Marilda 03 - Diagnóstico Molecular Na Influenza

FUNDAO OSWALDO CRUZ
INSTITUTO DE TECNOLOGIA EM IMUNOBIOLGICOS

MESTRADO EM TECNOLOGIA DE IMUNOBIOLGICOS
ENSAIO MOLECULAR PARA VIGILNCIA EPIDEMIOLGICA DE

GRIPE COM NFASE NO DIAGNSTICO DE INFLUENZA A H1N1
RONALDO FERREIRA DIAS
RIO DE JANEIRO
2011

Mestrado Profissional em Tecnologia de Imunobiolgicos
Ensaio Molecular para Vigilncia Epidemiolgica de Gripe com

nfase no diagnstico de Influenza A H1N1
Dissertao apresentada ao Instituto de

Tecnologia em Imunobiolgicos, como
parte dos requisitos para obteno do
ttulo de Mestre em Tecnologia de
Imunobiolgicos.
RIO DE JANEIRO
2011
FICHA CATALOGRFICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA DE MANGUINHOS /

CICT / FIOCRUZ RJ
Dias, Ronaldo Ferreira
Ensaio Molecular para Vigilncia Epidemiolgica de Gripe com nfase no diagnstico de

Influenza A H1N1/Ronaldo Ferreira Dias Rio de Janeiro, 2011. IX,
f.: il.
Dissertao (mestrado) Instituto Oswaldo Cruz, Tecnologia de Imunobiolgicos, 2011.

Bibliografia: f.
Orientador Alvarez, Patrcia; Krieger, Marco Aurlio
1. Diagnstico. 2. Influenza. 3. PCR em tempo real
I. Ttulo
ii
Trabalho realizado no Instituto de Tecnologia em

Imunobiolgicos
Bio-Manguinhos
no
Departamento de Reativos para Diagnstico do

Instituto de Biologia Molecular do Paran - IBMP,
sob a orientao da Dra. Patrcia Alvarez Brindeiro
e Dr. Marco Aurlio Krieger.
iii

Mestrado Profissional em Tecnologia de Imunobiolgicos
ENSAIO MOLECULAR PARA VIGILNCIA EPIDEMIOLGICA DE

GRIPE COM NFASE NO DIAGNSTICO DE INFLUENZA A H1N1
Orientadores: Dra. Patrcia Alvarez Brindeiro e Dr. Marco Aurlio Krieger
Dissertao aprovada em 09 de Junho de 2011.
Examinadores:
Profa. Dra. Elena C. C. Siqueira

Bio-Manguinhos/Fiocruz / Presidente
Prof. Dr. Jos Nelson Couceiro

UFRJ
Profa. Dra. Constana Britto

IOC/Fiocruz
RIO DE JANEIRO
2011
iv
June, por sempre ter acreditado na minha

capacidade
Ao Jos Victor, meu filho, que muito mais
importante do que tudo que eu j tenha feito ou venha a fazer.
v
AGRADECIMENTOS
Aos meus pais, Ronaldo e Filomena que me apiam em tudo e acreditam em mim
mais do que ningum,
Dra Patrcia Alvarez Brindeiro, que me apoiou e me deu suporte no decorrer neste
trabalho, nos momentos em que mais precisei, e que foi a pea fundamental para
que esse trabalho pudesse ser realizado,
Ao Dr. Marco Aurlio Krieger, que me propiciou as oportunidades e que, apesar da

distncia fsica, foi indispensvel realizao deste trabalho,
Ao Antonio Gomes Pinto Ferreira, que permitiu que tudo comeasse e sempre me
apoiou em todas as minhas iniciativas,
A todos do LATED, laboratrio de tecnologia diagnstica, e, em especial, aos

membros do setor de biologia molecular (Elisabete Ferreira, Daniele e Fabiane
Monteiro), por terem tido pacincia com meus erros e meus pedidos,
Ao DERED, especialmente ao pessoal do escritrio, pela receptividade e pacincia,
A todos do Instituto de Biologia Molecular do Paran, e, em especial, Andria

Dallabona, Camila Suarez e a toda a equipe da INTEC, por terem me acolhido de
uma maneira inesquecvel,
Celina Poersch, pela ajuda na parte prtica, apesar de ter tido de nos deixar, ainda
durante a realizao do trabalho,
A todos os colegas do Mestrado Profissional, pela amizade, ajuda, sugestes e

ensinamentos. Todos vocs, sem exceo, contriburam direta ou indiretamente
para a realizao dessa dissertao.
Aos amigos do Escritrio do DERED, por permitirem que utilizasse as instalaes

para a digitao deste trabalho.
vi
Aos amigos Carlos Renato Calvet da Silva, Pedro Paulo Ferreira Ribeiro, Bernardo
Loureiro, Rafael Alexandrino e Alfredo Jabour , pela inestimvel contribuio para a
finalizao deste trabalho,
Dra Elena Caride, pela sua reviso e pela participao ao longo deste trabalho,
Bio-Manguinhos, Fiocruz e ao IBMP, pelo apoio financeiro.
vii
Per Ardua Surgo

(Na dificuldade, Veno)
Lema do braso do estado da Bahia
viii
NDICE
1. INTRODUO ........................................................................................................ 1
1.1. Influenza ............................................................................................................... 1
1.1.1. Estrutura do vrus .............................................................................................. 1
1.1.3. Mecanismos de variaes antignicas. ............................................................. 5
1.1.4. Epidemiologia e Histrico das pandemias causadas pelo vrus Influenza A
H1N1. .......................................................................................................................... 8
1.2. Diagnstico de influenza. ................................................................................... 12
1.2.1. Isolamento viral ............................................................................................... 13
1.2.2. Outras possibilidades diagnsticas. ................................................................ 13
1.2.3. Diagnstico molecular. .................................................................................... 15
1.2.3.1 Histrico de tcnicas moleculares. ................................................................ 15
1.2.3.1.1 Tcnicas Moleculares ................................................................................. 16
1.2.3.1.2. Sistema Taqman ..................................................................................... 17
1.3. Situao da Influenza A H1N1 no Sistema nico de Sade. ............................ 20
1.4. Atuaes de Bio-Manguinhos no cenrio nacional............................................. 23
2. OBJETIVOS .......................................................................................................... 25
2.1. Objetivo Geral .................................................................................................... 25
2.2. Objetivos Especficos ......................................................................................... 25
3. MATERIAIS E MTODOS..................................................................................... 26
3.1. Sistemas de extrao e PCR em tempo real para a adaptao de um ensaio
molecular. .................................................................................................................. 26
3.2. Origem e quantidade de amostras utilizadas. .................................................... 28
3.3. Sistemas de Extrao avaliados ........................................................................ 29
3.3.1. Extrao manual ............................................................................................. 31
3.3.2. Maxwell16(Promega) ................................................................................... 31
3.3.3.. NucliSens miniMAG (BioMerieux) ................................................................ 32
3.3.4. MagMax (Applied Biosystems) ..................................................................... 33
3. 3. 5. QIAcube (Qiagen) ....................................................................................... 33
3.3.6 Labturbo(BioTools) ........................................................................................... 34
3.4 PCR em tempo real Protocolo IBMP/Bio-Manguinhos. ....................................... 35
3.5 Oligonucleotdeos e sondas ................................................................................ 36
3.6 Protocolo de PCR em tempo real ........................................................................ 38
ix
3.6.1 ABI 7500........................................................................................................... 39
3.6.2 LionCube .......................................................................................................... 39
3.7. Controles da reao ........................................................................................... 39
3.8 Protocolo H1N1 CDC .......................................................................................... 40
4. RESULTADOS ...................................................................................................... 42
4.1 Matriz de definies para os Equipamentos ........................................................ 42
4.2 Nacionalizao de insumos ................................................................................. 44
4.2.1. Avaliao das reaes SINGLE e MULTIPLEX de H1N1, HA, NA, INFA, M1 E
RNP ........................................................................................................................... 44
4.3 Padronizaes de ensaios Duplex ...................................................................... 46
4.3.1. Avaliao de reaes duplex H1N1/RNP e INFA-M1/RNP ............................. 47
4.3.2. Anlise de reprodutibilidade do modelo escolhido. ......................................... 49
4.4 - Teste com diferentes condies de master mix, e comparao entre sondas
purificadas e no purificadas por HPLC. ................................................................... 58
4.5- Comparaes entre o mtodo de extrao semiautomatizado (Labturbo) e o
mtodo de extrao manual (Invitrogen) e entre dois equipamentos de PCR em
tempo real (LionCube e ABI 7500) ............................................................................ 60
5 - DISCUSSO ........................................................................................................ 67
6 - CONCLUSO ...................................................................................................... 75
7. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS ...................................................................... 76
x
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ml
Mililitro
Microlitro
Micrmetro
mm
Milmetro
Aids
Sndrome da imunodeficincia adquirida
ANVISA
Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria
BPF
Boas Prticas de Fabricao
BPL
Boas Prticas de Laboratrio
CCEB
Tampo de eluio da coluna de extrao
CDC
Centers for Disease Control and Prevention
cDNA
DNA complementar
CI
Controle Interno
CP
Controle positivo
Ct
Ciclo Threshold- Ciclo Limiar
CV
Coeficiente de variao
DERED
Departamento de Reativos para Diagnstico
DESVPAD
Desvio-padro
DNA
Deoxyribonucleic acid (cido Desoxirribonuclico)
dNTP
desoxirribonucleotdeos trifosfatados
ELISA/EIE
Teste imunoenzimtico
FDA
Food and drug Administration
Fiocruz
Fundao Oswaldo Cruz
GMP
Good Manufacturing pratices
H1N1
Hemaglutinina do tipo 1 e neuraminidase do tipo 1
H2N2
H3N2
HCV
Virus da hepatite C
HIV
Vrus da imunodeficincia humana
HPLC
High-performance liquid chromatography
IBMP
Instituto de Biologia Molecular do Paran
IOC
Instituto Oswaldo Cruz
xi
IVD
in vitro diagnostics
LACEN
Laboratrio Central de Sade Pblica
MP(M1)
Matrix Protein
MS
Ministrio da Sade
NTC
No template control
OMS
Organizao Mundial da Sade
PCR
Polimerase Chain Reaction ( reao em cadeia da polimerase)
RNA
Ribonucleic acid (cido Ribonucleco)
RNP
Rnase P
RT
Reverse transcriptase (Transcriptase Reversa)
SRH
hemlise radial simples
SUS
Sistema nico de Sade
Tm
Temperatura de melting
WHO
World Health Organization
PB1
Polimerase bsica 1
PB2
Polimerase Bsica 2
NP
Nucleoprotena
NS
Protena no-estrutural
NA
Neuraminidase
M1
Protena de Matriz
HA
Hemaglutinina
FRET
Fluorescence Resonance Energy Transfer
xii
LISTA DE FIGURAS
Figura 1.1: Estrutura do vrus da influenza, com a vizualizao das protenas

hemaglutinina, neuraminidade e M2(canal Inico), membrana, complexo da RNA
polimerase e complexo de nucleoprotena, alm de todos os genes (1 a 8) que
compes o vrus da influenza A e B...........................................................................02
Figura 1.2: Ciclo da replicao do vrus Influenza: A) o hospedeiro contaminado

pelas vias areas. B) o vrus adere clula, via cido silico. C) este sofre
endocitose, entrando no citoplasma da clula. D) liberao do RNA viral no
citoplasma. E) o RNA viral entra no ncleo. F) O RNA transcrito. G) Ocorre a
formao de complexos de ribonucleopreotenas no citoplasma. H) Formao de
uma nova partcula viral. K) com a nova partcula viral formada, esta reinicia o ciclo
em uma nova clula. .................................................................................................05
Figura 1.3: Antigenic drift e antigenic shift , permitindo a vizualizao de pequenas

mutaes( antigenic drift) e a formao de novas cepas(antigenic shift)..................06
Figura 1.4: Figura que ilustra a formao da nova linhagem de influenza A H1N1,
com a constituio do recombinante qudruplo, pois continha genes PB2 e PA
provenientes da infeco ocorrida em 1998, gene PB1 da pandemia de 1968, genes
HA, NP e NS da linhagem norte-americana de 1918 e genes NA e MA originrios da
protena de matriz provenientes da linhagem eurasiana de 1979.............................08
Figura 1.5: Distribuio dos casos de H1N1 durante a epidemia. Situao em

agosto de 2009. Fonte: http://flutracker.rhizalabs.com/flu/by_status_and_num.html
Legenda: Em laranja, casos confirmados; Em vermelho, bitos confirmados..........12
Figura 1.6: foto de isolamento do Vrus influenza em ovo. .....................................13
Figura 1.7: Sistema TaqMan: A) Desnaturao das fitas do cDNA. B) Anelamento

dos iniciadores Foward e Reverso e da sonda marcada com um silenciador
(quencher) na ponta 3 e um reporter na extremidade 5, especficos para a regio
alvo a ser amplificada. Neste momento a sonda encontra-se em equilbrio
xiii
(Fenmeno FRET). C) Extenso da regio alvo. Ocorre a eliso da sonda pela
enzima Taq DNA polimerase, resultando na separao dos corantes reprter e
silenciador com subseqente emisso de fluorescncia do reprter, gerando assim
um aumento de emisso de fluorescncia, sendo esta detectada. ..........................18
Figura 1.8: Modelo esquemtico de um resultado de PCR em Tempo Real, onde

fica visualizada a linha do threshold e o baseline (indice de fluorescncia basal da
reao). .....................................................................................................................20
Figura 3.1: Fluxograma da cadeia de aes para desenvolvimento de ensaio

molecular. Foram avaliadas as regies alvo conservadas, mtodos e equipamentos
de extrao e PCR em tempo real, alm de insumos para a reao de PCR em
tempo real. Para isso foram avaliadas as questes de propriedade intelectual, alm
da rastreabilidade, sensibilidade, custo, assistncia tcnica e facilidade para o
manuseio dos equipamentos.....................................................................................28
Figura 3.2: Equipamento de extrao Maxwell16 da empresa Promega. ............32
Figura 3.3: Equipamento de extrao NucliSens miniMAG (BioMeiriux). ............32
Figura 3.4: Equipamento de extrao MagMax ( Applied Biosystems)..................33
Figura 3.5: Equipamento de extrao QIAcube da empresa QIAGEN. .................34
Figura 3.6: Equipamento de extrao LabTurbo 36 C, da Fabricante BioTools. .....35
Figura 3.7: Descrio dos equipamentos utilizados, insumos de extrao e de RTPCR dos protocolos preconizados pelo CDC e IBMP. .............................................41
Figura 4.1: Resultados das trs extraes realizadas com as mdias, desviospadro (DESVPAD) e o coeficiente de variao (CV) dos protocolos sugeridos......41
Figura 4.2: Resultados obtidos com o oligonucleotdeo RNP e H1N1 (demonstrado

nos quadros 4.7 e 4.8), com as respectivas porcentagens de contaminao obtida
xiv
nas alquotas de CCEB e SM nos testes realizados entre as limpezas mecnicas
sugeridas
no
protocolo
descrito
na
metodologia,
com
suas
respectivas
porcentagens. ............................................................................................................53
Figura 4.3: Grfico com os resultados positivos para o oligonucleotdeo

1(H1N1\MP), com os respectivos fatores de diluio em ordem crescente. Legenda
ao lado. LC-lioncube, ABI-ABI 7500. ........................................................................62
Figura 4.4: Grfico com os resultados positivos para o oligonucleotdeo 1(MP\RNP),

com os respectivos fatores de diluio em ordem crescente. Legenda ao lado. LClioncube, ABI-ABI 7500. ...........................................................................................62
Figura 4.5: Grfico com os resultados positivos para o oligonucleotdeo 1

(H1N1\MP), com os respectivos fatores de diluio em ordem crescente. Legenda ao
lado. LC-lioncube, ABI-ABI 7500. .............................................................................63

(H1N1\MP), extrados por extrao manual com os respectivos fatores de diluio
em ordem crescente. Legenda ao lado. LC-lioncube, ABI-ABI 7500. .......................64
Figura 4.7: Grfico com os resultados positivos para o oligonucleotdeo 2(MP\RNP),

extrados por extrao manual com os respectivos fatores de diluio em ordem
crescente. Legenda ao lado. LC-lioncube, ABI-ABI 7500. .......................................64

(H1N1\RNP), extrados por extrao manual e amplificados com sondas purificadas
com os respectivos fatores de diluio em ordem crescente. Legenda ao lado. LClioncube, ABI-ABI 7500. ...........................................................................................65

(H1N1\RNP), extrados por extrao manual e semiautomatizada, e amplificados
com sondas purificadas com os respectivos fatores de diluio em ordem crescente.
Legenda ao lado. .......................................................................................................66
xv
LISTA DE QUADROS
Quadro 1.1: Comparao entre os subtipos A, B e C do vrus influenza, em relao

a genoma, estrutura, hospedeiro, evoluo e caractersticas epidemiolgicas. ......01
Quadro 3.1: Matrizes de possibilidades automticas e semiautomatizadas de

extrao, com suas respectivas metodologias e informaes analisadas. ...............30
Quadro 3.2: Sequncias dos iniciadores Foward (F) e Reverse (R) e sondas dos
oligonucleotdeos usados neste trabalho. Todas esto colocadas na direo 53
Sondas: H1N1- sonda especfica para influenza pandmico, SwINFA- sonda
especfica para influenza sazonal, MP- sonda especfica para gene da protena de
matriz e RNP- Sonda especfica gene RNAseP. (-) significa que no utiliza essa
sonda em sua combinao para diagnstico. Conjunto de oligonucleotdeos usados
no trabalho................................................................................................................37
Quadro 3.3: Concentraes necessrias para uma reao de PCR em tempo real
padronizada neste trabalho na proposta de produto efetuada no trabalho. Todos os
insumos usados so oriundos da transferncia de tecnologia da empresa BioTools
para o IBMP. .............................................................................................................38
Quadro 3.4: reagentes e volumes necessrios para a realizao da reao de PCR

em tempo real conforme protocolo CDC. .................................................................41
Quadro 4.1: Resumo das informaes prestadas pelas empresas participantes, e

dos critrios determinantes observados. Legenda: IVD- In vitro diagnostic, BPFBoas prticas de fabricao, ISO- Internacional Organization for Standardization,
BR-Brasil.Legenda:r-reaes; Transf. De tec- Transferncia de tecnologia............43
Quadro 4.2 : Resultados Discordantes Obtidos com os Oligonigleotdeos

Especficos para H1N1 Pandmico em 2010 (IBMP) em relao aos resultados
previamente obtidos com o padro de referncia CDC2009. Resultado expresso em
nmero de amostras discordantes. (-)- nenhuma discordncia. ..............................45
xvi
Quadro 4.3: Resultados Discordantes Obtidos com os Oligonigleotdeos Especficos
para H1N1 Pandmico em 2010 (IBMP) em relao aos resultados previamente
obtidos com o padro de referncia CDC2009. Resultado expresso em nmero de
amostras discordantes. ............................................................................................45

obtidos com o padro de referncia CDC2009 . Resultado expresso em nmero de
amostras discordantes. ............................................................................................46

para H1N1 Pandmico em 2010 (IBMP) e 2009 (CDC) com o duplex H1N1/RNP
(H1N1 IBMP) e com os singleplex swH1N1 E swINFA (H1N1 CDC) realizados em
2009.Resultado expresso em nmero de pacientes discordantes. ...........................47

para H1N1 Pandmico em 2010 (IBMP) e 2009 (CDC) do duplex MP/RNP E
INFA+MP/RNP (MP IBMP, INFA+MP IBMP) e com o singleplex INFA (INFA CDC)
realizado em 2009. Resultado expresso em nmero de pacientes discordantes. ....48
Quadro 4.7: Resultados das trs extraes realizadas com 5 duplicatas das
amostras positivas com as mdias, desvios-padro (DESVPAD) E o coeficiente de
variao (CV) dos protocolos sugeridos. ...................................................................48
Quadro 4.8: Resultados obtidos com o oligonucleotdeo RNP nos testes realizados
entre as limpezas mecnicas sugeridas no protocolo descrito na metodologia, com
suas respectivas porcentagens. Amostra: tampes CCEB e meio de cultura SM. ...52
Quadro 4.9: Resultados obtidos com o oligonucleotdeo H1N1 nos testes realizados
suas respectivas porcentagens. Amostra: tampes CCEB e meio de cultura SM. ...52
xvii
Quadro 4.10: Resultados obtidos com os oligonucleotdeos H1N1/RNP e
MP/RNP no protocolo de teste realizado com pool positivo e alquotas de CCEB. Os
resultados esto expressos em Ct. ..........................................................................54
Quadro 4.11: Resultados obtidos com os oligonucleotdeos H1N1/RNP e MP/RNP

nos protocolos de testes realizados com pool positivo e negativo. A referida tabela
demonstra o resultado das quatro repeties propostas no protocolo detalhado
acima. Os resultados em vermelho indicam a amplificao de amostras negativas.
Os resultados esto expressos em Ct. ......................................................................55
Quadro 4.12: Resultados obtidos com os oligonucleotdeos H1N1/RNP e MP/RNP

no protocolo de teste nmero cinco preconizado acima e realizado com pool positivo
e alquotas de CCEB. Os resultados esto expressos em Ct. ..................................56
Quadro 4.13: Resultados obtidos nas 12 extraes realizadas no tpico 4.3, com as
respectivas amostras utilizadas e resultados obtidos. ..............................................57
Quadro 4.14: Condies de concentraes de MgSO4, dNTP, primers, sondas, Taq

polimerase(Taq) e Reverse transcriptase(RT) utilizadas nos testes realizados. ......58
Quadro 4.15: Resultados obtidos em PCR em tempo real realizado com as

condies de master mix descritas no quadro 4.14 com sondas no purificadas para
o oligonucleotdeo H1N1. Resultados expressos em Ct. Na condio 4 no houve
amplificao. Os resultados esto expressos em Ct. Em azul, a melhor condio
verificada entre todas apresentadas. .......................................................................56

condies de mster mix descritas no
quadro 4.14 com sondas no purificadas
para o oligonucleotdeo RNP. Resultados expressos em Ct. Na condio 4 no

houve amplificao. Os resultados esto expressos em Ct. Em azul, a melhor
condio verificada entre todas apresentadas. .........................................................59

condies de mster mix descritas No quadro 4.14 com sondas purificadas para o
xviii
oligonucleotdeo H1N1. Resultados expressos em Ct. Na condio 4 no houve
verificada entre todas apresentadas. ........................................................................59

condies de master mix descritas No quadro 4.14 com sondas purificadas para o
oligonucleotdeo RNP. Resultados expressos em Ct. Na condio 4 no houve
verificada entre todas apresentadas. ........................................................................60
xix
Resumo
O uso de mtodos moleculares tem sido apontado como uma das principais
ferramentas para o diagnstico de doenas infecciosas. Dentre as tcnicas
disponveis, a PCR em tempo real tem sido uma das mais amplamente utilizadas. A
partir dos achados das inmeras pesquisas desenvolvidas em virtude da epidemia
de Influenza A H1N1 em 2009, tal metodologia foi preconizada pelo CDC como
sendo a mais eficiente para a confirmao desta patologia na populao. A rpida
disseminao da epidemia de 2009, em territrio Brasileiro, evidenciou a
necessidade de adoo de uma alternativa de teste em mbito nacional, cujos
custos fossem mais compatveis com os recursos de que dispe o Sistema nico de
Sade (SUS). Esta dissertao buscou estabelecer um prottipo de produto para a
Vigilncia epidemiolgica de Influenza A H1N1 a partir de uma plataforma de PCR
em Tempo Real, visando contribuir para o estabelecimento de uma rede de
vigilncia epidemiolgica baseada em ensaios moleculares, com a definio de uma
matriz de extrao semiautomatizada e um equipamento para a realizao de PCR
em Tempo Real. Este trabalho foi desenvolvido por meio da comparao de
matrizes de extrao e de equipamentos de PCR em tempo real dos principais
fornecedores internacionais. A empresa que obteve a melhor avaliao segundo os
critrios descritos foi a Biotools, por ter apresentado uma proposta competitiva
quanto aos custos das plataformas e insumos necessrios, alm de um atraente
pacote de transferncia de tecnologia. Aps a definio dos equipamentos e
insumos, foi iniciada a aferio de um prottipo de modelo nacionalizado de
diagnstico. Em paralelo, buscou-se ainda a melhoria do desempenho do modelo
brasileiro, com a avaliao de diferentes composies da mistura de reao, tendo
sido tambm testadas regies genmicas diferentes daquelas do padro de
referncia para o diagnstico, alm da possibilidade do uso de sondas purificadas.
Com base nos resultados obtidos, observou-se que a extrao semiautomatizada e
aquela realizada pelo mtodo manual apresentam um padro semelhante de
eficincia. Tambm foi comprovada a capacidade de extrao do equipamento,
inclusive em diluies de amostra pura at uma concentrao de 1024 vezes, alm
da eficincia da purificao de sondas pela tcnica de HPLC (High-performance
liquid chromatography). Ficou evidenciada a equivalncia da reao de PCR em
tempo real desenvolvida pelo consrcio IBMP/Bio-Manguinhos quando comparada
reao de PCR em tempo real desenvolvida pelo CDC-EUA, considerado padro de
referncia para o diagnstico molecular de influenza A H1N1. Concomitantemente, o
modelo de equipamentos da Biotools(Labturbo/Liongene) oferece, como vantagens,
a possibilidade de eliminar a etapa manual de extrao indicada pelo protocolo do
CDC, e de agregar ao processo a realizao de uma extrao semiautomatizada, o
que facilita a execuo do protocolo e amplia o quantitativo de amostras que podem
ser examinadas a cada ciclo de trabalho.
xx
Abstract
Nowadays, molecular tools appear as the main alternatives for diagnosis of
infectious diseases. Among the available techniques, Real Time PCR (RT-PCR) has
been widely used, coupled to extraction matrices. In view of the findings obtained
from several researches conducted due to the Influenza A H1N1 epidemic, this
technique is considered by the CDC as the most efficient method to confirm this
pathology in an affected population. The rapid expansion of the 2009 epidemic in
Brazil evidenced the need of a nationalized alternative diagnostic option, without
requiring materials from international (foreign) suppliers, and that could be costeffective to Brazilian National Health System (SUS). The present work aimed at the
establishment of a product prototype that could meet such requirements. The choice
of an instrument setting based on the Real Time PCR (RT-PCR) platform contributes
to an epidemiological surveillance network of molecular assays, and enhances BioManguinhos participation in this field.Other factors that were taken into account
concern the economic viability of such instruments, as well as the respective
installation and validation protocols and clearance by the National Sanitary
Surveillance Agency (ANVISA). According to the aforesaid criteria, the best ranked
supplier was BioTools Company, which presented a competitive proposal for cost of
platform and consumables, as well as an attractive technology transfer proposal.
Different formulations of the reaction mixture were evaluated in order to improve the
test performance. It was found that the Real Time PCR (RT-PCR) assay developed
by the IBMP/Bio-Manguinhos consortium presented a better efficacy than that of the
CDC-USA, which is the reference standard for Influenza A H1N1 molecular
diagnosis. Furthermore, BioTools instruments, which were chosen for the tests, have
the advantage of eliminating the manual extraction step in the CDC protocol and
include a semi-automated extraction, which facilitates the performance and increases
the amount of samples processed (throughput of samples).
1. INTRODUO
1.1. Influenza
1.1.1. Estrutura do vrus
O vrus da Influenza (figura 1.1) pertence famlia Orthomyxoviridae, j tendo
sido isoladas diferentes linhagens dos subtipos A, B e C. Os Vrus da Influenza so
partculas envelopadas de RNA, segmentado, de fita simples e sentido negativo,
sendo os subtipos A e B mais relevantes em humanos, como agentes causadores
da doena. Dentre os trs, o Vrus da influenza A o que apresenta a maior
variabilidade e o maior potencial infeccioso. De fato, ele muito suscetvel a
alteraes morfolgicas, j que, no hospedeiro, forma uma populao heterognea
de pequenas partculas esfricas, cujo dimetro varia de 80 a 120 mm (Forrest e
Webster, 2010, McHardy,2009, Sullivan et al, 2009).
A estrutura e o funcionamento das protenas codificadas pelas 8 estruturas
genmicas j foram bem descritos na literatura. A exceo consiste no subtipo C,
que possui apenas 7 estruturas genmicas (Nicholson et al, 1998). O quadro 1.1
demonstra as diferenas entre os 3 subtipos de Influenza, bem como
os
mecanismos de evoluo gentica/antignica por eles utilizados. Os mecanismos de

Antigenic drift e Antigenic shift sero detalhados no item 1.1.3.
Quadro 1.1: Comparao entre os subtipos A, B e C do vrus influenza, em relao
a genoma, estrutura, hospedeiro, evoluo e caractersticas epidemiolgicas.
Genoma
Estrutura
Hospedeiro
Evoluo
gentica/antignica
Caractersticas
epidemiolgicas
Influenza A
8 segmentos
11 protenas
Humanos, sunos, equinos, aves, outros
mamferos marinhos e terrestres
Antigenic shift e drift
Causa epidemias
pandemias
Fonte: www.medicinanet.com.br/influenza
pode
causar
Influenza B
8 segmentos
11 protenas
Humanos,
mamferos
marinhos
Influenza C
7 segmentos
9 protenas
Humanos e sunos
Antigenic drift
Antigenic drift
Causa epidemias e no
causa pandemias
Sem sazonalidade
marcada
O genoma do vrus da influenza apresenta polaridade negativa, ou seja, a

fita de RNA complementar ao genoma que ser sintetizada na clula infectada que
desempenhar o papel de RNA mensageiro. Os segmentos de RNA genmico da
influenza A codificam as seguintes protenas: trs polimerases (PB1, PB2 e PA),
hemaglutinina (HA), nucleoprotena (NP), neuraminidase (NA), protenas da matriz
(M1) e canal inico (M2), e protenas no-estruturais (NS1 e NS2) (figura 1.1).
Figura 1.1: Estrutura do vrus da influenza, com a vizualizao das protenas hemaglutinina,
neuraminidade e M2(canal Inico), membrana, complexo da RNA polimerase e complexo de
nucleoprotena, alm de todos os genes (nmeros 1 a 8) que compes o vrus da influenza A e
B.Adaptado de Mchardy, 2009
O vrus da influenza A ainda subdividido de acordo com as caractersticas

estruturais e antignicas da HA e NA. So conhecidas, atualmente, 16 variantes de
HA e 9 de NA. A determinao da variante antignica da HA e da NA permite
caracterizar as diferentes cepas isoladas, sendo indicada por um nmero de 1 a 16,
3
aps a letra H, no caso da hemaglutinina; e por um nmero de 1 a 9, acompanhado
da letra N, para a neuraminidase (Nicholson et al, 1998).
A nomenclatura-padro do vrus inclui o gnero do vrus (gnero A), sua
origem geogrfica, o nmero da linhagem, ano e o subtipo da linhagem viral. Como
exemplo, por ter a linhagem de influenza A H1N1 causadora da pandemia de 2009
ter sido isolada na Califrnia, em meados deste mesmo ano, ficou designada
A/Califrnia/04/2009(H1N1) (Nicholson et al, 1998, McHardy,2009).
A natureza fragmentada do material gentico do vrus influenza induz a altas
taxas de mutao e a uma capacidade de realizar rearranjos, em especial, na fase
de replicao. Essas mutaes, que, em geral, so observadas nas duas
glicoprotenas de superfcie, a saber, a hemaglutinina e a neuraminidase, ocorrem
de forma independente e imprevisvel, e provocam o aparecimento de novas
variantes, dotadas da sua conhecida caracterstica de disseminao fcil e rpida
em populaes humanas. Essas mudanas podem ser pontuais, ou o seu advento
pode resultar da formao de uma nova linhagem, mediante mecanismos de
rearranjo (Forrest e Webster,2010)
1.1.2. Ciclo de replicao do vrus.

O ciclo de replicao do vrus da influenza se inicia a partir da entrada do
vrus no organismo hospedeiro humano, cuja principal via de ingresso costuma ser o
trato respiratrio. Sendo replicado no epitlio nasal e na faringe, o vrus, ao longo da
evoluo da doena, consegue infectar o trato respiratrio inferior e os brnquios,
alm dos alvolos pulmonares (Forrest e Webster, 2010, McHardy,2009, Sullivan et
al, 2010). O mecanismo que permite a entrada na clula consiste na ligao da
protena hemaglutinina ao cido silico, disponvel na membrana, e, em seguida, na
entrada deste no interior da clula, via um endossomo. O vrus Influenza humano
tem preferncia por resduos silicos, que esto ligados galactose mediante uma
ligao alfa2-6. Aps a adeso, com a endocitose pela clula hospedeira,
fundamental a liberao das riboncleoprotenas virais para o ncleo celular.
Entrando no ncleo celular, as subunidades da polimerase (PB1 e PB2) e a
nucleoprotena (NP) iniciam a replicao e a transcrio do RNA viral. A protena
PB1 atua por meio da catalisao da adio de nucleotdeos s cadeias de RNA,
enquanto que a PB2 responsvel pela ao da endonuclease, responsvel pela
4
gerao do iniciador utilizado para a sntese do RNAm. Devido incapacidade da
RNA polimerase de corrigir a fita que est sendo sintetizada, podem haver mutaes
pontuais. (Loureiro, 2004).
As protenas nucleares e as de matriz so exportadas para o citoplasma via
complexos ribonucleoproteicos, para a produo de novas partculas virais na
membrana. A liberao de partculas virais para outras clulas realizada e
facilitada pela protena neuraminidase, j preparada para a infeco de novas
clulas (Sullivan et al, 2010).
A sada do vrus da clula ocorre, ainda, por meio da hemaglutinina ligada ao
cido silico, sendo posteriormente clivada pela neuraminidase, que remove os
resduos de cido silico, possibilitando a infeco de novas clulas. Se, no
momento da formao da nova partcula viral, houver uma disponibilidade de genes
de mais de um subtipo de vrus influenza, poder ser observada a formao de um
novo vrus rearranjado, gerando uma nova linhagem. Aps a clivagem pela
neuraminidase, uma nova partcula viral est apta a recomear um novo ciclo em
uma nova clula, ou a ser expelida novamente pelo sistema respiratrio, infectando
outros indivduos (Sullivan et al, 2010) (figura 1.2).
Figura 1.2: Ciclo da replicao do vrus Influenza: A) o hospedeiro contaminado pelas vias areas.
B) o vrus adere clula, via cido silico. C) este sofre endocitose, entrando no citoplasma da clula.
D) liberao do RNA viral no citoplasma. E) o RNA viral entra no ncleo. F) O RNA transcrito. G)
Ocorre a formao de complexos de ribonucleopreotenas no citoplasma. H) Formao de uma nova
partcula viral. K) com a nova partcula viral formada, esta reinicia o ciclo em uma nova clula.
Loureiro, 2004
1.1.3. Mecanismos de variaes antignicas.
Os vrus da influenza esto sujeitos a dois tipos de variaes antignicas:

Antigenic drift e antigenic shift. As antigenic drift so variaes antignicas
menores, que ocorrem a cada 2 ou 3 anos no subtipo A, e a cada 5 ou 6 anos no
subtipo B. Estas variaes so devidas a mutaes pontuais nos segmentos do
genoma viral, que ocasionam a mudana de aminocidos nas glicoprotenas de
superfcie. As antigenic shift, ou rearranjo so variaes antignicas maiores, que
esto associadas substituio completa de um ou mais segmentos do material
6
gentico do vrus, geralmente nas reas que controlam a produo de
glicoprotenas de superfcie. Essas alteraes decorrem do reagrupamento entre o
vrus circulante em humanos e aquele que infecta outras espcies de animais,
gerando uma recombinao. Diante dos relatos sobre a ocorrncia de fenmenos de
antigenic shift, observa-se que a maioria da populao no possui imunidade para
novos vrus, o que leva rpida disseminao da doena, afetando indivduos de
todas as classes sociais e faixas etrias. As grandes pandemias resultaram de
variaes antignicas mais significativas, que acarretaram os episdios da gripe
espanhola (1918-1919), da asitica (1957) e da de Hong Kong (1968) (McHardy,
2009, Schnitzler, 2009) (figura 1.3).
Figura 1.3: Antigenic drift e antigenic shift , permitindo a vizualizao de pequenas mutaes( antigenic drift) e a
formao de novas cepas( antigenic shift).Do autor
As variaes antignicas so uma das caractersticas mais peculiares do

vrus da influenza. Ao final de seu ciclo, o vrus recm-formado precisa encapsidar
seus genes para sair da clula. Quando dois vrus influenza de linhagens diferentes
entram na mesma clula, o rearranjo um possvel mecanismo de atuao do vrus.
Seus genes se replicam no ncleo, e saem dele para o citoplasma para serem
encapsidados. Todos os 8 genes precisam entrar na nova partcula viral formada,
para que ela se torne infecciosa. Para tanto, cada gene possui uma sequncia sinal
que interage com a protena M1(MP-protena de matriz), conferindo a estrutura da
partcula do vrus influenza de todos os subtipos. Contudo, este sinal semelhante,
at mesmo em vrus distintos, e os genes de um podem ser empacotados em
7
conjunto com genes de outro, no fenmeno denominado de rearranjo (Loureiro,
2004).
Embora sejam diversas as possibilidades de rearranjo entre dois vrus,
apenas algumas combinaes geram vrus viveis, capazes de ser em transmitidos.
Dentre estas, algumas podem mesclar caractersticas entre os dois vrus de
linhagens distintas que sofreram rearranjo, permitindo, por exemplo, que um vrus
avirio adquira genes que possibilitem a sua replicao em humanos (Nicholson et
al, 1998).
Neste momento, o novo vrus recebeu novas Hemaglutinina e Neuraminidase,
inditas para o sistema imune e no reconhecidas por anticorpos, o que lhe confere
a capacidade de infectar mais pessoas e de escapar resposta imune montada por
vacinas prvias (Schnitzler, 2009).
Em 1918, o H1N1 avirio passou a circular, tanto em humanos quanto em
porcos, gerando linhagens distintas e presentes at hoje. Em 1997, um novo vrus
suno surgiu na Amrica do Norte, a partir de um triplo rearranjo, com uma
combinao de genes de Influenza humanos (H3N2 gerado em 1968), sunos e
avirios. Trata-se do H1N2 suno. Os porcos da Europa estavam virtualmente a
salvo de gripe at 1976, quando o H1N1 suno foi trazido em um carregamento de
porcos da Amrica do Norte; em 1979, este foi rapidamente substitudo por um
H1N1 avirio (Nicholson et al, 1998).
Na figura 1.4, fica demonstrada a formao da nova linhagem de influenza A
H1N1, com a formao do recombinante qudruplo, pois continha genes PB2 e PA
provenientes da infeco ocorrida em 1998, gene PB1 da pandemia de 1968, genes
HA, NP e NS da linhagem norte-americana de 1918, e genes NA e MA provenientes
da protena de matriz gerados pela linhagem eurasiana de 1979.
Figura 1.4: Figura que ilustra a formao da nova linhagem de influenza A H1N1, com a constituio
do recombinante qudruplo, pois continha genes PB2 e PA provenientes da infeco ocorrida em
1998, gene PB1 da pandemia de 1968, genes HA, NP e NS da linhagem norte-americana de 1918 e
genes NA e MA originrios da protena de matriz provenientes da linhagem eurasiana de 1979.
adaptado de Garten et al.
1.1.4. Epidemiologia e Histrico das pandemias causadas pelo

vrus Influenza A H1N1.
As doenas respiratrias atingem a humanidade desde 412 A.C, e o primeiro
relato de tais patologias remonta a descries de Hipcrates, pai da medicina. Ao
longo da antiguidade, surtos de influenza foram registrados em diversos momentos,
inclusive durante a Guerra do Peloponeso. O histrico detalhado de epidemias de
doenas respiratrias se inicia nos anos de 1173-1174, com a descrio clara dos
sintomas apresentados, embora no haja registros de que este surto tenha se
tornado uma pandemia. Ao longo dos sculos 14,15 e 16, existem relatos vagos de
surtos, inclusive de alguns ocorridos durante a Guerra dos Cem Anos, cujo
detalhamento, no entanto, no nos fornecido pelas fontes histricas. A partir do
9
sculo 18, cresce a quantidade de informaes sobre a influenza e, no inicio do
sculo 20, comea a haver uma profuso de trabalhos e estudos sobre o tema.
(Nicholson et al, 1998).
O incio do histrico das infeces recentes por Influenza A pode ser datado
de 1918, com a transmisso de um vrus de origem aviria para humanos, gerando o
desencadeamento de uma pandemia que, segundo estimativas, teria dizimado mais
de cinqenta milhes de pessoas. Cabe destacar que a maioria dos bitos ocorreu
durante a segunda onda da epidemia, mais precisamente entre os anos de 1919-20,
pela ao de um vrus que apresentava mutaes derivada de sunos. Esta teoria foi
comprovada em estudos posteriores, realizados em ratos. (Nicholson et al, 1998).
Em 1957, foram observados rearranjos, como o da influenza A H1N1,
gerando uma nova linhagem denominada H2N2, que foi derivada de uma espcie de
H1N1, originrio de aves. Em 1968, ocorreu na China, mais especificamente em
Hong Kong, uma epidemia com um novo subtipo de vrus, denominado H3N2.
Rapidamente essa linhagem foi responsvel pela epidemia que se espalhou por todo
o sudeste asitico. Em 1976, a linhagem H1N1 reemergiu, e causou uma epidemia
nos Estados Unidos, embora tenha se verificado que este vrus no conseguiu se
disseminar na populao em geral, estabelecendo-se apenas em um quartel em
Nova Jersey, onde foi relatada uma morte. Observa-se que, desde 1977, as
epidemias sasonais tm apresentado uma alternncia entre o vrus da influenza A
H1N1 e a linhagem H3N2 (Nicholson et al, 1998).
Em 1998, em uma populao de sunos da Amrica do Norte, foi identificada
uma linhagem dotada de uma combinao tripla de genes virais, com origem em
linhagens diversificadas. Esta linhagem continha 5 segmentos clssicos da influenza
suna H1N1, embora tambm inclusse genes da polimerase oriundos de aves e de
humanos. O primeiro caso de infeco em humanos causada por essa linhagem foi
relatado em 2005, atingindo uma adolescente de 16 anos que haviatido contato com
sunos em uma fazenda em Wisconsin, nos EUA. Em relao aos outros 10 casos
relatados, as investigaes sempre apontaram que os pacientes haviam travado
contato com sunos (Nicholson et al, 1998).
Em abril de 2009, o CDC confirmou comunidade cientfica internacional dois
casos de mortes causadas por uma doena respiratria acompanhada de febre, no
sul da Califrnia, nos EUA. Nesta mesma poca, foram notificados bitos no Mxico
(Provncias de Veracruz e Potos), com sintomatologia anloga, por infeco pelo
10
vrus da influenza, do subtipo A, de linhagem H1N1, e cujos genes da linhagem
suna circulavam entre porcos desde 1999. Ainda no decorrer da confirmao dos
casos, verificou-se que nenhuma das duas pessoas mortas na Califrnia havia tido
contato anterior com porcos, o que evidenciou a capacidade de transmisso entre
humanos. A linhagem de influenza A H1N1 acima relatada possua a combinao de
6 segmentos de genes da combinao tripla recombinante suna que circulava
desde 1999, alm de mais 2 genes derivados da linhagem eurasiana da influenza A
H1N1 (Sullivan et al 2009, www.cdc.com/flua).
As pandemias ocasionadas pelo vrus da influenza ocorrem com certa
regularidade, embora apresentem uma variao em seu grau de intensidade. As
epidemias e pandemias da influenza iniciam-se de forma rpida e inesperada, e
atingem seu pico em duas ou trs semanas, com uma durao total de 5 a 8
semanas. So fenmenos de rearranjos como os descritos anteriormente que deram
origem aos vrus causadores da maioria das pandemias de gripe. Em 1957, um
evento de rearranjo com um vrus avirio forneceu novas hemaglutinina e
neuraminidase que permitiram ao vrus promover uma infeco mais intensa, na
chamada gripe Asitica. Em 1968, novamente em um rearranjo, o vrus adquiriu uma
nova Hemaglutinina aviria, e causou a Gripe de Hong Kong (Nicholson et al, 1998).
Em 2008, o triplo rearranjado circulante em porcos na Amrica do Norte
tornou a se rearranjar com o vrus suno H1N1 da Eursia. Ainda no se sabe se
este evento ocorreu em porcos ou em humanos. O mais provvel que tenha
atingido humanos, pois ainda no encontramos porcos contaminados. Em abril de
2009, uma nova linhagem H1N1 foi detectada em casos relatados na Califrnia, e,
algumas semanas depois, houve a exploso da epidemia, cujo incio foi oficialmente
confirmado no Mxico. O vrus foi identificado como semelhante ao que circulava em
sunos. Foi aventada a possibilidade da contaminao de seres humanos, em uma
fase inicial, em fazendas de criao de sunos no norte do Mxico. Esse processo
teria evoludo para a pandemia, exigindo, assim, uma rpida resposta da
comunidade cientfica, inclusive em relao aos diagnsticos (Schnitzler, 2009).
A maioria dos casos de Influenza A H1N1 com a mutao observada em 2009
apresenta uma sintomatologia parecida com outras linhagens de influenza, como
tosse, dor no corpo, acompanhado de febre em alguns casos. A transmisso ocorre
sob 3 formas distintas: exposio por contato com pessoa infectada, por aerossis
ou por partculas que possuam contaminao, como a saliva. A contribuio de cada
11
uma das vias acima mencionadas sofre variaes, varia dependendo de fatores
como, por exemplo, distncia em relao s pessoas infectadas, alm das
condies de temperatura e umidade.
O quadro de superinfeco caracterizado por uma pneumonia grave,
podendo evoluir ao bito. Em geral, a hospitalizao de pacientes somente se
justifica diante de uma pr-condio existente, como asma, obesidade mrbida,
gravidez e patologias, que, de alguma maneira, possam debilitar o sistema
imunolgico da paciente. No Mxico, os casos fatais foram estimados em 0,4 % dos
pacientes infectados, muito prximo ao nmero verificado no Brasil. Atualmente, a
mortalidade causada pelo vrus Influenza A H1N1 e pelas linhagens sazonais est
relacionada a esses mesmos percentuais (Schnitzler, 2009).
A estimativa acerca do perodo de incubao do vrus da influenza de 1 a 7
dias. O vrus pode ser transmitido desde o primeiro dia de infeco at 1-2 dias aps
o encerramento da apresentao dos sintomas. Estudos recentes demonstram que
80 % dos pacientes portam o vrus por 5 dias, 40 % por 7 dias e 10 % por 10 dias
(Perez-Padilha et al, 2009).
A maioria dos casos ocorre em adultos jovens, com idades entre 12 e 17
anos, embora as infeces mais graves sejam, em sua maioria, relatadas em faixas
etrias mais elevadas e, principalmente, em idosos (Perez-Padilha et al, 2009).
O Brasil foi um dos pases mais afetados em nmero de casos em 2009.
Segundo um boletim epidemiolgico do Ministrio da Sade, at 1 de agosto de
2009, haviam sido notificados 17.277 casos suspeitos de influenza, dentre os quais
apenas 2.959 foram confirmados pela tcnica de PCR em tempo real 2.959. Houve
confirmao de casos em 1049 municpios do Brasil, assim como um nmero
registrado de 96 bitos (BRASIL, 2010), conforme demonstrado no mapa pelos
pontos em vermelho (figura 1.5).
12
Figura 1.5: Distribuio dos casos de H1N1 durante a epidemia. Situao em agosto de 2009.
http://flutracker.rhizalabs.com/flu/by_status_and_num.html. Legenda: Em laranja, casos confirmados; Em
vermelho, bitos confirmados.
1.2. Diagnstico de influenza.
O diagnstico da influenza deve ser o mais preciso possvel, devido

similaridade entre essa patologia e outras causadas por vrus que afetam o sistema
respiratrio. Embora a administrao da terapia antiviral dependesse da confirmao
do diagnstico, nos casos de pandemia, em que as ferramentas diagnsticas
disponveis no eram suficientes, o tratamento tinha de ser iniciado aps a simples
verificao dos sintomas.
A seguir, passam a ser apresentadas as possibilidades diagnsticas mais
freqentes para a confirmao de infeco pela influenza.
13
1.2.1. Isolamento viral

As amostras coletadas para o isolamento viral devem ser inoculadas em ovos
embrionados ou clulas MDCK (Madin-Darby Canine Kidney). Os materiais clnicos
preconizados so swabs nasofarngeos, lavado nasal ou traqueal, ou amostra de
tecido pulmonar no caso da morte do animal (WHO, 2002), embora o efeito
citoptico (ECP) seja de difcil visualizao ao microscpio em clulas MDCK. Sete
dias aps a inoculao, ou assim que for observado um eventual ECP, deve-se
coletar o sobrenadante, e realizar o teste de hemaglutinao.
O isolamento viral tambm pode ser realizado em ovos, para propiciar
aumento da concentrao de vrus disponveis. So utilizados trs ovos por amostra,
inoculando-se 0,1 mL do material na cavidade alantica, na amnitica, ou em ambas
(figura 1.6). Sete dias aps a inoculao, realizada a coleta do lquido alantico
e/ou amnitico, ambos sendo testados para a deteco da presena do vrus, por
meio da prova de hemaglutinao (Figura 1.6).
,
Figura 1.6: foto de isolamento do Vrus influenza em ovo.
Loureiro,2004
1.2.2. Outras possibilidades diagnsticas.
O diagnstico sorolgico deve ser empregado, sempre que possvel, para

complementar o isolamento, adquirindo uma extrema relevncia em casos onde no
14
tiverem sido coletados materiais clnicos para o isolamento, ou onde o laboratrio
no dispuser dos equipamentos necessrios para tanto (WHO, 2002).
O teste de inibio da hemaglutinao (HI) utilizado para duas finalidades: a
caracterizao antignica das amostras isoladas, e a deteco da presena de
Anticorpos contra o vrus da influenza. O uso do HI para o diagnstico sorolgico
realizado em duas etapas. Primeiramente o vrus hemaglutinante misturado ao
anticorpo, onde caso esse seja especfico ir se ligar e inibir sua capacidade de
aglutinao. Posteriormente adiciona-se o soro do paciente e se os anticorpos
inibirem a reao num determinado momento, o vrus identificado. A diferena
consiste na utilizao do soro que se deseja pesquisar sobre a presena de
anticorpos, em vez dos soros hiperimunes, e um vrus- padro, em vez daquele que
havia sido isolado.
Na hemlise radial simples (SRH), antgenos virais so misturados a
hemcias de carneiro fixadas em agarose contendo fatores de complemento de
cobaia. Os soros testados so adicionados em poos feitos na agarose, e os
anticorpos anti-influenza, atuando em conjunto com o complemento, iro lisar as
hemcias, formando um halo claro ao redor do poo, que pode ser medido em mm2
(WHO, 2002).
No teste de hemaglutinao, o vrus previamente inoculado em ovos
retirado e colocado em conjunto com um concentrado de hemcias. Em caso de
positividade da reao, haver a formao de um precipitado, passvel de ser
observado a olho nu. Ressalta-se que autores no consideram esse tcnica um
diagnstico sorolgico, j que no h a formao de um complexo antgenoanticorpo.
possvel ainda o uso de testes rpidos para influenza, que funcionam com a
deteco da nucleoprotena viral e informa resultados em at 30 minutos. Porm
estes possuem baixa sensibilidade e podem gerar resultados falsos negativos ou
no diferenciar entre as linhagens de Influenza A H1N1.
15
1.2.3. Diagnstico molecular.

1.2.3.1 Histrico de tcnicas moleculares.
H mais de 60 anos, a comunidade cientfica tem trabalhado no
aperfeioamento de tcnicas mais eficientes para o diagnstico de doenas. O
advento
da
biologia
molecular trouxe
novas
perspectivas
no
mbito
do
desenvolvimento tecnolgico de ensaios, como, por exemplo, a identificao de

vrus e bactrias e a quantificao destes patgenos. Desde a descoberta da
estrutura do cido nuclico, tem se avanado no ramo das metodologias capazes de
realizar a deteco de material gentico em diversos tipos de tecidos e fluidos. Ao
longo desse processo, foi observada a capacidade de utilizao das tcnicas de
biologia molecular como ferramenta de diagnstico capaz de ser sensvel e eficiente.
Dentre as tcnicas desenvolvidas na rea de diagnstico, a reao em cadeia da
polimerase (PCR) tem se consolidado, nos ltimos 20 anos, como uma das
ferramentas mais utilizadas e promissoras (Csako, 2006, Ratcliff et al, 2007).
Para a realizao de um diagnstico molecular, devemos contar com um
conjunto que contemple a maior eficincia possvel de extrao e a preciso
necessria para deteco de cidos nuclicos. A utilizao de sistemas de PCR em
tempo real, em conjunto com um sistema de extrao eficiente, possibilitam a
realizao destas reaes, assegurando a eficincia e a acurcia aludidas acima
(Yeh et al., 2009).
As tcnicas de extrao de cidos nuclicos e sua posterior utilizao
avanaram consideravelmente, tendo evoludo desde os primeiros mtodos com
solventes orgnicos e cloreto de clcio, at a extrao por matrizes de fase slida
dos dias atuais, que pode ser realizada por meio da adoo de metodologias
diversas (Berensmeier, 2006, Wen et al., 2008).
Concomitantemente a isso, a PCR em Tempo Real tambm avanou e
permitiu o aumento de sensibilidade, reprodutibilidade e especificidade dos ensaios
de diagnsticos moleculares, graas ao desenvolvimento de ensaios qualitativos e
quantitativos (Yeh et al., 2009). A PCR em tempo real baseada no mtodo de PCR
convencional desenvolvida por Kary Mullins, nos anos 80, que permitiu a
amplificao de pequenas quantidades de DNA (Mullins & Faloona, 1987). As
estratgias de pesquisa baseadas em metodologias derivadas do PCR permitiram
avanos na biologia molecular (Csako, 2006, Buckingham e Flaws,2007).
16
A PCR convencional consiste em uma reao em que o cido nuclico
submetido a diferentes temperaturas e tempos variveis, denominados ciclos. Este
processo determinado por trs etapas: desnaturao do cido nuclico,
anelamento dos primers e extenso da cadeia. Na etapa de anelamento, deve-se
sempre ter como base o Tm (melting temperature) dos iniciadores, temperatura que
determina que 50 % dos oligonucleotdeos iniciadores na reao encontram-se
anelados a sua seqncia alvo. Essas etapas ou fases iro se repetir, de acordo
com o nmero de ciclos necessrios. Os resultados de PCR convencional so
visualizados em um gel (agarose ou acrilamida) onde so avaliadas as amplificaes
(Mullins & Faloona, 1987).
A PCR em Tempo Real tem como principais caractersticas o fato de tratar-se
de um mtodo quantitativo e/ou qualitativo, que possibilita a reduo do tempo para
a obteno do diagnstico, graas eliminao de etapas posteriores ao
processamento dos ciclos de reao, como a visualizao em gel de agarose
(Higuchi et al, 1992, Cikos e Koopel, 2009). Porm, existem algumas desvantagens
como, por exemplo, o custo dos equipamentos e dos reagentes envolvidos. Tendo
em vista os aspectos acima enumerados, esse mtodo baseado no sistema
TaqMan, apresenta inmeras vantagens em relao ao PCR convencional, dentre
as quais se destacam a reduo no tempo de processamento, o aumento na
especificidade de reao, na sensibilidade, e a possibilidade de realizao de
ensaios
quantitativos
por
meio
da
comparao
com
curva-padro
com
concentraes previamente estabelecidas (Lee et al,1993, Livak et al, 1995,

Freeman et al, 2000, Csako, 2006).
1.2.3.1.1 Tcnicas Moleculares

As tcnicas de biologia molecular esto sendo cada vez mais usadas, e a
reao em cadeia da polimerase (PCR) o mtodo mais empregado como
ferramenta diagnstica. Porm, com a evoluo para a PCR em tempo real, este
vem sendo substitudo ( Vernet, 2004).
Diversos protocolos foram desenvolvidos, com variaes em relao ao
mtodo de extrao do material gentico, concentrao de reagentes e as
condies de ciclagem trmica. A regio a ser amplificada est diretamente
17
relacionada com os iniciadores utilizados na reao, tornando muito relevante a
escolha destes para uma boa sensibilidade e especificidade da reao.
Normalmente so utilizados iniciadores especficos para o gene que codifica a
glicoprotena hemaglutinina (Fouchier et al, 2000).
Existem outros protocolos de RT-PCR que detectam outros genes, que no a
hemaglutinina. Fouchier e colaboradores (2000) desenvolveram um trabalho,
mostrando a possibilidade de detectar infeces por qualquer subtipo do vrus
influenza, em qualquer espcie animal, por meio da identificao do gene M, que
altamente conservado. Entretanto, no possvel determinar o subtipo do vrus.
Para
diagnstico
de
rotina,
Organizao
Mundial
da
Sade recomenda que a deteco e a determinao do subtipo sejam realizadas

pelas tcnicas de hemaglutinao (HA) e inibio da hemaglutinao (HI). Porm, o
uso das novas tcnicas moleculares para a deteco direta do vrus na amostra
clnica, facilitou a rpida identificao e caracterizao gentica dos vrus (WHO,
2002).
Um diagnstico dotado de um grau elevado de acurcia fundamental para o
incio da terapia antiviral e para o estabelecimento de polticas de sade pblica.
Whiley e colaboradores em 2009 desenvolveram uma possibilidade de diagnstico
usando a metodologia de PCR em Tempo Real baseado no sistema TaqMan, onde
os alvos para o anelamento dos iniciadores seriam os genes da hemaglutinina e a
neuraminidase especficas da linhagem circulante. A diferenciao entre as
linhagens circulantes A, B e C e as do subtipo Influenza A H1N1 fundamental para
a rapidez e eficincia do diagnstico.
1.2.3.1.2. Sistema Taqman

Dentre as possibilidades de sistemas de PCR em tempo real, o sistema
TaqMan o mais utilizado, sendo composto por um par de iniciadores e uma
sonda interna ao fragmento que ser amplificado, onde se situa um fluorforo
reporter na extremidade 5 e um quencher na extremidade 3. Neste momento, a
sonda encontra-se em equilbrio. A sonda TaqMan (especfica para o gene de
interesse) marcada duplamente com um corante reprter em uma extremidade e
18
um corante silenciador na outra. No estando anelado ao alvo, a transferncia
de energia fluorescente (fenmeno FRET) ocorre de modo a que a emisso pelo
reprter seja absorvida pelo silenciador. Quando a sonda encontra-se hibridizada ao
alvo e degradada pela enzima Taq DNA polimerase, durante a PCR, os corantes
reprter e silenciador so separados, e a emisso de fluorescncia do reprter no
ser mais absorvida pelo silenciador, o que conduz a um aumento de emisso de
fluorescncia pelo reprter, que a cada ciclo de reao ser detectada e
quantificada.(figura 1.7)(Lee et al, 1993; Livak et al 1995, Bustin, 2000).
Figura 1.7: Sistema TaqMan: A) Desnaturao das fitas do cDNA. B) Anelamento dos iniciadores
Foward e Reverso e da sonda marcada com um silenciador (quencher) na ponta 3 e um reporter na
extremidade 5, especficos para a regio alvo a ser amplificada. Neste momento a sonda encontra-se
em equilbrio (Fenmeno FRET). C) Extenso da regio alvo. Ocorre a eliso da sonda pela enzima
Taq DNA polimerase, resultando na separao dos corantes reprter e silenciador com subseqente
emisso de fluorescncia do reprter, gerando assim um aumento de emisso de fluorescncia, sendo
esta detectada. Poersch, 2007.
Quando no h a extenso da regio alvo, a sonda permanece ntegra,

ocorrendo a Transferncia de Energia por Ressonncia de Fluorescncia (FRET) do
fton, que liberado pelo fluorforo para molcula quencher, acarretando o bloqueio
desta emisso no sistema. medida que a enzima Taq DNA polimerase com
atividade exonuclesica 5-3, estende a cadeia e encontra a sonda, que
sequncia-especfica, e,
portanto
hibridizada
ao
alvo,
promove
quebra
19
exonuclesica (eliso) da mesma, separando o fluorforo do quencher e
permitindo, assim, a liberao da fluorescncia, com a gerao do sinal de
amplificao. A fluorescncia aumenta a cada ciclo, sendo proporcional
quantidade de produto amplificado (Lee et al, 1993; Livak et al 1995).
O sistema TaqMan permite o desenvolvimento de ensaios multiplex, graas
possibilidade de acoplamento de diferentes fluorforos a diferentes sondas. Com
efeito, eles emitem fluorescncias em comprimentos distintos de onda, tornando
vivel a deteco diferenciada de cada alvo, e relacionando-os com a fluorescncia
especfica. Vale salientar que o equipamento de PCR em Tempo Real deve dispor
dos filtros (emisso e deteco) compatveis com as fluorescncias escolhidas, alm
de lmpadas (diodo, branca, laser, etc) para excitao e cmara CCD e/ou
fotomultiplicadores para deteco.
O resultado da PCR em Tempo Real gerado em um grfico, onde
representado o acmulo de fluorescncia pelo tempo ou nmero de ciclos da reao
(Ct - Ciclo Threshold) (Figura 1.8). Este o ciclo (Ct) onde a fluorescncia
detectada de uma determinada amostra intercepta a linha de threshold acima do
background de fluorescncia (Mackay et al., 2002), ou seja, inicia a fase
exponencial, permitindo uma quantificao exata e reprodutvel do nmero inicial de
cidos nuclicos presentes na amostra (do material amplificado) (Lee et al, 1993;
Livak et al 1995).
.
Fluorescncia Normalizadada reporter (Rn)
20
Caractersticas do grfico Real Time
0.90
0.80
Y=X(1+e)
0.70
Amostra
baixa CV
Plateau
Alta CV
Log [DNA]
0.60
Rn
0.50
0.40
Threshold
0.30
0.20
Geometric
Baseline
Y=X2
nControle
sem Template
0.10
Cycle #
0.00
0
10
Nmero de ciclos PCR
15
20
25
CT
30
35
40
Fase Linear
CT inversamente proporcional a concentrao de DNA

Figura 1.8: Modelo esquemtico de um resultado de PCR em Tempo Real em escala linear, onde
fica visualizada a linha do threshold e o baseline (indice de fluorescncia basal da reao).Do Autor.
Os dados brutos gerados em uma reao de PCR em tempo Real devem ser
exportados em formatos compatveis, para anlises em programas-padro como, por
exemplo, o Excel, o que oferece, assim, uma gama maior de possibilidades na
anlise dos resultados. A padronizao das anlises garante um resultado mais
preciso e real, confirmando a credibilidade desta tecnologia, e consolidando-a no
cenrio de tcnicas de diagnstico molecular.
1.3. Situao da Influenza A H1N1 no Sistema nico de Sade.
O Instituto Oswaldo Cruz atua como Laboratrio de Referncia Nacional para

Influenza, credenciado pelo Ministrio da Sade, e integra, h mais de 50 anos, a
rede da Organizao Mundial da Sade (OMS) de centros nacionais de influenza. A
rede nacional de laboratrios de vigilncia em influenza tambm integrada pelo
Instituto Adolfo Lutz (SP) e pelo Instituto Evandro Chagas (PA), que figuram como
Laboratrios
de
Referncia
Regional
do
(http://www.fiocruz.br/ccs/cgi/cgilua.exe/sys/start.htm?
Ministrio
da
Sade
infoid=2531&sid=9).
manejo dos pacientes requer aes especficas de biossegurana e cuidados com a
21
sade, que geram impactos diretos sobre o atendimento fornecido pelo Sistema
nico de Sade (SUS).
Uma resposta laboratorial precisa e rpida certamente favorecer os usurios
deste sistema, possibilitando, ainda, a organizao de informaes e dados que
permitiro uma melhor compreenso epidemiolgica da doena. Segundo um
boletim epidemiolgico do Ministrio da Sade, foram processadas, de abril de 2009
de fevereiro de 2010, 73.121 amostras com suspeita de influenza A H1N1 pela
tcnica de PCR em tempo real, tendo sido confirmada a positividade de 28.256
dentre elas (Brasil, 2010). Em relao ao nmero de bitos, at o dia 20 de fevereiro
de 2010, foram contabilizadas 2091 mortes em decorrncia da Influenza A H1N1 nos
anos de 2009/2010.
Durante os anos de 2009 e 2010, ficou evidenciada a ineficincia do,
fornecimento de insumos pelos fabricantes, o que gerou transtornos na entrega de
resultados necessrios ao monitoramento da infeco. Nos meses de julho e agosto
de 2010, uma amostra levava at 3 meses para ser processada, dando ensejo a um
clima de ansiedade na divulgao dos resultados e a um aumento do pnico da
populao. Acrescente-se a isso que os produtos oferecidos internacionalmente
para este diagnstico, tanto pelo CDC quanto por empresas privadas, no possuem
registro junto aos rgos competentes de vigilncia sanitria (ANVISA e FDA). Estes
produtos,
conforme
recomendaes
dos
fabricantes
devem
ser
utilizados
exclusivamente em pesquisas, pois so fabricados sem o atendimento s Boas

Prticas de Fabricao (BPF) e certificao necessria.
A situao observada por ocasio da pandemia de H1N1 motivou a tomada
de atitudes, tanto na rea diagnstica quanto na teraputica. No Brasil, os testes de
diagnstico para o vrus Influenza A H1N1 pandmico eram totalmente dependentes
do mercado internacional. Alguns dos insumos utilizados nestes testes so doados
pelo Centers for Disease Control and Prevention (CDC) ou adquiridos de empresas
privadas, o que deixa vulnervel o Estado brasileiro, frente s oscilaes de custo e
de oferta destes produtos, alm das dificuldades em assegurar padres de
qualidade dos ensaios in house, na execuo e resultados destes testes. Durante a
pandemia de 2009, a confirmao dos casos suspeitos de influenza A H1N1 era
realizada por cultura viral ou por PCR em tempo real, embora o tratamento j fosse
22
administrado em algumas faixas etrias, independentemente do diagnstico
confirmado de infeco pela linhagem descrita acima.
Na poca, ainda se questionou que o modelo de diagnstico por PCR em
tempo Real desenvolvido pelo CDC apresentava falhas, e que outros desenhos de
alvos moleculares comeavam a ser descritos na literatura, como alternativa ao
modelo estabelecido e utilizado.
Foi diante da percepo do cenrio mencionado acima que Unidades da
Fundao Oswaldo Cruz, em parceria com o IBMP (Instituto de Biologia Molecular
do Paran), resolveram instituir uma fora-tarefa para o desenvolvimento de um
diagnstico nacional, capaz de modificar esta situao em curto e mdio prazo. Este
teste diagnstico nacional apresentar certas caractersticas como, por exemplo:
sua produo em condies de BPF, sua oferta aos Laboratrios Centrais de Sade
Pblica (LACENS) juntamente com os equipamentos que compem uma plataforma
tecnolgica semiautomtica, com formao e capacitao de recursos humanos,
alm de assistncia tcnica e cientfica. Tais condies aprimorariam a competncia
tcnica destes laboratrios, assim como a qualidade e a quantidade de diagnsticos.
Esse sistema nacionalizado poder ser utilizado pelos Laboratrios, tambm
em perodo ps-pandemia, para o diagnstico de outros agravos, tais como:
Dengue, Febre Amarela, Hepatite C (HCV), Hepatite B (HBV), Leishmaniose,
Doena de Chagas, Hantavirose, Ricketisiose, Leptospirose e outros. O consrcio
formado pela Fiocruz/Bio-Manguinhos e IBMP j vem trabalhando em um sistema de
diagnstico molecular para diferentes agravos, sob condies padronizadas e de
BPF, e cujo baixo custo permita a sua incorporao e disponibilizao ao SUS,
promovendo, assim, a equidade entre os usurios deste sistema.
O presente trabalho buscar estabelecer um prottipo de produto para
Vigilncia epidemiolgica de Influenza A H1N1 com base na plataforma de PCR em
Tempo Real, visando consolidar a atuao de Bio-Manguinhos no referido projeto
tecnolgico e ainda, contribuir para o estabelecimento de uma rede de vigilncia
epidemiolgica baseada em ensaios moleculares.
23
1.4. Atuaes de Bio-Manguinhos no cenrio nacional

Em relao realidade da sade publica brasileira, o diagnstico e as
notificaes de doenas tm se apresentado como uma barreira de difcil superao,
pois o cenrio nacional no propicia a realizao do diagnstico e a correta
comunicao de ocorrncias, e nem as possveis aes envolvidas no combate dos
problemas relatados.
Uma rede nacional de vigilncia epidemiolgica padronizada e dotada de
insumos nacionalizados poderia facilitar esse trabalho, aumentando seu escopo de
atuao. Por outro lado, a diversidade de tipos de ensaios in house existentes no
permite a padronizao dos resultados obtidos, impedindo, assim, a obteno do
verdadeiro retrato da situao nacional.
Desde a dcada de 80, Bio-Manguinhos tem atuado no fornecimento de
reativos para diagnstico em aes conjuntas com o Ministrio da Sade. Possui um
papel estratgico, j que, em muitos casos, esta Instituio a nica a fornecer
ferramentas diagnsticas para determinadas patologias.
No atual mbito do desenvolvimento em Reativos para Diagnstico, BioManguinhos vem atuando em testes moleculares baseados na plataforma de PCR
em Tempo Real, como Kit NAT multiplex HIV/HCV, Carga Viral HIV e HCV e ensaio
qualitativo para Dengue, e, com isso, vem agregando conhecimento e capacitao
tecnolgica para padronizao de seus ensaios moleculares, em consonncia com
as mais modernas tecnologias de diagnstico existentes.
Bio-Manguinhos j obteve a transferncia de tecnologia da enzima Taq DNA
polimerase e tampo de reao para PCR em Tempo Real, podendo contribuir para
a produo nacionalizada de ensaios/kits diagnsticos para diferentes patgenos,
com base nesta tecnologia, gerando a possibilidade de responder mais
eficientemente, com menor custo e em menor tempo s demandas que lhe forem
apresentadas pelo Ministrio da Sade.
Podemos ilustrar a importncia da atuao do Desenvolvimento Tecnolgico
de Reativos para Diagnstico de Bio-Manguinhos pelo exemplo da partcula
calibradora (Patente da Fiocruz), que pode ser processada como controle interno
e/ou controle positivo. Trata-se de partculas virais mimticas (VLP Virus Like
Particle), e biosseguras, por no possurem as protenas do envelope viral do HIV
responsveis pela interao com a clula CD4. Sendo assim, estas partculas
24
mimticas no possuem capacidade replicativa, sendo obtidas por transfeco,
em um ciclo nico. So capazes de monitorar todas as etapas do processo,
validando, assim, cada reao isoladamente. Caso o CI (controle interno) de uma
dada reao esteja fora da faixa aceitvel de sua anlise, somente esta reao ser
invalidada, sendo necessria sua repetio em uma prxima rotina.
No Brasil, imperioso o desenvolvimento de ensaios moleculares que
possibilitem a vigilncia epidemiolgica na populao, e cujos custos e
equipamentos sejam adequados realidade do parque tecnolgico instalado e s
unidades de sade disponveis.
Um dos objetivos do presente trabalho consiste em lanar as bases para que
a FIOCRUZ (Bio-Manguinhos e IBMP) possa produzir kits para o diagnstico da
influenza A H1N1, atendendo aos requisitos das Boas Prticas de Fabricao (BPF)
e, como conseqncia, contribuir para o estabelecimento de uma rede de vigilncia
epidemiolgica com nfase em diagnstico molecular, mtodo este que ser
estratgico para as aes de sade pblica coordenadas pelo Ministrio da Sade.
A referida rede poderia vir a tornar-se uma ferramenta de diagnstico, com
vrias aplicaes nas mais diversas patologias de interesse para a sade publica
brasileira. Com o objetivo de alcanar um melhor aproveitamento desta rede, j
esto sendo desenvolvidos kits para dengue, malria, leishmaniose, dentre outras
doenas. .
O desenvolvimento do presente trabalho foi possibilitado pela organizao de
um fluxograma para a avaliao das possveis fornecedores de equipamentos e
insumos, onde foram avaliados aspectos
fundamentais a
um processo de
transferncia de tecnologia no mbito do poder publico federal, a saber: custos,

operao dos equipamentos, facilidade de utilizao pelo usurio, tempo de uso e
agregao de conhecimento matriz tecnolgica, e a gama de possibilidades de
mtodos diagnsticos oferecidos pela unidade.
25
2. OBJETIVOS
2.1. Objetivo Geral

Estabelecer um prottipo de produto, e definir um conjunto de equipamentos
com base na plataforma de PCR em Tempo Real para diagnstico de Influenza A
H1N1, com a finalidade de contribuir para a formao de uma rede de vigilncia
epidemiolgica por meio do uso de ensaios moleculares.
2.2. Objetivos Especficos

Avaliar diferentes regies genmicas conservadas do vrus da influenza A
H1N1, e verificar a possibilidade de formao de um duplex para a reao de PCR
em tempo real, onde possam ser adaptadas e padronizadas no modelo proposto de
prottipo de produto com base na plataforma de PCR em Tempo Real, com o melhor
resultado possvel;
Identificar e analisar metodologias automatizadas ou semiautomatizadas de
extrao de cidos nuclicos, testando aquelas que forem disponibilizadas pelas
empresas;
Identificar e analisar equipamentos de PCR em Tempo Real, testando aqueles
que forem disponibilizados pelas empresas;
Definir critrios para a formao da matriz de deciso, referentes a custo,
assistncia tcnica, propriedade intelectual, rastreabilidade, sensibilidade e facilidade
de execuo do mesmo;
Definir um protocolo-padro de PCR em Tempo Real, dotado de insumos
nacionalizados, e que apresente um desempenho igual ou superior ao protocolo
tradicional desenvolvido pelo CDC/USA.
26
3. MATERIAL E MTODOS
.
3.1. Sistemas de extrao e PCR em tempo real para a adaptao de

um ensaio molecular.
Este trabalho foi realizado com a adaptao de possveis modelos de ensaios
moleculares baseados na tcnica de PCR em Tempo Real para Influenza A H1N1,
comparando estas demandas com os dados j existentes na bibliografia cientfica
internacional e a avaliao de custo-benefcio desta proposta de modelo de
equipamentos de extrao e PCR em Tempo Real e insumos/reagentes para
posterior comparao com o modelo estabelecido pelo CDC (Schnitzler, 2009).
Foi analisado qual o grau de sensibilidade e processos dos mtodos de
extrao e, ainda, foram levados em conta os pacotes de protocolos de instalao e
validao dos equipamentos, alm de registro na ANVISA (Agncia Nacional de
Vigilncia Sanitria) e uma anlise econmica e tcnica de viabilidade. Essas bases
so fundamentais para minimizar a dependncia tecnolgica e evitar amarras que
impossibilitem a incorporao dos processos envolvidos.
Com objetivo de trazer mais confiabilidade ao trabalho em termos de
sensibilidade e especificidade, foi definido como alvo da reao regio genmica
mais conservada, baseando-se na bibliografia disponvel e em comparao de
seqncias de Influenza A H1N1 isolados em diversas regies demogrficas,
inclusive do Brasil, e de diferentes tipos e subtipos, em bancos de dados como ex:
GeneBank.
O projeto Nacionalizao da Produo de Insumos para o Diagnstico
Molecular da Influenza A H1N1 e Estruturao de Rede Piloto de Diagnstico
Molecular e Vigilncia Epidemiolgica Voltados para a Sade Pblica, foi aprovado
em Agosto/2009. Em Dezembro de 2010, foi publicada a portaria TC 104/2009, que
liberou recursos para o projeto para a Fiocruz. No mesmo ms, foi assinado, entre a
Fiocruz e o IBMP, o contrato 45/2009, no valor de R$ 1.547.700,00 para
financiamento do projeto. Em Janeiro de 2010, para dar incio ao projeto e anlise
de viabilidade de um sistema semi-automatizado, que inclua plataformas de
27
extrao e deteco para testes moleculares, foi elaborada uma Matriz de Anlise,
tendo sido determinados alguns critrios a serem empregados na escolha dos
equipamentos. Os critrios estabelecidos para a aquisio dos equipamentos foram
os seguintes: Transferncia de Tecnologia para produo dos insumos (excludos
plsticos e ponteiras), Rastreabilidade da amostra, Software/Sistema aberto de
Integrao entre as Plataformas, Equipamentos com Certificao IVD e Certificao
GMP e Desempenho tcnico.
Alm dos parmetros mencionados na portaria acima referida, foram
acrescentados itens ao modelo escolhido. O fluxograma de aes abaixo (figura 3.1)
representa as aes envolvidas nesta dissertao. Foram avaliadas as regies alvo
conservadas, mtodos e equipamentos de extrao e PCR em tempo real, alm de
insumos para a reao de PCR em tempo real. Para isso foram avaliadas as
questes de propriedade intelectual, alm da rastreabilidade, sensibilidade, custo,
assistncia tcnica e facilidade para o manuseio dos equipamentos. Segue abaixo,
ilustrativamente, a cadeia de aes que foi analisada para a tomada de decises.
28
Figura 3.1: Fluxograma da cadeia de aes para desenvolvimento de ensaio molecular. Foram
avaliadas as regies alvo conservadas, mtodos e equipamentos de extrao e PCR em tempo real,
alm de insumos para a reao de PCR em tempo real. Para isso foram avaliadas as questes de
propriedade intelectual, alm da rastreabilidade, sensibilidade, custo, assistncia tcnica e facilidade
para o manuseio dos equipamentos Fonte: Do autor
3.2. Origem e quantidade de amostras utilizadas.
As amostras utilizadas neste trabalho foram cedidas pelo Laboratrio de Vrus

Respiratrios do Instituto Oswaldo Cruz (IOC) /Fiocruz e pelo Laboratrio Central do
estado do Paran, a identificao das amostras clnicas e RNA eram desconhecidas
e estas so amostras da epidemia de 2009.
Foram utilizadas 116 amostras de RNA obtidas no laboratrio de vrus
respiratrios do Instituto Oswaldo Cruz (IOC)/Fiocruz e 203 amostras do Laboratrio
29
central do estado do Paran. Estas amostras consistiam em RNA extrado pelos
mtodos de extrao manual, que sero posteriormente citados, a partir de amostras
de aspirado nasal obtidas por Swab e conservadas em meio de transporte.
Adicionalmente foram processados pool de amostras positivas e negativas,
onde foram utilizadas amostras clnicas confirmadas pela reao de PCR em tempo
real (protocolo CDC) realizada pelo Laboratrio Central do Estado do Paran.
3.3. Sistemas de Extrao avaliados

Dentre as diversas metodologias de extrao testadas, destacam-se a
extrao por partculas de slica e aquela por beads magnticos. Essas
metodologias vm se mostrando consolidadas no mercado, como as alternativas
mais viveis para o fornecimento em escala compatvel com o tamanho do projeto,
que possam ser padronizados e implementados em uma rede nacional de vigilncia
epidemiolgica molecular (Wen et al., 2008).
Seguem, na tabela abaixo, as possibilidades de fornecedores com seus
equipamentos e metodologias que foram analisadas neste trabalho (quadro 3.1).
Empresa
Sim
Sim
Sim
Sem possibilidade
de uso de cdigo
de barras
Sem possibilidade
de uso de cdigo
de barras
Applied
Beads
Sensibilidade
Biosystem magnticos
Partculas
Sensibilidade
de slica
Assistncia tcnica
36 amostras no Brasil ainda
falha
Qiagen
Biotools
Magmax
QiaCube
Labturbo
36
12
At 96
12
16
Nmero
Amostras
200 ul
140 ul
200 ul
200 ul
300 ul
Volume
amostra
80-200 ul
10 ul
80-130 ul
25 ul
20-300 ul
Volume
eluio
Tipo de Facilidade de
execuo
amostra
Qualquer
tecido
biolgico
Sangue
total e
plasma
Sangue
total,
60 minutos
plasma e
aspirado
Sangue
total ,
90 minutos plasma e
aspirado
nasal
60 minutos
60 minutos
Simples
execuo,
PCR setup
integrado
Simples
execuo
Simples
execuo
Manual, difcil
execuo
Sangue
total,
40 minutos plasma e Sem avaliao
aspirado
nasal
Tempo
Quadro 3.1: Matrizes de possibilidades automticas e semiautomatizadas de extrao, com suas respectivas metodologias e informaes analisadas.
Partculas
de slica
No
Sim
Sem possibilidade
de uso de cdigo
de barras
Manuseio
complexo
+ rpido
Beads
magnticos
Automao
Desvantagens
BioMerieu
Beads
Sensibilidade
x
magnticos
Vantagens
Mtodo
MiniMag
Maxwell 16 Promega
Modelo
30
31
Conforme apresentado, o presente trabalho tem como um de seus objetivos
a avaliao dos potenciais candidatos a matrizes de extrao de cidos nuclicos,
levando em conta as possibilidades de transferncia de tecnologia para IBMP/BioManguinhos, sua facilidade de execuo, tempo de processo, seu potencial de
recuperao do material extrado, seu custo e capacidade para prestao de servios
de assistncia tcnica em territrio nacional. Foram analisadas as seguintes
metodologias / equipamentos:
3.3.1. Extrao manual
As extraes manuais dos RNAs utilizados na dissertao, cedidas pelo

Laboratrio de Vrus Respiratrios do Instituto Oswaldo Cruz (IOC) /Fiocruz e pelo
Laboratrio Central do estado do Paran, foram realizadas com o Kit PureLink Viral
DNA/RNA Kits do fabricante Invitrogen, e com o Kit Qiamp Viral RNA mini Kit da
fabricante Qiagen, a partir de 200 uL de aspirado nasal, seguindo as instrues do
fabricante, e com volume de eluio de 80 ul. Ambos so utilizados no protocolo
preconizado pelo CDC.
3.3.2. Maxwell16(Promega)
O Maxell16 um sistema automatizado capaz de extrair cidos nuclicos de

diferentes tipos de amostras. O equipamento processa 16 amostras, com o volume
inicial de 300 ul em aproximadamente 15 a 40 minutos, dependendo do tipo de
amostra e plataforma utilizadas (figura 3.2).
O Maxwell16 pode ser configurado para eluio de diferentes volumes
utilizando as seguintes plataformas: Lev (Low elution volume) para eluio de
volumes entre 20-100L e Sev (Standart elution volume) para volumes de at 300L.
O sistema para purificao das amostras baseado em partculas
paramagnticas (PMPs), que permanecem numa fase slida mvel para capturar as
partculas virais; em seguida, ocorrem lavagens e, por fim, a eluio do material
desejado.
32
Figura 3.2: Equipamento de extrao Maxwell16 da empresa Promega.www.promega.com
3.3.3.. NucliSens miniMAG (BioMerieux)
nucliSens
semiautomatizado
base
miniMAG
segunda
gerao
de
um
sistema
de isolamento de cidos nuclicos de amostras clnicas, com
na tecnologia de extrao a partir de beads magnticos, possibilitando a
anlise de 12 amostras em um nico procedimento. Esta metodologia pode ser

acoplada a diferentes mtodos de amplificao, e possui etapas manuais (figura 3.3).
Figura 3.3: Equipamento de extrao NucliSens miniMAG da empresa BioMeiriux www.Biomerieux.com
33
3.3.4. MagMax (Applied Biosystems)
O MagMax um sistema de extrao automatizada, cuja
tecnologia se
baseia na extrao por beads magnticos. Ele possibilita a extrao de 96 amostras

a cada rodada, facilitando o fluxo de trabalho dos tcnicos, e, nesse trabalho, o
respectivo protocolo foi utilizado segundo as instrues do fabricante (figura 3.4).
Figura 3.4: Equipamento de extrao MagMax da empresa Applied Biosystems.www.

Appliedbiosystems.com
3. 3. 5. QIAcube (Qiagen)
O QIAcube uma estao de trabalho para extrao semiautomatizada,

que possui capacidade para a extrao de 12 amostras, e elimina etapas manuais
capazes de comprometer o desempenho da extrao. Foi utilizado o protocolo
segundo as instrues do fabricante (figura 3.5).
Figura 3.5: Equipamento de extrao QIAcube da empresa QIAGEN.www.qiagen.com
34
3.3.6 Labturbo(BioTools)
O Labturbo 36c, fabricado pela empresa taiwanesa Taigen e comercializado
pela espanhola BIOTOOLS, um equipamento de extrao semiautomtica,
baseado na tcnica de coluna de extrao com partculas de slica para a extrao
de cidos nuclecos, que, alm da extrao, agrega a capacidade de incorporao da
etapa de PCR Setup, sendo um diferencial na manipulao das amostras para
diagnstico.
Esse equipamento tem capacidade de extrair 36 amostras em uma hora e
trinta minutos, tanto de plasma, quanto de aspirado nasal, sendo um aparelho de fcil
utilizao pelo operador. Apresenta programas que permitem a extrao de 200 a
500 uL de amostras dos referidos matrias biolgicos citados acima (figura 3.6).
A extrao realizada no equipamento Labturbo seguiu as especificaes
determinadas pelo fabricante, e partiu de 200 ul, especfico para amostras de
aspirado nasal. Esse equipamento, com o uso desse programa, efetua 24 extraes
a partir de 200 ul de aspirado nasal, gerando em cada uma das extraes 80 ul de
RNA disponveis para amplificao. Padronizou-se um programa especfico para o
processamento de 24 amostras de 200 ul de aspirado nasal.
Para aumentar a eficincia de extrao nos casos de utilizao do aspirado
nasal, o fabricante recomenda a realizao de uma etapa de solubilizao prvia das
amostras com o tampo de extrao, a saber, fora do equipamento em questo, e
antes da colocao das amostras no equipamento. Inicia-se com a colocao de 200
uL de tampo de lavagem e 200 uL de amostra em um microtubo de 1,5 mL
devidamente identificado. Aps este procedimento, agita-se em aparelho de vortex
por 5 segundos e aguarda-se 10 minutos. A Soluo posteriormente transferida
para o tubo de extrao especifico do equipamento e colocada na posio
determinada pelo usurio na maquina. Aps a colocao no equipamento, inicia-se o
programa, com as seguintes etapas: etapa de lise, etapa de lavagem das colunas e
etapa de eluio (sendo estas realizadas com auxlio de uma bomba de vcuo
acoplada ao equipamento), com sua posterior transferncia para um tubo
devidamente
identificado
onde
esse
RNA
ficar
armazenado.
Aps
esse
procedimento de extrao, efetua-se a descontaminao do equipamento por luz

ultravioleta, durante 30 minutos.
35
O procedimento de limpeza e descontaminao do equipamento consiste
no uso de hipoclorito de sdio diludo a 2 % em gua, para a limpeza mecnica das
partes e seu interior. Esse procedimento segue a recomendao do fabricante.
Aps analisar todas as possibilidades de extrao descritas neste tpico, foi
escolhido o Labturbo para compor a matriz diagnstica a ser definida na dissertao.
O detalhamento dos motivos ser discutido nos resultados apresentados.
Figura 3.6: Equipamento de extrao LabTurbo 36 C, da Fabricante BioTools.www.biotools.com
3.4 PCR em tempo real Protocolo IBMP/Bio-Manguinhos.

As sequncias dos iniciadores e sondas infA (sonda especfica para influenza
sazonal) e RNP (gene constitutivo da RNAse P) so as mesmas preconizadas pelo
CDC para a realizao da vigilncia do vrus H1N1 pandmico (Quadro 3.2). Os
iniciadores e sondas H1N1(sonda especfica para influenza pandmica H1N1), HA
(hemaglutinina), NA (neuraminidase) e MP(M1) (gene da proteina de matriz) foram
desenhados pela equipe do IBMP, com base nas sequncias dos vrus de Influenza
A sazonal e H1N1 pandmico, depositadas no GeneBank, sendo as sequncias do
CDC
GACCRATCCTGTCACCTCTGAC
AGGGCATTYTGGACAAAKCGTCTA
5FAM TGCAGTCCTCGCTCACTGGGCACG BHQ1 3
GCACGGTCAGCACTTATYCTRAG
GTGRGCTGGGTTTTCATTTGGTC
5FAM CYACTGCAAGCCCATACACACAAGCAGGCA 3BHQ
GTGCTATAAACACCAGCCTYCCA
CGGGATATTCCTTAATCCTGTRGC
5FAM CAGAATATACATCCRGTCACAATTGGARAA BHQ1 3
AGA TTT GGA CCT GCG AGC G
GAG CGG CTG TCT CCA CAA GT
5HEX TTC TGA CCT GAA GGC TCT GCG CG BHQ1 3
IBMP
GACCRATCCTGTCACCTCTGAC
AGGGCATTYTGGACAAAKCGTCTA
5FAM TGCAGTCCTCGCTCACTGGGCACG 3BHQ1
AGACCAATCYTGTCACCTCTG
CATTYTGGACAAAKCGTCTACG
5FAM TCCTCGCTCACTGGGCACGGT BHQ1 3
GACATATGTTAACATCAGCAACACCAACT
TTGTCTTTACTGTATATAGCCCATCCACTAAC
5FAM GCTGGACAGTCAGTGGTTTCCGTGAA BHQ1 3
AGA TTT GGA CCT GCG AGC G
GAG CGG CTG TCT CCA CAA GT
5HEX TTC TGA CCT GAA GGC TCT GCG CG BHQ1 3
36
conjunto de oligonucleotdeos (primers e sondas) de H1N1 e NA especficas para
uma regio do gene da neuraminidase do H1N1 pandmico, as de HA especficas
para uma regio do gene da hemaglutinina do H1N1 pandmico, e as de M1
especficas para uma regio do gene da matriz dos vrus Influenza
3.5 Oligonucleotdeos e sondas

Visando padronizar os ensaios duplex para o Kit de H1N1, foram realizados testes
com diferentes conjuntos de oligonucleotdeos e sondas, testados pelo grupo do IBMP.
Abaixo, segue a lista das seqncias padronizadas para a proposta de prottipo de kit:
RNAse P
Hemaglutinina
na
Nucleoprote
Matriz
Matriz
Gene
RNP R
RNP F
H1N1 R
H1N1 F
SwinfA R
SwinfA F
MP R
MP F
InfA R
InfA F
Iniciadores
RNP
H1N1
SwinfA
MP
InfA
sonda
Quadro 3.2: Sequncias dos iniciadores Foward (F) e Reverse (R) e sondas dos oligonucleotdeos usados
neste trabalho. Todas esto colocadas na direo 53 Sondas: H1N1- sonda especfica para influenza
pandmico, SwINFA- sonda especfica para influenza sazonal, MP- sonda especfica para gene da protena de
matriz e RNP- Sonda especfica gene RNAseP. (-) significa que no utiliza essa sonda em sua combinao para
diagnstico. Conjunto de oligonucleotdeos usados no trabalho.
37
38
3.6 Protocolo de PCR em tempo real

A tcnica de Transcrio reversa seguida da PCR em Tempo real o mtodo
mais sensvel para a deteco e a quantificao de RNA. A incorporao da enzima
RT a uma etapa prvia da reao de PCR, definida como PCR em uma nica etapa
(one step PCR), acarreta a otimizao do tempo de processamento do ensaio.
Geralmente, usado um oligonucleotdeo a partir da regio 3 do RNA como
iniciador da reao de RT, que ser o mesmo usado na reao seguinte de PCR,
como oligonucleotdeo reverso, em adio ao oligonucleotdeo direto (foward). A
ciclagem de PCR em tempo real padronizada para o ensaio de influenza A H1N1
composta de um ciclo nico a 47oc por 30 minutos para a transcrio reversa de
RNA em cDNA (DNA complementar), seguidos de um nico ciclo e 95oc por 7
minutos, e de 40 ciclos de 95oc por 20 segundos, seguidos de 55oc por 60 segundos
Segue, abaixo, tabela com o quantitativo necessrio e suas respectivas
concentraes (quadro 3.3) para cada reao padro de PCR em tempo real, no
protocolo estabelecido no prottipo de kit IBMP/Bio-Manguinhos (H1N1/RNP e
MP/RNP):
Quadro 3.3: Concentraes necessrias para uma reao de PCR em tempo real
padronizada neste trabalho na proposta de produto efetuada no trabalho. Todos os
insumos usados so oriundos da transferncia de tecnologia da empresa BioTools
para o IBMP.
REAGENTE
Tampo 10X + Taq DNA Polimerase
Enzima RT 100X
Conjunto de oligonucleotdeos
RNA
Volume final
CONCENTRAO FINAL
1X
1X
0,4 uM primers / 0,2 uM sondas
---
VOLUME
12,5 ul
0,25 ul
2 ul
10 ul
25 ul
Foram testados dois equipamentos de PCR em tempo real, ABI 7500 e

LionCube para a amplificao/deteco das amostras de RNA obtidos. Para ambos a
ciclagem, reao e volume de RNA eram iguais.
39
3.6.1 ABI 7500
Para o desenvolvimento da tese, foi utilizado para todas as anlises o

equipamento ABI 7500, que se encontra no Laboratrio de tecnologia diagnstica
(LATED). A linha do threshold foi padronizada no valor de 1.0, com limite de deteco
para todos os oligonucleotdeos citados at o Ct 35, estabelecendo como parmetros
preliminares de anlise os valores de threshold. O cut off expressa a linha de corte
no ciclo de amplificao mximo permitido para a deteco no equipamento de PCR
em tempo real, especfico para este ensaio padronizado.
3.6.2 LionCube
Foi utilizado, durante as pesquisas para a tese, o equipamento LionCube( da

fabricante espanhola BioTools), que se encontra no Laboratrio de tecnologia
diagnstica (LATED). Para todas as anlises, foi utilizada a linha do threshold no
valor de 6.0, com limite de deteco para todos os oligonucleotdeos citados at o ct
36, estabelecendo como parmetros preliminares de anlise os valores de threshold.
O cut off expressa a linha de corte no ciclo de amplificao mximo permitido para a
deteco no equipamento de PCR em tempo real, especfico para este ensaio
padronizado.
3.7. Controles da reao

A proposta de produto consiste em iniciadores e sondas estabelecidos pelo
IBMP, insumos de RT-PCR obtidos atravs da transferncia de tecnologia com a
empresa Biotools para o IBMP, alm de um controle positivo e um negativo, cuja
finalidade baseia-se em avaliar todo o processo, desde a etapa de extrao at a de
amplificao. Os controles devem ser considerados como amostras desde o incio
40
do teste e devem ser processados em todas as corridas, sendo processados 200
uL de cada controle em uma rotina.
O controle positivo consiste em um armored RNA, tambm conhecido como
RNA encouraado ou ainda protegido, contendo sequncias- alvo para a
deteco especfica de vrus subtipo H1N1 e do vrus Influenza A Esse Armored
RNA composto por um fago que pode ter sua seqncia alterada conforme o
interesse do ensaio, com a adio de alvos especficos de interesse em cada
reao.
O controle negativo da reao composto pelo fago em questo sem a
seqncia de interesse. Para a validao dos testes, o resultado da amplificao do
controle positivo deve ser positivo para as sequncias relacionadas neste produto.
Ainda est em fase de anlise a definio de uma faixa esperada de Ct.
Acrescenta-se ainda que foram usados como controles negativos para a
execuo dos experimentos descritos nos resultados meios de cultura SM(Tris-HCL,
NaCl e gelatina), tampo de eluio da coluna de extrao (CCEB Column clean
elution buffer), pool de amostras sabidamente negativas testadas em PCR em tempo
real pelo protocolo CDC, alm de gua RNAse FREE. Ainda foi usado o NTC (no
template control), que vem a ser os insumos da reao de PCR, mais a substituio
da amostra por gua RNAse FREE. Em virtude de sua natureza, era esperada a
ausncia de amplificao dessas amostras.
3.8 Protocolo H1N1 CDC

O protocolo do CDC foi utilizado pelo Laboratrio de Vrus Respiratrios do
Instituto Oswaldo Cruz (IOC) /Fiocruz e pelo Laboratrio Central do estado do Paran
como padro para as comparaes o prottipo de kit Brasileiro,est disponvel no site
abaixo:
O protocolo do CDC utilizado como padro de referncia consiste em um
ensaio de RT-PCR onde a reao de PCR em tempo real realizada com 4 alvos em
reaes separadas (single) onde estes detectam regies da influenza pandmica
(SwInfA), influenza sazonal (InfA), a regio da hemaglutinina da influenza pandmica
(SwH1) e o gene da RnaseP (RNP). Esse protocolo deve ser realizado com
secrees respiratrias e aspirado nasofarngico ( quadro 3.4).
Segundo protocolo do CDC, recomenda-se o uso da enzima invitrogen
superScript III platinum e seu tampo, com equipamentos de amplificao da Applied
41
Biosystem e da BioRad. Para a extrao de cido nuclico, recomendou-se o uso
de kits de extrao manual da Invitrogen ou Roche.
A reao de PCR em tempo real realizada com um ciclo de 50c por 30
minutos para a transcrio reversa, seguido por um ciclo de 95c por 2 minutos e 45
ciclos de amplificao de PCR de 95c por 15 seg e 30c por 55 seg.
Quadro 3.4: reagentes e volumes necessrios para a realizao da reao de PCR

em tempo real conforme protocolo CDC.
Reagente
gua RNAse FREE
Iniciador foward 40 uM
Iniciador reverse 40 uM
Sonda 10 uM
Taq polimerase
2X Master Mix PCR
Volume Final
Concentrao / reao
N x 5,5 ul
N x 0,5 (1 uM)
N x 0,5 (1 uM)
N x 0,5 (0,25 uM)
N x 0,5
N x 12,5
N x 20,0
Legenda: N- Nmero de reaes.
A figura 3.7 ilustra um comparativo dos equipamentos, insumos de extrao e

insumos de PCR em tempo rela utilizado no protocolo preconizado pelo CDC e pela
proposta de produto Bio-Manguinhos/IBMP.
Figura 3.7: Descrio dos equipamentos utilizados, insumos de extrao e de RT-PCR dos
protocolos preconizados pelo CDC e IBMP. Fonte: Do autor.
42
4. RESULTADOS
4.1 Matriz de definies para os Equipamentos

Os equipamentos foram analisados quanto capacidade da empresa em
atender aos critrios relacionados na figura 3.1, tais como: sensibilidade,
rastreabilidade, custo, simples execuo dos procedimentos, capacidade de
processamento e assistncia tcnica em nosso pas, e suas particularidades em
termos de deslocamentos, o que sintetiza todas as necessidades de Bio-Manguinhos
para poder fornecer um sistema completo ao Ministrio da Sade.
Cinco empresas foram consultadas e convidadas a apresentar propostas, a
saber: Applied Biosystem, Biotools, Biomeuriex, Promega e Qiagen, conhecidas
mundialmente nesta linha de equipamentos, e que mantm representantes no Brasil.
Dentre essas empresas, duas no ofereciam plataformas de deteco e nem se
pronunciaram quanto transferncia de tecnologia, enquanto que a terceira no
preenchia qualquer dos critrios (estabelecidos no quadro 3.1 da metodologia). Dentre
as duas empresas restantes, a companhia que obteve melhor avaliao segundo os
critrios acima descritos foi a Biotools, que apresentou proposta competitiva quanto
aos custos das plataformas e insumos necessrios, alm de um atraente pacote de
transferncia de tecnologia (Quadro 4.1). Desta forma, as plataformas escolhidas
foram:
Termociclador: LionCub - Marca Biotools
Extrao: Labturbo 36 Compact System Marca Biotools).
Alm dos aspectos acima relatados, o equipamento Labturbo 36 Compact
System
apresentou
uma
caracterstica
tcnica
de
grande
relevncia,
que
desempenhou um papel primordial para a sua escolha: a capacidade de realizar, no

prprio equipamento de extrao, o setup da reao de PCR e das amostras para a
No respondeu
Sim
No respondeu
Sim
extrao
extrao +
setup
extrao
extrao +
setup
Biomerieux
Biotools
Promega
Qiagen
Sim
Sim
Sim
Sim
No
Rastreabilidade
No
IVD
No
Sim, software flexvel
Sim
ISO 13485
BR no
Sim
Sim. Eles no informam se o

ISO 13485
software est includo
No
Sistema de Integrao
Sim
No
No
Sim
No
BPF
10,72
15,81
RotorGene Q (5
plex HRM) - em
andamento CE-IVD
9,86
8,15
9,35
Valor R$ Equipos +
Insumos/200.000 r
No possui
LionCube
- sem IVD
No possui
ABI 7500 - sem IVD
Mdulo de
Deteco
Transferncia de tecnologia.
Quadro 4.1: Resumo das informaes prestadas pelas empresas participantes, e dos critrios determinantes observados. Legenda: IVD- In vitro diagnostic,
BPF- Boas prticas
de fabricao, ISO- Internacional Organization for Standardization, BR-Brasil.Legenda:r-reaes; Transf. De tec-
No
extrao +
setup
Applied
Biosystems
Transf. de Tec.
Funo
Empresa
Critrios analisados
43
reao. Este procedimento minimiza o tempo de processamento, diminuindo as
possibilidades de contaminao e de falha humana durante as reaes.
44
A partir deste momento, foi dada continuidade ao desenvolvimento do prottipo
de produto para o diagnstico da Influenza A H1N1. Dentre as diversas atividades
empreendidas e as repetidas rodadas de testes com nmero e tipos variados de
amostras, realizamos estudos com os insumos/reagentes brasileiros (tampes de
extrao, master mix com Taq DNA Polimerase, enzima reverse transciptase),
comparando o seu desempenho com o de produtos equivalentes que compem o
modelo preconizado pelo CDC. Buscamos, ainda, a melhoria do desempenho do teste,
com a avaliao de diferentes formulaes da mistura de reao (alterando as
concentraes dos sais, enzimas, iniciadores e sondas, bem como as temperaturas da
reao). Esses resultados so apresentados, em detalhes, nos tpicos que seguem.
4.2 Nacionalizao de insumos
4.2.1. Avaliao das reaes SINGLE e MULTIPLEX de H1N1, HA, NA,

INFA, M1 E RNP
Foi utilizado RNA previamente extrado de 116 amostras coletadas durante a
pandemia de 2009, processadas e analisadas pelo Laboratrio de Referncia em
Doenas Respiratrias do IOC (Instituto Oswaldo Cruz). Esse ensaio tinha por objetivo
avaliar os reagentes desenvolvidos e produzidos pelo IBMP com reaes singleplex
para a vigilncia epidemiolgica de H1N1 pandmico, e a comparao entre os
resultados obtidos com o protocolo preconizado pelo CDC e executado pelo
Laboratrio de Referncia em Doenas Respiratrias do IOC, durante o ano de 2009.
Novas alquotas das mesmas amostras relatadas acima foram extradas pelo
equipamento Labturbo, conforme protocolo detalhado na metodologia.
78 RNAs positivos para H1N1, 19 RNAs positivos para Influenza A (INFA)
sazonal ( sem determinao de subtipo) e 19 RNAs negativos para H1N1 e Influenza
A sazonal extrados durante o ano de 2009 com o kit Qiamp Viral RNA Mini Kit
(Qiagen) foram submetidas a reao de PCR em tempo real. Cada amostra foi
submetida a seis reaes singleplex de amplificao, sendo elas: H1N1(iniciador para
a influenza A pandmica), HA (gene da hemaglutinina), NA (neuraminidase), INFA
45
(iniciador para a influenza A sazonal), MP (gene da protena de matriz) e RNP (gene
humano RNAseP).
Por meio da mesma metodologia descrita acima (Kit Qiamp Viral RNA Mini Kit
Qiagen), tambm foi realizado o PCR em tempo real para os modelos de duplex
propostos. Foram processados 57 RNAs positivos para H1N1, 16 RNAs positivos para
InfA sazonal e 14 RNAs negativos para H1N1 e InfA sazonal extrados durante o ano
de 2009 com o kit Qiamp Viral RNA Mini Kit (Qiagen). Cada amostra foi submetida a
trs reaes singleplex e, tambm a reaes duplex e triplex de amplificao, sendo
elas: H1N1/RNP,MP/RNP, INFA+MP/RNP.
Neste primeiro momento, foram testados os oligonucleotdeos e sondas NA,
H1N1, HA e os duplexs NA+H1N1, HA+NA+H1N1 e HA+NA, todos desenhados pelo
IBMP, testados frente ao modelo H1N1 CDC. Evidenciou-se que houve 24 % de
discordncias em relao aos desenhos preconizados pelo IBMP (quadro 4.2).
Quadro 4.2: Resultados Discordantes Obtidos com os Oligonucleotdeos Especficos
obtidos com o padro de referncia CDC2009.Resultado expresso em nmero de
amostras discordantes. (-) nenhuma discordncia.
Total de
Amostras
H1N1
CDC
NA
IBMP
H1N1
IBMP
HA
IBMP
NA + H1N1
IBMP
HA + NA +
H1N1 IBMP
116
10
14
HA +
NA
IBMP
4
Total
28
O quadro 4.3 demonstra que ocorreram discordncias em relao aos

desenhos preconizados pelo IBMP em 31 % de amostras quando comparado ao
modelo
preconizado
como
padro.
Os
testes
foram
realizados
com
os
oligonucleotdeos INFA e MP e o duplex INFA+MP, todos desenhados pelo IBMP, e

testados frente ao oligonucleotdeo INFA CDC.

obtidos com o padro de referncia CDC 2009. Resultado expresso em nmero de
Total de
Amostras
116
INFA CDC
M1 IBMP
INFA IBMP
INFA + M1 IBMP
Total
18
18
16
36
46
Foi feita a reao com o oligonucleotdeo RNP (quadro 4.4), sintetizado pelo
IBMP, frente ao oligonucleotdeo RNP CDC. O resultado demonstra que houve 1,7%
de discordncias em relao ao desenho preconizado pelo IBMP.

obtidos com o padro de referncia CDC2009 . Resultado expresso em nmero de
Total de
Amostras
116
RNP IBMP
RNP CDC
Total
Mediante os resultados apresentados onde foi possvel observar um ganho no

tempo de processamento e a diminuio do nmero de amostras discordantes quando
utilizado o ensaio no formato duplex. A bibliografia disponvel corrobora com esta
estratgia. Mediante a resposta obtida, foi formatada a possibilidade de uso de
ensaios duplex em busca de um melhor resultado na deteco da influenza pandmica
Os ensaios de validao do formato Duplex do teste trazem duas importantes
vantagens: a diminuio do numero de reaes de quatro para duas por paciente, e a
realizao concomitante das reaes de deteco e controle em um mesmo tubo. Tais
procedimentos tinham como objetivo trazer mais confiabilidade ao teste, gerando a
possibilidade do controle da reao em tempo real, simultaneamente ocorrncia da
reao do diagnstico.
4.3 Padronizaes de ensaios Duplex

Estes resultados, apresentados a seguir, obtiveram uma avaliao satisfatria
durante a anlise da proposta de kit Brasileiro. Neste momento, foi decidido que o
primeiro protocolo de validao deveria ser efetuado j na plataforma completa
adquirida para o projeto, e que os resultados discordantes seriam analisados pelos
dois protocolos. Vale ainda salientar que, no mesmo perodo, foram avaliados a
reprodutibilidade das reaes desenhadas para o teste Brasileiro e os controles para
as reaes de identificao dos alvos moleculares de influenza includos no projeto,
47
com a utilizao da metodologia de armored RNA, desenvolvida pela equipe do
IBMP/ICC/PR. Mediante resultados obtidos anteriormente nas avaliaes singleplex, a
utilizao de um conjunto de oligonucleotdeos MP/INFA para a confirmao da
influenza sazonal e um conjunto especfico para H1N1 foi a melhor estratgia para a
padronizao de ensaios duplex.
4.3.1. Avaliao de reaes duplex H1N1/RNP e INFA-M1/RNP

Utilizou-se RNA previamente extrado de 87 amostras coletadas durante a
pandemia de 2009, processadas e analisadas pelo Laboratrio de Doenas
Respiratrias do Instituto Oswaldo Cruz. O objetivo foi avaliar as reaes duplex de
PCR em tempo real para vigilncia epidemiolgica de H1N1 pandmica, desenvolvida
pelo IBMP, e comparar os resultados obtidos com o protocolo preconizado pelo CDC,
executado pelo Laboratrio de doenas respiratrias do Instituto Oswaldo Cruz,
durante o ano de 2009. Fica evidenciada a eficincia do modelo de RNP, testados
como controle interno da reao para a verificao de amplificao. Essa situao
chancela sua incluso nos oligonucleotdeos a partir dessa parte da dissertao.
No quadro abaixo (Quadro 4.5) segue a anlise dos dados obtidos com os
testes dos oligonucleotdeos H1N1 e RNP, desenhados pelo IBMP, que foram
avaliados frente ao oligonucleotdeo swINFA e swH1N1 CDC. Podemos observar
que, em relao aos resultados obtidos com o modelo swINFA e swH1N1 CDC,
houve 8 % de discordncias com as sequncias definidas pelo IBMP.
Quadro 4.5: Resultados Discordantes Obtidos com os Oligonucleotdeos Especficos

para H1N1 Pandmico em 2010 (IBMP) e 2009 (CDC) com o duplex H1N1/RNP
(H1N1 IBMP) e com os singleplex swH1N1 E swINFA (H1N1 CDC) realizados em
2009.Resultado expresso em nmero de pacientes discordantes. (-) nenhuma
discordncia.
Total de
amostras
swH1N1 E
swINFA CDC
H1N1 IBMP
Total
87
48
Houve 21,5 % de resultados discordantes frente aos desenhos preconizados
pelo IBMP com os testes dos oligonucleotdeos MP IBMP e o duplex INFA + MP,
ambos desenhados pelo IBMP (quadro 4.6).

para H1N1 Pandmico em 2010 (IBMP) e 2009 (CDC) do duplex MP/RNP E
INFA+MP/RNP (MP IBMP, INFA+MP IBMP) e com o singleplex INFA (INFA CDC)
realizado em 2009. Resultado expresso em nmero de pacientes discordantes. (-)
nenhuma discordncia.
Total de
Amostras
116
INFA CDC
M1 IBMP
INFA + M1 IBMP
Total
25
Utilizando o duplex H1N1/RNP, temos 8 % de resultados discordantes em

relao ao protocolo do CDC realizado em 2009. Dentre as amostras amplificadas
com o duplex M1/RNP, 7,75 %, apresentaram resultado diferente do obtido at o
momento. Nesse conjunto, seis, que eram positivas quando analisadas pelo protocolo
do CDC em 2009, foram consideradas negativas segundo o protocolo IBMP e trs que
eram consideradas negativas pelo protocolo do CDC, foram consideradas positivas
pelo protocolo do IBMP.
O duplex IFNA+MP(M1)/RNP gerou 6 % de resultados discordantes, todos
referentes a amostras supostamente negativas conforme o resultado fornecido pelo
laboratrio de Doenas Respiratrias do Instituto Oswaldo Cruz em 2009, e que foram
consideradas positivas com a utilizao do protocolo/reagentes IBMP. Esse dado
indica uma possvel amplificao inespecfica ocasionada pela utilizao da
combinao de oligonucleotdeos. Com base nestes resultados, foi definido que o
modelo Brasileiro teria como base os alvos moleculares identificados pelos conjuntos
H1N1 (especfico para influenza H1N1 pandmica), MP (Regio do gene da matriz
(M1)-especfico para influenza A), alm do controle interno da reao para a
verificao de amplificao, que vem a ser o mesmo preconizado pelo CDC (gene
Humano RNP).
49
4.3.2. Anlise de reprodutibilidade do modelo escolhido.

Para a anlise de reprodutibilidade do mtodo, foi efetuada a extrao e
realizado o teste de PCR em tempo real de rplicas de um pool de 10 amostras
sabidamente positivas, com o objetivo de verificar a reprodutibilidade dos resultados
obtidos com a extrao. Como descrito no incio dos resultados, o equipamento
escolhido tambm realiza o PCR setup automatizados na plataforma selecionada e o
objetivo era a verificao da eficincia do mesmo tambm.
Para a verificao da condio descrita acima, efetuou-se o protocolo de
experimentos, repetido em trs testes consecutivos: uma extrao de 5 alquotas de
200ul cada de um pool de amostras positivas para H1N1 e de uma amostra de gua
RNase free. O PCR em tempo real foi realizado com 6 amostras extradas ( alquotas
do pool positivo descrito acima e uma da amostra RNAse FREE) no Labturbo, cada
um em duplicata e amplificadas com o conjunto de oligonucleotdeos 1 (H1N1/RNP) e
com o conjunto de oligonucleotdeos 2 (MP/RNP) no equipamento LionCub.
O quadro 4.7 apresenta a mdia dos resultados positivos (expressos em Ct) das
trs extraes realizadas, com seus desvios-padro e coeficientes de variao. Fica
demonstrada a reprodutibilidade do modelo de extrao com a variao de apenas 2
Ct entre os testes realizados em condies idnticas s descritas acima. Ainda vale
ressaltar que os coeficientes de variao foram sempre prximos de 0, o que
demonstra a baixa variabilidade verificada entre as extraes.
50
Quadro 4.7: Resultados das trs extraes realizadas com 5 duplicatas das amostras
positivas com as mdias, desvios-padro (DESVPAD) E o coeficiente de variao (CV)
dos protocolos sugeridos. Legenda:Ct-Ciclo threshold.
Extrao realizada no LabTurbo
Ct H1N1
Ct MP
Ct RNP1 Oligos 1
Ct RNP2 Oligos 2
Mdia Pool Positivo
32,52
33,05
26,8
26,94
Desvpad Pool Positivo
1,88
1,63
0,36
0,39
Cv Pool Positivo
0,058
0,049
0,013
0,014
32,66
34,52
29,06
29,54
1,5
1,63
0,36
0,23
0,046
0,047
0,012
0,008
Mdia Pool Positivo
34,73
36,56
28,6
29,14
2,79
2,56
0,32
0,25
Cv Pool Positivo
0,08
0,07
0,011
0,009
Mdia Pool (+)
33,3
34,71
28,15
28,54
Mdia Desvio Padro Pool (+)
2,05
1,93
0,34
0,29
Mdia Cv Pool (+)
0,06
0,06
0,01
0,01
Extrao 1
Extrao 2
Mdia Pool Positivo
Cv Pool Positivo
Extrao 3
Mdia das Extrao 1,2 e 3
A figura 4.1 expressa os dados obtidos entre as trs extraes citadas no

quadro 4.7, possvel observar que, entre as 3 extraes, obteve-se uma variao de,
aproximadamente, 2 Ct.
51
Resultados obtidos nas trs extraes realizadas
38
36,56
Ct
36
34
32
34,71
34,52
34,73
33,05
32,66
32,52
Ct H1N1
33,3
Ct MP
30
extrao 1
extrao 2
extrao 3
Mdia obtida
Figura 4.1: Resultados das trs extraes realizadas com dados expostos no quadro 4.7, referentes as sondas dos
oligonucleotideos H1N1 e MP.
.
Como os resultados negativos (gua RNAse FREE) apresentaram uma

amplificao que no era esperada em todas as alquotas testadas, suspeitou-se de
uma contaminao do equipamento durante os processos de extrao. Efetuou-se
uma limpeza segundo as instrues do fabricante no equipamento Labturbo e no
laboratrio. Esse teste teve como objetivo identificar e resolver o suposto problema de
contaminao durante a extrao com o Labturbo. A extrao e o PCR em tempo real
de amostras negativas (tampo de eluio e meio SM, descritos anteriormente no
captulo de materiais e mtodos), juntamente com a extrao de pool de amostras
positivas e pool de amostras negativas foram processadas, com o uso do Labturbo e
com a realizao de PCR em tempo real do material extrado no LionCub. Aps a
realizao de cada teste, foi realizada a limpeza no interior do equipamento Labturbo,
assim como em todo o laboratrio, conforme descrito na metodologia, tendo sido, em
seguida, realizado um novo teste.
Foram realizados 3 testes (quadro 4.8 e 4.9 e Extrao 1,2 e 3 do quadro 4.13)
com o seguinte protocolo: Extrao de 12 alquotas com 200ul cada de tampo de
eluio (CCEB) e 6 alquotas com 200ul de meio SM no Labturbo e o PCR em tempo
real de 18 amostras extradas, 1 amostra de controle positivo e 1 amostra de controle
negativo previamente submetidas extrao e 1 NTC (non template control),
constitudo de tampo de eluio. Para esse teste, a amplificao foi efetuada apenas
com conjunto de oligonucleotdeos 1 (H1N1/RNP) no equipamento Lioncube.
Ressalte-se ainda que, entre a realizao dos protocolos de extrao detalhados,
foram realizados os procedimentos de limpeza mecnica descritos na metodologia. A
eficcia do protocolo de limpeza mecnica, realizada no intervalo de cada teste
52
realizado, descrita na metodologia se reflete no decrscimo das contaminaes,
conforme verificado nos quadros 4.8 e 4.9.
Quadro 4.8: Resultados obtidos com o oligonucleotdeo RNP nos testes realizados
suas respectivas porcentagens. Amostra: tampes CCEB e meio de cultura SM
Amostras
Total CCEB contaminadas
CCEB
% contaminao
CCEB
Total SM
Amostras
% contaminao
contaminadas SM
SM
Teste 1
12
33,00%
67,00%
Teste 2
12
33,00%
0%
Teste 3
12
15 %
0%
Quadro 4.9: Resultados obtidos com o oligonucleotdeo H1N1 nos testes realizados
suas respectivas porcentagens. Amostra: tampes CCEB e meio de cultura SM.
Amostras
Total CCEB contaminadas
CCEB
% contaminao
CCEB
Total SM
% contaminao
Amostras
SM
contaminadas SM
Teste 1
12
7,5 %
15 %
Teste 2
12
0%
0%
Teste 3
12
0%
0%
A figura 4.2 ilustra os resultados obtidos nos quadros 4.8 e 4.9, mostrando o
decrscimo das contaminaes e demonstrando a eficcia da limpeza mecnica
sugerida. Infere-se da que grande parte das contaminaes poderia ter sido originada
a partir das contaminaes cruzada entre as amostras. A descrio do grfico
apresentada na legenda ao lado, que traz, em detalhes, o contedo de cada linha,
com seus respectivos percentuais.
53
Porcentagem de contaminao nas alquotas CCEB e SME
80%
Porcentagem
70%
67%
60%
% contaminaao CCEB
50%
% contaminaao SME
40%
30%
20%
10%
33%
33%
% contaminaao CCEB
15%
8%
15%
0%
0%
Teste 1
Teste 2
% contaminaao SME
0%
Teste 3
Figura 4.2: Resultados obtidos com o oligonucleotdeo RNP (linhas rosa e laranja) e H1N1 (linhas vermelha e
violeta), demonstrado nos quadros 4.8 e 4.9, com as respectivas porcentagens de contaminao obtida nas
alquotas de CCEB e SM nos testes realizados entre as limpezas mecnicas sugeridas no protocolo descrito na
metodologia, com suas respectivas porcentagens.
O quarto teste (Extrao 4 do quadro 4.13) foi realizada no Labturbo, com a

extrao de 10 alquotas de 200ul cada de um pool de amostras positivas para H1N1
(Positiva), 10 alquotas de 200ul cada de um pool de amostras negativas para H1N1 e
InfA sazonal (Negativa) e 4 alquotas de 200ul cada de tampo de eluio (CCEB). O
PCR em tempo real: 24 amostras extradas, 1 amostra de RNA do controle positivo e 1
NTC (non template control), constitudo de tampo de eluio (CCEB). A amplificao
foi realizada apenas com conjunto de oligonucleotdeos 1 (H1N1/RNP) no LionCub.
Neste teste, 50 % das amostras negativas apresentaram Ct que seriam
considerados positivos na avaliao dos resultados, devido aos critrios de Threshold
e cut off estabelecidos na metodologia, levando necessidade de repetio do
protocolo para a confirmao da descontaminao do equipamento Labturbo. Foi feita
uma nova limpeza mecnica, conforme o procedimento descrito na metodologia.
Foi realizada uma nova extrao (Extrao 5 do quadro 4.13) de 24 alquotas
de 200ul cada de tampo de eluio (CCEB) e efetuado o PCR em tempo real de 24
amostras extradas, 1 amostra de RNA do controle positivo e 1 NTC (non template
control), constitudo de tampo de eluio (CCEB), com amplificao apenas com
conjunto de oligonucleotdeos 1 (H1N1/RNP) e reao efetuada no LionCub conforme
descrito na metodologia. Neste teste, observou-se somente a contaminao de uma
Amostra da extrao realizada.
Verificou-se o decrscimo da taxa de contaminao medida que as limpezas
foram feitas, no tendo sido observado qualquer aumento da contaminao, mesmo
aps a extrao de amostras positivas. A reprodutibilidade obtida com a extrao de
10 rplicas do pool positivo para H1N1 foi satisfatria com valores de CV (coeficiente
54
de variao) iguais a 1,78% para H1N1 e 1,40% para RNaseP e o pool de amostras
negativas apresentou, em metade dos casos, um valor de Ct positivo, podendo indicar
que, dentre as amostras utilizadas para fazer o pool, havia amostras falso-negativas,
ou que houve contaminao do mesmo durante seu preparo.
A metodologia do Labturbo tornou a ser repetida. Foi realizada a extrao e
PCR em tempo real de pool de amostras positivas, pool de amostras negativas e de
amostras brancas, simultaneamente. O objetivo foi a verificao de no-ocorrncia
de contaminao durante o processo de extrao e PCR setup dentro do Labturbo,
bem como a aferio da reprodutibilidade dos resultados obtidos com a extrao e o
PCR setup automatizados e, ainda, a confirmao da qualidade dos reagentes de
extrao IBMP quanto capacidade de gerar resultados reprodutveis e quanto
inexistncia de contaminantes.
Foi realizado um teste com a extrao (Extrao 6 e 7 do quadro 4.13) de 10
alquotas de 200ul cada de um pool de amostras positivas para H1N1, 2 amostras
brancas (CCEB) , realizado-se um PCR em tempo real das 12 amostras extradas
com 1 amostra de controle positivo previamente submetida extrao e 1 NTC (non
template control), constitudo de tampo de eluio. Foi realizada a amplificao com
conjunto de oligonucleotdeos 1 (H1N1/RNP) e 2 (MP/RNP) , com a reao de PCR
em tempo real no Lioncube, como descrito na metodologia, e cujos resultados so
apresentados no quadro 4.10.
Quadro 4.10: Resultados obtidos com os oligonucleotdeos H1N1/RNP e MP/RNP no

protocolo de teste realizado com pool positivo e alquotas de CCEB. Os resultados
esto expressos em Ct.
Pool positivo
Ct H1N1
Ct MP
Ct RNaseP
Mdia Pool Positivo
27.07
28.72
26.93
0.28
0.26
0.32
Cv %
1.03
0.92
1.19
A reprodutibilidade obtida com a extrao de 10 rplicas do pool positivo para

H1N1 foi satisfatria, com valores de CV variando entre 0,92% a 1,19% e a ausncia
de amplificao das amostras brancas sugere a inocorrncia de contaminao
durante os processos de extrao e PCR setup.
Era ainda necessrio proceder extrao e ao teste de PCR em tempo real de
pool de amostras positivas para H1N1, pool de amostras negativas para H1N1 e InfA
sazonal, simultaneamente extrao, com o PCR em tempo real, de pool de amostras
positivas e amostras brancas (CCEB). Esse ensaio tinha como objetivo a verificao
55
de inocorrncia de contaminao durante o processo de extrao e PCR setup
dentro do Labturbo, a aferio da reprodutibilidade dos resultados obtidos com a
extrao e o PCR setup automatizados, e, ainda, a reproduo da rotina de trabalho
enfrentada pelos usurios do teste na rede de vigilncia. Foram efetuadas 4 extraes
independentes ( Extraes 8,9,10 e 11 do quadro 4.13) de 12 alquotas de 200ul cada
de um pool de amostras positivas para H1N1 (Pool positivo) e 12 alquotas de 200ul
cada de um pool de amostras negativas para H1N1 e InfA sazonal (Pool negativo),
com a realizao do PCR em tempo real das 24 amostras extradas. Estas foram
amplificadas com o conjunto de oligonucleotdeos 1 (H1N1/RNP) e o conjunto de
oligonucleotdeos 2 (MP/RNP) no equipamento LionCub conforme protocolo descrito
na metodologia (quadro 4.11).

protocolos de testes realizados com pool positivo e negativo. A referida tabela
demonstra o resultado das quatro repeties propostas no protocolo detalhado acima.
Os resultados em vermelho indicam a amplificao de amostras negativas. Os
resultados esto expressos em Ct.
EXTRAO 1
Mdia Pool positivo
Mdia Pool Negativo
Ct H1N1
Ct MP
Ct RNP Oligos 1
Ct RNP Oligos 2
24,57
28,7
26,31
29,47
21,52
21,52
25,22
25,22
Ct RNP Oligos 1
21,52
21,52
Ct RNP Oligos 2
25,22
25,22
EXTRAO 2
Ct H1N1
Mdia Pool positivo
24,57
Mdia Pool Negativo
28,29
Ct MP
26,31
28,77
EXTRAO 3
Ct H1N1
Mdia Pool positivo
24,57
Mdia Pool Negativo
28,56
Ct MP
26,31
29,99
Ct RNP Oligos 1
21,52
21,52
Ct RNP Oligos 2
25,22
25,22
EXTRAO 4
Mdia Pool positivo
Mdia Pool Negativo
Ct H1N1
24,57
28,57
Ct MP
26,31
29,47
Ct RNP Oligos 1
21,52
21,52
Ct RNP Oligos 2
25,22
25,22
Conclumos que continua ocorrendo uma amplificao no esperada nas

amostras de pool negativo.Realizamos um quinto teste( Extrao 12 do quadro 4.13),
substituindo as amostras negativas por amostras do CCEB. Seguem, abaixo, os
resultados obtidos (quadro 4.12), onde foi possvel observar o decrscimo de amostras
contaminadas frente s 4 primeiras extraes realizadas com apenas uma amostra
contaminada.
56
protocolo de teste nmero cinco preconizado acima e realizado com pool positivo e
alquotas de CCEB. Os resultados esto expressos em Ct.
EXTRAO 5
Mdia Pool Positivo

Amostras CCEB contaminadas
Ct H1N1
Ct MP
Ct RNP Oligos 1
Ct RNP Oligos 2
25,85
27,62
26,13
26,72
Verifica-se que o pool negativo do quadro 4.11 apresentou amplificao, e que

o teste feito com amostras brancas (CCEB) revelou a amplificao (contaminao
em alguma etapa) de uma das 12 alquotas utilizadas, corroborando a necessidade da
limpeza mecnica preconizada no protocolo. A partir deste momento, o procedimento
de limpeza mecnica passa a ser obrigatrio no incio de cada extrao.
A reprodutibilidade na realizao das extraes propostas foi satisfatria para
todas as extraes e amplificaes (coeficiente de variao-CV-entre 1 e 2%). O
aumento do nessa situao pode ser atribudo falta de centrifugao dos tubos de
PCR antes da colocao dos mesmos no equipamento de amplificao (LionCub), o
que pode tambm justificar a no-amplificao de uma amostra. Esse procedimento foi
realizado em todos os demais testes ora apresentados.
Segue abaixo um resumo das extraes efetuadas neste tpico, com as
respectivas amostras utilizadas, alm dos resultados obtidos (quadro 4.13).
24
12
Teste 4
Teste 5
Teste 6
Teste 7
Teste 8
Teste 9
Teste 10
Teste 11
12
12
12
12
12
10
10
10
Pool
positivo
12
12
12
12
10
Pool
negativo
RNAse
Free
Amplificao de amostras negativas
Amplificao de positivos e ausncia de amplificao

no controles negativos, alm da ausncia de
amplificao nos tampes CCEB
Amplificao de positivos e ausncia de amplificao Amplificao de amostras negativas. Suspeita-se do

pool de amostras negativas. Fica evidenciada a
necessidade de limpeza mecnica
Somente uma amostra de tampo CCEB apresentou
amplificao.

Somente uma amostra apresentou amplificao
Ausncia de amplificao nos tampes CCEB
Reprodutibilidade satisfatria e ausncia de

contaminao nas amostras de tampo CCEB
50 % das amostras negativas apresentaram

amplificao.repetio do protocolo de impeza

Reprodutibilidade da amostras positivas
Amplificao de resultados negativos, realizado

protocolo de limpeza conforme metodologia

no controles negativos ( gua RNAse FREE)
Reprodutibilidade satisfatria e ausncia de

contaminao nas amostras de tampo CCEB


Reprodutibilidade da amostras positivas

Comentrios

Resultado esperado
Quadro 4.13: Resultados obtidos nas 12 extraes realizadas no tpico 4.3, com as respectivas amostras utilizadas e resultados obtidos.
Teste 12
12
Teste 3
12
Teste 2
SM
12
CCEB
Teste 1
Teste Extrao
Nmero de
amostras
57
58
4.4 - Teste com diferentes condies de master mix, e comparao

entre sondas purificadas e no purificadas por HPLC.
Foi realizado um PCR em tempo real de pool de RNAs positivos para H1N1,
pool de RNAs positivos para InfA sazonal e pool de RNAs negativos para H1N1 e InfA
sazonal com master mix de diferentes composies e com sondas no purificadas e
purificadas por HPLC, para observar se o master mix utilizado representa a melhor
opo para o ensaio em questo. Foi verificado, ainda, se o processo de purificao
ou no das sondas por HPLC interfere no resultado final.
As alquotas de RNAs pool H1N1, pool InfA, pool NEG, amostras de H1N1 e
mais um NTC foram amplificados em PCR em tempo real, utilizando-se 7 condies
diferentes de master mix. Cada uma dessas 7 condies foi testada duas vezes, uma
com o conjunto de oligonucleotdeos 1 (H1N1/RNP) constitudo por sondas no
purificadas por HPLC e em uma reao duplex composta pelos primers H1N1 e MP e
por suas respectivas sondas purificadas por HPLC. As 7 composies de master mix
testadas esto descritas, a seguir, no quadro 4.14.
Quadro 4.14: Condies de concentraes de MgSO4, dNTP, primers, sondas, Taq

polimerase(Taq) e Reverse transcriptase(RT) utilizadas nos testes realizados.
MgSO4 100mM
dNTP 10mM
10uM primers
5uM sondas
Taq 5U/ul
RT/uL
Padro
6mM
0,2 mM
0,4 uM
0,2 uM
0,1 U/ul
0,25 uL
Condio 1
9mM
0,2 mM
0,4 uM
0,2 uM
0,1 U/ul
0,25 uL
Condio 2
3mM
0,2 mM
0,4 uM
0,2 uM
0,1 U/ul
0,25 uL
Condio 3
6mM
0,2 mM
0,4 uM
0,2 uM
0,15 U/ul
0,25 uL
Condio 4
6mM
0,2 mM
0,4 uM
0,2 uM
0,1 U/ul
0,5 uL
Condio 5
9mM
0,2 mM
0,4 uM
0,2 uM
0,15 U/ul
0,5 uL
Condio 6
3mM
0,2 mM
0,4 uM
0,2 uM
0,15 U/ul
0,5 uL
Seguem, abaixo, os resultados obtidos com as condies de reagentes

detalhadas no protocolo acima e seus respectivos resultados com a utilizao de
sondas no purificadas (quadro 4.15 e 4.16), onde fica evidenciado que a condio 6
a melhor pelos valores de Ct e perfil das curvas, tanto para sondas purificadas e
quanto para as no purificadas.
59
Quadro 4.15: Resultados obtidos em PCR em tempo real realizado com as condies
de master mix descritas no quadro 4.14 com sondas no purificadas para o
verificada entre todas apresentadas.
Condies descritas anteriormente no quadro
Padro
1
2
3
4
28,92
29,68
28,27
27,97
29,5
29,02
31,02
29,87
-
POOL H1N1
Amostra H1N1
POOL INFA
POOL NEG
NTC
5
26,95
28,83
-
6
27,9
28,36
-
de mster mix descritas no quadro 4.14 com sondas no purificadas para o
Condies descritas anteriormente no quadro
POOL H1N1
Amostra H1N1
POOL INFA
POOL NEG
NTC
Padro
22,86
23,17
22,79
24,43
1
23,07
22,95
22,9
23,81
2
23,83
23,93
24,29
25,05
3
22,94
23,09
22,77
24,03
5
22,74
23,14
22,6
23,9
6
24,14
23,78
23,56
25,01
Seguem, abaixo, os resultados obtidos com as condies de primers detalhadas

no protocolo acima e seus respectivos resultados com a utilizao de sondas
purificadas (quadro 4.17 e 4.18).
de mster mix descritas No quadro 4.14 com sondas purificadas para o
POOL H1N1
Amostra H1N1
POOL INFA
POOL NEG
NTC
Padro
25,7
24,51
-
1
26,84
25,06
-
2
25,46
27,27
-
3
26,95
24,93
-
5
25,3
24,34
-
6
24,86
23,78
-
37,84
60
de master mix descritas No quadro 4.14 com sondas purificadas para o
POOL H1N1
Amostra H1N1
POOL INFA
POOL NEG
NTC
Padro
26,52
25,2
26,79
-
1
27,72
25,94
27,44
-
2
26,37
28,07
26,56
-
3
27,59
25,96
27,43
-
5
25,79
24,88
25,93
-
6
25,63
23,99
25,27
37,43
Em todas as condies testadas, a utilizao da sonda purificada para H1N1

resultou em valores de Ct inferiores, quando comparados com os valores obtidos com
a mesma sonda no purificada, sendo a mdia dessas diferenas igual a 3,45 Cts.
Para ambos os oligonucleotdeos, a condio 4 no apresentou amplificao.
A condio 6 (3mM MgSO4, 0,2 mM dNTP, 0,4 uM primers, 0,2 uM sondas , 0,15 U/ul Taq
e 0,5 ul Rt)
conduziu ao maior ganho, dentre todas as condies testadas, quando
comparada com a condio padro. O decrscimo foi de, aproximadamente, 1 Ct em

trs das quatro amplificaes analisadas (o fato no foi observado para os resultados
obtidos com a sonda RNP no purificada). Em um primeiro momento, no foi efetuada
a alterao da composio do master mix, em virtude do tempo necessrio que essa
padronizao iria demorar. Tal prazo era incompatvel com a finalizao do trabalho,
posteriormente efetuaremos esta padronizao da mistura de PCR em tempo real.
4.5- Comparaes entre o mtodo de extrao semiautomatizado

(Labturbo) e o mtodo de extrao manual (Invitrogen) e entre dois
equipamentos de PCR em tempo real (LionCube e ABI 7500)
Para a comparao do modelo preconizado pelo CDC com o modelo proposto,
foram utilizadas amostras em diluies seriadas com fator de diluio igual a 4, a partir
de um pool de amostras positivas para H1N1. Foram usadas, para extrao, o
equipamento automatizado Labturbo e a posterior realizao de PCR em tempo real,
tanto no LIONCUB quanto no ABI 7500. O mesmo ensaio foi repetido utilizando o kit
manual de extrao Pure Link Viral RNA/DNA Minikit da Invitrogen, para a
61
comparao da eficincia de extraes manuais do modelo preconizado pelo CDC e o
equipamento proposto para a utilizao na rede de vigilncia, que seria o LABTURBO.
Ainda acrescenta-se a realizao do PCR em tempo real utilizando as sondas
no purificadas por HPLC e as sondas purificadas por HPLC nos equipamentos de
PCR LionCub e ABI 7500. O objetivo era efetuar uma comparao entre a eficincia
do mtodo de extrao automatizado e o mtodo manual e, ainda, um cotejo entre os
equipamentos de PCR LionCub e ABI 7500, bem como entre
as sondas no
purificadas e purificadas por HPLC nos equipamentos de PCR LionCub e ABI 7500.
Realizou-se a extrao de 12 alquotas de 200ul consistindo em: 2 alquotas de
amostra pura, 2 alquotas de amostra diluda 4 x , 2 alquotas de amostra diluda 16 x,
2 alquotas de amostra diluda 64 x, 2 alquotas de amostra diluda 256 x, 2 alquotas
de amostra diluda 1024 x , representando cada ponto, em duplicata da reta
apresentada grficos deste tpico e duas amostras brancas (CCEB para a extrao
com o Labturbo e gua RNase FREE para a extrao manual) e o PCR em tempo real
das amostras extradas. Estas foram amplificadas com o conjunto de oligonucleotdeos
1 (H1N1/RNP), constitudo por sondas no purificadas por HPLC, com o conjunto de
oligonucleotdeos 2 (MP/RNP), tambm composto por sondas no purificadas, e em
uma reao duplex composta pelos primers H1N1 e MP e por suas respectivas sondas
purificadas por HPLC.
No primeiro teste desta etapa, foi realizada uma extrao automatizada no
equipamento Labturbo das alquotas em fatores de diluio de ordem 4, sendo usada
uma amostra pura, e esta mesma amostra diluda em 4, 16, 64, 256, 1024 vezes com
uma amostra sabidamente negativa. Foram utilizadas sondas no purificadas do
oligonucleotdeo 1(H1N1/RNP) para a realizao da reao de PCR em tempo real
tanto no ABI 7500 quanto no LionCube. O principal objetivo era observar se haveria
uma diferena significativa nos resultados de PCR em tempo real expressos em Ct. O
resultado desta reao fica evidenciado na figura 4.3, onde as linhas que representam
as diluies nos pontos acima detalhados no apresentaram diferenas significativas
considerveis entre os resultados das extraes posteriormente verificadas em
diferentes equipamentos de amplificao.
62
Resultados obtidos na comparao dos equipamentos ABI

7500 e LionCube utilizando o conjunto de sondas no
purificadas com as diluies propostas
40
Ct
H1N1 LC
30
RNP LC
H1N1 ABI
RNP ABI
20
puro
16
64
256
1024
Fator de diluio
Figura 4.3: Grfico com os resultados positivos para o oligonucleotdeo 1(H1N1\RNP), com os respectivos fatores
de diluio em ordem crescente. Legenda ao lado. LC-lioncube, ABI-ABI 7500
Posteriormente, o mesmo protocolo de experimento foi repetido com o conjunto

de oligonucleotdeos 2 (MP/RNP), com as sondas no purificadas, e sua amplificao
foi realizada no ABI 7500 e no LionCub. O resultado desta reao fica evidenciado na
figura 4.4, onde as linhas que representam as diluies nos pontos acima detalhados
no apresentaram diferenas significativas considerveis entre os resultados das
extraes posteriormente verificadas em diferentes equipamentos de amplificao.
Resultados obtidos na comparao dos equipamentos ABI 7500

e LionCube utilizando o conjunto de sondas no purificadas
com as diluies propostas
40
MP LC
RNP LC
Ct
MP ABI
30
RNP ABI
20
puro
16
64
Fator de diluio
256
1024
Figura 4.4: Grfico com os resultados positivos para o oligonucleotdeo 1(MP\RNP), com os respectivos fatores de
diluio em ordem crescente. Legenda ao lado. LC-lioncube, ABI-ABI 7500.
63
Como relatado anteriormente, o mesmo procedimento realizado nas figuras 4.3
e 4.4 com sondas no purificadas foi repetido com o oligonucleotdeo 1 composto por
sondas purificadas. , Este resultado est detalhado na figura 4.5, onde as linhas
sobrepostas no demonstram haver diferena significativa nas amplificaes.

e LionCube utilizando o conjunto de sondas purificadas
Nas diluies propostas
40
H1N1 LC
Ct
RNP LC
30
H1N1 ABI
RNP ABI
20
puro
16
64
256
1024
Fator de diluio
Figura 4.5: Grfico com os resultados positivos para o oligonucleotdeo 1 (H1N1\RNP), com os respectivos fatores
de diluio em ordem crescente. Legenda ao lado. LC-lioncube, ABI-ABI 7500.
Como comparativo com o modelo do CDC para o diagnstico-padro do H1N1,

foi repetido o mesmo experimento, com os mesmos fatores de diluio e os mesmos
conjuntos de sondas, tanto purificadas quanto no purificadas.
Na figura 4.6, segue o grfico com os resultados positivos do conjunto de
oligonucleotdeos 1 (H1N1\RNP) purificados, com a amplificao de PCR em tempo
real realizada nos dois equipamentos, ABI 7500 e LionCube. A extrao manual foi
realizada segundo o protocolo do Kit InvitrogenTM , detalhado na metodologia . Apesar
de ter havido um provvel erro na alquota de diluio n 64, a sobreposio das retas
evidencia a eficincia de ambos os equipamentos de PCR em tempo real. Podemos
confirmar tal achado tambm em relao figura 4.7, onde a comparao foi feita com
o oligonucleotdeo 2 (MP/RNP) no purificado.
64

e LionCube utilizando o conjunto de sondas purificadas
nas diluies propostas
40
H1N1 LC
Ct
RNP LC
30
H1N1 ABI
RNP ABI
20
puro
16
64
256
1024
Fator de diluio
Figura 4.6: Grfico com os resultados positivos para o oligonucleotdeo 1 (H1N1\RNP), extrados por extrao
manual com os respectivos fatores de diluio em ordem crescente. Legenda ao lado. LC-lioncube, ABI-ABI 7500.
Segue, abaixo, um novo teste, realizado sob as mesmas condies de extrao

e amplificao da figura 4.6, mas, desta vez, com o conjunto de oligonucleotdeos 2
no purificados (figura 4.7).

7500 e LionCube utilizando o conjunto de sondas no
purificadas com as diluies propostas utilizando extrao
manual
40
Ct
MP LC
RNP LC
30
MP ABI
RNP ABI
20
puro
16
64
256
1024
Fator de diluio
Figura 4.7: Grfico com os resultados positivos para o oligonucleotdeo 2(MP\RNP), extrados por extrao manual
com os respectivos fatores de diluio em ordem crescente. Legenda ao lado. LC-lioncube, ABI-ABI 7500.
Foi efetuado o mesmo protocolo, realizado sob as mesmas condies de

extrao e amplificao da figura 4.6, com o conjunto de oligonucleotdeos 1 de
sondas purificadas. Apesar do provvel erro ocorrido durante o processamento da
amostra na diluio 64, a sobreposio das retas evidencia que no h diferenas
65
significativas entre os equipamentos de PCR em tempo real descritos na metodologia.
(figura 4.8).

7500 e LionCube utilizando o conjunto de sondas
purificadas com as diluies propostas utilizando extrao
manual
40
H1N1 LC
Ct
RNP LC
30
H1N1 ABI
RNP ABI
20
puro
16
64
256
1024
Fator de diluio
Figura 4.8: Grfico com os resultados positivos para o oligonucleotdeo 1 (H1N1\RNP), extrados por extrao
manual e amplificados com sondas purificadas com os respectivos fatores de diluio em ordem crescente.
Legenda ao lado. LC-lioncube, ABI-ABI 7500.
Como um dos principais objetivos do trabalho consiste no estabelecimento de

modelo alternativos, mais geis e simples que o preconizado pelo CDC, segue, na
figura 4.9 abaixo, um comparativo de extrao manual e semiautomatizada, em
amplificao realizada no Lioncube com o conjunto de oligonucleotdeos 1 com sondas
purificadas. A sobreposio das retas evidencia que no h diferenas significativas
entre as extraes manuais e semi-automatizadas propostas no trabalho, e que sua
utilizao foi uma deciso acertada no decorrer do trabalho, pois se agrega a
rastreabilidade e a reduo de tempo para o usurio.
66
Comparao da extrao manual e semi-automatizada com

amplificao LionCube
40
Ct
H1N1 LC
LabTurbo
RNP LC
LabTurbo
H1N1 LC Manual
30
RNP LC Manual
20
puro
16
64
256
1024
Fator de diluio
Figura 4.9: grfico com os resultados positivos para o oligonucleotdeo 1 (H1N1\RNP), extrados por extrao
manual e semiautomatizada, e amplificados com sondas purificadas com os respectivos fatores de diluio em
ordem crescente. Legenda ao lado.
67
5 - DISCUSSO
H
mais
de
60
anos,
comunidade
cientfica
tem
trabalhado
no
aperfeioamento de tcnicas mais eficientes para o diagnstico. Apesar do xito, logo

no incio, das tcnicas sorolgicas no desempenho desse papel, com o advento da
biologia
molecular,
foram
introduzidas
novas
perspectivas
no
mbito
do
desenvolvimento tecnolgico de ensaios, tais como a identificao de vrus e bactrias

e a quantificao de patgenos. Os diagnsticos por tcnicas moleculares esto
presentes na maioria dos hospitais e laboratrios, devido s suas caractersticas de
eficincia, sensibilidade rapidez e qualidade. Um diagnstico rpido e eficiente uma
ferramenta que, muitas vezes, significa um tratamento mais eficaz devido a
possibilidade de administrar frmacos especficos, aumentando a qualidade de vida do
paciente, e levando a um melhor prognstico e at cura. (Ratcliff et al., 2007 Bustin,
2000; Vernet, 2004).
Como inicialmente descrito neste trabalho, as tendncias das novas tecnologias
para o diagnstico laboratorial esto voltadas para testes que permitam a deteco
simultnea de diversos patgenos e suas tipagens, em um grande nmero de
amostras,
com
simples
execuo,
com
sistemas
automatizados
ou
semiautomatizados, e que forneam resultados em um curto perodo de tempo

(Dunbar et al, 2003).
A escolha de um modelo de diagnstico molecular pela tcnica de PCR em
tempo real com o sistema Taqman, associado a uma matriz de extrao
semiautomatizada, torna-se uma escolha compatvel com o desenvolvimento cientifico
e tecnolgico atual, aliando a capacidade de acurcia necessria, para ensaios
moleculares, possibilidade de transferncia de tecnologia. Fica evidenciado, no
decorrer da dissertao, que o objetivo o fornecimento de uma matriz diagnstica
que atenda aos requisitos citados na figura 3.1, e, ainda, a real possibilidade de
agregao da tecnologia envolvida ao complexo industrial da Sade (Temporo et
al,2003).
A metodologia de PCR em tempo real se consolida, cada vez mais, como um
mtodo diagnstico (Mackay et al., 2002; Niesters, 2001), o que deve ser atribudo
facilidade de execuo dos ensaios, menor necessidade de
simultaneidade entre deteco do alvo e a ocorrncia da
manipulao, e
reao diagnstica. A
68
ausncia de manipulao aps a etapa de amplificao, alm de conferir maior
reprodutibilidade, possibilita a obteno dos resultados em um curto perodo de tempo
(Laue et al., 1999; Ratcliff et al., 2007; Shu et al., 2003). Essa tcnica considerada
mais sensvel e especfica, alm de mais rpida, do que as tcnicas tradicionais de
amplificao e, portanto, extremamente apropriada para o diagnstico molecular em
laboratrios clnicos (Bustin, 2000; Vernet, 2004). Alm das vantagens j citadas, a
PCR em tempo real tambm possui a caracterstica de ser um ensaio qualitativo e
quantitativo, possibilitando a quantificao do RNA ou DNA adicionado no incio da
reao, e, portanto, a determinao da carga viral, em uma ampla faixa de
concentraes (Niesters, 2001).
Na rea de diagnstico, a necessidade de inovao constante, constituindo
um requisito obrigatrio para o desenvolvimento voltado para a Sade Pblica e o
correto investimento dos recursos. importante ressaltar que os parceiros
tecnolgicos envolvidos nesse trabalho tm, como motivao principal, a efetiva
utilizao dos recursos pblicos. Uma ferramenta utilizada para atingir esse objetivo
a transferncia de tecnologia, que visa nacionalizao dos processos, agregando
conhecimento, diminuindo dependncias e custos, e viabilizando o desenvolvimento
de produtos de ponta na rea diagnstica.
Em Ferreira, 2005, tivemos um exemplo claro de agregao de tecnologia e
diminuio de custos, com a transferncia do HIV Statpak da empresa Chembio para
Bio-Manguinhos. Essa iniciativa gerou economia, alm de trazer uma nova plataforma
tecnolgica para o parque de desenvolvimento de produtos desta unidade. Esta
iniciativa mostrou-se to eficiente que, nos ltimos 7 anos, outros 5 contratos de
transferncia
para testes de HIV, Leishmaniose, Sfilis e Leptospirose foram
assinados, e esto em processo de execuo, com a nova plataforma DPP(Dual Path

Plataform).
A partir do incio da pandemia de influenza de 2009, evidenciou-se a necessidade
de uma alternativa diagnstica para o modelo CDC, devido a diversos atrasos no
fornecimento de insumos para a deteco em ensaios in house do vrus. Ficou claro
que o diagnstico em territrio nacional, em um pas com dimenses continentais, s
seria possvel com uma matriz nacionalizada, sem dependncia de multinacionais,
minimizando as questes alfandegrias para o fornecimento de insumos. Ressalta-se,
ainda, que o custo e atrasos do modelo CDC registrados no inicio da pandemia
inviabilizaram a implementao de uma ampla rede diagnstica que pudesse atender
plenamente ao SUS, acarretando enormes atrasos na entrega dos resultados aos
pacientes, no auge da pandemia. Esses atrasos eram de aproximadamente 30-40 dias
69
aps o previsto, causando deficincia no tratamento dos pacientes acometidos pela
infeco.
A premncia de um diagnstico rpido, eficiente e preciso se deve reao da
populao frente infeco pela influenza A H1N1, que tem como principal
mecanismo de transmisso via area (Perez-Padilha, 2010). Embora, em sua
maioria, os quadros no evoluam para bito, sua disseminao (tanto pelo ar como
pelo contato) em todas as faixas de idade e de renda, assim como a sua rpida
propagao, potencializam cobranas da populao em relao assistncia mdica
e diagnstica. A infeco pela Influenza A H1N1 acarreta graves problemas de
atendimento nas redes pblica e privada de sade, alm de implicar na incapacitao
momentnea do indivduo para a realizao de suas atividades profissionais,
sobretudo quando esta evolui para um quadro de superinfeco.
O modelo do CDC foi preconizado como padro-ouro no diagnstico durante a
pandemia. Segundo Whiley e colaboradores, em um trabalho publicado em 2009, o
uso desse modelo para o diagnstico e a diferenciao da Influenza A H1N1 e de
outras influenzas sazonais eficiente em 98 % dos casos. Por esse motivo, ele
tambm foi usado como padro-ouro no decorrer dessa dissertao, onde foram
observados ndices similares em comparao ao modelo brasileiro, conforme
apresentado nos quadros 4.2, 4.3, 4.4, 4.5 e 4.6.
O consrcio formado pelo IBMP e Bio-Manguinhos planejou e executou o
projeto de nacionalizao do diagnstico de Influenza A H1N1, com a transferncia de
tecnologia de uma matriz de extrao semiautomatizada associada a insumos, mistura
de PCR, RT (reverse transcriptase) e oligonucleotdeos produzidos nacionalmente. Os
resultados preliminares da prova de conceito e validao dos insumos de extrao, de
RT-PCR e dos oligonucleotdeos supracitados foram satisfatrios, quando comparados
aos insumos preconizados pelo CDC, conforme observado nos quadros 4.2, 4.3, 4.4,
4.5 e 4.6. Estes resultados indicam a viabilidade do uso desse desenho nacional, pois
os seus nveis de sensibilidade e especificidade so compatveis com aqueles obtidos
no protocolo do CDC.Alm disso, a padronizao dos ensaios levou a ganhos na
eficincia da reao, como, por exemplo, a utilizao de sondas purificadas pela
tcnica de HPLC e a otimizao do master mix. Essa anlise fica evidenciada quando
se analisado o perfil das curvas no equipamento de PCR em tempo real.
Os resultados obtidos com os equipamentos permitem extrapolar para novas
matrizes de anlise, onde outros critrios podem ser reanalisados, ficando evidenciada
a necessidade de sistemas de extrao, com testes que comprovem de maneira
indiscutvel a ausncia de contaminao cruzada, evento que gerou uma carga
70
desnecessria de trabalho no decorrer desta dissertao. O risco de resultados falsopositivos e falso-negativos deve ser minimizado, pois tais achados produziro
impactos diretos sobre direo a ser seguida, e ainda implicaro na gerao de dados
errneos para a rede de vigilncia epidemiolgica.
Em relao assistncia tcnica, os critrios adotados na escolha dos
parceiros devem ser mais rgidos, gerando compromissos e responsabilidades mais
claros e objetivos na correo de problemas que ocorram durante os processos de
padronizao. Se isso j tivesse sido adotado durante este processo, os problemas de
contaminao cruzada poderiam ter sido minimizados.
Vale a pena salientar que a estimativa de custo de realizao deste diagnstico
significativamente inferior (U$10/teste includas as plataformas de equipamentos e
seu pacote de servios) ao custo efetivo aferido na primeira onda da pandemia (20
U$/teste), com uma reduo significativa de 50 % do valor inicial do teste. Essa
reduo do custo deve-se a transferncia de tecnologia da Biotools para o IBMP dos
insumos da realizao de PCR em tempo real, como master mix, tampes de extrao
e enzima RT. Em Sade Pblica, a influenza A uma patologia impactante em termos
de custo e atendimento, de modo que o seu diagnstico correto pode levar a aes
eficazes de tratamento e visualizao do quadro epidemiolgico nacional. Essa
diminuio de custo pode representar o acesso de centenas de pessoas a uma
melhoria na qualidade de vida, bem como uma diminuio nos impactos sociais
causados pela Influenza durante sua infeco.
Todas as empresas participantes (Applied Biosystem, Biotools, BioMeuriex,
Promega e Qiagen) tambm tiveram de esclarecer as questes relacionadas
propriedade intelectuais em territrio brasileiro, auxiliando nas negociaes para a
identificao de parceiros que permitam agregar conhecimento e capacitao
tecnolgica e que, por outro lado, no impliquem em impedimentos em relao a
patentes. Devem, tambm, ser economicamente compatveis com a realidade nacional
em termos de custo e investimentos. A Biotools, como relatado nos resultados, foi a
empresa que, naquele momento, respondeu mais efetivamente aos critrios
estabelecidos, e ainda que ofereceu o mais amplo pacote de transferncia de
tecnologia de insumos e de plataformas de extrao e PCR em tempo real. A grande
lio que pode ser proposta e acrescentada em futuras matrizes de deciso a
realizao de testes preliminares dos candidatos com a adio de avaliao prtica
para os processos decisrios. Assim, acrescentamos como sugesto uma vasta
pesquisa nas documentaes e publicaes relacionadas aos equipamentos, para
verificar se estes atendem prontamente ao uso a que sero destinados.
71
Logo aps a liberao dos recursos e assinatura do contrato, a saber, em Maro
de 2010, iniciou-se o processo de importao de 8 (oito) equipamentos de extrao e
8 (oito) de deteco, alm dos insumos necessrios. O cronograma para embarque
das mquinas foi estabelecido para entrega ao longo do ms de Abril, visando
aproximar o incio do projeto ao prazo originalmente proposto. No decorrer deste
perodo, os locais onde os equipamentos seriam instalados foram visitados e
vistoriados, a fim de identificar se as instalaes fsicas e eltricas eram compatveis
com os equipamentos, ou se necessitariam de adaptaes.
Aps as instalaes dos equipamentos, foi dada continuidade aos objetivos
propostos. Com base nos resultados observados nos quadros 4.4, 4.5 e 4.6, fica
evidenciado que a utilizao de reaes duplex com o controle interno da RNP foi uma
deciso acertada, pois este modelo diminuiu o nmero de resultados discordantes.
Essa combinao mostrou ser, ao longo do trabalho, a mais eficaz, tanto para o
diagnstico da doena, quanto para a observao e diferenciao da linhagem
pandmica. Nas comparaes efetuadas no desenvolvimento deste trabalho, esse
modelo constituiu o meio mais eficiente do diagnstico da Influenza A H1N1. Para os
oligonucleotdeos especficos de Influenza A, o conjunto M1 e o conjunto INFA IBMP
apresentaram resultados discordantes equivalentes quando comparado ao mpadro
de referncia preconizado pelo CDC. Contudo, apesar de terem apresentado
praticamente o mesmo nmero de resultados discordantes, os valores de Ct obtidos
com o conjunto MP foram, para a maioria dos casos, inferiores aos valores obtidos
com o conjunto InfA IBMP, indicando uma maior sensibilidade e eficincia da reao.
Segundo Carr e colaboradores, em estudo publicado no ano de 2009, a escolha do
Gene M1 diminui a ocorrncia de resultados discordantes por reaes cruzadas
inispecficas, corroborando com os resultados deste trabalho. Sua utilizao junto
variante pandmica resulta em um modelo satisfatrio para a diferenciao da
influenza circulante.
Ao longo da execuo do trabalho, com o sinal de background observado nos
resultados, levantou-se a suspeita da possibilidade de contaminao na etapa de
extrao (devido a aerossis observados durante esta etapa). Esse fato causou a
vinda de um tcnico da empresa taiwanesa, que forneceu um protocolo de limpeza, a
ser executada antes da etapa de extrao. A limpeza mecnica realizada antes de
cada extrao foi um fator importante para a obteno de resultados satisfatrios.
Essa situao foi fundamental para que se descartassem outras possibilidades que
foram levantadas durante o processo, como, por exemplo, a degradao das sondas
utilizadas e a inespecificidade dos oligonucleotideos
72
Com base nestes resultados, foi definido que o modelo Brasileiro de
oligonucleotdeos teria como base os alvos moleculares identificados pelos conjuntos
H1N1 (especfico para influenza H1N1 pandmica), MP (especfico para influenza A,
referente ao gene M1, que altamente conservado), alm do controle preconizado
pelo CDC (gene Humano RNP). Apesar de representarem um desafio para o
desenvolvimento, metodologias que permitam a realizao de testes multiplex so
altamente aplicveis, pois implicam na reduo de custos, trabalho e tempo de
processamento (Dunbar, 2006).
A reprodutibilidade das extraes realizadas no Labturbo foi verificada na figura
4.1, onde a variao de Cts entre as extraes 1 e 2 foi insignificante sob o prisma
estatstico (menor que 0,02) e, apesar de um provvel erro de procedimento na
extrao 3, a variao continua sendo de apenas 2 Cts, resultado altamente
satisfatrio para a verificao da reprodutibilidade. O possvel erro na etapa de
extrao no comprometeu o resultado, e apesar da diferena observada, as mdias
so satisfatrias, no tendo sido evidenciada qualquer necessidade de reproduo do
protocolo estabelecido. A figura 4.2 demonstra a eficincia da extrao e da
amplificao em testes realizados com pool de amostras positivas, como detalhado
anteriormente nos resultados, pela sobreposio dos pontos na figura em questo.
Fica tambm evidenciado, nos resultados obtidos, que os coeficientes de variao
foram baixos, sempre prximos de zero, o que torna a variabilidade do mtodo
reduzida e sua reprodutibilidade e repetibilidade satisfatrios.
As alteraes efetuadas no master mix apresentaram diferenas considerveis
nos resultados mostrados (ganho de 1 Ct), embora, num primeiro momento, tenha sido
descartada uma nova otimizao destes insumos, pois
o tempo de realizao
necessrio para a padronizao destas novas concentraes no seria compatvel

com os prazos estipulados para a concluso do trabalho objeto desta dissertao. Pela
experincia adquirida na padronizao do kit NAT HIV-HCV, apesar de novas
padronizaes resultarem em xito no resultado final, este processo demanda tempo
para a certificao desta, devendo ser tal padronizao finalizada no futuro.
Como parte do processo de anlise e de decises para o modelo escolhido
para a avaliao da sensibilidade e da especificidade, foi realizado um teste com
amostras com diferentes concentraes, como verificado no item 4.5. A utilizao de
diluies seriadas uma das maneiras mais eficientes de avaliar a extrao e a
amplificao, tendo se apresentado como uma importante ferramenta para a aferio
da reprodutibilidade da extrao. O uso de sondas purificadas por HPLC, que uma
73
tcnica cromatogrfica de alta eficincia para purificaes, afastou completamente a
possibilidade de degradao das sondas, e esses resultados podem ser evidenciados
no tpico 4.5, com a diminuio dos Ct com o uso de sondas purificadas. Durante o
desenvolvimento do Kit NAT HIV/HCV de Bio-Manguinhos, observou-se a necessidade
de utilizao de sondas purificadas por HPLC, j que se tratava de um kit diagnstico,
onde reprodutibilidade e sensibilidade so premissas essenciais (Yeung, 2004). Os
resultados obtidos nesta dissertao corroboram os que foram obtidos ao longo do
projeto NAT (Nucleic Acid Test) e Kit NAT HIV/HCV de Bio-Manguinhos. Cabe ressaltar
que parmetros e valores de reprodutibilidade e especificidade ainda esto sendo
calculados e definidos, no havendo ainda dados suficientes para o estabelecimento
destes valores.
A comparao da extrao manual e do equipamento de extrao proposto,
assim como a avaliao dos equipamentos de amplificao (ABI 7500 e LionCub),
evidenciaram
que o modelo proposto nesse trabalho to eficiente quanto o
proposto no protocolo do CDC. O conjunto de equipamentos escolhidos apresenta

vantagens inegveis como, por exemplo, o ganho de escala de trabalho, j que cada
extrao tem a capacidade de processamento de 24 amostras em 1 hora e 30
minutos, alm da diminuio dos riscos de erro humano, por tratar-se de um
equipamento semiautomatizado, e da reduo do custo final da reao. Como
vantagem adicional, ainda se obtm um ensaio duplex. O teste de PCR em tempo real
uma ferramenta que permite a deteco de mais de um alvo molecular e sua
capacidade deve ser explorada, com o propsito de levar obteno de resultados
mais eficientes.
Em relao amplificao dos cidos nuclicos, os resultados demonstraram
claramente que no existem diferenas entre as amplificaes realizadas tanto no ABI
7500, quanto no LionCub, atestando, assim, que o modelo escolhido de equipamentos
e insumos pode substituir com a mesma confiabilidade o modelo preconizado pelo
CDC, como ferramenta diagnstica para a deteco de infeces causadas pelo
Influenza A H1N1.
Trabalhos como esse consolidam o modelo de desenvolvimento tecnolgico
adotado por Bio-Manguinhos nos ltimos anos, principalmente na rea de reativos
para diagnstico, estabelecendo uma forte atuao em biologia molecular. Com a
obteno de registro do Kit NAT HIV/HCV, concedido no ltimo ano, estabelece-se,
pela primeira vez no Brasil, um modelo de diagnstico nacionalizado, com a
incorporao de insumos nacionalizados, em escala industrial, para a formao de
uma rede de diagnstico molecular do Sistema nico de Sade. Essa cadeia no
74
fomenta apenas o desenvolvimento, mas tambm agrega conhecimentos para todas
as etapas envolvidas na produo de imunobiolgicos, como, por exemplo, produo,
garantia de qualidade e controle de qualidade, permitindo, ainda, a consolidao do
quadro tcnico envolvido. Acrescente-se ainda que a disseminao do conhecimento
no ocorre apenas na etapa de fabricao do produto, mas durante toda a prestao
de servios envolvida nesse processo, tornando imperiosa a capacitao de
profissionais na rea de assistncia tcnica, com o treinamento e preparo destes.
Apesar de toda a crtica referente atuao das empresas pblicas no
desenvolvimento de novas tecnologias, fica evidenciado que, graas ao corpo tcnico
capacitado, ao apoio institucional, e aos recursos, podero ser gerados produtos
inovadores, com a adaptao necessria nossa realidade. Este trabalho permite
vislumbrar a padronizao de novos ensaios para o modelo de vigilncia
epidemiolgica, uma vez que o conhecimento obtido poder ser utilizado para a
melhoria do formato final do modelo H1N1 e, futuramente, para outros ensaios de
interesse do Ministrio da Sade para o combate a outras patologias como, por
exemplo, Dengue, Leishmaniose, e outros que possam ser igualmente viveis e
dotadas de caractersticas que permitam essa adaptao.
75
6 - CONCLUSO
A situao da rede de diagnstico implementada at o momento do incio deste
trabalho era deficiente nas aes de confirmao de casos de influenza A H1N1, e
apesar da relevncia desta patologia no cenrio da sade pblica brasileira, no foram
tomadas medidas suficientes para o fornecimento de uma estrutura adequada, e nem
para a capacitao de recursos humanos para a realizao do referido diagnstico
diferencial. Pelos objetivos propostos, conclui-se que:
- O modelo proposto, com o uso de um duplex com controle interno da reao de

amplificao (RNP), eficiente para o diagnstico da influenza A H1N1 e para sua
diferenciao em relao a influenzas sazonais circulantes.
- Foi identificada, testada e definida uma matriz de cido nuclico semiautomatizada

para o prottipo de diagnstico de Influenza A H1N1, o Labturbo, da empresa Taigen,
representada pela Biotools.
- Foi identificado, testado e definido um equipamento de PCR em tempo real,

LionCube, da empresa BioTools, destinado ao prottipo de diagnstico de Influenza A
H1N1.
- Foram definidos critrios, tendo sido formada uma matriz de deciso que avalia
custos, assistncia tcnica, propriedade intelectual, rastreabilidade, sensibilidade e
facilidade de execuo dos ensaios, resultado na definio do parceiro para a
transferncia de tecnologia de equipamentos e insumos.
- Ficou estabelecido um prottipo de Kit diagnstico para o diagnstico e diferenciao

da influenza A H1N1, que possui eficincia similar ao CDC.
- Esta proposta de modelo ser aplicada a outros desenvolvimentos de ensaios

moleculares para a rede de vigilncia epidemiolgica.
76
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