FACULTAD DE MEDIO AMBIENTE Y RECURSOS NATURALES

PROYECTO CURRICULAR INGENIERIA AMBIENTAL

INFORME N7: VALORACION DE PROTEINAS POR EL METODO DE LAWRY
Andrs Oden 20132180893
RESUMEN

La determinacin cuantitativa de la concentracin de protenas es una de las pruebas ms

frecuentes en laboratorios de bioqumica. Primitivamente la medicin se evaluaba realizando una
estimacin de la cantidad total de nitrgeno proteico y teniendo en cuenta que este elemento
representa aproximadamente el 16% del peso de la protena. Estos mtodos eran muy extensos
por lo que en la actualidad se cuenta con mtodos calorimtricos y colorimtricos lo cual ha
permitido solventar estos inconvenientes. La espectrofotometra UV-visible es una tcnica
analtica que permite determinar la concentracin de un compuesto en solucin. Se basa en que
las molculas absorben las radiaciones electromagnticas y a su vez que la cantidad de luz
absorbida depende de forma lineal de la concentracin. En el presente laboratorio se realizada la
determinacin de la concentracin de protenas presentes en una solucin por el mtodo de
Lawry con ayuda del espectrofotmetro.
Palabras clave: absorbancia, transmitancia, colorimetra, Lawry, Folin.
ABSTRACT

Quantitative determination of the protein concentration is one of the most common tests in
biochemistry laboratories. Originally measurement was evaluated by estimating the total amount
of protein nitrogen and considering that this element represents about 16% of the protein weight.
These methods were very extensive so that today it has calorimetric and colorimetric methods
which enabled overcome these drawbacks. UV-visible spectrophotometry is an analytical
technique for determining the concentration of a compound in solution. It is based on the
molecules absorb electromagnetic radiation and in turn the amount of light absorbed depends
linearly on the concentration. In this laboratory determining the concentration of proteins present
in a solution by the method of Lawry using the spectrophotometer is performed.
Keywords:
absorbance,
transmittance,
colorimetry,
Lawry,
Folin.
OBJETIVOS
Determinar la concentracin de albumina presente en una solucin por el mtodo de Lawry
Objetivos especficos
Conocer la incidencia del reactivo Folin en la reaccin qumica.
Familiarizar los conceptos de absorbancia y transmitancia.
Representar la relacin Absorbancia- concentracin en una curva de calibracin

MARCO TEORICO

Los mtodos espectroscpicos de anlisis

estn basados en la medida de la radiacin
electromagntica que es absorbida o
emitida por una sustancia. En funcin de
ello se clasifican fundamentalmente en:
Mtodos de absorcin: Se basan en la
disminucin de la potencia de un haz de
radiacin electromagntica al interaccionar
con una sustancia.
Mtodos de emisin: Se basan en la
radiacin que emite una sustancia cuando
es excitada previamente por medio de otro
tipo de energa (trmica, elctrica...).

Mtodos de fluorescencia: Se basan en la

radiacin que emite la sustancia cuando es
excitada previamente por un haz de
radiacin electromagntica.
Otras clasificaciones de los mtodos
espectroscpicos se establecen en funcin
de la regin del espectro electromagntico
que interviene en la tcnica. As, pueden
utilizarse regiones como rayos X,
ultravioleta, visible, infrarrojo, microondas,
etc. En la Figura 1 pueden verse las
regiones del espectro electromagntico, en
funcin de los valores de la longitud de onda
() de cada radiacin:

Ilustracin 1: Espectro electromagntico. Tomado de practica 4, Qumica general UAM.

La regin UV se define como el rango de

longitudes de onda de 195 a 400 nm. Es
una regin de energa muy alta. Provoca
dao al ojo humano as como quemadura
comn. Los compuestos con dobles enlaces
aislados, triples enlaces, enlaces peptdicos,
sistemas aromticos, grupos carbonilos y
otros heterotomos tienen su mxima
absorbancia en la regin UV, por lo que sta
es muy importante para la determinacin
cualitativa y cuantitativa de compuestos
orgnicos. Diversos factores -como pH,
concentracin de sal y el disolvente- que
alteran la carga de las molculas, provocan
desplazamientos de los espectros UV. La
fuente de radiacin ultravioleta es una
lmpara de deuterio. En la regin visible
apreciamos el color visible de una solucin y
que corresponde a las longitudes de onda
de luz que transmite, no que absorbe. El

color que absorbe es el complementario del

color que transmite. Por tanto, para realizar
mediciones de absorcin es necesario
utilizar la longitud de onda en la que
absorbe luz la solucin coloreada. La fuente
de radiacin visible suele ser una lmpara
de tungsteno y no proporciona suficiente
energa por debajo de 320 nm.
Transmitancia y Absorbancia
Cuando un rayo de luz de una determinada
longitud de onda de intensidad Io incide
perpendicularmente sobre una disolucin de
un compuesto qumico que absorbe luz o
cromforo, el compuesto absorber una
parte de la radiacin incidente (Ia) y dejar
pasar el resto (It), de forma que se cumple:
Io= Ia+ It

La transmitancia (T) de una sustancia en

solucin es la relacin entre la cantidad de
luz transmitida que llega al detector una vez
que ha atravesado la muestra, I t, y la
cantidad de luz que incidi sobre ella, Io, y
se representa normalmente en tanto por
ciento: % T=It/Io x 100
La transmitancia nos da una medida fsica
de la relacin de intensidad incidente y
transmitida al pasar por la muestra. La
relacin entre %T y la concentracin no es
lineal, pero asume una relacin logartmica
inversa. La absorbancia (A) es un concepto
ms relacionado con la muestra puesto que
nos indica la cantidad de luz absorbida por
la misma, y se define como el logaritmo de
1/T, en consecuencia:
A = log 1/T = -log T = -log It/ Io
Cuando la intensidad incidente y transmitida
son iguales (Io = It), la transmitancia es del
100% e indica que la muestra no absorbe a
una determinada longitud de onda, y
entonces A vale log 1 = 0.
Instrumentacin para la medicin de
absorbancias de la luz visible y
ultravioleta:
espectrofotmetro UVvisible
La medicin de absorbancia de la luz por las
molculas se realiza en unos aparatos
llamados espectrofotmetros. Aunque
pueden variar en diseo, en especial con la
incorporacin de ordenadores para el
anlisis
de
datos,
todos
los
espectrofotmetros constan, segn se
indica en la figura, de:
1. Una fuente de energa radiante: lmpara
de deuterio y tungsteno.
2. Un monocromador para la seleccin de
radiaciones de una determinada longitud de
onda: filtros, prismas, redes de difraccin.
3. Un compartimento donde se aloja un
recipiente transparente (cubetas o tubos)
que contenga la muestra Pueden ser de
vidrio, cuarzo o plstico transparente. Para
medir en UV se deben usar las de cuarzo o
slice fundido, porque el vidrio no transmite
la radiacin UV.

4. Un detector de luz y un amplificador

convertidor de las seales luminosas en
seales elctricas.
5. Un registrador o sistema de lectura de
datos.

Ilustracin 2: Espectrofotmetro. Tomada

de Departamento de Bioqumica UCO.

Desde el punto de vista operativo, el primer

paso es seleccionar la fuente de luz y
longitud de onda a la que se va a realizar la
medida. Hay espectrofotmetros de un solo
haz (con una sola celdilla para alojar la
cubeta con la muestra) y de doble haz (con
dos celdillas para dos cubetas); en nuestro
caso se trabajar con los de un solo haz. Se
mide primero la absorbancia del disolvente
(conocido como blanco) y al que se le
asigna el valor de cero mediante el ajuste
del mando, de forma que la intensidad
incidente y transmitida sean iguales (Io=It),
y por tanto la absorbancia es cero. A
continuacin se pone en la celdilla la cubeta
con la muestra y se lee la absorbancia de
sta.
Ley de Lambert-Beer
Esta ley expresa la relacin entre
absorbancia de luz monocromtica (de
longitud de onda fija) y concentracin de un
cromforo en solucin:
A = log I/Io = cl
La absorbancia de una solucin es
directamente
proporcional
a
su

concentracin a mayor nmero de

molculas mayor interaccin de la luz con
ellas-; tambin depende de la distancia que
recorre la luz por la solucin a igual
concentracin, cuanto mayor distancia
recorre la luz por la muestra ms molculas
se encontrar-; y por ltimo, depende de ,
una constante de proporcionalidad
-denominada coeficiente de extincin- que
es especfica de cada cromforo. Como A
es adimensional, las dimensiones de
dependen de las de c y l. La segunda
magnitud (l) se expresa siempre en cm
mientras que la primera (c) se hace,
siempre que sea posible, en M, con lo que
las dimensiones de resultan ser M-1cm-1.
Este coeficiente as expresado, en trminos
de unidades de concentracin molar (o un
submltiplo apropiado), se denomina
coeficiente de extincin molar (M). Cuando,
por desconocerse el peso molecular del
soluto, la concentracin de la disolucin se
expresa en otras unidades distintas de M,
por ejemplo gL-1, las dimensiones de
resultan ser distintas, por ejemplo g-1Lcm1, y al coeficiente as expresado se
denomina
coeficiente
de
extincin
especfico (s).
La ley de Lambert-Beer se cumple para
soluciones diluidas; para valores de c altos,
vara con la concentracin, debido a
fenmenos de dispersin de la luz,
agregacin de molculas, cambios del
medio, etc.
CURVA DE CALIBRACIN
Denominamos espectro de una sustancia a
la representacin de absorbancia (A) en
funcin de longitud de onda (), este grfico
presenta ondulaciones con mximos y
mnimos.
Para
hacer
las
determinaciones
cuantitativas se elige, en general, la longitud
de onda correspondiente a un mximo, pues

el error de medicin es mnimo y la

sensibilidad mxima.
Para verificar el cumplimiento de la ley de
Beer, se debe realizar la curva de
calibracin; absorbancia (A) en funcin de
concentracin (c), para lo cual se preparan
soluciones de la sustancia

Ilustracin 3: Curva de calibracin.

Tomada de Departamento de
Qumica analtica UBA.

Preparan soluciones de la sustancia de

concentraciones conocidas y se mide la
absorbancia a la longitud de onda elegida
Si es vlida la ley de Beer, para esa
sustancia a esas concentraciones, la
relacin debe ser una recta, que pase por el
origen de los ejes cartesianos; a menudo se
observan desviaciones debidas a diversos
factores.
Mtodos de valoracin de protenas
Los mtodos utilizados para medir las
protenas totales pueden clasificarse en 6
categoras:
1. Procedimientos turbidimtricos:
a) cido sulfosaliclico ms sulfato sdico
b) cido tricloroactico (TCA)
2. Espectrofotometra ultravioleta a 210 mn
despus de:
a) Cromatografa en columna.
b) Ultrafiltracin
3. Mtodos de Lowry utilizando el reactivo
de Folin-Ciocalteau:
a) Con blanco
b) Sin blanco
4. Procedimientos modificados del biuret
con medicin a 300 nm
5. Mtodos inmunolgicos.

En el presente laboratorio se har uso del

mtodo de Lowry con el reactivo de FolinCiocalteau es ampliamente utilizado para
este tipo de valoraciones. En este mtodo
se observa una reaccin en dos etapas: a)
una reaccin inicial de la protena y el cobre,
relacionada con la reaccin del biuret; b)
una segunda reduccin de los cidos
fosfotungstico y fosfohemolibdico con el
complejo de cobre-protena as como con
tiosina y triptfano. El mtodo de Lawry solo
precisa 100 a 200 l de LCR. Sin embargo
es ms prolongado y ms difcil que los
mtodos turbimetricos y est sujeto a
interferencias variables derivadas de los
fenoles
y
frmacos
producidos
endgenamente
(salicilatos,
cloropromacina, tetraciclina y sulfamidas).

MATERIALES

Espectrofotmetro.
Planca calefactora
Baln Aforado.
Pipeta graduada de 10ml.
Beacker de 50 ml.
Agitador de vidrio.
Baln aforado
Albumina
Reactivo de Folin
Reactivo de cobre
Pasta

Albmina
Es una protena que se encuentra en gran
abundancia en el plasma sanguneo, siendo
la principal protena de la sangre. Es
sintetizada en el Muest Absorba Mas Volum %P/ RESULTADOS
hgado. Son
el ra
ncia
a
en
V
En el presente laboratorio
75%
de
las
(ml)
se ha utilizado el mtodo
protenas
del Blanco
0
25
0 de Lowry usando reactivo
suero y el 11% de
M1
0,229
30
25 120 de
Folin-Ciocalteau
las
protenas
M2
0,345
60
25 240 usando un blanco de
totales, solubles
0,624 120
25 480
en presencia de M3
Tabla 1: Concentracin y absorbancia de los patrones.
SO4Na2 al 20%. Hay 3 tipos: lactoglobulina,
lactoalbmina y seroalbminas.
Funciones de la albmina
-Mantenimiento de la presin onctica.
-Transporte de hormonas tiroideas.
-Transporte de hormonas liposolubles.
-Transporte de cidos grasos libres. (Esto
es, no esterificados)
-Transporte de bilirrubina no conjugada.
-Transporte de muchos frmacos y drogas.
-Unin competitiva con iones de calcio.
-Control del pH.
-Funciona como un transportador de la
sangre y lo contiene el plasma

agua destilada. Los valores obtenidos para

absorbancia del blanco y las 3 muestras
evaluadas se presentan a continuacin:
A partir de estos datos se ha construido la curva
de calibracin la cual permitir encontrar la
concentracin de las muestras analizadas en
este laboratorio.
Adicional, se realiz la coccin de pasta de la
cual se obtuvo un suero de 40 ml el cual fue
aforado en un matraz adicionando 100 ml
adicionales de agua destilada. Se aplic el
reactivo de cobre y posteriormente FolinCiocalteau. Una vez hecho esto las muestras
manejadas tomaron una coloracin verdosa.

Curva de calibracin
0.8
0.6
Absorbancia

f(x) = 0x + 0.04
R = 0.98

0.4
0.2
0

100

200

300

400

500

600

Concentracion (P/V)
Absorbancia

Igualmente se ha hecho el anlisis de dos

muestras de pastas las cuales fueron hervidas y
se les aplico el mtodo de Lawry para
determinacin de concentracin de protena
presente en la solucin. Para el clculo ha sido
utilizada la ecuacin de la recta encontrada en
el tem anterior. Para la estimacin de la
concentracin real se ha empleado el factor de
dilucin obteniendo la siguiente tabla:
C.
Masa Absorba Dilui C.
Muestra (g)
ncia
da
Real
10,25
126,8 317,
Tornillos
0
0,165
87
22
10,04
438,4 1096
Fideos
0
0,570
26
,1
Conchita 10,12
249,1 622,
s
0
0,324
95
99
Macarro
10,40
146,8 367,
nes
0
0,191
87
22
Tabla 2: Concentracin de las muestras.

ANLISIS DE RESULTADOS

Durante la reaccin se observ que las

protenas utilizadas formaron un compuesto
de color verde azuloso al reaccionar con los
reactivos Folin-Lawri. Esto se debe a que el
mtodo genera coloracin en la medida que
reaccionan las protenas con los reactivos.
Primero se desarrolla un color de baja
intensidad con el reactivo de cobre en el
medio alcalino produciendo un complejo
coloreado entre el ion Cu2+ y los grupos

Linear (Absorbancia)

aminos presentes en los enlaces peptdicos

de la albumina. Este compuesto se reduce y
despus un reactivo de fosfotungstato
fosfomolibdico para dar un color azul
(reactivo de Folin = Wolfanato sdico,
molibdato sdico, cido fosfrico, cido
clorhdrico, Sulfato de litio, agua y agua de
bromuro). Adems de esto, el grupo fenol es
capaz de reducir el molibdeno del complejo
cido fosfomolibdotungstico. Los residuos
de tirosina y serina proporcionan a los
grupos OH mayor sensibilidad al ensayo. El
color que toman las muestras es
proporcional a la cantidad de protena que
hay en cada tubo y este es el que medimos
espectrofotomtricamente. El siguiente
esquema muestra el mecanismo de
reaccin terico para el ensayo.

Ilustracin 4: Mecanismo de reaccin.

Teniendo en cuenta que despus de la

reaccin entre la protena y los reactivos
empleados no produjo se una coloracin
azul se infiere que la cantidad de protena
disuelta no era mucha.
En la curva de calibracin se puede apreciar
se ha conformado una lnea recta con los
valores obtenidos mostrando que conservan
una estrecha relacin lineal confirmando un
error mnimo y una sensibilidad mxima que
nos permite verificar el cumplimiento de la
ley de Lambert-Beer en las diluciones
analizadas durante esta prctica que fueron
utilizadas como patrones, confirmndonos
que fueron correctamente diluidas,
permitindonos asi, corroborar la relacin
existente entre la concentracin de la
muestra y la absorbancia obtenida.
Posteriormente con el calculo de las
concentraciones para las muestras
utilizadas de las diferentes tipos de pasta se
puede observar como estos valores de
concentracion de la dilucion presentan la
realacion entre la concentracion de la
proteina analizada y la absorbancia
calculada
en
el
espectofotometro
confirmando que los valores hayados
presentan coherencia. Igualmente se pudo
observar como era mayor la concentracion
de la proteina cuando se obtuvieron los
primeros 40 ml antes de ser diluidos en el
matraz. Es de destacar que los fideos
presentaron una mayor concentracion de
proteinas frente a las demas pastas lo que
en terminos nutricionales haria pensar que
tiene mayor valor alimenticio.
CONCLUSION

En la presente practica se ha logrado

determinar la concentracin de albumina
presente en diferentes tipos de pasta por
medio del uso de una curva de calibracin

generada a partir de disoluciones patrones,

lo cual ha permitido dar aplicacin a la ley
de Lambert-Beer. Se ha podido observar
experimentalmente como el reacivo de Folin
ejerce influencia en la reaccin por medio
de la coloracin de los enlaces peptdicos
presentes en la albumina para la medicin
de su concentracin a partir de
espectrofotometra. Los resultados que han
sido obtenidos muestran coherencia entre
sus concentraciones y los patrones
inicialmente utilizados teniendo en cuenta
que estos tenan una alta correlacin lineal.
Igualmente, se ha logrado afianzar
conocimientos en el manejo del
espectrofotmetro y la relacin entre el nivel
de absorbancia de luz por parte de
soluciones frente a su nivel de
concentracin. Como anlisis adicional
podra llegar a calcularse la cantidad de
protena que se disolvi frente a la que
contiene cada pasta.
BIBLIOGRAFIA
Fernndez, C. (2011). Quimiometra.
Valencia. Espaa: Universidad de Valencia.
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Analtica:
segundo
cuatrimestre.
Departamento de Qumica. Universidad de
Buenos Aires.
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Autnoma de Madrid.
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Espectrofotometra: espectros de absorcin
y
cuantificacin
colorimtrica
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biomolculas. Departamento de Bioqumica.
Universidad de Crdoba. Espaa.