento de
substrato ao sistema permite que se mantenha a velocidade de crescimento celular
em intervalos desejados e/ ou minimize a formao de produtos txicos para as
clulas, possibilitando que se consiga altas concentraes destas e, tambm, aumentei na quantidade de produto formado .

..

2 IO

Fermentao descontnua alimentada

I 0.2.4 - Superao de problemas freqentes de estabilidade em


processo contnuo
Contaminao, mutao e instabilidade de plasmdeo so algumas das dificuldades de manter estvel um processo contnuo. Nesses casos, utiliza-se o processo descontnuo alimentado com a finalidade de super-las. 1

I 0.2.5 - Adequao do processo fermentativo a condies operacionais


No Brasil, o aumento da capacidade de produo de etanol das unidades industriais forou o aumento da capacidade volumtrica e do nmero de fermentadores.18 Apesar de grande parte das instalaes industriais anteriormente virem
trabalhando com o processo descontnuo clssico, no foi mais possvel mant-lo,
devido a problema de intensa formao de espuma, que era menos significativo
quando se operava com domas de pequena capacidade volumtrica, sem levar em
conta efeitos de inibio pelo substrato, que pode ocorrer quando a concentrao
de substrato atinge maiores valores no meio de fermentao . Surgiu, ento, a aplicao do processo descontnuo alimentado para contornar esses problemas. Em
estudo de vazes de enchimento de dornas, vazes decrescentes levaram a maiores produtividades em etanol. 19'20'21 '22 AQUARONE et al.19 concluem que vazes decrescentes levam a maiores produtividades em etanol e minimizam problemas
com espuma, pois a velocidade de adio de acar mxima no incio, quando se
tm menores volumes de meio em fermentao e ainda no h inibio por etanol,
e mnima no final da fase de enchimento.
No caso de ter-se um nutriente que seja instvel nas condies de fermentao, e cujo custo justifique sua utilizao, ele pode ser usado, desde que seja adicionado aos poucos, ajustando a velocidade de adio velocidade de consumo
pelo microrganismo.
Tambm em processos aerbios de perodos mais extensos, tais como em
fermentaes de antibiticos (1 a 2 semanas), pode-se incorporar o substrato a ser
adicionado no lquido de reposio de perda por evaporao. 3'23 Aqui o processo
descontnuo alimentado concatena dois objetivos: repe lquido que o sistema perde e alimenta-o com o substrato.

I 0.2.6 - Estudo de cintica de processos fermentativos


Processo descontnuo alimentado til para o estudo de cintica de processos fermentativos, pois permite a manuteno de baixos nveis de substrato por longo perodo de tempo, que favorvel estimao de parmetros cinticos}4
permite manter concentrao celular constante e controlar velocidade de crescimento em condies transientes. Ademais, h evidncias que as mximas velocidades
de alguns processos podem ser encontradas somente nessas circunstncias. 25

I0.3 - Classificao
Devido diversidade de aplicaes do processo descontnuo alimentado, algumas variaes podem decorrer com a finalidade de ajust-lo produo de di-

Classificao

2I I

versos produtos obtidos por fermentao, sendo qualificados na literatura por


terminologias complementares.
Processo descontnuo alimentado ,r.ep.eti-tUm- aquele em que uma frao
constante de volume de cultura removida a intervalos de tempo fixos, podendo
ser mantido indefinidamente. 6' 26 Em outras palavras, de tempos em tempos, retira-se rapidamente um determinado volume de meio fermentado da doma (o qual
ser destinado separao do produto fermentado), sendo recomposto at seu va27
lor mximo atravs da adio de mosto com vazo de alimentao conveniente.
Terminada a fermentao, repete-se o procedimento, que ser interrompido se cair
a produtividade e/ ou rendimento do sistema, que podem ocorrer, por exemplo, se
houver contaminao. Enchimentos e esvaziamentos repetidos de volumes especficos resultam numa operao cclica de variao de volume/8 sendo designado
por estes autores como processo descontnuo alimentado cclico, como assinalam
MOR! et al. 29 Esse tipo de processo tem sido utilizado industrialmente para produo de levedura e de antibiticos/8 com o intuito de aproveitar como inculo o microrganismo que est crescendo com alta velocidade de crescimento e de trabalhar
com as clulas que esto na fase produtiva por mais tempo, respectivamente, levando ao aumento de produtividade do sistema.
Processo descontnuo alimentado -~t~ndido descreve o modo de operao
em que a concentrao de substrato limitante mantida constante no meio em fermentao pelo suprimento contnuo do nutriente.30 ' 31 Como o prprio nome sugere, tem por finalidade estender o perodo de fermentao; mantendo nveis de
concentrao de substrato no reator adequados para que as clulas continuem com
atividade fermentativa direcionada para a formao do produto desejado.
Tanto a fermentao descontnua alimentada como a descontnua alimentq.da estendida usualmente cobrem somente um ciclo de operao e diferem do processo descontnuo alimentado repetitivo 32 (cclico) quanto durao da
periodicidade aplicada cultura.
O processo descontnuo alimentado pode ser dividido em dois grupos, baseados no fato de a adio de substrato ser ou no controlada por um mecanismo
de retroalimentao 1' 3 (Tab. 10.1).
I
No modo de operao com controle por retroalimentao, o fornecimento de
substrato pode ser controlado em funo da concentrao deste no meio de fermentao (controle direto) ou em funo de outros parmetros (controle indireto),
tais como densidade ptica, pH, quociente respiratrio, entre outros.
Por outro lado, o suprimento de substrato ao sistema feito intermitentemente ou de forma ininterrupta at o final da fase de enchimento da doma nos
processos no sujeitos ao controle por retroalimentao. Alm disso, pode-se alimentar com vazes constantes ou variveis.
Em ambos os modos de operao, o que se visa a otimizao dos valores
da concentrao de substrato no fermentador, com vistas a aumentar o rendimento e/ ou produtividade do processo fermentativo. H casos em que se visa manter
uma determinada concentrao de nutriente no caldo em fermentao e outros em
que se deseja que ela oscile de acordo com um perfil definido, considerado como
timo.U

212

Fermentao descontfnua alimentada

Tabela I 0.1 - Classificao de tcnicas de processo descontnuo alimentado.


EXEMPLO

TCNICA

Condio

Com controle
por retroalimentao

Mtodo

Substrato/
aditivo

Produto

Indireto

Quociente
respiratrio

Melao

Levedura

'

I:

!!

Adio
com taxa
constante

:.-~j ;,-~,:~~~;:, _:.:""/i'~ .

,';'~e

Etanol

Nenhum

cido
fenilactico

Penicilir1a

Glicerol

P-galactosidas e

Etanol

Protena
microbiana

Nenhum

Nenhum
....

I ~i

Protena
microbiana

Etanol

Direto

Adio
com taxa
exponencial

I0.4 -

....
'
t

Parmetro
de controle

In termi tente
ou
incrementos

Sem controle
por retroalimentao

, ..

,,.J-J

r..,..
,:I

-'

.f:,

,;

rl

..

{;.

,
1.
'

-:
.,

-~..-:

....
.'!

Modelos matemticos

A utilizao de equaes que representam um processo pode permitir a estimao de parmetros, bem como sua otimizao.
Consideraremos aqui modelos que foram desenvolvidos para fermentadores
agitados (homogneos), alimentados com mosto constitudo de um substrato limitante.33

I 0.4.1 - Modelo para clulas


Tem-se que a velocidade de variao de massa de clulas no reator corresponde massa celular formada decorrente do crescimento microbiano. Algebrica~
mente:
(10.1)

dMx
dt

--=j.iV X

(10.2)

d(V . X) = ll V X

(10.3)

dt

Modelos matemticos

dV
dX
- . X + - . V = J.! . V. X
dt
dt

213

(10.4)

Considerando que a variao de volume na doma deve-se exclusivamente


alimentao:
dX
FX+-V=J.!VX

(10.5)

F
dX
-X+-=J.!X
v
dt

(10.6)

dX
:.DX+-=J.lX

(10.7)

dX
-=(J.t-D)X
dt

(10.8)

dt

dt

Notar, pela eq. 10.8, que se no houver variao da concentrao celular no


decorrer do tempo, isto , dXI dt =O, tem-se a igualdade J.! = D. Nessa condio, a
velocidade especfica de crescimento celular numericamente igual vazo especfica de alimentao.
Exemplificando: Num processo onde o volume varie de V; a Vf e se alimente a dorna com vazo constante F ternos que V= V;+ F t. Assim, D decresce
com o tempo de acordo orn a expresso:
(10.9)

D =F I (Vi +F . t)

Desta forma, se dXI dt =O, J.! = D =F I (V; + F t), decrescendo, neste caso, ao
longo do tempo.

I 0.4.2 - Modelo para substrato


A velocidade de variao da massa de substrato no ferrnentador corresponde diferena entre a massa de substrato adicionada por tempo e a utilizada para
o crescimento celular. Pode ser representada pela expresso:

dMsr =F S - dMsc
dt
m
dt

d(V. S) =FS

dt

(10.10)

dM s_c
___

- -

(10.11)

dt

0--

-000

--

- - - - -- -- -

2 14

Fermentao descontnua alimentada

dV
dS
_ d.Msc
-S+-V=FS
dt
dt
m
dt

(10.12)

Considerando que a variao de volume na dorna deve-se exclusivamente


alimentao:

~ - f+-dS =.f .s _..!._ d.Msc


V

dt

dt

dS
D S+-=DS -rs
dt
m
onde: rs

(10.13)

(10.14)

=velocidade de consumo de substrato


dS=D (S -S)-r
dt
.m
s.

Sabendo que Yx/s

(10.15)

= rxfrs , chega-se a:
dS
1
- =D (S - S ) - - r
dt
m
Yx;s X

dS
1
-=D(Sm -5)--J..LX
dt
Yx;s

(10.16)

(1q.17)

A eq. 10.17 uma equao simplificada, estando de acordo com trabalhos


descritos na literatura. H autores, entretanto, que sugerem equaes mais completas, onde consideram que uma parcela do substrato vai para crescimento celular e outra para a manuteno,3.6 e at parcela que considera substrato deitinado
formao de produtos complexos. 34 Tambm aqui, vale lembrar que o valor de D
varivel com o tempo, diferenciando a equao acima daquela proposta para balano de substrato de um processo contnuo com doma nica/5 onde o valor de D
fixo.

I 0.4.3 - Modelo para produto


A velocidade de variao de massa de produto no fermentador depende da
massa que formada devido ao metabolismo microbiano. Ou seja:

(10.18)

d(V . P) = ll

dt

.V . X
p

(10.19)

Modelos matemticos

215

Considerando que a variao de volume na doma deve-se exclusivamente


alimentao, tem-se:

dP
dt

FP+-V=~p

VX

(10.21)

(10.22)

X-DP

(10.23)

dP
dt

D P+-=~p

dP
dt

-=~p

onde:

~p

X = rp

Nomenclatura:
D: Vazo especfica de alimentao (h-1)
F: Vazo volumtrica de alimentao (L/h)
MP: Massa de produto no fermentador (g)
M .c: Massa de substrato consumida pelo microrganismo (g)
M.r: Massa de substrato (residual) no fermentador (g)
M,: Massa celular no fermentador (g de matria seca)
P: Concentrao de produto no fermentador (g/L)
rP: Velocidade de formao de produto (g/L.h)
r.: Velocidade de consumo de substrato (g/L.h)
r,: Velocidade de crescimento celular (g de ~atria seca/L.h)
S: Concentrao de substrato residual no fermentador (g/L)
Sm: Concentrao de substrato no mosto de alimentao (g/L)
t: Instante t (h)
TE: Tempo de enchimento do fermentador (h)
TF: Tempo de fermentao (h)
V: Volume de meio no fermentador (fase lquida+ fase slida) (L)
V;: Volume de inculo (L)
Vf: Volume final de meio no fermentador (mximo valor de V)(L)
. X: Concentrao celular no fermentador (g de matria seca/L)
1
~:Velocidade especfica de crescimento celular (h- )
1
~P: Velocidade especfica de formao de produto (h- )
Y, 1.: Fator de converso de substrato limitante em clulas (g de massa
celular seca formada/ g de substrato consumido)

2 16

Fermentao descontnua alimentada

(dMP/dt): Velocidade de variao da massa de produto


no fermentador (g/h)
(dMP/ dt)c: Velocidade de formao de produto em termos mssicos (g/h)
(d.M.cl dt): Velocidade de consumo de substrato em termos mssicos (g/h)
(d.M.rfdt): Velocidade de variao da massa de substrato residual
no fermentador (g/h)
(dMx/dt): Velocidade de variao de massa celular seca no fermentador
(g de matria seca/h)
(dMxfdt)c: Velocidade de crescimento celular em termos mssicos
(g de matria seca/h)
(dP /dt): Velocidade de variao da concentrao de produto
no fermentador (g/L h)
(dS/dt): Velocidade de variao da concentrao de substrato residual
no fermentador (g/L h)
(dV I dt): Velocidade de variao de volume na doma (L/h)
(dX/ dt): Velocidade de variao da concentrao celular no fermentador
(g de matria seca/L h)

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219

_-_-_--==-==-=-==--===============

--- --------- - - - - - -

Walter Borzani

I 1.1 - Definio
O processo ferrnentativo recebe a denominao de sernicontnuo quando,
urna vez colocados no reator o meio de fermentao e o inculo, as operaes que
se seguem obedecerem seguinte ordem:
Operao n. 0 l-Aguarda-se o trrnino .da fermentao.
Operao n. o 2 - Retira-se parte do meio fermentado, mantendo-se, no reator o restante de mosto fermentado.
Operao n. 0 3 - Adiciona-se ao reator um volume de meio de fermentao
. igual ao volume de ineio fermentado retirado na Operao n. 0 2.
O meio de fermentao adicionado na Operao n .0 3 encontra, no reator as
clulas rnicrobianas existentes no meio fermentado que nele foi mantido. Em outras palavras, o meio fermentado no retirado do ferrnentador na Operao n .0 2
serve de inculo ao meio de fermentao adicionado na Operao n. 0 3. Reinicia-se, desse modo, a seqncia de operaes acima descrita, que ser repetida enquanto no houver queda da produtividade do processo.
Em alguns casos o meio fermentado retirado do ferrnentador (Operao n. o
2) submetido a urna centrifugao, para separar os microrganismos nele existentes, microrganismos estes que voltam ao reator juntamente com o meio de fermentao citado.na Operao n. 0 3.
Um processo corno o aqui descrito chama-se sernicontnuo, porque so intermitentes tanto o fluxo de entrada do meio no reator quanto o de sada de material
ferrnen ta do.
O antigo processo de fabricao de vinagres a partir de vinho, conhecido
corno processo lento (ou processo francs ou, ainda, processo de Orleans), um
exemplo tpico de processo sernicontnuo (ver Vol. 4, Captulo 6).

220

Fermentao semicontnua

I 1.2 - Produtividade do processo semicontnuo


A produtividade de um processo fermentativo depende de muitos fatores,
tais como: microrganismo utilizado, mtodo de preparo do inculo, concentrao
microbiana no fermentador, composio do meio, temperatura, pH, fornecimento
de oxignio e de nutrientes durante o desenvolvimento da fermentao, e outros
mais.
Nosso objetivo neste momento, , porm, bastante especfico. Para definir
esse objetivo de maneira a no deixar margem a dvidas, chamemos de V o volume total de meio inoculado existente no reator e j completamente fermentado
(Operao n . 0 1), e de a V (sendo O< a< 1) o volume de meio fermentado retirado do reator na Operao n. o 2.
Interessa-nos saber de que maneira a frao a afeta a produtividade do processo.
No difcil mostrar que a afeta a produtividade. Para tanto, indiquemos
por:
5 0 = concentrao do substrato principal (geralmente, a fonte de carbono) no
meio de fermentao, substrato este que ser totalmente consumido.
N 0 = concentrao de outro nutriente importante para a atividade vital do
microrganismo (como a fonte de nitrognio, por exemplo) no meio de fermentao.
P1 =concentrao do produto no meio fermentado.
N 1 = concentrao, no meio fermentado, do outro nutriente importante para
a atuao do microrganismo.
xf = concentrao microbiana no meio fermentado.
Se, na Operao n .0 2, o volume de meio retirado do reator a V, o volume
de meio remanescente ser (1-a)V.
Conseqentemente, na Operao n. 0 3 sero misturados um volumf (1-a)V
de meio fermentado e um volume a V de meio de fermentao.
Podemos ento calcular, na mistura resultante:
a) concentrao do substrato principal (S;):

(11.1)
b) concentrao do outro nutriente j citado (Ni):
(11.2)

c) concentrao microbiana (Xi), admitindo-se que no haja retorno, ao reator, dos


microrganismos existentes no volume de meio fermentado a V:

(11.3)

Produtividade do processo semicontnuo

22 I

d) concentrao do produto (PJ


(11.4)
O tempo para se completar a fermentao da mistura resultante da Operao n. 0 3 (e, conseqentemente, a produtividade do processo) depende:
a) do valor de Xil porque quanto maior for a concentrao microbiana inicial, menor ser o tempo de fermentao.
b) do valor de S;, uma vez que quanto maior for a concentrao inicial do
substrato, maior ser o tempo necessrio sua transformao em produto;
c) do valor de N;, pois se a concentrao inicial do outro nutriente j referido
no for adequada, as clulas microbianas trabalharo mais lentamente;
d) do valor de Pv porque o produto da fermentao , muito freqentemente, um inibidor da atividade microbiana, o que pode acarretar maior tempo para
se atingir fermentao completa.
Mas as eqs. (11.1) a (11.4) nos mostram que S;, N;, X; e P; dependem de a.
Logo, a afetar a produtividade do p~ocesso.
A Figura 11.1 mostra, esquematicamente, de que maneiras a pode influir na
produtividade.

a
Figura 11.1 - Representao esquemtica de possveis influncias de a na produtividade do processo semicontnuo.

No cabe, em um curso de graduao, examinar pormenorizadamente os resultados representados na Figura 11.1. Os interessados podero, contudo, consultar a literatura indicada no final deste Captulo.
Duas situaes particulares, porm, devem ser comentadas, a saber:
a) Se a = 1, isto , se na Operao n. o 2 retirarmos todo o meio fermentado
existente no reator e o substituirmos por meio de fermentao, no se processar
mais qualquer transformao, porque no haver clulas microbianas para servi-

222

Fermentao semicontnua

rem de inculo ao meio adicionado. Em outras palavras, a produtividade ser


nula.
b) Se a. se aproximar de zero, o volume de meio fermentado periodicamente
retirado do reator (Operao n. o 2) ser muito pequeno quando comparado com o
volume de meio fermentado remanescente, e o processo semicontnuo se aproximar do contnuo.

I 1.3 - Comentrios finais


Em que pese o fato de o processo semicontnuo apresentar relativamente
poucas aplicaes, seu emprego, principalmente quando o volume de produo
relativamente pequeno, pode apresentar algul}las vantagens significativas, destacando-se:
a) possibilidade de operar o fermentador por longos perodos (s vezes, alguns meses) sem que seja necessrio preparar um novo inculo;
b) possibilidade de aumentar a produtividade do reator apenas modificando-se o cronograma de trabalho;
c) possibilidade de, uma vez conhecidas as melhores condies de operao,
conseguir produtividade significativamente maior do que a obtida em processo
descontnuo.

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223

Maria Cndida Reginato Facciotti

12.1 - Conceitos bsicos


O processo de fermentao contnua caracteriza-se por possuir uma alimentao contnua de meio de cultura a uma determinada vazo constante, sendo o
volume de reao mantido constante atravs da retirada contnua de caldo fermentado.
A manuteno de volume constante de lquido no reator de primordial importncia, a fim de que o sistema atinja a condio de estado estacionrio ou regime permanente ("stead,y state"), condio na qual as variveis de estado
(concentrao de clulas, de substrato limitante e de produto) permanecem constantes ao longo do tempo de operao do sistema.
De fato, o processo contnuo caracteriza-se fundamentalmente por ser um
sistema que pode operar por longos perodos de tempo em estado estacionrio,
decorrendo desta situao uma srie de vantagens em relao ao processo descontnuo tradicional, conforme ser visto adiante.
Entretanto, manuteno de volume constante no reator significa teoricamente a necessidade de se contar com vazes idnticas de alimentao e de retirada de meio, o que praticamente impossvel de se obter na prtica. Por essa razo,
utilizam-se em geral sistemas de retirada de lquido por transbordamento ("ladro"), de forma a manter o nvel de lquido constante ou, ainda pode-se empregar bombas de alta vazo na sada, acionadas intermitentemente, de forma a
manter uma massa constante no reator. Para essa finalidade, alguns fermentado. res de lboratrio mais modernos contam com um sistema automtico de controle
da massa do reator, atravs da manuteno do mesmo sobre uma balana, a qual
comanda o acionamento das bombas de alimentao e de retirada de lquido.
Outro problema que pode igualmente comprometer a manuteno de volume constante, principalmente em processos aerados, a formao intensa de espu...--~ ..

- - - ---------- ----------- - - - -

-- ---~------ -- ------ - --

224

Fermentao contnua

ma, que deve ser evitada, seja atravs da utilizao de antiespumantes


apropriados, ou atravs de sistemas mecnicos de quebra de espuma.
Tais problemas tornam-se particularmente crticos quando se opera ~m reatores de pequena capacidade, onde se torna de vital importncia a precisb no estabelecimento das vazes de alimentao e de retirada do caldo fermentado ..

12.2 - Vantagens e desvantagens do processo contnuo


em relao ao descontnuo
Conforme mencionado anteriormente, as principais vantagens apresentadas
pelo processo contnuo de fermentao, em relao ao descontnuo tradicional,
so decorrentes da operao em estado estacionrio, podendo-se destacar:
aumento da produtividade do processo, em virtude de uma reduo dos
tempos mortos ou no-produtivos;
obteno de caldo fermentado uniforme, o que facilita o projeto das operaes de recuperao do produto de interesse ("downstream");
manuteno das clulas em um mesmo estado fisiolgico, o que torna o
processo contnuo uma excelente ferramenta para estudos de mecanismos
de regulao metablica 1' 2 ou, ainda, para estudos de otimizao da com. - d e melO
. d e cultura; 3'4'5'6
postao
possibilidade de associao com outras operaes contnuas na linha de
produo;
maior facilidade no emprego de controles avanados;
menor necessidade de mo-de-obra.
Entretanto, ao lado das inmeras vantagens apontadas, o processo contnuo
de fermentao apresenta tambm algumas desvantagens ou problemas prticos,
que podem limitar o emprego deste tipo de sistema em escala industrial, para alguns processos fermentativos. Assim, podem-se destacar:

maior investimento inicial na planta;


possibilidade de ocorrncia de mutaes genticas espontneas, resultando na seleo de mutantes menos produtivos;
maior possibilidade de ocorrncia de contaminaes, por se tratar de um
sistema essencialmente aberto, necessitando pois, de manuteno de condies de assepsia nos sistemas de alimentao e retirada de meio, desde
que o processo assim o exija;
dificuldades de manuteno de homogeneidade no reator, quando se trabalha com baixas vazes, ou quando o caldo adquire comportamento pseudoplstico, como o casodo cultivo de fungos filamentosos;
\!] dificuldades de operao em estado estacionrio em determinadas situaes (formao de espuma, crescimento do microrganismo nas paredes do
reator, ou ainda, nos sistemas de entrada e sada de lquido).
Apesar dos problemas acima mencionados, a utilizao do processo contnuo de fermentao encontra grande aplicao prtica, podendo-se citar como
exemplo tpico a fermentao alcolica, onde se utiliza normalmente, em escala

Formas de operao no sistema contnuo

225

industrial, o processo contnuo com reciclo de clulas ou, ainda, o processo cont-.
nuo em mltiplos estgios/ permitindo, desta forma, a obteno de elevados rendimentos, bem como elevadas produtividades do processo. Outro importante
exemplo de utilizao do processo contnuo em larga escala o tratamento biolgico de resduos, em reatores de fluxo ascendente (tipo UASB), empregados para o
tratamento de uma grande variedade de efluentes industriais, tais como os oriundos de fbricas de cerveja~ e refri~erantes, de fbricas de laticnios e de indstrias
alimentcias de um modo geral. 8' 9' 0
Deve-se ressaltar que ambos os casos de emprego da fermentao contnua
acima citados, so processos no asspticos, nos quais se empregam reatores de
enormes capacidades, podendo chegar a at alguns milhes de litros. Por outro
lado, para processos exigentes em termos de manuteno de condies de assepsia, como o caso da produo de enzimas e antibiticos, o processo contnuo encontra ainda aplicao restrita, devido principalmente possibilidade de
ocorrncia de contaminaes, conforme mencionado anteriormente.

12.3 - Formas de operao no sistema contnuo


O processo de fermentao contnua normalmente tem incio em um processo descontnuo, ou seja, carrega-se inicialmente o reator com meio de cultura,
procede-se inoculao com o microrganismo responsvel pela converso, sendo que, aps algum perodo de operao descontnua, inicia-se a'alimentao de
meio de cultura e retirada de caldo, dando-se incio efetivamente ao processo
contnuo.
Dependendo do instante em que se inicie o processo contnuo propriamente
dito, bem como da vazo de alimentao empregada, o sistema poder convergir
com maior ou menor rapidez situao de estado estacionrio. Assim, recomenda-se usualmente que se inicie a alimentao com o cultivo em fase exponencial, e
contendo uma concentrao celular a mais elevada possvel.
O sistema contnuo de fermentao extremamente verstil quanto s suas
vrias possibilidades de operao, tais como:
Contnuo em um nico estgio (um nico reator):
sem reciclo de clulas
com reciclo de clulas
Contnuo em mltiplos estgios (n reatores em srie):
com uma nica alimentao (com ou sem reciclo de clulas)
com mltiplas alimentaes (com ou sem reciclo de clulas)
Cada uma dessas diferentes opes ir resultar em distintos comportamentos das variveis de estado (concentro de clulas, de substrato e de produto)
nos diversos estados estacionrios possveis, podendo-se, assim, definir faixas
ideais de operao do sistema, tendo como objetivo bsico a obteno de elevadas
produtividades do processo.
Nos subitens seguintes, focalizar-se-, com detalhes, cada uma destas diferentes formas de operao no sistema contnuo.

226

Fennentao contnua

12.3.1 - Equacionamento para o reator contnuo ideal


sem reciclo de clulas
A Figura 12.1 mostra, esquematicamente, um sistema empregado para a realizao de um cultivo contnuo em um nico estgio, sem recirculao de clulas.
O meio de cultura contendo o substrato limitante em uma determinada concentrao, alimentado a uma vazo constante. Admite-se agitao perfeita, de forma
que o reator possa ser considerado como homogneo. Assim, portanto, admite-se
que cada poro de meio alimentada no reator seja instantaneamente misturada
no volume de reao, de forma que o lquido efluente possuir as mesmas concentraes de clulas, substrato e produto, que aquelas existentes no meio de reao.
F

X,S,P

Figura 12.1 - Sistema contnuo em um nico estgio, sem reciclo de clulas

Definem-se, pois, as seguintes variveis:


F= vazo volumtrica de alimentao de meio (L/h)
V= volume de meio no reator (L)
X= concentrao de clulas no reator (g/L)

X0 = concentrao de clulas no meio de alimentao (g/L)


S =concentrao do substrato limitante no reator (g/L)
So = concentrao do substrato limitante no meio de alimentao (g/L)
P = concentrao do produto P no reator (g/L)
Po= concentrao do produto P no meio de alimentao (g/L)
f..l =.velocidade especfica de crescimento = (1 I X) (dX I dt) (h -l)
f..lp= velocidade especfica de produo do produto P genrico =
(g produto I g clulas h ou simplesmente g/ g h)
f..ls= velocidade especfica de consumo de substrato = (1 I X) (-dS I dt)
(g substrato/ g clula h ou simplesmente g/ g h)
Yx;s =fator de converso substrato a clulas= .:1X/(.:1S)101a 1
(g clula/g substrato ou simplesmente g/g)
Assim, pode-se escrever o seguinte balano material para o microrganismo,
considerando o reator como volume de controle:

22 7

Formas de operao no sistema continuo

(Variao da
massa de
clulas
no reator)

(Massa de
clulas
que entra)

(Massa
de clulas
que sai)

(Massa
de clulas
que aparece
devido ao
crescimento)

Portanto, considerando-se volume constante, tem-se:

VdX
-. =FX 0 -FX +V (dX)
dt
dt crescimento

(12.1)

A velocidade global instantnea de crescimento, por sua vez, pode ser expressa corno:
dX)
=J..!X
(dt crescimento

(12.2)

Define-se a "vazo especfica de alimentao" (D) ("dilution rate"), corno


sendo a relao entre a vazo volumtrica de alimentao e o volume de meio no
reator. Assim, tem-se que:
D =f_ (h -l)

(12.3)

sendo que (1 I D)= tempo de residncia hidrulico no reator.


Assim, substituindo-se as equaes (12.2) e (12.3) na equao (12.1) obtm-se:
dX
-=D(X 0 -X)+J..!X
dt

(12.4)

Corno freqentemente se procede alimentao de meio de cultura esterilizado, tem-se normalmente Xo =O. Assim, tem-se:
dX
(12.5)
-=f.lX-DX
dt
Considerando, pois, que se tenha atingido urna situao de estado estacionrio no reator, na qual a concentrao celular permanece constante (e, portanto,
dX/ dt = 0), obtm-se que:
(12.6)
ou, ainda:
(12.7)

J.l=D

As equaes acima so de fundamental importncia na !lnlise do processo


contnuo de fermentao, pois indicam que, na condio de regime permanente, a
-

---

- -----

_ _ _____I
_[

228

Feimentao contnua

concentrao celular se mantm constante graas a um equilbrio entre a velocidade de crescimento celular e a velocidade de retirada de clulas do fermentador e,
ainda, que a velocidade especfica de crescimento (Jl) igual vazo especfica de
alimentao (D). Ou seja, significa que atravs da imposio de uma determinada
vazo de alimentao ao reator, consegue-se controlar a velocidade especfica de
crescimento das clulas, significando que possvel, em princpio, fixar o estado
fisiolgico das clulas, o que sem dvida de primordial importncia.
De forma anloga ao que foi efetuado para o microrganismo, pode-se equacionar os balanos materiais para o substrato limitante e para o produto P genrico, de forma a se obter as expresses a seguir:

d5
.
J.!X
-=D(5 0 -5)-Jl 8 X=D(5 0 - 5 ) - - dt
Yx;s

dP

-=D(P0 -P)+JlpX
dt

(12.8)

(12.9)

Deve-se observar que, na eq. (12.8), o ltimo termo representa a velocidade


de consumo do substrato para crescimento das clulas, sendo que no se considerou o consumo de substrato para a manuteno destas, assunto o qual ser abordado no item 12.3.2.
Por outro lado, na eq. (12.9) o ltimo termo representa a velocidade global
de sntese do produto P pelas clulas. Conforme ser visto adiante, no item 12.4,
dependendo da cintica de formao do produto, dada por diferentes correlaes entre f.lp e Jl, poder-se-o ter distintos comportamentos da concentrao de
produto no reator. Deve-se esclarecer, ainda, que tambm no se considerou que
haja decomposio ou degradao do produto, o que eventualmen~ poder
ocorrer e, obviamente, nestes casos, ser necessrio incluir um termo adicional
na eq. (12.9).
Considerando-se, pois, a eq. (12.8) em estado estacionrio (dS/ dt = 0), pode-se escrever:
J.!X = Y x;sD(50 -5)

(12.10)

Assim, fazendo-se Jl = D, obtm-se a expresso:


X=Yx;s(5 0 -5)

(12.11)

No que se refere operao do biorreator em regime contnuo, da mais


alta importncia que se procureconhecer o comportamento das variveis de estado X, 5 e P, em estado estacionrio, em funo da vazo especfica de alimentao
D, a fim de que se possam estabelecer faixas ideais de operao do sistema, tendo
em vista a obteno de altas produtividades do processo.

Formas de operao no sistema contnuo

229

Nesse sentido, torna-se necessrio o conhecimento da cintica do processo, o


que significa dispor de uma correlao entre a velocidade especfica de crescimento (f..l) e a concentrao do substrato limitante (S).
Como se sabe, embora existam vrias propostas na literatura, o modelo cintico de MONOD 11 o mais amplamente empregado, adequando-se para um grande
nmero de processos fermentativos. Por essa razo, de grande interesse obter-se
as curvas de X e S em estado estacionrio, quando se considera vlido o modelo
de Monod, dado pela equao abaixo:
(12.12)

onde:
f..lmax =velocidade especfica mxima de crescimento (h-

1
)

K5 =constante de saturao de Monod (g/L)


Assim, fazendo-se f..l = D e isolando-se S, obtm-se:
S=

KsD

(12.13)

f..lmax- D

Substituindo-se a eq. (12.13) na eq. (12.11), obtm-se a seguinte equao para


X em funo de D:

X= Y

x;s(so -_K---'s'-D-)
-D

(12.14)

f..lmax

Por outro lado, a produtividade em clulas, no sistema contnuo sem reciclo


de clulas, dada por:

s;~ = DJf = DYx;s (so -_K__::s::._D_)

(12.15)

f..lmax -D

Dessa forma, a partir das eqs. (12.13), (12.14) e (12.15), pode-se prever o
comportamento de X, S e Px, em funo da vazo especfica de alimentao D,
conforme indicado na Figura 12.2, onde se apresentam as curvas obtidas por simulao das citadas equaes.
A partir da Figura 12.2, observa-se que os valores de X permanecem praticamente constantes em uma grande faixa de valores de D, ocorrendo uma brusca
queda at o valor zero, quando D se aproxima do valor de f..lmax Por outro lado, a
equao (12.13) indica que quando D = f..lmax' o valor de S tende ao infinito, o que
na prtica signfica tender para o mximo valor possvel, ou seja, o valor 50 , isto ,
a concentrao do substrato na 'alimentao.
Nesse caso, quando S =50 observa-se, a partir da eq. (12.14), que se obtm um
valor nulo para a concentrao celular em estado estacionrio. Tal condio de ope-

230

Fermentao contnua

rao conhecida como "estado estacionrio de lavagem", ou simplesmente "lavagem" (liwash-out"), situao na qual ocorre um arraste das clulas do reator. O
valor da vazf!o especfica de alimentao no qual se tem a mxima velocidade especfica de crescimento denominado "D crtico"(Dc)
X,S(g/L)

Px(g/L.h)

6 . - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - . , 3,0

X
5

2,5

2,0

1,5

1,0

0,5

s
o

0;2

0;1

0,3
0(1/h)

Figura 12.2 - Sistema contnuo em um nico estgio, sem reciclo de clulas (simulao das equaes 12. 13
1
a 12.15, com J.Lmax= 0,5 h- ; Ks = 0,1 g/L; YXIS = 0,5; 50 = lO g/L)

Assim, a condio de lavagem do reator permite estabelecer a faixa de operao do reator contnuo que, no caso do reator ideal, sem reciclo de clulas, est
entre zero e Jlmax' obedecendo-se, portanto, condio D <De.
Entretanto, dentro dessa ampla faixa de operao, verifica-se, a partir da
Figura 12.2, que os mais altos valores de produtividade em clulas so obtidos
quando D est muito prximo a Jlmax' ou seja, numa regio de grande instabilidade de operao do reator, pois uma flutuao mnima na vazo especfica de alimentao, poder ocasionar a lavagem do reator. Por essa razo, caso o objetivo
do processo seja produo de clulas, recomenda-se a operao do reator em
valores um pouco menores de D (em torno de 10 a 15% menor), obtendo-se assim
uma produtividade em clulas menor que a mxima, porm ainda suficientemente elevada.
O arraste das clulas, embora obviamente indesejvel quando se est operando um reator contnuo, usualmente empregado para a determinao da velocidade especfi<;a mxima de crescimento (Jlmax), sendo esta tcnica conhecida
como "mtodo dinmico de determinao de Jlmax" sendo amplamente descrita na
literatura.12 Essa tcnica consiste em, partindo-se de um dado estado estacionrio
com Jl = D, impor-se uma vazo especfica de alimentao nitidamente superior a
Jlmax' de forma a se obter um decrscimo da concentrao celular no reator, conforme pode ser verificado a partir da eq. (12.5), reescrita abaixo:

dX
= (Jlmax - D)X
dt

(12.16)

Formas de operao no sistema continuo

23 I

Assim, integrando-se a equao acima entre t0 a t, sendo to o instante em que


se fez D > f.lmaXI no qual se tinha uma concentrao celular igual a Xi, tem-se:
(12.17)

Assim, plotando-se ln(X/Xi) em funo do tempo, obtm-se uma reta, cujo


coeficiente angular igual a (f.lmax- D). Como D conhecido, calcula-se assim o valor de f.lmax A Figura 12.3 ilustra o procedimento descrito.
Convm ainda, aproveitar a Figura 12.2 para colocar as definies de "quimiostato" e "turbidostato", freqentemente mencionadas na literatura. Por quimiostato entende-se um reator contnuo operando na regio de valores de D para os
quais X varia pouco e, portanto, um processo cuja composio qumica mantida constante (X e S constantes), atravs da introduo de substrato pela alimentao. Por turbidostato, por outro lado, designa-se o processo contnuo operando na
regio de grande variao de X, isto , na regio de D prximo a f.lmax Nesse caso,
ajusta-se a vazo de alimentao de forma a manter X constante, o que em alguns
casos, corresponde a manter a turbidez do meio constante.
Para finalizar o presente item, convm mencionar que, no caso do tratamento biolgico de resduos, deve-se operar o reator com baixos valores de D, pois o
objetivo, neste caso, obter um efluente com baixos valores da concentrao do
substrato. Nessa situao de baixos valores de S, todavia, tornam-se crticos certos
fenmenos, tais como, metabolismo endgeno, lise celular e consumo de substrato
para manuteno, cujas conseqncias para o desempenho do reator sero analisadas no prximo item.

o
-2

-4
-6

-8

-10
-12
-14~---L----~--~----~----L---~--~

10

12

14

Tempo (h}

Figura 12.3 -Mtodo dinmico de determinao de f-lmax (simulao da equao 12.17, com J..lmax
1
I ,5 h- ; X;= 5,0 g/L; ta= O)

= 0,5 h- 1; O =

232

Fennentao contnua

12.3.2 - Desvios do comportamento ideal devido manuteno


e ao decaimento celular
No desenvolvimento apresentado no item anterior, considerou-se um reator
contnuo ideal, sem levar em considerao o consumo de substrato para manuteno, bem como sem considerar a possvel ocorrncia de decaimento celular ("decay"), seja como conseqncia do metabolismo endgeno, ou ainda, resultante de
lise celular. 13
No presente item pretende-se, pois, verificar quais os tipos de alteraes resul. tantes no comportamento das variveis de estado X e S, em funo da vazo especfica de alimentao, quando se levam em considerao os aspectos mencionados.
Assim, as equaes de balano material para o microrganismo ~ para o substrato limitante, adquirem o seguinte formato:
(12.18)

(12.19)

-=D(S
dS
f..1
0 -S)- ( -+m
5 X
dt
YG
onde:
kd =velocidade especfica de decaimento celular (h-1)
12
Y c= fator de converso verdadeiro substrato a clulas (g/ g), PIRT
m. =coeficiente de manuteno (h-1)

Considerando-se as equaes (12.18) e (12.19) em estado estacionrio e admitindo-se vlida a cintica de Monod, obtm-se as seguintes expresses para X e S:
X=

y cD(So -S)

Ycms +(D+kd)
S=

Ks(D+kd)
f-lmax -(D+kd)

(12.20)

(12.21)

sendo que, em estado estacionrio, tem-se f..1 = D + kd:


Assim, na Figura 12.4 apresentam-:se as curvas de X e S obtidas por simulao das eqs. (12 .20) e (12.21), nas quais se considerou diferentes valores
parakd e m 5
Conforme se pode verificar atravs dessa figura, as alteraes mais significativas no comportamento da concentrao celular ocorrem na regio de baixos valores de D e, portanto, onde se tm baixas concentraes de substrato, situao na
qual o substrato utilizado preferencialmente para manuteno da viabilidade celu~ar.

Formas de operao no sistema contnuo

233

Portanto, em processos nos quais se trabalha com baixas vazes especficas de


alimentao, cujo exemplo tpico o tratamento biolgico de resduos, nos quais se
opera na regio de baixos valores de S, h necessidade de se tomar uma certa cautela no estabelecimento da vazo de operao, pois se poder obter, em estado estacionrio, concentraes celulares significativamente inferiores s previstas
quando no se considera o decaimento celular e o consumo de substrato para manuteno. Deve-se mencionar, ainda, que nas simulaes apresentadas na Figura
12.4, considerou-se kd e m. constantes. Entretanto, para um tratamento mais rigoroso, se poderia consider-los como sendo funes de S e, portanto, variveis com
D, conforme indicam algumas propostas na literatura. 13' 14
Convm mencionar, ainda, que uma srie de conseqncias importantes so
observadas, quando se analisa a ocorrncia de perda de viabilidade celular no reator contnuo, conforme apontado em trabalho recente, por FACCIOTTI;
SCHMIDELL. 14

12.3.3 - Sistema contnuo com reciclo de clulas


A operao do sistema contnuo com recirculao de clulas tem como objetivo a obteno de alta densidade celular no reator, aumentando-se assim consideravelmente as velocidades e, portanto, em ltima anlise, a produtividade do
processo. O reciclo de clulas pode ser interno ou externo ao reator.
Por recirculao interna entende~se a situao na qual uma frao das clulas mantida no reator, seja atravs de uma simples sediment~o, ou atravs do
emprego de um filtro na sada de lquido do reator. No caso do reciclo externo o lquido efluente circula atravs de urtl "separador de clulas" (sedimentador, centrfuga ou sistema de filtrao por membranas), de maneira que uma corrente
concentrada em clulas retoma ao fermentador, enquanto uma outra (filtrado ou
permeado), sai praticamente isenta de clulas.
X(g/L)

S(g/L)

6.----------------------------------.-.----.

10

S(Kd=O;
m.=o
ou0,03) 8

0,4

0,5

Figura 12.4 - Influncia da manuteno e do decaimento celular no sistema contnuo em um nico estgio, sem recido de

clulas (simulao das equaes 12.20 e 12.21 ,com flmax = O,Sh-I; K; = O, I gtl; YG = 0,5; 50 = IOgtl)

234

Fermentao contnua

Deve-se ressaltar que a recirculao interna de clulas representa uma situao comparativamente mais segura em termos de manuteno de condies de assepsia, quando comparada com o reciclo externo, sendo por esta razo mais
adequada no caso de processos exigentes em termos de assepsia, como o caso da
produo de enzimas e antibiticos. Por outro lado, o reciclo externo torna-se uma
alternativa bastante vivel no caso de processos em que esta preocupao no seja
to intensa, ou at mesmo no exista, como por exemplo na fermentao alcolica,
ou, ainda, no tratamento biolgico de resduos (processo de lodos ativados), os
quais so exemplos prticos de utilizao do processo contnuo com reciclo externo de clulas em escala industrial, com reatores de grandes capacidades, podendo-se chegar a at alguns milhares de metros cbicos.

12.3.3.1 - Sistema com reciclo interno


Considerando-se o sistema contnuo com reciclo interno de clulas indicado
na Figura 12.5, no qual a reteno de clulas ocorre atravs do emprego de uma
filtrao interna do lquido efluente, definem-se os seguintes parmetros:
c= frao do lquido efluente removida diretamente do fermentador,
sem passar pelo filtro ("purga")
h= fator de diluio da concentrao celular obtido no lquido filtrado

F
S0

cF
X,S
(1-c) F
r,===:!~=f=4=A

hX,S

Figura 12.5 - Sistema contnuo em um nico estgio, com reciclo intemo de clulas.

Assim, pode-se escrever a seguinte equao de balano material para o microrganismo no fermentador, considerando-se X0 = 0:
dX
V-= V11X -cFX -(1- c)F hX
dt

(12.22)

Deve-se observar que o segundo termo do membro direito da equao acima


representa a massa de clulas que removida atravs da purga, enquanto que o
ltimo se refere massa de clulas removida atravs do efluente filtrado, com
uma vazo (1 - c)F e com uma concentrao de clulas igual a hX.
primei~a vista pode parecer estranho o fato de se considerar a existncia
de uma "purga", conforme representado na Figura 12.5. De fato, a sua existncia
no estritamente necessria. E;ntretanto, conforme ser visto adiante, essa sada

Formas de operao no sistema contnuo

235

direta de caldo fermentado, sem filtrao, permite uma maior controlabilidade do


processo em termos de manuteno do estado estacionrio neste sistema.
A seguir, dividindo-se os termos da eq. (12.22) pelo volume de meio no reator (V), obtm-se, aps alguns rearranjos: .
dX
= {J.t-D[c +h(1- c)]}X
dt

(12.23)

A=[c+h(1-c)]

(12.24)

Seja:

Assim, pode-se escrever que:


dX
dt

-=(J.t-AD)X

(12.25)

Portanto, em estado estacionrio (dX/ dt = 0), obtm-se:


J.l=AD

(12.26)

A eq. (12.26) indica que, em estado estacionrio, no mais vlida a igualdade entre J.l e D, conforme ocorre para o sistema contnuo simples sem reciclo de clulas. Alm disso, pode-se observar que A ser sempre menor do que 1, pois
considerando-se as duas situaes extremas possveis, quais sejam: h=O (reteno
total de clulas atravs do, filtro) e h = 1 (reteno nula de clulas, recaindo portanto, no sistema sem reciclo), verifica-se que c< A< 1, significando portanto, que
J.l < D. Essa desigualdade possui um significado prtico de grande importncia,
pois indica que, para esse sistema, o valor de D no qual ocorrer a lavagem, isto ,
D crtico, ser superior ao valor de J.lmax' pois:
D = llmax
c

(12.27)

Significa, portanto, na prtica, uma ampliao na faixa de operao da vazo


especfica de alimentao, podendo-se operar com valores de D superiores a J.lmax
Com relao equao de balano material para o substrato limitante, pode-se verificar que no h alterao desta em relao anteriormente desenvolvida para o sistema sem reciclo de clulas (eq. 12.8).
Assim, considerando-se vlida a cintica de Monod, obtm-se em estado estacionrio:
X= Yx;s (So - S)
A

(12.28)

236

Fermentao contnua

S=

K 5 AD

(12.29)

J.lmax -AD

Px =ADX

(12.30)

Atravs das equaes acima, torna-se possvel verificar algumas conseqncias prticas adicionais advindas do reciclo de clulas, alm da ampliao
da faixa de operao da vazo especfica de alimentao, discutida anteriormente. Dessa maneira, pode-se observar, comparando-se as eqs. (12.28) e (i2.29) com
as eqs . (12.11) e (12.13), que no sistema com recirculao de clulas tem-se, em
estado estacionrio, uma maior concentrao de clulas, ao lado de uma menor
concentrao de substrato, sendo que a concentrao celular no sistema com reeielo aproximadamente igual do sistema sem reciclo, multiplicada pelo fator
(1/ A) .
No que se refere produtividade em clulas, verifica-se que para valores
de D inferiores a J.lmax' a produtividade no sistema com reciclo praticamente
igual do sistema sem reciclo. J para valores de D superiores a J.lmax' verificam-se elevadas produtividades no sistema com reciclo, enquanto que obviamente se observam valores nulos no sistema sem reciclo, devido ocorrncia de
lavagem de clulas.
Pode-se concluir, portanto, que caso o objetivo do processo seja a produo de clulas, ento o sistema com reciclo oferecer vantagens realmente efetivas em relao ao sistema sem reciclo, isto , maiores valores de X e Px. apenas
caso se opere na regio de valores de D superiores a J.lmax' at o limite de J.lmaxf A ,
conforme se pode verificar atravs da Figura 12.6, na qual se apresentam as
curvas de X e Px, obtidas por simulao das eqs. (12.28) e (12.30) {Xc; rec e Pxc!rec ),
bem como se indicam ainda, as curvas respectivas para o sistema sem reciclo
(Xs!rec e Pxs!rec)
Por outro lado, no caso de tratamento de resduos, onde o objetivo a degradao da matria orgnica, pode-se observar que, comparativamente ao sistema
sem reciclo, possvel a obteno de concentraes residuais de substrato ainda
bastante baixas, para valores mais altos de D, significando desta maneira uma sensvel reduo no tempo de residncia necessrio para se atingir a degradao desejada da matria orgnica do resduo.
Com relao ao acmulo de um determinado produto de interesse, a faixa
ideal de operao em termos de D ir depender da cintica de formao desse pr~
duto, o que ser abordado separadamente no item 12.4.
Convm ressaltar que nas equaes desenvolvidas para o sistema com reeielo de clulas, no se considerou a ocorrncia de decaimento celular, bem como o
consumo de substrato para manuteno celular~ os quais podem ser . particularmente crticos quando se empregam valores muito baixos de D, conforme discutido anteriormente no item 12.3.2.

Formas de operao no sistema contnuo

23 7

Px(g/L.h)

r-----------------------------------------16

12

Px
c/rec

~------~------~~----~~----~~----~~0
1 ,O

1 ,5

2,0

2,5

0(1/h)

Figura 12.6- Sistema contnuo em um nico estgio, com reciclo de clulas (simulao das equaes 12.28 e
-I
12.30, com flmax = 0,5 h : Ks = O, I g!L; YXIS = 0,5; 50 = I Og!L; c = O; h = 0,2).

Um aspecto adicional que merece ser comentado, diz respeito importncia


da existncia da "purga" no sistema contnuo com reciclo, isto , de uma sada direta de lquido efluente do reator, sem passar pelo filtro. Caso essa no exista,
tem-se c = O, podendo-se observar, a partir das eqs. (12.24) e (12.26) que, em estado
estacionrio, a velocidade especfica de crescimento ser igual ao parmetro h, o
qual depende diretamente da eficincia do filtro empregado. Assim, caso ocorra
um entupimento desse filtro, o que significa ter-se h = O, isto r~sulta teoricamente
na impossibilidade de se atingir uma condio de estado estacionrio, conforme se
pode verificar atravs da eq. (12.28), pois tem-se A= O e X= oo. No entanto, se houver uma purga, mesmo que se tenha h = O, ter-se- A ~ O e, portanto, torna-se possvel atingir a condio de estado estacionrio.
Para finalizar o presente item, convm esclarecer que, no caso de se executar
o reciclo de clulas atravs da sedimentao de clulas no reator, conforme indicado na Figura 12.7, as equaes de balano material para este tipo de situao so
as mesmas desenvolvidas, considerando-se a filtrao interna das clulas, sendo
que neste caso, entretanto, o volume V refere-se ao volume da "zona de reao"
ou "zona de crescimento" apenas.
12.3 .3 .2 - Sistema com reciclo externo

A Figura 12.8 representa esquematicamente um sistema contnuo com reeielo externo de clulas, definindo-se os seguintes parmetros adicionais:
F 5 = vazo de sada do lquido efluente (L/h)
a = frao da vazo do lquido efluente que reciclada
g = fator relativo ao incremento da concentrao celular obtido no "separador" (centrfuga, sedimentador ou filtro de membranas), sendo g>l.
Os parmetros c e h possuem significado anlogo ao visto anteriormente
para o sistema com reciclo interno de clulas.

238

Fermentao contnua

zona de
sedimentaao
zona de
reao

50

X,S

Figura 12.7 - Sistema contnuo com sedimentao interna de clulas.

(1-c) F
hX,S

cF
gX,S

gX,S

Figura 12.8 - Sistema contnuo em um nico estgio com reciclo externo de clulas.

Tem-se, pois:

F5 =F +aF5

(12.31)

F
Fs=-(1-a)

(12.32)

Portanto:

Assim, efetuando-se um balano material para as clulas, considerando-se o


reator como volume de controle, obtm-se:
dX

V -=V~J.X+aF 5

dt

.
gX-F5 X

(12.33)

Assim., dividindo-se ambos os membros da equao acima por V, e ainda


utilizando-se a eq. 12.32, obtm-se aps alguns rearranjos:

Formas de operao no sistema contnuo

Seja:

23 9

~~ ={~-[~11~a;)J}x

(12.34)

l-ag
B=-l-a

(12.35)

Assim, pode-se escrever que:


dX

dt=(~-BD)X

(12.36)

Deve-se, pois, observar que a equao (12.36) acima, formalmente idntica


equao (12.25), desenvolvida anteriormente para o sistema com reciclo interno
de clulas e, conseqentemente, sero obtidas para o sistema com reciclo externo,
concluses anlogas quelas discutidas anteriormente. Assim, em estado estacionrio tem-se:
~=BD

(12.37)

X= Yx;s (S -5)
B

(12.38)

S=

K 5 BD
~max -BD

Px =BDX

(12.39)

(12.40)

O valor de D crtico nesse sistema ser, portanto:


D
c

= ~max
B

(12.41)

Verifica-se, pois, que as eqs. (12.37) a (12.41) so anlogas quelas previamente desenvolvidas para o sistema contnuo com reciclo interno de clulas, sendo que formalmente tem-se a varivel B em vez de A . Conseqentemente, o
comportamento de X, S e Px ein estado estacionrio, em funo da vazo especfica de alimentao, ser o mesmo visto anteriormente no item 12.3.3.1.
En.tretanto, deve-se salientar que como (1- ag) < (1- a), significa que B < 1,
ou seja, significa que necessariamente se deve ter o produto ag < 1, pois ag = !indicaria uma situao hipottica,na qual todas as clulas estariam sendo recicladas
ao reator, no sendo possvel atingir-se a condio de estado estacionrio.

240

Fermentao contnua

Convm esclarecer ainda que, no sistema esquematizado na Figura 12.8,


considerou-se a existncia de uma purga aps o processo de separao de clulas.
Todavia, poder-se-ia imaginar a alocao dessa purga diretamente no reator, da
mesma forma como foi efetuado para o sistema com reciclo interno de clulas,
sendo que obviamente se teria uma alterao nas equaes de balano material desenvolvidas.
De fato, em alguns textos encontra-se a mencionada situao, sendo que alguns autores optam ainda por fazer os balanos materiais considerando-se conjuntamente o reator mais o separador como volume de controle. Tais estilos
diferentes de abordagem conduzem, no entanto, s mesmas concluses indicadas
no presente texto, com relao ao desempenho do processo de fermentao contnua com reciclo externo de clulas.

12.3.4 -:---- Sistema contnuo em mltiplos estgios


Quando se imagina a operao do sistema contnuo em mltiplos estgios,
isto , com n-reatores acoplados em srie, conhecido tambm como sistema em
"cascata", diversas so as opes de conduo do processo, podendo-se ter:
sistema com uma nica alimentao
("single-stream multi-stage")
sistema com mltiplas alimentaes
("multi-stream multi-stage")
sistema com reciclo de clulas, com uma ou com mltiplas alimentaes
Essas diferentes possibilidades esto esquematizadas nas Figuras 12.9 e 12.10,
onde se observa que no caso do sistema com uma nica alimentao tem-se a alimentao de meio esterilizado apenas no primeiro estgio, enquanto que nos
demais reatores a alimentao o lquido efluente do reator imediatamente anterior
a este. J no caso do sistema com mltiplas alimentaes tem-se, num ~ado reator
intermedirio, duas alimentaes, sendo uma o meio de cultura esterilizado e a segunda o efluente do fermentador anterior.

Figura 12.9 - Sistema contnuo em mltiplos estgios, com uma nica alimentao e com reciclo.

Formas de operao no sistema continuo

24 I

Figura 12.1 O - Sistema contnuo em mltiplos estgios, com mltiplas alimentaes e com reciclo.

No caso do sistema com reciclo de clulas, embora nas Figuras 12.9 e 12.10 esteja representado esquematicamente o reciclo do ltimo para o primeiro estgio, pode-se ter na realidade inmeras outras possibilidades, imaginando-se por exemplo
a existncia de reciclos intermedirios entre os estgios, caso esta'-eot}figurao seja
interessante em termos de permitir urna melhoria no desempenho do processo.
Tais sofisticaes, entretanto, em nvel do arranjo dos reatores, nern .sernpre
so de fcil implantao e execuo em nvel industrial, podendo acarretar custos
adicionais considerveis. Por essa razo, a utilizao do sistema contnuo em mltiplos estgios encontra ainda aplicao restrita, apresentando, no entanto, urna
grande potencialidade, em vista da grande versatilidade do sistema e das vanta-
gens que pode apresentar no que se refere ao desempenho do processo.
De um modo geral, os sistemas em mltiplos estgios proporcionam diferentes ambientes para o desenvolvimento das clulas, ao se mudar de um estgio
para outro, aproximando-se assim de um: reator de fluxo pistonado ("plug-flow")
e, permitindo, portanto, que se empreguem condies otirnizadas distintas nos v-,
rios reatores. Assim, por'exemplo, no caso da produo de um determinado metablito, cuja cintica de formao seja no-associada ao crescimento, pode-se
imaginar a utili.:Zao de dois reatores em srie, sendo que no primeiro se poderia
otimizar as . condies de cultivo de forma a se maximizar o crescimento celular,
enquanto que no segundo se poderiam empregar condies que levassem a urna
rnaxirnizao da produo do produto de interesse.
Um outro exemplo de aplicao do sistema contnuo em mltiplos estgios,
freqentemente mencionado na literatura, a sua utilizao para processos com
inibio pelo produto, corno o caso da produo de etanol. Nesses casos, tem-se
normalmente elevadas velocidades de converso nos estgios iniciais, pois as concentraes do produto so ainda relativamente baixas, ao passo que nos estgios
finais tm-se baixas velocidades, sendo denominados de estgios de "polimento",
nos quais se verifica o consumo do residual da fonte de carbono e se atingem, portanto, elevadas concentraes do produto inibitrio.
Convm esclarecer que. o equacionarnento para um sistema de mltiplos estgios deve seguir a mesma estratgia utilizada nos itens anteriores, sendo que,
para os reatores intermedirios da srie, se dever considerar; no balano material
para as clulas, um termo relativo entrada de clulas, provenientes do efluente
do reator anterior a este.

242

Fennentao contnua

12.4 - Formao de produtos no sistema contnuo


Neste item ser abordada a formao de produtos no sistema contnuo sem
reciclo de clulas, considerando-se a classificao de GADEN} 5 com equacionamento correlacionando as velocidades especficas de crescimento (J.l) e de produo (J.lp), conforme proposto originalmente por LUEDEKING e PIRET} 6 como
especificamos a seguir:
Produo associada ao crescimento:
J.lp =UJ.l

(12.42)

Produo no-associada ao crescimento:


(12.43)

Produo parcialmente associada:


J.lp =UJ.l +~

(12.44)

onde a e p sero considerados constantes.


Considerando-se a eq. (12.9) de balano material para o produto, desenvolvida no item 12.3.1: fazendo-se Po =O, obtm-se a seguinte expresso para a concentrao do produto P em estado estacionrio (dP I dt = 0):
P=J.lpX
D

(12.45)

Por outro lado, a produtividade deste produto ser dada por:


(DP) =J.lpX

(12.46)

e lemSubstituindo-se, pois, as eqs. (12.42) a (12.44) nas eqs. (12.45) e (12.46),


brando que J.l = D, obtm-se as seguintes expresses para a concentrao do pro~
duto (P) e a sua produtividade (DP), em estado estacionrio, em funo ~e D:
Produo associada:
P=aX

(12.47)

(DP) = u(DX) = aPx

(12.48)

Produo no-associada:
(12.49)

Formao de produtos no sistema continuo

(DP) = J3X

243

(12.50)

Produo parcialmente associada:


(12.51)

(DP) =X (a.D + J3)

(12.52)

As Figuras 12.11 a 12.13 indicam as curvas de P e (DP) obtidas por simulao das eqs. (12.47) a (12.52).
Dessa maneira, conforme se pode observar a partir da Figura 12.11, bem
como atravs das eqs. (12.47) e (12.48), no caso de produo associada ao crescimento, o comportamento matemtico de P e (DP) anlogo ao observado para X e
Px, respectivamente, obviamente multiplicados por um fator a, aqui considerado
constante. Portanto, interessa nesse caso a operao do sistema contnuo em valores relativamente elevados de D, situao na qual se podero obter, ao mesmo
tempo, elevada concentrao do produto, bem como elevada produtividade deste.
No caso de produo no-associada ao crescimento, conforme indicado pelas eqs. (12.49) e (12.50), bem como pela Figura 12.12, observa-se que a concentrao do produto P varia inversamente com D, ao passo que a produtividade (DP)
proporcional a X, ou seja, permanece praticamente constante para uma ampla
faixa de variao de D, decaindo bruscamente prximo a f.lmax' isto , prximo
lavagem. Conclui-se, portanto, que neste caso interessante trabalhar-se com valores relativamente baixos de D, no sentido de se conciliar altos valores de P e
(DP).
Por ltim, no caso de produo parcialmente associada ao crescimento, pode-se verificar atravs das eqs. (12.51) e (12.52), bem como atravs da Figura 12.13,
que P varia inversamente com D, enquanto que a produtividade (DP) constituda pela soma de dois termos, sendo um deles a produtividade em clulas multiplicada por a., e o outro o termo J3X; o qual aproximadamente constante para uma
ampla faixa de valores de D, desde que J3 seja constante. Dessa forma, conforme se
verifica na Figura 12.13, a regio de operao mais favorvel situa-se na faixa de
valores intermedirios de D.
O tratamento apresentado no presente item indica, portanto, que dependendo do tipo de cintica de formao do produto, haver determinadas faixas
mais adequadas de operao do sistema contnuo, de forma a se buscar a obteno de elevadas concentraes e produtividades do produto de interesse. Deve-se destacar ainda, que as curvas apresentadas nas Figuras 12.11 a 12.13 so
vlidas, desde que a cintica de Monod seja adequada para representar o processo, uma vez que esta hiptese foi considerada no desenvolvimento do presente captulo.

244

Fermentao contnua

X,P(g/L)

Px,(DP)(g/L.h)

10.-------------------------------~

ar-------------------------

X
3

Figura 12.11 - Produo associada ao crescimento (simulao das equaes 12.47 e 12.48,com Jlmax = 0,5h-I;

Ks = 0,1 g!L; Yx;s = 0,5; So = IOg/L; a= 1,6g/g)


X,P(g/L)

Px,(DP)(g/L.h)

3,0

80
(DP)

2,5

60

2,0
1,5

40

1,0
20
0,5
0,2

0,3

0,4

0,5

0(1/h)

Figura 12.12 - Produo no-associada ao crescimento (simulao das equaes 12.49 e 12.50, com Jlmax =

0,5h- 1; Ks = O, I g!L; YXJS = 0,5; So = IOg!L; 13 = 0,5 g/g.h).


X, P(g/L)

70

Px,(DP)(g/L.h)

Figura 12.13 - Produo parcialmente associada ao crJscimento (simulao das equaes 12.SI e 12.52)
(Jlmax = 0,5h - I; Ks = O, I g/L; YXiS = 0,5; 50 = IOg!L; a = I ,83 g/g; 13 = 0,155 g/g.h).

Referncias bibliogrficas

245

Claro est, portanto, que caso outro modelo cintico seja mais adequado para
a descrio do processo, tais como as propostas de Teissier, Contais, Andrews e outros,17 este dever ser introduzido no conjunto de equaes, no lugar da equao de
Monod, (eq. 12.12), de maneira que assim se possam obter os novos perfis de concentrao celular, concentrao de substrato e produto, e de produtividades, em
funo da vazo especfica de alimentao, de forma a se definir as faixas ideais de
operao do sistema contnuo para cada caso especfico.

Referncias bibliogrficas
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(3) GOLDBERG, I.; ER- EL,Z. The chemostat- an efficient technique for medium optimization. Proc.Biochem., v. 16, p.2-8, 1981.
(4) KUHN, H.; FRIEDRICH, U.; FIECHTER, A. Defined minimal medium for a thermophilic Bacillus sp. developed by a chemostat pulse and shift technique. Eur.J.Appl.Microbiol.Biotech., v. 6, p.341-9, 1979.
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Escherichia coli X90. Biotechnol.Bioeng., v. 41,p.221-30, 1993.
(7) FINGUERUT, J. Estado da arte da fermentao alcolica nas usinas cooperadas. Revista Politcnica, n.209, p. 42-5, 1993.
(8) LETTINGA, G. et.al. Use of the upflow sludge blanket (UASB) reactor concept for biological wastewater treatment, specially for anaerobic treatment. Biotechnol.Bioeng., v.22,
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(9) CRAVEIRO, A.M; SOARES, H.M.; SCHMIDELL, W. Technical aspects and costs estimations for anaerobic systems treating vinasse and brewery I soft drink wastewater.
Wat.Sci.Technol.,v. 18, n.12, p.123-34, 1986.
(10) SCHMIDELL, W. Introduo aos Reatores Biolgicos. In: 11 Curso de Tratamento
Biolgico de Resduos, Instituto de Pesquisas Tecnolgicas do Estado de So Paulo, 1993.
(11) MONOD, J. Recherches sur la Croissance des Cultures Bacteriennes. Paris, Hermann & Cie., 1942.
(12) PIRT, S.J. Principies of Microbe and Cell Cultivation. Nova York, John Wiley &
Sons, 1975.
(13) MOSER, A. Continuous Cultivation. In: REHM, H.J.; REED, G. Biotechnology: a
Comprehensive Treatise in Eight Volumes, l.ed., Wien, Springer Verlag, VCH, v. 2, cap.15,
p.285-309, 1985.
(14) FACCIOTTI, M.C.R.; SCHMIDELL, W. The new concept of minimum cell viability
and its consequences on bioprocess design and operation. Brazilian Journal of Chemical
Engineering, v. 12, n.1, p.22-31, 1995.
(15) GADEN, E.L., Jr. Fermentation kinetics and productivity. Chem.Ind., v.7, p.154,
1955.

i
I

246

Fermentao continua

(16) LUEDEKING, R.; PIRET, E.L. A kinetic study of the lactic acid fermentation . Batch
process at controlled pH. J.Biochem.Microbiol.Technol.Eng., v. 1, p.393, 1959.
(17) MOSER, A. Kinetics of Batch Fermentations. In: REHM, H .J.; REED, G. Biotechnology: a Comprehensive Treatise in Eight Volumes, l.ed., Viena, Springer Verlag, VCH, v. 2,
cap.14, p.243-283, 1985.

247

- - - - - - - - - - - - ----- -- - - - - - - - - - - -

---- ------ --.


:f---=A~
-~-8 ====-

--_-==EERME----m:----

.....

-~-_,.__..-e:;_-=~EM~-STADO=SUDO===~
------- - --

---------------------------------Vanildo Luiz De I Bianchi .


Iracema de Oliveira Moraes
Deise Maria Fontana Capalbo

13.1 - Introduo
Quem nunca viu uma laranja coberta por uma camada verde ou negra de
mofos? Um po embolorado? Ou mesmo um sapato mofado aps ter sido deixado
em um lugar mido? Pois bem, esses exemplos citados, que acontecem com freqncia na natureza, ocorrem principalmente devido a determinadas condies
ambientais e alimentao propcias ao crescimento desses microrganismos.
Porm, esse desenvolvimento microbiano indesejvel pode ser, se houver
um controle do processo, uma ferramenta potencialmente interessante na obteno de diversos produtos, tais como enzimas, biomassa microbiana, inculos, alm
de alimentos, medicamentos, pigmentos, etc.
.
Essa forma de processo denominada "fermentao em estado slido", "fermentao em substrato slido", "fermentao em meio semi-slido" ou simplesmente "fermentao semi-slida". Como forma abreviada, pode ser utilizada tambm a sigla FSS (embora, menos freqentemente, alguns pesquisadores prefiram
usar as siglas FMS e FES).
Esse processo, comumente empregado em pases do Oriente e do continente
africano visando a elaborao de alimentos, vem ganhando adeptos em sua utilizao, ano aps ano, entre pesquisadores da Europa e do continente americano,
devido a peculiaridades que sero enfocadas nas pginas seguintes.
Tomando por base a definio utilizada por DURANT et al. 1 , na qual tambm se enquadram algumas outras extradas da literatura/'3' 4 ' 5 mas ressalvando
que o substrato no tem de ser necessariamente insolvel em gua e, desta forma
ser slido, pois ocorrem exemplos em que o substrato lquido (soluo de sacarose e de sais nutrientes ou melao) est umedecendo uma matriz slida inerte (sabugo de milho ou bagao de cana), 6' 7' 8 a fermentao em estado slido pode ser
definida como "processos que referem-se a cultura de microrganismos sobre ou
dentro de partculas em matriz slida (substrato ou material inerte), onde o con-

248

Fermentao em estado slido

tedo de lquido (substrato ou meio umidificante) ligado a ela est a um nvel de


atividade de gua que, por um lado, assegure o crescimento e metabolismo das
clulas e, por outro, no exceda mxima capacidade de ligao da gua com a
matriz slida".
Por essa definio, eliminam-se tambm algumas confuses criadas por determinados autores/ que colocam erroneamente os sistemas de filtro biolgico aerbio utilizados em processos de tratamento de guas residurias e o sistema de
fermentao actica para obteno de vinagre, onde, em ambos os casos, h a percolao de nutrientes lquidos atravs de uma matriz slida inerte e insolvel, na
qual esto imobilizados os microrganismos, como processos de fermentao em
estado slido.
O termo fermentao em superfcie, s vezes utilizado para referir-se cultura em substrato slido, deve ser evitado, pois esta denominao diz respeito ao
processo em que h o crescimento microbiano sobre a superfcie lquida esttica
de um substrato, tal como a antiga forma de produo de vinagre em barris.
Outro erro que no deve ser cometido confundir esse processo com a cultura em meio slido ou semi-slido utilizando agar, usualmente empregada em
microbiologia para a seleo e manuteno de microrganismos.
Nesse captulo sero descritos, de maneira sucinta, tpicos de interesse
compreenso desse processo, mais especificamente tipos de microrganismos, caractersticas dos substratos, formas de reatores e principais controles comumente
utilizados, as vantagens e desvantagens inerentes ao sistema em relao ao processo submerso, alm de exemplificar alguns casos relatados por pesquisadores
em diversos artigos cientficos.
Porm, dentre todos os assuntos analisados, o estudo sobre produo de cogumelos comestveis, pela quantidade de material bibliogrfico existente, mesmo
empregando os meios em estado slido para o crescimento e produo enzimtica,
no ser examinado neste captulo, pois merece uma ateno parte.
No item "Referncias bibliogrficas" ser apresentado um vasto oomero de
ttulos de artigos cientficos utilizados neste captulo, visando facilitar a procura
de material bibliogrfico para aqueles que quiserem iniciar uma pesquisa envolvendo esse processo.

13.2 - Histrico do processo da FSS


Pelos primeiros exemplos citados neste captulo, pode-se concluir que a
ocorrncia da fermentao em estado slido , com certeza, mais antiga que o prprio homem, sendo, portanto, muito difcil precisar o incio desta prtica pela atividade humana. Sabe-se, contudo, que vrias formas de alimentos utilizando esse
processo microbiano fazem parte da dieta de diversos povos h muitos sculos.
So citados exemplos de alimentos que necessitavam, de alguma forma, da
fermentao em estado slido h milnios. Como, por exemplo, na China, a produo de molho de soja em 1.000 a.C. e a de "chiang" (similar ao "miso") entre
2.500 e 500 a.C./' 10 os quais so obtidos a partir da modificao enzimtica do
meio utilizando-se o "koji". O "koji" consiste numa massa umidificada de um

Histrico do processo da FSS

249

cereal cozido (na maior parte dos casos, arroz) na qual houve o crescimento de

Aspergillus oryzae e a conseqente produo de um complexo enzimtico com atividade diasttica. 10' 11
Uma das primeiras referncias que se tem sobre o processo em meio slido
no Ocidente, alm de uma citao da obteno de queijo roquefort em 100 d.C./
est associada, no incio deste sculo, nos Estados Unidos, ao nome do pesquisador Takamine na produo de "mold bran", similar ao "Koji", que consiste basicamente no emprego do farelo de trigo no lugar do arroz e de outros fungos para a
obteno do complexo enzimtico. Esse estudo visava substituir o malte na indstria de destilados. 2' 5' 10
Segundo HESSELTINE/ 0 UNDERKOFLER et al. 12' 13 continuou este trabalho de
1937 a 49, no objetivo de produzir lcool etlico a partir de milho. Utilizaram-se
para esse processo fermentadores do tipo tambores rotativos, tambores estticos
ou simples bandejas, sendo estudadas as vantagens e desvantagens de cada um
destes reatores.
Assim, at a metade deste sculo, e sempre se referindo a esta parte do planeta, dominaram, para o caso de fermentao em estado slido, as pesquisas em
torno da produo de enzimas microbianas.
Porm, principalmente para agilizar a produo de penicilina, durante o perodo da Segunda Guerra Mundial, houve a opo de desenvolver os processos
que envolviam a fermentao lquida em tanques profundos, negligenciando os
processos em estado slido. 10' 11
Dessa forma, as pesquisas voltaram-se quase que exclusivamente para o
projeto de desenvolvimento de fermentadores para os processos em fase lquida,
com muito poucos estudos empregando a fermentao em substrato slido.
Apenas para exemplificar, h citaes de experinciaspara produo de cido ctrico em fermentao em estado slido at 1936, retornando novamente o in
teresse nesses e;tudos somente em 1975. 14
No Japo, contudo, o processo tradicional, que era realizado em bandejas de
madeira ou bambu, onde os cereais, tais como arroz e trigo ou trigo e soja eram
inoculados e fermentados com o "koji", foi sendo aperfeioado. Projetaram-se incubadoras automatizadas com inoculao, controle das condies ambientais, agitao controlada do meio e recuperao do produto final, utilizando-se tambm
linhagens mutantes melhoradas. 10 Esses fatos conduziram o Japo obteno de
uma tecnologia cada vez mais avanada, em termos de produo por fermentao
em estado slido.
Nos pases do Ocidente, nos dias de hoje, diversos estudos esto sendo realizados utilizando-se substrato slido, tanto na obteno de bioprodutos como no
desenvolvimento de reatores ou conhecimento do metabolismo e condies do
processo. Porm, em nveis industriais, o processo submerso continua sendo o
principal sistema de gerao deprodutos obtidos via fermentao, sendo insignificante o nmero de empresas que empregam a fermentao em estado slido para
estes fins.

250

Fennentao em estado slido

13.3 - Microrganismos comumente utilizados


P ANDEY 15 indica que os processos por fermentao em esta <;lo slido podem
utilizar tanto microrganismos em seu estado natural, como por exemplo nos casos
de ensilagem ou compostagem, 16 como na forma de culturas puras individuais, em
que se enquadram a maior parte das pesquisas nesta rea, ou, mais raramente, na
forma de culturas mistas. 17
Devido aos baixos nveis de gua no sistema, os fungos filamentosos tm recebido a maioria das atenes nas pesquisas, pois apresentam melhor capacidade
de crescimento nestas condies. 2 Assim, um vasto campo de estudos tem se vislumbrado utilizando estes microrganismos.
Como exemplos, podem ser citados, dentre muitos outros, o uso de culturas
de Rhizopus, Trichoderma, Penicillium ou Aspergillus para obteno de enriquecimento protico e produo de enzimas, Mucor ou Rhizopus na produo de renina
microbiana, Penicillium para a fsroduo de penicilina e Fusarium ou Giberella para
a obteno de cido giberlico. 5
Porm, outros microrganismos tm obtido espao nesse tipo de sistema,
como a produo de esporos de Bacillus thuringiensis 1 para a produo de bioinseticidas, de o.-amilase por linhagens de Bacillus} 9 e de lcool por Zymomonas mobilis
2'6.21
ou por 1eve d uras tra d tcwnats.
Ou seja, como todo o processo fermentativo, a escolha do microrganismo
adequado uma pea .chave no sucesso da produo desejada. Por exemplo, a
o.-amilase pode ser produzida por, no mnimo, 28 tipos diferentes de culturas microbianas. J a cultura de Aspergillus niger tem a capacidade de produzir nada menos do que 19 tipos diferentes de enzimas, dependendo da induo e/ou do
substrato utilizado.15
Neste sentido,a fermentao em estado slido tem se mostrado apta a realizar vrios tipos de transformaes, seja ela por fungos, leveduras ou bactrias, e o
que ir determinar a escolha da linhagem mais apropriada, durante a fase de seleo de microrganismos, ser o estudo detalhado do processo, visando obter o melhor meio de cultura e as melhores condies ambientais da fermentao,
principalmente no que se refere temperatura e umidade do sistema.
o

13.4 - Substratos: caractersticas e composio


Ao iniciar este item; antes de tudo necessrio comentar que o termo fermentao em estado slido remete idia de dois tipos de materiais insolveis em
gua, sobre os quais os microrganismos iro crescer: quando o suporte slido atua
ele prprio como fonte de nutrientes e no caso em que os nutrientes so solveis
em gua e os microrganismos esto aderidos a uma matriz slida, inerte ou no,
que ir absorver o meio de cultura lquido. A maioria dos processos revistos em literatura utilizam o principio em que o suporte slido atua tambm coino fonte de
nutrientes.
Em relao ao segundo caso existem, dentre outras, as citaes da produo
de esporos de Aspergillus niger em sabugo de milho umedecido com soluo de sacarose para a formao de tculo na produo de cido ctrico/ do emprego de

Substratos: caracteristicas e composio

25 I

uma soluo de glicose e de nutrientes umedecendo bagao de cana para a produo de cido ltico, 22 de partculas de polpa de madeira fornecendo umidade e
permitindo melhor ventilao em meio de arroz ou farelo de trigo para produo
de enzimas 23 e a obteno de lcool etlico em bagao de cana umedecido com melaoY
possvel notar, pelos exemplos citados, que o substrato pode estar tanto na
forma natural como na fdrma sinttica, dependendo do processo que se deseja realizar, da facilidade de se obter determinadas matrias-primas ou dos resultados
que se deseja conseguir. Bagao de cana pode ser abundante em determinadas regies, assim como o sabugo de milho ou a palha de arroz pode ser em outras.
J para estudos de cintica das fermentaes, cita-se o exemplo da utilizao
de partculas de argila 24 ' 25 como matriz slida inerte insolvel, que no exercem influncia sobre o consumo de substrato e facilitam a separao entre a massa microbiana e o meio de cultura.
Porm, de forma geral, os materiais utilizados so provenientes de matrias-primas, produtos e/ ou resduos agroindustriais, sendo que, logicamente, dependendo do produto que se deseja obter, estes ltimos tm tido a preferncia nas
pesquisas, devido ao baixo ou nenhum valor comercial.
Pode-se tambm incorporar soluo nutriente ao substrato slido, visando
adequ-lo melhor s condies nutricionais do microrganismo para a fermentao
desejada. Como o estudo realizado para a produo de a-galactosidase por Aspergillus niger/6 no qual ao meio composto de farelo de trigo foram adicionados uria
(como fonte de nitrognio), gua de macerao de milho (como fonte de fatores de
crescimento), farinha de soja ou farinha guar (como indutores da enzima) e cido
ctrico (que favorece a produo da enzima desejada). Ou, no caso de enriquecimento protico, quando se introduz fontes de nitrognio tais como amnia, uria,
triptona e casena 27 ou s~lues sintticas como sulfato de amnia.
O substrato (ou a matriz slida) deve ter algumas caractersticas que possibilitem o maior rendimento do processo. A principal peculiaridade o alto grau
de acessibilidade do microrganismo a todo o meio e, para tanto, de suas caractersticas mais importantes destacam-se a porosidade, o tamanho e o formato das
partculas.
Em relao ao tamanho da partcula, um problema se apresenta: se, por um
lado, quanto menor o tamanho maior a rea superficial e, conseqentemente, maior
o grau de transformao, por outro lado o processo necessita ter uma granulome~
tria prpria visando permitir a circulao do ar por entre a massa e a dissipao
de gases e calor produzidos, os quais poderiam vir a prejudicar o rendimento do
processo. Esse item importante para a definio da altura do substrato e da granulometria do meio que deve ser empregada no processo.
Por exemplo, segundo estudo de P ANDEY et al}8 partculas de farelo de trigo e farinha de milho (a uma proporo de 9:1) com dimetros entre 425-500 J..tm e
500-600 J..tm, respectivamente, resultaram em uma maior produo de amiloglicosidase, embora tenha sido notado que partculas de dimetro entre 180 J..tm e 1,4
mm tenham apresentado rendimentos similares.

252

Fermentao em estado slido

ECHEVARRIA et al. 29 obtiveram o melhor rendimento de enriquecimento protico de Aspergillus niger utilizando partculas de cana-de-acar com 1,4 mm. J
BUDIATMAN; LONSANE30 utilizaram resduo fibroso do processamento de mandioca com dimetro entre 3,0 e 5,0 mm para a produo de pectinase.
A Figura 13.1 apresenta a velocidade de fermentao, avaliada pela porcentagem de co2 produzida no decorrer do processo, em funo do tamanho das partculas do meio slido. Pode-se observar que, conforme diminui o tamanho das
partculas, aumenta a quantidade de gs carbnico produzido, assim como diminui o tempo em que o processo atinge o mximo de produo de C02
10

~
N

o()

00

o o.-,-a---<> 2,0mm

8,0mm

12,0mm

4
2

o
o

10

15

20
25
30
35
40
Tempo de fermentaao (horas)

Figura 13.1 .- Influncia do ?manha das ~Jlrtculas na velocidade de fermentao de acar de beterraba por Zymomonas mobd1s para a produao de etanol.

Quanto porosidade, a principal qualidade desta caracterstica a capacidade de absoro de gua, que facilita o transporte de enzimas e metablitos por entre o meio e os microrganismos.
Embora alguns autores citem como aspecto importante a simplit:idade do
meio de cultura utilizado no processo, em boa parte dos estudos o substrato necessita de um pr-tratamento para se adequar s condies necessrias ao crescimento e produo de metablitos pelos microrganismos. Assim, para facilitar a
atuao dos microrganismos sobre o meio, podem ser empregados os processos
de:
esmagamento, quebra, moagem e peneiramento, visando adequar o meio
granulometria mais adequada do processo;
suplementao de nutrientes e correo de pH, para suprir a falta de
algum nutriente ou adequar s melhores condies de crescimento microbiano;
hidrlise cida ou alcalina de material celulsico, visando facilitar a atuao enzimtica;
embebio, para regular o teor de umidade inicial do processo;_
vaporizao ou aqueciment, visando a gelatinizao ou inchamento do
substrato; 6

Substratos: caractersticas e composio

253

adio de agente seqestrante; com o objetivo de retirar ons metlicos do


meio, que podem diminuir o rendimento do processo; 31
processo de esterilizao, que visa a diminuio ou eliminao de possveis contaminaes.
Nesse ltimo caso, porm, alm de ser uma etapa de consumo muito grande
de energia, a esterilizao pelo calor pode causar uma modificao nas caractersticas do substrato, tais coino textura ou qualidade nutricional, que refletem na formao de uma massa compacta ou granular, um ressecamento da massa e, s vezes, uma adeso da massa parede do fermentador. OSHIMA32 cita a modificao
da textura de diferentes meios aps a esterilizao.
Felizmente, alguns autores mostram que, a partir da adio de uma quantidade grande de inculo que visa evitar ou abrandar o problema de contaminaes, a no esterilizao do meio no afeta a produtividade, como por exemplo na
obteno de penicilina33 e de etanoi.34
Diversas matrias-primas e, dentre estas, principalmente diversos tipos de
resduos agroindustriais, podem ser empregadas na fermentao em estado slido. A escolha de cada meio, logicamente, ir depender do produto final que se deseja obter.
Pode-se exemplificar os seguintes materiais:
celulose, hemicelulose e lignina oriundas de biomassa vegetal e/ ou esterco de animais para a produo de compostos orgnicos;35' 36
farelo 37'38 e palha de trigo} farinha e farelo de soja/9 farinha, manipueira e
resduos slidos do processamento da mandioca} 0 palha e quirera de ar- d e enzimas;

roz, 4o'41 b agao d e cana42'43 e me 1ao para pro d uao


sorgo/ polpa de ,beterraba/0' 21 "grits" de milho/ 2 bagao de ma, bagao
de uva, quirera de arroz, melao e cana-de-acar8 para a produo de lcool;
resduos de banana, farinha, 44 manipueira e resduos slidos do processamento de mandioca, espiga de milho, ba?ao de laranja,45 cana-de-acar/9 bagao de cana, bagao de ma, 1 melao, vinhaa, farelo
e palha de trigo, 46 gro-de-bico, beterraba, polpa de caf,47 polpa de batata-doce/ arroz cozido, 40 folha de "maple" 36 para a obteno de enriquecimento protico;
bagao de cana, gua de macerao de milho, lactose, sacarose 33 e farelo
de trigo 48 para a produo de antibiticos;
gros de milho, 49 alfafa e aveia/0 gros de sorgo, soja, trigo, amendoim,
- d e pro d uao
- d e t oxmas;
.
m1'Ih o w e arroz1051
' para a ven'f'1caao
52
4
31
farelo de trigo/ beterraba, bagao de cana e melao ' para a produo
de cidos orgnicos;

soja ("hamanatto", "tempeh", "miso", "natto", "shoyu"), pasta de amendoim ("ontjom"), peixe ("katsuobushi") e mandioca ("gari", "kokonte",
"lafun") para a elaborao de alimentos e condimentos orientais 2' 11 ' 53 e
africanos;9

254

Fermentao em estado slido

sacarose, polpa de beterraba .e gros de argila/4' 25 farinha de mandioca e


soluo nutriente 54 para a determinao das cinticas do processo.
Um problema que pode surgir quando da atividade em larga escala para a
obteno de um bioproduto por FSS o descarte ou o aproveitamento do resduo
gerado.
Segundo ROUSSOS, 55 tem-se sugerido a utilizao do reSduo na gerao de
biogs, de rao animal, disposio em aterro sanitrio e de fabricao de chapas e
papis, sem, porm, haver urna pesquisa concreta da viabilidade de cada aplicao. Foi, ento, realizado um estudo de ensilagern com o resduo proveniente da
produo de celulase por Trichoderma harzianum em meio de bagao de cana, farelo de trigo e soluo nutriente. O resduo foi prensado e ajustado a urna umidade
entre 33 e 45%. Aps a adio de bactrias lcteas, solues cidas e melao de
cana, a massa foi colocada em sacos plsticos perfurados a 23-28C. Depois de 6
meses, verificou-se que o resduo mantinha as mesmas qualidades iniciais.

13.5 - Reatores para a fermentao semi-slida


Para iniciar a discusso sobre os tipos de reatores comumente empregados,
interessante analisar quais as formas de processo que so utilizadas para a realizao de urna fermentao em estado slido.
A forma empregada em praticamente todos os estudos revistos diz respeito
ao processo em batelada no qual, basicamente, o meio adicionado ao reator,
ocorrendo ento a inoculao do substrato e a incubao do mesmo por um determinado perodo de tempo.

A seguir, o produto obtido pode ser extrado por suspenso do meio com
gua, solues-tampo ou solventes (corno no caso de enzimas, cidos, lcool, ... )
ou ento, simplesmente, secado e armazenado (corno para a produo de bioinseticidas ou protena rnicrobiana).
Porm, outros processos so citados na literatura.

Efetuou-se urna fermentao sernicontnua para a produo de cido ctrico,


em que h, por cinco vezes consecutivas no mximo, a extrao do produto e areintroduo do meio de cultura matriz inerte e microrganismos para urna nova
fermentao, permanecendo assim a /matriz slida junto com a massa rnicrobiana
durante 20 a 25 dias dentro do reator ernpregado. 31
No caso da produo de cido giberlico/ 4 cita-se o processo em batelada
alimentada, no qual h a adio de pores iguais de sacarose ao meio no terceiro,
quarto e quinto dia de fermentao, visando diminuir o efeito inibidor ocasionado
por este substrato massa rnicrobiana.
Nos anos 40, h urna citao de produo em escala industrial de enzimas
fngicas, por Aspergillus oryzae, por processo contnuo. 56 O mtodo, baseado no
sistema de bandejas, consistia na esterilizao, resfriamento, alimentao e inoculao do substrato por meios mecnicos, fermentao e secagem atravs da passagem das bandejas, colocadas em urna espcie de estantes rolantes; por tneis
aclirnatados, finalizando com moagem e empacotamento mecnicos.

Reatores para a fermentao semi-slida

255

Um outro item que deve tambm ser analisado refere-se escolha dos fermentadores e, neste caso, deve-se. levar em conta os objetivos da fermentao,57 a
anlise econmica dos custos iniciais e operacionais do processo,l,57 a manipulao simplificada do sistema (carga/recarga, limpeza, manuteno)! e a possibilidade de monitoramento e controle de diversos parmetros, se houver necessidade.l,57

Para a ampliao de escala do reator, deve-se verificar, primeiriun,ente, em


escala de laboratrio, se os objetivos foram alcanados,57 e observar parmetros
que, em pequena escala, no so compatveis com a escala industrial (como os
efeitos da espessura da camada, da compactao do substrato, da taxa de aerao
e da dissipao de calor).l
Dos diferentes tipos de reatores encontrados na literatura, segue~se como
exemplos de alguns dos mais comumente empregados:
Reatores de vidro: logicamente, por ser um processo ainda no muito difundido, quando se fala em fermentao em estado slido deve-se pensar
antes de tudo em pesquisas que so realizadas, em nvel de laboratrio,
atravs deste mtodo.
Assim, os primeiros reatores que devem ser citados so os de vidro, comumente utilizados em laboratrio. Erlenmeyers so os primeiros a serem lembrados, devido facilidade de manuseio durante as pesquisas.
Frascos de Fembach58 tambm so bastante utilizados, inclusive em nvel industrial, para a produo de esporos, devido ampla rea superficial entre o substrato e a atmosfera que o mesmo fornece para o desenvolvimento dos microrganismos.
Garrafa~ de cultura tambm so muito empregadas pelos mesmos fatos expostos acima. Esses "reatores", embora excelentes para o incio de uma pesquisa,
deixam a desejar quand~ se pensa em uma ampliao de escala do processo.
Dessa forma, diversos tipos de reatores tm sido propostos para amenizar os
problemas de aerao, troca de calor, umidade, entre outros.

Figura 13.2 - Reato res de vid ro: pe la o rdem, frasco de Fe mbach de 2500 ml, garrafa de cultu ra, tubular vertical,
erle nmeyer de 250 ml, e rle nmeyer de 2800 ml.

256

Fermentao em estado slido

Bandejas: as primeiras a surgirem foram as bandejas rasas. Construdas em


estrutura de madeira,59 bambu/ alumnio 59 ou outros materiais,6 de diversos tamanhos (mas, com a altura do meio variando basicamente entre 2 a 7
cm2' 9), elas podem possuir seu fundo intacto, o que significaria uma atuao
muito parecida .com a dos erlenmeyers, porm com uma rea superficial de
troca e uma capacidade de alocar meio de cultura muito maior. Podem
tambm ter seu fundo substitudo por uma tela perfurada, o que lhes confere uma maior eficincia na circulao de ar por todo o meio, e no somente na parte superior exposta ao ambiente.
Para a disposio das bandejas, deve-se ter um local apropriado para o desenvolvimento da fermentao. Podem ser utilizadas simplesmente salas comestantes, fazendo-se uso de ar natural ou aerao forada (passando antes por umidificadores), desde que haja o controle de temperatura e umidade. As bandejas,
perfuradas, por outro lado, podem ser tambm dispostas em estufas que possuam
uma adaptao para a entrada de aerao forada pelo fundo do equipamento.
CANNEL; MOO-YOUNG 2 citam o exemplo de utilizao de grandes bandejas
(1,4 a 4,5m 2 ) com fundo de tela, para a produo de "koji" em processo mecanizado, que so colocadas em cmaras de incubao tendo a temperatura ajustada pela
passagem de ar por entre o substrato.
Nesses casos, o substrato aspergido por uma soluo de inculo. Instalaes desse tipo requerem um elevado nmero de trabalhadores, alm de o nmero
de bandejas manipuladas diariamente ser igualmente elevado.

Figura 13.3 - Reatores tipo bandeja: pela ordem, com meio de cultura e vazio com fundo perfurado.

Tanques circulares: pode ser visto, na Figura 13.4, o exemplo de um equipamento em cultura esttica, em nvel industrial. TOYAMA60 indica um
equipamento, denominado produtor de "koji" automtico estacionrio,
que consiste de dois tanques rotatrios de 7 ril . de dimetro, dotados de
um agitador helicoidal, dentro de uma cmara de condies controladas.
Podem ser processados, a cada batelada, cerca de 2 a 3 toneladas de meio
de cultura, com alimentao, esterilizao, inoculao e retirada do produto realizados automaticamente.

Reatores para a fermentao semi-slida

Figura 13.4 - Tanques circulares

257

Esteira rolante: este sistema uma variante do frmentador de bandejas.


As etapas de inoculao e incubao do material esterilizado so realizadas em longas esteiras de fundo perfurado por onde circula ar mido. De
acordo com as necessidades de cada produto, pode ser realizada tambm
uma agitao ocasional. 5

I I

r- r-

Figura 13.5 - Esteira rolante

Tubular horizontal: neste processo, tambm denominado tambor rotativo,


o substrato este'r ilizado e resfriado diretamente no tambor. A rotao do
reator p()de ser ocasionada tanto por um eixo central como pela movimentao de roletes sobre os quais o fermentador esteja montado. A rotao
pode variar de 1 at 180 rpm.
Carga

[T

gua

[T,['I~~~L
5

Figura 13.6 - Reator tubular horizontal com agitao interna

A agitao do substrato pode ser realizada pela simples rotao do reator ou


por agitador central contendo nmero varivel de ps; neste segundo caso, o processo denominado por fermentador tubular com agitao interna.

258

Fermentao. em estado. slido.

A aerao da massa realizada pela passagem de ar esterilizado e umidificado atravs do reator, objetivando tambm o controle da temperatura interna.
Esse equipamento apresenta como dificuldades a serem sup'l antadas o custo
relativamente elevado para o volume de material produzido, a manuteno da integridade do miclio devido agitao do sistema, alm das dificuldades de ampliao de escala do processo. 5
Utilizou-se esse tipo de reator para a produo de ocratoxinas, 61 tendo 33 em
de dimetro, quatro chicanas internas e uma rotao a uma velocidade de 1 a 40
rpm. Estabeleceu-se que, para permitir a formao das hifas, a fase inicial deveria
ser realizada em processo esttico. TOYAMA60 citou, tambm, o exemplo de um
tambor rotativo automtico, em escala industrial, para a produo de "koji", em
que todas as etapas do processo so realizadas automaticamente.
Em nvel laboratorial, o tambor rotativo foi utilizado por NISHI062 (capacidade de dois litros) e SILMAN58 (capacidade para 150 g de meio) para a produo
de extrato enzimtico a partir de Aspergillus.
Tubular vertical: tambm denominado fermentador tipo coluna, tem
sido o reator utilizado em pesquisas quando se deseja obter o controle
do processo . Esses reatores podem ser construdos em vidro 63 ou ao
inox/ com dimenses de 2 a 40 em de dimetro por 20 a 180 em de altura1'44'62'63'64, permitindq uma capacidade entre 10 g e 8 kg 33'54 '63'64 a
cada batelada.

O controle da temperatura deve ser feito atravs da passagem de ar por entre o meio, embora alguns pesquisadores indiquem a existncia de jaquetas em
torno do reator. 63 Porm, devido baixa condutividade trmica do material slido
utilizado, somente a utilizao de jaquetas no suficiente para controlar a temperatura interna do reator.
Dentro dessa categoria, encontra-se o reator Zymotis, projetado pela
ORSTOM-Frana, que possui capacidade para receber 21 kg de meio.65
Esse tipo de reator apresenta, como vantagens, um espao reduzido, a
rapidez de carga e descarga e uma relao volume total/volume tilprximo
a 1. Como desvantagens, a compactao da massa, a dificuldade de dissipao
de calor e um grau de umidade da massa no uniforme ao longo do equipamento.5
Visando superar algumas das desvantagens apresentadas, se inclui tambm
o denominado reator de leito fluidizado ar-slido que, segundo pesquisadores,66
fornece um melhor controle de temperatura, de umidade e maior homogeneidade
do sistema.
Sacos plsticos: na verificao de produo de tempeh,S 9 de toxinas 49 e
pesticidas, 67 foram utilizados sacos de polietileno autoclavveis, com
dimenses de 20,0 x 38,0 cm 59 e 30 5 x 61,0 cm .49 Tambm utilizaram-se
tubos plsticos de 10,0 em de dimetro. 59 Cita-se que necessrio perfurar os sacos aps um certo perodo, para permitir a aerao do
meio .49,S9
.
.
1

Controles do processo

259

13.6 - Controles do processo


Como em todo processo fermentativo, o controle de determinados parmetros se faz necessrio para a obteno de produtos com caractersticas constantes e
uniformes.
Em relao aos conhecimentos de engenharia bioqumica, importantes
compreenso desse item, ~AMANA MURTHY et al. 68 apresentam uma resenha arespeito de transferncia de massa, transferncia de calor, cintica das reaes, medi. das experimentais de crescimento de biomassa e controle de temperatura e concentrao de gases, alm da influncia do substrato e do biorreator no processo
fermentativo .
O controle da umidade, da temperatura e do pH do meio, a velocidade e freqncia de agitao, as condies de transferncia de oxignio e de nutrientes, as
caractersticas do substrato, alm das caractersticas e estimativa de crescimento e
da automao do processo so os parmetros mais freqentemente analisados em
diversos estudos revistos.
Umidade: o teor de umidade do substrato um dos principais parmetros
que influencia o sucesso de uma fermentao em estado slido.
A natureza do substrato, as necessidades do microrganismo utilizado e o
tipo de produto final desejado so os principais fatores que determinam o grau de
umidade que o substrato dever ter no incio e ao longo da fermentao .4' 5
Um substrato apropriadamente umedecido deve ter um filme superficial de
gua visando facilitar a dissoluo e a transferncia de massa de nutrientes e de
oxignio. Porm, entre as partculas devem existir canais que permitam a difuso
de gases e a dissipao de calor. 16
Assim, se o nvel de umidade for elevado, implicar no d~crscimo de porosidade do substrato e ir resultar em uma menor difuso de oxignio no interior
do meio e conseqente decrscimo de trocas gasosas, alm de aumentar o risco de
contaminao, principalmente a bacteriana. 4
Para nveis de umidade menores que o necessitado, haver maior dificuldade na difuso de nutrientes, resultando em um crescimento do microrganismo menor do que o possvel e esperado e, conseqentemente, com menor produo do
produto desejado (lembrando ~ue, a um teor de umidade abaixo de 12%, no h
.
desenvolvimento microbiano). 6
O teor de umidade na FSS pode variar entre 18 e 85%, sendo ele estipulado
em funo do poder de absoro do substrato. Como exemplo, pode-se citar o processo "koji" (cultura de fungos sobre arroz cozido) onde o substrato moderadamente umedecido durante o cozimento pelo vapor (35 a 40% de gua), e mantido
mido pela passagem de ar com 80 a 90% de umidade relativa, para o desenvolvimento de determinados fungos em sua superfcie.
Para a produo de toxinas, necessrio apenas um teor de umidade entre
18 a 30%, 61 ' 63 enquanto que para o crescimento de microrganismos, tendo a lignocelulose como substrato, os nveis variaram entre 70 a 80%. Quando o microrganismo utilizado uma bactria, a umidade costuma ser sempre superior a 60%.
A Figura 13.7 apresenta a taxa de produo de protenas de Aspergillus niger
de acordo com a umidade inicial do meio de cultura. Pode-se observar que, con-

260

Frmentao em estado slido

forme h o aumento da umidade do meio de 35% para 55%, aumenta-se a produo de protenas no processo, assim como diminui o tempo em que se d a fase
logartmica e o ponto mximo de obteno do bioproduto desejado.
~

.s

~ 14

.c

ijl 12
Cl
o
o 10

~
..,

i!

c:

Q.

4
2

-5

15

25

35

45

Tempo de fermentaao (horas)


44

Figura 13.7 - Influncia do teor de umidade no crescimento de Aspergillus niger.

Durante a fermentao, haver uma perda de umidade devido evaporao


e s atividades metablicas microbianas. Essa perda poder ser reposta ou evitada, pela adio de gua esterilizada em intervalos constantes de tempo, pela manuteno da umidade atmosfrica entre 90-97% de umidade relativa atravs de
injeo contnua de ar mido no ferment_a dor ou com a instalao de umidificadores.4
Atividade de gua: este parmetro fornece a quantidade de gua no ligada vivel disposio dos microrganismos . Ela definida como a razo entre a presso de equilbrio de vapor do substrato emrelao
gua pura, mesma temperatura. A atividade de gua (aw) influencia o
desenvolvimento microbiano e os processos bioqumicos. Assim, cada
microrganismo tem um nvel de aw mnimo para que possa efetuar suas
atividades metablicas. Em termos gerais, por exemplo, os fungos possuem uma aw mnima de 0,7, enquanto que para as leveduras o valor situa-se em 0,8 e para as bactrias, 0,9. 68
Em PANDEY/ 5 so citados exemplos em que, durante uma fermentao em
estado slido para fungos filamentosos, altas atividades de gua favorecem a esporulao, enquanto que para baixas atividades h o favorecimento de crescimento micelial ou germinao dos esporos. A atividade da gua influencia a produo
de aromas em queijos, sendo encontrado que o ponto timo de produo situa-se
na faixa de aw = 0,98. NARAHARA 40 cita que o desenvolvimento de Aspergillus oryzae em arroz cozido cessa .a valores inferiores a aw = 0,90. YANG/ 0 para .o enriquecimento protico de resduos de batata-doce com leveluras amilolticas, indica
valores de aw= 0.98-0,99.

Controles do processo

261

Temperatura: devido s atividades metablicas dos microrganismos e dependendo da altura da camada de substrato, uma grande quantidade de
calor pode ser produzida durante o processo fermentativo.
Por exemplo, RATHBUN, SHULER71 indicam um gradiente de 3C a cada centmetro de meio em um reator, sem dissipao de calor, com uma camada de substrato de 6,5 em de profundidade, para a produo de tempeh.
Como a temperatur afeta direta~ente a germinao dos esporos, o crescimento e a esporulao dos microrganismos e a formao de produto, o calor produzido dever ser imediatamente dissipado, para que o aumento da temperatura
no prejudique a fermentao desejada.
Isso pode ser efetuado com a introduo de ar comprimido atravs do meio
de cultura, com o controle da temperatura da sala ou do equipamento onde ocorre
a fermentao, ou pelo sistema de camisas em torno do fermentador com circulao de gua refrigerante. 4
No processo de compostagem, que utiliza grandes leiras de difcil oxigenao interna, a temperatura interior chega a atingir nveis de. 60 a 70C. 57
J em um exemplo de produo de etanol, a temperatura tima situou-se na
faixa de 35C, sendo que foi observada a produo de sorbitol a temperaturas pouco maiores (39C) e a formao de levana a temperaturas mais baixas (25C). 21
A Figura 13.8 apresenta a taxa de produo de protenas de Aspergillus niger
em relao temperatura empregada no processo. Pode-se observar que, embora
a temperatura de 40C tenha apresentado um menor tempo em que ocorre a fase
logartmica, o processo temperatura de 35C obteve os maiores valores de produo protica. Observa-se tambm que a temperatura de 45C apresentou uma
perda sensvel na eficincia do processo.

.....-

14

.9 12
~
ii

.o
:::J

rn

10

C)

o
....
111

0..

4
2

oo

5
Tempo de fermentao (horas)

Figura 13.8 - Influncia da temperatura no crescimento de Aspergillus niger.

44

Quanto ao controle de temperatura, NARAHARA 40 reporta que para a produo de enzimas proteolticas utilizando-se Aspergillus oryzae ein arroz cozido, a

262

Fennentao em estado slido

temperatura ideal situa-se na faixa de 30C, sendo que, visando o crescimento do


microrganismo, a temperatura deve ser mantida a 38C.
pH: o controle do pH durante a fermentao em estado slido, embora
este seja um dos parmetros mais crticos, dificilmente ser conseguido
devido heterogeneidade e consistncia do material. Corno tentativa de
amenizar o efeito de urna variao brusca do potencial hidrogeninico,
utilizam-se substratos com boa capacidade tarnponante ou a adio de solues-tampo durante a etapa de urnidificao do substrato. 4
Aerao: para um bom rendimento e urna rpida fermentao em substrato slido, necessrio o uso de urna grande rea superficial do meio de
cultura, no qual o microrganismo pode se desenvolver em contato com o
ar. Na maior parte dos processos, tanto em nvel laboratorial corno em nvel industrial, a oxigenao do meio realizada pela introduo de aresterilizado sob presso no equipamento de fermentao.
Dependendo do valor da taxa de aerao introduzida, pode ser ocasionada
urna perda de umidade devido exausto do ar, provocando urna secagem no
desejada do substrato. Assim sendo, torna-se sempre necessrio, nesses casos, a
presena de urnidificadores de ar antes da introduo do mesmo ao reator.
H diferentes maneiras para se obter urna melhor movimentao do ar por
entre o substrato, permitindo assim uma melhor transferncia de oxignio, quer
seja pela utilizao de material poroso rnedianamente granulado ou fibroso, pelo
uso de pequena espessura da camada de substrato, pela utilizao de bandejas
perfuradas ou reatores com fundo composto por uma tela de arame, pela agitao
do substrato ou ainda pel introduo de ar forado estril dentro do reator. 4 .
Essa quantidade de ar estril a ser introduzida no processo fermentativo vai
depender da natureza dos microrganismos, da quantidade de calor metablico a
ser dissipada do processo, da espessura da camada de substrato, da quantidade de
C02 e outros metablitos volteis a serem eliminados e da necessidade de oxignio para a sntese dos produtos. 4

Em comparao com a fermentao submersa, esta necessita de qutro a cinco vezes mais oxignio que a fermentao em estado slido. 5
Para se avaliar a taxa de consumo de oxignio e de formao de outros gases, pode-se utilizar tanto um analisador de 0 2 e C02, assim como um cromatgrafo a gs, capazes de analisar os gases existentes na atmosfera do reator. 62 ' 72
Agitao: o emprego da agitao em um processo em estado slido pode
vir a fornecer uma melhor homogeneizao quanto distribuio dos in. culos e do umidificante, impedir a formao de agregados e favorecer tanto a transferncia gasosa pela exposio de partculas de substrato
atmosfera do fermentador como a troca de calor dentro do meio. 4 A agitao, porm, devido fragmentao mecnica do rniclio, pode interferir
na formao dos esporos e no desenvolvimento natural do microrganisrno.58 Pode causar tambm a compactao do meio e a danificao das hifas .5
Estimativa e car;::tcterstica de crescimento: a seqncia de cresCimento rnicrobiano em meio de cultura, em condies timas, envolve a germinao
---

------- - ----- ------. ---------- --

---------------- - ----

Controles do processo

263

nas primeiras horas, seguida de um aumento gradual de temperatura devido ao incio das atividades metablicas, urna taxa crescente das atividades metablicas, a fase estacionria e de declnio. A durao de cada etapa
vai depender das condies de fermentao, do microrganismo empregado e do produto que se deseja obter. 4
O fungo filamentosp tem a capacidade de penetrar nos espaos inter e intragranulares por meios mecnicos ou enzimticos, com a firme fixao das hifas na
superfcie do substrato e posterior intensa ramificao e penetrao na parede celular do substrato pela atuao de enzimas extracelulares produzidas e excretadas
pelos microrganismos.
Alguns estudos tm sido realizados visando determinar as cinticas de crescimento do microrganismo, de consumo de substrato e de gerao do produto.
Contudo, muito difcil estimar diretamente a biomassa rnicrobiana no processo
em estado slido, 69 assim corno separar, em muitos casos, o rniclio do substrato.
Dessa forma, so utilizados mtodos indiretos, tais como extrao alcalina da protena micelial do complexo celulose-fungo; estimativa da quantidade de ATP ou glicosamina 24 ' 25' 62 do microrganismo; estimativa da quantidade
de protenas por infravermelho 1 ; determinao da atividade da lacase extracelular; determinao contnua da quantidade de C02 e 0 2 presentes na atmosfera do fermentador por analisadores de gases/' 23' 24 ' 40' 72 ' 73 ' 74 ou por absoro do
C0 2 em Na0H. 54
Extrao de produtos: existem poucas informaes disponveis em literatura relacionadas a estudos de extrao de produtos obtidos por FSS. Por
exemplo, para extrao de enzimas extracelulares, em geral, apenas citada a utilizao de um diluente, corno gua corrente, gua destilada, soluo diluda de sais ou soluo-tampo.
RAMAKRISHNA

et aC 5 realizaram urna pesquisa visando recuperar arnilo-

glicosidase, produzida por Aspergillus niger em meio de farelo de trigo, farinha


de milho e soluo nutriente, utilizando os mtodos de percolao e recuperao em sistemas multiestgios em contracorrente. Concluram, por esse estudo,
que:
a) para a percolao, o rendimento da extrao o mesmo, tanto utilizando a
proporo 1:10 como 1:100 entre meio e diluente. Nesse caso, o rendimento mximo de extrao foi de 80 a 82%.
b) A recuperao com agitao cerca de 8% maior em relao ao processo
esttico. Ainda assim, tende a restar 17% da enzima produzida retida na matriz
slida.
c) a utilizao de soluo de sais, na faixa de 0,5% a 5%, no afetou a taxa de
extrao.
d) o sistema utilizando cinco estgios, com o diluente circulando continuamente por entre eles, mostrou-se mais vantajoso, devido ao fato de o extrato enzimtico obtido estar mais concentrado, eliminando, por vezes, a necessidade de
concentrao que poderia interferir na atividade enzimtica.

264

Fermentao em estado slido

13.7 - Vantagens e desvantagens


O processo em estado slido apresenta as seguintes vantagens operacionais
em relao ao processo submerso:
apresenta uma acelerao na taxa de reao devido ao dreto contato entre
21
.
.
o sub strato e o mtcrorgamsmo;
pode eliminar etapas de pr-tratamento do substrato, como no caso da
produo de etanol, no qual no h a necessidade do processo de extrao

do caldo de cana/ 1
vrios estudos apontam que o substrato utilizado relativamente simples,
necessitando, em muitos casos, somente de adio de gua ou uma pequena correo do meio com a introduo de fontes de nitrognio e de outros
nutrientes minerais; 2' 9' 11 ' 76
devido menor quantidade de gua empregada, o volume do reator deve
ser sempre bem menor que a operao similar em processo submerso, o
que ir reduzir os custos de operao e de capital investido assim como o
, ..
2 7 9 11 21.76
espao ocupa d o necessano ao processo; '' ' ' '
essa baixa quantidade de gua empregada tambm deve reduzir os custos
de capital investido e de energia consumida na recuperao do produto,
como no caso da produo de lcool; 2' 21
a utilizao de agitao contnua raramente necessria, podendo ser empregada, ocasionalmente, apenas uma leve mistura do substrato; 2
a aerao, natural ou forada, facilmente acessvel aos microrganismos,
devido aos interstcios existentes entre as partculas do substrato; 2' 9' 76
os baixos teores de umidade empregados, somados alta concentrao de
inculo incorporado ao meio, reduzem, ou muitas vezes at eliminam, o
problema de contaminao por outros microrganismos indesejveis;2' 7,33' 34' 76
as condies de crescimento empregadas so, em geral, similar<ts s condies naturais de crescimento dos fungos filamentosos, o que possibilita,
em muitos casos, maiores rendimentos na obteno de produtos de utilizao industrial/6
tambm esse fato permite o estudo de casos que somente ocorrem em condies semelhantes fermentao em estado slido, como a produo de
toxinas por determinados fungos filamentosos em gros/6
o produto final encontra-se mais concentrado, o que permite, em alguns
casos, como na produo de bioinseticidas ou rao animaV0 o processo
direto de secagem e embalagem do produto final obtido, ou mesmo a utilizao direta, como para alguns alimentos orientais; 2' 76
quando for necessria a recuperao do material obtido, a concentrao
do mesmo facilita esta etapa, pois permite a utilizao de menores quantidades de solventes empregados para extrair o produto; 76
h uma menor produo de resduos lquidos a serem tratados ou dispostos, o que reduz tambm os custos de capital investido e de operao da

Vantagens e desvantagens

265

planta de tratamento construda, alm de resultar em urna reduo nos


problemas ambientais originados pelo processo; 2' 7' 76
assim corno o processo submerso, a fermentao em estado slido pode
ser realizada de modo contnuo, sernicontnuo ou em batelada, e os equipamentos empregados em laboratrio, planta-piloto ou em escala industrial por este sistema no so mais complexos em comparao com aqueles
utilizados na fermentao tradicional;
sendo necessria urna rea de estocagern do produto serniprocessado ou
final, esta dever ser bem menor que a similar em processo submerso}
em diversos casos, obteve-se um rendimento do processo maior que em
comparao fermentao subrnersa. 76
Contudo, o processo apresenta tambm as seguintes limitaes, que devem
ser conhecidas para futuros estudos visando urna possvel resoluo destes problemas:
dependendo das caractersticas do meio e do tipo de reator empregado,
pode haver dificuldade em dissipar tanto o calor produzido corno os gases
gerados durante o processo, o que ir conduzir, para o primeiro caso, a
urna elevao da temperatura em pontos localizados, e, no cmputo geral,
resultar em quedas sensveis no rendimento}
devido heterogeneidade do substrato, dissipao de calor e gases gerados, manipulao do meio e do produto final e do monitoramento e controle do processo, poder haver dificuldades intrnsecas quando se desejar
realizar a ampliao de escala do sistema;
se for necessrio o emprego da agitao do meio em fermentao, a energia despendida dever ser bem maior que em processo subrnerso; 11 ' 76
embora estejam sendo realizados estudos para a suplantao desses problemas, ainda h urna dificuldade no acompanhamento e controle de parmetros operacionais, tais corno ~H, temperatura, umidade, aerao e
crescimento de rnicrorganisrnos/' 5' 9' 6
para evitar a esterilizao do meio e visando obter o mximo de rendirnento, h a necessidade de incorporar urna grande '\uantidade de inculo
ao substrato e posterior hornogeneizao do sistema; '11
assim corno, para alguns estudos, somente essa forma de processo pode
ser utilizada, para outros casos, principalmente quando h o envolvirnen. to de bactrias, a exclusividade cabe ao processo submerso;
da mesma forma que a fermentao tradicional, h a necessidade do
pr-tratamento dos substratos, e, em alguns casos, mais custoso, adequ-los fermentao desejada; 76
h urna dificuldade de coleta de amostras representativas durante o processo, devido no homogeneidade da massa em fermentao/
de acordo com o processo, pode haver a necessidade de um controle mais
rigoroso das condies ambientais nos locais de acesso fermentao,
principalmente quando houver a produo de esporos de fungos filamentosos, visando preservar a sade das pessoas envolvidas com o sistema;

266

Fermentao em estado slido

embora seja um fato que vrios estudos tm sido realizados, notando-se


um crescente interesse nessa rea por pesquisadores do Ocidente, ainda
h uma reduzida oferta de publicaes tcnicas 2 e de exemplos concretos
que possam ser observados e vivenciados.

13.8 - Exemplos de casos


Este item dedicado apresentao de alguns estudos referentes explorao da fermentao em estado slido para a obteno de bioprodutos por diversos
autores, publicados nos mais importantes peridicos da rea de biotecnologia e bioprocessos. No se trata de esgotar o tema, e sim de dar subsdios para quem quiser
comear a utilizar esse processo em suas pesquisas.
PRODUO DE LCOOL ETLICO
Foram trs as principais linhagens de microrganismos estudadas na produo de lcool etlico via FSS: a tradicional Saccharomyces cerevisia/'8' 12' 34 e
Schwanniomyces castelli, 64' 77 dentre as leveduras, e a bactria Zymomonas mobilis. 20' 21
O emprego de cada uma delas dependeu principalmente do substrato a ser utilizado: no caso de Saccharomyces e Zymomonas, o meio de cultura deve ser composto
basicamente por acares (cana-de-acar, 8 beterraba/0' 21 sorgo/ vagem de alfarroba34) ou amido pr-sacarificado (milho e cevada 12); j para Schwanniomyces castelli, pode ser utilizado amid diretamente/'8 uma vez que estes microrganismos
apresentam enzimas com capacidade amiloltica. No caso, s autores utilizaram
amido solvel embebido em bagao de cana. O teor de umidade do meio, nos diferentes estudos, variou de 70,0 a 77,3%, a temperatura de 25 a 35C e o pH de 4~0 a
5,7. O etanol pde ser obtido em um perodo entre 16 a 30 horas, a partir de inculos variando de 1,0 x 107 a 7,5 x 108 clulas/ g meio. Utilizaram-se partculas de tamanho desde 0,5 a 5,0 mm, sendo que a eficincia de converso a etanol situou-se
na faixa de 80 a 95%.

PRODUO DE CIDOS ORGNICOS


a) cido lctico: a produo pode ser obtida a partir de Rhizopus oryzae,
dentre os fungos 78 e pelas bactrias Lactobacillus casei, Lactobacillus helveticus e
Streptococcus thermophilus.22 Utilizaram-se, como meio de cultura, solues de glicose e de carbonato de clcio embebendo partculas de bagao de cana de tamanho
entre 0,8 a 2,0 mm ou torta de filtro (resduo da indstria de lcool) simplesmente.
Em uma comparao com o processo em meio lquido, SOCCOL et aC 8 apontaram
um rendimento na faixa de 77% para ambs as fermentaes.
b) cido giberlico: esta produo foi realizada utilizando-se linhagens de
Gibberella fujikuroi em meio de cultivo composto basicamente de farelo de trigo,
amido solvel e soluo de nutrientes minerais, com o teor de umidade sendo estabelecido a partir da proporo de duas partes de meio slido para uma de lquido. Manteve-se a temperatura a 28C e a produo efetuou-se por um perodo de 6
a 7 dias, utilizando-se os processos de fermentao em estado slido; tanto em batelada como em batelada alimentada. 14

Exemplos de casos

26 7

c) cido ctrico: o microrganismo utilizado para esta produo foi, em todos os estudos, Aspergillus niger. 6' 31'52'79'80 Os meios de cultura podem ser melao
(junto com a adio de soluo de nutrientes base de nitrognio, fsforo e potssio) em bagao de cana/ 1' 52 torta de filtro do processamento de cana-de-acar, 80
bagao de ma 79 ou sacarose,52 com o teor de acar variando de 8,5 a 14,0%. A
temperatura situou-se na faixa de 28 a 30C, com o meio tendo um teor de umidade em torno de 65 a 88%,, e valores de pH entre 5,5 e 5,8. Inoculando-se com uma
suspenso de 2,0 x 106 e~poros/~ meio, aps 4 a 6 dias, obteve-se uma converso
de 80%. A adio de metanol52' 7 e/ou hexacianoferrato 31' 80 (agente seqestrante)
ao substrato aumentou o rendimento do processo.
PRODUO DE ENZIMAS
a) Fitase: para a reduo de nveis de cido ftico em farinha de semente
de colza e de canola (subprodutos do processamento de leo a partir destas matrias-primas), utilizou-se uma cultura de Aspergillus carbonarius em meio composto por farinha de canola e fosfato inorgnico. 81 O perodo de fermentao foi de 72
horas, a um teor de umidade de 53-60%? A adio de oleato de sdio (1 %) e Tween-80 ao meio aumentou a produtividade do processo. 83
b) cx-amilase: para a produo desta enzima termoestvel, utilizaram-se diversas linhagens de Bacillus, como Bacillus coagulans/ 1 Bacillus megaterium, 84 Bacillus Iicheniformis 85 e Bacillus sp.,86 em meio de farelo de trigo/ 1 com partculas de
dimetro entre 0,4 e 0,8 em, pH inicial 7,0 a 40C. 84 Foi mostrado que a atividade
enzimtica reduzida em at 85% caso o teor de umidade inicial do meio varie de
65% a 95%. LONSANE; RAMESH 19 mostram um resumo desta produo em FSS por
bactrias. J por fungos, verificou-se a produo por Rhizopus oryzae em meio
base de mandioca. 87
,
c) Pectinase: foram emgregadas culturas de Aspergillus sp } 0 Aspergillus carbonarius88 e Aspergillus riiger 3 em meio de resduo fibroso de processamento de
mandioca/ 0 far~lo de trigo e sais, 88 pectina mais sacarose, glicose ou cido galacturnico embebidos em suporte de bagao de cana.43 Um dos meios consistiu de partculas de tamanho entre 3-5 mm, 30 a uma umidade de 70%/ 0.4 3 e a 30C. 88 Foi
constatado que, em termos de atividade enzimtica, a fermentao em estado slido foi onze vezes superior fermentao submersa. 43
d) Ce1ulases: Foi observada a atividade celuloltica de extratos enzimticos obtidos a partir de Trichoderma reesei/ Trichoderma viride,42'89 PeniCillium citrinum,41 Penicillium chrysogenum e Fusarium oxysporum, 42 tendo como substrato
89
palha de trigo/ bagao de cana seco ao sol/ 2 cascas de arroz 41 e fibra de coco.
Foram utilizadas, como condies do processo, um pH inicial de 5,8 a uni. teor
de umidade de 80% e temperatura de 25C 42 e 30C/ durante um perodo de
7-14 dias. 41' 42' 89 Observou-se, tambm, que a produo em meio slido foi trs
.
. a' su b mersa. 42
vezes supenor
.
e) Enzimas proteolticas: verificou-se a produo de enzimas proteolti39
cas a partir de Bacillus amylolique[.aciens / 0 Aspergillus awamori, e Aspergillus
39
91
4
90
37
oryzae/ 0' temperatura de 30C ' e 37C,
inicial de 7,9 e um teor de
91
umidade de 35%, 40 utilizando arroz cozido, 4 farelo de trigo e farinha de
soja. 39

fH

268

Fermentao em estado slido

f) amiloglicosidase: estudou-se a produo por Rhizopus oryzae}7 Aspergillus


oryzae/3 e Asperf.sillus niger/ 5' 28' 37' 38' 92 em meio base de farinha de mandioca,S7 farelo de trigo 28' 38' 7 ' 92 e farelo de arroz. 15 Empregou-se, como cond~es de cultivo,
uma temperatura entre 28 e 30C, 15' 23' 38' 92 a valores iniciais de umidade de 55% e pH
4,7. 92 Mostrou-se que a ~rodutividade em meio slido foi 32 vezes superior produo em meio lquido. 7

Meio de cultura base de farelo de trigo umedecido, esterilizado com vapor

Resfriamento e inoculao com esporos de Aspergillus

Mistura e colocao em bandejas ou tambores rotativos

Incubao a 20-4sc de 1 a 7 dias

Extrao da enzima com gua ou soluo-tampo

Secagem e moagem da cultura

Extrato enzimtico

Farelo enzimtico
57

Figura 13.9 - Uma seqncia tpica de um processo de produo de enzimas pelo mtodo de cultura slida.

PRODUO DE TOXINAS
Observou-se que diferentes espcies de Fusarium so potenciais produtores
de toxinas, tais como a fusarina C/3 a fumonisina, 49 deoxini"talnol e
3-acetildeoxinivaleol,51 tendo como substrato arroz 51 ou milho. 49 Da mesma forma,
Aspergillus produzem aflatoxina e ocratoxina, principalmente por Aspergillus Jlavus,
Aspergillus parasiticus e Aspergillus ocraceus. 10.so.61 '94' 95 Os estudos foram conduzidos
em uma faixa de temperatura entre 25 a 29C, teor de umidade entre 18 a 31 %, 61 ' 63
utilizando-se como meio slido forragens de alfafa e aveia, 10'50' 94 gros de sorgo,
. t ngo,
.
.amen d mm,
. m1'lho e arroz. 10So95
SOJa,

PRODUO DE ANTIBITICOS
a) Penicilina: a utilizao de Penicillium chrysogenum, em meio de bagao de
cana umidificado com soluo nutriente base de glicose, lactose e gua de macerao de milho, obteve maior produtividade volumtrica e maior rendimento em
menor perodo de fermentao, quando comparado com o processo submerso.
Para tanto, foi introduzido no processo um inculo com 5,0 x 106 esporos por grama de meio, temperatura de 26C, pH inicial de 5,5 e um teor de umidade inicial
de 70 a 73%, durante um perodo de 46 horas .33

Exemplos de casos

269

b) Iturina: para a produo deste antibitico antifngico por Bacillus subtilis,


utilizou-se farelo de trigo, verificando-se que a produo em meio slido foi de
cinco a seis vezes maior que a similar em meio lquido. 48

PRODUO DE BIOPESTICIDAS
a) Foram produzidos esporos do fungo entomopatognico Beauveria
brongniartii em gros de /milho pr-tratados, alcanando um rendimento de 4,8 x
108 condios por grama de gros;67
b) Estudou-se a atuao do farelo fngico, obtido a partir da fermentao de
Stilbella aciculosa em farelo de trigo, contra Rhizoctonia solani; 96
c) Esporos de Coniothyrium minitans, inibidor da germinao de Sclerotinia
sclerotiorum, foram produzidos em diferentes tipos de substratos, alcanando um
rendimento na faixa de 1,9 a 9,3 x 108 esporos por grama de meio de cultura; 97
d) Verificou-se a produo de esporos de Bacillus thuringiensis a partir de
resduos de indstria de processamento de mandioca, alcanando um alto rendimento no processo, bem superior cultura submersa. 18
PRODUO DE ESPOROS
Efetuou-se a obteno de esporos de Trichoderma harzianum (potencial gerador de celulases, biopesticidas, antibiticos, compostos flavorizantes e protena
microbiana) em suporte inerte (bagao de cana) e substrato omposto por farinha de mandioca e soluo nutriente, a 29"C, com um teor de umidade de 75%,
durante um perodo de 6 dias a uma taxa de aerao de 300 litros de ar por quilograma de meio por hora. A partir de um inculo de 3,0 x 10 7 esporos/g meio, foram gerados at 5,0 x 10 10 esporos/ g de meio, 5 vezes mais que a produo em

mew
agar. 98
ENRIQUECIMENTO PROTICO
Visando obter um enriquecimento protico,microbiano, foram estudadas as
linhagens de Aspergillus niger/9' 44,45 ,47 Trichoderma reesei/' 46 Rhyzopus sp., 45 Rhizopus
oligosporus/9 Aspergillus oryzae/0 Saccharomyces diastaticus e Saccharomyces sp. 70 Os
meios empregados foram cana-de-acar e nutrientes/9 polpa de batata-doce/'70
arroz cozido/0 farinha de mandioca e soluo salina,44 "grits" de milho/ 9 polpa de
caf/7 bagao de laranja, 45 palha de trigo e soluo nutriente, 45 com uma concentrao inicial de 2 a 5 x 107 esporos por grama de meio. 29,44
Verificou-se que as variveis do processo observadas foram as mais diversificadas dentre todas as aplicaes da fermentao em estado slido revistas. Como
exemplos, os estudos foram conduzidos a um pH inicial de 2,5/ 3,5,47 3,8/
3,5-4,3,45 4,2/9 4,5 70 e 5,0/6 a teores de umidade de 40%, 40 50-55%/4 60%/9 65%/0
69%/9 70% 45,46 e 80%/ 7 temperaturas de 28C/ 29"C,46 30C,45 ' 70 33-36C/9 35C,44' 47
37C/9 e 38C/ 0 com taxas de aerao de 4,3 29 e 8,047 litros por quilograma de meio
por minuto.
Tambm foram realizados estudos a Rartir de resduos agrcolas celulsicos
(palha de centeio<35 l, folha de "maple"<36 ), com pr-tratamento com H 2S04 e

270

Fermentao em estado slido

NH 40H, 35 ou NaOH 36 a 121C para hidrlise do matei.-ial. Aps essa etapa, adicionou-se soluo salina e inoculou-se com Candida utilis, Aerobasidium pululans, Trichoderma viride 35 e Chaetomium cellulolyticum/6 a um teor de umidade de 75%-78% e
temperatura ambiente 35 ou a 37C. 36
ALIMENTOS ORIENTAIS
Como exemplo, foi estudada a produo de tempeh, um tradicional alimento da Indonsia, a partir de Rhizopus oligosporus 100 e Rhizopus sp., 59 em meio
base de trigo 100 ou soja, 59 a 31 C por 20-24 horas. 59' 100 Por esse processo, o sabor
desagradvel da soja torna-se mais aceitvel, o alimento mais facilmente digervel devido ao das enzimas lipolticas, proteolticas e amilolticas produzidas, alm de aumentar os nveis de niacina e riboflavina ao longo da
fermentao. 100

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____________ ----- - -

__.

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Willibaldo Schmidell

14.1 - A importncia da transferncia de oxignio


Entre os processos biotecnolgicos de interesse industrial, envolvendo o cultivo de clulas microbianas, sem dvida os processos conduzidos em aerobiose
encontram uma situao de enorme destaque. Assim, por exemplo, a produo de
antibiticos, enzimas, vitaminas, fermentos e inoculantes, protenas recombinantes (hormnios de crescimento, insulina; etc.), constitui em sua grande maioria
processos aerbios. Igualmente, o cultivo de clulas animais, 'v isando a produo
de produtos ou a posterior infeco por vrus para a obteno de vacinas, so processos aerbios.

Dessa forma, os processos fermentativos envolvendo o cultivo de clulas aerbias ou aerbias facultativas, visando a produo de produtos como os acima
exemplificados, ou ainda para a realizao do tratamento biolgico de guas residurias, tm todos o aspecto comum de exigirem um adequado dimensionamento
do sistema de transferncia de oxignio, ou seja, da operao de dissoluo do oxignio contido na fase gasosa (normalmente o ar, ou ar enriquecido com oxignio)
para a fase lquida, de onde o microrganismo ir consumir este oxignio para a
respirao.
Como se sabe, do ponto de vista bioqumica, o oxignio o ltimo elemento
a aceitar eltrons, ao final da cadeia respiratria, s~ndo ento reduzido a gua,
permitindo que ocorra a reoxidao das coenzimas que participam das reaes de
desidrogenao (ao longo da gliclise e do ciclo de Krebs) e, ainda, permitindo o
armazenamento de energia atravs da passagem das molculas de ADP para ATP.
Estas ltimas, por sua vez, iro participar necessariamente nas reaes de sntese
de molculas, para a sobrevivncia das clulas e para o surgimento de novas clulas, no processo de proliferao da biomassa microbiana, para as quais fundamental a introduo de energia.

278

Agitao e aerao em biorreatores

Assim sendo, um cultivo que seja altamente eficiente, ocorrendo com elevadas velocidades de crescimento celular, significa altas velocidades de consumo da fonte de carbono, a fim de que haja abundncia de eltrons transportados
na cadeia respiratria (gerao de ATP), mas significa tambm, obrigatoriamente,
a necessidade da existncia de oxignio dissolvido, a fim de que estes eltrons sejam drenados ao final desta cadeia.
A equao estequiomtrica de oxidao completa da glicose ilustra bem esta
situao:

ou seja, para que ocorra a oxidao de 1 mol de glicose, necessrio o consumo de


6 mols de 0 2 .
Essas consideraes tornam bvia a co~preenso sobre a necessidade de se
agitar e aerar um meio de cultivo, para que se possa efetuar um processo fermentativo aerbio. No entanto, ainda resta entender a necessidade de executar essa
operao ao longo de todo um processo fermentativo e no apenas em seus instantes iniciais.
Para que essa necessidade fique clara, preciso lembrar que sempre possvel dissolver quantidades significativas das fontes de carbono, nitrognio, fsforo
e demais nutrientes necessrios. De fato, sabe-se que a glicose bastante solvel
em gua, sendo possvel solubilizar centenas de gramas por litro de soluo, sem
maiores dificuldades. Igualmente, para os outros nutrientes necessrios, sempre
possvel encontrar espcies qurrcas razoavelmente solveis, de forma a se colocar disposio dos microrganismos dezenas de gramas por litro.
Para o oxignio, no entanto, essa situao bastante distinta, pois este elemento muito pouco solvel em gua. De fato, a concentrao de oxignio dissolvido na saturao apenas da ordem de 7 mg0 2 /L (7 ppm), ao se borbulhar ar atmosfrico presso de 1 atm e a 35C.
Conclui-se, portanto, que de nada adiantaria dissolver centenas de gramas
de glicose por litro, alm das quantidades necessrias dos demais nutrientes, para
que se imaginasse efetuar um processo fermentativo descontnuo aerbio, sem
que se imaginasse igualmente introduzir, ao longo do processo, o oxignio necessrio para suportar a condio de aerobiose, tendo em vista a baixssima capacidade de armazenar o 0 2 na soluo.
Exatamente por essa razo que se costuma afirmar que a extenso de um
processo descontnuo aerbio e, por conseguinte, a obteno de elevadas concentraes do produto desejado, depende enormemente da capacidade de se transferir o 0 2 para a fase lquida, especialmente nos instantes mais avanados do
processo, onde a concentrao celular pode ser elevada.
Da mesma forma, no que se refere aos processos contnuos e qescontnuos
alimentados, o emprego de elevadas vazes de alimentao de nutrientes s ser
efetivo caso se tenha sistemas bem dimensionados de transferncia de oxignio.

Sistemas para a transferncia de oxignio

279

Em outras palavras, pode-se ter situaes em que a capacidade de transferncia de


oxignio que ditar as condies de operao.
Como se sabe, existem vrios trabalhos publicados nos quais se indicam as
vantagens em se operar reatores com altssimas densidades celulares (algo como
100 g/1) e empregando-se clulas mantidas em altas velocidades especficas de
crescimento e, por decorrncia, com elevadas velocidades especficas de respirao (conforme ser vistd mais adiante). Tais situaes devem ser observadas com
certa cautela, pois ser sempre muito complicado efetuar-se a ampliao de escala
dessas situaes, justamente tendo em vista as enormes capacidades de transferncia de oxignio que seriam necessrias.
Igualmente, sabe-se das freqentes crticas elaboradas com relao aos sistemas aerbios de tratamento de resduos, os quais so sempre muito mal monitorados e controlados, tendo em vista no pertencerem especificamente ao sistema
produtivo da unidade industrial. Deve-se, antes, buscar explicaes no dimensionamento do sistema de transferncia de 0 2 (freqentemente se superestima ~sta
capacidade, a fim de reduzir o tamanho dos reatores), ou observar a forma de dperar, a qual deve ser compatvel com a capacidade de manter o sistema biolgico
em condies de aerobiose.
Essas consideraes caracterizam a necessidade de se entender as bases fundamentais da transferncia de oxignio, objetivo central do presente texto, o qual
complementado com as consideraes do captulo seguinte (Captulo 15: Variao de Escala).

14.2 - Sistemas para a transferncia de oxignio


Tendo em vista a importncia da operao de transferncia de oxignio, de
se esperar que existam muitas formas de execut-la, obviamente umas mais eficientes do que outras. Aquelas menos eficientes, em termos de transferncia de oxignio, podem ser interessantes sob outros aspectos, como, por exemplo, a de
submeterem as clulas a um menor cisalhamento.
Na Figura 14.1 esto indicadas algumas possibilidades de se transferir oxignio em biorreatores.
Os esquemas indicados por (1) e (2) na Figura 14.1, indicam o que se costuma chamar de aerao superficial (designao no apropriada, pois toda transferncia ocorre em uma superfcie). O esquema (1) procura ilustrar a operao de
bandejas, ou lagoas de oxidao para o tratamento biolgico de resduos, nas
quais a transferncia de oxignio ocorre por simples difuso no lquido em contato com o ar atmosfrico. J o esquema (2) sugere a transferncia de oxignio em
reatores com clulas imobilizadas (aderidas) em um leito fixo, constitudo por
cavacos de madeir, no caso de reatores para a produo de vinagre, ou cascalho, no caso de filtros aerbios para o tratamento de guas residurias.
As demais ilustraes da Figura 14.1 referem-se chamada aerao em
profundidade, ou seja, aquelas nas quais se procura transferir oxignio atravs
do borbulhamento de ar.

::

280

Agitao e aerao em biorreatores

Os detalhes (3) e (4) sugerem a possibilidade de se transferir oxignio


apenas por borbulhamento de ar.
O reator indicado com o nmero (3), tambm conhecido co'mo coluna de bolhas, utilizado ainda para a produo de fermento, consiste simplesmente numa
serpentina localizada no fundo do reator, atravs da qual devem surgir bolhas de
pequeno dimetro que sobem toda a altura do reator, provocando agitao e
transferindo oxignio. Uma alternativa a esse sistema de serpentinas pode ser a
colocao de calotas de ao sinterizado, para dentro das quais se faz fluir o ar, o
qual passa para o lquido na forma de pequenas bolhas (sistema "air-blown"), em
virtude dos poros diminutos do elemento s~nterizado.
J o esquema (4) ilustra a forma mais convencional dos reatores conhecidos
como "air-lift" (existem muitas variantes deste tipo de reator), nos quais o ar introduzido em uma chamin no interior do reator, atravs de um metal ou material
cermico sinterizado de pequenos poros, o que provoca uma intensa agitao no
lquido, dependendo da vazo de ar empregada. Esses reatores so bastante
interessantes para o cultivo de clulas que apresentem grande sensibilidade
ao cisalhamento, como o caso do cultivo. de clulas animais.
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Gases

Gases
Entrada
meio

Ar

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(1)
Entrada ar

(2)

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Gases
Gases
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(4)

(6)

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Ar

Ar

Figura 14.1 - Sistemas diversos para a transferncia de oxignio em biorreatores. (I) bandeja ou lagoa; (2) reator de
leito fixo; (3) coluna de bolhas; (4) "air-lift"; (5) tanque agitado e aerado; (6) "draught-tube".

Concentrao de oxignio dissolvido em solues saturadas

281

Esses reatores apenas aerados tm merecido muita ateno, 1' 2 no apenas


pelo menor cisalhamento, mas tambm por evitarem o emprego de sistemas de
agitao, o que simplifica a construo do biorreator, alm de tambm permitirem uma eventual economia de energia. Por outro lado, esses reatores normalmente exigem vazes de aerao mais elevadas, a fim de manterem um bom
nvel de agitao e transferncia de oxignio, o que significa um maior dispndio de energia na compresso do ar. Apenas para se ter uma idia, eles so operados com vazes especficas prximas a 1 min-1 (ou, como comumente
mencionado, l v.v.m.- volu~e de ar por volume de meio por minuto), enquanto que os aerados e--agldos ficam mais prximos de 0,5 min- 1
Outro detalhe importante que os reatores apenas aerados costumam ser
projetados com uma alh.tra bem superior ao dimetro do tanque, contrariamente
aos agitados e aerados, a fim de permitirem um maior tempo de residncia do ar
em contato com o lquido.
Finalmente, os esquemas indicados com. ~s nmeros (5) e (6), na Figura
14.1, referem-se justamente aos reatores agitados e aerados. O detalhe (5) ilustra o tradicional tanque agitado, que continua sendo o tipo de reator mais freqente na indstria, responsvel por cerca de 93% das aplicaes. 2
O reator tipo tanque agitado e aerado, entendido como padro, apresenta
altura do lquido igual ao dimetro do tanque, sendo agitado por um impelidor
tipo turbina com 6 ps planas ("flat-blade turbine"), apresentando um dimetro igual a l/3 do dimetro do tanque. A fim de evitar a formao de vrtice,
usa-se um sistema de 4 chicanas, diametralmente opostas, apresentando cada
uma largura de l/10 ou l/12 do dimetro do tanque.
Conforme j salientado no Captulo 8, apesar de existir a descrio desse tanque padro, na verdade raramente verifica-se uma perfeita obedincia a
essas relaes geomtricas, observando-se, freqentemente, tanques com altura maior do que o dimetro, assim como turbinas de dimenses superiores
indicada, alm do emprego de mltiplas turbinas. Justifica-se tal procedimento pela necessidade de se obter maior homogeneizao do contedo do reator,
assim como transferncia de oxignio mais efetiva. Esse fato dificulta um correto dimensionamento da transferncia de oxignio, por ausncia de dados
em geometrias distintas, conforme se ver mais adiante.
O esquema indicado com o nmero (6), prope a colocao do impelidor
no interior de um duto, objetivando a formao de vrtice no interior desta
chamin e, com isto, ampliar a efetividade na transferncia de oxignio. O sistema "draught-tube" de fato encontra alguma aplicao industrial, mas entendido como o sistema que causa maior cisalhamento nas clulas, em relao
ao tanque agitado e aerado convencional.

14.3 - Concentrao de oxignio dissolvido em solues


saturadas
Conforme apontado anteriormente, o oxignio muito pouco solvel em
gua, o que acaba causando a necessidade de se fornecer este elemento ao longo
de todo o processo fermentativo.

282

Agitao e aerao em biorreatores

Na Tabela 14.1 encontram-se alguns dados a respeito da solubilidade do oxignio, na condio de saturao, para diferentes temperaturas, presso parcial de
oxignio na fase gasosa e presena de sais dissolvidos. 3
A observao dos valores contidos na Tabela 14.1 evidencia a baixa solubilidade do oxignio, pois a concentrao de saturao em gua de apenas 7 mg/L a
35C, quando em equilbrio com o ar atmosfrico, o qual apresenta uma frao molar ou volumtrica de 20,9% de oxignio, ou seja, a uma presso total de 1 atm
apresenta uma presso parcial de oxignio de 0,209 atm.
3

Tabela 14.1 - Valores da concentrao de oxignio dissolvido na saturao, em diferentes condies.

Temp
(OC)

".

Cone, NaCl
(M)

P. Pare. 0 2
(atm)

Cone. 0 2 na .
sat. (mg / L)

Cte. Henry
(mg/L. atm)

25

0,209

8,10

38,8

35

0,209

6,99

33,4

25

1,0

40,3

25

0,5

1,0

34,2

25

1,0

1,0

28,5

25

2,0

1,0

22,7

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Observa-se que a concentrao de oxignio dissolvido diminui com o aumento da temperatura, assim como diminui com o aumento da concentrao de
um sal dissolvido. Por outro lado, a concentrao de 0 2 aumenta com o aumento
da presso parcial de oxignio na fase gasosa, como seria o caso de saklrar gua
com oxignio puro (presso parcial de 0 2 de 1 atm), atingindo-se 40,3 mg/L no
equilbrio a 25C.
Os nmeros apontados na Tabela 14.1 permitem refletir sobre alguns pontos
importantes, considerando a necessidade de se ter valores da concentrao na saturao mais elevados. Em primeiro lugar, o abaixamento da temperatura no seria soluo mais adequada, pois na . maioria dos processos fermentativcis de importncia
trabalha-se na faixa mesoflica de temperaturas, ou seja, da ordem de 35C.
A operao com presses parciais de oxignio no gs mais elevadas, de
fato uma alternativa interessante, sendo mesmo praticada atravs do enriquecimento do ar atmosfrico com oxignio. No entanto, essa operao deve ser efetuada com muito cuidado, pois grande parte dos microrganismos aerbios apresenta
tendncia inibio por elevadas concentraes de oxignio dissolvido, inibio
esta observada para valores no muito distintos da concentrao de saturao com
o .ar atmosfrico. H at mesmo indcios de inibio, para algumas espcies, para
valores da ordem de 7 a 8 mg/L, ou mesmo inferiores. 4

Concentrao de oxignio dissolvido em solues saturadas

283

O fato de se observar uma reduo da concentrao de oxignio dissolvido,


quando se dissolvem outras espcies qumicas em um lquido, permite lembrar
que sempre se fermenta solues de nutrientes, o que significa a presena de muitas substncias dissolvidas, as quais, no cmputo final, reduzem a concentrao
de saturao do oxignio em relao ao valor observado para a gua.
Esse problema ainda agravado, lembrando-se que o microrganismo consome esses nutrientes, ad longo do tempo, lanando no meio produtos de metabolismo. Isso significa que a composio qumica do meio de cultura alterada a
cada instante do processo, o que causa alterao na concentrao do oxignio
dissolvido na saturao.
Por esse motivo existem na literatura 5 propostas para o clculo da concentrao de saturao, a partir do conhecimento da composio qumica do meio a cada
instante, o que, alm de conduzir a clculos relativamente tediosos, ainda exige
determinaes analticas detalhadas, no muito freqentes em processos fermentativos. Existe tambm proposta para essa determinao experimentaV que apresenta particular utilidade para o conhecimento da concentrao de saturao pelo
menos no instante inicial.
Em se tratando de uma soluo bastante diluda, para este caso aplicvel a
lei de Henry, segundo a qual a concentrao de oxignio dissolvido no equilbrio
(saturao) proporcional presso parcial de oxignio no gs, ou seja:
Cs =H pg

(14.1)

onde: Cs =concentrao de oxignio na saturao (g0 2 /m 3 )


H= constante de Henry (g0 2 /m3 atm)
pg =presso parcial de 0 2 na fase gasosa (atm) = x02 .P
x02 = frao molar ou volumtrica do 0 2 no gs
P =presso total do gs (atm)
Dessa forma, ao variar a composio qumiCa de um dado lquido, o que varia a constante de Henry e, portanto, a concentrao de saturao para um dado
valor da presso parcial do oxignio no gs. Na Tabela 14.1 encontram-se alguns
dados para essa constante de Henry.
necessrio lembrar que a concentrao de oxignio dissolvido, durante um processo fermentativo, normalmente monitorada atravs de eletrodos
(polarogrficos ou galvnicos - para maiores detalhes sobre eletrodos, sugere-se a leitura da reviso escrita por LEE;TSA0). 7 Esses eletrodos so calibrados no instante inicial, antes de se efetuar a inoculao do reator,
saturando-se o lquido com oxignio atravs de agitao e aerao, fixando-se
na escala do aparelho o valor 100%. Caso no se conhea a constante de Henry
para o lquido em estudo, tambm no se conhece o valor absoluto da concentrao de saturao, sendo que durante o processo fermentativo o eletrodo indicar valores intermedirios entre zero e 100%, o que significa, para um dado
instante, a concentrao de oxignio dissolvido em relao saturao.

284

Agitao e aerao em biorreatores

Como esses eletrodos respondem presso parcial do oxignio, para efetuar


medidas confiveis, deve-se manter constante a presso no interior do reator pois,
caso ela varie, o eletrodo indicar variaes que no so devidas ao fenmeno biolgico que est ocorrendo. Igualmente, deve-se lembrar que o eletrodo no indicar variaes em virtude de alteraes na composio do meio, sendo, portanto, um
dado valor indicado sempre correspondente a uma porcentagem do valor inicial
da saturao. Dessa maneira, possvel ocorrer a indicao de valores superiores
a 100%, caso ocorra um aumento de presso no reator, ou caso se introduza oxignio na corrente gasosa.
Tendo em vista as dificuldades apontadas, alguns autores preferem, quando
h a necessidade do conhecimento do valor absoluto da concentrao de oxignio
dissolvido, supor que se trata de gua, utilizando ento valores existentes em manuais. Tambm existem alguns trabalhos nos quais se observam concentraes de
oxignio dissolvido expressas em presso parcial de oxignio (mmHg), lembrando-se que para o ar, a 1 atm de presso total, tem-se 159 mmHg para a presso
parcial do oxignio.

14.4 - Transferncia de oxignio e respirao microbiana


O objetivo central de um sistema de agitao e aerao o fornecimento de
oxignio para a manuteno de uma dada atividade respiratria de um certo conjunto de clulas. Assim, o que se visa transferir o oxignio da fase gasosa para o
lquido, fazer com que este oxignio dissolvido chegue s clulas suspensas, penetre nestas clulas e, finalmente, seja consumido na reao.
, portanto, possvel imaginar que existam muitas resistncias associadas a
. esse transporte do oxignio da fase gasosa at oseu consumo final. Na Figura 14.2
busca-se ilustrar algumas dessas possveis resistncias.

Peliculas
. - - - - - - - estagnadas

Reao
bioqulmica
Meio de
cultivo

:'

____ .,._ .....


Clula

'

__ .....
''
'

'

Interface
gs-liquido

Figura 14.2 - Resistncias associadas dissoluo e ao consumo do oxignio.

Transferncia de oxignio e respirao microbiana

285

Conforme sugere a Figura 14.2, essa questo pode ser dividida em trs
problemas distintos. O primeiro diz respeito dissoluo, ou transferncia do
oxignio do gs para o lquido, o segundo eventual difuso do oxignio at a
clula e, finalmente, o problema do consumo do oxignio .
No que se refere resistncia 4, ou seja, aquela associada difuso do oxignio at as clulas, espera-se que o lquido seja suficientemente agitado, a fim de
que possa ocorrer o transporte convectivo e, desta forma, imagina-se que esta resistncia possa ser desprezada. No caso de lquidos extremamente viscosos essa
hiptese pode no se verificar.
No caso da transferncia do oxignio do gs para o lquido, pode-se imaginar uma primeira resistncia (resistncia 1 - Figura 14.2) devido a uma pelcula
gasosa estagnada, atravs da qual o oxignio deve difundir. A seguir, pode-se
imaginar uma resistncia na interface gs-lquido (resistncia 2) e, finalmente, a
resistncia associada pelcula lquida estagnada ao redor da bolha de gs (resistncia 3). Dados existentes na literatura permitem imaginar que a resistncia do
lado da fase gasosa pode ser desprezada, em virtude da intensa movimentao
das molculas de oxignio. Da mesma forma, a resistncia devido interface comumente considerada desprezvel, a menos que se empregue substncias que possam aderir a essa superfcie e, desta forma, provocar um aumento nesta
resistncia, como o caso de alguns antiespumantes.
Conclui-se, portanto, que a resistncia dominante refere-se quela associada
pelcula lquida, resistncia esta que funo da difusividade do oxignio no lquido, assim como devido espessura desta pelcula.
No lado do consumo do oxignio, pode-se imaginar uma resistncia devido
pelcula lquida em torno da clula (resistncia 5- Figura 14.2), outra devido
resistncia imposta pela membrana celular (resistncia 6), a resistncia devido
difuso do oxignio no citoplasma (7) e, finalmente, aquela associada velocidade
da reao de consumo final deste oxignio (resistncia 8).
Tendo em vista as diminutas dimenses das clulas, assim como a enorme
rea exposta ao meio lquido, a resistncia 5 pode ser desprezada. Da mesma forma, a resistncia 6 pode ser desprezada, pois a membrana celular no deve opor
resistncia difuso do oxignio, sendo hoje entendido que o oxignio penetra na
clula por simples difuso, no havendo sistemas de transporte para este elemento,4.8 fato inclusive que justifica a possibilidade de inibio da atividade de clulas,
quando expostas a elevadas concentraes de oxignio no meio lquido, conforme
apontado anteriormente.
No que se refere resistncia 7, pode-se tambm consider-la pouco significativa, tendo em vista novamente a elevada rea exposta pela clula ao meio ambiente.
No caso de clulas eucariticas, poder-se-ia imaginar alguma dificuldade para o
oxignio atingir as membranas internas das mitocndrias, onde esto localizados
os sistemas enzimticos e as protenas responsveis pela respirao. 8 No caso de
bactrias, a localizao desses sistemas na !Tiembrana citoplasmtica, motivo
pelo qual no h realmente razo para considerar essa resistncia.

286

Agitao e aerao em biorreatores

Dessa forma, do lado do consumo, a resistncia mais significativa ficaria


por conta da velocidade da reao enzimtica da respirao (resistncia 8), ou
seja, na dependncia da atividade e concentrao dos complexos enzimticos
e proticos que efetuam esta reao, alm de toda a atividade biolgica da clula, o que incide na disponibilidade de eltrons a serem transportados pela
cadeia respiratria, com a concomitante utilizao do ATP gerado para a sntese de novas molculas. No que tange atividade e concentrao dos complexos proticos responsveis pela respirao, no se tem condies simples de
interferncia, a no ser que se imaginasse alteraes genticas o que, apesar
de extremamente atraente, ainda , presentemente, tarefa relativamente complicada.
Claro est que no caso de microrganismos que crescem em aglomerados,
como o caso de fungos filamentosos que crescem na forma de miclios, ainda se
poderia considerar uma resistncia adicional em termos da difuso do oxignio
para as clulas mais internas dos aglomerados.
A partir dessa discusso, pode-se perceber que a tarefa de projetar adequadamente um sistema de transferncia de oxignio, reside em obter-se uma
eficiente dissoluo do oxignio no meio lquido, deixando ento para as clulas a situao de no limitao de oxignio, para que elas possam consumir este
substrato de forma plena, dentro das caractersticas biolgicas prprias de cada
espcie.

14.4. I - Transferncia de oxignio


Dentre as vrias teorias que permitem o equacionamento da transferncia de
oxignio, a de maior utilidade para a presente questo exatamente aquela que
considera a existncia de duas pelculas estagnadas. Na Figura 14.3 busca-se ilustrar, com maiores detalhes, a interface lquido-gs com as mencionadas pelculas.
Conforme salientado no item anterior, ao se imaginar uma bolha. de ar suspensa em um meio lquido, pode-se tambm supor a existncia de uma pelcula
gasosa estagnada, entre o seio gasoso (homogneo com presso parcial de 0 2 constante) e a interface gs-lquido, pelcula na qual se localizaria a resistncia ao
transporte do oxignio, caracterizada pelo inverso do coeficiente de transferncia
da pelcula gasosa (kg), coeficiente este definido pela relao entre a difusividade
do oxignio e a espessura da pelcula estagnada. A transferncia ocorreria apenas
por efeito difusional e, portanto, depende da existncia de um gradiente entre a
presso parcial de 0 2 no interior homogneo da bolha (pg) e a presso parcial de
0 2 na interface (p;).
Igualmente pode-se supor, na fase lquida, a existncia de uma pelcula estagnada ao redor da bolha, na qual se localizaria a resistncia ao transporte do oxignio, caracterizada pelo inverso do coeficiente de transporte na pelcula lquida
(kL) . Aqui tambm o fluxo de oxignio depende, alm do coeficiente de transferncia, da existncia de um gradiente entre a concentrao de 0 2 na interface (CJ e a
concentrao de 0 2 no seio lquido (C).

287

Transferncia de oxignio e respirao microbiana

Gs

Pelfcula
lfquida

Lfquido

Figura 14.3 - Interface gs-lquido com as pelculas estagnadas.

Admitindo que o sistema esteja em estado estacionrio, em termos da transferncia de oxignio, assim como a existncia de um perfil linear da concentrao
de oxignio no interior das pelculas, pode-se escrever:

gradiente
resistncia

=-=---02

onde: n 0 = fluxo de oxignio por unidade de rea interfacial


2

(g0 2 /m2 h)
resistncia = inverso do coeficiente de transferncia
ou seja:
(14.2)
onde: kg =coeficiente de transferncia de massa da pelcula gasosa (m/h)
kL = coefi~iente de transferncia de massa da pelcula lquida (m/h)
pg =presso parcial de 0 2 no seio gasoso (atm)
Pi =presso parcial de 0 2 na interface (atm)
p1 = presso parcial de 0 2 em um gs que estaria em equilbrio com a
concentrao de oxignio C no lquido, segundo a lei de Henry (atm)
H= constante de Henry (g0 2 /m3 atm)
Cs =concentrao de 0 2 dissolvido no lquido em equilbrio com pg,
segundo a lei de Henry (g0 2 /m3)
Ci =concentrao de 0 2 dissolvido em equilbrio com pi (g0 2 /m 3 )
C= concentrao de oxignio no seio lquido (g0 2 /m3)
Como se observa na Eq. 14.2, introduziram-se como gradientes as diferenas
entre as presses parciais de 0 2, ou estas traduzidas em concentraes atravs da
lei de Henry.

288

Agitao e aerao .em biorreatores

Na verdade, no h condies de se conhecer os valores relativos interface


gs-lquido, podendo-se determinar os valores das concentraes no seio do gs e
do lquido. Assim, prefere-se trabalhar com um coeficiente global de transferncia
de oxignio (o qual corresponderia soma das resistncias das duas pelculas).
Ou, ainda, lembrando que a resistncia devido ao filme gasoso pode ser desprezada, tendo em vista a resistncia do filme lquido, pode-se considerar pg =pie, como
decorrncia, ci = c.
Assim, a Eq. 14.2 pode ser escrta:
(14.3)
Tendo em vista que esse fluxo de oxignio est definido por unidade de rea
interfacial de troca de massa, rea essa de difcil quantificao quando se tem um
enorme nmero de bolhas suspensas em um lquido, pode-se definir:
rea interfacial de transferncia de massa (m 2)

a=--------------------------------~--~

volume total de lquido (m3 )

Assim, pode-se escrever:


(14.4)
onde: n 02a =velocidade de transferncia de oxignio (g0 2 lm3 h)
kLa =coeficiente volumtrico de transferncia de 0 2 (h-1)
finalmente, caso no se esteja em estado estacionrio em termos de fluxo de
0 2, mas esteja ocorrendo uma variao da concentrao de 0 2 dissolvido (C) no
tempo (t), pode-se escrever que n 02 a =dC I dt(g 2 I m 3 h), ou seja:

dC

-=kta(C
-C)
dt
s

(14.5)

Essa equao, apesar de ser extremamente simples, permite uma exata compreenso de todas as formas de que se dispe para o controle da concentrao de
oxignio dissolvido em um certo meio.
De fato, caso se enriquea em 0 2 o gs de entrada de um: reator (aumento de
pg), ou se aumente a presso de cabea do fermentador (aumento de P), incrementa-se o gradiente (C5 - C), para um dado valor de C em um certo instante, pois se
estaria aumentando o valor de C5 Igualmente, aumentando-se a freqncia de agitao, se estaria rompendo e dispersando mais as bolhas de ar (aumento de a) e reduzindo a espessura do filme lquido (aumento de kL) . Por outro lado, o aumento
da vazo de aerao, significa tim maior acmulo de bolhas de ar no seio lquido
(aumento de a), ao mesmo tempo em que se promove um maior arraste do co2
produzido (aumento de pg).

Transferncia de oxignio e respirao microbiana

289

As Eqs. 14.4 e 14.5 permitem ainda entender que a mxima capacidade de


transferncia de oxignio de um dado sistema de agitao e aerao dada pelo
produto kLaC., ou seja para a situao de concentrao de 0 2 nula no meio. Tal situao no tem interesse, no que se refere ao cultivo de um dado microrganismo
aerbio, mas interessante para a caracterizao de um dado sistema de transferncia.
Na realidade, ao se desenvolver uma dada equao que pretende descrever
um certo fenmeno, sempre ocorre a necessidade da introduo de certos parmetros, os quais necessitam ser determinados experimentalmente, a fim de que a
equao desenvolvida possa ter utilidade prtica. Igualmente, a caracterizao de
um dado sistema de transferncia de oxignio, conforme descrito pela Eq. 14.5,
significa determinar os valores do parmetro kLa, o que possvel atravs de diversas metodologias.
A mais antiga dentre elas o chamado mtodo do sulfito, que consiste em
transferir oxignio para uma soluo de sulfito de sdio na presena de um sal de
cobre como catalisador. Essa metodologia est muito bem descrita no trabalho publicado por COOPER et aC
Coloca-se no reator uma soluo de sulfito de sdio, adiciona-se sulfato de
cobre e estabelece-se a aerao desejada. Em um dado instante colhe-se uma
amostra e determina-se a concentrao de sulfito por iodometria (adiciona-se
amostra uma soluo de iodo, que oxida o sulfito a sulfato, e titula-se o iodo em
excesso por uma soluo de tiossulfato). Aps um certo intervalo de tempo em
que se mantm constantes as condies de aerao, colhe-se uma nova amostra e
determina-se novamente a concentrao de sulfito remanescente.
Atravs da estequiometria da reao de oxidao do sulfito a sulfato pelo
oxignio, imaginando-se que todo o oxignio dissolvido reage instantaneamente,
pode-se conhecer a velocidade de dissoluo do oxignio, ou seja:

Dessa forma, conhecendo-se a massa total de oxignio que foi transferido


para o volume total de reao, durante o intervalo de tempo entre as duas amostras, tm-se todos os dados para o clculo da grandeza n 0 , a da Eq. 14.4. Como,
em princpio, a concentrao do oxignio dissolvido, na soluo relativamente
concentrada de sulfito, pode ser desprezada, pode-se escrever:

n 0 , a=k 1 aHpg =KvPg

(14.6)

onde: Kv= coeficiente de absoro (g0 2 /m h atm)


Assim, prefere-se efetuar o clculo desse coeficiente de absoro, o qual engloba a constante de Henry para a soluo submetida aerao, ou seja, evita-se a
necessidade de conhecer a concentrao de oxignio na saturao. Caso a concentrao de oxignio dissolvido no seja nula, logicamente na Eq. 14.6 n 02a deve ser
dividido por (pg- p1), sendo p1 determinado a partir do sinal de um eletrodo.

290

Agitao e aerao em biorreatores

Uma dvida adicional seria quanto ao valor de Pg a ser utilizado para o clculo de Ky . Realmente, o gs que entra no reator diferente do gs que sai do sis. tema, pois oxignio foi transferido ao lquido. Uma forma seria considerar o reator
como homogneo e determinar a frao volumtrica de oxignio no gs efluente, o
qual seria representativo do gs que est trocando massa com o meio. Essa hiptese de homogeneidade difcil de ser aceita, especialmente para reatores de grande
porte, sendo mais conveniente calcular a mdia logartmica entre as presses parciais de oxignio na entrada e sada do reator, ou seja: lO
(14.7)

onde:

=presso parcial de 0 2 no gs de entrada (atm)


=presso parcial de 0 2 no gs de sada (atm)
Novamente a Eq. 14.7 foi escrita supondo o caso mais comum de se ter p1 =O
Pge

Pgs

atm.
Na Eq. 14.7 tem-se:
Pge =

(14.8)

Xoze(p + HL )
10,3

onde: x02 = frao molar ou volumtrica de 0 2 no gs que entra no reator


(0,209 para o ar)
P =presso interna no reator (presso atmosfrica+ sobrepresso na
cabea) (atm)
HL = altura da coluna lquida (m)
Pgs =

Xoze (1- E)P

(14.9)

Na Eq. 14.9 E representa a eficincia da transferncia de oxignio, ou seja:


E=

oxignio transferido
oxignio total introduzido

(14.10)

onde: V= volume de reao (m3 )


Q = vazo de aerao (CNTP) (m3 /h)
Nesse mtodo do sulfito necessrio lembrar que se est agitando e aerando
uma soluo de sulfito de sdio, a qual tem caractersticas distintas de um meio de
cultura que se pretende fermentar. Possivelmente a diferena mais importante
que se emprega soluo salina relativamente concentrada, o que significa um meio
no coalescente. Ou seja, as bolhas de ar, em seu trajeto entre o fundo e o topo da
coluna lquida, no se juntam, o que significa a possibilidade de manter uma elevada rea de transferncia de massa (a), o que pode no ocorrer em um meio de
cultura. Com isto, de uma forma geral, obtm-se valores da velocidade de transferncia maiores do que os observados durante um processo fermentativo (este ponto ser novamente abordado mais adiante).

Transferncia de oxignio e respirao microbiana

291

Alm disso, deve-se salientar que o mtodo do sulfito permite a determinao da mxima capacidade de transferncia de oxignio, pois se imagina nula a
concentrao de oxignio na soluo. Esse fato tem muita importncia quando se
empregam dados de transferncia obtidos pelo mtodo do sulfito, no projeto de
sistemas de agitao e aerao, para os quais se ter C t: O..
Mais recentemente, tm surgido algumas alternativas ao mtodo do sulfito
tradicional. Urna delas consiste em se dispor, no reator, de um eletrodo para a determinao da concentrao de oxignio dissolvido. Coloca-se no reator a soluo
do catalisador, praticando-se a aerao e a agitao a ser estudada, o que permite
calibrar o eletrodo na posio 100%. Ao se adicionar a soluo de sulfito de sdio,
mantendo-se a agitao e a aerao, ocorre um rpido decrscimo no sinal da sonda, at um valor prximo a zero. O sinal da sonda permanecer baixo enquanto
existir sulfito no oxidado no reator. No instante em que a sonda indicar um rpido sinal ascendente, isto ser devido ao trmino do sulfito de sdio.
Dessa forma, conhecendo-se a massa de sulfito adicionada e o tempo para a
sua completa oxidao, tem-se o dado necessrio para o clculo de Kv, havendo a
vantagem de no se necessitar colher amostras e realizar as titulaes com iodo.
Outro avano recente do mtodo do sulfito foi o proposto por IMAI et al. 11
Esses autores imaginaram efetuar o mtodo do sulfito em processo contnuo, ou
seja, alimentam o reator, submetido a aerao e agitao, com urna soluo de sulfito de sdio e catalisador em urna dada vazo, de forma a manter constante urna
certa concentrao de oxignio dissolvido indicada por um eletrodo. O balano
material, no estado estacionrio, para o sulfito de sdio, conhecendo-se as concentraes de sulfito na entrada e na sada do reator considerado h9rnogneo, permite
o clculo de kLa ou de Kv.
Sem dvida essa proposta de processo contnuo significa um av ano significativo para ~m todo do sulfito, pois permite o emprego de baixas concentraes do reagente, o que incide em economia para o processo, quando
imaginado para grandes reatores, alm de se obter v alores mais compatveis
com os sistemas reais, nos quais ocorre coalescncia de bolhas, conforme mencionado anteriormente ~
Outra estratgia existente para a determinao experimental de kLa a que
utiliza apenas o sinal de resposta de um eletrodo imerso no lquido submetido
aerao.
O ensaio tpico para a determinao de kta, pelo emprego de um eletrodo especfico para a medida da concentrao de 0 2 em um meio lquido (mtodo dinmico), consiste em inicialmente borbulhar nitrognio no lquido, a fim de eliminar
todo o Oi dissolvido, at que a sonda indique o valor zero.
A seguir, em um dado instante, inicia-se a aerao e a agitao do meio
lquido, nas condies em que se pretende obter o v alor dekLa, passando-se
ento a registrar o sinal da sonda . Esse sinal sair do valor zero, aumentando
at atingir a saturao, ou seja, at que o eletrodo indique o valor 100% (sonda
previamente calibrada no lquido saturado em 0 2 ) .

- ---

-~

-- ,

---- ------ - -----------

-- ~----~-----......--

---- - ------ --- - - - - - -- - -

- - - --- ---

2 92

Agitao e aerao em biorreatores

Nessas condies a Eq. 14.5 pode ser integrada, conhecendo-se a condio


inicial (t =O; C = 0), pois possvel separar as variveis:
dC = kLa dt, ou integrada
(Cs -C)
(14.11)

ou ainda:

_S_ =(1 -

cs

e - klat)

(14.12)

Observa-se pela Eq. 14.11 que ao se plotar ln(1- C/C 5 ) em funo do tempo
(t), a partir dos dados experimentais obtidos pelo ensaio descrito, deve-se obter
uma reta cujo coeficiente angular fornece o valor de kLa. Observa-se tambm que
no h a necessidade do conhecimento da concentrao de saturao (C 5 ) , mas das
fraes (C/C5 ), ou seja, o sinal da sonda previamente calibrada no intervalo de
zero a 100%, o que simplifica o clculo da grandeza desejada.
Na verdade, o valor de kLa estaria correto, caso a sonda apresentasse um perfeito acompanhamento do aumento da concentrao de 0 2 no lquido, o que pode
no ocorrer em virtude do atraso no sinal.
Esse atraso devido necessidade de o 0 2 dissolvido no seio lquidoter de
se difundir atravs da membrana do eletrodo, que isola o meio lquido da superfcie do catodo (onde o oxignio reduzido gerando o fluxo de eltrons), alm de se
poder considerar, ainda, um filme lquido estagnado, dependendo da condio de
agitao empregada (e, portanto, da velocidade de passagem de lquido pela superfcie do eletrodo), atravs do qual o 0 2 deve se difundir.
Justamente com o objetivo de corrigir esse atraso da sonda, AIBAet al. 10 propuseram que o sinal da sonda (Cp), varie no tempo proporcionalmente diferena
entre a concentrao real de0 2 (C) e o sinal (Cp), ou seja:

dCP

ili =kp (C -CP)

(14.13)

onde: CP= sinal do eletrodo (CP= O para t =o e CP= C5 para t = oo)


kP =constante de atraso do eletrodo (h-1)
Introduzindo-se na Eq. 14.13 o valor de C em funo do tempo, obtido a partir da Eq. 14.12 e, agora, integrando-se a equao resultante, obtm-se:
(14.14)
Observa~se, na Eq. 14.14, que para valores de kP muito maiores do que kLa,
esta equao retoma Eq. 14.12, ou seja, no haveria a necessidade de corrigir o
sinal do eletrodo

Transferncia de oxignio e respirao microbiana

293

De qualquer forma, possvel ajustar a Eq.14.14 aos dados experimentais (CP= f(t)), obtendo-se o valor correto de kLa, desde que se conhea o valor de
kp.
Essa constante de atraso do eletrodo pode ser determinada atravs de um
ensaio em degrau, ou seja, equilibrando-se a sonda em um lquido submetido a
borbulhamento com nitrognio (sonda indicando o valor zero) e, a seguir, retirando-se a sonda deste lq.ido e introduzindo-a imediatamente em um lquido
saturado em 0 2 (caso se pretenda determinar apenas o atraso da sonda sem a interferncia do filme lquido, este deve estar intensamente agitado, ou, ainda, pode-se equilibrar a sonda em atmosfera de nitrognio gasoso e, a seguir, exp-la
ao ar atmosfrico). Nessas condies tem-se desde o instante t =O do degrau que
C= c. e, portanto, na Eq. 14.13 fica-se com:

a qual integrada fornece:


(14.15)

A Eq. 14.15 mostra que plotando-se os valores de ln(1 - Cp/C.), em funo


do tempo, obtidos no ensaio em degrau, deve-se obter uma reta; cujo coeficiente
angular permite a obteno do valor de kP.
bastante freqente contar-se, como informao do fabricante do eletrodo, que uma sonda razoavelmente rpida permite a obteno de 90% da resposta em 20 segundos, no teste em degrau. Ora, essa informao pode ser entendida como atribuir-se, na Eq. 14.15, o valor (C~ / C.)= 0,9 para t = 20 s (lembrando-se que a reta passa pela origem, pois (Cp/C.)= O para t = 0), o que permite a traduo da informao para o valor de kP = 0,12 s- 1, ou kP = 414,6 h-1
Apenas como ilustrao, possvel simular as Eqs. 14.12 e 14.14, a fim
de se observar a variao da concentrao real de 0 2 dissolvido (C) e da concentrao prevista pela sonda (Cp), em funo do tempo, para determinados
valores de kLa e kP. Tais simulaes esto indicadas na Figura 14.4, na qual se
pode ter uma clara idia a respeito da importncia de se efetuar esta correo.
Assim sendo, possvel, a partir das equaes anteriores, gerar curvas
semelhantes s da Figura 14.4 para distintos valores de kLa. Tal procedimento
permite concluir que, com uma sonda que apresente um kP da ordem de 400
h- 1, pode-se estimar, com uma razovel preciso, sem a necessidade de efetuar
correes, valores de kLa inferiores a 200 h- 1 . Acima desses valores de kLa, os
erros tornam-se muito elevados, exigindo que se efetue a correo proposta
pela Eq. 14.14.

294

Agitao e aerao em biorreatores

C/Cs; Cp/Cs

1,2.-~~------------------------------------

1,O

kLa= 400 1/h


kp= 414,6 1/h

Cp/Cs

20

10

30

40

Tempo (s)

Figura 14.4 -Variao no tempo da concentrao real de 0 2 dissolvido (C/C,) e sinal do eletrodo (CpiCJ durante a
execuo do mtodo dinmico.

14.4.2 - Respirao microbiana


No item anterior buscou-se abordar as bases tericas que permitem o estudo da transferncia do oxignio do ar para o meio lquido, havendo agora a necessidade de abordar o problema do consumo do oxignio dissolvido, ou seja, da
respirao microbiana.
Inicialmente necessrio definir o que se entende por velocidade especfica
de respirao(Q 02 ), como sendo:
(14.16)

onde: Q02 = velocidade especfica de respirao (g0 2 / gcel h)


X= concentrao celular (gcel/m 3 )
(d02 /dt)=velocidade de consumo de 0 2 {g02 /m3 h)
Na verdade, esta grandeza Q02 introduz, na presente discusso, a caracterstica biolgica do sistema em estudo, pois ela depende do microrganismo empregado, assim como da composio do meio e das condies de fermentao (pH,
temperatura, etc.).
O valor de Q02 , para um dado microrganismo, funo da concentrao de
oxignio dissolvido no meio lquido (C), seguindo uma equao tipo Monod, ou
seja:
Q02

.= Q02max

o+ C

(14.17)

29 5

Transferncia de oxignio e respirao microbiana

onde: Q02 mx = mximo valor de Q02 (g0 2 / gcel.h)


3
K 0 =constante de saturao para o 0 2 (g0 2 /m )
A Figura 14.5 ilustra a variao de Q02 com a concentrao de oxignio dissolvido no meio, segundo o proposto pela Eq. 14.17.

C(mgOt'L)

Figura 14.5 - Representao esquemtica da variao de Q02 com C, segundo a equao de Monod.

Nessa figura observa-se que acima de uma dada concentrao de 0 2 dissolvido, definida como concentrao crtica (Ccri 1), o valor de Q02 constante e mximo. Isso significa que o dimensionamento de um sistema de agitao e aerao,
caso tenha como objetivo, permitir a mxima velocidade especfica de respirao
(situao muito freqente), deve buscar a manuteno da concentrao de 0 2 dissolvido acima da concentrao crtica, a fim de que o 0 2 no seja limitante.
Alguns valores de Ccrit existem na literatura, como os exemplificados na
Tabela. 14.2. 3
Tabela 14.2 - Valores da concentrao crtica de 0 2 dissolvido para alguns microrganismoP>.

Temperatura (C)

Ccrit (mg/L)

Escherichia c.oli

37,8

0,26

Serratia marcescens

-,
,,,

31,0

0,48

Levedura

34,8

0,15

24,0

0,70

30,0

0,29

Microrganismo

P. chrysogenum
Aspergillus oryzae
~'$C.P;

,,,

30,0

,-

'

.RI ~......

0,64
<

,,;::._......

--~~.. ~L c~.:

j,~

.,1

I.,~
1.~

296

Agitao e aerao em biorreatores

Como se pode observar, os valores de Ccrit situam-se entre 0,3 e 0,7 ppm, ou
seja, valores abaixo de 10% da concentrao de saturao (da ordem de 7 ppm, a
35C e 1 atm, empregando-se ar atmosfrico- Tabela 14.1). So valores portanto
extremamente baixos, o que indica igualmente valores muito baixos para a constante de saturao (K0 ).
Caso a produo de um dado produto seja mxima para condies de limitao de oxignio dissolvido (entre zero e 10% da saturao), isto significa uma certa
dificuldade no controle da concentrao de 0 2 dissolvido dentro destes limites
bastante restritos. Normalmente esse tipo de condio obtido naturalmente,
atravs da imposio de uma transferncia de 0 2 sabidamente insuficiente para a
manuteno de Q02max
necessrio mencionar que esses valores de ccrit so caractersticos de clulas que crescem isoladamente. No caso de microrganismos que crescem na forma
de grumos, ou "pellets", como o caso de fungos filamentosos, essa concentrao
crtica pode atingir valores da ordem de 30 a 50% da concentrao de saturao.
Obviamente, para esses casos, a situao tambm mais complicada, pois para se
poder manter altas velocidades especficas de respirao, so necessrias altas
concentraes de 0 2 dissolvido, a fim de que o 0 2 possa ser transportado para o
interior dos flocos ou grumos.
Conforme comentado anteriormente, no apenas a concentrao de 0 2 dissolvido que interfere em Q02, mas tambm as demais condies de cultivo. Portanto, mesmo intuitivamente, pode-se entender que clulas que estejam crescendo em
altas velocidades tm de apresentar elevadas velocidades de consumo da fonte de
carbono, assim como elevadas velocidades de respirao, conforme indicado anteriormente.
Essa reflexo permite concluir que deve existir uma relao entre a velocidade especfica de respirao (Q 02 ) e a velocidade especfica de crescimento (J.t). Normalmente admite-se a existncia de uma relao linear, conforme svgerido por
PIRT( 12>, ou seja:
(14.18)

onde: m0 = coeficiente de manuteno para o 0 2 (g0 2 / gcel h)


Y 0 =fator de converso de 0 2 para clulas (gcel/ g02 )
1
Jl = (1/X)(dX/dt) =velocidade especfica de crescimento (h- )
X= concentrao celular (gcel/L)
Esse coeficiente de manuteno (m 0 ) significa a velocidade especfica derespirao para Jl = O, ou seja, a velocidade especfica de consumo de 0 2 para manter
as clulas viveis.
Um exemplo cie aplicao da Eq.14 .18 foi propiciado por FACHINI, 13 durante cultivos descontnuos de Asprgillus awamori NRRL 3112 em distintas

Transferncia de oxignio e respirao microbiana

297

condies de transferncia de oxignio. Esse autor obteve um valor mdio para m0


da ordem de 2 mmol0 2 / gcel h e 1,55 gcel/ g02 como representativo de Y 0 . No entanto, deve-se salientar que os valores de m0 variaram de 1,5 a 4,1 mmol0 2 / gcel h
para os diferentes cultivos, enquanto que os valores de Y 0 apresentaram uma maior
constncia, sugerindo que os valores maiores de m0 foram observados para as condies de transferncia de oxignio mais intensas.

14.4.3 - Anlise co'njunta da transferncia e consumo do oxignio


Durante o cultivo de um dado microrganismo, efetua-se a transferncia de
oxignio da fase gasosa para a fase lquida, enquanto que, simultaneamente, o microrganismo consome o 0 2 dissolvido. Assim sendo, o equacionamento mais adequado surge atravs de um balano de oxignio no meio lquido, ou seja:
(14.19)
A Eq. 14.19 indica que a variao da concentrao de oxignio dissolvido no
lquido (dC/ dt) o resultado da diferena entre a quantidade de 0 2 que se consegue dissolver (kLa (C.- C)) e o oxignio consumido pelas clulas (Q 02 X). No caso
de um processo fermentativo contnuo, dever-se-ia ainda considerar o 0 2 que entra no reator com o meio de alimentao (DC., onde D = vazo especfica de alimentao) e o 0 2 que sai do reator com o lquido fermentado (DC). No entanto,
estas parcelas adicionais so freqentemente desprezadas, pois so muito pequenas em relao s demais.
necessrio lembrar que a cintica de um dado cultivo est amplamente
contemplada na Eq.14.19, pois X ir variar com o tempo e Q02 varia com fl (Eq.
14.18).
Dessa forma, considerando um processo fermentativo descontnuo, fcil
compreender que, no instante inicial, tem-se uma baixa concentrao celular (X0 )
e, como o cultivo -poder contar com uma fase lag (f.l=), ter-se- tambm o mnimo valor para Q 02 (= m0 ), o que significa a necessid~de de baixs transferncias de
0 2 a fim de satisfazer a esta pequena demanda (m 0 X0 ) . No entanto, com o decorrer
do tempo X ir aumentar, ocorrendo o mesmo com o valor de Q02 , o qual atingir
o seu mximo valor na fase exponencial (f.l = f.lmx). A seguir, Q02 dever diminuir
com o valor de fl, mas ainda se observar um aumento em X, devendo, portanto,
ainda ocorrer um aumento na demanda Q02 X, a qual dever atingir o mximo valor para instantes posteriores fase exponencial, passando ento a decrescer.
Claro est que o sistema de transferncia de 0 2 dever ser dimensionado de
forma a atender mxima demanda, caso se pretenda manter o cultivo em condi. es no limitantes em termos de oxignio dissolvido.
Dentro dessa idia, a Figura 14.6 procura ilustrar duas possibilidades de
operao, devendo-se informar que esta figura foi elaborada a partir de dados experimentais13 obtidos durante o cultivo de Aspergillus awamori, durante o qual no
se observou fase exponencial, sendo os valores de Q02 calculados a partir da Eq.
14.18. Ainda, saliente-se que as escalas foram tornadas relativas, pois os valores
absolutos no so necessrios dentro da presente discusso.

298

Agitao e aerao em biorreatores

O primeiro estilo de operao seria imaginar a existncia de um eletrodo


para a medida da concentrao de 0 2 dissolvido, sendo o seu sinal empregado
para uma ao de controle, a fim de manter constante esta concentrao (variando
a freqncia de agitao e a vazo de aerao). Nessa situao, na Eq. 14.19 como
C constante dC/ dt nulo, podendo-se escrever:
(14.20)

onde: Cc =valor constante estipulado para C (exemplos Cc = 0,2


14.6, ou CC= ccrit) (g02/m3 )

c. conforme Fig.

ou ainda:
(14.21)

Observa-se, pela Eq. 14.21, que para manter C= Cc deve-se variar kLa proporcionalmente a Q02 X, tendo em vista que a grandeza c. - Cc constante, desde que
no se varie a presso parcial de 0 2 no gs empregado na aerao. Isso pode ser
verificado na Figura 14.6, na qual tambm pode-se observar que o mximo valor
de kLa atingido para o mximo valor de Q02 X.
1,2

X,~ot,

Q02X,C (esc . rei.)

C(kla cte)

0,8

0,8
0,6
0,6

0,4
0,2

Tempo (escala rei.)

Figura 14.6 - Ilustrao de duas possveis formas para projetar um sistema de transferncia de 0
kLa varivel, ou com kLa = cte. e C varivel com o mnimo fixado em 0,2
(vide texto).

c.

2:

com C = cte. e

A conseqncia imediata dessa estratgia de operao a necessidade de investimento em sistema de controle, ao lado de uma evidente economia de energia, a
fim de manter o processo na condio desejada. De fato, no incio dever-se- agitar
e aerar muito pouco, pois a demanda baixa, conforme indicado anteriormente.
Apenas se utilizaria a mxima energia no instante da mxima demanda.

Transferncia de oxignio e respirao microbiana

299

A segunda opo seria calcular o valor de kLa para o instante de mximo valor de Q02 X, atravs da Eq. 14.21, praticando este valor (traduzido por um certo
valor da freqncia de agitao e uma dada vazo de aerao) desde o incio do
processo. Nesse caso, C variar com o tempo, atingindo o valor mnimo (Cc) no
instante de mximo Q02 X (Fig. 14.6).
De fato, a partir da Eq. 14.19, desprezando-se o valor de dC/ dt, pode-se escrever:

~ = 1 _ Qo, X
C5

(14.22)

kLaC 5

Essa Eq. 14.22 indica a variao de C (ou C/C.) em funo de Q02 X, ou seja,
em funo do tempo, com um valor constante de kLa.
Obviamente, nessa segunda opo se estaria gastando mais energia e, por
outro lado, investindo menos em controle.
Na realidade, dificilmente observa-se um valor constante de kLa ao longo de
um processo fermentativo, mantendo-se fixas as condies de aerao e agitao,
pois a atividade microbiana vai provocando alteraesnas caractersticas do meio
(por exemplo, aumento da viscosidade), o que freqentemente contribui para uma
reduo de kLa (diminuio da difusividade do 0 2, aumento da espessura do filme
lquido estagnado e aumento da tendncia de coalescncia de bolhas). Por outro
lado, a necessidade da adio de antiespumantes freqentemente contribui para a
reduo de kLa, em virtude de introduzir uma resistncia adicional na interface
gs-lquido.
Todos os fatos apontados indicam a clara necessidade de se determinar os
valores de kLa e Q0 2 durante um processo fermentativo, a fim de se contar com dados confiveis para o correto dimensionamento de um sistema de transferncia de
z.

14.4.4 - Determinao de kLa e Q 02 durante o processo fermentativo


As metodologias descritas no item 14.4.1 para a determinao de k1 a sem a
presena de microrganismos, encontram importncia especialmente quando se
pretende comparar o desempenho de diferentes sistemas de agitao e aerao.
No presente item h a preocupao em descrever alguns mtodos para a quantificao de k1 a e Q02 durante um processo fermentativo, ou seja, na presena de microrganismos.
Um dos mtodos mais utilizados para realizar essa tarefa, o que emprega
uma sonda para a determinao da concentrao de 0 2 dissolvido, conhecido
como mtodo dinmico.14
Nesse mtodo, em um dado instante de um processo fermentativo (t 0 ), interrompe-se a aerao, de forma a anular a transferncia de oxignio, conforme
ilustrado na Figura 14.7. Recomenda-se tambm reduzir a freqncia de agitao, a fim de reduzir ao mximo a transferncia de 0 2 na superfcie do lquido,
mas isto deve ser executado com cautela, pois esta reduo pode causar uma baixa velocidade de lquido na superfcie do eletrodo, o que pode causar um atraso
exagerado de sinal.

-----------

~-~-- -. -- --------.....,..---:

--.- -

----- ---------

--- -----.. ~- ---

-.-~ ------

-,-----------

-~--

------

--;-------------------------:---- --- ------------- ------------ ---.

300

Agitao e aerao em biorreatores

Cone. 02 dissolv.(c
Co

Co 1----r---.

Co1 --------

''

------------------

1to

t1
Tempo

Figura 14.7 - Variao da concentrao de 0 2 dissolvido" com o tempo, durante a execuo do mtodo dinmico.

Como se observa na Figura 14.7, a concentrao de 0 2 dissolvido C0, que estava ocorrendo no instante inicial, comea a diminuir, sendo que o sin-1 da sonda
deve ser registrado continuamente. Ao se atingir um certo valor C01 (instante t1 ),
retoma-se a agitao e a aerao, nas condies que estavam sendo praticadas, observando-se, ento, o aumento da concentrao de 0 2 dissolvido, at atingir-se novamente o valor anterior C0
Tal procedimento deve levar um tempo relativamente curto, no demandando mais do que alguns minutos para sua execuo, tempo este que depende obviamente do instante da fermentao, ou mais propriamente da concentrao celular
existente. Assim sendo, dentro desse curto intervalo de tempo, pode-se supor que
no haja alterao da concentrao celular (X), assim como deve ser mantido constante o valor de Q 02, no permitindo que a concentrao de 0 2 atinja valores abaixo da concentrao crtica (deve-se manter c> ccrit).
Nessas condies, para o trecho sem aerao, deve-se observar, a.partir da
Eq. 14.19, que:

dC
(14.23)
-=-Q02X
dt
Conforme comentado anteriormente, o produto Q02 X deve ser constante
durante esse intervalo de tempo, o que permite a integrao da Eq. 14.23, obtendo-se:
(14.24)
A Eq. 14.24prev que a partir do instante t0 (C= C0 ), deve ocorrer uma variao linear de C com o tempo, reta esta cujo coeficiente angular igual a
(-Q02 X), resultando, assim, determinado o valor de Q 02 conhecendo-se o valor de
X neste instante. Conforme se pode observar na Figura 14.7, no ocorre relao
linear desde o instante da interrupo da aerao, pois h um certo perodo em
que ainda existem bolhas de ar no seio lquido e, portanto, ainda ocorre alguma
transferncia de 0 2

Transferncia de oxignio e respirao microbiana

30 I

Uma vez conhecido o valor de Q02 X, possvel efetuar o clculo de kLa de


duas formas distintas.
A primeira delas consiste em imaginar que a concentrao de 0 2 dissolvido
ao longo do processo fermentativo, varia muito lentamente, esperando-se que ao
final da aplicao do mtodo dinmico, a concentrao de 0 2 dissolvido volte ao
valor original C0 Assim, supondo estado estacionrio em relao a C, pode-se fazer novamente (dC/dt) =O na Eq. 14.19, o que significa considerar a Eq. 14.21 e,
portanto:
(14.25)

Essa metodologia de clculo apenas deve ser aplicada para os instantes


em que j se tenham valores de C0 razoavelmente abaixo de C5 (por exemplo valores de C0 < 0,8 C5 ), caso contrrio passa-se a obter valores de kLa absurdamente altos, pois se est dividindo Q02 X por valores muito baixos e, ainda, possivelmente afetados por erros de medida .
A segunda forma para o clculo de kLa, e a mais adequada, consiste em empregar os dados obtidos no trecho ascendente da concentrao de 0 2 dissolvido,
durante o qual a Eq. 14.19 aplica-se na ntegra. Assim, rearranjando a Eq. 14.19 obtm-se:
(14.26)

Admitindo-se, nova~ente, estado estacionrio na Eq. 14.19, no patamar que


antecede a interrupo da aerao (C= C0), pode-se demonstrar que:
(14.27)

Introduzindo-se a Eq. 14.27 na Eq. 14.26, fica-se com:


dC
= kta(Co -C)
dt

(14.28)

Essa equao pode ser integrada, lembrando que para o instante inicial de
retomada da agitao e aerao, ou seja, para t = t 1 tem-se C = C011 obtendo-se:

(14.29)

----:-.------ --~

---- .- ---

--:---~--

-------------- -- -- - ... ...._......... --- - - - -

-~ --- --

302

Agitao e aerao em biorreatores

Dessa forma, plotando-se C = J(t), conforme proposto pela Eq. 14.29, obtm-se urna reta, cujo coeficiente angular permite o clculo de kLa. Na realidade,
aqui tambm ocorrer um certo perodo transitrio, no qual as bolhas de ar ainda
no esto ocupando o volume total de reao, de forma a se verificar a relao linear apenas para instantes ligeiramente posteriores retornada da aerao. Note-se tambm que a Eq. 14.29 pode ser usada justamente para explicitar C em funo do tempo.
Deve-se observar que nas consideraes anteriores no se levou em considerao o possvel atraso na resposta do eletrodo, conforme efetuado na determinao de kLa na ausncia do microrganismo.
bvio que essa abordagem adicional agora mais complicada, mas pode
ser realizada de algumas maneiras distintas.
Inicialmente, ao se empregar o trecho descendente para o clculo de Q02 X,
possvel imaginar que o atraso da sonda possa causar determinaes afetadas de
erro. No entanto, desde que se empregue sondas em boas condies e suficientemente rpidas, est demonstrado na literatura (e tambm ser visto mais adiante)
que a reta obtida com o sinal da sonda CP =J(t) paralela reta da concentrao
real C= J(t) e, portanto, o coeficiente angular continua a fornecer o valor correto
de Q02X. Para verificar essa informao, sugere-se a leitura dos artigos de
KOIZUMI;AIBA 15 e de YANG et al. 16
Alternativamente, pode-se raciocinar segundo proposto por BADINO Jr. et
al., 17 que consiste em retornar a sugesto de equacionarnento proposta por AIBA et
al., 10 considerando que a resposta do eletrodo possa ser descrita segundo a Eq.
14.13.
Para tanto, retornando a Eq. 14.24 e fazendo-se t 0 = O (instante inicial da interrupo da aerao) e introduzindo o valor de C na Eq. 14.13, fica-se com:
(14.30)

Essa equao pode ser integrada, fornecendo:

1
Cp =C 0 -Q02 X[t- _!__
k +k
kt
p

p *CP

(14.31)

onde: C0 = Cpo = concentrao real de 0 2 antes da interrupo da aerao,


coincidente com o sinal do eletrodo.
A Eq. 14.31, a qual obviamente leva em conta a constante de atraso da sonda, porm no considera o transiente antes mencionado (existncia de bolhas de
ar nos instantes irnediatarnenteposteriores interrupo da aerao), prev que
para tempos elevados no ensaio (o termo 1 I kPekp.t seria desprezvel), obter-se-ia
urna reta paralela representada pela Eq. 14.24, podendo-se portanto estimar o
valor de Q02 X atravs do sinal do eletrodo (CP = f(t)). Igualmente, para valores
elevados de kP (sonda rpida), as Eqs. 14.24 ~.14.31 ~eriarn coincidentes.

Transferncia de oxignio e respirao microbiana

303

Na Figura 14.8 indica-se o ajuste da Eq. 14.31 a dados experimentais, durante o cultivo de Aspergillus awamori, assim corno a reta prevista pela Eq. 14.24.
Corno se pode notar, o ajuste excelente, apesar de no se considerar o perodo
transitrio.
A fim de efetuar o clculo de kLa, levando em conta o atraso da sonda, pode-se empregar estratgia semelhante descrita acima, considerando o trecho ascendente da concentrao qe 0 2 dissolvido.
CP (mmoL I L)
0,20 ,-------,------,,------.-----.--.------.---,-----,

0,15
Eq .14.24
Eq .14.29

" "-"

0,10

- 0,05

Eq .14.31

/.

- - - - I

"-"' "-.
-

Ar

Ar

desligado

ligado

I,

Eq .14.33

oo,

Ponto de inflexao

- I_

-'-

'

to

o,ooL---L-~L--~~~~-~--L--L--~

20

40

60

80

Tempo (s)

Figura 14.8 - Dados experimentais do mtodo dinmico (o), aplicado em um dado instante de um cultivo de
Aspergil/us ONamori. As curvas traadas correspondem s equaes indicadas (vide texto) .

. De fato, retornando a Eq. 14.28 e efetuando-se a integrao a partir do instante t 2 =O, cuja concentrao de 0 2 dissolvido C02, fica-se com:
(14.32)
Pode-se agora substituir este valor de C na Eq.14.13 e, em seguida, integrar a
equao resultante, obtendo-se:
C -C
P

02 e

-kp t

k (C -C 02 ) ( -kpt
+ C 0 (1 -e -kpt) + p o
* e -e -kl at)
k p -k L.a

(14.33)

onde: Cpoz = sinal d sonda no instante t 2 = Oconsiderado para a integrao


C02 = concentrao real de 0 2 no instante t 2 = O
C0 = Cpo = concentrao de 0 2 antes da interrupo da aerao
(a concentrao real coincide com o sinal do eletrodo)
A Figura 14.8 mostra o ajuste da Eq. 14.33 aos dados experimentais obtidos
durante um ensaio de cultivo de Aspergillus awamori, a partir do qual pode-se estimar os valores de kLa e C02 (a qual no conhecida, pois a concentrao real),

304 . Agitao e aerao em biorreatores

conhecendo-se os valores de kp (determinado previamente com ensaio em degrau), C0 e CP 02 . O ajuste pode ser realizado atravs da rotina de Marquardt para a
estimativa de parmetros, sendo o instante inicial de integrao escolhido (t 2) o
correspondente ao ponto de inflexo da curva ascendente de Cp=f(t), a fim de evitar o perodo transiente j mencionado. Observe-se, tambm, a partir da Eq.14.33,
que o valor de kLa pode ser determinado diretamente a partir do sinal do eletrodo,
sem a necessidade do conhecimento de C5 , pois todos os termos desta equao podem ser divididos por C5 .
Outra interessante forma de se efetuar a determinao de kLa e Q02, atravs
do mtodo dinmico levando em conta o atraso do eletrodo, mediante a proposta elaborada por MIGNONE;ERTOLA 18 e MIGNONE, 19 a qual deve ser examinada
pelo leitor interessado em aprimorar este tipo de metodologia.
De qualquer maneira, para a aplicao do mtodo dinmico, h a necessidade de se contar com valores relativamente elevados da concentrao de
oxignio dissolvido no meio no instante em que se pretende aplicar o mtodo
(C 0 ). Isso ocorre, pois no se deve permitir que esta concentrao caia abaixo
da concentrao crtica, a fim de manter constante o valor de Q02 das clulas
presentes.
Esse fato limita a aplicao dessa metodologia, para instantes adiantados de
urna fermentao, quando o 0 2 dissolvido j esteja baixo e, assim, no se pode cortar a aerao, sem o risco de se ter C<Ccrit
Alm disso, todos os mtodos que empregam eletrodos tm o inconveniente
de se colocar este eletrodo em urna dada posio no interior do reator. Assim sendo, a determinao efetuada vlida para o ponto de medida e, normalmente, extrapola-se o valor de kLa para todo o reator.
No caso de reatores de pequenas dimenses, essa extrapolao bastante razovel, tendo em vista a possibilidade de consider-lo corno homogneo. No entanto, para reatores de porte rncl,io ou grande (milhares de litros), a considerao
de reator homogneo difiCilmente verdadeira, o que torna estas metodologias

passveis de crticas.
Urna alternativa aos eletrodos imersos no lquido a realizao de medidas nos gases afluente e efluente do reator, o que permite a execuo de balanos
gasosos e o clculo de kLa e Q02 . Para tanto, necessita-se monitorar com preciso
as vazes de entrada e sada de gases no reator, alm do teor de 0 2 e C0 2 nestes
gases.
Normalmente empregam-se os analisadores pararnagnticos para a monitorao de 0 21 e os analisadores infravermelho para a medida do C02 Alternativamente, pode-se tambm empregar sondas para medir o teor de 0 2 em um gs
efluente, o que conta com a vantagem de serem equipamentos de baixo custo, mas
s vezes questionados quanto sua preciso.
Em todo caso, as medidas efetuadas nos gases efluentes so, em princpio,
mais recomendveis, pois podem ser feitas sem assepsia, permitindo as freqentes
calibraes e manutenes dos instrumentos de medida, o que obviamente no
possvel com os sensores imersos no meio lquido.

Transferncia de oxignio e respirao microbiana

305

Imagine-se um reator de volume til V, que esteja recebendo uma dada vazo de ar, podendo-se medir o teor de oxignio na entrada e na sada deste reator.
O balano para o oxignio no gs, fornece:
Xo2e~ge -Xo2s ~gs =kLa(C s -C)V

(14.34)

onde: x02e = frao molar ou volumtrica de 0 2 no gs de entrada


~ge =vazo molar de gs na entrada (mol gs/h)
xa2s = frao molar ou volumtrica de 0 2 no gs de sada
~gs =vazo molar de gs na sada (mol gs/h)
V = volume de lquido no reator
Por outro lado, j se sabe que o balano de 0 2 no lquido fornece:
(14.35)
Introduzindo-se a Eq.14.34 na Eq.14.35, obtm-se:
(14.36)
Na Eq. 14.36 pode-se novamente imaginar que a variao da concentrao
de 0 2 dissolvido em funo do tempo seja pequena ao longo do processo, o que
significa escrever que (dC/dt)=O (hiptese esta que a rigor no necessria, desde
que se disponha do registro de C=f(t) e se calcule o valor de d/ dt no instante da
realizao do balano), obtendo-se ento:

(14.37)

As vazes molares podem ser convertidas em vazes volumtricas, lembrando-se que:

~=QP

RT

onde: Q =vazo volumtrica do gs (m 3 / h)


P = presso total do gs (atm)
R= constante universal dos gases (m3.atm/mol.K)
T = temperatura absoluta do gs (K)
Assim, na Eq.14.37,fica-se com:
(14.38)

306

, Agitao e aerao em biorreatores

onde: P. =presso do gs na entrada do reator (atm)


T. = temperatura do gs na entrada do reator (K)
Qge =vazo volumtrica de gs na entrada do reator (m 3 /h)
P. =presso do gs na sada do reator (atm)
T. = temperatura do gs na sada do reator (K)
Qgs =vazo volumtrica de gs na sada do reator (m3 /h)
Atravs da Eq. 14.38 possvel calcular Q 02 X, desde que se disponha das
grandezas nela indicadas. Particularmente, deve-se salientar que na entrada do
gs (onde x02.=0,209, caso se esteja empregando ar atmosfrico sem enriquecimento com 0 2 ) a presso total (P.) consiste na somatria da presso atmosfrica,
da presso na cabea do reator e da presso exercida pela coluna de lquido no
reator, conforme indicado na Eq. 14.8. Essa coluna lquida, que pode ser desprezada para pequenos reatores de bancada, no pode ser desconsiderada para reatores de grande porte, para os quais pode-se ter vrios metros de altura (8 m, por
exemplo).
Caso se possa admitir que as vazes molares de entrada e sada sejam iguais
(o que significa imaginar que cada molde 0 2 consumido gere um moi de C02, ou
seja, que o coeficiente respiratrio RQ=(Qco2 /Q 02 )=1, onde Qcoz=(1/X).(dC02 /dt),
sendo que experimentalmente com freqncia observam-se valores superiores
unidade, como por exemplo 1,1, ou mesmo superiores), alm de se admitir que os
gases de entrada e sada estejam na mesma temperatura e presso (desprezando-se' a coluna lquida), ento resulta igualdade das vazes volumtricas e, portanto, na Eq. 14.38 fica-se com:

(14.39)

bvio que a Eq. 14.39 bem mais simples do que a Eq. 14.38, mas preciso
prestar ateno nas simplificaes introduzidas.
Caso se esteja utilizando ar atmosfrico e se possa dispor da medida da frao molar de 0 2 no gs efluente (x02.) e, simultaneamente, da frao molar de C02
neste gs (xc 02.), pode-se efetuar um balano de nitrognio (componente inerte),
obtendo:

onde:

= frao molar de N 2 na entrada


=frao molar de N 2 na sada
<D.r =vazo molar de ar na entrada do reator (mol/h)
xN2e

XN2s

Transferncia de oxignio e respirao microbiana

307

ou, ainda, pode-se escrever:

e, finalmente:
(14.40)

onde:

X CO , S = frao molar de C02 na sada.


Logo, possvel calcular ~gs' desde que se disponha adicionalmente de
xc 025 , no havendo assim a necess1dade de medir esta vazo.
Saliente-se, ainda, que a disponibilidade de xc 025 (considera-se, normalmente, desprezvel o teor de C02 no ar de entrada) permite a realizao do balano gasoso para o co2 e, portanto, o clculo de Q02t desde que se admita coeficiente respiratrio RQ igual a um, conforme discutido acima . Essa uma alternativa
possvel, lembrando a maior robustez dos analisadores de C02 .
Quanto determinao de kLa, esta realizada imaginando-se estado estacionrio para C, ou seja, atravs da Eq. 14.25, lembrando a restrio acima mencionada
sobre a necessidade de se contar com um_a concentrao de 0 2 dissolvido razoavelmente distinta da concentrao de saturao, a fim de no se superestimar o valor
de kta
O emprego do balano gasoso uma ferramenta bastante conveniente, pois
alm das vantagens acima indicadas sobre a efetivao da medida fora do reator,
ainda se est analisando o reator como um todo e no efetuando uma leitura em
um certo ponto do reator. Adicionalmente, essa metodologia no interfere na operao do reator, pois nad alterado em termos de sua conduo, no havendo necessidade d~ alterar vazo de ar ou freqncia de agitao.
Trata-se, portanto, de uma medida "on-line", que conta com o inconveniente, como as anteriores, de se necessitar do conhecimento de X para se saber o valor
de Q 02 . No entanto, o valor da grandeza Q 02 X j extremamente til, em termos
de controle do processo.

Um outro problema dessa metodologia refere-se quantificao das diferenas entre as fraes molares de 02 e co2 dos gases de entrada e sada do reator,
para os instantes iniciais do processo fermentativo. De fato, para esses instantes,
normalmente a concentrao celular baixa, havendo um baixo consumo de 0 2 e,
por conseguinte, um gs efluente com composio muito prxima ao gs de entrada. Isso dificulta uma boa estimativa de Q02 X, o que, ao lado da problemtica da
determinao de baixas concentraes celulares, impede que se obtenha bons valores para Q 02 .

Essa observao de importncia para o emprego do balano gasoso de uma


forma geral, pois o uso de elevadas vazes de aerao pode tambm expandir essa
dificuldade para todo o processo fermentativo recomenda-se empregar baixas vazes especficas de aerao (=relao Q/V), como, por exemplo, 0,2 vvm (volume
de ar por volume de meio por minuto), em vez de 1,0 vvm como usual em pequenos reatores de bancada.

308

i1

!i

Agitao e aerao em biorreatores

Claro est que se a estimativa de Q02 X ruim, por se ter gases de entrada e
sada muito semelhantes, isto freqentemente tambm significa ter C:C5 , o que inviabiliza as estimativas de kLa .
Deve-se lembrar que, quando se discutiu o mtodo dinmico (uso de eletrodos no lquido), um srio problema residia em haver dificuldades para os instantes adiantados do processo fermentativo, quando a concentrao celular fosse
elevada, pois a concentrao de 0 2 no lquido pode atingir valores reduzidos.
No entanto, para os instantes iniciais tem-se baixos valores de X e elevados
valores de C, o que permite a realizao do mtodo dinmico, com relativa facilidade. Adicionalmente, os baixos valores de X, causam um decrscimo lento da
concentrao de 0 2 dissolvido, quando se interrompe a aerao, o que facilita o
monitoramento de C atravs do sinal do eletrodo CP. Quando se retoma a aerao,
no entanto, verifica-se um rpido aumento em C, o que continua a exigir o emprego das metodologias para a correo do sinal do eletrodo.
De qualquer maneira, o exposto acima permite concluir que o mtodo dinmico e o balano gasoso, enquanto duas metodologias distintas para as determinaes de kLa e Q02 , so na realidade complementares. O mtodo dinmico aplica-se
bem no incio de um processo descontnuo, ou para processos com baixa concentrao celular, enquanto que o balano gasoso encontra melhor aplicao para
concentraes celulares mais elevadas.

;.

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li

,,I!

!!

14.5 - Transferncia de oxignio em sistemas agitados


e aerados
Sabendo-se como possvel determinar experimentalmente os valores de
kLa durante um processo fermentativo, surge naturalmente o interesse em correlacionar os valores deste coeficiente de transferncia com as condies de agita
o e aerao empregadas, objetivando sempre o atendimento da demanda
Q02X,
conforme amplamente discutido no item 14.4.3.
Essa tarefa exige que se aborde, em um primeiro momento, a operao unitria de agitao (ou mistura), a fim de se contar com algumas informaes fundamentais sobre esta operao, a qual objetiva estudar a transferncia de energia a
um lquido submetido agitao, o que permite o dimensionamento desta operao muito freqente na indstria qumica.

14.5.1 - Agitao de lquidos newtonianos .


Os objetivos de uma operao de mistura podem ser tornar (ou manter) homognea uma soluo, manter slidos em suspenso, ou, ainda, tornar eficientes
os transportes de calor e massa. Esses objetivos podem ser atingidos na medida
em que se busque movimentar o lquido no interior de um recipiente, ou seja,
procura-se transmitir potncia (energia/tempo) ao lquido, atravs de um sistema de agitao.

Transferncia de oxignio em sistemas agitados e aerados

309

A determinao dessa energia transmitida pode ser efetuada pelo emprego


de dinammetros, "strain-gage", ou por balano trmico, lembrando-se, no entanto, que sempre se busca determinar a potncia efetivamente transmitida ao lquido e no a potncia total despendida (sempre ocorrem perdas de potncia nos selos de entrada do eixo no biorreator, no sistema de reduo de velocidade, ou no
prprio motor). Os detalhes dessas metodologias de medida devem ser observados nos trabalhos que ser~o mencionados a seguir.
Conforme sugerido na Figura 14.9, intuitivo imaginar que quando se faz
girar um dado impelidor, imerso em um lquido, a capacidade desta turbina de
transmitir potncia ao lquido depende de uma enorme quantidade de possveis
variveis. De fato, o tipo de impelidor usado, seu dimetro, a freqncia do
agitador, o dimetro do tanque, a altura da coluna lquida, a existncia ou no
de chicanas e sua largura, as caractersticas do lquido (densidade, viscosidade), so apenas alguns exemplos das possveis variveis que afetam a potncia
que se transfere a um lquido submetido a agitao.
Uma possvel estratgia para abordar esse tipo de situao, consiste em lanar mo da anlise dimensional, atravs da qual se busca juntar as variveis em
grupos adimensionais e, a seguir, obter as correlaes entre esses adimensionais.
Justamente essa foi a estratgia empregada por RUSHTON et al./ 0' 21 os quais
demonstraram que:
2

=t(NDfp N D; HL DT WB
N D; p
1.1
g - D; D; D;
3

(14.41)

onde: Nr =Nmero de potncia (=P /N3 D;5 p) (adimensional)


NR. = Nmero de Reynolds (=ND; 2p/M (adimensional)
NFr =Nmero de Froude (=N2 D;/ g) (adimensional)
P = potncia transmitida na agitao (W)
N = freqncia de agitao (rps ou s-1)
3
p =densidade do lquido (kg/m )
1.1 =viscosidade do lquido (kg/ms)
g = acelerao da gravidade (m/ s 2)
D; = dimetro do impelidor (m)
HL/D;,DT/D;,W8 /D;, ... = adimensionais ligados geometria do reator
H L = altura da coluna de lquido (m)
DT = dimetro do tanque (m)
W 8 = largura da chicana (m)
C = distncia do impelidor ao fundo do reator (m)
W; =altura da p da turbina (m)
--~-: ----.-. ,----~- - --:--.-.-- - -- - -------- ----

..... .,_...,..._ ~,...-----.-~- --- - - --~-- ..:_ __ . __ __ -: ------- ----~ -

---- - - - - - - -- --- -

3IO

Agitao e aerao em biorreatores

,, .. -....,,R,.,,,oooo,,,,,, ... ''"~ ,.,,,,.-.._,,,,,.._,,,o ...~...- ,., ''"'

Figura 14.9 - Esquema de um tanque agitado por turbina


de ps planas, com indicao de dimenses importantes na
transmisso de potncia ao lquido.

1~1
~
RUSHTON et al. 20 ' 21 efetuaram determinaes de potncia transmitida para

um grande nmero de impelidores e em diferentes geometrias. Na Figura 14.10


encontram-se dados para a turbina de disco e ps planas ("flat-blade turbine") e
para o impelidor tipo hlice ("marine propeller"- hlice impelidora de navios),
que so os impelidores mais freqentemente empregados em processos fetmentativos. Esses dados foram obtidos atravs da variao de N, Di, p e ll em tanques geometricamente semelhantes, providos com chicanas, indicando-se na Tabela 14.3
as relaes geomtricas utilizadas, as quais so entendidas como relaes padro,
conforme discutido no item 14.2. Em distintas geometrias as curvas so semelhantes, porm deslocadas em relao s curvas indicadas na Figura 14.10.
Para essa situao de tanques geometricamente semelhantes e ainda dotados
com chicanas, que evitam a formao de vrtice, no ocorrendo, portanto, a participao do nmero de Fraude, a Eq. 14.41 fica:
(14.42)
NP

100~-----------------------------------------.

Turbina com disco e ps planas

10

/
Hlice
(marine propeller)

Figura 14.1 O- Nmero de potncia(Np=P/N 3D; 5 p) em funo do Nmero de Reynolds (NRe=ND; 2p/J.t). para
impelidores tipo ps planas e tipo hlice ("propeller"). Dados obtidos para as geometrias indicadas na Tabela 14.3.

3I I

Transferncia de oxignio em sistemas agitados e aerados

Tabela 14.3 - Relaes geomtricas relativas aos dados da Figura 14.1 O. Tanques com 4 chicanas.

Tipo de
impelidor

Dr/Di

HdDi

C/Di

LJDi

WJDi

WB/Dr

Turbina com
6 ps planas

0,25

0,2

0,10

Hlice
(pitch=Di)

0,10

'

Na Figura 14.10 observa-se a possibilidade de definir trs distintas regies: a


regio laminar (NRe<10), uma regio de transio e, finalmente, a regio turbulenta para elevados valores do nmero de Reynolds (NRe> 104 ).
Na regio laminar constata-se que:
(14.43)
Na regio de fluxo turbulento:
(14.44)
As Eqs.14.43 e 14.44 indicam que, para o dimensionamento de sistemas de
agitao na regio laminar, a potncia varia proporcionalmente com o quadrado da freqncia de agitao e com o cubo do dimetro do impelidor, alm de
depender da viscosidade do fluido. J na regio turbulenta, na qual freqentemente se procura efetuar os dimensionamentos, a potncia proporcional ao
cubo da freqncia e quinta potncia do dimetro do impelidor, dependendo
tambm da densidade do fluido e no da viscosidade.
Conforme se pode observar na Figura 14.10, na regio turbulenta Np=6,
sendo este o valor mais elevado dentre todas as turbinas ensaiadas por
RUSHTON. Alm disso, observa-se que na regio de transio h uma tendncia de queda do Np, o que interessante para um processo fermentativo quando ocorre aumento na viscosidade do meio e, portanto, uma reduo no NRe
Assim, caso o sistema de agitao tenha sido dimensionado na regio turbulenta, operando com uma freqncia de agitao constante, no haver risco
para o motor com o progresso da fermentao, pelo menos at regio laminar. Essas so duas razes pelas quais freqentemente se emprega turbina
tipo ps planas, para a agitao e transferncia de oxignio em um processo
aerbio.
Na verdade, o motivo que determina uma menor transmisso de potncia ao lquido por uma turbina tipo hlice ("propeller"), reside no fato de que
este impelidor tem um fluxo de descarga do lquido na direo axial (para baixo

3 12

Agitao e aerao em biorreatores

na direo do eixo; vide Fig. 14.11), enquanto que uma turbina de ps planas apresenta fluxo de descarga na direo radial (na direo das paredes do tanque; vide
Fig. 14.12). Assim, so turbinas que podem ter funes distintas em um reator,
mas em termos de tninsferncia de potncia, sem dvida, a turbina tipo
"flat-blade" mais efetiva.

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('

:J

1'- "'~ ~, . . . . . . ..._.

"

Figura 14.11 - Escoamento axial para impelidores tipo hlice ("propeller") em tanque com chicanas .

Figura 14.12 - Escoamento radial para impelidorestipo disco e ps planas ("flat-blade") em tanque com chicanas.

Apenas para se ter uma idia da importncia do tipo de turbina, em termos


da localizao da curva de Np=f(NR.), dados fornecidos por KING et al. 22 permitem
concluir que para uma turbina com 4 ps planas obtm-se Np=2,2, valor este bem
inferior ao mencionado anteriormente (turbina com 6 ps planas). Alm disso, esses autores observaram uma reduo no Np para valores elevados do NR., em virtude da incorporao de ar da superfcie, quando se agita a elevadas freqncias
de rotao.
Da mesma maneira a geometria do sistema interfere muito na potncia
transmitida como, por exemplo, a altura da p (Wi) da turbina, assim como a distncia da turbina ao fundo do tanque, ocorrendo a mxima transmisso de potncia na condio (C/Di)=1, conforme indicado por BATES et al. 24 Esses autores, assim como outros, encontraram Np=5, para as mesmas condies geomtricas e
mesma turbina de ps planas que a empregada por RUSHTON, valor este diferente
do indicado anteriormente.

Transferncia de oxignio em sistemas agitados e aerados

3I3

Como freqentemente se tem o problema .de calcular a potncia transmitida


em sistemas geometricamente distintos daqueles ensaiados por RUSHTON, AIBA
et al. 10propem multiplicar a potncia, estimada atravs dos dados de RUSHTON,
pelo seguinte fator de correo:

' fc= (DyiDi)*(HLIDi)*


'

(14.45)

(Dr I Di)(HL I Di)

onde: (DTIDJ e (HLIDi) relaes geomtricas de RUSHTON.


(DTIDY e (HLIDJ relaes geomtricas distintas em relao s propostas
por RUSHTON.
Essa expresso deve, no entanto, ser empregada com a devida cautela, tendo
em vista a interferncia da geometria que, s vezes, difcil de ser prevista de forma mais conveniente.
Uma outra importante questo, tendo em vista a realidade de um processo
fermentativo, reside na freqente necessidade de se empregar mais do que um impelidor em um mesmo eixo, situao esta no.examinada por RUSHTON et al. 20' 21
bastante intuitivo imaginar que, caso se pretenda colocar dois impelidores
em um eixo, se estes estiverem muito prximos um do outro no se ter a mxima
eficincia na transferncia de potncia, assim como no se atingir a melhor condio
de mistura. Por esta razo, encontra-se na literatura23 a seguinte recomendao:
Di< H i< 2Di (onde: Hi=distncia entre impelidores)
e sendo o nmero de impelidores definido da seguinte forma:
HL-D.

1
-=---..:..
> N de impelidores >

HL-2D1

Di
Di
Em termos quantitativos, h presentemente algumas menes na literatura
sobre a potncia transmitida ao lquido por duas turbinas em relao que se observa com apenas uma turbina. Na Figura 14.13 d-se Uma idia dos resultados obtidos por HUDCOVA et al. 25 (dados experimentais foram omitidos), na qual se observa
que ocorre a transferncia do dobro de potncia apenas quando (Hi I Di)> 1,8.
Os resultados indicados na Figura 14.13 foram obtidos com a geometria prxima indicada na Tabela 14.3, para a turbina de ps planas, apenas que vrios dados
experimentais foram obtidos com (HLIDT)=2. Quando as turbinas se encontram prximas [(HJ Di)<1,8], o fluxo de lquido causado por cada uma delas interfere no desempenho das outras turbinas, no permitindo o mximo de potncia transmitida.
Nessa direo, BATES et al./4 apesar de obterem um perfil de variao distinto do indicado na Figura 14.13, possivelmente por empregarem turl;>irtas de ps
planas distintas das anteriores, indicaram que (P 2 IP 1) ~ 2 quando (HJDi)>1,3..
Esse dado refora a idia de que, acima de um certo espaamento entre os impelidores, o qual depende do tipo de turbina empregada, esses impelidores passam a
operar de forma independente, o que permite estimar a potncia transmitida para
sistemas com mltiplas turbinas.

3 14

Agitao e ae~o em biorreatores

P2/P1
2 , 2.-----------~----~----------------------~

2,0
1,8

1,6
1,4

2,0

1,O

2,5

3,0

Figura 14.13 - Relao entre a potncia transmitida por duas turbinas em relao transferida por uma turbina
25
(P 2/P 1), em funo da relao H;/D;. para turbina de ps planas (H;=distncia entre as turbinas).

14.5.2 - Agitao de lquidos newtonianos submetidos a aerao.


As informaes contidas no item anterior permitem efetuar estimativas
de potncia transmitida para um lquido, por um determinado sistema de agitao, quando no se est praticando a aerao (borbulhamento de ar), ou
seja, quando h apenas a preocupao com o problema da mistura. Quando h
preocupao com a transferncia de oxignio, haver tambm a necessidade
de aerar o lquido submetido agitao, fato este que provocar alteraes
sensveis na potncia transmitida.
De fato, quando se tem bolhas de ar suspensas em um lquido, ocorre
uma reduo na densidade aparente, o que deve provocar uma redu~o na potncia que se consegue transmitir em relao potncia transferida ao lquido
no aerado.
A fim de estudar esse tipo de situao, mais complexa do que a anterior,
26
OHYAMA; ENDOH definiram um adimensional, que chamaram de Nmero de
Aerao (NA), atravs da seguinte expresso:

_Q!Df
Q
ND - ND~

(14.46)

A-

onde: NA= Nmero de Aerao (adimensional)


Q =vazo de ar (m3 /s)
ND; =velocidade da extremidade do impelidor (m/s)
A seguir, esses autores propuseram a construo de grficos nos quais
colocavam a relao entre a potncia transmitida no sistema aerado e a potn-

Transferncia de oxignio em sistemas agitados e aerados

3I5

cia sem aerao (Pg/ P), em funo deste nmero de aerao sendo, portanto,
relaes entre nmeros adimensionais.
Um exemplo desse tipo de resultado experimental encontra-se na Figura
14.14, resultados esses obtidos por HUDCOVA et al./ 5 novamente obtidos em
um sistema com dimenses padronizadas (Tab. 14.3) e duas turbinas com seis
ps planas, distanciadas de Hi=3Di, condio para a qual as turbinas se comportavam de forma razoavelmente independente. Saliente-se, tambm, que esses autores realizaram medidas de potncia com dois sistemas "strain-gage",
um deles colocado entre os impelidores e o outro acima dos dois, de forma a
obter os dados de potncia para cada impelidor.
Conforme se pode observar, ocorre uma sensvel queda na potncia transmitida, a qual funo da vazo de ar empregada. Particularmente, a turbina colocada na
parte inferior, situada logo acima do dispersar de ar, a que sofre uma maior perda
de potncia transmitida, justamente por receber diretamente todo o fluxo de ar,
tendo a importante tarefa de dispersar este ar. J a turbina colocada na parte superior conta com uma menor perda de potncia transmitida, pois ela no recebe todo
o fluxo de ar, o qual j foi dispersado. Dessa forma, as duas turbinas juntas tambm no conseguem transmitir a mesma potncia que a observada no sistema sem
aerao, mas o valor de Pg/P superior ao obtido com apenas um impelidor.

N=25 s-1
(H/0;)=3

0,6

0,4

Impelido r inferior
Os dois impelidores
Impelido r superior

0,20~------~L---------~------~~------~-L--~

0,05

Figura 14.14 - Pg I P em funo de

NA

0,10

NA

0,15

0,20

Q!N D; para sistema de agitao com duas turbinas de ps planas?

Uma interessante observao foi a efetuada por MARTNEZ et al. 27 no que se


refere ao emprego de distintos dispersares de ar. Esses autores indicaram que o
uso de anis no lugar de simples orifcios, permite obter uma maior potncia
transmitida pelo sistema de agitao. Quando empregaram um anel com um dimetro superior ao dimetro do impelidor, obtiveram ~alores muito maiores darelao Pg/P, para uma ampla faixa de valores de NA: Esses fatos comprovam
-------,----:-- ---------

--- - -:-- ---- ~ - .,---

.......,.....,....-,..,...--- ...... ------

--~ ----- - --- --;--- --- - --~-- ~--- --------------

--

,.

i
i'

I;

316

Agitao e aerao em biorreatores

.i

,,'

. I

novamente a importncia, em termos de transferncia de energia, de se procurar


evitar que um maior fluxo de ar incida diretamente sobre a turbina.
8
MICHEL; MILLER/ a partir do exame de seus resultados experimentais, propuseram a seguinte equao:

.,,,
,,H

(14.47)

onde: Pg=potncia transmitida ao lquido sob aerao (watt-W)


Na Eq. 14.47 a constante de proporcionalidade funo da geometria do sistema, mas, tendo em vista que esta correlao no foi estabelecida entre nmeros
adimensionais, ela depende tambm das unidades consideradas para as vrias
grandezas envolvidas.
Assim, considerando o Sistema Internacional de unidades (S.I.), MILLER 29
prope:

2 3)0,45

Pg

= 0,70

P ND
Qo,s6'

(14.48)

com: Pg e P em W
Nems1
Diemm
Qemm3 /s.
A expresso de MICHEL; MILLER,28 apesar da dificuldade deno propor
uma relao entre nmeros adimensionais, costuma ajustar-se muito bem a dados experimentais, l!lesmo obtidos em sistemas geometricamente distintos,
conforme ser comentado no item seguinte.
Antes, porm, uma dvida adicional merece ser esclarecid!. O motor
que ir acionar o sistema de agitao deve ser dimensionado segundo uma
dada potncia Pg (adicionada da perda de potncia no selo da cabea do reator), mas nos instantes iniciais de operao, quando se estiver dissolvendo os
nutrientes e promovendo a esterilizao, no se estar promovendo a aerao
do meio e, caso o reator j esteja operando no volume de reao pretendido, a
potncia que se estar transmitindo ser P e no Pg
Caso se possa prever um sistema de agitao que permita a variao da
freqncia de agitao (N), segundo a Eq. 14.44, deve-se prever uma freqncia suficientemente baixa que permita a operao sem riscos para o motor.
Alternativamente, h a possibilidade de se colocar dobradias em algumas lminas das turbinas tipo "flat-blade" (por exemplo, em um impelidor de seis
ps planas, trs delas podem conter dobradias), de forma que quando se estiver esterilizando, faz-se o motor girar na direo de fechamento das ps dotadas de dobradias, invertendo-se o sentido de rotao do motor to logo se
inicie a aerao, quando ento todas as lminas se abriro.
-- ~-------- --

----- - -- -

Transferncia de oxignio em sistemas agitados e aerados

3I7

14.5.3 - Agitao e aerao de lquidos no-newtonianos


At este ponto tratou-se apenas de situaes nas quais o interesse reside
na agitao e aerao de lquidos newtonianos,. mas sabe-se que durante um
processo fermentativo possvel ocorrerem alteraes significativas no caldo,
podendo este passar condio de lquido no-newtoniana, como o caso de
processos envolvendo o ,cultivo de fungos filamentosos.
bem evidente que essa situao mais complexa, exigindo um tratamento especial, sendo o caso mais freqente o surgimento de um comportamento
pseudoplstico.
Na Figura 14.15 indicam-se as possveis formas de variao da tenso de
cisalhamento ('t) em funo do gradiente de velocidade (dv/dr), para alguns lquidos tpicos.

Tensao de Cisalhamento (t)

newtoniana

Dilatante

Gradiente de velocidade (dvldt)

Figura 14.1 S - Tenso de cisalhamento () em funo do gradiente de velocidade (dv/dr), para lquido newtoniano
e lquidos no-newtonianos.
'

Os lquidos newtonianos caracterizam-se por apresentar uma proporcionalidade entre a tenso de cisalhamento e o gradiente de velocidade, sendo esta constante de proporcionalidade definida como a viscosidade do lquido, ou seja:

(14.49)
onde: 't =tenso de cisalhamento (kg/m.s2, Pa)
J.1 =viscosidade do lquido (kg/m.s, Pa.s)
(dv/dr) =gradiente de velocidade na direo radial (s-1)

318

Agitao e aerao em biorreatores

Para o lquido binghamiano pode-s escrever:


(14.50)

.,.;
'

onde: y =coeficiente de rigidez (kglm.s)


Para alguns fluidos no-newtonianos, bastante freqente aplicar-se achamada lei de potncia, ou seja:
't =

dv)n
K ( dr

(14.51)

onde: K = ndice de consistncia (kg m1 sn2 ou g cm1 sn2 )


n = ndice de comportamento do fluxo (adimensional)
Obviamente na Eq. 14.51 se n = 1 trata-se de um lquido newtoniana; se
O < n < 1 trata-se de um lquido pseudoplstico; quando n > 1 trata-se de um lquido dilatante.
Ainda, na Figura 14.15, caso se imaginasse uma reta unindo a origem
( 't = O; dv I dr = O) com um determinado ponto sobre a curva de um fluido pseudoplstico, por exemplo, pode-se definir uma viscosidade aparente, como o
coeficiente angular desta reta, ou seja:
(14.52)

onde: J..l.p =viscosidade aparente (kglm s)


Conforme se pode observar na Figura 14.15, essa viscosidad~ aparente
varia com o valor do gradiente de velocidade, sendo que, para o lquido pseudoplstico, ela diminui com o aumento de dv I dr. Dessa forma, ao se submeter
um dado fluido pseudoplstico a diferentes valores de dv I dr, em um viscosmetro, pode-se obter distintos valores de J..lap e, com esta srie de dados, efetuar
a determinao dos parmetros K e n, ou seja:
logJ..lap =logK +(n -1)log(dvldr)

(14.53)

Essa equao indica que a relao entre logJ..lap em funo do log(dv I dr)
linear, o que permite o clcJJ.lo dos parmetros que caracterizam o lquido.
Na Figura 14.16 encontra-se um exemplo de dados de caracterizao reolgica, ao longo de um cultivo de Aspergillus awamori, sendo os valores de K e n plotados em funo da concentrao celular.30
Conforme se pode observar, os valores de n e K variam ao longo do tempo, ou com a concentrao celular, havendo inclusive a possibilidade de ajuste de uma funo exponencial entre os valores de K e X (K=0,51e0,31X), o que

Transferncia de oxignio em sistemas agitados e aerados

3 I9

mostra a influncia do crescimento das clulas na alterao das caractersticas


reolgicas do meio, o que claramente torna o problema bem mais complexo.
Para uma melhor compreenso da dificuldade em se ter de manusear um
lquido no-newtoniana, basta lembrar que para estes fluidos no possvel
definir uma dada viscosidade, pois essa depende do valor de dv I dr que est
ocorrendo no tanque, gradiente de velocidade este imposto pelo impelidor.
Dessa forma, no se pod~ definir um dado valor para o nmero de Reynolds
(NRe' Eq. 14.41) e, assim, fica impossvel obter a correlao entre Np=f(NRe),
conforme indicado na Figura 14.10.
O que pode ser feito trabalhar com a viscosidade aparente (IJ..p, Eq. 14.52)
e definir um Nmero de Reynolds modificado,-como sendo:

NR

em

=NDfp

(14.54)

IJ.ap

ndice de fluxo (n)

ndice de consistncia (K)

1,2 , - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - , 3 5

,- -+,;t-

1,0

K=0,51 exp (0,31.X)

30

0 ,8

25

20

0 ,6
15
0 ,4
10
0,2

10

12

14

16

X(g/L)

Figura 14.16 - Valores do ndice de comportamento do fluxo (n, adimensional) e do ndice de consistncia (K, em
1 2
30
g.cm- .sn- ) em funo da concentrao celular (X), durante cultivo de Aspergillus awamori.

Vrios pesquisadores abordaram esse problema, ressaltando-se a contribuio de METZNER; 0TT0 31 e CALDERBANK; MOO-YOUNG, 32 que empregaram a seguinte metodologia experimental, aplicvel para um dado lquido
no-newtoniana:
a) inicialmente agitaram o lquido no-newtoniana num determinado tanque com distintas freqncias de agitao (N), efetuando a medida da potncia
transmitida (P) para cada N, o que permite a construo do grfico de Np em funo de N.

320

Agitao e aerao em biorreatores

b) a seguir, no mesmo tanque e mesmo sistema de agitao, agitaram


um lquido newtoniana, definindo a funo Np=f(NRe), pois agora pode-se conhecer NRe
c) dessa forma, para cada valor de N com o lquido no-newtoniana, tem-se
o valor de Np (item a) e, com este valor, pode-se entrar na figura gerada no item b
tirando-se o valor de NRe' o qual corresponde ao NRem (Eq. 14.54) no tanque operando com o lquido no-newtoniana na mesma freqncia de agitao. Isso permite a determinao de llw
d) cso as caractersticas reolgicas do lquido no-newtoniana (n e K, Eq.
14.51 ou 14.52) tenham sido determinadas em um viscosmetro, para cada valor
de llap pode-se determinar, no tanque agitado, o valor mdio do gradiente de
velocidade (dv I dr)m. Isso parece ser razovel, pois, conforme se observa na Figura 14.15, um determinado valor de Jlap apenas define um nico valor de
dv I dr, seja no viscosmetro ou no tanque submetido agitao, para qualquer lquido no-newtoniana.

Atravs desse procedimento, aqueles autores mostraram que existe uma


relao muito simples entre (dv I dr)m e N, ou seja:
(14.55)

onde: (dv I dr)m = valor mdio do gradiente de velocidade na direo radial e~tre a
extremidade do impelidor e a parede do tanque (s. 1)

ki =constante de proporcionalidade (adimensional), que depende do tipo


de impelidor e da geometria do sistema, alm do tipo de lquido
no-newtoniana.
Encontram-se na literatura2,33 valores de ki para turbinas com seis ps planas variando entre 11 e 13; para impelidores tipo hlice algo como 11; e p>ara agitadores de fita helicoidal valores da ordem de 30.
Substituindo-se a Eq. 14.55 na Eq. 14.52, obtm-se:
llap = KNn-1kf-1

(14.56)

Retornando, agora, Eq. 14.54, vem:


N

Rem-

N2- nD?p
z

Kkn-1

(14.57)

possvel, dessa forma, construir curvas do Np (conforme determinaes feitas


no item a) em funo destes valores de NRem' as quais devero ser muito semelhantes, ou at mesmo coincidentes, s obtidas com o fluido newtoniana (Figura
14.10), tendo em vista o prprio procedimento adotado. Essa coincidncia particularmente observada na regio laminar, na qual a potncia transmitida depende
fortemente da viscosidade do fluido, ocorrendo desvios na regio transiente,
quando o Np comea a no mais depender desta viscosidade.

Transferncia de oxignio em sistemas agitados e aerados

321

Inversamente, para um dado valor de N, conhecendo-se as caractersticas


reolgicas (n e K) de um dado fluido no-newtoniano, admitindo-se (ou tendo-se
determinado) um certo valor para a constante ki (dependendo do tipo de impelidor), pode-se determinar o NRem e, com isto, determinar Nr e a potncia P com a figura para o lquido newtoniano. Claro est que os valores dos parmetros n e K
devem ser conhecidos ao longo do tempo, tendo em vista a sua variabilidade, conforme indicado na Figura 14.16.
Particularmente, para um lquido pseudoplstico (n < 1), CALDERBANK;
MOO-YOUNG 32 observaram que possvel definir uma relao entre a viscosidade
aparente e as caractersticas reolgicas do fluido, expressa por:
1 2Sj..t
'

ap

1
3
K
( n+
(8N) 1-n
4n

)n

para n < 1 (pseudoplstico)

(14.58)

o que significa:

llap

(6n +2)n

(14.59)

=lONl-n - n-

Desta forma, o nmero de Reynolds modificado obtm a forma:


nP (. _n_
= D2N2i

N
Rem

0,1K

6n +2

)n

(14.60)

Na Figura 14.17 indica-se a curva obtida por esses autores (dados experimentais foram omitidos), a fim de se ter uma idia a respeito da semelhana desta
curva com a apresentada na Figura 14.10.

lI

1Q1
3

Figura 14.17 - Np=P/pN D; em funo de NRem (Eq. l4.60) para lquido pseudoplstico (n < I), impelidor tipo dis32
.
co com 6 ps planas.

.I

322

Agitao e aerao em biorreatores

Resta ainda .c onsiderar a questo de lquidos no-newtonianos submetidos


aerao, quando ento pode-se imaginar que ocorrer uma reduo na potncia
transferida pelo sistema de agitao, conforme j indicado anteriormente.
Sob esse aspecto, cumpre ressaltar que a equao proposta por MICHEL;
28
MILLER (Eq. 14.47) de utilidade para se procurar prever a potncia transmitida
a um lquido submetido agitao e aerao.
Na Figura 14.18 indica-se a correlao sugerida por aqueles pesquisadores,
no que se refere agitao e aerao de lquidos newtonianos e no-newtonianos.
necessrio mencionar que a Figura 14.18, na qual tambm foram omitidos os pontos experimentais, foi elaborada a partir dos dados fornecidos por
23
WANG et al. Esses autores indicam que, para o caso de lquidos newtonianos,
a correlao proposta inclui resultados obtidos em reatores de volumes muito
distintos, variando desde 3,5 litros at 42.000 litros, entre os quais, conforme
se poderia esperar, ocorre uma razovel variao entre as relaes geomtricas . Inclusive, para os reatores de maiores dimenses, houve a utilizao de 2
ou 3 turbinas nos sistemas de agitao .

pg =0,545(P2ND?tQ0,56)0,48
(newtoniana)

pg

=0 ,405(P2ND?tao.sa)o.44

( nao-newtoniano)

10

102

103

104

p2ND;3 /Qo~a

108

109

1010

W2s-1m3/(m3/s)Qss

Figura 14.18 - Correlao do tipo da proposta por MICHEL; MILLER. 28 entre a potncia transmitida sob aerao

(Pg) e a grandeza P2ND;3/Q 0 '56 , para lquidos newtonianos e no-newtonianos (unidades no sistema S.I.).

No entanto, a equao indicada na Figura 14.18 para o lquido newtoniana,


difere da indicada pela Eq. 14.48, especialmente quanto constante de proporcionalidade (0,706 na Eq. 14.48 e 0,545 na presente equao).
Para o lquido no-newtoniana, os dados referem-se ao trabalho de
4
TAGUCHI et al./ relativos ao cultivo de Endomyces, o qual propicia o surgimento de lquido pseudoplstico. Saliente-se, novamente, que os resultados
foram colhidos em reatores muito distintos, tanto em volume de reao (desde 20 at 30.000 litros), como em termos de relaes geomtricas.

Transferncia de oxignio em sistemas agitados e aerados

323

Apesar de se obter urna equao distinta da anterior, especialmente no que


se refere constante de proporcionalidade (agora atingindo o valor 0,405, vide
Figura 14.18), os resultados experimentais so muito bem representados pela relao linear proposta.
De qualquer maneira, fica bastante claro que urna equao com a estrutura
proposta por MICHEL; MILLER 28 de grande valia, apesar do inconveniente de
no relacionar nmeros adirnensionais, conforme j mencionado no item anterior .

14.5. 4 - Transferncia de oxignio


Nos subitens anteriores houve a preocupao de analisar o problema da
transferncia de energia para um lquido newtoniano ou no-newtoniano, na presena ou ausncia de aerao, procurando abordar as possibilidades de se prever
esta transmisso de potncia, dependendo do sistema de agitao e aerao existente, assim corno das caractersticas do prprio processo ferrnentativo.
Toda essa preocupao reside principalmente na expectativa de que a agitao e a aerao permitam transferir oxignio para o microrganismo, em condies
de satisfazer suas necessidades metablicas, ligadas s vias aerbias, conforme
discutido no item 14.4.3 (Eq. 14.19).
Na verdade, resta agora quantificar a influncia da transferncia de potncia
ao lquido, assim corno das condies de aerao, na capacidade de transferncia
de oxignio do sistema de agitao e aerao,-quantificao esta que permite o dimensionamento do sistema. As correlaes indicadas a seguir so empricas e,
corno sempre, encerram o inconveniente de terem validade dentro das condies
ensaiadas.
Um dos trabalhos mais clssicos nessa direo foi o publicado_por COOPER
et al} os quais, conforme j indicado no item 14.4.1, estudaram o transporte de
oxignio para unia soluo de sulfito de sdio, quantificando-a na forma do coeficiente de absoro Kv. Alm disso, mediram tambm a potncia transferida sob as
diferentes condies de agitao e aerao empregadas.
Na Figura 14.19 indicam-se os resultados obtidos pelos mencionados autores, j arranjados segundo urna equao do tipo:
(14.61)

onde: K3 =constante que depende da geometria do sistema, assim corno do


sistema de undades empregado.
3
V= volume de lquido submetido agitao e aerao (rn )
V5 =velocidade superficial do ar(= Q/S) (rn/s)
Q =vazo de ar (rn 3 /s)
S = rcD/ /4
a, 13 =constantes empricas
""'----c----- ------- . --- ---- -------- -.-- ----~-------~------~------ -----------

324

Aitao e aerao em biorreatores .

ou seja, para os dados de COOPER et al. 9 obtm-se:

K v = 25,301_ ~

)0,95
(V 5 )

(14.62)

0 67
'

desde que: Kv em mmolOdL h atm


Pg/Vem W/m3
V 5 em m/s
(HL/DT) = 1
Impelidor tipo disco ranhurado ("vaned disk")
Kv (m moi/L.h.atm)
2~0--~-------------------------------------,

2000

1~

1000

10
(~

20

30

40

50

60

70

80

/V)o.ss(Vs)o,67

Figura 14.19 - Dados de transferncia de oxignio (Kv) para soluo de sulfrt:o de sdio, submetida a diferentes
9

condies de agitao e aerao, com impelidor tipo disco ranhurado ("vaned disk").

Na Figura 14.19, os valores de Kv esto expressos em mmol0 2 /L h atm,


pois a constante de Henry para a gua tem um valor prximo da unidade quando
expressa em mmol0 2 /L atm (Tabela 14.1). Nessas condies, pela Eq. 14.6, os valores de Kv e kLa (em h"1) so muito prximos, caso se possa admitir a situao de
transferncia de oxignio para a gua.
Tambm, como se nota na Figura 14.19, h valores de Kv bastante elevados,
o que sugere a possibilidade de transferncias de oxignio extremamente elevadas. Pa mesma forma, o expoente do termo Pg/V muito elevado, o que confere a
este termo uma importncia muito relevante.
Tais fatos podem ser atribudos a alguns fatores, sendo um deles o estudq
da transferncia de oxignio para uma soluo de sulfito de sdio, isto , para
uma sohio salina relativamente concentrada, o que confere ao meio a caracterstica de no ocorrer a coalescncia de bolhas de ar, alm de reduzir a tenso superficial do lquido (caracterstica de solues salinas), o que tende a facilitar o

Transferncia de oxignio em sistemas agitados e aerados

325

transporte de oxignio. Nessa condio, sempre interessante transmitir elevadas potncias ao lquido (elevadas freqncias de agitao do sistema de turbinas), a fim de obter bolhas de pequeno dimetro, pois essas bolhas no
coalescem com facilidade, o que explica o elevado expoente do termo Pg/V.
Outro importante fator reside no emprego de um impelidor de disco ranhurado ("vaned disk"), o qual tem caractersticas bastante particulares e no parece
encontrar maiores aplicas em processos fermentativos.
Claro est que um dado meio de cultura em processo de fermentao pode
ser muito distinto de uma soluo de sulfito de sdio, especialmente no que se refere possibilidade de coalescncia de bolhas de ar.
Segundo KOSSEN; 00STERHUIS35 os valores dos expoentes da Eq. 14.61 sofrem tambm interferncia da escala em que se est trabalhando, observando-se
que, na medida em que se aumenta o tamanho do reator, estes valores aproximam-se daqueles obtidos em sistemas onde ocorre coalescncia de bolhas. Uma
possvel explicao para isso reside no fato de que, para reatores de grandes dimenses, as bolhas tm um maior tempo de residncia no lquido, ampliando a
possibilidade de coalescerem. Na Tabela 14.3 indicam-se os vlores colhidos na
literatura, pelos mencionados autores, a fim de apoiar esta discusso.

Tabela 14.3 - Expoentes a e

~da

35

Eq. l4.61 segundo a escala de trabalho.

Volume
do reator
(m3)

Sistema

0,005

0,95

0,67

no coalescente

0,5

0,6 - 0,7

0,67

50

0,4 - 0,5

0,50

0,002 - 2,6

0,4

0,50

coalescente

Como se pode notar na Tabela 14.3, para as vrias correlaes, o expoente de


V5 varia relativamente pouco, quando se compara com as variaes do expoente
do termo Pg/V.
Outro aspecto que merece ser comentado que a equao de COOPER apenas explcita ainterferncia da potncia transferida e da velocidade superficial (a
qual inchii a vazo de aerao), deixando de explicitar outras interferncias que
so de importncia. Obviamente, o fato de no explicitar no significa que a equao no contempla essas outras interferncias.
Por essa razo, surgiram na literatura outras correlaes, igualmente desenvolvidas atravs do mtodo do sulfito, como por exemplo a equao proposta por
RICHARDS: 36

326

Agitao e aerao em biorreatores

(14.63)

onde: N =freqncia de agitao(s-1 ).


Outro exemplo de correlao desse tipo, desenvolvida a partir de dados obtidos em reatores de 100 a 42.000 litros, pode ser escrita na forma :23
p

K v = (p + qN i) ~

)0,77

(V s) o,67

(14.64)

onde: Ni = nmero de turbinas no eixo de agitao


p, q = constantes empricas
Conforme salientado, as correlaes indicadas foram desenvolvidas para
solues de sulfito de sdio, as quais tm a caracterstica de no apresentarem
o problema da coalescncia de bolhas, o que significa uma situao diversa em
relao a um processo fermentativo .
Correlaes obtidas para processos fermentativos ainda so relativamente escassas na literatura, podendo-se mencionar o trabalho j citado de
TAGUCHI et al.} 4 que obtiveram resultados durante o cultivo de Endomyces, cujo
caldo torna-se pseudoplstico ao longo do processo. Na Figura 14.20 encontram-se
os resultados experimentais obtidos pelos autores, dados estes elaborados a partir
da figura proposta por WANG et al. 23
Conforme se pode observar, apesar de uma razovel disperso dos dados
experimentais, possvel imaginar uma correlao do tipo da equao de COOPER,
ou seja:

j p
Kv =128,4..-l ~

)0,33
Ws)o,s6

(14.65)

onde: (Pg/V) em W /m 3
(V5) em m/s
(Kv) em mmol0 2 /L h atm
Conforme esperado a partir da discusso anterior, observa-se que o expoente do termo Pg/V bem inferior ao proposto por COOPER, enquanto que o expoente do termo V 5 bastante prximo. De qualquer maneira, a correlao obtida razovel, tendo em vista as diferentes escalas em que os resultados foram
obtidos, salientando-se ainda a existncia de diferentes relaes geomtricas entre estas escalas .
. Na verdade, a equao de COOPER, apesar de intensamente empregada,
muito simples, tendo em vista o fenmeno que se est abordando, deixando de explicitar fatores importantes, conforme j mencionado. Alm disso, convm salientar que essa equao tambm relaciona grandezas cujos valores numricos dependem das unidades empregadas, pois no se trata de correlao entre 'grandezas
adimensionais.

Transferncia de oxignio em sistemas agitados e aerados

327

Kv (mmoi/Lhatm)
200.-----------------~--------------------,

Kv 128,49(Pg/V)o, 33(V5 )o, 56

200

100
100

+
+
X

20L

+ 60L

50

3.000 L
O 30.000 L

0~--_x~~------~--~==~==~
1,0

1,5

Figura 14.20 - Dados de transferncia de oxignio (Kv) em lquidos pseudoplsticos (cultivo de Endomyces), obti34
dos em reatores de 20 a 30.000 litros.

Ainda nessa direo da busca de correlaes entre a capacidade de transferncia de oxignio e as variveis manipulveis do sistema, porm obtidas durante
um processo fermentativo, necessrio mencionar o trabalho de JURECIC et al./7
que cultivaram Bacillus licheniformis visando a produo do antibitico bacitracina, cultivo este que resulta em um caldo pseudoplstico. Tais dados foram obtidos
em reator piloto de 100 litros e em reator industrial de 67.500 litros. Nesse reator
industrial, os autores dispunham da possibilidade de efetuar a medida da concentrao de oxignio dissolvido, a fim de efetuarem a determinao de kLa atravs do
mtodo dinmico, em duas alturas da coluna lquida.
Inicialmente, os autores buscaram correlacionar os resultados obtidos atravs de uma equao estilo COOPER, observando que, para a instalao piloto, o expoente de P8 /V era de 0,46 a 0,52, enquanto que o expoente de V5 era de 0,7,
indicando, assim, uma intensa participao de ambas as parcelas. J para a parte
inferior do reator industrial o expoente de P8 /V era de 0,46, mas o expoente de V5
encontrado era extremamente baixo, indicando uma forte interferncia da potncia transmitida. Para a parte de cima do reator industrial, o expoente de P8 /V foi
de 0,2 a 0,3 e um elevado valor para o expoente de V5, indicando uma maior participao do termo relativo vazo de aerao, ou seja, a parte superior funcionaria
mais como uma coluna de bolhas.
A partir dessas concluses, os autores propuseram a substituio da turbina superior por um impelidor tipo hlice, pois no haveria a necessidade de uma
transferncia de potncia importante, mas apenas teria a funo de evitar uma
maior coalescncia das bolhas, o que significaria uma razovel economia de
energia. Alm disso, os .resultados indicam tambm que os valores obtidos em
uma instalao piloto devem ser empregados com a devida cautela.
--- ----.-----,-_. . ...,.........._--- ~.....,_ __ _ -:- : -

- --- .,... --__,....,.------ - -,...--- ---- --~-- .,, ~--- ~,.---- - ----- - ,- ---.- ----------- --- -- -- -- -- - ------~--- --:---- ----- ------------ ------ ~- ----- ----

--- - ------ - ----------,------- -

328

Agitao e aerao em biorreatores

Todos os dados obtidos por }URECIC et al. 37 para as plantas piloto e industrial, apesar de operarem em condis muito distintas e no serem geometricamente semelhantes, foram ajustados de forma bastante razovel atravs da
equao:
(14.66)

onde

Pgm)' J~)
[Q
p(gv)2/3
v = Jl ap =viscosidade cinemtica
p
J.l.ap conforme Eq. 14.59 ou 14.56
p =densidade do meio (kg/m3 )
g = acelerao da gravidade (m/ s 2)
P8 m =potncia transmitida por turbina (W)
V m =volume de lquido dividido pelo nmero de impelidores (m3 )
Q=vazo de 'aerao (m3 /s)
Se =nmero de Schmidt = Jlapl pD
D = difusividade do oxignio (m 2 I s)
cr = tenso superficial do meio (N I m)
crw = tenso superficial da gua (N I m)
A Eq. 14.66, oriunda da proposta por ZLOKARNIK,38 um exemplo de correlao,entre as existentes na literatura, na qual se busca explicitar grandezas
importantes para o fenmeno em estudo, alm de relacionar nmeros adimensionais.
Claro est que a dificuldade reside em contar com os dados necessrios, o
que significa um trabalho experimental muito evoludo, alm de equipamentos
adequados para estas determinaes.
Ainda, o trabalho de JURECIC et al.'3-7 indica a p~ssibilidade at intuitiva de
que um reator industrial no apresente um mesmo comportamento ao longo de
todo o seu dimetro e altura da coluna lquida. Isso leva idia de se equacionar o
reator por compartimentos, coino indicado por OOSTERHUIS; KOSSEN39 e
BADER40. Essa abordagem no ser elaborada no presente texto.
De qualquer maneira, observe-se que, na parte final deste captulo, j houve certa abordagem de resultados obtidos em laboratrio, plantas piloto e escala
industrial, indicando a clara preocupao com a ampliao de escala, tema a ser
elaborado no prximo captulo.

Corisideraes finais

J 29

14.6 .- Consideraes finais


Sem dvida, um processo biolgico aerbio tem como um dos problemas fundamentais a necessidade de um correto dimensionamento do sistema
. de transferncia de oxignio, sem o qual esse processo dificilmente ser competitivo. Ao que tudo indica, com freqncia, as crticas aos sistemas aerbios
parecem estar muito ligaqas a uma eficincia no adequada deste sistema de
transferncia de oxignio.

No presente captulo buscou-se fornecer informaes que permitam. efetuar esse dimensionamento. A partir da demanda em um dado instante (Q 02 X)
possvel calcular as condies de agitao e aerao, representadas pela potncia transferida ao lquido e a vazo de aerao (a qual define, juntamente
com a geometria do sistema, a velocidade superficial V 5 ).
Como deve ter ficado claro, houve uma particular preocupao com o
reator agitado e aerado, o qual se constitui no reator mais empregado presen. temente, mas houve igualmente a preocupao com o estabelecimento dos
fundamentos desta operao em estudo.
Dessa forma, possvel imaginar que outros sistemas de transferncia de
oxignio possam ser adequadamente analisados, observando-se os conceitos aqui
desenvolvidos. Realmente, os reatores de colunas de bolhas, particularmente os
reatores "air-lift", ganham importncia e devem ser considerados como uma alternativa interessante para uma eficiente transferncia de oxignio.
Finalmente, cumpre destacar que as correlaes apontadas, apesar de,
com alguma freqncia, serem vlidas para reatores de distintas geometrias,
devem ser utilizadas com a devida cautela. Na realidade, a melhor condio
para t.Jm perfeito dimensionamento reside no levantamento de correlaes com
as condies especficas do processo fermentativo em desenvolvimento . Isso
significa um trabalho experimental intenso, alm de uma equipe de trabalho
suficientemente preparada para esta tarefa. Mas, sem dvida, constitui-se no
caminho mais seguro para uma perfeita ampliap de escala, objetivo maior de
um trabalho de desenvolvimento.

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Agitao e aerao em biorreatores

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t..

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333

: =?E02 ~

=-~ ~
--

DE=-ES=cAI;A
.....---=---=------------=========~~-~~---

Alberto Colli Badino Jr.


Willibaldo Schmidell

15.1 - Introduo
No desenvolvimento de processos qumicos, quando so encontradas condies econmicas adequadas de operao em escala de bancada, as quais com freqncia correspondem obteno de valores elevados para a produtividade e
rendimento do produto de interesse, sob o ponto de vista econ6mico, h a necessidade de se ampliar a esca~a de produo at uma escala industrial.
Na grande maioria dos processos, o desenvolvimento natural parte de uma
escala de produo menor para uma escala maior. A variao de escala nesse sentido conhecida como aumento de escala ou "scale-up". Caso contrrio, ou seja,
quando se est operando uma instalao industrial e se necessita elaborar ensaios
em pequena escala, a fim de verificar certos aspectos tem-se a chamada reduo
de escala ou "scale-down".
Dessa forma, o estudo da variao de escala de processos examina os problemas associados com a transposio de dados obtidos em equipamentos de escalas
de laboratrio e piloto, para a escala de produo industrial, e vice-versa.
Na Figura 15.1 indicam-se as vrias etapas relacionadas ao desenvolvimento
de um processo produtivo, assim como as interaes entre elas.
Em indstrias onde a converso da matria-prima em produto se baseia
numa .converso biolgica, entre todas as etapas que devem ser ampliadas, inclui-:se a etapa de biotransformao, realizada em fermentadores . Neste captulo
_sero apresentadas e discutidas as teorias relacionadas com a variao de escala
de fermentadores ou biorreatores convencionais. Entende-se por biorreatores convencionais tanques providos de dispersar de gs e agitador mecnico, constitudo
de motor, eixo e impelidores .
.. -

- -,--- -- -- - , -

. - , - o-. - -,. -

-.---- . . --- -

- :- - - -- - - .... ~-,~-~- -~ --- -

- ~ - --'-- -;-:----- ----- --- --------

---- --- - - - - - - -- - - - -- - --- --

334

Variao de escala

O desenvolvimento tradicional de processos fermentativos usualmente


executado em trs estgios ou scalas, a saber:
- Escala de bancada
- Escala piloto
- Escala industrial

:- - ------------~------------------------ - ------- --- ---~

:
:
~-----

lnformaao
bibliogrfica
e pesquisa
bsica de
bancada

'---'---r----'_' _-_::.-./--"'

Na o

~-------------+

Viabilidade
tnica e
econmica
preliminar

..
... ------ -- ------ ----
o
o

Sim
~

____ ..,.

: -----------------'o

Definio da

o
o
o
o

escala piloto

,. ____ ..,.
o
o
o

1----

Figura 15.1 - Etapas dei desenvolvimento de m processo produtivo: com as fases de obteno de dados e instantes principais de tomadas de decises.

Na escala de bancada, tendo em vista sua maior flexibilidade e menor custo


de operao, os dados bsicos sobre o processo devem ser levantados dentro do
maior nvel de detalhes possvel. Nessa escala so realizadas tarefas bsicas, como
a seleo do microrganismo e o desenvolvimento do meio de cultura ideal. So
tambm escolhidas as condies de temperatura e pH para o processo, assim
como a forma de operao dobiorreator. Caso o processo seja aerbio, deve-se conhecer a velocidade de consumo de oxignio, a fim de que se possa dimensionar
----

- - - ----- ---~------- -

- ------------ - -.---

----- -~- --

- - -

Introduo

335

adequadamente o sistema de transferncia de oxignio, conforme indicado no captulo anterior. Ainda, esse lE!vantamento de dados deve permitir a elaborao de
modelos matemticos, a fim de se poder visualizar o desempenho do processo em
condies no pesquisadas experimentalmente, atravs da simulao do modelo,
o que tambm auxilia o raciocnio nas etapas subseqentes.
Uma vez que se tenha acumulado suficiente experincia sobre o processo
fermentativo em questo, ~ desde que se tenha atingido desempenho adequado do
ponto de vista econmico, pretende-se ampliar a escala para um reator piloto.
Como agora a operao mais onerosa, deve-se manter constante grande parte
das possveis variveis, como o caso de se buscar operar na mesma temperatura,
pH, forma de operao, meio de cultura, etc. Sobre esse conhecimento acumulado
do processo, deve-se definir um determinado critrio de ampliao de escala, ou
seja, uma determinada grandeza que dever ser a mesma na escala piloto em relao empregada na escala de bancada. Como exemplo, pode-se pensar em manter
constante o cisalhamento no reator, caso as clulas sejam sensveis a ele, ou manter-se constante o coeficiente volumtrico de transferncia de oxignio (kLa), no
caso de cultivo de clulas aerbias.
Assim, com esse critrio fixado, opera-se a escala piloto, objetivando, obviamente, a obteno de igual desempenho que o observado na escala de bancada.
Caso esse desempenho seja adequado, conclui-se que o critrio fixado est correto
e, em caso contrrio, deve-se ensaiar um novo critrio, novamente escolhido de
acordo com o conhecimento do processo. Ainda, caso no se obtenha o sucesso esperado, algumas corridas devem ser feitas ha escala piloto, alterando-se ligeiramente as grandezas fixadas, a fim de melhorar o desempenho do processo, mas
deve-se lembrar que agora os custos operacionais so mais elevados.
Deve, portanto, ter ficado clara a idia de que a operao de uma escala piloto objetiva especialmente o teste do critrio de ampliao de escala e no o estudo
da influncia de fatores (pH, temperatura, composio de meio, etc.). Sabe-se, porm, que ao ampliar a escala de trabalho vai-se deixando a condio de reator homogneo, freqentemente observada na escala de bancada, e este importante fato
tambm estar sendo observado.
Por fim, a escala industrial, devido prpria dimenso, visa o lado econmico do processo, ou seja, a produo em alta escala. Na escala industrial, procura-se
operar o fermentador sob condies similares s ajustadas na escala piloto, as quais
permitiram a obteno de um desempenho adequado do processo.
A Figura 15.2 ilustra a seqncia de escalas que compem o desenvolvimento
de processos microbiolgicos, lembrando que a estrutura apresentada na Figura
15.2 no necessariamente rgida, podendo, em muitos casos, existir escalas intermedirias entre as escalas piloto e industrial. A existncia de vrios reatores piloto,
de diferentes dimenses, na verdade depende do volume do reator industrial.
De fato, no desenvolvimento de uma vacina bacteriana, na qual o reator final ter algo como algumas centenas de litros, a escala piloto ficar em torno de algumas dezenas .de litros. J para a produo de uma enzima ou antibitico, para
os quais o reator final dever ter centenas de milhares de litros, freqente se contar com pilotos da ordem milhares de litros e dezenas de milhares de litros .
.........__.___,_____

,,

--- ------ ... --- - -- -

--------...

..

- - --~--~-- ~

____ ...........,-- -- -- ...... __,,~ --. --- ........._........----------.- - -.


,

336

Variao de escala

claro que esses reatores intermedirios no sero apenas utilizados para o


desenvolvimento inicial, mas sero empregados como pr-fermentadores (preparo
do inculo) para o reator principal, ou para estudos em menor escala quando houver, por exemplo, a necessidade de ensaiar novo microrganismo ou novo lote de
matria-prima.
Industrial

Piloto

Bancada

:~. ...

200-400 mL

1 - 10 L

50 - 200 - 500 L

Figura I 5.2 - Escalas de trabalho no desenvolvimento de processos fenmentativos.

Portanto, o grande problema da variao de escala est exatamente em reproduzir, na escala industrial, condies ambientais responsveis pelo bom desempenho do sistema, obtidas nas de bancada e piloto.

Particularmente, alguns fatores fsicos como o gprau de mistura, consumo


de potncia, grau de cisalhamento de clulas, velocidade de transferncia de oxignio, entre outros, dependem da escala e, por esta razo, devem ser tratados com
maior cuidado, buscando-se ento a definio dos mencionados critrios de ampliao de escala. Saliente-se, desde j, que uma vez fixado um dado critrio, todos os demais sero distintos nas diferentes escalas, como ficar evidenciado mais
adiante.

I5.2 - Critrios para a ampliao de escala


O procedimento usual de uma ampliao de escala com base nos critrios de
ampliao baseia-se em, mantendo-se a semelhana geomtrica na escala maior,
selecionar o critrio e, a partir da, encontrar as novas condies de operao na
nova escala que, supostamente reproduziriam as condies encontradas na escala
menor. A Figura 15.3 ilustra o princpio da ampliao de escala e a seleo do valor do critrio que maximizao desempenho do processo.

Critrios para a ampliao de escala

337

Valor
selecionado

Critrio de aumento de escala

Figura 15.3 - Princpio de aumento de escala e seleo do valor do critrio fixado.

A seguir esto listados alguns critrios de ampliao de escala normalmente


recomendados para fermentadores ou biorreatores convencionais. So eles:
constncia da potncia no sistema no aerado por unidade de volume de
meio (P /V);
constncia do coeficiente volumtrico de transferncia de oxignio (kLa);
constncia da velocidade na extremidade do impelidor (v1;p);
constncia do tempo de mistura (tm);
constncia da capacidade de bombeamento do impelidor (FL/V);
constncia do nmero de Reynolds CN'Re);
constncia da presso parcial ou concentrao de 0 2 dissolvido( C).
O critrio de ampliao de escala a ser fixado varia de processo para processo, pois depende das especificidades de cada um. EINSELE 1 menciona os critrios
de ampliao de escala mais utilizados pelas indstrias de fermentao na Europa. A Tabela 15.1 ilustra esses dados.
Tabela 15.1 - - Critrios de ampliao de escala mais utilizados na Europa:

Critrio de ampliao

Quantidade de indstrias (%)

kLa

30

P/V

30

Vtip

20

20

0LDSHUE 2 cita alguns princpios bsicos que devem ser considerados no


aumento de escala de reatores ou fermentadores tipo tanques agitados:
1. importante identificar qual ou quais propriedades so . importantes
para otimizar a operao de um sistema agitado. Entre essas propriedades, pode-

338

Variao de esCala

mos citar a transferncia de massa (kLa), a capacidade de bombeamento (FL/V),


condies de cisalharnento, etc. Urna vez identificadas essas propriedades, o sistema pode ser submetido ao aumento de escala, desde que essas propriedades sejam
mantidas na nova escala, o que certamente resultar em variaes em outras variveis de menor importncia, lembrando sempre que a semelhana geomtrica deve
ser mantida.
2. As maiores diferenas entre grandes e pequenos tanques so que os grandes tanques apresentam um tempo de mistura (tm) maior e condio de cisalharnento mximo (na extremidade do irnpelidor) maior.
3. Para reaes qumicas homogneas, o consumo de potncia por unidade
de volume (P 1V) deve ser usado corno "critrio de aumento de escala".
4. No aumento de escala de sistemas bifsicos (gs-lquido), onde h transferncia de massa entre as fases, corno no caso de bioprocessos aerbios, o coeficiente
volumtrico de transferncia de massa (kLa) deve ser preferencialmente usado
corno critrio de aumento de escala. Em geral, o kLa relacionado com P /V.
5. Valores tpicos da razo entre o dimetro do irnpelidor e o dimetro do
tanque (DJDT), para ferrnentadores, esto na faixa entre 0,33 e 0,40. Utilizando-se
grandes irnpelidores, urna mistura adequada deve ser proporcionada por urna freqncia de rotao (N) que no d;mifique fisicamente as clulas. Alguns fermentadores no so, s vezes, operados em condies timas de transferncia de oxignio devido sensibilidade de alguns microrganismos ao cisalhamento.
Com base nesse apanhado geral, sero apresentados os critrios de ampliao de escala de ferrnentadores, e sero vistas as decorrncias nas variveis freqncia de rotao (N) e dimetro do irnpelidor (Di), quando se fixa um determinado critrio de ampliao de escala.
Mantendo-se a semelhana geomtrica e procedendo-se ao aumento de escala de ferrnentadores, utilizando-se os critrios de aumento escala, isto resultar em
relaes englobando as variveis freqncia de rotao do sistema de agitao (N)
e o dimetro do irnpelidor (Di), entre as escalas em estudo. Na apresentao das
relaes NDi entre as diferentes escalas, o ndice 1 indica a escala de partida, normalmente a escala menor ou de bancada, e o ndice 2 denota a nova escala piloto
ou industrial.

15.2. I - Constncia da potncia por unidade de volume de meio (PN)


At meados do sculo, o critrio de ampliao de escala de ferrnentadores
mais utilizado em bioprOcessos, onde se incluem os de produo de lcool e de
cidos orgnicos, foi o consumo de potncia pelo sistema no aerado por unidade
de volume de meio (P /V}. 3 Esse critrio , ainda hoje, amplamente utilizado, competindo apenas com o coeficiente volumtrico de transferncia de 0 2 (kLa).
Conforme visto no Captulo 14, em tanques cilndricos com chicanas, agitados por irnpelidores tipo turbina de ps planas, nos regimes de agitao laminar e
4
de transio (NRe<l0 ), tem-se que: .

Np

=f(1 J
NRe

(15.1)

Critrios para a ampliao de escala

3 39

onde: Np: nmero de potncia(= P /(N3D/p)) (adimensional)


NRe: nmero de Reynolds (= NDi 2 p/f.l) (adimensional)

P: potncia transmitida na agitao (W)


N: freqncia de rotao (rps ou s1)
p: densidade do fluido (kg m 3 )

f.!: viscosidade do flJido (kg m 1 s1)


D;: dimetro do impelidor (m)

Logo:
p
a
fl
N Drp
pNDf
3

Sendo as propriedades fsicas (p e f.l) constantes no aumento de escala,


tem-se que:
ou

(15.2)

No regime turbulento (NR. > 104), NP constante<4>, logo:


p
N

= constante

(15.3)

D; p

Portanto:
(15.4)
O volume do tanque (V) dado por:

D2

v= 1t____1_ H L
4

onde: DT: dimetro do tanque (m)


H L: altura da coluna de lquido (m)
Como se pretende, na ampliao de escala, manter semelhana geomtrica, e
sabendo-se que (Tabela 14.3- Captulo 14):
logo,
(15.5)

Dividindo-se as equaes 15.2 e 15.4 pela Eq. 15.5, tem-se que:


p a N2

--+regime laminar

(15.6)

340

Variao de escala

.f
va

N 3 D?
l

-Hegime turbulento

(15.7)

Na ampliao de uma escala 1 para uma escala 2, mantendo-se como critrio


P I V constante, tem-se, para o regime turbulento de agitao:

e, portanto:
N13D2ll = .N3D2
2 lz

!l'

D]2/3

ou N 2 =N 1 [

(15.8)

v::

Como um exemplo da utilizao desse critrio, a Figura 15.4 ilustra um aumento de escala para o processo de produo de penicilina baseado no critrio PN
constante (GADEN, informaes colhidas em W ANG et aC).

I
II

E
3

n.
(.)
+--

Valor escolhido
para o
aumento de escala

!)

0,0

2,0

4,0

kW/m 3

Figura I 5.4 - Produo de penicilina (C p) em funo da potncia fomecida em diferentes escalas.

Na Figura 15.4 nota-se um fato interessante, comum em estudos de aumento


de escala. Um valor prximo de 2,0 kW /m 3 para o critrio PN, obtido a partir de
ensaios em escala de bancada (5 L), foi o escolhido para realizar o aumento de escala. Pode-se notar que, nessa escala, valores razoavelmente maiores para o critrio PN no causam uma maior produo de penicilina. Portanto, esse o valor de
partida escolhido para aumento de escala desse processo. No entanto, deve-se ter
em mente que, em escalas maiores, devem ser realizados ensaios em condies
prximas ao valor do critrio escolhido na escala de bancada, uma vez que este
procedimento pode culminar num desempenho ainda melhor do processo. Nesse
exemplo, o valor de PN em torno de 2,0 kW /m 3 proporciona um desempenho similar para o processo, nas trs escalas envolvidas. J, valores de PN razoavelmente maiores, embora praticamente no alterem o desempenho do processo na escala

Critrios para a ampliao de escala

341

de bancada, resultam em razoveis melhorias, em termos de produo de penicilina, nas escalas piloto (760 L) e industrial (38m 3) .
15.2.2 - Constncia do coeficiente volumtrico de transferncia
de oxignio (kLa)
Em bioprocessos ql;le envolvem alta demanda de oxignio, como os de produo de antibiticos e trmacos em geral, o coeficiente volumtrico de transferncia de oxignio (kLa) mostra-se como o critrio ideal para ampliao de escala.
Conforme visto no Captulo 14, de acordo com COOPER et al., 5 pode-se escrever:
(Vs)B

(15.9)

onde: kLa : coeficiente volumtrico de transferncia de 0 2 (h-1 )


P g: potncia transmitida ao fluido sob aerao (W)
V : volume de fluido (m3)
V5 : velocidade superficial (m s-1 )
sendo a velocidade superficial, V 5 , dada pela equao:
Q

-_4Q

nDi

Vs = - = - -

onde Q: vazo volumtrica de ar (m 3 . s-1)


S: rea da seco transversal do tanque (nDi I 4) (m 2 )
DT: dimetro do tanque (m)
Cabe aqui ressaltar que correlaes deste tipo podem ser utilizadas na ampliao de escala, desde que sejam vlidas para as escalas envolvidas. Normalmente, em cultivos com fungos ou bactrias filamentosas que geram caldos
no-newtonianos, devem ser utilizadas correlaes mais complexas que levem em
considerao variaes nas propriedades fsicas do caldo (vide captulo anterior).
Na ampliao de uma escala 1 para uma escala 2, mantendo-se o kLa constante, tem-se que:
logo,
(15.10)

O consumo de potncia para o sistema no aerado (P) se relaciona com o


consumo de potncia para o sistema aerado (Pg) atravs do nmero de aerao

342

Variao de escala

(N.), ou atravs de correlao do tipo da proposta por MICHEL; MILLER6 conforme

abordado no captulo anterior (Eq. 14.47), ou seja:

Pg a (
Sendo V a

f"

p~~~~

(15.11)

Df e, para o regime turbulento de agitao, P a N 3 Df, logo:


(15.12)

e, portanto:
(15.13)

Sendo, Vs

4Q

= - --e
2

Dr a Di tem-se:

1tDr
V 5 aQ
-

(15.14)

D~I

Assim, substituindo-se as equaes 15.13 e 15.14 na equao 15.10, tem-se


que:
(15.15)

e, portanto,
2 B-2,85 A

Di,
N2 =N1 ( o.,,

3,15 A

0,25 A-B
(

~:)

3,15 A

(15.16)

A relao Q1 I Q2 pode ser obtida de critrios de ampliao de escala para


a aerao, que sero abordados posteriormente. Quanto escolha dos valores
dos coeficientes A e B, estes devem ser escolhidos de acordo com o tamanho do
tanque, e do tipo de caldo que o processo gera (coalescente ou no coalescentevide Tabela 14.3- Captulo 1410). Vale aqui salientar que deve-se buscar obter,
em escala de bancada, correlaes de kLa com as dimenses do tanque e com variveis de processo, como por exemplo, as constantes A e B para osistema em
desenvolvimento, a fim de que se tenha maior segurana na ampliao de escala do bioprocesso.

Critrios para a ampliao de escala

343

As Figuras 15.5 e 15.6 ilustram aumentos de escala para os processos de produo


de estreptomicina e vitamina B12 baseados no critrio kLa constante, onde kLa = Kv H,
sendo Kv o coeficiente de absoro de 0 2 e H a constante de Henry (Captulo 14).

1,0

o 5L
"" 57m3

+--

Valor escolhido
para o
aumento de escala

10

KvP 104 (moi 0 2 mL-1 h-1)

Figura 15.5 - Ampliao de escala de um processo de produo de estreptomicina utilizando-se como critrio, kLa
7
1
1
constante (KARROWeta/. ) (Kv: coeficiente de absoro de 0 2 (moi 0 2 ml- h-I atm - ) , p: presso do arde entrada (atm)).

5,0 . - - - - - - , - - - - - - r - - - - , , - - - - - - - ,
6.1

/
I

:::;E

3::.
"'
rii

. 2 ' 5 r-

0-~
// !----~
o

!
!
'

>o .

o-- ...... _o
""
-

~.6

'-,

'

lo

0,0

'-----~L.,__

__..JL.,_L.,__ ___..JL.,__ ___..J

o
Figura 15.6 - Amplia~ de escala de um processo deproduo de vitamina B12 , utilizando-se como critrio kLa
constante (BARTHOLOMEW ).

15.2.3 - Constncia da velocidade na extremidade do impelidor (v"p)


Um outro critrio importante na ampliao de escala de fermentadores a
velocidade na extremidade do impelidor (vtip), que se relaciona com a freqncia
de rotao (N) e com o dimetro do impelidor (D;), da forma que segue:
---~-- - , -- - --- .- -c- - -~

-,.- -- --- -- --- -:-- - -- - - ~- --.- -~~ -~--- -- --

_..._____________ _

344

Variao de escala

(15.17)
A velocidade na extremidade do impelidor determina a velocidade de cisa-

lhamento mxima (Ymx), que por sua vez tem forte influncia no dimetro mdio
de bolhas, no tamanho dos aglomerados celulares e, principalmente, na viabilidade celular, como o caso de clulas sensveis ao cisalhamento como clulas de tecidos animal e vegetal. Pela sua importncia, muitas companhias de fermentao
utilizam esse critrio na ampliao de escala de fermentadores. Em geral, uma faixa satisfatria de vtip para a ampliao de escala de cultivos envolvendo microrganismos, situa-se entre 250-500 cm/s. 3
De acordo com a Eq. 15.17,

No procedimento de ampliao de uma escala 1 para uma escala 2, mantendo-se vtip constante, tem-se que:

portanto,
(15.18)

ou

15.2.4 - Constncia do tempo de

mistura(~)

Uma caracterstica comum observada na ampliao de escala de fermentadores que fluidos agitados em grandes tanques exibem caractersticas no uniformes. Em pequenos fermentadores (<500 L), principalmente na agitaoo de fluidos de baixa viscosidade, a mistura praticamente instantnea. J, em grandes
tanques (>5.000 L), a mistura se apresenta deficiente, fato este ilustrado por perfis, tanto de pH quanto de oxignio dissolvido, observados ao longo da altura
desses tanques. O tempo de mistura Um), definido como o perodo de tempo necessrio para a completa homogeneizao de um fluido agitado, quando adicionada uma pequena quantidade de um fluido distinto, sob o ponto de vista prtico pode ser utilizado como uma medida do grau de mistura ou de turbulncia
num vaso agitado.
NORWOOD; METZNER9 relacionaram o fator tempo de mistura (<I>) com o
nmero de Reynolds (NRe) para sistemas agitados com um impelidor tipo turbina
padro de ps planas, sendo a grandeza <I> definida como:

<I>=

t
m

(N D~)2/3 gl/6
1

H112 D3/2
L

o:/2

(15.19)

Critrios para a ampliao de escala

345

onde <1>: fator tempo de mistura (adimensional)


tm: tempo de mistura (s)
N: freqncia de rotao (rps ou s-1)
D;: dimetro do impelidor (m)
g: acelerao da gravidade (m s-2)
HL: altura de coluna de fluido (m)
D 1 : dimetro do tanque (m)
Um esboo da curva experimental de <I> em funo de NRe ilustrado pela Figura
15.7, que mostra que para NRe >lOs, <I> apresenta um valor constante em torno de 4,2.
102

10

103

10

105
NRe

Figura 15.7 - Fator tempo de mistura (<I>) em funo do nmero de Reynolds (N Re) (NORWOOD; METZNER\

Para valores de NRe >lOs, e sabendo-se que HL e D 1 so proporcionais a D;,


tem-se:
ou
Na ampliao de uma escala 1 para uma escala 2, mantendo-se o tm constante, tem-se que:

(~~r =(~l

ou

(15.20)

15.2.5 - Constncia da capacidade de bombeJ.mento


do impelidor (FL /V)
No interior de um tanque agitado, onde existe um bom grau de mistura,
existe tambm um tempo de circulao caracterstico (te). A capacidade de

346

Variao de escala

bombeamento (FL/V), dada pela relao entre a vazo de circulao do fluido


no interior do tanque (FL) e o volume de lquido (V), expressa esse tempo de
circulao Uc ~ 1/FL). Seria como se as ps do(s) impelidor(es) funcionassem
como ps de uma bomba centrfuga, impondo ao fluido uma determinada
quantidade de movimento.
Sendo,
FL a NDf

e, sabendo-se que V a Di e DT a Di, logo:


ND~I
D~I

e, portanto:
FL a N

(15.21)

Na translao de uma escala 1 para uma escala 2, mantendo-se (FL/V) constante, tem-se que:

logo,
(15.22)

15.2.6 - Constncia do nmero de Reynolds (N Re)

Outro critrio de ampliao de escala diretamente ligado ao grau de agitao ou de mistura no interior de tanques agitados, o nmero de Reynolds (NRe>
Sendo NRe dado por:

N Re

_pN D?
-

ll

tem-se,

pois p e 1.1 so constantes na ampliao de escala.


Logo, na ampliao de uma escala 1 para uma escala 2, tem-se que:

e, portanto,
----- -- -~ -- ----

347

Critrios para a ampliao de escala

(15.23)

ou

Quando se utilizam os critrios de ampliao de escala expostos anteriormente, as equaes obtidas, na maioria dos casos, apresentam relaes entre freqncias de rotao (N) e' dimenses (D;) para as duas escalas envolvidas. Essas
equaes expressam, apenas as condies de "agitao" da nova escala, mas no
trazem informaes sobre as novas condies de "aerao", quando se trata de
bioprocessos aerbios.
Nesses casos; os "critrios ou regras de aerao", normalmente recornendados,11 so os que seguem:
- nmero de aerao (NA) constante
-velocidade superficial de ar (V5 ) constante
- vazo especfica de ar (<l>.r) constante
Para o critrio nmero de aerao (NA) constante, sendo,
(14.46)

tem-se que:

~ -- ------ -------

(15.24)

ou

A velocidade superficial de ar (V5 ) definida corno:


4Q
Vs = - nD~
e, sendo, Dy a D;, tem-se:
V5 a

(15.14)

D~1

Portanto, para o critrio velocidade superficial (V5) constante, tem-se que:


(2.25)

No terceiro critrio de aerao, a vazo especfica de ar (<!>.r) definida corno:


<l>ar(vvm) =

var

V meio tempo

- Q

(15.26)

348

Variao de escala

Portanto, para o critrio vazo especfica de ar


que V a
tem-se que:
.

Df,

(~ar)

constante, sabendo-se

(15.27)

Na seqncia, sero ilustradas algumas comparaes entre os critrios de


ampliao de escala apresentados.
,,
ij
:I

li

15.3 - Comparaes entre critrios para a ampliao


de escala

If
![
li

Como um exemplo de utilizao dos "critrios de ampliao de escala", a


Tabela 15.2 ilustra as novas condies de agitao numa ampliao de escala de 10 a
5.000 L de um bioprocesso aerbio de produo de uma determinada enzima, para
vrios critrios de ampliao escolhidos. As condies de agitao e aerao na escala de bancada foram, respectivamente, 700 rpm e 0,3 vvm, sendo que durante a
ampliao foi eleito como critrio de aerao, vazo especfica de ar (~ar) constante.

lI'i

Tabela 15.2 - Variao da freqncia de rotao (N) numa ampliao de escala


(V 1= lO L- V2 =5000 L- $a,=0,3 wm)

il
!I

r[

'i

Critrio de ampliao de escala

N (rpm) (V= 5.000 L)

P/V

175,9

kta (A

= 0,5 e B = 0,5)

91,3

cisalhamento (utip)

88,2

tm *

1174,9

FtfV

700

NRe

11,1

Observando-se a Tabela 15.2, pode-se notar alguns aspectos interessantes.


Por exemplo, a escolha do critrio kLa constante, praticamente no se diferencia da
escolha de vtip constante, mostrando que, qualquer um desses critrios poderia ser
escolhido como base para a ampliao de escala desse processo, sem detrimento
do outro. Pode-se notar, ainda, que a escolha de qualquer um dos critrios, tm ou
Ft!V constante, recairia em condies absurdas de agitao para uma escala de
5.000 L.
Quando se realiza uma ampliao de escala com base num dado critrio,
mantendo-se a semelhana geomtrica, outras variveis importantes do processo

Comparaes entre critrios para a ampliao de escala

349

tambm variam na ampliao. Para alguns processos especficos, variaes bruscas em outra varivel pode at inviabilizar o aumento de escala nas condies preestabelecidas. Um exemplo disso, a ampliao de escala de um processo que
envolva clulas sensveis ao cisalhamento. Nesse caso, quando se elege um critrio
de ampliao de escala, deve haver a preocupao com a varivel relativa s novas condies de cisalhamento, qual seja, o produto ND;. Escolhido um dado critrio, caso as novas condies de cisalhamento no sejam satisfatrias, deve-se
eleger outro critrio de ampliao oti, ento, ajustar novas condies de agitao e
aerao que satisfaam a essas duas variveis.
A Tabela 15.3 ilustra as alteraes em outros critrios ou variveis do processo, quando se elege um dado critrio de ampliao de escala. Nessa ilustrao,
escolheu-se como escala de partida um fermentador de 60 L, e como escala final
um fermentador de 7,5 m 3, tendo-se, portanto, uma ampliao de escala de 125 vezes o volume inicial.
3
)

Tabela I5.3 - Relao entre variveis numa ampliao de escala (V 1 = 60 L- V2 = 7,5 m

Relaes
entre
variveis

PN

Fd V

ND;

NRe

tm*

N2 / Nl

0,34

0,2

0,04

1,5

(Fd2/(Fd1

42,7

125

25

187

P2/Pl

125

3125

25

0,2

10449

(P / Vh/(P!Vh

25

0,2

0,0016

83,6

(FdVh / (FdVh

0,34

0,2

0,04

1,5

(ND;h/(ND;h

1,7

0,2

7,5

(NReh / (NReh

8,6

25

37,4

Umh / (tmh

2,7

1,3

3,8

0,089

Critrios para ampliao de escala

Pelos dados da Tabela 15.3, para o aumento de volume escolhido (125 vezes), a varivel consumo de potncia (P) mostra-se muito sensvel aos critrios tm e
Fd V constantes, resultando num aumento de mais de 10,000 vezes quando se escolhe o critrio tm constante. Quanto s condies de cisalhamento (ND;), quando
se elege um critrio comum de ampliao de escala, como P I V, h um aumento de
70% nas condies de cisalhamento, chegando mesmo a um aumento de 7,5 vezes,
quando tm consta~te venha a ser o critrio escolhido.
Esses exemplos mostram que na ampliao de escala de fermentadores, apesar de toda a teoria envolvida, deve-se confiar" no bom senso para a escolha do melhor critrio de ampliao, o que faz da ampliao de escala uma verdadeira arte.
--- --- ------...- -- - - -~-~-- - ---- ----~-~---~------~ ------- - -~------c------------- --:-'------

:r
i!

!:

350

Variao de escala

Como discutido nos exemplos anteriores, deve-se, portanto, atentar para todas as variveis durante uma ampliao de escala, sendo que tabelas do estilo da
Tabela 15.5, apresentam-se como uma ferramenta de muita utili~ade, a fim de estudos comparativos.
Assim sendo, interessante detalhar como se pode construir tabelas desse
estilo, o que ser feito a seguir para dois casos tomados como exemplo.
Variao de NOi (ou vtip) mantendo-se P/V constante

Para o critrio P /V constante, tem-se que:


N 13 O~1 1 = N 23 O 12~

(15.8)

A Eq. 15.8 pode ser modificada na forma:


N~ O . N 2 0i =Nf O . N 10i
t, ~

l~

( v"P ),

( vlip ),

ou
(15.28)

A Eq. 15.8 pode tambm ser escrita na forma que segue:

o.

N 1 = _ 1_
,
N 2 ( o.t,

)2/3

(15.8)

Logo, substituindo-se na Eq. 15.28, tem-se que:

(15.29)

ou, sabendo-se que v (l

o;

(15.30)

ou

Assim, na Tabela 15.3, admitindo-se o critrio [(P /Vh/(P /V)tl


(NOJ 2
(NOJ 1

=( 7.500 )
60

119

=1, 7

1, resulta:

Reduo de escala

35 I

Variao de NRe mantendo-se FJV constante

Para o critrio FL/V constante, sabe-se que:


(15.22)
e, sendo:
N Re "" N D~1
N

Pode-se alterar a Eq. 15.22 para:

ou

Logo, tem-se que:


. (15.31)

ou

Ou seja, na Tabela 15.3, tomando-se o critrio [(FdV) 2 /(FL/V) 1] = 1, resulta:

=( 7.500) =25
2/3

(NReh
(NReh

60

As demais relaes, podem ser obtidas de forma anloga.

15.4 - Reduo de escala


Sempre que se menciona variao de escala, pensa-se em ampliao de escala. No entanto, a operao de reduo de escala muito freqente nas indstrias
que se baseiam em processos fermentativos.
Em uma instalao j em operao, lembrando-se que os conhecimentos bsicos da rea avanam com muita rapidez, h sempre a necessidade da operao
de pequenos reatores, a fim de que sejam incorporados novos conceitos ao processo em operao. Isso reafirma o que foi mencionado no item 15.1, ou seja, o continuado emprego de reatores de menor porte na tarefa de pesquisa na empresa.
Outros aspectos que exigem a operao em menor escala so, entre outros, a
introduo de uma nova linhagem de microrganismo responsvel pelo processo
fermentativo e ensaios de novos lotes de matria-prima.
De fato, jamais se emprega uma nova linhagem, que tenha sido isolada ou
que tenha sido obtida por mutao, diretamente na escala industrial. Na verdade,

3 52

. Variao de escala

uma nova linhagem deve ser exaustivamente ensaiada em escalas de laboratrio e


piloto, a fim de se adequar as condies de operao s caractersticas deste novo
material biolgico.
Da mesma forma, como freqentemente se empregam meios de cultura naturais (farinhas diversas, gua de macerao de milho, melao, etc.), cuja composio
qumica mal conhecida, h sempre a necessidade de ensaiar novos lotes desta rp.atria-prima em reatores de menores dimenses, visando observar o desempenho do
processofermentativo para evitar surpresas nos reatores industriais.
Deve-se lembrar, ainda, que a obteno de resultados no satisfatrios na escala industrial pode ser devida a fatores pouco imaginados, como o caso de uma
distinta destruio de nutrientes durante as esterilizaes descontnuas do meio
de cultura na escala industrial e nas escalas de bancada ou piloto, em virtude de
perfis distintos de temperatura nestas diferentes escalas de trabalho.
Essa possibilidade pode ser verificada, efetuando-se ensaios tpicos de reduo de escala. Para tal, pode-se esterilizar o meio de cultura no reator industrial,
finda a qual colhe-se amostras com assepsia para a operao em reatores de bancada, efetuando-se a inoculao com o mesmo inculo empregado na escala industrial. Dessa forma, acompanha-se o desempenho do processo em ambas as escalas
e, em paralelo, observa-se o desempenho em reator de bancada cujo meio tenha
sido esterilizado in loco. Tal operao em igualdade de condies na pequena escala, tendo-se como nica varivel a esterilizao nas distintas escalas, permite observar a influncia da operao de esterilizao no comportamento do processo
fermentativo.
Essas observaes, ao lado de outras que poderiam ser descritas, tornam clara a idia da necessidade de uma continuada evoluo do processo, pois a situao considerada tima em um dado instante pode deixar de s-lo com a evoluo
dos conhecimentos.

IS.S - Consideraes finais

Conforme j salientado, freqente dizer-se que a tarefa de ampliar escala


uma "arte". Isso assim, em virtude da necessidade de se contar com muita experincia especfica, relativamente ao processo fermentativo em desenvolvimento.
Essa experincia s pode ser obtida atravs da observao de resultados experimentais obtidos em escala de bancada.
Deve-se lembrar que a obteno de dados em pequena escala significa um
custo relativamente reduzido, quando comparado com o custo da construo e
operao de uma instalao piloto ou industrial. Assim sendo, a deciso sobre a
construo e operao de uma instalao piloto deve ser tomada aps se contar
com certo grau de segurana, bseado no conhecimento do processo. No entanto,
deve-se tambm lembrar que no existe a disponibilidade de um tempo infinito
para se tomar essa deciso, assim como nunca se contar com o total conhecimento do processo, em virtude do tempo que isto iria demandar, perdendo-se a
oportunidade de lanar um novo produto no mercado. Conclui-se, portanto, que
um certo risco sempre estar presente, o que acentua o aspecto "arte", acima
mencionado.

Referncias Bibliogrficas

353

Um ponto que tambm deve ser comentado a freqente heterogeneidade


do reator industrial de grande porte. Isso significa que o microrganismo poder ficar exposto a valores diferentes de pH, temperatura, concentrao de oxignio dissolvido, etc., ao longo da altura do fermentador, fato este difcil de ser previsto em
escalas menores.
Ainda, quando se pensa em ampliar escala, imagina-se o emprego de reatores geometricamente semelhantes. No entanto, essa semelhana geomtrica difcil de ser mantida entre as vrias escalas, pois isto pode levar a reatores com
dimenses que poderiam, por exemplo, dificultar o seu transporte para a instalao industrial. Assim sendo, dependendo do volume necessrio para uma dada
produtividade, deve-se pensar em projetar um certo nmero de reatores com dimenses mais razoveis, do que um nico, ou poucos reatores de grandes dimenses, que exigiriam geometrias especiais. Na verdade, deve-se fazer vrios
exerccios e, dentro da experincia com a construo e operao desses biorreatores, escolher a situao mais conveniente.

Referncias Bibliogrficas
(1) EINSELE, A. Scaling-up bioreactors. Process Biochem., vol. 13, p. 13-14, 1978.
(2) OLDSHUE, J.Y. Current trends in mixer scale-up techniques. In: ULBRECHT, J.J.;
PATTERSON, G.K. Mixing of liquids by mechanical agitation, Nova York, Gordon and Breach Science Publishers, p.309-42, 1985.
(3) WANG, D.I.C.; COONEY, C.L.; DEMAIN, A.L.; DUNNILL, P.; HUMPHREY, A.E.;
LILLY, M.D. Fermentation and enzyme technology. Nova York, John Willey & Sons, 1979.
(4) RUSHTON, J.H.; COSTICH, E.W.; EVERETT, H.J. Power characteristics of mixing
impellers. Part li. Chem. Eng. Progress, vol. 46, p.467-76, 1950.
(5) COOPE~, C.M.; FERNSTROM, G.A.; MILLER, S.A. Performance of agitated
gas-liquid contactors. Ind. Eng. Chem., vol. 36, n 6, p.5Q4-09, 1944.
(6) MICHEL, B.J.; MILLER, S.A. Power requirements of gas-liquid agitated systems.
A.I.Ch.E. J., vol. 8, n 2, p.262-66, 1962.
(7) KARROW, E.O.; BARTHOLOMEW, W.H.; SFAT, M.R. Oxygen transfer and agitation in submerged fermentations. Agricult. And Food Chem.,vol. 1, n 4, p.302-06, 1953.
(8) BARTHOLOMEW, W.H. Scale-up of submerged fermentations. Adv. Appl. Microbiol., vol. 2, Nova York, Academic Press, Inc., p.289-300, 1960.
(9) NORWOOD, K.W.; METZNER, A.B. Flow patterns and mixing rates in agitated vessels. A.I.Ch.E. J., vol. 6, p.432-37, 1960.
(10) VAN'T RIET, K. Review of measuring methods and results in non-viscous
gas-liquid mass transfer in stirred vessels. Ind. Eng. Chem. Process. Des. Develop., vol. 18,
p.367-75, 1979.
(11) KOSSEN, N.W.F.; OOSTERHUIS, N.M.G. Modelling and scaling-up of bioreactors.
In: REHM, H.J.; REED, G; Biotechnology, Weinheim, VHC Publishers, vol. 2, p.571-606, 1985.

355

Jos Geraldo da Cruz Pradella

16.1 - Introduo
Os sistemas com clulas imobilizadas tm como principal caracterstica o
uso de alguma estrutura fsica de confinamento e que obriga as clulas a permanecerem em uma regio particular de um biorreator.
Devemos distinguir essencialmente dois tipos de processos fermentativos
realizados atravs de clulas imobilizadas.
O primeiro aquele que utiliza uma ou algumas das enzimas contidas nas
clulas, no havendo nece?sidade da existncia de coenzimas (ATP, NADH e outro~) e vias anablicas presentes na replicao celular.
Em outras palavras, as clulas no necessitam estar vivas quando imobilizadas; somente deve estar ativo o sistema enzimtico envolvido na converso bioqumica requerida.
Exemplo marcante desse processo a produo industrial de cido mlico,
cido asprtico e o xarope de frutose de milho (High Fructose Corn Syrup). 1
O segundo tipo de processo que utiliza clulasimobilizadas aquele em que
se impe a necessidade de manter a viabilidade celular, uma vez que os produtos
a serem formados requerem mltiplos passos de transformaes, regenerao de
coenzimas, presena de cadeia respiratria, vias metablicas geradoras de intermedirios e outros mecanismos inerentes s clulas vivas.
As principais vantagens dos sistemas com clulas imobilizadas citadas na literatura so as seguintes:
a) possibilidade de utilizao de altas concentraes celulares no volume
reacional, implicando em maiores velocidades de processamento;
b) operao de sistemas contnuos vazo especfica de alimentao acima
da velocidade especfica mxima de crescimento, !lmx' caracterstica da clula
no imobilizada;

356

Reatores com clulas imobilizadas

c) eliminao de problemticos reciclos externos de clulas atravs de uso de


sedimentadores, filtros centrfugas;
d) provvel obteno de maiores fatores de converso de substrato ao produto desejado;
e) possibilidade de utilizao de .projeto de biorreatores mais adequados

cintica do sistema biolgico utilizado;


f) maior proteo. ao sistema biolgico em relao ao estresse ambiental,
ocasionado por elevadas concentraes de substratos, pH e cisalhamento.
Alm disso, esse sistema nico no sentido de possibilitar a utilizao de
fermentao submersa, para o cultivo de linhagens de clulas de mamferos dependentes de ancoragem em um suporte para seu desenvolvimento adequado.
Este captulo tem como objetivo abordar os principais aspectos relacionados
com os processos que utilizam o sistema de clulas imobilizadas que detm sua
capacidade vital. Informaes sobre os processos que utilizam clulas no viveis
podem ser encontradas em literatura.2' 3

16.2 - Mtodos de imobilizao


A imobilizao geralmente conseguida atravs do contato de um material
utilizado para a imobilizao com as clulas vivas que se pretende imobilizar, sob
condies ambientais controladas. O material utilizado para a imobilizao denominado suporte.
As principais caractersticas de um suporte para a imobilizao de clulas
vivas so as seguintes: a) no toxidez s clulas; b) alta capacidade de reteno;
c) resistncia ao ataque qumico e microbiano; d) pouca sensibilidade s possveis solicitaes mecnicas, seja de compresso por peso, de tenses de cisalhamento ou eventuais presses internas e externas de gases; e) alta difusividade de
substratos e produtos.

Os suportes mais utilizados na imobilizao de clulas vivas esto apresentados na Tabela 16.1.
Deve-se destacar que existe possibilidade de se utilizar combinao desses
materiais para produo de novas matrizes imobilizadoras e de se proceder modificao da superfcie dos suportes, com a finalidade de se introduzir grupos funcionais que sero responsveis pela imobilizao.
Existem basicamente trs mtodos de imobilizao de clulas em suportes, a
saber, adsoro, ligao covalente e envolvimento.
Os mecanismos de interao clula-suporte so diferenciados para cada
uma dessas tcnicas.

16.2.1 - Adsoro
Segundo MESSING/ as foras de interao entre a superfcie celular e a superfcie do suporte no mtodo da adsoro so complexas e envolvem mltiplos
tipos de formao de ligaes. Deve-se destacar aqui as interaes eletrostticas

- - -:--

Mtodos de imobilizao

357

entre cargas opostas de parede celular e superfcie do suporte, a formao de ligaes inicas entre grupos amnicos e carboxlicos da parede celular e um grupo
reativo da superfcie do suporte e a formao de ligaes covalentes parciais
entre grupos amnicos da parede celular e grupo hidroxila ou silano (SiO-) da
superfcie do suporte. Considera-se, ento, adsoro a adeso de clulas em
suportes que no foram especialmente funcionalizados para a .ocorrncia de
ligao covalente. A principal limitao da tcnica reside no fato de que existe
influncia bastante acentuada das condies ambientais promovidas pelo
meio de cultivo na capacidade de reteno das clulas no suporte, mormente
as relacionadas com concentrao inica, pH e idade da populao celular que
se deseja imobilizar.
Tabela 16.1 - Materiais utilizados na produo de suportes para imobilizao de clulas vivas
Polmeros naturais

Polmeros sintticos

Materiais inorgnicos

Alginato

-Poliacrilamida

Alumina

K-carragenana

Cloreto de polivinila

Slica

Agar

Poliestireno

Zircnia

Pectina

Poliuretano

Vidro

Celulose

Polietileno

gli~ol

Diatomita

Colgeno
L .-

li
1'

.I

Vermiculita

Dextrana

c_/;~ ro..~ ~ ;-'~ ~l~~t~.i ij

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"
i~-; .....

Os materiais mais comumente utilizados na adsoro so os inorgnicos e os


polmeros sintticos mostrados na Tabela 16.1. Deve-se salientar que esses materiais
tm sido submetidos a tratamentos superficiais, visando a obteno de estruturas
macroporosas, com o intuito de se incrementar a capacidade de reteno do suporte. A Tabela 16.2 d alguns exemplos ilustrativos de suportes comerciais utilizados no mtodo de adsoro e suas principais caractersticas.

16.2.2 - Ligao covalente


No mtodo da ligao covalente, os suportes so especialmente funcionalizados para conter um grupamento qumico, que ser responsvel pela imobilizao
da clula ao suporte. A literatura descreve vrias tcnicas que se utilizam desse
princpio. Uma das mais utilizadas a silanizao de esferas de vidro, seguida de
reao com glutaraldedo.
Nessa metodologia, esferas de vidro de cerca de 100 a 500 micra so primeiramente tratadas com o reagente y-aminopropil-trietoxisilano (APTS) . Posteriormente, o grupamento amina resultante reage com glutaraldedo, de forma
a se produzir uma estrutura espacial que possui um grupamento -HC=O altamente reativo (Figura 16.1). A interao da clula com o su:Eorte se d pela ligao da carbonila do suporte com aminas daparede celular. '4

- -- :-- -- - --- , - - --. -----. ~ -. -.,.,. ;------- --..,_-.--- ---- -,.,....- ---- ~ -.-......,..,...----

.. --- -

i!

ii '

358

Reatores com clulas imobilizadas

Tabela 16.2 - Suportes comerciais utilizados no mtodo de adsoro

Nome comercial

Material

Dimetro
(mm)

Densidade
(g/mL)

Clula

Cytodex

Dextrana

0,20

1,04

Mamfero

Cytopore

Celulose

0,23

1,03

Mamfero
microrganismo

Cytoline

Polietileno e
slica

2,0 a 2,5

1,03 a 1,3

Mamfero
microrganismo

Siran

Vidro poroso

1,0 a 2,0

1,6

Microrgailismo

A grande limitao dessa metodologia para imobilizao de clulas vivas a


potencial toxicidade do sistema, conferida pela presena do glutaraldedo.

16.2.3 - Envolvimento
O envolvimento o mais utilizado dos mtodos de imobilizao de clulas vivas pela sua facilidade, baixssima toxidez e alta capacidade de reteno celular. A
tcnica consiste no confinamento fsico de uma populao celular em uma matriz
polimrica formadora de um gel hidroflico. Os poros da matriz formada so menores que as clulas contidas em seu interior.
Em contato com o meio de cultura, h o estabelecimento de um fluxo de
substratos para dentro das partculas de gel, onde so consumidos pela populao
imobilizada. Os produtos formados no interior da matriz difundem-:se atravs do
gele se acumulam no meio de cultura. Os materiais mais utilizados para produo
das partculas de gel so os polmeros naturais agar, k-carragenana, alginato e
pectina. A gelificao do primeiro realizada simplesmente pelo abaixamento de
temperatura e, dos ltimos, atravs da ao de um ction mono ou bivalente,
como K+ ou Ca 2+. O mtodo consiste ein se preparar inicialmente uma soluo do
polmero em gua a 1 a 4% em pes(). Em seguida suspende-se nessa soluo uma
populao celular previamente crescida. Procede-se ento ao gotejamento da suspenso clulas-polmero em uma soluo aquosa de CaC1 2 ou KCI 0,05 a 0,5 M, sob
agitao branda. As partculas formadas tm dimetro de 0,5 a 5 mm e densidade
populacional at cerca de 250 mg de biomassa seca g-1 de matriz. 5 A Figura 16.2
ilustra o procedimento.
O gel de poliacrilamida utilizado para o envolvimento das clulas vivas de uma maneira diferenciada. Uma soluo aquosa do monmero acrilamida pr~polimerizada em presena de um catalisador orgnico que possui
um radical amina. A cultura celular ento suspensa na soluo do polmero,
efetuando-se a seguir a adio de um agente para produzir as ligaes cruzadas responsveis pela gelificao da matriz. Posteriormente, a matriz obtida
granulada e utilizada nos biorreatores. O detalhamento dessa metodologia foi
.
descrito por FREEMANN. 6
----'- --~ ---~ -- --------.-------;--- - ~-

- - -- - - - --- -- -~

..

Mtodos de imobilizao

359

o
Suporte

-O-Si-C-C-C-NH2

; O

Resultante do tratamento de APTS e suporte

li

11

Suporte -O-Si - C - C - C - N- C-C- C - C - C

o
I

Resultante do tratamento do aminoalquil-suporte com glutaraldeldo


Figura 16.1 - Preparao de suporte para imobilizao de clulas por ligao covalente.

A principal desvantagem da tcnica de imobilizao por envolvimento a limitao imposta pela difuso intraparticular d~substratos e produtos metablicos.
O tamanho da partcula, a difusividade das espcies atravs da matriz polimrica e a concentrao celular na partcula devem ser otimizadas, no sentido de
se minimizar esses efeitos.

Polissacarldeo + clulas

o
Partlculas contendo
clulas imobilizadas

Soluao de KCI ou CaCI 2

Agitador magntico
Figura 16.2 - Imobilizao de clulas por envolvimento em gel hidroflico induzida por CaH e K+.
~---- - -

--. --- - ---- -- --

-----.----- ---- -...----.,------------ -- -- -

-~ --- -

------;---

---- - - - -.-- -- - - ----------.-----

3 60 . Reatores com clulas imobilizadas

16.3 - Tipos de biorreatores empregados


O confinamento celular, ensejado pelas tcnicas de imobilizao, permite a utilizao de biorreatores de configurao bastante diferenciadas do tradicional fermentador do tipo tanque continuamente agitado (STR). A maior
parte dos biorreatores estudados para sistemas com clulas imobilizadas,
constituem-se de colunas operadas continuamente, contendo um leito fixo ou
fluidizado das partculas com as clulas imobilizadas. 8

16.3. 1 - Leito fixo


O leito fixo disposto verticalmente tem sido o mais utilizado (Fig.l6.3a).
Normalmente a coluna esterilizada e empacotada com as partculas de gel hidroflico que contm as clulas imobilizadas, no caso da utilizao da tcnica de
envolvimento.
Quando o mtodo escolhido a adsoro ou ligao covalente, aps o empacotamento e eventual esterilizao da coluna, faz-se circular atravs do leito
uma suspenso celular previamente cultivada, para a promoo de sua adeso s
partculas.
Para prevenir a compactao do leito formado pelas partculas de gel hidroflico, tem sido proposta a utilizao de colunas de seo circular ou retangular
munidas de chicanas transversais/ ou de colunas em estgios. 10
Os leitos fixos de partculas imobilizadas, particularmente por adsoro,
apresentam tambm dificuldades operacionais quando em operao contnua
de longa durao, devido ao sobrecrescimento da biomassa celular dentro do
leito fixo, ocasionando o bloqueio fsico do sistema, com a formao de caminhos preferenciais e conseqente queda de converso. Alguns autores tm procurado contornar o problema, atravs da admisso peridica ao sistema de
meio de cultura limitado em algum nutriente, 11 ou da passagem fceqente de
uma corrente gasosa (N 2 ou C02 ), visando a remoo do excesso de biomassa

formada. 12
Nos processos biolgicos onde a evoluo de C0 2 intensa, produzindo
aumentos indesejveis de presso e formao de caminhos preferenciais, tem
sido proposta a utilizao do leito fixo horizontal (Fig. 16.3b). Esse arranjo tem
proporcionado desempenhos mais satisfatrios para esse tipo de processo. A colocao de chicanas nesse sistema tambm tem sido til para a minimizao de
problemas de retromistura ("backmixing") do fluido que escoa atravs do leito.
A eliminao desse fenmeno particularmente til em processos fermentativos
que possuam inibio pelo produto.11
O controle dos principais parmetros de processo (pH, oxignio dissolvido e
temperatura) obviamente bastante complicado de se efetuar no leito fixo.
Uma formulao bastante original desse tipo de biorreator a utilizao de
um leito fixo de fluxo paralelo, formado de placas de gel de resina de polietilenoglicol fotopolimerizada (Fig. 16.3c) proposta por NOJIMA; YAMADA. 7

- .- - -.. - - .------- --- ---- -- -

- ~ ----- - -- ----- -----..,. - ---------~


. -.

Tipos de biorreatores empregados

36 I

Os autores sustentam que esse arranjo sobrepuja vrios dos problemas encontrados com os leitos fixos convencionais, quais sejam, entupimento por sobrecrescimento da biomassa, necessidade de remoo do C02 formado e formao de
caminhos preferenciais. O controle das principais variveis de processo tende a
ser tambm mais fcil de se efetuar. O leito fixo proposto opera de forma vertical e
a manufatura das placas com as clulas imobilizadas, segundo os autores, pode
ser efetivada em larga escala e de forma assptica.

16.3.2 - Leito fluidizado


Outro tipo de biorreator bastante estudado o leito fluidizado (ou expandido) de partculas de clulas imobilizadas por adsoro ou envolvimento. A literatura descreve configuraes diversas desse tipo de fermentador.

Sada de gs
Sada de gs
Produto
Substratato

Produto

(b)

(a)
Substrato

Sada de gs e produto

(c)

Substrato

Figura 16.3 - (a) Leito fixo vertical; (b) Leito fixo horizontal; (c) Leito fixo de fluxo paralelo.

362

Reatores com clulas imobilizadas

Basicamente o biorreator constitui-se de uma coluna vertical de seo circular, dentro da qual as partculas com as clulas imobilizadas so carregadas, at
cerca de 70% do volume til do fermentador, e fluidizadas ou expandidas atravs
de um dos seguintes mecanismos: a) introduo na base da coluna de ar atmosfrico ou <;ie um gs inerte (N2 ou C02 ); b) reciclo parcial do efluente da coluna; c) movimentao interna do fluido promovida por agitao mecnica (Fig. 16.4a, b, c) .
Eventualmente a expanso do leito pode ser promovida pelo prpio ~s carbnico
1 13
formado durante o processo, como o caso da fermentao alcolica. '

Sarda de gs

\
U

7Produto

C)uO

Oooo

~oo

(a)

c&

Substrato

~00

-~--~

Safdade gs
Produto

1:

Gs inerte

Safdade gs
Produto

Substrato
1: agitador

Figura 16.4 - (a) Leitos flu idizados por reciclo, (b) gs e (c) agitador.

. - - -- -- - - - - .------- ------- ~-. ------- -- - - ---:----

- -

---,------- -- .. .. - -- . - .. - ----"

363

Aspectos relativos ao transporte de massa

As principais dificuldades encontradas nos leitos fixos (remoo de gases e


do excesso de biomassa, dificuldade de controle de variveis de processo) so facilmente contornveis nos leitos fluidizados.
possvel afirmar-se que, de uma maneira geral, os sistemas de leito fluidizado possuem escoamento mais prximo do tipo mistura completa ("backmixing") e os de leito fixo, do tipo pistonado ("plugflow"). Assim, biorreatores de
leito fluidizado em srie pofiem eventualmente ser utilizados para aqueles processos que se beneficiem de um escoamento mais prximo do tipo pistonado,
como o caso da fermentao alcolica. 14

16.4 - Aspectos relativos ao transporte de massa


16.4.1 - Efeitos difusivos
Um dos aspectos mais importantes dos sistemas com clulas imobilizadas o
efeito que as limitaes de transporte de massa de reagentes e produtos podem impor sobre a cintica das transformaes bioqumicas realizadas pelas partculas.
Essas resistncias so devidas ao filme de fluido que se forma ao redor das partculas (difuso interparticular) e ao transporte condutivo atravs das partculas (difuso
intraparticular), como mostra a Figura 16.5. Assim, a eficincia (rl) de uma partcula
que contm clulas imobilizadas definida como sendo a relao entre a velocidade
real de reao, rP' e a velocidade reacional mxima possvel na ausncia de qualquer
limitao de transporte de massa, r mx, dado por :

(16.1)
A difuso interparticular depende das condies hidrodinmicas do fluido
ao redor das partculas, a saber, velocidade do fluido, dimetro da partcula e
propriedades fsicas do fluido como viscosidade e densidade. A transferncia
de massa de uma molcula (substrato ou produto) atravs do filme de fluido
que se forma ao redor de uma partcula diretamente proporcional diferena
de concentrao dessa molcula noseio do fluido e na superfcie externa da matriz imobilizadora. O coeficiente de transporte de massa,nesse caso contido no
adimensional denominado nmero de Sherwood (Sh=kx O I c o. ), est relacionado com o nmero de Reynolds (Re=O v p/J.t) e com o nmero de Schmidt
(Sc=J.l/ p O.) atravs de uma equao da seguinte forma:
Sh=a Ren b Sem

(16.2)

onde: O = dimetro da partcula (m)


v = velocidade do fluido (m.s-1)
p = densidade do fluido (kg.m-3)
J.l =viscosidade do fluido (kg.m- 1 .s-1 )
kx = coeficiente de transferncia de massa atravs do filme (moles m 2 .s-1)
o. = difusividade do substratoS (m2 .s-1 )
c = concentrao molar (moles m '3)
a, n, m = constantes da equao (16.2).
~----- ---- - -.--- -.--------- - ------- --- -------------- -------.-.~:- --- - -.- ~ ---- ---- .

-- - -- --

---- .... ". --------- ------ - - ------------- . . --- -

364

Reatores com clulas imobilizadas

.r.

Substratos difundindo
para dentro

Filme de fluido

Produtos
difundindo para fora

Figura I6.5 - Efeito difusivo em partcula de clulas imobilizadas de dimetro D.

Assim, o aumento do coeficiente de transporte de massa, kx, atravs do filme


de fluido proporcional ao aumento do nmero de Reynolds do sistema.
Esse efeito pode ser conseguido atravs do aumento da velocidade do fluido, v, no caso de reatores de leito fixo e aument0 da velocidade de agitao ou da
vazo de reciclo, no caso dos reatores de leito fluidizado. Nesse caso, rP~rmx e
16
11~1< ' ), e a velocidade de reao se torna a mxima possvel rmx
A difuso intraparticular depende da concentrao celular, da estrutura e do
tamanho da matriz que contm as clulas imobilizadas, e do tamanho das molculas que se difundem atravs das partculas. A transferncia de massa de uma molcula (substrato ou produto) atravs de uma partcula formada pela matriz
imobilizadora e pelas clulas imobilizadas diretamente proporcional ao grqdiente da concentrao dessa molcula na superfcie externa da matriz imobilizadora e
no centro da partcula (eq. 16.3). O coeficiente de transporte de massa nesse caso
dado pela difusividade efetiva D. 1, e, segundo KLEIN e VORLOP/ 7 est relacionado
com outras propriedades das partculas, segundo a eq. 16.3:
15

N s =-Def (ds / dr)

(16.3)

onde: N 5 =fluxo molar de S atravs da partcula (moles m-2.s-1)


D. 1 = difusividade efetiva de S atravs da partcula (m 2.s-1 )
dS/dR =gradiente de concentrao de S.
O valor de D.1 deve ser medido experimentalmente, e metodologias so
apresentadas na literatura para sua determinao em matrizes de gel. 17
No caso da difuso intraparticular, a eficincia da reao 11 est correlacionada com um grupamento adimensional, denominado mdulo de Thiele, <I>, que
proporcional razo da velocidade real da reao e velocidade de difuso do
substrato ou do produto atravs da partcula. A literatura descreve vrios tipos
desse adimensional, dependendo do tipo da cintica do processo fermentativo em
questo e da geometria da partcula com as clulas imobilizadas. 17' 18' 19l
Um exemplo que ilustra o desenvolvimento matemtico do efeito difusivo e
suas implicaes na cintica do processo fermentativo pode ser encontrado em

Aspectos relativos ao transporte de massa

365

LUONG/ 0 que estudou a fermentao alcolica contnua em leito fixo realizado


por clulas de Zymomonas mobilis imobilizadas em partculas de gel hidroflico
de K -carragenana . O meio de cultura empregado tinha glicose como substrato
limitante. Nesse caso, estabeleceu-se uma relao entre a eficincia da reao
11 e o mdulo de Thiele <I>, ilustrada pela Figura 16.6. O mdulo de Thiele era
dado por:
(16.4)
onde: R = raio da partcula (m)
K. = constante de limitao do substrato (kg.m-3)
b =razo da rea superficial da partcula e seu volume (m2 .m-3 )
Na Figura 16.6 St a concentrao da glicose no seio do fluido.
O autor afirmou, que numa situao de concentrao de substrato (glicose) igual a 10 g/L, os efeitos difusivos eram desprezveis se o dimetro da
partcula fosse igual ou menor que 1 mm para a concentrao de clulas na
matriz de 276 g/L. Nesse caso, o fator de efetividade calculado, levando-se
em conta a eq. 16.4 e a Figura 16.6, era de 0,95. Assim, a velocidade real do
sistema se aproximava velocidade mxima possvel r m x Por outro lado,
partculas que apresentavam concentrao celular de 27,6 g/L possuam velocidade mxima possvel inferior ao caso anterior. Nessa situao, a utilizao de partculas de dimetro maior (3 mm) no ocasionava efeitos difusivos
,
20
a prec1a ve1s.

16.4.2 - Modelagem matemtica


A modelagem matemtica de sistemas com clulas imobilizadas b.astante
complexa.
Para a descrio dos reatores que se utilizam desse sistema, aos efeitos de
inibio por substratos e produtos de metabolismo que so tradicionalmente adicionados cintica clssica proposta por Monod, devem ser acrescidos tambm
efeitos fsicos.
Esses ltimos esto relacionados com a transferncia de massa de substratos e produtos, com o desvio de comportamento ideal do fluxo de fluido
atravs dos reatores e com a mudana da fisiologia das clulas imobilizadas.
Ess.e fatores so normalmente descritos por sistemas de equaes diferenciais parciais, que podem ser resolvidas numericamente (mtodo de colocao ortogonal e mtodo de Runge-Kutta de quarta ordem, por exemplo), utilizando-se
computador.
Est alm do escopo deste captulo a explorao dessa metodologia, e a
literatura possui vrios exemplos da tcnica .21 ' 22 ' 23
-- ~ --.-----....,----:- -.----.'---- --------.-:-- --- ~~- ----- -- -

366

Reatores com clulas imobilizadas

10

20

50

70 100

<l>

Figura 16.6 - Relao de TI e <I> para Z. mobilis imobilizada em K -carragenana em fermentao


alcolica contnua, para 51 = I Og/L. 20

16.5 - Processos que utilizam clUlas imobilizadas


Provavelmente o mais antigo dos processos que faz uso das clulas imobilizadas remonta ao sculo passado, e se constitui na fermentao actica de uma
corrente de vinho, que reciclada atravs de um leito fixo formado de suporte, o
qual abriga uma populao nativa de microrganismos acidognicos. 8
Nos ltimos anos, a partir de um trabalho pioneiro de imobilizao de clulas microbianas e de organelas em gel hidroflico de alginato de clcib, descrito por KIRSTEN, BUCKE/4 o tema ganhou novo impulso e uma grande
quantidade de informaes, abrangendo virtualmente todos os produtos de
sntese realizadas ~or clulas livres, tem sido tambm experimentadas por clulas imobilizadas. 5' 26 O objetivo deste captulo no fazer uma reviso extensa do tema, mas to-somente descrever alguns exemplos de aplicao, para
apontar as potencialidades do mtodo.

16.5. I - Produo de etano!


A fermentao alcolica contnua de carboidratos por leveduras e bactrias
tem sido, entre os sistemas imobilizados de clulas vivas, o mais estudado nos
ltimos anos.
A tcnica de imobilizao mais empregada a de envolvimento em gel hidroflico onde se destacam as matrizes formadas por alginato, K-carragenana e
pectina. Resinas de troca inica e polimerizadas por fotorradiao tambm tm
obtido sucesso. Em virtualmente todos esses sistemas, altas concentraes de clulas excedendo 100 g de biomassa/litro de reator so alcanadas, com elevados valores de fator de converso de carboidratos a etanol consumo da fonte de
carbono quase que completo. Produtividades, em etanol de cerca 20 a 30 g/litro
de reator h para Saccharomyces cerevisiae imobilizada em gel hidroflico e de at 100
g/litro de reator h para Zymomonas mobilis imobilizada em resina de troca inica,
so apontadas na literatura. 11

.....

Processos que utilizam clulas imobilizadas

361

Reatores de leito fixo (vertical, horizontal ou de fluxo paralelo) e leito fluidizado tm sido utilizados com sucesso, e vrios so os dispositivos empregados
para superar os inconvenientes inerentes a esse processo, ligados principalmente
enorme produo de gs carbnico associado ao etanoL
. Pelo menos um processo, que utiliza levedura imobilizada em gel de alginato
de clcio em reatores de leito fluidizado, desenvolvido pela Kyowa Hakko Kogyo
Co. do Japo, foi demonstrado em escala piloto27 (Fig. 16.7) . A imobilizao das clulas foi realizada atravs do gotejamento da suspenso de levedura e alginato de
sdio dentro dos reatores, que eram previamente preenchidos com uma soluo de
cloreto de clcio. O sistema operava com a alimentao contnua de uma soluo
de melao diluda a uma concentrao de carboidratos de 150 g/L, alimentada na .
base do primeiro fermentador. A fluidizao dos leitos era alcanada devido
grande quantidade de co2 formado .
A produtividade do sistema foi de 20 g de etanol/litro de reator h, a uma
concentrao de etanol no caldo fermentado de 68 g/L e rendimento da fermentao de 95% do valor terico.
Afirma-se que a planta piloto produzindo 12 m 3 de etanol por dia operou,
nas condies acima descritas, por 6 meses, sem perda de estabilidade. Essa caracterstica foi conseguida, segundo os autores, graas adio de esterides na matriz de imobilizao e pela aerao adequada dos reatores, o que proporcionou
uma populao de leveduras imobilizadas altamente vivel.
Os valores de produtividade em etanol e de rendimento da fermentao so
superiores aos processos de produo de etanol do tipo batelada alimentada (processo Melle-Boinot), hoje operando em nosso pas, que so respectivamente da ordem de 6 g de etanol/litro de reator h e 86%.28

.
Levedura

Alginato e esterides

Caldo para
destilaria

Melao

A9ua
ar

Figura 16.7 - Fluxograma simplificado para produo de etano! utilizando levedura imobilizada.27
--;---- -.----,----,

- - --~------ -------~

------ ......... ----..~.. ~~"":- "-------------------. -. ---- -- -- ... ____ _, ____ ---- --- - ------- -- -- -

368

Reatores com clulas imobilizadas

16.5.2 - Produo de antibiticos

A produo de antibiticos com clulas imobilizadas tambm tem sido


objeto de estudo. 25 ' 26 Uma das abordagens mais interessantes nesse tema a
descrita por ARCURI et al. 29 do Centro de Pesquisas da companhia Merck,
Sharp & Dohme dos Estados Unidos. Nesse trabalho, estudou-se a sntese do
antibitico thienamicina por clulas de Streptomyces cattleya imobilizada em
partculas de celite, de granulometria de 60 a 80 mesh. A imobilizao se
dava atravs do contato de uma suspenso celular, previamente crescida em
um meio de cultura completo, na qual se adicionava assepticamente uma
massa de celite esterilizada, que era posteriormente transferida para um reator constitudo de um leito fluidizado, como apresentado na Figura 16.3a.
Meio de cultura completo era ento continuamente introduzido pela base da
coluna, enquanto o efluente livre das partculas de celite era retirado pelo
topo da coluna, de maneira a se manter constante o nvel do sistema.
A fluidizao do leito era conseguida atravs do reciclo parcial do efluente para a base da coluna, e a aerao era feita atravs de dispersor localizado na
base da coluna.
Aps cerca de 4 a 5 dias, o reciclo, a aerao e a alimentao eram descontinuados, as clulas imobilizadas eram decantadas, e o meio de cultura para
crescimento celular era retirado do sistema. Esse meio era, em seguida, substitudo por um outro meio de cultura limitado em vitaminas e sais minerais, com
a finalidade de promover a sntese do antibitico. As operaes de reciclo e aerao eram ento reiniciadas e, a cada 24 horas, um novo ciclo dessas operaces, denominado pelos autores de "sangria e alimentao", era refeito.
Anlise dos dados indicou que foi possvel separar a fase de crescimento
da biomassa e a fase de produo do antibitico, atravs da manipulao de
meios de cultura diferenciados e da forma de operao do leito fluidizado. As
partculas de celite, aps a fase de crescimento, possuam cerca de 45% de sua
superfcie recoberta de biomassa de Streptomyces, firmemente imobilizada a
uma densidade de cerca de 240 mg de clulas/g de suporte, comparvel aos
mtodos de imobilizao por gel hidroflico. A estabilidade do sistema era
bastante grande, uma vez que os autores descreveram eperaes contnuas
por mais que 30 dias, produzindo o antibitico.
importante salientar que a estabilidade do sistema para produo desse antibitico, do mesmo modo que para a produo de etanol, pde ser conseguida atravs da manipulao de variveis controlveis de processo, na
qual se destaca o manejo de meios de cultura.

16.5.3 - Tratamento de resduos


O tratamento de resduos visto como uma das reas mais significativas
de aplicao para os processos com clulas imobilizadas.
A maior parte dos conceitos desenvolvidos so baseados em populaes
bacterianas no definidas, que formam um filme de biomassa sobre superfcies
slidas, retidas dentro de leitos fixos ou fluidizados. Processos de nitrificao
e denitrificaco, 8 e produo de metano a partir de resduos, encontram aplicaao nesses s1s t emas. 8'30
-

Processos que utilizam clulas imobilizadas

369

Recentemente, o uso de populaes microbianas, especializadas na degradao de compostos recalcitrantes (xenobiticos), tem encontrado na imobilizao celular uma tcnica extremamente til para o projeto e operao de biorreatores de alto desempenho .31 ' 32 Esses compostos se constituem principalmente
de resduos de processamentos qumicos, como os organoclorados e os heteroaromticos.
Devido cintica des's e tipo de processo ser altamente inibitria, em relao
concentrao desses substratos, reatores completamente agitados so preferveis
aos do tipo escoamento pistonado. Assim, leitos fluidizados com reciclo parcial de
efluente, e/ ou introduo de corrente gasosa, permitem aos sistemas operarem
mxima velocidade de converso.
Suportes de escolha para esse tipo de processo incluem partculas esfricas
31
de vidro poroso e blocos de espuma de poliuretano. 30' 32

16.5.4 - Produo de metablitos utilizando clulas animais


O cultivo de clulas animais em fermentadores realizado atualmente
para produo de diversas substncias, como vacinas, a enzima proteoltica uroquinase, anticorpos monoclonais e interferon. 18 Alguns tipos de clulas animais
necessitam estar imobilizadas em suporte slido compatvel, para que possam
se desenvolver.
A "ancoragem" ou imobilizao de cltilas animais em suportes tem merecido ateno nos ltimos anos.

Um dos mtodos mais bem-sucedidos, na imobilizao de hibridomas para


a produo de anticorpos monoclonais em larga escala, foi o proposto por LIMe
MOSS. 33 O mtodo se constitui numa variao do envolvimento celular em gel de
alginato de clcio. De fato, as clulas so submetidas ao envolvimento em gel,
como apresenta<i() na Figura 16.2. Um recobrimento posterior da superfcie das
partculas com polilisina efetuado, seguido da dissoluo e remoo da matriz
de alginato. Durante a promoo do crescimento, as clulas ocupam todo o espao interno da partcula, formando uma densa populao ativa.
Clulas animais tambm tm sido envolvidas em gel de polissacardeos}4 e
adsorvidas em microssuportes especialmente projetados para essa finalidade. 35 Os
reatores utilizados tm sido o leito fluidizado} 5 (Fig. 16.4b) e o expandido34 (Fig.
16.4a), para a produo de anticorpos monoclonais.

16.5.5 -

Utilizao de microrganismos geneticamente modificados

Microrganismos geneticamente modificados tm propiciado oportunidades extremamente interessantes para a produo industrial .de metablitos e de
protenas especializadas. O desempenho dos biorreatores, que fazem uso de
microrganismos que albergam plasmdeos exgenos, entretanto largamente
influenciado pelo carter instvel destes microrganismos. BARBOTIN 36 sugere
que dois tipos de instabilidade podem ocorrer: estrutural, devido instabilidade do prpio plasmdeo transferido e segregacional, devido insuficincia de

37O

Reatores com clulas imobilizadas

transferncia do plasmdeo para as clulas filhas durante a diviso celular. Nesse


caso, devido s diferenas de velocidade especfica de crescimento das clulas
transformadas e da populao livre do plasmdeo, essas ltimas tm capacidade
de rapidamente se tornar a populao dominante, implicando em perda irreversvel da capacidade produtiva do biorreator. A utilizao da presso de seleo, via
linhagens transformadas, que levam marca de resistncia a um antibitico como
mtodo de preveno da predominncia de linhagens no transformadas, uma
possibilidade factvel em nvel de bancada. Todavia, devido ao elevado custo desse insumo, o mtodo tende a ser irrealista em escala industrial.
A imobilizao de clulas microbianas pelo mtodo de envolvimento,
tem sido reportada em literatura na produo de importantes produtos proporcionados pela engenharia gentica de microrganismos. A Tabela 16.3,
adaptada de BARBOTIN/ 6 ilustra algumas dessas aplicaes.
Tabela 16.3 - Imobilizao de microrganismos geneticamente modificados.

Plasmdeos

Produto da clonagem

B subtilis BS 273

pPCB6

Proinsulina

Agarose

E. coli HB 101

pKBF
367-11

P-lactamase

K-carragenana

Levedura BJ 1991

p336/1

Somatomedina C

Alginato

S. cerevisiae SEY 2202

pYCB 115
<
...

a-2-lnterferon

Linhagens

Matriz

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Alginato
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16.6 - Concluses
Nos ltimos anos, a partir de trabalhos pioneiros na dcada de 70 sobre a
imobilizao de clulas microbianas e de organelas em gel hidroflico.desenvolvidos por vrios autores, essa tecnologia vem ganhando importncia crescente. Ela
vem contribuindo para um nova abordagem dos sistemas biolgicos, gerando
uma famlia inteiramente diferente de biorreatores de alto desempenho. Sua caracterstica mais diferenciada o confinamento fsico de elevadas densidades celulares em uma dada regio do sistema, independente dos fluxos de substratos e
produtos, propiciando sua reutilizao ilimitada.
A completa compreenso e domnio dessa tecnologia, mormente no que se
refere fisiologia das clulas imobilizadas e sua relao com as propriedades fsicas das matrizes de imobilizao, ainda est para ser completamente elucidada,
razo pela qual a aplicao desse sistema est circunscrita ainda a poucos casos
em escala comercial. As potencialidades do mtodo, entretanto, esto bastante
bem demonstradas para a biossntese de virtualmente qualquer classe de metablito celular. provvel que, em um futuro prximo, produtos de alto valor agregado, bem como a utilizao de microrganismos especializados no tratamento de
resduos de difcil biodegradao, devam encontrar nessa tcnica uma alternativa
de processo bastante interessante.

Referncias bibliogrficas

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--- ------------ - - ---- -

l .
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372

Reatores com clulas imobilizadas

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373

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Michele Vitolo

17.1 - Introduo
Converses bioqumicas podem ser feitas em reatores, usando-se microrganismos, organelas celulares ou enzimas isoladas como catalisadores.
No que tange s enzimas, tanto as extracelulares quanto vrias intracelulares encontram-se amplamente disponveis, e so usadas em diversos processos industriais (Tab. 17.1).
No momento impensvel o uso de enzimas isoladas em processos multienzimticos, tal como seria necessrio, por exemplo, em processos .de sntese qumica.
O custo da fermentao, associado aos custos relacionados com o isolamento
da enzima e,nos_casos pertinentes, os referentes imobilizao, devem ser minuciosamente avaliados, frente s potenciais vantagens de se utilizar um processo
enzimtico.
Quando comparadas aos microrganismos, as enzimas isoladas podero fornecer maior rendimento num dado produto, j que substncias colaterais contaminantes, resultantes do metabolismo e/ou lise celular, no seriam formadas. No
caso particular da imobilizao, h a possibilidade de se modificar as caractersticas cinticas da enzima.
A escolha entre as formas solvel e insolvel de uma enzima depende da natureza do processo de converso e da estabilidade operacional das duas formas.
Pela sua natureza, alguns processos, como panificao e amaciamento de carnes,
tornam invivel a recuperao das enzimas, desde que as mesmas so usadas na
forma solvel e adicionadas nos estgios finais dos processos. Embora em algumas situaes a escolha seria afetada pelo fato de ser possvel a remoo da enzima imobilizada do produto final, garantindo desta forma uma menor
contaminao protica, e/ ou pela possibilidade de mudana da cintica da reao,
inegvel que a estabilidade operacional do sistema imobilizado apresentaria um
peso pondervel na deciso entre enzima solvel versus enzima insolvel.
------

-----

--

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ii

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374

Reatores com e~zimas imobilizadas

Tabela 17.1 - Alguns exemplos de enzimas industriais.


;

INDSTRIA

uso

Panificao

Reduo da viscosidade da
massa; acelerar o crescimento da massa

Cervejaria

Liquefao do amido

Papel

Produo de gomas

Txtil

Remoo de gomas
de amido

Aucareira

Produo de xaropes
de glicose

Lavanderia

Incorporao
em detergentes

Curtume

Curtir e depilar o couro

Alimentcia

Fabricao de queijos,
amaciamento de carne

Pectinases

Alimentcia

Clarificao de sucos

Glicoseisomerase

Alimentcia

Produo de xaropes
de frutose

Glicoseoxidase

Alimentcia

Desglicosao d~ ovos

Papana

Alimentcia

Evitar turbidez
da cerveja

Penicilina-amidase

Farmacutica

Produo de antibiticos

Aminoacilase

Farmacutica
e alimentcia

Purificao de misturas
racmicas de aminocidos

ENZIMA

a-amilase

Glicoamilase

Proteases