La cromatografa lquida de alta eficacia o high performance liquid chromatography (

HPLC) es un tipo de cromatografa en columna utilizada frecuentemente en bioqumica

y qumica analtica. Tambin se la denomina a veces cromatografa lquida de alta presin o
cromatografa lquida de alta resolucin (high pressure liquid chromatography) (HPLC),
aunque esta terminologa se considera antigua y est en desuso. El HPLC es una tcnic
a utilizada para separar los componentes de una mezcla basndose en diferentes tip
os de interacciones qumicas entre las sustancias analizadas y la columna cromatog
rfica.,
ndice [ocultar]
1
Principio
1.1
Cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC)
1.2
Tipos de HPLC
1.3
Cromatografa de fase normal
1.4
Cromatografa de fase inversa (o reversa)
1.5
Cromatografa de exclusin molecular
1.6
Cromatografa de intercambio inico
1.7
Cromatografa basada en bioafinidad
1.8
Cromatografa lquida de alta eficacia en condiciones desnaturalizantes (DHP
LC)
2
Parmetros
2.1
Dimetro interno
2.2
Medida de las partculas
2.3
Tamao de poro
2.4
Presin del sistema
3
Fabricantes de aparatos de HPLC
4
Fabricantes de columnas de HPLC y accesorios
5
Vase tambin
6
Referencias
7
Enlaces externos
Principio[editar]
Cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC)[editar]
En la HPLC isocrtica el compuesto pasa por la columna cromatogrfica a travs de la f
ase estacionaria (normalmente, un cilindro con pequeas partculas redondeadas con c
iertas caractersticas qumicas en su superficie) mediante el bombeo de lquido (fase
mvil) a alta presin a travs de la columna. La muestra a analizar es introducida en
pequeas cantidades y sus componentes se retrasan diferencialmente dependiendo de
las interacciones qumicas o fsicas con la fase estacionaria a medida que adelantan
por la columna. El grado de retencin de los componentes de la muestra depende de
la naturaleza del compuesto, de la composicin de la fase estacionaria y de la fa
se mvil. El tiempo que tarda un compuesto a ser eluido de la columna se denomina
tiempo de retencin y se considera una propiedad identificativa caracterstica de un
compuesto en una determinada fase mvil y estacionaria. La utilizacin de presin en
este tipo de cromatografas incrementa la velocidad lineal de los compuestos dentr
o de la columna y reduce as su difusin dentro de la columna mejorando la resolucin
de la cromatografa. Los disolventes ms utilizados son el agua, el metanol y el ace
tonitrilo. El agua puede contener tampones, sales, o compuestos como el cido trif
luoroactico, que ayudan a la separacin de los compuestos.
Una mejora introducida a la tcnica de HPLC descrita es la variacin en la composicin
de la fase mvil durante el anlisis, conocida como elucin en gradiente. Un gradient
e normal en una cromatografa de fase reversa puede empezar a un 5% de acetonitril
o y progresar de forma lineal hasta un 50% en 25 minutos. El gradiente utilizado
vara en funcin de la hidrofobicidad del compuesto. El gradiente separa los compon
entes de la muestra como una funcin de la afinidad del compuesto por la fase mvil
utilizada respecto a la afinidad por la fase estacionaria. En el ejemplo, utiliz
ando un gradiente agua/acetonitrilo los compuestos ms hidroflicos eluirn a mayor co
ncentracin de agua, mientras que los compuestos ms hidrofbicos eluirn a concentracio
nes elevadas de acetonitrilo. A menudo, hace falta realizar una serie de pruebas
previas con tal de optimizar el gradiente de forma que permita una buena separa

cin de los compuestos.

Tipos de HPLC[editar]
Cromatografa de fase normal[editar]
La cromatografa de fase normal o normal phase HPLC (NP-HPLC) fue el primer tipo d
e sistema HPLC utilizado en el campo de la qumica, y se caracteriza por separar l
os compuestos sobre la base de su polaridad. Esta tcnica utiliza una fase estacio
naria polar y una fase mvil apolar, y se utiliza cuando el compuesto de inters es
bastante polar. El compuesto polar se asocia y es retenido por la fase estaciona
ria. La fuerza de adsorcin aumenta a medida que aumenta la polaridad del compuest
o y la interaccin entre el compuesto polar y la fase estacionaria polar (en compa
racin a la fase mvil) aumenta el tiempo de retencin.
La fuerza de interaccin no slo depende de los grupos funcionales del compuesto de
inters, sino tambin en factores estricos de forma que los ismeros estructurales a me
nudo se pueden diferenciar el uno del otro. La utilizacin de disolventes ms polare
s en la fase mvil disminuye el tiempo de retencin de los compuestos mientras que l
os disolventes ms hidrofbicos tienden a aumentar el tiempo de retencin.
La NP-HPLC cay en desuso a los aos setenta con el desarrollo del HPLC de fase reve
rsa o reversed-phase HPLC debido a la falta de reproductibilidad de los tiempos
de retencin puesto que los disolventes prticos cambiaban el estado de hidratacin de
la silica o almina de la cromatografa.
Cromatografa de fase inversa (o reversa)[editar]
La HPLC de fase inversa (RP-HPLC) consiste en una fase estacionaria apolar y una
fase mvil de polaridad moderada. Una de las fases estacionarias ms comunes de est
e tipo de cromatografa es la silica tratada con RMe2SiCl, donde la R es una caden
a alquil tal como C18H37 o C8H17. El tiempo de retencin es mayor para las molculas
de naturaleza apolar, mientras que las molculas de carcter polar eluyen ms rpidamen
te.
El tiempo de retencin aumenta con la adicin de disolvente polar a la fase mvil y di
sminuye con la introduccin de disolventes ms hidrofbicos. La cromatografa de fase re
versa es tan utilizada que a menudo se lo denomina HPLC sin ninguna especificacin
adicional. La cromatografa de fase reversa se basa en el principio de las intera
cciones hidrofbicas que resultan de las fuerzas de repulsin entre un disolvente re
lativamente polar, un compuesto relativamente apolar, y una fase estacionaria ap
olar. La fuerza conductora en la unin del compuesto a la fase estacionaria es la
disminucin del rea del segmento apolar del analito expuesto al disolvente. Este ef
ecto hidrofbico est dominado por el aumento de la entropa, y la consecuente disminu
cin de la energa libre, asociada con la minimizacin de la interfase compuesto-disol
vente polar. El efecto hidrofbico disminuye con la adicin de disolvente apolar a l
a fase mvil. Esto modifica el coeficiente de particin de forma que el compuesto se
mueve por la columna y eluye.
Las caractersticas del compuesto de inters juegan un papel muy importante en la re
tencin. En general, un compuesto con una cadena alquil larga se asocia con un tie
mpo de retencin mayor porque aumenta la hidrofobicidad de la molcula. Aun as, las m
olculas muy grandes pueden ver reducida la interaccin entre la superficie del comp
uesto y la fase estacionaria. El tiempo de retencin aumenta con el rea de superfic
ie hidrofbica que suele ser inversamente proporcional al tamao del compuesto. Los
compuestos ramificados suelen eluir ms rpidamente que sus ismeros lineales puesto q
ue la superficie total se ve reducida.
Aparte de la hidrofobicidad de la fase inmvil, otras modificaciones de la fase mvi
l pueden afectar la retencin del compuesto; por ejemplo, la adicin de sales inorgni
cas provoca un aumento lineal en la tensin superficial, y como que la entropa de l
a interfase compuesto-disolvente est controlada precisamente por la tensin superfi
cial, la adicin de sales tiende a aumentar el tiempo de retencin.

Otra variable importante es el pH puesto que puede cambiar la hidrofobicidad del

compuesto. Por este motivo, la mayora de mtodos utilizan un tampn como el fosfato
de sodio para controlar el valor del pH. Estos tampones controlan el pH, pero ta
mbin neutralizan la carga o cualquiera resto de silica de la fase estacionaria qu
e haya quedado expuesta y actan como contraiones que neutralizan la carga del com
puesto. El efecto de los tampones sobre la cromatografa puede variar, pero en gen
eral mejoran la separacin cromatogrfica.
Las columnas de fase reversa se echan a perder con menor facilidad que las colum
nas de silica normales. Aun as, muchas columnas de fase reversa estn formadas por
silica modificada con cadenas alquil y no se deben utilizar nunca con bases en m
edio acuoso puesto que stas podran daar el esqueleto de silica subyacente. Las colu
mnas se pueden utilizar en cidos en medio acuoso pero no deberan estar expuestas d
emasiado tiempo al cido porque puede corroer las partes metlicas del aparato de HP
LC.