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FACULTAD DE AGRONOMA
por
MONTEVIDEO
URUGUAY
2012
Director:
..
Ing. Agr. Msc. Silvia Ross
..
Ing. Agr. Rafael Escudero
..
Ing. Agr. Msc. Alicia Castillo
Fecha:
23 de noviembre de 2012
Autor:
..
Rafael Grasso
.
Romina de Souza
II
AGRADECIMIENTOS
De mi parte Rafael Grasso, agradezco el apoyo de mi familia en todo
momento, de mi padre Enrique, mi hermano Juan, mi abuela Blanca, de mi
madre Mara que me acompaa desde otro lugar.
Por mi parte Romina de Souza, agradezco el apoyo de mi familia a mi
Padre Luis, mi hermano Luisito y a mi madre Teresa por estar ah en todo
momento.
Agradecemos la valiosa ayuda de la orientadora y amiga Ing. Agr. Silvia
Ross, por sus valiosos aportes y apoyo durante el transcurso de la tesis.
Agradecemos a la Lic. Sully Toledo por su indispensable aporte en la
correccin de la tesis y su buena voluntad.
Agradecemos a Ing. Agr. Joaqun Dutour, por el indispensable apoyo en
los anlisis estadsticos y diseo del experimento.
Agradecemos a co-orientador Ing. Agr. Rafael Escudero por la buena
voluntad.
Agradecemos a las empresas Mundial Forestacin S.A. y Forestal
Oriental
S.A.
por
el
material
vegetal
proporcionado.
III
TABLA DE CONTENIDO
Pgina
PGINA DE APROBACIN... II
AGRADECIMIENTOS. III
LISTA DE CUADROS E ILUSTRACIONES..... VI
1. INTRODUCCIN. 1
1.1. OBJETIVOS.. 2
2. REVISIN BIBLIOGRFICA... 3
2.1. Eucalyptus dunnii EUCALIPTO BLANCO 3
2.1.1. Importancia en el pas de Eucalyptus dunnii. 5
2.2. PROPAGACIN VEGETATIVA. .. 7
2.2.1. Razones para clonar. .. 7
2.2.2. Mtodos de propagacin vegetativa en
Eucalyptus spp. ... 10
2.3. TCNICA DE MICROPROPAGACIN. . 11
2.3.1. Etapas de la micropropagacin..... 12
2.3.2. Composicin del medio de cultivo. 13
2.3.3. Problemas de la micropropagacin.. 17
2.3.4. Influencia de factores fsicos sobre el
crecimiento y desarrollo..... 18
2.3.5. Proceso de enraizamiento.. 22
2.3.5.1. Factores que influyen en el enraizamiento. 25
2.3.6. Experiencias en micropropagacin in vitro
en Eucalyptus dunnii.. 29
2.4. MICROPROPAGACIN FOTOAUTOTRFICA. 30
2.4.1. Ventajas de la micropropagacin fotoautotrfica. 31
2.4.2. Mejoras en la ventilacin 32
2.4.3. Sustratos 35
2.4.4. Antecedentes en micropropagacin fotoautotrfica.. 37
2.4.4.1. En Eucalyptus spp .. 37
2.4.4.2. En otras especies. 39
3. MATERIALES Y MTODOS. 42
IV
42
46
49
51
52
56
59
59
62
62
64
70
71
73
74
Pgina
1.
2.
3.
Porcentaje de sobrevivencia.. 62
4.
5.
6.
Porcentaje de enraizamiento. 64
7.
8.
9.
10.
Figura No.
1.
2.
3.
4.
5.
Clones A y B, ya acondicionadas.... 42
6.
Clon A, introduccin. 46
7.
8.
VI
10.
11.
Regulador de presin. . 54
12.
Caudalmetro de gas. . 55
13.
14.
VII
1. INTRODUCCIN
1.1. OBJETIVOS
Objetivo general
Evaluar un sistema de enraizamiento alternativo para E. dunnii in vitro.
Objetivos especficos
Disear y adaptar un sistema de enraizamiento de explantos en un
ambiente enriquecido con dixido de carbono (CO2).
Ajustar los tiempos de desinfeccin para los clones de Eucalyptus
utilizados.
2. REVISIN BIBLIOGRFICA
2.1. Eucalyptus dunnii EUCALIPTO BLANCO
verdes
netamente
oval-lanceoladas o
discoloras.
ampliamente
Las
intermedias
alternas,
lanceoladas, pice
agudo
frtiles o
Mantenimiento de clones
diferentes.
Algunas
de
ellas
son
caractersticas
muy
Combinacin de clones
Razones econmicas
10
Tcnica de injerto
Tcnica de estaca
11
Etapa I: Introduccin
12
tiamina;
cuya
concentracin
oscila
entre
0,1-1,0mg/l,
Los explantos creciendo in vitro poseen los mismos requerimientos que las
plantas intactas, pero en la mayora de los casos pierden la capacidad de
sintetizar su propia fuente de carbohidratos, reguladores de crecimiento y
vitaminas (Margara, 1982).
13
diferentes
concentraciones
endgenas
de
reguladores
del
nutrientes
minerales
necesidades
como
especficas
in
algunas
modificaciones
vitro.
Complementando
para
esas
atender
las
sustancias
Auxinas
El trmino auxina fue utilizado por primera vez por Went (1928) quien
descubri un compuesto indefinido que causaba la curvatura del coleoptilo de
avena, fenmeno conocido como fototropismo. Este compuesto es conocido
actualmente como cido indol actico (AIA). Las auxinas generalmente
producen: elongacin celular, expansin de los tejidos, divisin celular,
15
Citoquininas
16
producida
in vitro
son
comportar como auttrofas in vivo: el azcar debe ser producido por medio de
la fotosntesis.
Variacin somaclonal
Humedad
Sin embargo en algunos casos puede ser necesario que la humedad relativa
sea regulada y mantenida a niveles ms apropiados. En diversos estudios
realizados con varias especies del gnero Eucalyptus se ha observado que
muchas plantas cuando crecen en cmaras de ambiente controlado desarrollan
agallas en tejidos de hojas y callos. En un trabajo realizado por Warrington,
citado por Gravina et al. (s.f.) se ha determinado que este problema puede ser
evitado (o al menos minimizado) manteniendo las plantas bajo condiciones
medias a bajas de humedad relativa (menos de 60-65%), aunque el mecanismo
responsable inductor del desarrollo de estos sntomas no ha sido totalmente
elucidado.
Temperatura
El efecto de la temperatura sobre el crecimiento es la resultante de su
accin sobre la fotosntesis y las reacciones metablicas, pero tambin sobre la
nutricin hdrica y mineral y sobre la transpiracin (Heller, citado por Gravina et
al., s.f.). La temperatura ptima para el crecimiento y desarrollo in vitro es
generalmente 3-4C ms alta que la correspondiente para el crecimiento in vivo.
Teniendo en cuenta que la temperatura en los tubos de ensayo es 3-4C ms
alta que la cmara de crecimiento, la temperatura de esta ltima puede ser
mantenida en el ptimo para el crecimiento in vivo (Pierik 1990, George et al.
2010).
19
Termoperiodismo
Luz
20
21
Des-diferenciacin
de
clulas
diferenciadas
(que
conducen
Divisin celular,
Desarrollo de rganos.
24
Genotipo
25
Estado hdrico
Carbohidratos
carbohidrato/nitrgeno.
Segmentos
de
tallos
ms
ricos
en
cultivos
de
difcil
enraizamiento,
segmentos
de
tallos
26
Nutricin mineral
1) Reduciendo
los
abonos
nitrogenados
las
plantas
madres,
de
carbohidratos.
Cualquier
tipo
de
restriccin
al
27
Vieitez et al., citados por Torres et al. (1998) notaron que plantas creciendo
en ambiente luminoso produciran dos compuestos derivados del cido elgico,
que impiden la actividad rizognica del cido indol actico. Este compuesto no
fue encontrado en plantas cultivadas en ausencia de luz o con una intensidad
de luz reducida. El fotoperodo es otro factor importante relacionado con el
ambiente de las plantas dadoras de propgulos, por medio del cual la luz
interfiere en el proceso de enraizamiento. En E. grandis condiciones de das
cortos y noches fras fueron ms favorables al enraizamiento de segmentos
nodales in vitro (Durand-Cresswell et al., citados por Torres et al., 1998).
Edad Fisiolgica
28
29
Segn Kozai y Xiao (2008), existen tres modos de crecimiento de las plantas
in vitro en cuanto a su fuente de carbono y energa para el crecimiento vegetal:
30
(Zobayed et al., Afreen et al., Kozai et al., citados por Cristiano y Wulff 2005,
Kozai y Xiao 2008).
31
32
ii)
iii)
33
con
ventilacin
forzada
aumenta
considerablemente
el
34
2.4.3. Sustratos
Hay evidencia de que las races que crecen en un medio con agar
mostraron alteraciones estructurales de los tejidos (Kataoka, citado por
Zobeyed et al., 2004), a menudo carecan de pelos radiculares y murieron poco
despus del transplante (Debergh y Maene, Afreen et al., citados por Zobayed
et al., 2004).
Como
en
cultivos
hidropnicos,
los
medios
utilizados
en
la
El
38
Agar
Gelrite
Red de plstico
Vermiculita
Sistema convencional
Sistema fotoautotrfico
convencional se debi
distribucin relativamente
40
espacio superior del recipiente de cultivo, son factores importantes para lograr
un crecimiento uniforme de las plantas (Kozai y Xiao, 2000).
41
3. MATERIALES Y MTODOS
3.1.
PRIMER
ENSAYO:
EFECTO
DE
DIFERENTES
TIEMPOS
DE
DESINFECCIN
El material de partida para realizar el experimento, fueron plantas de
semillas de Eucalyptus dunnii del vivero Mundial Forestacin (Cerro Colorado,
Florida), y plantas clonales de Eucalyptus dunnii donadas por la empresa
Forestal Oriental S.A. totalizando 5 plantas del clon denominado A y 5 plantas
del clon denominado B las culas fueron trasladadas a Facultad de Agronoma
(Figura 5). Tanto las plantas de semillas como los clones fueron acondicionadas
en macetas de polietileno de dos litros, con sustrato comercial comprado en un
vivero local de composicin indefinida. Luego
fueron colocadas en un
42
44
45
3.2.
SEGUNDO
ENSAYO:
ENRAIZAMIENTO
EN
CONDICIONES
FOTOAUTOTRFICAS
Paysand.
46
Ln (y ij /1 - y ij ) 0 i z j (z ) i
Dnde:
Yij / 1-yij = es el valor para la variable en estudio.
0: intercepto.
(z ) ij:
gentico
47
Yij i z j (z )ij
ij
Dnde:
yij: es el valor para la variable en estudio con el efecto del Ambiente
(z )
ij:
gentico.
ij
48
y 1,5 Kg.cm-2 durante 20 minutos. Luego los mismos fueron colocados en una
cmara de crecimiento de ambiente controlado, a una temperatura de 24 +/2C con un fotoperodo de 16 horas de luz (lmparas de luz blanca fras con
una intensidad lumnica de 25 mol m -2s-1); en cada bolln se instalaron de 2 a
3 explantos (Figura 7); el objetivo del pasaje del material por este medio es
absorber el exceso de reguladores de crecimiento que fueron utilizados en el
proceso
de
multiplicacin.
El
tiempo
durante
el
cual
los
explantos
49
Tanque de CO2
CO2 puro
Tubera de gas
Regulador de presin de CO2
Caudalmetro
Bomba de aire
50
51
52
Regulador de presin
53
Caudalmetro de gas
Es un instrumento que mide el flujo de gas o caudal que pasa por una
caera en un determinado tiempo, nos da una media del gasto de gas que
circula (Figura 12). Para llevar a cabo el experimento el caudal fijado fueron 0,9
litros / min, durante 25 min lo que daba un total de 22,5 litros de gas.
54
55
Aplicaciones de productos
57
Fertilizacin
58
4. RESULTADOS Y DISCUSIN
Debido a que el sistema utilizado en la fase de enraizamiento se trata de
un sistema totalmente nuevo de inyeccin de CO2 en cultivos in vitro y
utilizacin de un sustrato alternativo al agar, sin antecedentes para el pas y
para la especie, se busc generar una primera aproximacin para comenzar a
adaptar la tcnica a nuestras condiciones y a dos clones de la especie en
estudio, pudiendo en un futuro evaluarse a una mayor escala. Por lo tanto si
bien
los
resultados
de
los
anlisis
estadsticos
cuantitativos
son
No.
Porcentaje
No. explantos
Tratamiento Explantos
contaminacin
contaminados
iniciales
(%)
10
90
56
62,22
15
90
43
10
15
10
15
90
90
100
100
67
60
11
5
47,78
74,44
66,67
11,00
5,00
60
61
4.2.
SEGUNDO
ENSAYO:
ENRAIZAMIENTO
EN
CONDICIONES
FOTOAUTOTRFICAS
explantos
Total observaciones
160
Total de explantos
58
% sobrevivencia total
36,25
62
Den DF
155
155
155
155
F-Valor
6,61
18,29
30,57
7,37
Pr > F
0,0111
<,0001
<,0001
0,0074
63
Tratamiento
Clon
Total
A
B
40
40
40
20
40
34
85
Sin enriquecimiento de
CO2
58
25
% con races
43,86
64
Num DF
1
1
1
Den DF
53
53
53
F-Valor
0,9
0,04
8,69
Pr > F
0,3466
0,8456
0,0047
Letter
Clon
Estimar
estndar
Group
0,5424
0,1088
0,0683
0,0856
65
Si bien surgen estos datos del anlisis, hay que tener en cuenta que el
material de partida fue disminuyendo por consecuencia de la grave
contaminacin. Al momento de evaluar el enraizamiento no se consider el total
de explantos iniciales, sino los que sobrevivieron. Como ya se mencion el ms
afectado fue el tratamiento enriquecido con CO2, siendo 16 explantos evaluados
en este tratamiento y 32 los evaluados en el tratamiento sin enriquecimiento.
Esto puede llevar a que se genere una comparacin errnea, que subestime o
sobreestime algn tratamiento.
% con
Tratamiento
races
races
15
46,7
42
18
42,9
66
Tratamiento
con
% con
races
Clon
N inicial
races
0,0
0,0
10
7,0
70,0
Sin enriquecimiento
1,0
12,5
de CO2
34
17,0
50,0
Figura 14. Clon B, con races, el da de finalizacin del ensayo, tratamiento sin
CO2.
67
de
69
5. CONCLUSIONES
70
6. RESUMEN
Eucalyptus dunnii es una especie que se ha tornado de gran importancia en la
produccin de pulpa de celulosa en Uruguay debido a su adaptacin a las
condiciones edafo-climticas con especial nfasis en tolerancia a las heladas.
Esto ha permitido aumentar el aprovechamiento de los campos forestales
pudiendo plantar en terrenos donde otras especies de Eucalyptus hasta el
momento no prosperaron. El objetivo de este trabajo fue evaluar un nuevo
sistema de enraizamiento en condiciones fotoautotrficas. El material utilizado
fueron plantas de E. dunnii provenientes de reproduccin seminal donadas por
la empresa Mundial Forestacin S.A. y clones de la misma especie donadas por
la empresa Forestal Oriental S.A. El experimento central consisti en evaluar el
enraizamiento
de
explantos
de
Eucalyptus
dunni
en
condiciones
71
72
7. SUMMARY
Eucalyptus dunnii has become a species of great importance for pulp production
in Uruguay. It adapts well to soil and climate conditions, and exhibits frost
tolerance, making it possible to plant where other Eucalyptus species do not
prosper successfully. Our objective was to asses a new rooting system in
photoautotrophic conditions. As source of explants we used E. dunnii seedlings
(Mundial Forestacin S.A donation) and clones (Forestal Oriental S.A donation).
In photoautotrophic rooting, a system without sugar in the culture medium,
carbohydrates accumulation depends on photosynthesis and mineral nutrients
acquisition. We designed a rooting system in larger containers, vermiculite as an
alternative to agar, without sugar and forced ventilation with CO2-enriched air.
Considering that E. dunnii is a species which shows rooting recalcitrance, we
tried to develop an alternative vegetative propagation system to overcome the
limitations of traditional micropropagation. In the introduction step we were able
to reduce contamination with a 15-immersion in sodium hypochlorite solution,
finding a strong clon-dependent effect. Despite the strong contamination,
43,86% rooting was achieved. Although a trend was observed towards
enhanced rooting in explants from CO2-enriched air treatment, no significant
differences were found. These preliminary data suggest that efforts should be
made in order to reduce contamination so that more data could be obtained and
objectively compared.
73
8. BIBLIOGRAFA
74
75
76