Introduccin

A partir del prctico anterior se aprendi como las protenas con actividad
cataltica, es decir, las enzimas pueden ser detectadas a travs del ensayo de
su actividad enzimtica, o sea, determinando la velocidad de las reacciones
que catalizan. Para esto es necesario conocer los productos y disponer de los
mtodos analticos correspondientes para medirlos. El mtodo utilizado fue la
espectroscopia, es decir medimos la absorbancia de una muestra patrn de pnitrofenol a pH bsico. Esta muestra patrn consiste en distintas
concentraciones del producto sealado anteriormente, as se construy una
curva de calibracin que es la que se utilizar en el siguiente trabajo prctico.
El objetivo del siguiente trabajo prctico es determinar las velocidades de
reaccin para distintos medios de reaccin que difieren nicamente en la
concentracin de enzima que poseen, y as a partir de grficos de moles de
producto en funcin del tiempo, graficar la velocidad inicial en funcin de la
concentracin de enzima para as finalmente determinar el efecto de la
concentracin de fosfatasa cida en la velocidad de la reaccin.
Resultados.
En funcin de graficar una curva de progreso, se prepararon 4 tubos, con
diferentes concentraciones de enzima, con el fin de observar la variacin de
tiempo de formacin de producto en funcin del tiempo.
Para esto se preparan 4 tubos con cierta cantidad de citrato de sodio 0,1M, pnitrofenilfosfato y agua, el agua es agregada segn lo que se necesite para que
la solucin tenga un volumen total de 4mL. Los tubos se incuban por 2
minutos, para luego agregarles las cantidades de enzima correspondientes a
cada tubo. Al momento de agregar la enzima al tubo A se mezcla por inversin
el tubo, y se vuelve a introducir al bao de agua caliente. Del tubo A, el cual se
est incubando, se extraern 0,5mL de la solucin durante intervalos regulares
de tiempo hasta 40 minutos. Los 0,5mL de solucin extrada con introducidos a
diferentes tubos de ensayo con 5,5mL NaOH, con el objetivo de detener la
reaccin. Luego se procede hacer lo mismo con el tubo B y C.
Tabla I: Volumen utilizado de cada componente para obtener solucin de 4mL
Tubo "A"
Tubo "B"
Tubo "C"
Control
Componente
Volumen
Volumen
Volumen
Volumen
[mL]
[mL]
[mL]
[mL]
Citrato de sodio
0,1 M
1,6
1,6
1,6
1,6
pH 5,0
p-nitrofenilfosfato 2mM
fosfatasa cida
0,2 mg/mL

0,8
0,4

0,8
0,8

0,8
1,6

0,8
0

Agua
1,2
0,8
0
1,6
Volumen Total [mL*
4,0
4,0
4,0
4,0
mg de fosfatasa acida
0,08
0,16
0,32
0
Luego de invertir el tubo se empieza a tomar el tiempo. Las extracciones de la
solucin son llevadas a cabo cada cierto tiempo y introducidas a 5,5mL de
NaOH. La absorbancia medida de cada alcuota de solucin extrada, se
exponen en la siguiente tabla.
Tabla II: Absorbancia medida para cada tubo a diferentes tiempo de reaccin.
Tubo "A"
Tubo "B"
Tubo "C"
Control
Absorban
Absorbanci Absorbancia Absorbancia
cia 405
Tiempo (min)
a 405 nm
405 nm
405 nm
nm
5
0,074
0,132
0,212
10
0,132
0,218
0,351
15
0,178
0,320
0,460
20
0,218
0,360
0,514
30
0,300
0,453
0,597
40
0,330
0,531
0,655
0,81
*Se utiliza un blanco de agua para calibrar el espectro de absorcin.
El hecho de que en el control no enzimtico se haya registrado una
absorbancia, es atribuible a que el p-nitrofenol tambin absorbe, aunque con
un coeficiente de extincin molar menor, a pH 5,0.

Se utilizar la curva de calibracin realizada el prctico pasado, para conocer la

concentracin de p-nitrofenol en solucin a los diferentes tiempo de reaccin.
Grfico I: Curva de calibracin
Tabla III: Concentracin de p-nitrofenol en cada tubo a los diferentes tiempo de
reaccin
Tubo "A"
[pnitrofenol]

Tubo "B"
[pnitrofenol]

Tubo "C"
[pnitrofenol]

Control
[pnitrofenol]

Tiempo (min)

moles/6mL

moles/6mL

moles/6mL

moles/6mL

0,0329

0,0570

0,0902

10

0,0570

0,0927

0,148

15

0,0761

0,135

0,193

20

0,0927

0,152

0,216

30

0,127

0,190

0,250

40

0,139

0,223

0,274

Figura II: Grfico Cantidad de producto vs tiempo. Curva de progreso.

Al observar la figura II, vemos un avance de las curvas en un inicio lineal, lo

que quiere decir que la enzima est transformando el sustrato en producto de
manera proporcionalmente directa con el avance del tiempo. Pero luego el
comportamiento lineal termina y se empieza a notar una curva, esto significa
que va disminuyendo el producto generado por unidad de tiempo, lo que se
manifiesta en una curva con forma asinttica. Este comportamiento es general
para las tres curva, pero la diferencia est en periodo inicial, ya que al tener en
solucin la misma cantidad de sustrato y condiciones de ensayo, se espera
obtener la misma cantidad de producto en todos los casos, pero a diferentes
tiempo. Esto se explica por la existencia de diferentes cantidades de enzima en
cada ensayo. Entonces si en un tubo tenemos la mitad de la enzima que en
otro tubo diferente, se esperar que se forme un comportamiento lineal con
pendiente mayor en el tubo con ms enzima, ya que habr ms enzima capaz
de reaccionar con el sustrato para formar producto. Este comportamiento lineal
inicial se identifica como velocidad inicial, la cual ser explicada ms adelante
en este informe.
Se concluye que la concentracin de enzima no influye de manera positiva o
negativa en la cantidad de producto generado, sino que en el tiempo de
reaccin.
Al observar la tabla III, podemos notar la cantidad de producto generado a
diferentes concentraciones de enzima. Si el tubo B posee el doble de enzima
que el tubo A, debera haberse formado el doble del producto en el tubo B en
un transcurso de tiempo de 40 minutos, a razn de la existencia de ms
componente catalizador en solucin, esto se puede observar en la figura II, al
fijarnos en la curva de color negro (tubo A) y en la curva de color rojo (tubo B).
Por otra parte, al comprar la cantidad de producto formado en el tubo C, el cual
tiene ms concentracin de enzima que los otros dos tubos, y puntualmente el
doble que el tubo B. Notamos que la cantidad de producto formador en este
tubo, no es el doble que en el tubo B, ni tampoco el cuatro veces el tubo A, o
sea se forma menos producto de lo esperado. Este resultado obtenido por
debajo de lo esperado, tiene causa a un error humano mayor al que existe en
el caso nombrado con anterioridad, quizs se debe a una mezcla por inversin
mal hecha o una mala precisin en los volmenes agregados.
A continuacin se calcula la velocidad de la reaccin a distintos tiempos, a
partir de la expresin (1)

V=

d [ P]
(1)
dt

Tabla IV: Velocidad de reaccin en cada tubo a los diferentes tiempo de

reaccin
Velocidad de la reaccin
[

moles de p-

nitrofenol/6mLmin]
Tiempo
(min)

Tubo
"A"

Tubo "B"

Tubo
"C"

5
10
15
20
30
40

0,0065
8
0,0057
0,0050
7
0,0046
4
0,0042
3
0,0034
8

0,0114

0,018

0,00927

0,014
8
0,012
9
0,010
8
0,008
33
0,006
85

0,009
0,0076
0,00633
0,00558

Figura III: Grafico velocidad de la reaccin vs tiempo

Se observa un comportamiento lineal slo en los primeros 5 minutos. Por lo
mismo, a partir de estos primeros 5 minutos, obtenemos la velocidad inicial.
As, la velocidad inicial, para cada uno de los tubos con distinta concentracin
de enzima es :
Tabla V: Velocidad inicial para cada una de las reacciones
Velocidad inicial [

moles de p-

nitrofenol/6mLmin]
Tubo A
Tubo B
Tubo C
0,00658
0,0114
0,018
A partir de esto ltimo, es posible graficar la velocidad en funcin de la
concentracin de enzima, considerando lo siguiente.
Tabla VI: Velocidad inicial para cada una de las reaccines y concentracin de
enzima de cada una.
Velocidad [ moles de Concentraci
n de

p-nitrofenol/6mLmin]
Tubo A
Tubo B
Tubo C

fosfatasa
[mg]
0.08
0.16
0.32

0.00658
0.0114
0.018

Figura IV: Grfico velocidad inicial versus concentracin de enzima

Para terminar se analizan las figuras III y IV, y la importancia del tiempo inicial
en una reaccin enzima.
Podemos decir que al existir mayor cantidad de enzima en solucin, la cantidad
de producto que se formar por unidad de tiempo ser mayor, haciendo la
reaccin ms rpida. Es por esto que se observan puntos mximos en la figura
III, o sea el tramo inicial de la reaccin, puede predecir la concentracin de
enzima al comprar las curvas obtenidas, y a dems cual reaccin ser ms
rpida. Pero es importante agregar, que las reacciones catalizadas por la
fosfatasa cida sern ms eficientes en tiempo, esto quiere decir ms rpida si
existe una mayor concentracin de enzima, pero la cantidad de producto
generado por la enzima ser igual en el tubo A, B y C.
En la figura IV, la recta generada por la comparacin de velocidades inicial en
funcin del tiempo, confirma lo dicho en el punto anterior. Siendo el tubo C, con
mayor concentracin de enzima, y por lo tanto mayor velocidad inicial.
Tabla V: Actividad enzimtica de la fosfatasa cida.
Tubo "A"
[pnitrofenol]

n moles/

Tubo "B"

Tubo "C"

[p-nitrofenol]

[p-nitrofenol]

n moles/mi

n moles/mi

Tiempo (min)

minmL

nmL

nmL

1,09

1,90

3,00

10

0,950

1,55

2,46

15

0,844

1,50

2,14

20

0,773

1,26

1,80

30

0,705

1,05

1,38

40

0,579

0,929

1,14

Conclusiones.
Una mayor cantidad de enzima generar mayor producto por unidad de
tiempo, pero no mayor cantidad de producto.
El control enzimtico confirma que no existe componente alguno que
lleve a la formacin de producto, en un tiempo menor de 40 minutos.
El tramo inicial de la curva de progreso, entrega informacin sobre la
velocidad inicial de la reaccin.

Referencias.

Gua de Trabajos Prcticos Bioqumica y Qumica Biolgica Primer

semestre 2016.
1.-Stryer, L. et al; 2001; Bioqumica; 6 Edicin; Editorial Revert;
Espaa, Capitulo 8, Enzima: Conceptos bsicos y cintica , paginas 211215.

UNIVERSIDAD DE CHILE
FACULTAD DE CIENCIAS
DEPARTAMENTO DE QUMICA
BIOQUMICA Y QCA. BIOLGICA

Cintica
enzimtic
a
Curva de progreso de la reaccin de
hidrlisis de p-nitrofenil fosfato y
efecto de la concentracin de
fosfatasa sobre la velocidad de
reaccin

Integrantes:

Sofa Ahumada V.
Jos Miguel Len

Fecha de entrega: 11 de mayo de 2016