Deteccin rpida fenotipo de hemoglobina por espectrometra de masas de

alta resolucin sobre las protenas intactas

Dado el excelente rendimiento de los espectrmetros de masas moderna, su aplicacin
clnica para el anlisis de macromolculas es un campo de creciente inters. Este
principio se explor mediante anlisis de hemoglobina, que es un ejemplo
representativo de su peso molecular y la relevancia clnica en los programas de cribado
por ejemplo talesemia y la hemoglobina variantes. Teniendo en cuenta su abundancia y
la contencin celular, pre-anlisis se reduce de manera significativa lo que permite
rpidas adquisiciones esenciales.
Mtodos: Mediante el anlisis paralelo de diagnstico de rutina para las variantes de
hemoglobina y la talasemia, que adquirieron muestras de adultos que fueron
consentidos para el cribado hemoglobinopata en nuestro laboratorio clnico. El proceso
de pre-analtica que slo consta de lisis de glbulos rojos; sin otras fases de digestin y
purificacin, las muestras se inyectaron directamente en una configuracin de
ionizacin por electrospray cuadrupolo tiempo de vuelo y las protenas intactas se
analizaron mediante anlisis por inyeccin en flujo. Despus de la optimizacin de los
parmetros del proceso, los espectros de masas deconvoluted revel la presencia de
alfa- y beta- globulinas. Los rangos de referencia para la masa media de ambos
globulinas y su relacin de intensidad (-relacin /) se dedujeron de un subgrupo
libre de enfermedad y los pacientes con una hemoglobinopata se compararon.
Resultados: El / -relacin es un marcador pobre para los pacientes con talasemia,
pero desviados / -ratios se encuentran en los pacientes con una variante de
hemoglobina. Desviaciones en masa de hasta 1 Da puede resolverse; incluso si el
paciente sufre de un trastorno heterocigtica, la masa media se encuentra fuera del
intervalo de referencia establecido. Conclusiones: A pesar de que no se detectaron
pacientes con talasemia leve, todos los pacientes con una variante de hemoglobina se
resolvieron por arriba hacia abajo espectrometra de masas utilizando la masa media
globulina y la -relacin / como parmetros de seleccin.
La hemoglobina humana es una estructura tetramrica basado en dos subunidades
diferentes que llevan a cabo las molculas hemo para el transporte de oxgeno y
dixido de carbono. Hemoglobina de adulto (HbA) consiste en dos - y dos subunidades
beta- (2 / 2) y estas globulinas se mantienen juntas mediante interacciones no
covalentes. Trastornos de la hemoglobina relacionados se refieren a anomalas en la
estructura y la sntesis de la - y -subunidades; estas hemoglobinopatas son las
alteraciones monognicas ms comunes en todo el mundo [1]. Produccin reprimida de
globulinas individuales (talesemia) o la sntesis de las globulinas con una secuencia de
aminocidos anormal (variantes de hemoglobina) estn conectados clnicamente para
una variedad de posibles sntomas tales como anemia hereditaria, sobrecarga de
hierro, insuficiencia cardaca e ictericia [2]. Algunas variantes de hemoglobina y los
trastornos relacionados con la talasemia son clnicamente relevantes y que coexisten
con regularidad. Por lo tanto el anlisis hemoglobinopata se incluye en los programas
de deteccin para recin nacidos, mientras que muchos laboratorios clnicos ofrecen
combinaciones de pruebas de ADN -talasemia anlisis y la cromatografa lquida de
alta presin (HPLC) o losa-gel / la electroforesis capilar de zona para beta-talasemia y la
hemoglobina variantes [3 ]. En este ltimo escenario, los anlisis de rutina se realizan
para los pacientes diagnosticados con una aparicin tarda de los sntomas. Teniendo
en cuenta la coherencia entre unas variantes de la hemoglobina y la talasemia,

sintomatolgico, as como bioqumica, nos explorar una aproximacin diagnstica

alternativa mediante espectrometra de masas de arriba hacia abajo (MS)
Anlisis de hemoglobina por MS se basa en caractersticas diferentes en comparacin
con las tcnicas actuales, tales como HPLC [4]. En este documento, la especificidad se
alcanza por el tiempo de retencin de tetrmeros de hemoglobina en una columna de
calibrado adecuadamente, que pueden llegar a ser menos especfico en presencia de
cromforos de interferencia. Debido a la desmontaje de ionizacin inducida del
tetrmero de hemoglobina, la masa de los diferentes tipos de globulina se adquiere,
por lo tanto, que es un marcador altamente especfico. Por lo tanto, MS
elaboradamente
ha
sido
reconocido
por
el
anlisis
de
variantes
de
hemoglobina. Resolucin de masa apropiada ha sido alcanzada por digestin trptica y
subsiguientes mediciones MALDI-TOF de fragmentos de pptido [5,6]. Metodologas
avanzadas que emplean ionizacin por electrospray (ESI) en tndem MS en pptidos
trpticos permitidos para anlisis de la secuencia, en los que la ubicacin de una
sustitucin de aminocidos dada podra conferirse [7-12]. Por este mtodo, las
proporciones de fragmentos de pptidos especficos se han aplicado en la deteccin de
hemoglobinopatas en manchas de sangre seca [13-16]. Aunque algunos de estos
enfoques de abajo hacia arriba se han automatizado, preparacin de la muestra puede
llevar mucho tiempo, especialmente cuando el anlisis de masas est precedida por
cromatografa. Rpida de arriba hacia abajo MS tambin se ha aplicado para la
deteccin de variantes de hemoglobina, en el que las masas de globulina intactas se
han obtenido por MALDI-TOF [17] y ESI triple cuadrupolo MS [18]. Ambos enfoques se
han combinado en las metodologas de dos niveles para la deteccin y
confirmacin; algunas
metodologas
han
sido
evaluados
clnicamente
[8,11,12,19,20]. Slo en una sofisticada Orbitrapbased MS, el enfoque de arriba hacia
abajo permitido para el diagnstico inequvoco de fenotipos clnicamente relevantes en
muestras de sangre seca mediante seguimiento de iones nica de la globulina intacta y
las posteriores etapas de fragmentacin [20-22].
Teniendo en cuenta la resolucin y sensibilidad de la EM actualmente accesibles,
presentamos una alternativa y un enfoque de arriba hacia abajo de rpido en un
tiempo-de-vuelo ESI-cuadrupolo (Q-TOF) MS.Teniendo en cuenta su gran abundancia y
la contencin celular, omitimos cualquier tipo de preparacin de la muestra o la
purificacin antes del anlisis de la hemoglobina. Por lo tanto, mediante el anlisis de
inyeccin de flujo (FIA), inyectamos directamente eritrocitos lisados y uso, despus de
deconvolucin espectral, la relacin de intensidad de la - y -subunidad as como su
masa especfica como parmetros de deteccin. Deducimos las distribuciones de
masas de la - y de cadena y la relacin / -intensidad de una poblacin que
comprende de los adultos libres de la enfermedad que sirven como referencia.
Posteriormente, los sujetos sanos y pacientes con hemoglobinopatas que han sido
analizados por HPLC y el ADN se comparan.
2.1. Productos qumicos e instrumentacin
Se extrajo sangre utilizando tubos de muestra Li-heparina (BD Vacutainer). Acetonitrilo
de grado HPLC y agua para dilucin de la muestra y la FIA se obtuvieron de Biosolve. El
cido frmico y formiato de amonio fueron adquiridos de Sigma Aldrich. Soluciones
para el anlisis se almacenan en 1,5 ml (viales de vidrio ALWSCI).
El anlisis por HPLC se realiz en un Waters 2695 Mdulo de separaciones (Alliance)
con un Polycat una columna (200 x 4,6 mm, 5 micras, Alltech Applied Science BV). La

deteccin se realiz por deteccin UV-vis en lnea (Waters 2487 Dual detector de
absorbancia) y la fecha se proces utilizando Empower Pro 2. Ingredientes para la fase
mvil A y B para HPLC (40 mM Bis-Tris + KCN 2 mM, pH 6,5 y 40 mM Bis-Tris + KCN 2
mM + NaCl 200 mM, pH 6,8) se obtuvieron de Sigma Aldrich.
El anlisis de ADN para la deteccin de -talasemia por GAP-PCR se realiz en un
termociclador Peltier (Biorad). Se aplicaron cinco cebadores para eliminaciones: 3.7,
4.2, 20.5, MAR y MED, que representan el 80% de -talasemia [23]. La cuantificacin
se realiz por imago Imaging (B & L sistemas)
Los espectros UV-vis para la determinacin de la concentracin de hemoglobina se
registraron en un Perkin Elmer Lambda 25
Los espectros de masas se adquirieron a partir de una Waters Xevo G2-S Q-TOF con
ESI conectado a un sistema de clase I Aquity UPLC. El funcionamiento de la
configuracin se realiz con el paquete de software MassLynx.
2.2. preparacin de la muestra
Para las mediciones de HPLC, 100 l de sangre entera de heparina se lav con 1 ml de
0,9% de NaCl. Despus de la agitacin, el material se centrifug durante 5 min a
15000G. El sobrenadante se retir mediante una pipeta y se aadi 200 l de agua
doble ionizado. Las clulas se lisaron por 5 min y el material se almacen en el
congelador (-20 C).
Para las mediciones de EM, se aadieron 20 l de lisado para HPLC a un 1,000 l de
tampn de formiato de amonio (10 mM en agua a pH = 4,5). La concentracin
aproximada de las soluciones fue de 20 M segn lo establecido por UV-vis. Despus
de mezclar por vrtice, las muestras se almacenaron a 10 C en carrusel de muestras
de la MS.
2.3. Condiciones de espectrometra de masas
Para la inyeccin, 0,2 l de muestra se inyectaron mediante inyeccin en bucle parcial
en un flujo isocrtico (0,2 ml / min) de 90/10 v / v de agua / acetonitrilo con cido
frmico al 0,1%. Las muestras se analizaron por FIA (sin columna), en el que se
estableci el tiempo de ejecucin en 1,5 min.
Para la formacin de iones de ESI, se aplicaron los siguientes ajustes optimizados:
tensin capilar = 1.0 kV, cono de muestreo = 20 V, cono de extraccin = 4,0 V,
temperatura Fuente = 100 C de temperatura, desolvatacin = 500 flujo de gas C,
Cono = 10 l / h, el flujo de gas de desolvatacin = 650 l / h.
Para la adquisicin de los espectros de masas en el modo de resolucin positiva, la MS
se calibr con cido fosfrico. Dentro de la correccin de la masa de gestin se logr
utilizando LockSpray con una leucina-encefalina (Tyr-Gly-Leu-Glyphe, 556,2771 Da)
estndar cada 10 s. Se obtuvo el sobre de masa en el rango de entre 150 y 2000 m / z
en un tiempo de ciclo de 0,1 s. Un perfil optimizado del primer cuadrupolo se mantuvo
a MASS1 (300 m / z en un 10% el tiempo de exploracin para la permanencia y el
tiempo de rampa), Mass2 (700 m / z en el instante 20% de exploracin para el tiempo
de permanencia) y Mass3 (1200 m / z ).

Procesamiento de datos
Un espectro de masas en bruto se obtuvo a partir del cromatograma de iones totales
de corriente (TIC) entre 5,0 y 12,0 s. Este espectro acumulativa, en base a 70 espectros
de masa individual, se proces por la secuencia de comandos de deconvolucin
entropa mxima (MaxEnt1) en el software MassLynx. Se utiliz el sobre de masa entre
650 y 1200 m / z fue procesado y los siguientes parmetros de script: Deconvolucin
rango de masas de salida: 14,000-17,000 Da, resolucin de salida de deconvolucin:
0,1 Da, Ajustes para el modelo de simulacin de daos patrn de istopos: anchura a
media altura : 0,25 Da y mnimas relaciones de intensidad: 33%. Deconvolucin a la
convergencia tom 25 s.
Despus de deconvolucin, deconvoluted masas exactas se obtuvieron mediante el
centrado pico en MassLynx (1, parte superior centroide 80%, espectro de rea). El
anlisis estadstico de la - y -media de la masa y la -relacin / se realiz mediante
Analizar-it en Microsoft Excel usando un mtodo paramtrico.
Seleccin de muestras
No se aplic la seleccin de pacientes y las muestras se utiliza partir de personas
adultas que fueron consentidos para el anlisis hemoglobinopata. En nuestro
laboratorio, esto incluye un anlisis total de hemograma, HPLC y ADN; proporcionando
de este modo un diagnstico basado en la rutina necesaria para esta comparacin, en
el que se realizaron mediciones paralelas por un perodo de 3 meses.
Las caractersticas basales de los sujetos se muestran en la Tabla 1. En lugar de
seleccionar a un subgrupo sana, una poblacin de controles negativos (o sujetos sin
enfermedad) sirvi de referencia. Los sujetos fueron considerados negativos en
ausencia de un diagnstico de la talasemia y una variante de hemoglobina. Talasemia
se diagnostica mediante una prueba de ADN positivo para -talasemia y los criterios
diagnsticos para un -talasemia son una fraccin HbA2-N3.5% con MCV b 80 fl y un
nivel de hierro normal. Este ltimo trastorno se diagnostica por un HbA1-fraccin B95%
y la presencia de otras variantes de la hemoglobina en HPLC.
estudio de optimizacin
Antes de la medicin de las muestras de pacientes, un estudio de optimizacin se
realiz para las condiciones apropiadas para la preparacin de muestras, la inyeccin,
la ionizacin, la adquisicin de la masa y de deconvolucin espectral. Para estas
investigaciones, se emple una muestra de hemoglobina de un sujeto sano en una
concentracin optimizada de 20 mM. La forma y el rea bajo la TIC-cromatograma se
utilizan para acceder a la eficiencia de ionizacin, que se considera ptimo cuando
estaban en forma de Gauss y el rea relacionada linealmente con la cantidad de
muestra inyectada. Con el fin de obtener las condiciones adecuadas, se variaron el
volumen y velocidad de flujo de inyeccin entre 0,1 y 0,3 ml / min y 0,1 a 0,3 l,
respectivamente. En este proceso, los parmetros de ionizacin tales como
desolvatacin flujo de gas / temperatura, el flujo de gas del cono, voltaje del cono de
muestra / extraccin, voltaje capilar y temperatura de la fuente se optimizaron
tambin. A un caudal de 0,2 ml / min y 0,2 l de la muestra inyectada, se recogieron los
espectros de masas entre 5.0 y 12.0 s resultantes en el espectro de masas en bruto
(Fig. 1A).

El espectro de masa cruda revela la presencia de ambos alfa y beta globulinas en

estados cargados distintamente, y la molcula de hemo-cargada individual en 616,5
Da. La -globulina es principalmente abundante en su estado de carga de 21 veces,
mientras que es en su mayora la actualidad el 20 veces estado de carga de la globulina. Debido a su diferencia de masa de 740,9 Da, el sobre masa de la ms
pesada -globulina se desplaza a / z valores de m ms alto. Como consecuencia, los
dos picos de masa estrechamente aproximadas a 721 bm / zb 723 (21 + -22 +) y
756 bm / zb 758 (21 + -20 +) a la que la resolucin del espectrmetro de masas es
sin embargo suficiente (Fig. 1B, panel superior) .
Con el fin de obtener el espectro de masas final, se utiliz una secuencia de comandos
de deconvolucin, que produce los picos de masa deconvoluted de la globulina - y en 15,126.2 y 15,867.0 Da, respectivamente (Fig. 1C). Como ya se ha observado en los
espectros en bruto, la intensidad de la -globulina es la ms alta, por lo tanto, la
relacin de intensidad entre la - y -pico del espectro de deconvoluted excede la
unidad (-relacin / N 1). Al tener en cuenta los picos de masa cantidad de y en
el espectro bruto, es obvio que el / - relacin depende de la seleccin que se utiliza
parte del espectro bruto para deconvolucin. Adems, la relacin de intensidad de los
picos de masa cruda en el momento cambios en el estado cargado (por ejemplo, [ / ]
21 + N-ratio [ / ] 13 +-ratio, Fig. 1B del panel superior e inferior,
respectivamente). En el estudio de optimizacin, se logr la mxima precisin de la / relacin de (CVwithin-run = 2,7%) despus de la seleccin de un gran, en lugar de un
sobre pequeo, de masa entre 650 bm / zb 1200 (24 + -13 +), en el que todos los
picos se resolvieron adecuadamente.
La discrepancia entre fisiolgicos / -ratios (1, a niveles bajos de HbA2) y los valores
fsicos superiores deducidas del espectrmetro de masas (/ -cociente 1.5) se
racionaliza por la menor afinidad protnica de -globulinas, debido a conformacional
efectos [24]. Como parte del estudio de optimizacin, afluencia selectiva de beta-iones
fue investigado por la composicin del flujo de lquido y diferentes estrategias de
tampn de muestras. Buffering con formato de amonio ionizability mejorada, en la que
tampones cidos (pH = 2,5) dio lugar a alta ionizability y altas / -ratios. A la inversa, el
tampn menos cida (pH = 4,5) proporcion / -ratios ms cerca de la unidad a
ionizability inferior. Adems de la qumica, la configuracin de ESI se han optimizado,
en el que se observ una tendencia similar; / -ratios ms cerca de la unidad
comprometer seales TIC inferiores. Compensacin para seales de TIC inferior se
consigue aumentando el volumen de inyeccin, en el que la relacin lineal entre el rea
bajo el volumen TIC-cromatograma y la inyeccin persisti. Adems, aumentando el
volumen de inyeccin no afect a la / - relacin, por lo tanto, la supresin de iones
no se evidenci. Por ltimo, la optimizacin de los parmetros matemticos para
deconvolucin solamente revel un efecto marginal en / - relacin. Sin embargo, el
centrado pico en MassLynx mejor fuertemente la reproducibilidad y baj el valor de la
-relacin / .
poblacin de referencia
Bajo las condiciones optimizadas, las muestras de pacientes se midieron poco despus
de anlisis de rutina por HPLC. Durante los 3 meses de adquisicin en paralelo, se
analizaron 60 muestras incluyendo su anlisis de ADN. Despus de una consulta SQL
en los datos de nuestro sistema de informacin de laboratorio, todos los sujetos sin una
variante de hemoglobina (N = 50) fueron reclutados para los intervalos de referencia
de la - y -deconvoluted masas. A media -masa de 15,126.216 se determin en un

intervalo de referencia percentil 1-99th de 15,126.136-15,126.292 Da (Fig. 2A). Para la

-globulina, una media de masa 15,866.994 Da se dedujo en un intervalo de referencia
percentil 1-99th de 15,866.896-15,867.089 Da (Fig. 2B). El subgrupo libre de
enfermedad con resultados negativos para un hemoglobinopata (N = 36) se utiliz
para establecer el intervalo de referencia para el / - relacin (figura 2C.); La relacin
media / - era 1,50 en un intervalo de referencia percentil 1-99th de 1,30 a 1,70
De vez en cuando, sobre el procesamiento de los espectros de masas de la poblacin
de referencia, se observaron otros picos que y en pequeas intensidades. En
muchos temas, un aducto de glutatin se encuentra en la -globulina en 16,172.2 Da
(Fig. 1C, panel superior) [25], y aductos de glucosa en ambos alfa y beta globulinas se
encontraron en los pacientes diabticos (Fig. 1C, centro panel). Adems, deltaglobulinas procedentes de HbA2 (2 / 2) en 15,924.1 Da fueron dbilmente visible.
Comparacin de pacientes Despus de ajustar la referencia para los controles
negativos, el / - relacin de todos los sujetos se compar con la fraccin HbA1 y
HbA2, que se determinaron mediante HPLC (Fig. 3A). Todos los pacientes con talasemia (N = 6) tena HbA1 normal (N95%) y HbA2 (1.5 a 3.5%) y los niveles de
su relacin de / - se encontr en el rango de referencia (Fig. 3B). -talasemia
pacientes (N = 8 con niveles de HbA2 N3.5%) tambin tenan relaciones de -alfa /
en el intervalo de referencia, aunque todos los valores se encuentran por encima
del percentil 50. En esta categora, los pacientes con HbA1 b 95% y niveles
suficientemente altos de HbA2 se analizaron para un estudio de concordancia entre
el nivel de -relacin / y HbA2 [9]. Aunque delta-globulinas eran visibles en estos
pacientes (Fig. 1C, panel inferior), el pico de masa era insuficiente para la
cuantificacin reproducible
Concordancia Strong, sin embargo, se encontr en los pacientes con variantes de
hemoglobina (N = 10). Se analizaron 6 muestras de pacientes con HbS, en los que
se encontr una -globulina mutado (betaS) en 15,837.0 Da al lado de la globulina normal en 15,867.0 Da (Fig. 3C, panel superior). Esta diferencia 30 Da es
debida a la sustitucin de cido glutmico (147,13 Da) con valina (117,15 Da) en la
posicin 6 de la -globulina. En estos temas (y la mayora de los pacientes con
otras variantes de hemoglobina), la -globulina se ha visto comprometida, lo que
causa alta / -ratios (Fig. 3B). Un aumento de la -relacin / tambin se encontr
en un paciente con la persistencia de HbF (2 / 2), en la que el G-globulina en
15,995.6 Da era evidente al lado de la -globulina. Adems, con respecto a la
hemoglobina fetal, se analizaron muestras de recin nacidos, en la que
encontramos de vez en cuando una A -globulina adicional en 16,009.3 Da [27]. En
un sujeto, el / - relacin se utiliza para controlar la activacin de genes de
globulina-fetal a adulto (Fig. 3C, panel inferior). El / - relacin no podra ser
deducido a partir de dos pacientes que carecan completamente HbA1 en HPLC, lo
que corrobora con la ausencia de un pico de -masa en la EM. Una homocigotos
HbSS (2 / betaS 2) paciente en una crisis de clulas falciformes slo revel el pico
de masa de los betaS globulina adems de la globulina -. Otro tema con HbE / talasemia (HbE (35%) / HbF (65%)) revel un pico de masa de la G-globulina al
lado de la -globulina y un "aparente -globulina 'en 15,865.9 Da (Fig. 3D).
Puesto que ningn HbA1c fue encontrado en este paciente en particular, globulinas estaban ausentes y la masa adquiridos nicamente dependan del alelo
variante E. El observado 1 Da diferencia de masa se origina a partir de la
sustitucin de cido glutmico (147,13 Da) por lisina (146,18 Da) en la posicin 26

(para pacientes con HbC en la posicin 6) de la -globulina. En dos pacientes

heterocigotos con HbC (29%) y HBe (27%), se encontr que las fracciones de HbA1
N65%, en la que -globulinas regulares fueron ms abundantes que sus
contrapartes C y E. A pesar de sus estados superpuestos mixtos, se encontr que
la masa media resultante fuera del rango de referencia percentil 1-99th establecido
para la -masa (Fig. 3D-insercin). Sorprendentemente, sin embargo, todos los
pacientes HbS revelaron las masas medias irregulares para el -globulina, aparte
de alfa / -ratios desviadas establecidos anteriormente. Esto no era de esperar
teniendo en cuenta la presencia de -globulinas regulares de HbA1 residual en
estos temas. Digno de mencin, Wild y colaboradores encontraron un rango
percentil -masa 1-99th de 0,42 y 0,84 Da para HbFA y HbFAS, respectivamente
[18]. Un triple cuadrupolo ESI MS se utiliz para el anlisis de arriba hacia abajo de
las muestras neonatales y la -masa se determin sobre la fijacin de la -masa en
15,126.38 Da. De esta manera, se reconoce este fenmeno, mientras que un rango
de -masa significativamente menor se encuentra en nuestra configuracin de una
resolucin ms alta.
Discusin
El rango de referencia de la -relacin / se dedujo a partir de sujetos libres de la
enfermedad, todos los cuales dieron como resultado niveles normales de HbA1 y
HbA2 en HPLC. Cuando se compara con la EM, la propagacin de la / - relacin
puede ser inesperadamente alta. Es causada fsicamente por las cantidades de alfa
y beta iones que entran en el Q-TOF, en el que se observa una variacin leve entre
pacientes. Con la mencionada CVwithin-run = 2,7% y un CVwithin-laboratorio =
4,8% (deducida a partir de un protocolo EP05 basado en lisados congelados
idnticos), la imprecisin de la MS, en lugar de los efectos de matriz biolgicas,
predominantemente atributos a este rango de referencia. Por lo tanto, la
aplicabilidad de la relacin / - como un parmetro de cribado para la talasemia
parece pobres; despus de todo, la mayora de nuestros pacientes con talasemia
tienen niveles normales de HbA1 en HPLC con nica variacin menor (Fig. 3A).
Con respecto a -talasemia, todos los pacientes se encuentran en el intervalo de
referencia establecida, mientras que la hiptesis de que los pacientes con tres /
cuatro a-alelos afectados tendrn menor / - relacin debido a la presencia
abundante de HbH y / o Hb Barts. Con respecto a -talasemia, observamos / coeficientes alfa de fenotipos de soporte por encima del percentil 50, lo que
probablemente es causada por la presencia de HbA2. En nuestro caso, intactos
delta-globulinas estaban mal cuantificable y teniendo en cuenta el enfoque de
arriba hacia abajo que 224 F. HELMICH et al./ Clinica Chimica Acta 460 (2016) 220226 puede ser capaz de identificar a los sujetos con trastornos clnicamente
relevantes tales como la -talasemia mayor. Mediante el uso de HPLC con
deteccin ptica, Wan et al. demostr que la relacin de las globulinas intactas ( /
beta y / delta) podra utilizarse para discriminar sujetos normales de portadores
beta-talasemia [26]. Esto se logr mediante notablemente pequeas variaciones de
las relaciones de intensidad globulina entre los subgrupos. Mediante el uso de MS,
la cuantificacin ha sido realizada por nica MS de abajo hacia arriba, en el que las
transiciones MRM de pptidos trpticos-globulina especfica se cuantificaron las
proporciones de pptidos rendimiento en rangos de referencia relativamente
amplias. Daniel y sus colaboradores revelaron fuerte concordancia entre los niveles
de HbA2 y delta / beta-ratios basado en T2, T3i y fragmentos de pptido T13
[9]. Boemer et al. los recin nacidos identificados con talasemia mayor - por este

mtodo utilizando el (T1b1) / (T12b2) ratio [15], mientras que la fosa et

al. discriminado en sujetos normales de los recin nacidos con -talasemia mayor /
intermedia por una baja (T1y4) / (T2y6) y altas relaciones de (T2y6) / (T2y6)
en muestras de sangre de papel [13].
En contraste con la deteccin de la talasemia, se encontraron desviada alpha / ratios para los pacientes con variantes de hemoglobina. La incorporacin de un
aminocido diferente provoca un desplazamiento de masa del pico de
globulina; por ejemplo, en caso de HbS, la -globulina es menos abundante debido
a la presencia de betaS y / -ratios ms altos que el lmite superior de referencia se
encuentran. Un requisito previo para este algoritmo es la diferenciacin entre la
masa propia de tipo salvaje y mutante globulina, que es alcanzable por arriba hacia
abajo MS como se presenta aqu. En primer lugar, la masa-reproducibilidad se
consigue por dentro de adquisicin de correcciones de masas utilizando
LockSpray; cada 10 s, un estndar leucina-encefalina en 556,2771 Da corrige el
espectro de masa cruda hacia precisiones en masa dentro de 0,8 ppm. Despus de
deconvolucin adecuada y el centrado de pico, esto proporciona picos de masa con
1- rangos de masa percentil 99 de 0,20 Da para ambos alfa y beta globulinas. En
segundo lugar, estos picos deconvoluted cuentan con una anchura de pico a la
mitad de la abundancia matemtica mximo de 1 Da. Por lo tanto, la
superposicin de pico no es un problema para las mutaciones de globulina que dan
cuenta de diferencias de masa N2 Da como HbS y HbF que se detectan sin
rodeos. Diferencias de masa b2 Da, sin embargo, la superposicin con la globulina regular y el pico de masa adyacente induce un hombro. En este caso, el
centrado pico genera una masa media, que se encuentra fuera del rango de
referencia para la -masa. Nuestros ejemplos de pacientes con HBC HbE (ambos -1
Da diferencia de masa con respecto a la -globulina) revelaron que su masa media
globulina fue aparentemente desviada; incluso en presencia de 65%
HbA1. Desviaciones de masas hacia abajo a 1 Da pueden resolverse despus de
pico centrado en el A - 1 Da de dominio, incluso si el paciente sufre de un
trastorno heterocigtico.
De arriba hacia abajo MS permite la deteccin rpida a travs de la cuantificacin
por el / - relacin y calificacin de la -masa. En contraste con la deteccin,
nuestro enfoque no permite la identificacin inequvoca de variantes de
hemoglobina. En primer lugar, ya que mltiples mutaciones se basan en las
sustituciones de aminocidos idnticos en diferentes sitios, la masa media de la
protena intacta no es variante especfica. En segundo lugar, la identificacin es
restringida por discrepancias sub-Dalton entre la masa medida y la masa calculada
debido a las diferentes distribuciones isotpicas asignados por diferentes
algoritmos. Con el nivel establecido de viabilidad, una expansin cohorte est en
marcha para otros fines de validacin. Esto conlleva los pacientes con talasemia
mayor, en la que el / -relacin de puede ser un marcador aplicable y otras
variantes de hemoglobina clnicamente relevantes tales como Oarab, DPunjab y
Lepore. En vista de la evaluacin del recin nacido, la transformacin de las
muestras fetales permite la verificacin de este mtodo de diagnstico que incluye
los procedimientos que afecten a las manchas de sangre en papel preanalticos.Paralelamente a la expansin de cohorte, el proceso de cuantificacin se
est optimizando por ESI, por este medio destinado a / -ratios ms reproducibles y
uniformes en sujetos sanos de ajuste. Por ltimo, consideraciones tcnicas estn
bajo investigacin por un mtodo de confirmacin que permite la identificacin de
variantes de globulina.

El anlisis de grandes molculas mediante espectrometra de masas se explor

clnicamente mediante cribado hemoglobina paralelo en un laboratorio clnico
basado en la rutina. Adquisiciones rpidas con un tiempo de ejecucin en el orden
de un minuto estn asegurados por la omisin de factores pre-analticos, tales
como la digestin de protenas y cromatografa. Intervalos de referencia derivados
de una relativamente pequea cohorte de controles negativos con xito se han
aplicado en pacientes con una variante de hemoglobina. En nuestra cohorte
relativamente pequea, variantes de la hemoglobina con desviaciones en masa de
hasta 1 Da puede resolverse; incluso si el paciente sufre de un trastorno
heterocigtico, la masa media se encuentra fuera del intervalo de referencia
establecido para la masa globulina. Adems, desviada alfa / -ratios se encuentran
en estos pacientes. De acuerdo con ello, todas las variantes de hemoglobina
mediante un anlisis, basado en la rutina han sido detectados por la deteccin
rpida de la masa media -globulina y la posterior determinacin de -relacin / .

Cmo funciona la espectrometra de masas?

La espectrometra de masas es una prueba de identificacin molecular rpida y que requiere pequeas cantidades de la
muestra para aportar informacin acerca de la estructura, masa molecular y formula molecular de un compuesto.

Los iones moleculares producidos por el espectrmetro y el patrn de iones de fragmentos registrados son nicos en
cada compuesto y se configuran como una huella dactilar para diferenciar e identificar compuestos y molculas.

Objetivos del artculo.

Algunas variantes de hemoglobina y los trastornos relacionados con la talasemia son clnicamente relevantes y que
coexisten con regularidad. Por lo tanto el anlisis de las hemoglobinopatas es de vital importancia en el mbito de la
salud y por ello dichos anlisis se incluye en los programas de deteccin para recin nacidos; mientras que muchos
laboratorios clnicos ofrecen combinaciones de pruebas de ADN -talasemia y la cromatografa lquida de alta presin
(HPLC) o la electroforesis capilar de zona para beta-talasemia y la hemoglobina variantes. En este ltimo escenario, los
anlisis de rutina se realizan para los pacientes diagnosticados con una aparicin tarda de los sntomas. Por lo que el
objetivo de la investigacin es explorar una aproximacin diagnstica alternativa mediante espectrometra de
masas(MS).

Como se us la espectrometra
Mediante el anlisis de inyeccin de flujo y despus de del anlisis espectral, la relacin de intensidad de la - y subunidad, as como su masa especfica se usaron como parmetros de deteccin. Deducimos las distribuciones de
masas de la - y de cadena y la relacin / - de una poblacin que comprende de los adultos libres de la enfermedad
que sirven como referencia.

Resultados obtenidos
La relacin alfa/beta es un marcador pobre para los pacientes con talasemia, pero sirve en los pacientes con una
variante de hemoglobina. se encontraron desviaciones entre la relacin alpha/beta para los pacientes con variantes de
hemoglobina. La incorporacin de un aminocido diferente provoca un desplazamiento de masa del pico de globulina;
por ejemplo, en caso de HbS, la -globulina es menos abundante

Conclusiones
A pesar de que no se detectaron pacientes con talasemia leve, todos los pacientes con una variante de hemoglobina se
resolvieron por espectrometra de masas utilizando la masa media globulina y la -relacin / como parmetros de
seleccin