Mtodos Espectroscpicos

Aplicacin al anlisis farmacutico

Mtodos espectroscpicos
Todo mtodo analtico que utilice alguna regin del espectro
electromagntico con fines cualitativos (identificacin y elucidacin
de estructuras qumicas) o cuantitativos
Longitud de onda

Tipo de radiacin

Tipos de transicin

0,005 1,4

Rayos gamma

Nuclear

0,1 - 100

Rayos X

Electrones internos

10 - 180 nm

UV lejano (en vaco)

180 400 nm

Ultravioleta

400 - 780 nm

Visible

0,78 2,5 m

IR cercano (NIR)

2,5 50 m

IR medio (MIR o Mid-IR)

50 - 1000 m

IR lejano

1 10 mm

Microondas

Rotaciones

1 10 cm

Radiofrecuencia (RMN)

Inversin de spin

Electrones externos

Electrones externos
Vibraciones

Mtodos espectroscpicos
Todo mtodo analtico que utilice alguna regin del espectro
electromagntico con fines cualitativos (identificacin y elucidacin
de estructuras qumicas) o cuantitativos
Longitud de onda

Tipo de radiacin

Tipos de transicin

0,005 1,4

Rayos gamma

Nuclear

0,1 - 100

Rayos X

Electrones internos

10 - 180 nm

UV lejano (en vaco)

180 400 nm

Ultravioleta

400 - 780 nm

Visible

0,78 2,5 m

IR cercano (NIR)

2,5 50 m

IR medio (MIR o Mid-IR)

50 - 1000 m

IR lejano

1 10 mm

Microondas

Rotaciones

1 10 cm

Radiofrecuencia (RMN)

Inversin de spin

Electrones externos

Electrones externos
Vibraciones

Mtodos espectroscpicos
A veces tambin se incluyen tcnicas que utilizan otra radiacin (no
EM). Ejemplos: iones (e. de masa), electrones (e. de electrones),
sonido (e. acstica).

Adems de la clasificacin en funcin de la longitud de onda, estos

mtodos tambin se pueden clasificar segn el tipo de interaccin
radiacin-materia:
# Mtodos de Absorcin: se mide la disminucin de energa de la
radiacin que atraviesa una muestra. Puede ser atmica (e. de
absorcin atmica) o molecular (e. UV-Visible e IR)
# Mtodos de Emisin: se mide la radiacin emitida por la materia
luego de excitacin trmica y/o elctrica. Puede ser atmica (e.
de emisin atmica, e. de fluorescencia atmica) o molecular (e.
de fluorescencia, e. Raman)

Qu es la luz?

FrequencyAnimation
de Sbyrnes321 Trabajo propio.
Disponible bajo la
licencia Dominio
pblico va Wikimedia
Commons -

La luz es un campo electromagntico caracterizado

por una frecuencia , velocidad c y longitud de onda
, de acuerdo a las siguientes expresiones:

E = hn

n=c/l

Interaccin materiaradiacin
CUANDO LA RADIACIN INCIDE SOBRE LA MATERIA, PUEDE HABER:

Reflexin
Difraccin
Absorcin
Abs + emisin (fluorescencia)
Reac. Fotoqumica, ETC.

En particular, tanto en las tcnicas de UV como IR interesa la absorcin transferencia

de energa cuantizada desde la radiacin hacia las molculas. Dicha energa va a
interferir con los niveles cuantizados de energa molecular causando una perturbacin.

= + +

La energa potencial de una molcula est compuesta

por la suma de su energa electrnica, vibracional y
rotacional (Ee > Evib > Erot)

La energa rotacional es debida al movimiento de rotacin de la molcula respecto a su

centro de masas.
La energa vibracional es debida a la oscilacin de los tomos respecto a su posicin
de equilibrio.
La energa electrnica es debida a los diferentes estados electrnicos de la molcula
(soluciones de la ecuacin de Schrdinger electrnica en la geometra de equilibrio).

El concepto de absorbancia
Experimentalmente, la absorbancia es el log de la inversa de la transmitancia:
A = log(1/T) = log (I0 / I)
Luz de
intensidad I0

Luz de
intensidad I

Cuando la coincide con la energa requerida para una transicin,

se produce un evento de absorcin, y por lo tanto I < I0
Es decir, la de absorcin depende de la estructura qumica de la
molcula

De qu depende la absorbancia, es decir, la intensidad de la

absorcin?

Transmitancia

Transmitancia y camino ptico:

la ley de Bouguer-Lambert

Camino ptico

T I / I0 e

k b

Transmitancia

Transmitancia y concentracin:
la ley de Beer

Concentracin

T I / I 0 e k C

Absorbancia

La ley de Lambert-Beer

Concentracin

A logT logI / I 0 logI 0 / I b c

La constante de proporcionalidad (absortividad) es independiente de la
concentracin, paso de luz e intensidad de la radiacin.

Absortividad
Depende de la temperatura, disolvente, estructura molecular y longitud de
onda (l) de la radiacin. Posibles denominaciones (segn las unidades de c):
Absortividad (a): es la absorbancia de una solucin cuya concentracin
es de 1 g/L, medida en una celda de paso ptico b = 1 cm.

A
a
cb

1%

Absortividad especfica ( A1cm ): es la absorbancia de una solucin

cuya concentracin es de 1%, medida en una celda de
%
A11cm
paso ptico b = 1 cm.

10a
cb

Absortividad molar (): es la absorbancia de una solucin cuya concentracin es 1 M,

medida en una celda de paso ptico b = 1 cm. Puede calcularse
como el producto de la absortividad por el PM del analito:
a PM
%
Los valores de a, A11cm
y , a una longitud de onda especfica, temperatura
y solvente determinado, son caractersticos del analito.

Error en la medida de Abs

La escala de T% va de 0 a 100. Si un equipo tiene un T
(error absoluto constante en la medida) mximo de 0,005,
se tiene que:
=

=
2,303

= 2,303 =

2,303

0,434

=
= (%)

Se trabaja en el rango
0,2 0,8 de absorbancia
para tener ER% < 2% en
la concentracin*

* Equipos con menor T admitiran mayores rangos

de trabajo para para ER% < 2% en la concentracin

Adimensionales
T

ER%

0,95

0,022

10,2%

0,90

0,046

5,3%

0,80

0,097

2,8%

0,70

0,155

2,00%

0,60

0,222

1,60%

0,50

0,301

1,40%

0,40

0,398

1,36%

0,30

0,523

1,38%

0,20

0,699

1,55%

0,15

0,824

1,76%

0,10

2,17%

0,03

1,523

4,75%

0,02

1,699

6,39%

Espectroscopa IR

Rango

IR lejano

IR medio

IR cercano

Long. de onda

50 1000 m

2,5 50 m

0,8 2,5 m

Nmero de onda

200 10 cm-1

4000 200 cm-1

12500 4000 cm-1

0,025 0,0012 eV

0,5 0,025 eV

1,55 0,5 eV

Energa

La regin del IR medio (MIR o Mid-IR) es la ms usada para confirmacin

estructural (identificacin). La zona de IR cercano (NIR analysis o NIRA) es cada
vez ms empleada en control de calidad a nivel industrial.

Ejemplo: el HCl en estado gaseoso presenta una mximo de absorcin alrededor

de 2900 cm-1, correspondiente a la transicin entre el estado vibracional basal
(V0) y el primer estado excitado (V1). Como los estados vibracionales se
encuentran equi-espaciados, si ocurrieran transiciones de orden mayor (V1 V2,
V2 V3) la energa de transicin sera la misma*.

h
H

Cl

* La mecnica cuntica no permite transiciones de 2 o 3 niveles (ej. V0V2), aunque stas pueden ocurrir levemente y dan origen a los espectros NIR.

Energa potencial

E*
V*4
V*3
V*2
V*1
V*0
E1 = E3 = E4

E0

%T
100

50

V4
V3
V2
V1

V0

Distancia (r)

H r H

4000

Nmero de onda (cm-1)

3000
2000 1500

500

Se distinguen dos zonas:

Tensiones simples: zona de grupos funcionales, 1500 - 4000 cm-1

Vibraciones complejas (de la molcula completa): zona de huellas dactilares,
500 - 1500 cm-1

Modos de vibracin

Long. de onda (m)

Frecuencias
de tensiones
Frecuencias
de flexiones

Tensiones

Flexiones
Aleteo

Simtrica

Asimtrica

Balanceo

Cabeceo

Torsin

 Para que la componente elctrica de la radiacin EM pueda interactuar

con un enlace, ste debe tener momento dipolar 0. Es decir, molculas
simtricas tales como O2 y N2 no absorben al IR.
De la misma manera, no todas las vibraciones sern activas al IR, sino
solamente aquellas que produzcan un cambio en el momento dipolar
durante la vibracin.
La mayora de las molculas orgnicas poseen muchos centros de
asimetra, por lo que an en molculas simples y/o pequeas los modos
de vibracin son complejos (es decir, se observan muchas bandas de
absorcin).
Cada banda del espectro corresponde a un movimiento de vibracin de
un enlace en concreto dentro de la molcula.

A excepcin de dos enantimeros, no hay dos molculas que tengan

exactamente el mismo espectro IR.

>> Anlisis cualitativo y elucidacin estructural

Anlisis cualitativo y elucidacin estructural

La intensidad de una banda de absorcin es determinada por el momento
dipolar (por lo que depende indirectamente de la electronegatividad de los
tomos involucrados). Ejemplo:
C-O > C-Cl > C-N > C-C-OH > C-C-H
La posicin de una banda de absorcin est determinada por la energa
requerida para dicha transicin. Imaginando a la molcula como constituida
por tomos unidos por enlaces que actan como resortes, se puede aplicar la
Ley de Hooke para llegar a:

El evento de absorcin se da cuando la E de la

radiacin (h) coincide con la vibracin, es decir:

K es la constante elstica del resorte (el enlace, en este caso) y es

la masa reducida.
Por lo tanto, la de abs depende la fuerza del enlace y las masas
de los tomos involucrados. Ejemplo:

1 2
1 + 2

O-H > N-H > C-H > CN > CC > C=O > C=C > C-O > C-C > C-F > C-Cl

Instrumentacin
1. Equipos por dispersin
Muestra

Tambin pueden ser de simle haz (previa correccin por el

blanco). La salida es el registro de la %T (Mta/Ref) vs.
nmero de onda
Detector

Fuente

Ref (aire o SV)

Red de
difraccin
+ rendijas

Espectro IR

Fuente: se utilizan filamentos calentados elctricamente a temp. de 1500-2000 K que

producen una radiacin continua del tipo de cuerpo negro Pueden ser de xidos
metlicos, como xido de circonio, itrio y torio, o tambin carburo de Si.
Muestra: diferentes tipos de celda segn la muestra
Detector: como la luz IR es poco energtica para los detectores fotovoltaicos comunes
(empleados en UV), se suele aprovecha su efecto trmico termocuplas

Espejo fijo

Instrumentacin
2. FT-IR

Haz
parcial

Los equipos de IR por transformada de

Fuente
Fourier (FT-IR) poseen un interfermetro
Divisor del
haz
en lugar del monocromador. El haz es
dividido por un espejo semitransparente y los
dos haces resultantes se reflejan en sendos
Muestra
espejos, uno fijo y otro mvil.
Al mover este ltimo, se logra que el haz recombinado
posea determinadas frecuencias (interferencia selectiva).
Es as como se obtiene un interferograma (en coordenadas
de tiempo), el cual es transformado mediante FT para extraer
el espectro (en coordenadas de frecuencia).

Haz parcial
retrasado

Haz
recombinado

Espejo
mvil

Detector

Ventajas:
1.
2.
3.
4.

Mejor relacin seal/ruido ya que la luz no debe pasar por un monocromador.

Se miden todas las frecuencias a la vez rapidez (1 s vs. 2-3 min del dispersivo)
Puede tener una resolucin de menos de 0.01 cm-1
Los espectros pasan necesariamente por una computadora lo que facilita el
anlisis y manejo espectral

Calibracin del equipo (*)

Resolucin
Registrar el espectro de una pelcula de poliestireno
de 35 m de espesor.
En instrumentos con monocromador, se debe
verificar que:
La diferencia entre el mximo de %T en el pto. A
(2870 cm-1 o 3,48 m) y el mnimo de %T en el pto.
B (2849,5 cm-1 o 3,51 m) debe ser 18.

La diferencia entre el mximo de %T en el pto. C

(1589 cm-1 o 6,29 m) y el mnimo de %T en el pto.
D (1583 cm-1 o 6,32 m) debe ser 10.
En FT-IR, seleccionar una resolucin adecuada con
una atenuacin apropiada segn indicacin del
fabricante. Luego, el punto 1 debe dar 0,33, y el
punto 2 0,08.
* Acorde a BP 2013 y Farmacopea Mercosur

Calibracin del equipo (*)

Verificacin de la escala de longitud de onda
La escala de longitud de onda puede verificarse empleando una pelcula de
poliestireno, el cual debe presentar los mnimos de transmisin (mximos de
absorcin) a los siguientes nmeros de onda (en cm-1):
Mnimos de
transmisin (cm-1)

Tolerancias (cm-1)
Monocromador
FT-IR

3060,0

1,5

1,0

2849,5

2,0

1,0

1942,9

1,5

1,0

1601,2

1,0

1,0

1583,0

1,0

1,0

1154,5

1,0

1,0

1028,3

1,0

1,0

* Acorde a BP 2013 y Farmacopea Mercosur

Preparacin de muestra
En fase slida
Pastillas de KBr (o KCl, para sales HCl): se pulveriza la muestra con KBr (seco y de alta
pureza) en un mortero de gata (en una relacin cercana al 1%), y luego alrededor de
200 mg del pulverizado se comprime por aplicacin de alta presin (aprox. 800 kPa)
para generar un disco de 10-15 mm de dimetro. Mtodo ms usado por farmacopeas.
Varios factores, tales como una molienda inadecuada, humedad e impurezas en el
haluro pueden dar origen a discos no aptos para el anlisis. El disco debe desecharse
si no es visualmente uniforme, o si la %T a 2000 cm-1 (en ausencia de una banda de
absorcin especfica) es < 60% sin emplear compensacin en el haz de referencia.
La ventaja de este mtodo es que el KBr no absorbe por encima de 400 cm-1

Suspensiones: se coloca la muestra (5-20 mg) en mortero de gata, se pulveriza

hasta polvo fino y se aaden 1 - 2 gotas de parafina lquida (nujol, aporta bandas a
3000 y 1400-1500 cm-1) o fluorolube (CClF=CF2, til a partir de 1370 cm-1) hasta
formar una pasta, la cual se observa una vez ubicada entre dos discos de NaCl o KCl.
Procedimiento til para el estudio de sales (ya que con KBr podra haber intercambio
de iones), polimorfos y pseudopolimorfos (hidratos).
Films polimricos: ciertas muestras, tales como los polmeros que se usan como
material de envase, se observan directamente como films delgados preparados por
compresin y moldeado en caliente o corte con micrtomo.

Preparacin de muestra
En fase slida
Pastillas de KBr (o KCl, para sales HCl): se pulveriza la muestra con KBr (seco y de alta
pureza) en un mortero de gata (en una relacin cercana al 1%), y luego alrededor de
200 mg del pulverizado se comprime por aplicacin de alta presin (aprox. 800 kPa)
para generar un disco de 10-15 mm de dimetro. Mtodo ms usado por farmacopeas.
Varios factores, tales como una molienda inadecuada, humedad e impurezas en el
haluro pueden dar origen a discos no aptos para el anlisis. El disco debe desecharse
si no es visualmente uniforme, o si la %T a 2000 cm-1 (en ausencia de una banda de
absorcin especfica) es < 60% sin emplear compensacin en el haz de referencia.
La ventaja de este mtodo es que el KBr no absorbe por encima de 400 cm-1

Suspensiones: se coloca la muestra (5-20 mg) en mortero de gata, se pulveriza

hasta polvo fino y se aaden 1 - 2 gotas de parafina lquida (nujol, aporta bandas a
3000 y 1400-1500 cm-1) o fluorolube (CClF=CF2, til a partir de 1370 cm-1) hasta
formar una pasta, la cual se observa una vez ubicada entre dos discos de NaCl o KCl.
Procedimiento til para el estudio de sales (ya que con KBr podra haber intercambio
de iones), polimorfos y pseudopolimorfos (hidratos).
Films polimricos: ciertas muestras, tales como los polmeros que se usan como
material de envase, se observan directamente como films delgados preparados por
compresin y moldeado en caliente o corte con micrtomo.

Preparacin de muestra
En fase lquida
Lquidos puros: los lquidos viscosos y no voltiles se analizan ubicados entre dos discos de KBr
(o KCl), sin burbujas y cubriendo todo el dimetro de los discos. Para lquidos de baja viscosidad,
existen celdas especiales (paso ptico 0,1 0,5 mm) en las que se colocan unas gotas entre dos
discos de NaCl o KCl.

Soluciones: suelen ser al 1 10%, en solventes transparentes al IR (CHCl3, CCl4, CS2 ). Se

emplean las mismas celdas del caso anterior. La absorcin debida al solvente puede
compensarse colocando el solvente puro en la celda de referencia; sin embargo, aquellas
regiones del espectro en las que el solvente presenta una fuerte absorcin no deben tenerse en
cuenta.

En fase gaseosa
Se emplean celdas especiales para gases (cilindro de vidrio o acero con ventanitas en los
extremos de NaCl o KCl), las cuales se llenan con la muestra, y si fuera necesario se ajusta la
presin con un gas transparente al IR (cules podran ser?).
Los espectos en fase gaseosa se modifican mucho si vara la P y/o la T.
Para evitar interferencias de absorcin debido al vapor de agua, CO2 u otros gases atmosfricos,
colocar en el haz de referencia una celda idntica (vaca o con un gas trasparente).

Preparacin de muestra
En fase lquida
Lquidos puros: los lquidos viscosos y no voltiles se analizan ubicados entre dos discos de KBr
(o KCl), sin burbujas y cubriendo todo el dimetro de los discos. Para lquidos de baja viscosidad,
existen celdas especiales (paso ptico 0,1 0,5 mm) en las que se colocan unas gotas entre dos
discos de NaCl o KCl.

Soluciones: suelen ser al 1 10%, en solventes transparentes al IR (CHCl3, CCl4, CS2 ). Se

emplean las mismas celdas del caso anterior. La absorcin debida al solvente puede
compensarse colocando el solvente puro en la celda de referencia; sin embargo, aquellas
regiones del espectro en las que el solvente presenta una fuerte absorcin no deben tenerse en
cuenta.
Ventana (NaCl,
En fase
gaseosa
Sello
KCl, CaF ) Espaciador

Ventana (NaCl, Sello

KCl, CaF2)
Se emplean celdas especiales para gases (cilindro de
vidrio o acero con ventanitas en los
extremos de NaCl o KCl), las cuales se llenan con la muestra, y si fuera necesario se ajusta la
presin con un gas transparente al IR (cules podran ser?).
2

Los espectos en fase gaseosa se modifican mucho si vara la P y/o la T.

Para evitar interferencias de absorcin debido al vapor de agua, CO2 u otros gases atmosfricos,
colocar en el haz de referencia una celda idntica (vaca o con un gas trasparente).

Otras tcnicas de preparacin de muestra

Reflectancia difusa (DR, DRIFTS*)
Cuando la radiacin IR incide sobre una superficie
rugosa, parte es absorbida y parte reflejada en
forma difusa (en todas direcciones). Si se recoge
la radiacin reflejada adecuadamente (espejos
curvos), sta llega al detector el cual revela el %T
(y por lo tanto, la luz absorbida) por la muestra.
Ventajas:
- Mnima preparacin de muestra (se diluye la
muestra con 90 99% de KBr o KCl y se coloca en un accesorio adecuado)
- No requiere compresin (apto polimorfos)
- Puede emplearse para analizar films y materiales de cobertura si stos se colocan
sobre un fondo reflectante.
A diferencia de la espectroscopa de absorcin IR, en la que hay una relacin lineal (abs vs. conc, que viene
dada por la ley de Beer), en DR esto no ocurre. Por lo tanto, el anlisis cuantitativo por esta tcnica no es
sencillo, si bien puede emplearse una funcin emprica derivada por Kubelka y Munk que transforma los
espectros de reflectancia en espectros semejantes a los de absorbancia clsicos
* Diffuse Reflectance Infrared Fourier Transform Spectroscopy

Otras tcnicas de preparacin de muestra

Reflectancia total atenuada (ATR)
Cuando la radiacin pasa a travs de un medio de alto ndice de
refraccin n1 (IRE, internal reflection element), con un ngulo de
incidencia mayor al ngulo crtico, es internamente reflejada en
su totalidad por una interfaz en contacto con un material de menor
ndice de refraccin n2 (la muestra). El ngulo crtico viene dado por n1/n2.

IRE

En la celda de referencia se coloca slo el IRE (el cual suele ser seleniato de Zn, diamante,
germanio, bromuro de talio-ioduro de talio) o el IRE + matriz blanco.
En la celda de lectura se coloca la muestra en ntimo contacto con el IRE
-

Muestras slidas: se coloca la muestra sobre el IRE, con o sin presin aplicada.

Soluciones: disolver la muestra en un sv adecuado, cubrir el IRE con la solucin y evaporar

hasta sequedad.

Ventaja: nico mtodo de preparacin de muestra que admite el anlisis de cremas, geles, etc.
Permite el estudio tanto de la matriz como de las interacciones con la droga.

Reflectancia
mltiple

Ensayo de Identificacin por IR USP 39

El espectro IR de una sustancia, comparado con el de su correspondiente SR
obtenido en forma concomitante, provee quizs la evidencia ms concluyente
sobre la identidad de la sustancia que puede obtenerse con un nico test (el
espectro UV, en cambio, no posee un elevado grado de especificidad).
La muestra, previamente secada, debe prepararse segn lo indique la
monografa individual, y luego obtener su espectro y el de una SR tratada igual
en el rango 650 3800 cm-1. Los mximos de absorcin deben ser
coincidentes.
La existencia de diferencias puede deberse a la existencia de polimorfos, lo que
no siempre es aceptable. A menos que se indique algo diferente en la
monografa individual, si se observan diferencias se recomienda disolver la
misma cantidad de muestra y de SR en iguales volmenes de un solvente
adecuado, evaporar la solucin a sequedad en recipientes similares bajo
condiciones idnticas y repetir el ensayo sobre los residuos.
Cuando un mtodo por IR se va a utilizar como alternativa a un procedimiento oficial, el mismo debe ser
validado en trminos de su especificidad (nico parmetro para mtodos cuyo objetivo es la identificacin) o
en trminos de exactitud, precisin, especificidad, lmite de cuantificacin, linealidad, rango y robustez
(mtodos con fines cuantitativos)

Ensayo de Identificacin por IR BP 2013

Por comparacin con SR: preparar la muestra y la SR empleando el mismo
procedimiento, registrar el espectro entre 4000 y 650 cm-1 y compararlos. La
posicin y tamao relativo de las bandas debe ser coincidente.
Si se observan diferencias, tratar la muestra y la SR de tal manera que ambas
cristalicen o se produzcan de la misma manera.

Por comparacin con espectros de referencia: en un equipo recin calibrado,

preparar la muestra siguiendo las instrucciones que acompaan al espectro de
referencia. Trazar el espectro en las mismas condiciones operativas, y verificar que
la posicin y tamao relativo de las bandas sean coincidentes entre ambos
espectros. Ejemplo:
Acenocumarol (BP 2013)
Identificacin. El espectro de absorcin IR, Apndice II A, es concordante con el
espectro de referencia de acenocumarol (RS 001). Si los espectros no son
concordantes, disolver 0,1 g de la sustancia que se examin en 10 ml de acetona y
aadir agua gota a gota hasta que la solucin se vuelva turbia. Calentar en un bao
de agua hasta que se clarifique y dejar reposar. Filtrar, lavar los cristales con una
mezcla de volmenes iguales de acetona y agua y secar a 100 C a una presin de 2
kPa durante 30 minutos. Volver a registrar el espectro de residuo.

Ensayo de Identificacin por IR BP 2013

Por comparacin con SR: preparar la muestra y la SR empleando el mismo
procedimiento, registrar el espectro entre 4000 y 650 cm-1 y compararlos. La
posicin y tamao relativo de las bandas debe ser coincidente.
Si se observan diferencias, tratar la muestra y la SR de tal manera que ambas
cristalicen o se produzcan de la misma manera.

Por comparacin con espectros de referencia: en un equipo recin calibrado,

preparar la muestra siguiendo las instrucciones que acompaan al espectro de
referencia. Trazar el espectro en las mismas condiciones operativas, y verificar que
la posicin y tamao relativo de las bandas sean coincidentes entre ambos
espectros. Ejemplo:
Acenocumarol (BP 2013)
Identificacin. El espectro de absorcin IR, Apndice II A, es concordante con el
espectro de referencia de acenocumarol (RS 001). Si los espectros no son
concordantes, disolver 0,1 g de la sustancia que se examin en 10 ml de acetona y
aadir agua gota a gota hasta que la solucin se vuelva turbia. Calentar en un bao
de agua hasta que se clarifique y dejar reposar. Filtrar, lavar los cristales con una
mezcla de volmenes iguales de acetona y agua y secar a 100 C a una presin de 2
kPa durante 30 minutos. Volver a registrar el espectro de residuo.

Espectroscopa UV-Visible

Interaccin materiaradiacin
CUANDO LA RADIACIN INCIDE SOBRE LA MATERIA, PUEDE HABER:

Reflexin
Difraccin
Absorcin
Abs + emisin (fluorescencia)
Reac. Fotoqumica, ETC.

En particular, tanto en las tcnicas de UV como IR interesa la absorcin transferencia

de energa cuantizada desde la radiacin hacia las molculas. Dicha energa va a
interferir con los niveles cuantizados de energa molecular causando una perturbacin.

= + +

La energa potencial de una molcula est compuesta

por la suma de su energa electrnica, vibracional y
rotacional (Ee > Evib > Erot)

La energa electrnica es debida a los diferentes estados electrnicas de la molcula

(soluciones de la ecuacin de Schrdinger electrnica en la geometra de equilibrio).

La energa de la radiacin en la zona del UV-Visible es < 7 eV, por lo que slo
es suficiente para interactuar con los electrones menos energticos, es decir,
los ms lejanos al ncleo (tomos) o los de los enlaces (molculas).

E1
E2

V*4
V*3
V*2
V*1
V*0
E3 E4
E5

V0

Absorbancia

Energa potencial

E*

Este esquema corresponde a una

transicin electrnica. Si se pudiera
producir otra, aparece otra banda.

E
0

Distancia (r)

H r H

E5

E4

E3 E2

E1

Longitud de onda ()

Al incidir luz UV sobre molculas en solucin, se producen

transiciones electrnicas desde el estado fundamental a uno de
varios estados vibracionales diferentes correspondientes al estado
electrnico excitado (V0 Vi*)

Transiciones electrnicas observadas

# Aunque el espectro UV se extiende por debajo de 100 nm
(alta energa), el oxgeno en la atmsfera no es
transparente por debajo de 200 nm
# Se requieren equipos especiales para trabajar en la zona
de UV lejano (de alto vaco)
# Los espectros de compuestos orgnicos se suelen
registrar en el rango 200-700 nm, equivalente a 6,9
1,7 eV.
# Esta energa limita las transiciones que se pueden
observar a las siguientes (en general, *):

 Es *, pero no se llega a ver

La conjugacin estabiliza el sistema

Es *, pero no se llega a ver

Es n*, de menor energa pero
prohibida

Las transiciones
prohibidas poseen
mx < 100.
Son aquellas con
muy baja
probabilidad de
ocurrir

El espectro de absorcin
Es la representacin grfica del comportamiento de absorcin de la
sustancia en cuestin, en funcin de la longitud de onda ().
Por lo tanto, en el eje x del espectro se representa la longitud de onda (200350 nm para UV, 200-700 para las determinaciones UV-VIS), mientras que
en el eje Y se grafica la absorbancia de la muestra a cada una de las .

NH2

lmax =
O

206 nm
252
317
376

Espectrofotmetro de un haz

Las muestras se miden en solucin

se fija el cero de seal con la cubeta llena de solvente (sin muestra)

Espectrofotmetro convencional
# Se requieren dos fuentes para cubrir todo el espectro UV-VIS:
# Lmpara de deuterio - cubre el UV (200-350 nm)
# Lmpara de tungsteno - cubre el visible (350-700 nm)
# Las lmparas irradian toda la banda de la radiacin UV o luz visible, el
monocromador (red o prisma) separa dicha luz en sus diferentes
componentes (longitudes de onda)

# El detector mide la diferencia entre la luz transmitida a travs de la

muestra (I) vs. la luz incidente (I0) y enva esta informacin al registrador
# Las celdas pueden ser de cuarzo (todo el rango), plstico o vidrio (slo
para el visible)
# Calibracin del equipo ver Anexo I de la Gua de Problemas

Solventes empleados
#
#
#

Los solventes deben ser transparentes en la regin de trabajo; la

longitud de onda a la cual un disolvente ya no es transparente se
conoce como el punto de corte
Debido a que los espectros no se obtienen ms all de 200 nm, los
solventes adecuados sern aquellos que carezcan de grupos
carbonilos o sistemas p conjugados
Solventes ms utilizados y puntos de corte:
Acetonitrilo
Cloroformo
Ciclohexano
1,4-Dioxano
Etanol 95%
n-Hexano
Metanol
Isooctano
Agua

190
240
195
215
205
201
205
195
190

Espectroscopa derivativa
# Un espectro puede expresarse como una funcin A=f(), la cual
puede derivarse para obtener:
Orden cero
Primer orden
Segundo orden

A = f(l)
dA/dl = f(l)
d2A/dl2 = f(l)

A = bC
dA/dl = (d/dl)bC
d2A/dl2 = (d2/dl2)bC

El espectro derivado es la representacin de esas derivadas en funcin de

# Contiene picos ms agudos, por lo que se consigue una mejor

ubicacin de los picos mximos y mejor capacidad de
identificacin de especies absorbentes en una muestra
# A medida que el orden de la derivada aumenta, el ruido aumenta
tambin lo hace (disminuye la seal)
# Principales aplicaciones: anlisis cualitativo (identificacin);
eliminacin de interferencias (ej. ruido de fondo o lnea de base);
resolucin espectral de ciertos sistemas multicomponentes.

Derivadas 1, 2, 3 y 4 de un pico con forma de gaussiana

43

Eliminacin de la absorcin de base y supresin de la deriva

empleando la derivada primera

Anlisis Cuantitativo
Se basa en la relacin entre la
absorbancia y la concentracin

Anlisis cuantitativo
A.

Un mtodo analtico por espectroscopa UV se define al fijar las

siguientes variables:
#
#
#

Medio (solvente)
Longitud de onda de trabajo
Concentracin de trabajo

B. En los mtodos farmacopeicos, esas variables ya estn fijadas.

C. De lo contrario, es necesario establecerlas:
1.
2.
3.

Seleccionar el medio (?), y preparar una solucin del analito

Trazar el espectro (si fuera necesario, diluir/concentrar hasta A en rango)
Identificar lmx y medir AM
por qu trabajamos en un mximo de absorcin?

D. Clculo de la concentracin
#
#
#

1%
Conocido el valor de A1cm
Mtodo del estndar externo (unipuntual o curva de calibracin)
Mtodo del estndar agregado (unipuntual o curva de calibracin)

Anlisis cuantitativo
Browse: British Pharmacopoeia 2013
British Pharmacopoeia Volume III
Formulated Preparations: Specific Monographs
Furosemide Tablets
Action and use: Loop diuretic.
DEFINITION Furosemide Tablets contain Furosemide.
Content of furosemide C12H11ClN2O5S 95.0 to 105.0% of the stated amount.
IDENTIFICATION
A. The light absorption in the range 220 to 320 nm of the final solution obtained in the Assay exhibits two maxima,
at 228 nm and 271 nm.
B. In the test for Related substances, the principal peak in the chromatogram obtained with solution (2) shows a
peak with the same retention time as the principal peak in the chromatogram obtained with solution (3).
TESTS
Dissolution ()
Related substances ()
ASSAY
Weigh and powder 20 tablets. Shake a quantity of the powder containing 0.2 g of Furosemide with 300 mL of 0.1 M
sodium hydroxide for 10 minutes, add sufficient 0.1 M sodium hydroxide to produce 500 mL and filter. Dilute 5 mL
to 250 mL with 0.1 M sodium hydroxide and measure the absorbance of the resulting solution at the maximum at
271 nm. Calculate the content of C12H11ClN2O5S taking 580 as the value of A(1%, 1 cm) at the maximum at 271 nm.

Muy importante: CALIBRACIN RECIENTE DEL EQUIPO

Anlisis cuantitativo

Antiparasitario
Comprimidos por 100 mg

Muestras:
10 mg/250ml DFA*5/250 Agua*1000
= 8 g/ml
Solucin estndar:
400 g/ml *5/250 de agua = 8 g/ml

Factor= 250/5*250/1000 = 12,5

Absorbancia a l mxima

Mediante una curva de calibracin

trazada con sustancia de referencia
del analito (varias soluciones
de concentracin conocida)
1.2

0.8

0.4

Concentracin

Para que lo resuelvan uds

Se prepararon soluciones de Furazolidona SR
de cuatro concentraciones diferentes, por
duplicado, y se construy la siguiente curva de
calibracin leyendo cada una por duplicado en
el espectrofotmetro:

Furazolidona
Comprimidos por 100 mg
Peso medio (N=20) = 132 mg
Peso alcuota = 130 mg

Concentracin
(g/ml)

1.

Cuntas rplicas independientes tiene este

ensayo? Cunto vale N?

2.

Crees que es una buena curva de

calibracin? Justifica tu respuesta

Determina la concentracin de la muestra

problema en los siguientes casos:

3.

i.
ii.

iii.

Estndar externo, curva de calibracin

Estndar externo, unipuntual (SR de 8 g/ml
de abs 0,56 y 0,58)

Estndar externo, unipuntual (SR de 8 g/ml

de abs 0,54 y 0,52)

12

Abs 1

Abs 2

0,13

0,15

0,18

0,16

0,31

0,28

0,26

0,28

0,56

0,58

0,54

0,52

0,85

0,86

0,83

0,82

Anlisis multicomponente
Cuando la muestra contiene ms de una especie absorbente, la
absorbancia de la solucin ser la suma de todas las absorbancias:
A = A1 + A2 + A3 + ....

Esto se debe verificar

Los diferentes constituyentes se pueden determinar si construimos

tantas ecuaciones como incgnitas tengamos (procedimiento
tedioso, sobre todo por el clculo de absortividades)
En el caso particular de que slo dos especies estn presentes, la
solucin es sencilla y consiste en la bsqueda de la absorbancia de
la solucin a dos longitudes de onda (longitud de onda mxima para
cada analito):
A1 = x,1bcx + y,1bcy
A2 = x,2bcx + y,2bcy

A1 = x,1bcx + y,1bcy

A2 = x,2bcx + y,2bcy

0.8

x,1

0.4

1.2

0.8

x,2

0.4
3

Conc. XSR

Abs a l2

1.2

Abs a l1

Abs a l2

Abs a l1

x,1; y,1; x,2; y,2 se pueden

determinar a partir de curvas de
calibracin realizadas con
sustancia de referencia de ambos
analitos, a ambas (cuatro curvas
en este ejemplo).
1.2

0.8

y,1

0.4
3

Conc. XSR

1.2

0.8

y,2

0.4
3

Conc. YSR

Conc. YSR

Anlisis multicomponente - caso particular 1

Mirando los espectros superpuestos, parece que hay una longitud
de onda donde se podra determinar a uno de los compuestos sin
interferencia del otro.

>> Problema 1

Anlisis multicomponente - caso particular 2

La formulacin posee un nico pa, pero sospechamos interferencia
de los excipientes. Al igual que en el caso anterior, mirando los
espectros superpuestos, parece que hay una longitud de onda
donde se podra determinar al pa sin interferencia.

>> Problema 2

Mtodo de los ceros cruzados

Para resolver mezclas por espectrofotometra derivativa.
Se puede aplicar si se encuentran dos longitudes de onda tal que, en algn orden de
derivada, uno de los compuestos presente un cero de Abs mientras que el otro tenga
seal, y viceversa.

Aditividad de las absorbancias

Existencia del cero cruzado

Absorbancia

Linealidad de la respuesta
Mezcla
Pa 2
Pa 1

200 nm

250 nm

300 nm

Verificar la nointeraccin de los

componentes de la
mezcla es, en
trminos prcticos,
comprobar que el
espectro de la
mezcla equivale a la
suma de los
espectros
350 nm

Mtodo de los ceros cruzados

Existencia del cero
cruzado

dA/d

Soluciones con concentracin creciente del pa

1 y concentracin fija o constante del pa 2

Espectros
dibujados! Las
derivadas no
estn calculadas

Seal del pa 2, sin

interferencias del pa 1
200 nm

242 nm
para el pa 2

350 nm

Mtodo de los ceros cruzados

Existencia del cero
cruzado

dA/d

Soluciones con concentracin creciente del pa 2

y concentracin fija o constante del pa 1

Seal del pa 1, sin

interferencias del pa 2

Espectros
dibujados! Las
derivadas no
estn calculadas

200 nm

260 nm
para el pa 1

350 nm

Absorbancia

Mtodo de los ceros cruzados

Mezcla
Pa 2
Pa 1

260 nm
para el pa 1

dA/d (260 nm)

dA/d (242 nm)

242 nm
para el pa 2

0,12

0,08

0,04

Linealidad de la respuesta

0,09

0,06

0,03

Conc. Pa 2

Conc. Pa 1