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Mtodos de Isolamento e Cultivo

de Fungos

Prof.: Daniela Pontes

Roteiro
Coleta da amostra
Fatores relacionados contaminao de
alimentos por fungos
Tcnicas de isolamento e identificao de fungos
relacionados a contaminantes de alimentos

Microscopia do material
Semeadura do material

COLETA

Colheita da Amostra
Utilizar utenslios esterilizados.
Material clnico:
- Somente aps suspenso de medicao antifngica: 15 dias (uso
tpico), 30 dias (uso sistmico).
- Informaes sobre o paciente acompanhando a amostra.

Alimentos:
- Produtos prontos para consumo devem ser coletados em suas
embalagens originais fechadas.
- Embalagens abertas: devem ser acondicionadas adequadamente
para evitar contaminao com outros alimentos, com
manipuladores, com o ambiente, etc.

FATORES RELACIONADOS CONTAMINAO DE


ALIMENTOS POR FUNGOS

A capacidade de sobrevivncia ou de multiplicao dos


microrganismos que esto presentes em um alimento depende
de uma srie de fatores:

Fatores Intrnsecos

Relacionados com as
caractersticas prprias do alimento

Fatores Extrnsecos

Relacionados com o ambiente em


que o alimento se encontra

Permite prever, em determinado alimento, a "vida de prateleira", a


estabilidade microbiolgica, a capacidade de crescimento e/ou produo
de toxinas por microrganismos patognicos eventualmente presentes.

Fatores Intrnsecos
Atividade de gua (Aa)

Acidez (pH)
Potencial de oxi-reduo (Eh)

Composio qumica
Presena de fatores antimicrobianos naturais
Interaes entre os microrganismos presentes nos alimentos

Fatores Intrnsecos
Atividade de gua (Aa):

Parmetro que mede a disponibilidade de gua em um


alimento.
gua disponvel: gua que no est ligada a macromolculas
por foras fsicas; do contrrio, no est livre para agir como
solvente ou para participar de reaes qumicas.

Fatores Intrnsecos
Acidez (pH):
pH em torno da neutralidade (entre 6,5 e 7,5) o mais
favorvel para a maioria dos microrganismos.

Os bolores e leveduras mostram maior tolerncia ao pH.


Bolores podem multiplicar-se em valores de pH mais baixos
que as leveduras.
Frutas, refrigerantes, vinhos, e vinagres normalmente
deterioram-se devido ao crescimento de bolores e leveduras,
que toleram pH inferior a 3,5.

Faixa aproximada de pH de crescimento de alguns


microrganismos encontrados em alimentos.

Fatores Intrnsecos
Potencial de Oxi-reduo (Eh):

Definido como a facilidade com que determinado substrato


ganha ou perde eltrons.
Quanto mais oxidado (perdeu eltrons) um composto,
mais positivo o seu Eh.
Quanto mais reduzido (ganhou eltrons) um composto,
mais negativo o seu Eh.
Microrganismos aerbios (bolores e leveduras aerbias)
requerem valores de Eh positivos para multiplicao.

Fatores Intrnsecos
Composio qumica:

gua
Fonte de energia: acares, lipdios.

Fonte de nitrognio: aminocidos, nucleotdios, peptdios,


protenas.
Vitaminas: complexo B, biotina, cido pantotnico.

Sais minerais: Na, K, Ca, Mg, Fe, Cu, Mn, Mo, Zn, Co, P, S.

Fatores Intrnsecos
Presena de fatores antimicrobianos naturais:
Presentes naturalmente em alguns alimentos, com
capacidade de retardar ou impedir a multiplicao
microbiana.
Exemplos: leos essenciais com atividade antimicrobiana
presentes em condimentos; derivados do cido
hidroxicinmico, tanino, cidos orgnicos e leos essenciais,
encontrados em frutas e vegetais.
Estruturas biolgicas que funcionam como barreiras
mecnicas para penetrao do microrganismo: cascas, peles
dos animais, pelcula das sementes.

Fatores Intrnsecos
Interaes entre os microrganismos presentes nos alimentos:

Determinado microrganismo, ao se multiplicar em um


alimento, produz metablitos que podem afetar a
capacidade de sobrevivncia e de multiplicao de outros
microrganismos presentes nesse alimento.

Fatores Extrnsecos
Umidade ambiental
Temperatura ambiental
Composio qumica da atmosfera que envolve o alimento

Fatores Extrnsecos
Temperatura ambiental:
Fungos podem crescer em faixas de temperatura mais ampla
do que as bactrias.

Muitos fungos so capazes de se multiplicar em alimentos


refrigerados.
As leveduras no toleram bem temperaturas altas, preferindo
as faixas mesfila e psicrfila.
psicrfilos: crescem a T de 0 a 20C
mesfilos: crescem a T de 20 a 40C
termfilos: crescem a T de 40 a 50C

Fatores Extrnsecos
Composio qumica da atmosfera que envolve o alimento:

A composio gasosa do ambiente que envolve um alimento


pode determinar os tipos de microrganismos que podero
nele predominar.
A presena de oxignio favorecer a multiplicao de
microrganismos aerbios e sua ausncia causar
predominncia dos anaerbios.

TCNICAS DE ISOLAMENTO E IDENTIFICAO DE


FUNGOS RELACIONADOS A CONTAMINANTES DE
ALIMENTOS

Anlise dos Alimentos


Objetivos:
Conhecer as condies de higiene em que o alimento foi
preparado;
Conhecer os riscos que o alimento pode oferecer sade do
consumidor;
Conhecer se o alimento ter ou no a vida til pretendida;
Determinar o agente etiolgico mais provvel no caso de um
episdio de toxinfeco alimentar;
Verificar se os padres e especificaes microbiolgicos,
nacionais e internacionais, esto sendo atendidos
adequadamente.

Anlise dos Alimentos


Amostragem:
Produtos prontos para consumo devem ser coletados em
suas embalagens originais fechadas, com especificaes de
identificao: nmero do lote, data de fabricao, etc.
Embalagens
abertas:
devem
ser
acondicionadas
adequadamente para evitar contaminao com outros
alimentos, com manipuladores, com o ambiente, etc.

Utilizar utenslios esterilizados.

Anlise dos Alimentos


Amostragem:
Amostras de alimentos perecveis refrigerados: mantidas
entre 0 e 4,4C at o incio da anlise.
Alimentos congelados: descongelar somente para realizao
da anlise.

Toda amostra deve ser analisada at 36h aps sua obteno,


do contrrio deve ser refrigerada ou congelada, dependendo
do tipo de produto, objetivo da anlise e tipo de
microrganismo a ser pesquisado.

Anlise dos Alimentos


Preparao da amostra para anlise:
Tcnicas asspticas em todas as etapas.
Uma homogeneizao de toda a amostra indispensvel, pois a
distribuio dos microrganismos nos alimentos no uniforme.
Poro da amostra: 25g, 50g ou 100g (ou mL)
Para produtos slidos ou semi-slidos necessria a
homogeneizao com diluente apropriado: diluente de Butterfield
(gua fosfatada tamponada, pH 7,2) ou gua peptonada a 0,1%.
Alimentos ricos em gordura: emulsificao com agentes
tensoativos.

MICROSCOPIA DO MATERIAL
(Exame Direto)

Exame Direto
Preparaes montadas entre lmina e lamnula, imersas em
uma substncia que facilite a visualizao microscpica
(KOH, tinta da China, K-tinta).
Indica, na maioria das vezes, se o material examinado
contm ou no estruturas fngicas.
Preparados imediatos utilizados como auxiliares no
diagnstico clnico.

Confeco de lmina-lamnula com K-tinta.

KOH a 10-40%
Prata-metenamina
(corante)

KOH a 10-40%

PAS, GrocottGomori ou HE

Fluxograma mostrando as principais tcnicas utilizadas para


confeco de lminas do material clnico.

SEMEADURA DO MATERIAL
(Cultura)

Cultura
Absolutamente necessria para o isolamento e identificao
dos fungos.
Exame direto ou microscopia com colorao -> semeadura
em diversos meios de isolamento.
A escolha dos meios orientada pelos achados micolgicos
do exame direto ou das preparaes coradas e tambm pela
suspeita clnica.
Meios de cultura primrios:
antibitico
- Sabouraud simples
- Sabouraud + cloranfenicol
- Sabouraud + cloranfenicol + cicloeximida

inibe crescimento de
fungos oportunistas

Cultura

fneros = cabelos,
pelos e unhas.

Fluxograma mostrando os meios primrios que devem ser utilizados para cada espcime
clnico, bem como os intervalos de tempo sugeridos para observao do crescimento
fngico.

Cultura
Meios de cultura diferenciais:
- CHROMagar: usado para facilitar evidenciao de infeco mista
por leveduras (quando a pesquisa direta indica possvel existncia
de leveduras).
- Sabouraud + BHI (Brain Heart Infusion) -> SABHI: para suspeita
clnica de histoplasmose e/ou coccidioidomicose.

CHROMagar com trs tipos diferentes de


colnias formadas. A C. albicans; B C.
tropicalis; C outras espcies.

Placa de CHROagar: A - C. albicans,


B - C. tropicalis, C - C. glabrata.

Cultura
Caracterizao das Colnias:
Geralmente apresentam morfologias tpicas, quando os
microrganismos so semeados em meios com a mesma
composio qumica.
Atravs do aspectos macroestruturais, possvel sugerir a
espcie microbiana presente na colnia.
Na observao das caractersticas deve-se ressaltar os
seguintes aspectos:
- Tamanho da colnia,
- Caractersticas dos bordos,
- Textura,

- Relevo,
- Pigmentao.

Cultura
Caracterizao das Colnias Tamanho:
A colnia pode apresentar-se com tamanho bastante
varivel, dependendo da qualidade e quantidade do
substrato ofertado;
Colnias de uma mesma espcie fngica, aps semeadas e
crescidas isoladamente em placa de Petri, se apresentam
como macrocolnias.

Cultura
Caracterizao das Colnias Bordos:
Podem ser observados muitos desenhos, desde morfologias
bem delimitadas at achados de projees irregulares (que
lembram franjas);
Podem ser observada, nos bordos das colnias, uma
variao da colorao em relao ao centro pea-chave
para identificar o possvel patgeno implicado.

Cultura
Caracterizao das Colnias Tamanho e bordos:

Aspecto macroscpico de uma macrocolnia.

Cultura
Caracterizao das Colnias Textura:
colnias algodonosas: apresentam-se macroscopicamente com
aspecto de algodo;
colnias furfurceas: lembram um punhado de substncia
farincea espalhado em uma superfcie;
colnias penugentas: evidenciam-se estruturas que lembram
pequenos fragmentos de penugem de aves;
colnias arenosas: assemelham-se a areia de praia;
colnias veludosas: apresentam aspecto de tecido aveludado;
colnias glabrosas: apresentam aspecto visual de cera ou
manteiga.

Cultura
Caracterizao das Colnias Textura:

Aspecto das colnias fngicas quanto textura: 1- colnias algodonosas; 2colnias furfurceas; 3- colnias penugentas; 4- colnias arenosas; 5- colnias
veludosas; 6- colnias glabrosas.

Cultura
Caracterizao das Colnias Relevo:
colnias cerebriformes: topografia de altos e baixos, fazendo
circunvolues e lembrando o aspecto encontrado no crebro;
colnias rugosas: variao da cerebriforme, s que as pregas
topogrficas se fazem menos evidentes e, s vezes, radiais, a
partir do centro da colnia;
colnias apiculadas: presena de uma salincia na parte central,
lembrando um pequeno cume;
colnias crateriformes: aprofundam no meio, assumindo o
aspecto de uma cratera.

Cultura
Caracterizao das Colnias Relevo:

Aspecto das colnias fngicas quanto ao relevo: 1- colnias cerebriformes; 2colnias rugosas; 3- colnias apiculadas; 4- colnias crateriformes.

Cultura
Caracterizao das Colnias Pigmentao:

Caractersticas dos fungos quanto pigmentao: A- pigmento no verso da


colnia; B- pigmento no reverso da colnia; C- pigmento difusvel no meio de
cultura.

Cultura
Achados Micromorfolgicos: estruturas de frutificao e de
ornamentao.

Sequenciamento de figuras mostrando a preparao de microcultivo em lminas


para fungos filamentosos e dimrficos: A- placa montada e esterilizada; B- placa
com meio para micromorfologia; C- montagem da lmina; D- semeadura; Ecrescimento; F- confeco de lminas para microscopia.

Cultura
Provas Nutricionais:

Provas
nutricionais
nos
meios
Trichophyton (7 meios), para auxiliar na
identificao dos dermatfitos.

Anlise dos Alimentos


Isolamento e Identificao de Fungos Relacionados a
Contaminantes de Alimentos:
Mtodos convencionais: testes bioqumicos
Mtodos novos:
- Tcnicas bioqumicas miniaturizadas: kits
- Tcnicas imunolgicas: ELISA e radioimunoensaio, para
aflatoxinas.

Bibliografia
SIDRIM, J. J. C. Fundamentos Clnicos e Laboratoriais da Micologia
Mdica. Editora Guanabara Koogan. 1999.

ALMEIDA, S. R. Micologia. Editora Guanabara Koogan. 2008.


FRANCO, B. D. G. M; LANDGRAF, M. Microbiologia dos Alimentos. So
Paulo: Editora Atheneu, 2008.
JAY, J. M. Microbiologia de Alimentos. Porto Alegre: Artmed, 2005.