BACTERIOLOGA

TCNICA DEL N.M.P (Nmero Ms Probable)

MATERIALES

Tubos de ensayo
Tapas
Campanitas de Durghans
Gradillas
Pipetas de10 ml esterilizadas
Autoclave
Frascos estriles
Cinta de esterilizacin
Mechero de Bunsen
Ansa para sembrado

REACTIVOS
MEDIO PARA CULTIVO MAC CONKEY
a) Solucin de caldo Mac Conkey Doble: Se pesan 70 g de caldo y se lleva a un
litro con agua destilada.
b) Solucin de caldo Mac Conkey Simple : Se pesan 35 g de medio y se lleva a 1
litro de agua destilada
MEDIO PARA CULTIVO CITRATO DE KOSER DESHIDRATADO
Se pesan 2,850 g y se diluye en 500 ml de agua destilada
SOLUCION DE TIOSULFATO DE SODIO AL 3 % :
Se pesan 3 g de Tiosulfato de Sodio en 100 ml de agua destilada

PREPARACIN DEL MATERIAL:

Medios de cultivo:
Se deber preparar series de 5 tubos con solucin de caldo Mac Conkey
de concentracin doble dispensando 10 ml en cada tubo; dentro de cada uno se
colocara una Campana de Durghans (con la parte abierta hacia abajo). Tapar todos los
tubos, colocar cinta de esterilizacin y esterilizar en autoclave a 120 C y 1 atm de
presin durante 15 minutos.
De la misma forma se debe preparar tubos con solucin de medio de cultivo
de concentracin simple dispensando, en este caso, 5 ml y una campana de Durghans.
Tapar y esterilizar en autoclave.
Tambin se preparan tubos con 5 ml de medio Koser, se tapan y esteriliza
en autoclave a 120 C y 1 atm durante 15 minutos.

Se deben esterilizar tambin de la misma forma las pipetas de 10 ml

para ser utilizadas en la etapa de sembrado.

Envases:
Se utilizaran frascos de vidrio neutro con tapn hermtico y
capacidad de 200 a 250 ml; esterilizados en autoclave a 120 C y 1 atm de
presin, durante 15 minutos.
Se deben colocar previamente dentro de cada envase 3 ml de
solucin de Tiosulfato de Sodio al 3 % para inhibir la actividad del cloro en
caso que estuviera presente en la muestra a extraer.
El frasco debe conservarse correctamente y no abrirse hasta el
momento de la toma de muestra.

TCNICA
Sembrado:
Se realizara en un ambiente totalmente asptico con en
mechero de Bunsen encendido permanentemente.
Para cada muestra se utiliza una serie de cinco tubos de los
preparados con Caldo de Cultivo de concentracin Doble
De cada muestra extrada se toma con la misma pipeta
esterilizada cinco porciones del agua a analizar de 10 ml cada una, que se
colocaran respectivamente en un tubo de la serie.
Es importante rotular correctamente el primer tubo de cada
serie con el lugar al que pertenece la muestra y la fecha en la que fue sembrada.
Se llevan finalmente a incubacin en estufa de cultivo a 37 C
durante 48 hs.
Luego de ese lapso de tiempo se observan los resultados y se
determinan si hay algn tubo positivo

Repique
A este procedimiento se someten todos los tubos que segn la
interpretacin de resultados se consideren positivos.
De esta forma se toma, por cada tubo positivo, un tubo de los
preparados con Mac Conkey simple y uno de Koser. Tomando el ansa y
colocndola sobre la llama del mechero hasta que llegue a rojo se siembran en
ambas serie de tubos cada positivo.
Inmediatamente los tubos de Mac Conkey Simple sembrados
se incuban en bao trmico a 42 C durante 48 hs. y, los sembrados con Koser
se colocan en estufa de cultivo a 37 C por el mismo lapso de tiempo.
Finalmente, pasado este tiempo, se observa los tubos y se
leern los datos en la tabla de equivalencias correspondiente para poder obtener
as los resultados.

INTERPRETACIN DE LOS RESULTADOS

Se considera POSITIVO todo aquel tubo de Mac Conkey doble que durante
el tiempo de incubacin de la primera etapa haya sufrido cambio de color ( de violeta a
amarillento ) y haya tambin desarrollado presencia de mas de un 10 % de gas dentro
de la campana , siendo estos los que se repican en la siguiente etapa.
Cuando en la primer etapa todos los tubos sembrados de la serie de Mac
Conkey doble correspondiente a la misma muestra permanecen inalterables, o bien,
solo cambian de color, o, solo desarrollan gas en la campana, se consideran
NEGATIVOS, lo cual implica que dicha muestra tiene en este momento un resultado
clasificado como BUENA o APTA.
Luego del tiempo de incubacin a los que se someten los tubos positivos
repicados en Mac Conkey Simple, se consideran POSITIVOS y NEGATIVOS
aquellos que hayan sufrido idnticos cambios que los explicados para la primera etapa,
En el caso de los tubos repicados en Koser se considera NEGATIVO aquel
que permanece inalterable, y, POSITIVO aquel que desarrolla turbiedad. En estos
mismos se realizara la deteccin de Pseudomonas que se concreta cuando se visualiza
en el medio un viraje a color verdoso, lo que indicara POSITIVA la presencia de
Bacterias Pseudomona Aeruginosa.
De esta forma es importante considerar al finalizarse la incubacin de la
etapa de sembrado contar y anotar la cantidad de tubos positivos que se repican de
cada muestra y, luego del repique contar el nmero de tubos positivos obtenidos de
cada medio. Estos son los nmeros con los que finalmente se leen en la tabla los
resultados del Numero Mas Probable de presencia de bacterias de cada tipo halladas en
las muestras analizadas, que determinan la aptitud o no de la misma.

BACTERIOLOGA DE EFLUENTES
TCNICA DEL N.M.P POR DILUCIN
MATERIALES
Se utilizan los mismos materiales que para la tcnica en agua de consumo ,
la nica diferencia radica en que las pipetas a utilizar deben ser de 1 ml .

REACTIVOS
SOLUCION DE PEPTONA DE CARNE AL 2 % : se prepara pesando 2 g de
peptona en 100 ml de agua destilada . Dispensar en tubos de ensayo 9,3 ml de esta
solucin , tapar y esterilizar en autoclave durante 15 minutos a 120 C y 1 atm de
presin . Se utiliza un tubo para preparar cada dilucin.
MEDIO DE CULTIVO MAC CONKEY SIMPLE : Ver tcnica anterior. Se
utiliza una serie de tres tubos por dilucin en la siembra ; y los necesarios para el
repique .
MEDIO DE CULTIVO KOSER : ver tcnica anterior. Se utilizan los necesarios
para el repique.

TCNICA :
Siembra :
El mecanismo fundamental es la realizacin de una serie de diluciones para
cada muestra.
De esta forma , en primer lugar se homogeniza correctamente la muestra a
sembrar . Se toma una pipeta de 1 ml y se siembra con ella una serie de tres tubos de
caldo Mac Conkey simple , colocando 1 ml en cada uno .Esta serie es llamada serie O
, y es la correspondiente a la muestra pura , sin diluir . Utilizando la misma pipeta se
coloca 1 ml de muestra en el primer tubo de peptona , se homogeniza en el interior y;
cambiando la pipeta se procede a sembrar , tomando sucesivamente 1 ml de esta
dilucin la segunda serie de tres tubos de Mac Conkey simple . Esta es la serie
llamada A correspondiente a una dilucin 1/10 . Utilizando la misma pipeta , se
toma , 1 ml de la dilucin A hecha en peptona y se colocan en un nuevo tubo de
peptona , se homogeniza , y ; cambiando la pipeta se siembra la siguiente serie de tres
tubos Mac Conkey simple , a la que se rotula como serie B y corresponde a una
dilucin 1/100 .
Sucesivamente se repite el mecanismo las veces que sean necesarias segn
tantas diluciones requiera la muestra de a cuerdo a la carga bacteriana estimada que
posea. Se rotulan sucesivamente C , D , E , F , etc a cada nueva dilucin.

Finalizada la siembra se colocan las series en incubacin en estufa de

cultivo , a 37 C , durante 48 hs , tiempo luego del cual se procede a contar y anotar la
cantida de tubos positivo y negativos obtenidos de cada serie de diluciones
sembradas.

Repique :
Esta etapa de la tcnica es similar a la explicada anteriormente para
bacteriologa de agua de consumo.

INTERPRETACIN DE LOS RESULTADOS:

Los resultados se determinan igual que para la bacteriologa anterior ,
donde se consideran tubos positivos y negativos segn se explico ; y en base a estos
se repican los positivos , siempre y cuando sea necesario discriminar el tipo de
bacterias; si no se procede a la lectura de los resultados en las tablas correspondientes
utilizando el numero de tubos positivos y negativos obtenidos para cada serie
sembrada de cada dilucin.
Las condiciones de aptitud o no de dicha muestra se determina segn las
caractersticas del proceso o lugar al que la muestra pertenece comparando los
resultados segn las normativas vigentes en cuanto a los valores limites permitidos
para ese tipo de efluente especifico , es decir si supera o no los valores mximos
permitidos exigidos por la ley en el poceso, etapa o lugar que la muestra representa
puntualmente.