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DEPARTAMENTO
DE QUMICA. LABORATORIO DE PRINCIPIOS DE BIOQUMICA.
PRIMER SEMESTRE 2016
Febrero 2016
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TRABAJO EN EL LABORATORIO
1. SEALIZACIN.
La sealizacin normalizada es necesaria para la seguridad, pues indica de manera
inmediata los posibles peligros de carcter general. Existen mltiples seales
reconocidas internacionalmente que informan aspectos diferentes:
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PRECAUCIONES IMPORTANTES
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Los quizzes son evaluaciones cortas que se realizan antes de iniciar la prctica
correspondiente. Son preguntas sencillas que pretenden mostrar el grado de
preparacin del estudiante para la realizacin de la prctica.
Datos del laboratorio. Al finalizar cada prctica, cada grupo debe entregar (o
presentar ) una tabla con los datos obtenidos durante la prctica, la cual es necesaria
para poder entregar el informe en la siguiente sesin. La no entrega de la tabla de
datos, indica la no obtencin de resultados necesarios para realizar el informe. Esta
tabla de datos debe venir diseada previamente (realizar un formato adecuado y
BIEN PRESENTADO) y se debe presentar con el preinforme.
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CUESTIONARIO
1. Dibuje y explique el significado de smbolos que indican peligro, seales de
prohibicin y precauciones importantes.
2. Explique el funcionamiento de las claves internacionales R-S
3. Indique cules son los riesgos biolgicos ms frecuentes que se pueden presentar en
un laboratorio de Bioqumica.
4. Para reportar datos en el informe es importante realizarlo con un manejo adecuado
de las cifras significativas. Expliqu qu son y cules son las reglas bsicas del
manejo de estas cifras significativas.
5. Realice un esquema (plano) del laboratorio indicando el sitio donde est:
a. Su puesto de trabajo
b. Las balanzas
c. El extintor
d. El lavaojos
e. La nevera
f. Las centrfugas
g. Los recipientes de desechos
h. El botiqun
6. Reconozca los recipientes que hay en el laboratorio para colectar los desechos de las
prcticas. Haga una descripcin de ellos indicando qu sustancias se pueden
desechar en cada uno.
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FUNDAMENTO TEORICO
A. Lpidos
Las grasas (o lpidos) son los compuestos con los que el cuerpo humano, as como muchos
otros organismos, almacena energa para las pocas de carencia. Estos se caracterizan por
su poca afinidad por el agua soluciones acuosas. Evolutivamente, el cuerpo humano es
almacenador de energa, es decir, est diseado para acumular parte de la energa que
absorbe por los alimentos para pocas de ayuno. La forma ms eficaz de almacenar esta
energa es en forma de grasas, que son muy ligeras por lo que en poco peso de grasa se
puede acumular mucha energa. Los lpidos se clasifican en dos grupos principales:
simples y complejos. Los lpidos simples ms importantes son las grasas formadas por
cidos grasos y glicerol, dentro de este grupo se encuentran los triglicridos; dentro de los
lpidos complejos se pueden mencionar los fosfolpidos, entre otros, y como compuesto
derivado de los lpidos se encuentra el colesterol. El colesterol est presente en todas las
clulas del organismo. Se presenta en altas concentraciones en la mdula espinal, pncreas
y cerebro pero se sintetiza principalmente en el hgado y en el intestino delgado.
Aproximadamente el 50% de las necesidades de colesterol son sintetizadas en el hgado
mientras que el resto se obtiene de los alimentos de origen animal presentes en la dieta.
En cuanto a solubilidad, los lpidos son insolubles en agua pero solubles en solventes
orgnicos. Se pueden identificar por:
1. Saponificacin
La hidrlisis alcalina de los acilgliceroles produce jabones y glicerol. Si el hidrolizado se
somete a la accin del ter, los jabones sedimentan y en el sobrenadante queda el glicerol.
2. Reaccin de Fiske-Subbarow (prueba de fosfatos)
Los fosfolpidos por accin del NaOH se hidrolizan, produciendo fosfatos inorgnicos, que
con el cido molibdico dan fosfomolibdatos, y stos por accin de reductores como el cido
1,2,4-aminonaftolsulfnico o el cido ascrbico, producen complejos de xidos de
molibdeno de color azul.
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REACTIVOS
Etanol
KOH 2 N
HCl 2 N
Reactivo de Millon
Ninhidrina al 0.2%
Reactvo de Biuret
Acido sulfrico concentrado
HNO3 concentrado
NH4OH concentrado
Eter etlico
NaOH al 15%.
Cloroformo
Colesterol
Acido molbdico
Lecitina
Acido ascrbico (150mg/100ml)
Albmina
Glicina
Floroglucinol
Tirosina
Agua destilada
Etanol:ter (2:1)
Acetona
cido actico 1M
Sulfato de amonio (780g/L)
PROCEDIMIENTO
Separe la clara de la yema del huevo. La clara se utiliza para obtener protenas (albminas
principalmente) y la yema para obtener lpidos y protenas.
1. Separe la yema y retire la membrana. Tome 1 mL de yema (aproximadamente) y
adicione 10 mL de agua destilada. Agite suavemente. Centrifugue a 5000 rpm
durante 5 minutos. Separe el sobrenadante del precipitado. En el sobrenadante
(muestra M1) se encuentran sustancias solubles en agua (como protenas, vitaminas
hidrosolubles, carbohidratos, etc), mientras que los lpidos se encuentran en la
fraccin insoluble. Tome el precipitado y disulvalo en 5 mL de una mezcla
etanol:ter (2:1). Homogenice hasta no ver precipitado. Adicione 2 mL de acetona
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Lpidos:
A. Prueba de Salkowski (patrn Colesterol )
En un tubo seco adicione 1 mL de colesterol ( la muestra a evaluar ), y 1 mL de
cloroformo, luego adicione LENTAMENTE, POR LAS PAREDES DEL TUBO, 1 mL de
cido sulfrico concentrado. Mezcle suavemente y deje en reposo por 3 minutos. Observe
la coloracin y compare los resultados del colesterol con el de la muestra.
B. Saponificacin (Patrn Lecitina).
A una cantidad anloga a la anterior de las fracciones indicadas, agregar 3 ml de NaOH al
15 %. Colocar en la boca del tubo una esfera de vidrio o papel de aluminio y reflujar al
bao mara durante 20 min. Aadir 2 ml de ter y filtrar los jabones resultantes.
C. Fosfatos (filtrados obtenidos en B, u otros mencionados en la metodologa)
A 1 ml del filtrado agregar 10 gotas de cido molbdico, mezclar y dejar en reposo 5 min.
En seguida adicionar 10 gotas de solucin de cido ascrbico. Observe la coloracin. Si no
se desarrolla color colocar el tubo en el bao mara por 5 min.
Protenas:
A. Millon. (Patrones: albmina, y tirosina)
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A una fraccin de las muestras (0.5 ml de cada una) agregar 5 gotas de reactivo de Millon;
calentar durante unos minutos al bao mara ; observar el precipitado.
BIBLIOGRAFIA
1. Martnez J. C. Guas de Anlisis Orgnico. Universidad Nacional de Colombia., 1996
2. Shriner R.L. Fuson R.C. Identificacin sistemtica de compuestos orgnicos. Limusa
Noriega editores , 1995.
3. Vogels A. Textbook of practical Organic Chemistry. Fourth Ed., 1978
4. Durst H.D. Gokel G.W. Qumica Orgnica experimental. Ed. Revert, 1985
5. Alemany M, Font S. Prcticas de Bioqumica.1983. Primera edicin. Edit Alhambra,
Espaa
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como unidades monomricas los nucletidos. Estos se componen de una base nitrogenada
heterocclica, derivada de purina o de pirimidina, una pentosa y cido fosfrico, unidos
entre si mediante enlaces fosfodister a travs de la pentosa. Las bases nitrogenadas se unen
en forma covalente al esqueleto azcar-fosfato.
El DNA est constituido por dos cadenas polinucleotdicas complementarias mantenidas
por puentes de hidrgeno entre las bases nitrogenadas, estructura conocida como doble
hlice. Sus bases nitrogenadas son adenina (A), guanina (G), citosina (C) y timina (T) , la
pentosa es la 2-desoxi-ribosa y el grupo fosfato. La mayor parte del DNA se encuentra en el
ncleo, dando lugar a unidades ms pequeas llamadas cromosomas. El nmero de
cromosomas es caracterstico de cada especie. Las clulas procariticas no contienen
ncleo y el DNA forma un solo cromosoma circular.
El RNA se encuentra principalmente en el citoplasma y participa directamente en la
biosntesis de las protenas. El RNA tiene como bases nitrogenadas la adenina (A) guanina
(G) citosina (C) y uracilo (U) , como pentosa la ribosa y el grupo fosfato. Tanto el DNA
como el RNA absorben eficientemente luz ultravioleta por tanto este es un mtodo preciso,
rpido y no destructivo para determinar su presencia.. Las bases nitrogenadas de los
nucletidos presentan un mximo de absorcin a una longitud de onda de 260 nm mientras
que las protenas, por la presencia de aminocidos aromticos, absorben a 280 nm. La
relacin Abs260/Abs280 es una medida de la pureza del DNA y debe tener un valor de 1.65
a 1.85. Valores ms bajos indican contaminacin con protenas. Cuando el DNA se somete
a desnaturalizacin trmica su efecto puede evaluarse por medicin de la absorcin a 260
nm, la cual aumenta debido a que las dos cadenas se separan quedando las bases
nitrogenadas ms expuestas a la interaccin con la radiacin incidente. Este efecto se
conoce como efecto hipercrmico. Si el sistema se enfra rapidamente las cadenas
permanecen separadas pero si la temperatura desciende lentamente, las cadenas se
reasocian volviendo a la forma de doble hlice.
El DNA puede tambin desnaturalizarse a pHs fuertemente alcalinos (pH mayor de 11),
fuerzas inicas bajas, accin del metanol 3.5M, accin de la rea, con prdida de su
actividad biolgica. Las protenas unidas al DNA pueden disociarse desnaturalizndolas
por accin de detergentes aninicos y/o con sales concentradas. Los cidos nucleicos
puedes identificarse por medio de algunas pruebas sencillas como las siguientes:
1. Hidrlisis alcalina
Los lcalis diluidos (0.3 a 1.0 N), hidrolizan los enlaces ster del cido ribonucleico,
mientras que los enlaces ster del cido desoxirribonucleico son relativamente estables, lo
mismo que los enlaces N-glicosdicos de ambos cidos. La facilidad de hidrlisis en el
RNA parece estar asociada a la presencia de OH en los carbonos 2 y 3, lo cual permite la
formacin de intermediarios cclicos 2 y 3 fosfonucletidos, que finalmente dan los
monofosfonucletidos 2 3. Como la desoxirribosa del DNA no forma tales
intermediarios, es relativamente estable en presencia de lcali diluida. La acidificacin de la
solucin despus del tratamiento alcalino precipita las molculas de DNA intactas.
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MATERIALES Y REACTIVOS
Mortero
Vasos de precipitados
Erlenmeyer pequeo
Tubos de ensayo
Pipetas
Termostato
Centrfuga
Espectrofotmetro
Bao de hielo
Levadura
Buffer de extraccin: Tris 100mM , EDTA 50mM , NaCl 500mM, pH 8.0
Dodecil sulfato de sodio (SDS) al 20%
Acetato de potasio 5M
Isopropanol
Solucin de citrato de sodio 0.0015M-NaCl 0.015M
Acido molbdico
Acido ascrbico 100 mg/100 ml recin preparado
HCl concentrado
HCl 2 N
Reactivo de Millon
Solucin de Lugol
Reactivo de Molish
Acido sulfrico concentrado
Reactivo de Benedict
Eter etlico
Glucosa
Acido molbdico
Acido ascrbico (150mg/100ml)
HCl 6 N
PROCEDIMIENTO
Obtencin de Carbohidratos
1. Pele una papa de tamao mediano y ryela con un rallador de queso para obtener una
pulpa fina (esto debe hacerse lo ms rpido posible para evitar las reacciones de
oscurecimiento).
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Pruebas de Reconocimiento
1. Carbohidratos:
Patrones de glucosa y almidn.
A. Lugol.
A una fraccin de cada una de las muestras y de los patrones (0.5 ml de cada una) agregar 4
ml de agua y 1 gota de solucin de Lugol. Observar las coloraciones. Si la solucin es muy
oscura diluir con ms agua y observar nuevamente. A otras porciones iguales de estos
compuestos adicionar 1 ml de HCl 2 N y colocarlos en bao mara durante 15 min. Dejar
enfriar y agregar nuevamente Lugol. Observe los resultados y explquelos en el informe.
B. Molish.
A una nueva fraccin (0.5 ml de cada uno) de los compuestos anteriores agregar 2 gotas de
reactivo de Molish. Mezclar cuidadosamente y con los tubos inclinados agregar 1 ml de
H2SO4 concentrado de manera que se forme una capa de cido debajo de la fase acuosa.
No agitar los tubos. Observe el color del anillo formado en la interfase.
C. Benedict.
Colocar al bao mara durante 2 minutos, fracciones de las muestras y patrones (0.5 ml de
cada una), con 1 ml de solucin de Benedict. Observe los resultados y contine calentando
por 15 min. De nuevo observe los tubos.
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10.En la extraccin del ADN qu funcin cumplen el EDTA, el SDS y el acetato de Potasio.
BIBLIOGRAFIA
1. Martnez J. C. Guas de Anlisis Orgnico. Universidad Nacional de Colombia., 1996
2. Shriner R.L. Fuson R.C. Identificacin sistemtica de compuestos orgnicos. Limusa
Noriega editores , 1995.
3. Vogels A. Textbook of practical Organic Chemistry. Fourth Ed., 1978
4. Durst H.D. Gokel G.W. Qumica Orgnica experimental. Ed. Revert, 1985
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Los seres humanos y otros primates, as como los conejillos de indias y algunos
murcilagos, son los nicos mamferos conocidos que son incapaces de sintetizar cido
ascrbico; en consecuencia requieren vitamina C en la dieta para la prevencin del
escorbuto. Como es caracterstico en animales que no requieren vitamina C en la dieta, la
rata sintetiza cido ascrbico a partir de glucosa por medio de la formacin intermediaria de
cido D-glucuronico, cido L-glucornico, y L-gluconolactona. Los seres humanos, monos
y conejillos de indias carecen de la enzima heptica necesaria para llevar a cabo esta ltima
reaccin, es decir, la conversin de L-gluconolactona en cido L-ascrbico.
El cido ascrbico se obtiene a partir de frutas ctricas, tomates, fresas, verduras verdes, col
(repollo) y papas. Los jugos de naranja y limn son fuentes con alto contenido de la
vitamina y contienen alrededor de 0.5 mg/ml (2.8 mM). El cido ascrbico se destruye con
facilidad por calor, oxidacin y lcalis. Adems de su participacin en la nutricin, el cido
ascrbico suele utilizarse como un antioxidante para proteger el sabor y color naturales de
muchos alimentos (ej., fruta procesada, verduras y productos lcteos). En los materiales
vegetales puede presentarse en forma libre (cido ascrbico) o en forma combinada
(ascorbgeno). En esta forma no es susceptible de ser detectado por los mtodos corrientes
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de anlisis a menos que se hidrolice a cido ascrbico, hirviendo el material con solucin
de cido oxlico.
REACTIVOS
2-nitro anilina 0.16% en cido actico glacial- HCl 10% (relacin 9:1)
Nitrito de sodio 0.08 % en agua
HCl 1%
Etanol Absoluto
cido oxlico 0.15%
Solucin stock de Vitamina C 0.2 mg/ml
2 FRUTAS DIFERENTES PARA EXTRAER ZUMO (Deben traerlas los estudiantes,
preferiblemente CTRICOS)
PROCEDIMIENTO:
Tomar 1 ml de zumo de la fruta a estudiar y agregar 4 ml de cido oxlico 0.15%; mezclar
y filtrar si es necesario. Cuando trabaja con frutas que no se puedan exprimir, pesar 1g de
fruta y macerarlo con 4 ml de cido.
En tubos de ensayo marcados agregar los siguientes reactivos (adicione ms tubos si es
necesario de acuerdo a las muestras problema a analizar):
BLANCO T - T - T - T - T - T - T - T1
2
3
4
5
6
7
8
2-NITROANILINA
0.1
0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1
NITRITO DE SODIO
0.1
0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1
AGITAR Y OBSERVAR DECOLORACIN,
SI NO SE PRODUCE, ADICIONAR 0.1 ml DE NITRITO Y AL FINAL
RESTARLO DEL AGUA
ETANOL ABSOLUTO
1.0
1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
SLN VITAMINA C
0
0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6
0
0
CIDO OXLICO
0.6
0.5 0.4 0.3 0.2 0.1
0
0.3 0
MUESTRA
0.3 0.6
PROBLEMA
MEZCLAR Y DEJAR EN REPOSO 5 Min
NaOH
0.6
0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6
AGUA DESTILADA
2.6
2.6 2.6 2.6 2.6 2.6 2.6 2.6 2.6
T9
0.1
0.1
1.0
0
0.3
0.3
0.6
2.6
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encontrada en los tubos problema teniendo en cuenta las diluciones, calcular los mg de
cido ascrbico en 100 ml de jugo y en 100g de fruta.
DATOS, RESULTADOS Y DISCUSIN
1. Realice una tabla de datos de nmero de tubo y absorbancia a 540nm.
2. Realice una curva de calibracin con los datos de concentracin de patrn de cido
ascrbico contra absorbancia de la solucin a 540 nm.
3. Determine la concentracin de cido ascrbico en las muestras problema.
4. Determine el porcentaje de cido ascrbico en la fruta (tenga en cuenta el peso de la
fruta antes de partirla.
CUESTIONARIO
1. Cul es la funcin del cido oxlico en la prctica?
2. Explique cules son las reacciones que ocurren durante la prctica.
3. Qu pasara si se hiciera la determinacin de cido ascrbico a un zumo de fruta en
diferentes tiempos de haberse obtenido (inmediatamente, 1 hora despus, 10 horas
despus)? Por qu se presenta este fenmeno?
BIBLIOGRAFA:
ROCHE. Compendio de vitaminas. Propiedades de las vitaminas y su importancia en la
alimentacin humana. F. Hoffmann-LaRoche & Cia. 1972
MARKs, J. A guide of vitamins. Their role in health and disease. MTP, 1975
PLUMBER, D. Bioqumica Prctica. Bogot: Editorial Mc Graw Hill. 1981
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La presencia de inhibidores como los iones cianuro que forman complejos muy estables
con enzimas que tienen hierro frrico, lo inactivan. Los citocromos y la catalasa contienen
hierro frrico por tanto el cianuro las inhibe de manera no competitiva.
MATERIALES Y REACTIVOS.
Solucin de sangre fresca o extracto de habichuela
Buffer de fosfatos 0.02 M, pH 7.0 (Buffer pH 4,0, 5,0, 6,0 y 8,0)
Solucin de perxido de hidrgeno (H 2O2) 0.05 M, recin preparada en el buffer fosfato pH
7,0).
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TUBO 2
9,5
TUBO 3
9,0
TUBO 4
8,5
TUBO 5
8
(mL)
H2O2 (mL)
Enzima (mL)
2
2
2
2
2
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
Despus de adicionar la enzima y agitar los tubos, deje reaccionar 5 min. y adicione:
H2SO4
H2O2 (mL)
Enzima (mL)
0,5
1,0
1,5
2
0,5
0,5
0,5
0,5
Despus de adicionar la enzima y agitar los tubos, deje reaccionar 5 min. y adicione:
H2SO4
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REACTIVOS TUBO 1
B.
Fosfatos
9,5
seleccionado en I
TUBO 2
9,5
TUBO 3
9,5
(mL)
H2O2 (mL)
NaCN (gotas)
Enzima (mL)
2
2
2
5
10
15
1,0
1,0
1,0
Despus de adicionar la enzima y agitar los tubos, deje reaccionar 5 min. y adicione:
H2SO4
mL
KMnO4
gastados
Micromoles
H 2O 2
Iniciales
Micromoles
H2O2
residuales
Micromoles
Micromoles
H 2O 2
descompuestas/min/
descompuestas mL enzima
1
2
3
4
5
6
7
2.
3.
4.
5.
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CUESTIONARIO
1. En la prctica Ud. estudi algunos factores que afectan la actividad de la enzima. Qu
otros factores tendra que evaluar para completar el estudio cintico de la catalasa?
EXPLIQUE.
2. Compare la accin de la catalasa con la accin de la peroxidasa.
3. Cul es el papel del H 2SO4 en esta prctica? Por qu no se aplica al tiempo con los
dems reactivos?
4. Se podra sustituir el cido sulfrico por otro reactivo como el hidrxido de sodio
(NaOH)? Justifique su respuesta.
5. Qu pruebas adicionales tendra que realizar para determinar si sta es una enzima
michaeliana alostrica? Justifique su respuesta.
BIBLIOGRAFA
BOHINSKI R. Bioqumica. Ed. Fondo Educativo Interamericano, 1992
HARPER H. y cols. Bioqumica. Ed. El Manual Moderno, 1995
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Espectrofotometra
Espectrofotometra es el sistema de anlisis basado en las medidas de la intensidad de la luz
que pasa a travs de una solucin utilizando un estrecho intervalo de longitudes de onda.
Se define como la distancia entre dos picos cuando la luz recorre un camino en forma
ondulatoria, se mide en Amstrongs (A)= 108 cm, milimicras o nanmetros (nm) = 10-7 cm
Fundamentos de la colorimetra
Cuando un rayo de luz de longitud de onda especfica pasa a travs de una solucin, parte
de la luz es absorbida. La cantidad de luz absorbida por dicha solucin depende de dos
factores: la distancia que debe recorrer el haz luminoso dentro del lquido y de la
concentracin de la sustancia que absorbe en la solucin. Las leyes que relacionan estos
factores con las medidas colorimtricas de las sustancias son:
A. Ley de Lambert: Establece una relacin entre la intensidad de la luz trasmitida y el
espesor de la celda o camino recorrido por la radiacin luminosa. La expresin matemtica
es:
I = Io e-K1L
Donde: I = Intensidad de la luz transmitida
Io= Intensidad de la luz incidente
e = Base de logaritmos naturales
L = Espesor de la celda atravesada por la luz (cm)
K1= Constante caracterstica de la sustancia coloreada.
B. La ley de Beer: Relaciona la intensidad de la luz trasmitida con la concentracin de la
sustancia coloreada dentro de la solucin, mediante la siguiente ecuacin:
I = Io e-K2C
Donde I, Io y e son los mismos de la primera ecuacin.
C = Concentracin de la solucin coloreada (M).
K2 = Constante de la sustancia coloreada.
Las dos leyes pueden combinarse en una, conocida como la Ley de Lambert-Beer, cuya
expresin matemtica es:
I = Io e-KCL
Despejando y pasando a logaritmo decimal tenemos:
Log Io/I = 0.4343 KCL
El log Io/I es el valor conocido como absorbancia (A) o densidad ptica. El valor 0.4343K
se conoce como coeficiente de extincin ptica y se representa como ae. Reemplazando en
la ecuacin tenemos:
A = aeCL
La transmitancia (T) se ha definido como:
T = I/Io
%T = I/Io x 100
Io/I = 100 / %T
Log Io/I = log 100 log %T
La frmula que relaciona la transmitancia con la absorbancia es:
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A = 2 log %T
Anlisis de protenas
Para la determinacin de protenas no existe un mtodo totalmente satisfactorio; por tanto
la escogencia del mtodo depender de la naturaleza de la protena y de otros componentes
de la muestra, de la exactitud y sensibilidad deseadas y de la rapidez con que se requieran
los resultados.
Mtodo de Biuret.
Los compuestos que tienen ms de dos enlaces peptdicos, dan un color rosado o lila
caracterstico, cuando se tratan con sulfato de cobre en solucin alcalina. El color es debido
al complejo de coordinacin del tomo de cobre con cuatro tomos de nitrgeno
provenientes de los enlaces peptdicos (dos de cada pptido) . La estructura del complejo a
la cual se debe la coloracin es la siguiente:
Los espectros de absorcin de los complejos de cobre formados por diferentes protenas son
similares y por consiguiente es posible utilizar una protena cualquiera como patrn de
coloracin. Para obtener coloracin se requieren cantidades relativamente grandes de
protena (1-20 mg/mL).
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Mtodo de Kjeldahl.
El mtodo de Kjeldahl, diseado para la determinacin de nitrgeno total (nitrgeno
proteico y nitrgeno no proteico), puede aplicarse al anlisis de protena de una muestra. El
contenido de protena verdadera puede determinarse haciendo una extraccin previa de sta
o tambin determinando el nitrgeno no proteico. Las reacciones que ocurren durante el
proceso son :
El porcentaje de nitrgeno total (Nt) se puede calcular a partir del volumen de cido
clorhdrico ( de concentracin conocida) gastado, de acuerdo a la siguiente frmula:
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REACTIVOS
Mezcla catalizadora
cido brico 4%
H2SO4 concentrado
NaOH 50%
HCl 0.01N valorado
Indicador de Tashiro
Reactivo de Biuret
NaCl 1%
Patrn de protena (albmina de huevo o casena) de 5mg/ml
METODOLOGIA
1. Preparacin de la muestra.
Pesar 2 gramos de la harina respectiva y distribuirla en dos tubos plsticos. Adicionar 10 ml
de NaCl 1% a cada uno, agitar durante 10 minutos, centrifugar a 2800 rpm, y recibir el
sobrenadante en un matraz aforado de 25 ml y llevar a volumen con NaCl 1%. Descartar el
residuo. Aqu se obtiene un extracto de protenas que contiene albminas y globulinas, las
cuales se cuantificarn por el mtodo de Kjeldahl y el mtodo de Biuret.
2. Mtodo de Kjeldahl.
a. Digestin
Tome dos matraces Kjeldahl para digestin y adicione en uno de ellos entre 2 mL del
extracto de la harina obtenida en el paso 1 y en el otro 3 ml de agua destilada (ste ser el
blanco del procedimiento y solo lo realizar un grupo). A cada matraz adicione en su orden:
100 mg de mezcla catalizadora
30 gotas de H2SO4 concentrado.
Coloque los balones en el digestor (consulte el profesor), calentando suavemente al inicio y
aumentado la temperatura hasta que la solucin tome una coloracin verde esmeralda.
b. Destilacin y adsorcin.
Transferir a un matraz de boca esmerilada la solucin digerida. Lavar dos veces con 1 ml
de agua destilada y transferir la solucin de lavado al mismo baln. Consulte al profesor el
manejo del destilador. En un erlenmeyer de 100 ml, medir 10 ml de cido brico 4% y
adicionar 2 gotas del indicador Tashiro. Recoger el destilado sobre esta solucin y observar
el cambio de coloracin a medida que se recoge ste.
c. Titulacin.
Titular el destilado recibido sobre el cido brico, con HCl de normalidad conocida, hasta
obtener la coloracin inicial.
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3. Mtodo de Biuret.
Para la determinacin de protenas por el mtodo de Biuret se realiza una curva de
calibracin utilizando patrn de albmina o de casena de una concentracin de 5 mg/ml.
Rotular 8 tubos de ensayo y adicionar los siguientes reactivos:
Mezclar bien y dejar en reposo por 30 minutos a temperatura ambiente o por 10 minutos a
30 C para el desarrollo del color. Leer en cada tubo el porcentaje de transmitancia a 540
nm usando el tubo B para ajustar el 100 % de transmitancia.
CALCULOS, RESULTADOS Y DISCUSION
A. Kjeldahl: Empleando la frmula calcule el porcentaje de protena presente en la harina.
B. Biuret: Trace en papel milimetrado la grfica de calibracin (Absorbancia vs
concentracin en mg/ml). Calcule la concentracin de albminas y globulinas presentes en
el extracto.
C. Comparar los resultados obtenidos por los dos mtodos y con la literatura consultada.
CUESTIONARIO
1. Al efectuar la extraccin de protenas con base en la solubilidad, por error usted us agua
en lugar de NaCl al 1%. Qu obtuvo en el sobrenadante? Qu protenas quedaron en el
residuo? EXPLIQUE.
2. Que tcnicas se aplican para desnaturalizar protenas? Cules de esos agentes son
reversibles?
3. Usted realiz la curva de calibracin de Biuret (valores de absorbancia entre 0,17 y 1,54)
y al leer la Absorbancia de los tubos que contienen la muestra a analizar, se obtuvo un valor
de 2,10. Qu hara Ud. en este caso con la muestra? EXPLIQUE.
4. Que diferencia hay entre protena bruta y protena verdadera? EXPLIQUE.
5. Indique cul es la composicin de la mezcla catalizadora usada en el mtodo de Kjeldahl.
6. Qu es y cmo funciona el Indicador de Tashiro?
BIBLIOGRAFIA
1. Acevedo F., Estudio de las protenas presentes en las semillas de algunas leguminosas
Colombianas., Tesis de Qumica 1972.
2. Surez G., Sastre Marco F. Comparacin de cuatro mtodos para la determinacin
cuantitativa de protenas Tesis de Qumica, 1982
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Lisis celular. Vlido para clulas sin pared celular como las clulas de tejidos
animales, pero no es suficiente para clulas vegetales o bacterias. Consiste en
suspender las clulas en una solucin hipotnica (ms diluida que el interior celular).
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eluyen primero las protenas mas dbilmente retenidas y cuando la fuerza inica sea
mayor saldrn las protenas ms cargadas y por lo tanto ms retenidas.
Todos estos sistemas pueden automatizarse, en base a sistemas cromatogrficos tales como
el FPLC, en el que se hace uso de bombas de alta presin (100-400 bares) y columnas con
materiales que soportan altas presiones. Este sistema reduce notablemente los tiempos de
purificacin y utilizan fases estacionarias con mayor poder de retencin, lo que incrementa
los porcentajes y rendimiento de las purificaciones.
PROCEDIMIENTO
PARTE I
EXTRACCIN DE PROTENAS
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280 nm. Las fracciones con absorbancias altas, correspondern a la favina pura
y libre de glucosa. Rena estas fracciones en un pool y guarde una alcuota para
pruebas posteriores (aglutinacin y electroforesis).
PARTE III
PRUEBAS DE AGLUTINACIN
CUANTIFICACIN
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BIBLIOGRAFA
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