Introduccin a las

tcnicas cromatogrficas
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03/08/2015
Introduccin a las tcnicas cromatogrficas

Descripcin general de la cromatografa.

Parmetros cromatogrficos.

Ensanchamiento de banda y eficacia de la columna.

Resolucin de la columna.

Aplicaciones de la cromatografa.

Ejercicios.

Definicin de cromatografa
Segn la IUPAC, la cromatografa es un mtodo fsico de separacin en el que los
componentes a separar son distribuidos entre dos fases, una de las cuales
permanece estacionaria mientras que la otra se mueve en una direccin
determinada.
Por lo tanto, en cualquier proceso cromatogrfico distinguimos:

Una fase mvil (FM), que puede ser un gas, un lquido o un fluido supercrtico,
en la que va disuelta la muestra.

Una fase estacionaria (FE) inmiscible, la cual se mantiene fija sobre una
columna o sobre una superficie slida.

Los componentes que son fuertemente retenidos por la fase estacionaria se mueven con
mayor lentitud en la fase mvil, mientras que aquellos que se unen dbilmente a la fase
estacionaria se mueven con mayor rapidez. Esta diferencia de velocidades en el seno de
la fase mvil permite la separacin y el anlisis cualitativo o cuantitativo de los
componentes.

Clasificacin de los mtodos cromatogrficos

1

Segn la forma de contacto entre la FM y la FE:

Cromatografa en columna: la FE se introduce en una columna estrecha a

travs de la cual pasa la FM por efecto de la gravedad o de una presin aplicada.

Cromatografa plana: la FE se fija sobre una placa plana o a los intersticios de

un papel y la FM se desplaza a travs de la fase estacionaria por capilaridad o
por gravedad.

Segn el estado fsico de la FM:

Cromatografa de lquidos: la fase mvil es un lquido.

Distinguimos la cromatografa lquido-lquido o de reparto (la FE es un
lquido), la cromatografa lquido-slido o de adsorcin (la FE es un slido),
la cromatografa de intercambio inico (la FE es una resina intercambiadora
de iones), la cromatografa de exclusin por tamao (la FE es un lquido en
los intersticios de un slido polimrico) o la cromatografa de afinidad (la FE
es un grupo de lquidos especficos unidos a una superficie slida).

Cromatografa de gases: la fase mvil es un gas. Distinguimos la

cromatografa de gas-lquido (la FE es un lquido adsorbido o unido a una
superficie slida) o la cromatografa gas-slido (la FE es un slido).

Cromatografa de fluidos supercrticos: la fase mvil es un fluido supercrtico

(la FE est compuesta por molculas orgnicas enlazadas a una superficie
slida).

Cromatografa de elucin en Columna

La elucin implica el transporte de una especie a travs de una columna por la adicin
de nueva fase mvil:

Inicialmente se introduce una cierta cantidad de muestra diluida en FM. Al ir aadiendo

FM nueva, el eluyente (la parte de la muestra contenida en en la FM) desciende por la
columna, donde tiene lugar un reparto o distribucin entre la FM y la FE, en una
serie continua de transferencias entre las dos fases. Segn sea el coeficiente de reparto,
los solutos estarn ms o menos tiempo en la fase mvil, que es la que consigue
hacerlos avanzar. Por tanto, cuanto ms tiempo pasen en la fase mvil, ms
rpidamente se movern. Los solutos que presenten una mayor afinidad por la FE
quedarn ms tiempo retenidos, por lo que avanzarn a menor velocidad.
La diferencia en la velocidad de desplazamiento de los solutos o analitos permite su
separacin en zonas o bandas a lo largo de la columna. A medida que se va aadiendo
ms FM a la columna, las bandas van llegando individualmente al final de la columna
y son eluidas. La fraccin eluida se denomina eluato.
Si al final de la columna se coloca un detector que responde a la concentracin del
soluto y se registra su seal en funcin del tiempo (o del volumen de FM aadido) se
obtiene un cromatograma. Lgicamente, el proceso de separacin produce una
dilucin considerable del analito, por lo que los detectores empleados deben ser ms
sensibles que los que seran necesarios si el proceso de separacin no fuera
imprescindible.

Parmetros cromatogrficos
04/08/2015Deja un comentario
04/08/2015
Cromatograma

El cromatograma es la curva de elucin que se obtiene en una cromatografa y

representa la seal recogida por el detector en respuesta a la concentracin de analito en
funcin del tiempo o del volumen de fase mvil aadido:

Tiempo muerto (tM o t0): tiempo requerido para que una especie no
retenida alcance el detector.

Volumen muerto (VM o V0): volumen de fase mvil necesario para

eluir una especie no retenida.

Tiempo de retencin (tR): tiempo transcurrido desde la inyeccin

de la muestra hasta que uno de los componentes llega al detector.

Volumen de retencin (VR): volumen necesario para eluir un

determinado soluto en la columna.

Tiempo neto de retencin o tiempo de retencin

corregido (tR): es la diferencia entre el tiempo de retencin de un
componente con respecto al de una sustancia no retenida (tR tM).

Los picos cromatogrficos tienen forma de curva de error normal o Gaussiana. Estas
curvas representan la distribucin simtrica de los datos replicados alrededor de la
media.

Altura de pico (h): intensidad mxima registrada por el detector.

Desviacin estndar (): altura media del pico en el punto de

inflexin.

Anchura de base del pico (): se define como 4.

Anchura de pico a la semialtura (05): es igual a 2354.

Constante de distribucin

La distribucin de un soluto entre la fase mvil y la estacionaria se puede describir

mediante el siguiente equilibrio, para un determinado soluto A:

Siendo K la constante de distribucin entre las dos fases y de ella depender, en

buena medida, el reparto de soluto entre ellas y, por tanto, su separacin. El valor de K
se mantiene constante en un amplio intervalo de temperaturas, por lo que existe una
proporcionalidad entre las concentraciones de soluto la fase estacionaria y la fase mvil,
en cuyo caso se habla de cromatografa lineal y los picos recogidos en el
cromatograma son simtricos:

Las asimetras suelen ser debidas a la presencia en la fase estacionaria de lugares que
retienen al soluto con ms fuerza que otros o a la inyeccin de una cantidad excesiva de
muestra.
Velocidad de migraciN

La velocidad lineal promedio de la migracin del soluto a lo largo de una columna de

longitud L se define como:

La velocidad lineal promedio de las molculas en la fase mvil ser:

Ambas se pueden relacionar as:

Esta ltima expresin relaciona la velocidad de migracin del soluto con la constante
de distribucin y de los volmenes de las fases mvil y estacionaria.
Tasa de flujo volumtrico

En el caso de un columna tubular abierta, la tasa de flujo volumtrico F (cm/min) est

relacionada con la velocidad lineal a la salida de la columna:

En el caso de una columna rellena, desconocemos el volumen disponible para el lquido,

por lo que se expresa as:

factor de capacidad o de retencin

El factor de capacidad o de retencin para un soluto A se define como:

El factor de retencin mide la relacin entre el tiempo que las molculas del analito
estn en la fase estacionaria y el que estn en la fase mvil. Se usa para comparar las
velocidades de migracin de los solutos, y no depende de la forma de la columna o de la
tasa de flujo volumtrico.
Lo ideal es que el valor de los factores de retencin de los solutos de una muestra
oscilen entre 1 y 10. Valores mucho menores que la unidad indican que el analito sale
de la columna en un tiempo prximo al tiempo muerto. Valores mucho mayores indican
un tiempo de elucin excesivamente largo.
FACTOR DE Selectividad

El factor de selectividad de una columna para dos solutos A y B se define como:

7

La selectividad es una manera de medir la eficiencia de una separacin

cromatogrfica.
Ensanchamiento de banda y eficacia de una columna cromatogrfica
04/08/2015Deja un comentario

La eficacia de la separacin de los componentes de una mezcla en una columna

cromatogrfica guarda una estrecha relacin con la forma y la separacin de los picos
cromatogrficos que se reflejan en el cromatograma.
Teora de los platos tericos

Considera que una columna cromatogrfica est constituida por una serie de capas
estrechas, discretas pero contiguas, denominadas platos tericos, en los cuales se
establece el equilibrio de distribucin de cada soluto entre la fase mvil y la fase
estacionaria.
Podemos definir, entonces, plato terico como la longitud de una columna en la que el
soluto experimenta un equilibrio completo entre las dos fase. El nmero de platos
tericos N de una columna de longutid L ser:

Cuantos ms platos tericos formen una columna mayor ser su eficacia (o lo que
es lo mismo, cuanto menor sea la altura de plato mayor ser la eficacia).
Como los picos cromatogrficos tienen forma de curva gaussiana, la anchura de cada
pico est directamente relacionada con la varianza () o la desviacin estndar (). Por
lo tanto, la altura de plato terico H se puede definir en funcin de dichos parmetros
como:

Se puede deducir que el nmero de platos tericos se relaciona con parmetros que
pueden deducirse fcilmente de un cromatograma:

Siendo tR el tiempo de retencin del soluto, el ancho de la base del pico y 05 es el

ancho del pico a la mitad de su altura.
Conviene recordar que el plato terico es una construccin artifical que nos permite
explicar la forma de los picos y la velocidad de desplazamiento a travs de la columna.
Teora cintica de la cromatografa

Uno de los factores que afectan a la eficacia es el ensanchamiento de banda:

La teora cintica de la cromatografa ofrece una explicacin ms realista que la

teora de platos y permite razonar cuantitativamente las formas y tambin los anchos de
las bandas.
La forma gaussiana de una banda se atribuye a la combinacin aditiva de los
movimientos aleatorios de las distintas molculas a medida que descienden por la
columna. Los factores que contribuyen a la anchura de banda son:

Difusin en remolino o difusin de Eddy: las molculas en

disolucin pueden atravesar la columna siguiendo trayectorias de
distinta longitud con tiempos de retencin diferentes; es
directamente proporcional al dimetro de las partculas que
componen el relleno de la columna y no se ve afectada por la
velocidad de difusin de la fase mvil, cuando stas son
suficientemente altas.

Difusin longitudinal: desde la zona central de la banda, en la que

la concentracin de solutos es mayor, hacia los extremos de la banda,
donde la concentracin es menor; es inversamente proporcional
9

a la velocidad de flujo de la fase mvil, por lo que cuanto mayor

es la velocidad de flujo de la fase mvil ms breve es el periodo de
tiempo que el analito reside en la columna (la difusin desde el centro
de la banda hacia los extremos tiene menos tiempo para producirse).
La difusin en los lquidos es muy lenta y su efecto es mucho menor
que en los gases.

Resistencia a la transferencia de masa entre la fase mvil y la

fase estacionaria, ya que el equilibrio de distribucin no es
inmediato y no tiene el tiempo suficiente para establecerse, por lo
que es proporcional a la velocidad de flujo.

Estos tres factores se relacionan con la altura de plato mediante la ecuacin de van
Deemter:

Si representamos la altura de plato frente a la velocidad de flujo de la fase mvil, vemos

que existe una velocidad de flujo ptima para la cual la altura de plato se hace
mnima y la eficacia es mayor:

Resumimos los factores que afectan al ensanchamiento (permiten optimizar el valor de

H):

Dimetro de las partculas que constituyen el relleno de la

columna: al aumentar el dimetro aumenta la difusin en remolino
10

Dimetro de la columna: al disminuir el dimetro de la columna se

disminuye la contribucin de la difusin de remolino a la altura de
plato terico.

Coeficiente de difusin: su influencia es detectable en el caso de

los gases, cuando la velocidad de flujo no es muy grande y el trmino
de difusin longitudinal es determinante (aumenta con la
temperatura); en el caso de los lquidos su efecto es mnimo.

Velocidad de flujo de la fase mvil, ya que las velocidades suelen

ser lo suficientemente elevadas como para que el trmino de
transferencia de masar sea el que controla la eficacia de la columna.

Otros factores, como la naturaleza de la fase mvil (su viscosidad,

por ejemplo), el tamao de la muestra o la rapidez de la
inyeccin (una inyeccin lenta conduce al ensanchamiento de banda
y disminuye la eficacia).

En HPLC, se debe tener en cuenta el ensanchamiento de banda

extracolumna.

Resolucin en las columnas cromatogrficas

05/08/2015Deja un comentario

Una separacin cromatogrfica se optimiza variando las condiciones experimentales

hasta que los componentes de una mezcla se separan completamente en el menor
tiempo posible.

Para ello se procurar:

Reducir el ensanchamiento de banda: al reducir la altura de plato se

aumenta la eficacia de la columna.

Modificar las velocidades de migracin (o los tiempos de retencin)

de los solutos: al aumentar la diferencia entre las velocidades (o los
tiempos) se mejora la separacin.

La resolucin (Rs) de una columna es una medida cuantitativa de su capacidad para

separar dos analitos (A y B), y permite evaluar la separacin entre dos bandas con
respecto a sus anchos:
11

Con una resolucin igual a 10 el solapamiento entre los dos picos es del 4 %. Con una
resolucin de 15 el solapamiento es tan slo del 03 % y permite una separacin
esencialmente completa de los dos componentes:

Factores que aFectan a la resolucin de la columna

La resolucin de la columna se puede relacionar con los factores de retencin de los dos
componentes A y B, el factor de selectividad y el nmero de platos que forman la
columna:

12

Variacin del nmero de platos (N):

Se consigue mejorar la resolucin de la columna aumentando el nmero de platos.

Esto se puede conseguir aumentando la longitud (L) de la columna, lo cual
aumentara el tiempo necesario para la separacin, o disminuyendo la altura de plato
(H). Segn la ecuacin de van Deemter la altura de plato puede disminuirse con un
menor dimetro de las partculas del relleno, un menor dimetro de la columna,
controlando la velocidad del flujo o reduciendo la viscosidad de la fase mvil, y
empleando tamaos de muestra pequeos para disminuir la resistencia a la transferencia
de materia.

Variacin del factor de retencin o capacidad (kB): el valor

ptimo debe estar entre 1 y 5. Valores superiores no suponen un
aumento significativo de la resolucin, pero que dan lugar a tiempos
de retencin excesivos.

El factor de retencin puede adecuarse modificando la temperatura, en el caso de FM

gaseosas, o modificando la composicin del disolvente, cuando las FM son lquidas.

Variacin del factor de selectividad (): el aumento

de (manteniendo kB entre 1 y 5) tambin puede lograrse
modificando la temperatura de la columna o la composicin de la fase
mvil, o bien, cambiando la naturaleza de la fase estacionaria o
mediante algn efecto qumico especfico.

El problema general de la elucin

En muestras complejas de un gran nmero de componentes, en muchas ocasiones

resulta difcil encontrar unas condiciones experimentales nicas que consigan la
resolucin de todos los picos de los analitos y adems permitan la perfecta
cuantificacin de los mismos.

13

Una solucin frecuente consiste en cambiar las condiciones que afectan a k mientras
tiene lugar la separacin. En cromatografa de lquidos se recurre a variaciones en la
composicin de la fase mvil durante la elucin (elucin en gradiente). En
cromatografa de gases, el incremento de temperatura permite conseguir las condiciones
ptimas para las separaciones (programacin de temperatura).

Aplicaciones de la cromatografa
05/08/2015Deja un comentario

Las tcnicas cromatogrficas estn ampliamente extendidas y su enorme aplicacin se

debe a su elevada sencillez, bajo coste y gran eficacia de separacin.

Anlisis cualitativo: la cromatografa es una herramienta muy

empleada para identificar determinados componentes en mezclas
sencillas de composicin conocida. esta identificacin se hace a partir
de la evaluacin del tiempo de retencin observable en el
cromatograma.

Anlisis cuantitativo: los mtodos cromatogrficos proporcionan

una valiosa informacin cuantitativa acerca de las especies
separadas, mediante la comparacin de las alturas o las reas de los
picos, con una sensibilidad que supera en muchas ocasiones a la de
otras tcnicas.

Anlisis basados en la altura del pico

Se pueden realizar estudios cuantitativos de las muestras separadas a partir de las alturas
de los picos cromatogrficos. La mayor precisin se consigue cuando tenemos picos
bien definidos, agudos, estrechos y simtricos. Hay que tener en cuenta que la altura
es inversamente proporcional a la anchura del pico, por lo que este mtodo se ve
muy afectado por las condiciones experimentales (temperatura de la columna, caudal de
la fase mvil, velocidad de inyeccin de la muestra), por lo que su aplicacin es
limitada. Puede ser til en ensayos de rutina o en aquellos en los que se prefiera una
mayor rapidez, aunque se pierda exactitud.
14

Anlisis basados en las reas de los picos

Las reas de los picos son independientes de la anchura, por lo que estos anlisis son
ms precisos que los basados en las alturas de los picos, aunque su lectura sea ms
sencilla. Una forma de estimar el rea de los picos es multiplicar su altura por el ancho a
la mitad de su altura. En realidad, la mayora de los cromatgrafos actuales incluyen
sistemas de integracin electrnicos y programas informticos que permiten que el
analista pueda determinar con precisin las reas de los picos.

La resolucin de algunos picos puede ser problemtica. Existen programas informticos

que ayudan al analista a calcular estas reas.
mtodo de calibrado

El mtodo ms sencillo para llevar a cabo un anlisis cuantitativo de una muestra

mediante cromatografa implica la preparacin de una serie de disoluciones patrn
de concentracin conocida y de composicin similar a la muestra. Con la
informacin obtenida en el cromatograma, podemos reallizar una representacin de las
reas o las alturas de los picos en funcin de las respectivas concentraciones, que
permitan establecer una relacin lineal que nos servir para determinar la
concentracin de la muestra problema.
El error ms habitual deriva de la incertidumbre en el volumen de la muestra, que puede
ser realmente importante al tratar con muestras de volumen muy pequeo. Por ello,
suelen emplearse dos mtodos que solucionan este problema:

Mtodo del patrn interno: se introduce en cada estndar y en la

muestra una cantidad exactamente medida de otra sustancia que
llamamos patrn interno, cuyo pico cromatogrfico est bien
diferenciado. De esta manera, en lugar de utilizar las reas/alturas de
los picos, tomaremos como parmetro analtico la relacin
existente entre las reas/alturas de los picos del analito y del
patrn interno. As, aunque haya imprecisin en el volumen
inyectado, la relacin entre analito y patrn interno no se ver
afectada.

Mtodo de la normalizacin de las reas: en este caso se

proceder a la elucin completa de todos los componentes de la
muestra para determinar las reas de todos los picos, siendo el
parmetro analtico la relacin de su rea con el rea total de
15

los picos. Para poder emplear este mtodo debemos tener mezclas
que en las condiciones en las que trabajemos se puedan eluir todos
los componentes en un tiempo razonable.

Ejercicios de introduccin a la cromatografa

05/08/2015Deja un comentario
Ejercicio 1

Clculo del nmero y la altura de los platos tericos de una columna cromatogrfica:

Ejercicio 2

Clculo de diferentes parmetros cromatogrficos a partir de la informacin

proporcionada por un cromatograma:

16

17

Ejercicio 3

Clculos para obtener y mejorar la resolucin de una separacin cromatogrfica:

Ejercicio 4

Presta atencin a la deduccin y las aplicaciones de la siguiente expresin:

18

19

20

Ejercicio 5

Aplicacin de la cromatografa con fines cuantitativos, basado en las reas de los picos.

Puedes ver ms aplicaciones de los fundamentos cromatogrficos aqu.

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