Dr. Mg Q.

F Eduardo Flores Jurez

Ctedra de Anlisis Clnicos
Departamento de Bioqumica

HELICOBACTER PYLORI IgM

Para uso diagnstico in Vitro
RESUMEN DEL PROCEDIMIENTO DEL ENSAYO:
Paso

(Temperatura ambiente 20-25 C)

Volumen

Tiempo de
Incubacin

1
2
3
4
5
6
7
8

Diluyente 1:40 = 5 l / 200 l

Muestras diluidas, controles y calibrador
Buffer de lavado (3 veces)
Enzima conjugada
Buffer de lavado (3 veces)
TMB Substrato cromognico
Solucion de paro
Lectura a 450 nm

100 l
350 l
100 l
350 l
100 l
100 l

30 minutos
30 minutos
30 minutos

NOMBRE Y USO DESTINADO

El diagnostico de IgM Helicobacter pylori por el mtodo de ELISA automatizado, est
destinado para utilizarse en la evaluacin serolgica del estado de infeccin por H.
pylori en pacientes con sntomas gastrointestinales.
RESUMEN Y EXPLICACION DE LA PRUEBA
Helicobacter pylori es una bacteria espiral que se cultiv desde la mucosa gstrica
humana por Marshall in 1982. Los estudios han indicado que la presencia de H pylori
est asociada con una variedad de enfermedades gastrointestinales incluyendo
gastritis, lcera gstrica y duodenal, dispepsia no ulcrica, linfoma y adenocarcinoma
gstrico. El organismo est presente en el 95-98% de los pacientes con lcera
duodenal y en el 60-90% de los pacientes con lceras gstricas. Los estudios tambin
han demostrado que la remocin del organismo por medio de terapia antimicrobiana
i
est correlacionada con la resolucin de los sntomas y cura de enfermedades.
Los pacientes que presentan sntomas clnicos relacionados con el tracto
gastrointestinal pueden ser diagnosticados para la infeccin H pylori por medio de dos
mtodos
1) Las tcnicas invasivas incluyen la biopsia seguida de un cultivo o examen
histolgico de biopsia o deteccin directa de actividad ureasa.
2) Las tcnicas no invasivas incluyen pruebas de aliento de urea y mtodos
serolgicos.
Todas las pruebas realizadas en muestras de biopsia estn sujetas a errores
relacionados con el muestreo e interferencia de contaminacin por bacterias.
H. Pylori IgM, el cual prueba la presencia del anticuerpo especfico IgM de H. pylori es
la tcnica de eleccin para las pruebas serolgicas por su precisin y simplicidad.

PRINCIPIO DE LA PRUEBA

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Ctedra de Anlisis Clnicos
Departamento de Bioqumica

El antgeno H. pylori purificado est cubierto sobre la superficie de los micro pozos. El
suero diluido del paciente es agregado a los pozos, y el anticuerpo especfico de H.
pylori IgM, si se encontrara presente, se adhiere al antgeno. Todos los materiales no
adheridos son lavados para su retiro. Despus de agregar el conjugado de enzima,
ste se adhiere al complejo del antgeno-anticuerpo. El exceso de conjugado de
enzima es lavado para su retiro y el substrato y cromgeno es agregado. La reaccin
cataltica del conjugado de enzima es detenida a un tiempo especfico. La intensidad
del color generado es proporcional a la cantidad de anticuerpo especfico de IgM en la
muestra. Los resultados son interpretados por un lector de micro pozos comparados
de una manera paralela con un calibrador y controles.
MATERIALES ABASTECIDOS:
1. Tiras con micropozos cubiertos de antgeno H. pylori purificados (12 x 8)
2. Solucin absorbente: Tapa Negra 1 frasco (22 ml)
3. Concentrado de Lavado 10x: Tapa Blanca 1 botella (100 ml)
4. TMB Substrato Cromognico: Botella mbar 1 frasco (15 ml)
5. Enzima conjugada; Solucin de color rojo 1 frasco (12 ml)
6. Calibrador Cut-off (Rango indicado en etiqueta); Tapa Amarilla, ndice H. pylori
M = 1.0 1 vial (150 l)
7. Control Negativo: (Rango indicado en etiqueta). Tapa Color Natural 1 vial (150
l)
8. Control Positivo: (Rango indicado en la etiqueta). Tapa Color Rojo 1 vial (150
l)
9. Solucin de Pare: 2N HCl; 1 frasco 12 ml.

ALMACENAJE Y ESTABILIDAD:
1. Almacene el equipo de prueba a 2 8 C.
2. Mantenga siempre los micro pozos sellados en una bolsa seca con desecantes. Recomendamos usar todos los micro pozos dentro de las siguientes 4
semanas despus de abierto el empaque.
3. Los reactivos son estables hasta la fecha de caducidad del equipo de prueba
4. No exponga los reactivos de prueba al calor, sol, o luz fuerte durante el
almacenaje o uso.
ADVERTENCIAS Y PRECAUCIONES:
1. Materiales bio-peligrosos potenciales:
El calibrador y los controles contienen componentes de fuente humana los cuales
han sido probados con reactivos con licencia del FDA y no se han encontrado
reactivos para el antgeno de superficie de la hepatitis B as como del anticuerpo
VIH. Sin embargo, ya que no existe un mtodo de prueba que pueda ofrecer un
aseguramiento completo que el VIH, el virus de Hepatitis B u otros agentes
infecciosos estn ausentes, estos reactivos deben ser manejados al Nivel de
Bioseguridad 2, como se recomienda en los Centros para el Control de
Enfermedades / Institutos Nacionales del manual de Salud, Bioseguridad en
Laboratorios Microbiolgicos y Biomdicos. 1984.
2. No utilice la pipeta oralmente. No fume, coma, ni beba en las reas en las
cuales los especmenes o los reactivos del equipo de prueba estn
manejndose.

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3. Los compuestos en este equipo de prueba estn destinados para su uso como
una unidad integral. Los compuestos de lotes diferentes no deben ser
mezclados.
4. Este producto contiene compuestos conservados con zida sdica. La zida
sdica podra reaccionar con tuberas de plomo o cobre para formar zida
metlica explosiva. Para desecharlo, enjuague con un gran volumen de agua.
RECOLECCIN DEL ESPCIMEN Y MANEJO:
1. Recolecte la muestra y separe el suero.
2. Las muestras pueden ser refrigerados a 2 - 8 C por hasta 7 das o
congelados por hasta seis meses. Evite el congelado y descongelado repetitivo
de la muestra de suero.
PREPARACIN PARA EL ENSAYO:
1. Prepare el buffer de lavado 1x.
Prepare el buffer de lavado al agregar agua destilada o desionizada al
concentrado de lavado 10x para obtener un volumen final de 1 litro.
2. Ponga todos los especmenes y reactivos del equipo de prueba a temperatura
ambiente (20-25C) y mezcle suavemente.
PROCEDIMIENTO DEL ENSAYO:
1. Coloque el nmero deseado de tiras cubiertas en el soporte.
2. Prepare la dilucin 1:40 al agregar 5 l de la muestra, control negativo, control
positivo y calibrador a 200 l del diluente de muestra. Mezcle bien.
3. Vierta 100 l de suero diludo, calibrador, y controles en los pozos apropiados.
Para el blanco de reactivo, vierta 100 l de diluente de muestra en la posicin
del pozo 1A. Dele golpecitos al soporte para retirar burbujas de aire del lquido
y mezcle bien. Incube por 30 minutos a temperatura ambiente.
4. Retire el lquido de todos los pozos y repita el lavado tres veces con el buffer
de lavado.
5. Vierta 100 l de enzima conjugada a cada depsito e incube por 30 minutos a
temperatura ambiente.
6. Retire la enzima conjugada de todos los pozos. Repita el lavado tres veces con
buffer de lavado.
7. Vierta 100 l de TMB Substrato a cada pozo e incube por 30 minutos a
temperatura ambiente y en la obscuridad.
8. Agregue 100 l de HCl 2 N, para detener la reaccin.
Asegrese que no existan burbujas de aire en cada depsito antes de la lectura.
9. Lea a 450 nm DO con un lector de micro pozos.
CLCULO DE RESULTADOS:
1. Calcule la media del valor Xc del calibrador duplicado.
2. Calcule la media del control positivo, el control negativo y las muestras del
paciente duplicados
3. Calcule el ndice de H. pylori M de cada determinacin al dividir los valores de
la media de cada muestra entre el valor xc de la media del calibrador.
Ejemplo De Resultados Tpicos:
Calibrador de Cut-Off ndice M H. pylori = 1.0
D.O. Calibrador Cut-Off. = 0.650, 0630

Xc=0.640

D.O. Control Negativo = 0.210, .230

Xn=0.220

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ndice M de H. Pylori = 0.220 / 0.640 = 0.340

D.O. Control Positivo= 1.105, 1.210
ndice M de H. Pylori = 1.200 / 0.640 = 1.80
O.D. Muestra del Paciente = 1.501, 1.670
ndice H. Pylori m = 1.600 / 0.640 = 2.50

Xp=1.200
Xs=1.600

CONTROL DE CALIDAD:
La corrida de la prueba podra ser considerada vlida siempre y cuando los siguientes
criterios sean cumplidos:
1. El valor D.O. del blanco de reactivo comparado con el del aire de un lector de
micropozos debe ser menor de 0.250.
2. Si el valor D.O. del Calibrador es menor de 0.250, la prueba no es vlida y
debe ser repetida.
3. El ndice M de H. pylori para el Control Positivo y Negativo debe encontrarse en
el rango descrito en las etiquetas.
INTERPRETACIN:
Negativo: El ndice H. pylori M de 0.90 o menor es seronegativo para el anticuerpo
IgM para el H. pylori. La muestra de suero pudo haber sido tomada muy
prematuramente.
Errneo: El ndice H. pylori M de 0.91-0.99 es errneo. Vuelva a probar de una
manera paralela con una nueva muestra de suero tomada 3 semanas despus.
Positivo: ndice H. pylori M es de 1.00 o mayor es seropositivo.
LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO:
El ensayo debe ser solamente utilizado para evaluar a pacientes con seales
clnicas que sugieren una enfermedad gastrointestinal.
Un resultado de prueba positivo indica una infeccin activa y colonizada de H.
Pylori. No necesariamente indica que una enfermedad gastrointestinal est
presente.
REFERENCIA:
1. Marshall, B.J. and J.R.Warren. Unidentified curved bacilli in the stomach of
patients with gastritis and Peptic ulceration, Lancet 1:131-1314, 1984.
2. Ruawsa, E.A.J. and G.N.J. Tyagat. Cure of duodenal ulcer associated with
eradication of Helicobacter Pylori, Lancet 335:1233-35, 1990.
3.Perez-Perez, G.I. S.S. Wilkin, M.D. Decker and M.J. Blaswer. Seroprevalence of
Helicobacter Pylori infection in couples. J.Clin. Microbiol. 29:642-644, 1991.

i Dr. Mg. QF. Eduardo Flores Juarez