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Universidad Tecnolgica del Usumacinta

Divisin Acadmica de Procesos Alimentarios,


Biotecnolgicos y Paramdico.

Biologa Molecular II

Catedrtica: M.C. Manuela De J. Cambranes Chi

Unidad II

Resultado de aprendizaje

Alumno: Guillermo Vidal Barrientos Gonzlez

T.S.U. Qumica: rea Biotecnologa.

5to. Cuatrimestre

Grupo: A

Emiliano Zapata, Tab. A 09 de marzo de 2016.

INTRODUCCIN
Un organismo genticamente modificado (abreviado OMG u OGM) es un
organismo cuyo material gentico ha sido alterado usando tcnicas de ingeniera
gentica. La definicin estadounidense incluye igualmente las modificaciones
realizadas mediante la seleccin artificial. La ingeniera gentica permite modificar
organismos mediante la transgnesis o la cisgnesis, es decir, la insercin de uno
o varios genes en el genoma. Los OGM incluyen microorganismos como bacterias
o levaduras, insectos, plantas, peces y animales. Estos organismos son la fuente
de los alimentos genticamente modificados, y son ampliamente utilizados en
investigaciones cientficas para producir otros bienes distintos a los alimentos. El
trmino OGM est muy asociado al trmino tcnico legal, organismo viviente
modificado, definido en el Protocolo de Cartagena en Bioseguridad, que regula
internacionalmente el comercio de los OGM vivientes (especialmente, "cualquier
organismo viviente que posee una combinacin de material gentico obtenida
mediante el uso de biotecnologias modernas").
Las posibles modificaciones genticas que se pueden usar incluyen la mutacin,
insercin y delecin de genes. Cuando se inserta material gentico ste suele
provenir de otra especie, de forma parecida a la transferencia horizontal que se
produce en la naturaleza. Para producir de forma artificial esta transferencia suele
ser necesario recurrir a diferentes tcnicas. Los genes pueden ser incorporados a
un virus o pueden ser fsicamente inyectados en el ncleo de la clula con una
aguja ultrafina o con un can de genes. Otras tcnicas aprovechan la habilidad
de ciertos organismos como los lentivirus o algunas bacterias como la
Agrobacterium tumefaciens para transferir material gentico a animales y plantas.
La produccin agrcola actual se basa en el cultivo de un nmero reducido de
especies vegetales, domesticadas por el hombre a lo largo de muchos siglos, de
tal forma que en la mayora de los casos las variedades actualmente cultivadas se
extinguiran en pocos aos si los agricultores dejaran de cultivarlas.
Esta domesticacin consiste en una serie de modificaciones genticas naturales,
que el hombre ha seleccionado de forma emprica, seguidas de nuevas
modificaciones buscadas y obtenidas mediante cruzamientos dirigidos,
hibridaciones, mutaciones, duplicaciones de cromosomas, etc., que en diferentes
cultivos se utilizan y consumen sin problemas.
El presente trabajo se describir los procesos para la produccin de una especie
de maz modificada genticamente, mediante la introduccin de plsmido
bacteriano, de la especie BT.

-Diagrama de flujo.
El proceso de ingeniera gentica requiere del cumplimiento exitoso de una serie
de cuatro etapas. Para entender mejor cada una de esas etapas, se usar como
ejemplo el desarrollo del maz Bt (Bt corn). Antes de iniciar el proceso de
ingeniera gentica, debe localizarse un organismo viviente que presente la
caracterstica que se desea incorporar a una planta.
Extraccin del ADN: Seleccin del
organismo, caracterstica del Maz BT
(resistencia al barrenador Europeo del
maz.).

Clonacin del gen: Se extrae todo el


ADN del organismo, mediante el cual se
estudia y experimenta con el gen
separado. Se hace un copiado del gen.

Diseo del gen: se hace en tubos de


ensaye cortando el gen en partes con
enzimas y reemplazando ciertas
regiones.

Transformacin o insercin del gen: Se


inserta mediante biolistica en callo
mediante la tcnica de cultivo de
tejidos.

El maz Bt es un tipo de maz transgnico que produce una protena de origen


bacteriano. La protena Cry, producida naturalmente por Bacillus thuringiensis es
txica para las larvas de insectos barrenadores del tallo, que mueren al comer
hojas o tallos de maz Bt.
-Mapa del vector de clonacin.
El Bacillus thuringiensis: Es una bacteria del suelo que en condiciones naturales
produce la protena cristalina Bt. Esta protena es el ingrediente activo que ha sido
utilizado por los agricultores y jardineros durante 40 aos en la agricultura
tradicional y orgnica. Las diferentes subespecies de Bt producen diferentes

protenas llamadas protenas Cry, existiendo ms de 200 tipos que son


clasificadas segn su estructura y los insectos que controlan.
Las protenas Bt tipo Cr y, controlan algunas de las plagas del maz, entre ellas, el
barreneador del tallo o taladro, nombre comn con que se designa en Europa a
Ostrinia nubilialis, uno de los insectos ms destructivos y por consiguiente una de
las plagas con mayor impacto econmico en la produccin de maz.

-Diagrama del mapa del vector de clonacin.

-Etapa 1: Extraccin del ADN


El proceso de ingeniera gentica requiere del cumplimiento exitoso de una serie
de cinco etapas. Para entender mejor cada una de esas etapas, se usar como
ejemplo el desarrollo del maz Bt (Bt corn).
Antes de iniciar el proceso de ingeniera gentica, debe localizarse un organismo
viviente que presente la caracterstica que se desea incorporar a una planta. La
caracterstica para el maz Bt (resistencia al barrenador Europeo del maz) fue
descubierta hace unos 100 aos. Los criadores de gusano de seda en el Oriente
haban notado que las poblaciones del gusano estaban muriendo; los cientficos
de ese entonces descubrieron que la causa de tales muertes era una bacteria que
existe de manera natural en el suelo. La bacteria, llamada Bacillus thuringiensis,
abreviado como Bt, produca una protena que era txica para el gusano de seda:
la protena Bt.
Aunque en su tiempo no se dieron cuenta, los cientficos de aquel entonces
haban hecho uno de los primeros descubrimientos necesarios para el desarrollo
del maz Bt. La misma protena Bt que se descubri que era txica para el gusano
de seda es tambin txica para el barrenador Europeo del maz ya que ambos
insectos pertenecen al orden Lepidptera. La produccin de la protena Bt en la
bacteria Bt del suelo es controlada por su ADN.
-Extraccin del ADN de un organismo.

Para poder trabajar con el ADN, los cientficos deben


primero extraerlo de la bacteria Bt del suelo. La extraccin
de ADN es la primera etapa en el proceso de ingeniera
gentica. Esta se realiza tomando una muestra de la
bacteria que contiene el gen de inters y llevndola a travs
de varias fases para separar el ADN de las otras partes de
la clula.

-Etapa 2: Clonacin del Gen


-Seleccin del gen para clonamiento.
La segunda etapa del proceso de ingeniera gentica es la
clonacin del gen. Durante la extraccin del ADN, todo el
ADN de un organismo es extrado al mismo tiempo. Esto
significa que el ADN extrado de Bacillus thuringiensis
contendr el gen que codifica la protena Bt, al igual que
todos los otros genes de la bacteria. Los cientficos usan la
clonacin del gen para separar nicamente el gen de
inters del resto de los genes extrados.
Las siguientes etapas del proceso de ingeniera gentica involucrarn el posterior
estudio y experimentacin con el gen separado. Para ello, un cientfico necesita
tener miles de copias exactas de ese gen. Este copiado se hace como parte de la
etapa de clonacin del gen.
-Etapa 3: Diseo del Gen
El diseo de un gen para fines de ingeniera gentica se basa en otro gran
descubrimiento. Este descubrimiento es la teora conocida como 'Un gen Una
enzima', originalmente propuesta por George W. Beadle y Edward L. Tatum en los
aos 1940s. Los descubrimientos hechos a travs de sus investigaciones
fundamentaron la teora de que un solo gen contiene la informacin necesaria y
suficiente para instruir a la clula para la produccin
de una enzima (protena) en particular. Por lo tanto,
un solo gen controla la produccin de la protena Bt.
Este es el llamado gen Bt.
-Sustitucin del promotor existente por uno nuevo.
Una vez que un gen ha sido clonado, los ingenieros
genetistas empiezan la tercera etapa: el diseo del gen para que funcione dentro

de un organismo diferente. Esto se hace en tubos de ensaye cortando el gen en


partes con enzimas y reemplazando ciertas regiones. El primer gen Bt
comercializado fue diseado para producir niveles letales de protena Bt contra el
barrenador Europeo del maz nicamente en los tejidos verdes de la planta (hojas,
tallos, etc.). Posteriormente, los genes Bt fueron diseados para producir niveles
letales de la protena en todos los tejidos de la planta (hojas, tallos, inflorescencia,
jilote, races, etc.).
-Etapa 4: Transformacin
El gen modificado ya est listo para la cuarta etapa del proceso: la transformacin
o insercin del gen. Debido a que las plantas tienen millones de clulas, sera
imposible insertar una copia del gen transformado (transgene) en cada una de sus
clulas. Por lo tanto, la tcnica de cultivo de tejidos es usada para propagar masas
de clulas no diferenciadas llamadas callos. Estas son las clulas en las que se
insertar el gen transformado.
El nuevo gen es insertado en algunas de las clulas no diferenciadas usando
varias tcnicas. Algunos de los mtodos mas comunes incluyen la biolstica,
agrobacterium, microfibras y electroporacin. El objetivo principal de cada uno de
estos mtodos es transportar el nuevo gen o genes e insertarlos en el ncleo de
una clula sin matarla. Por ejemplo, con el mtodo de la biolstica (gen gun) se
disparan partculas microscpicas de oro recubiertas con el gen o genes que se
desea insertar en el ADN nuclear de las clulas no diferenciadas. A partir de aqu,
el nuevo ADN puede, o no, ser exitosamente insertado en un cromosoma.
Las clulas que reciben el nuevo gen son llamadas transgnicas y son
seleccionadas y separadas de las no transgnicas. Las clulas vegetales
transformadas son entonces regeneradas como plantas transgnicas. Muchos
tipos de clulas vegetales son totipotentes, lo que significa que a partir de una sola
clula se puede regenerar una planta completa. Por lo tanto, de cada clula
transgnica se puede regenerar una planta completa que contendr el gen
transformado en cada una de sus clulas. Las plantas transgnicas son cultivadas
en invernaderos hasta su madurez y la semilla que producen, la cual contiene el
gen transformado, es colectada. Aqu termina la labor del especialista en
ingeniera gentica. La semilla colectada es ahora puesta en manos de un
fitomejorador, quien ser el responsable de la etapa final.
-Transformantes, enzimas utilizadas y determinacin.
-Clonacin de regiones recombinantes: La cepa IPS82 de B. thuringiensis var.
israelensis creci en medio LB a 28 C y las extracciones de ADN genmico de Bt
se realizaron con una modificacin del mtodo Dubnau y DavidoffAbelson. El

ADN obtenido fue suficientemente puro para electroforesis y digestin por enzimas
de restriccin. Se us la enzima EcoRI para digerir el ADN genmico y los
fragmentos obtenidos se ligaron mediante la enzima T4 ligasa en el plsmido
suicida pES. La mezcla de ligacin se us para transformar E. coli. As se
obtuvieron diferentes transformantes en E. coli con insertos que variaban en
tamao.
-Seleccin de recombinantes: El plsmido pHT3101, conteniendo una regin de
replicacin del plsmido pHT1030 de B. thuringiensis y sus derivados, se usaron
para transformar Bti por el procedimiento de electroporacin y evaluar la eficiencia
del proceso. Para ello se inocularon 20 mL de BHI (infusin de cerebrocorazn)
(Difco) con 100 L de esporas (5107108 mL1) y se incubaron con agitacin a
200 rpm a 28 C para alcanzar OD600nm=0.300.40. Las clulas se recuperaron
por centrifugacin durante 5 min a 4000 rpm y a 4 C; se lavaron dos veces con 20
mL de agua destilada estril a 4 C y una vez con 10 mL de una solucin estril de
glicerol al 10 %. Finalmente, se resuspendieron en 400 Lde glicerol al 10 %. Esta
suspensin celular se us inmediatamente despus de su preparacin. La
electroporacin se realiz con un Gene Pulser II (BioRad*) acoplado a un
selector de resistencia paralelo (controlador de pulso BioRad*). Para la
electroporacin se mezclaron 200 L de clulas de Bti a 4 C con ADN plasmdico
y se transfirieron a cubetas de plstico de electroporacin (0.2 cm ancho). Se
aplicaron 1400 V, 25 F y 400 Ohms, en un pulso. Despus de la electroporacin
las clulas se recuperaron con 1 mL de BHI y se incubaron 3 h a 28 C con
agitacin suave. Alcuotas de 200 L de estas clulas se colocaron en placas con
LB ms eritromicina (2g mL1). Las transformantes de Bt formaron colonias
despus de una noche (12 h) de incubacin a 28 C. Las transformantes
resistentes a eritromicina se seleccionaron y se midi la eficiencia de
transformacin.
-Caracterizacin de recombinantes: Para corroborar la recombinacin homloga,
el ADN total de las transformantes de Bt fue extrado y digerido con enzimas de
restriccin como BamHI, KpnI, EcoRI y HindIII. Los fragmentos de ADN se
separaron en un gel de agarosa al 0.8 % por electroforesis, se transfirieron a una
membrana de nylon; stas fueron hibridadas con una sonda marcada con 32P y
se obtuvo la autoradiografa usando pelculas de rayos X de Kodak..
Se evaluaron algunos efectos secundarios en las recombinantes. Se midi el
porcentaje de esporulacin creciendo las recombinantes y la cepa silvestre en un
medio TrisG para inducir la esporulacin a 28 C por 3 d. Las esporas fueron
contadas como unidades formadoras de colonia (ufc) realizando diluciones y
sembrndolas en placas de LB. Tambin se comprob el efecto de la integracin
sobre la produccin de protenas realizando geles SDSPAGE (electroforesis

desnaturalizante con dodecil sulfato de sodio en gel de poliacrilamida) de


protenas cristalferas.

CONLUSIN
El origen del maz ha sido objeto de numerosos trabajos, con base en los cuales
se han sugerido varios sitios de origen que van desde Paraguay en Sur Amrica
hasta Guatemala y Mxico en Mesoamrica. El lugar de origen que sugiere la
evidencia cientfica como ms razonable identifica a Mxico como el lugar ms
probable de origen o a Guatemala como segunda opcin. Una de las
caractersticas del maz era su nula capacidad para defenderse de ciertos
depredadores por lo cual se opt por su transformacin mediante la insercin de
un plsmido de una bacteria, la cual produce una protena denominada BT, esta es
toxica para algunos insectos y por ende despus del estudio de este plasmido se
logr insertarlo en cayos de maz para inducir su crecimiento mediante las
tcnicas de cultivo In Vitro.

REFERENCIAS
-Organismos modificados genticamente. Instituto Nacional De Ecologa. SEMARNAT
-Mejoramiento Gentico del maz BT. Plant And Soils Sciences e Library.
-Maz genticamente modificado. Agro-Bio.
-Recombinacin homloga en un paso en el cromosoma de Bacillus thuringiensis.
Estibaliz SansineneaRoyano1, Gabriela Olmedolvarez2 y Candelario VzquezCruz2.
1Centro de Investigaciones en Ciencias Microbiolgicas del Instituto de Ciencias de la
Benemrita Universidad Autnoma de Puebla, 72570, Puebla, Puebla, Mxico. 2Centro de
Investigacin y Estudios Avanzados, Campus Irapuato, Irapuato 36000, Guanajuato,
Mxico.