Informe Practica Biotecnologia Alimentaria (R)

BIOTECNOLOGIA ALIMENTARIA
211619
ACTIVIDAD
INFORME COMPONENTE PRCTICO
Presentado por:
SHIRLY PAOLA CABRERA
Cd. 23178904 ; Grupo 211619_14; CEAD Jos Acevedo y Gmez.
ANGIE PAOLA VALBUENA
Cd.; Grupo 211619_15; CEAD Fusagasug.
ANDRUS DAVID SIERRA RICAURTE
Cd. 1105786184; Grupo 211619_11; CEAD Jos Acevedo y Gmez.
OSCAR JAVIER BARRERA CASTRO
Cd. 1030522684; Grupo 211619_11; CEAD Jos Acevedo y Gmez.
DIRECTOR / TUTOR
YHON GLAEHTER FLOREZ
UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA

ESCUELA DE CIENCIAS BSICAS, TECNOLOGIA E INGENIERIA
PROGRAMA INGENIERIA DE ALIMENTOS
BOGOTA D.C.
04 DE DICIEMBRE DE 2013
TABLA DE CONTENIDO
1.
INTRODUCCIN...................................................................................................................... 4
2.
CINETICA Y CRECIMIENTO MICROBIANO ................................................................................ 5
3.
4.
5.
2.1.
RESUMEN ....................................................................................................................... 5
2.2.
OBJETIVOS ...................................................................................................................... 5
2.3.
DIAGRAMA DE FLUJO (METODOLOGA) .......................................................................... 5
2.4.
MATERIALES Y REACTIVOS .............................................................................................. 6
2.5.
RESULTADOS .................................................................................................................. 6
2.6.
DISCUSION DE RESULTADOS ........................................................................................... 7
2.7.
CONCLUSIONES .............................................................................................................. 7
EXTRACCIN DE ADN ............................................................................................................. 9

3.1.
RESUMEN ....................................................................................................................... 9
3.2.
OBJETIVOS ...................................................................................................................... 9
3.3.
METODOLOGA ............................................................................................................... 9
3.4.
MATERIALES Y REACTIVOS ............................................................................................ 13
3.5.
RESULTADOS ................................................................................................................ 13
3.6.
DISCUSION DE RESULTADOS ......................................................................................... 14
3.7.
CONCLUSIONES ............................................................................................................ 14
ELECTROFORESIS PROTEICA ................................................................................................. 15

4.1.
RESUMEN ..................................................................................................................... 15
4.2.
OBJETIVOS .................................................................................................................... 15
4.3.
JUSTIFICACIN.............................................................................................................. 15
4.4.
METODOLOGA ............................................................................................................. 16
4.5.
4.6.
RESULTADOS ................................................................................................................ 17
4.7.
4.8.
CONCLUSIONES ............................................................................................................ 18
CINETICA ENZIMATICA ......................................................................................................... 20

5.1.
RESUMEN ..................................................................................................................... 20
5.2.
OBJETIVOS .................................................................................................................... 20
5.3.
6.
5.4.
RESULTADOS ................................................................................................................ 21
5.5.
5.6.
CONCLUSIONES ............................................................................................................ 31
INMOVILIZACION ENZIMATICA Y CELULAR............................................................................ 32

6.1.
RESUMEN ..................................................................................................................... 32
6.2.
OBJETIVOS .................................................................................................................... 32
6.3.
PRINCIPIOS TEORICOS................................................................................................... 32
6.4.
METODOLOGA: ............................................................................................................ 32
6.5.
6.6.
RESULTADOS ................................................................................................................ 34
6.7.
6.8.
CONCLUSIONES ............................................................................................................ 35
1. INTRODUCCIN
La Biotecnologa Alimentaria se puede definir como: el desarrollo, produccin y utilizacin
racional de recursos biolgicos destinados a la creacin, modificacin e implementacin de
procesos como alternativa a soluciones que repercutan en la seguridad y calidad de los
recursos alimentarios. Estos objetivos se pueden realizar gracias a los avances en las ltimas
dcadas en la manipulacin de macromolculas orgnicas como el ADN, ARN y protenas;
dando origen a campos de conocimiento como: la gentica molecular 1, protemica,
metabolmica, citmica, entre otras; los conocimientos obtenidos por tcnicas bsicas
como la cintica de crecimiento celular, determinacin de actividad enzimtica, aislamiento
y cuantificacin de cidos nucleicos (a.n.), son determinantes para la comprensin,
desarrollo y control de procesos en Biotecnologa Alimentaria.
El crecimiento bacteriano se define como un aumento en el nmero de clulas, en otras
palabras, se refiere al crecimiento en poblacin y no al crecimiento en tamao. Existen
diferentes mtodos para medir el crecimiento bacteriano, en esta prctica solo nos
enfocaremos a la tcnica la Medida de la turbidez del cultivo.
El fenmeno de electroforesis, se basa en el desplazamiento de partculas portadoras de
carga a travs de un medio lquido, bajo la influencia de un campo elctrico aplicado. La
aplicacin de este fenmeno a la separacin de los componentes de una mezcla compleja
hace necesaria la existencia de diferentes velocidades de migracin, que a su vez dependen
del campo elctrico aplicado. De aqu que se defina el concepto de movilidad electrofortica
(m) como la velocidad de migracin para un campo elctrico de gradiente potencial unidad.
Las enzimas son protenas con capacidad de catalizar reacciones biolgicas. Igual que los
catalizadores inorgnicos, aumentan la velocidad para alcanzar el equilibrio de la reaccin.
El mecanismo por el cual las enzimas incrementan la velocidad de la reaccin es reduciendo
la energa libre de activacin requerida para la transformar un sustrato al producto
correspondiente, sin afectar la constante de equilibrio.
La inmovilizacin de clulas y enzimas se refiere a clulas y enzimas fsicamente confinadas
o localizadas en una cierta regin definida en el espacio reteniendo sus propiedades y
actividades catalticas. Asimismo, dependiendo del tipo de inmovilizacin tanto las clulas
como las enzimas pueden ser inmovilizadas de forma permanente o temporal para ser
utilizadas repetida y continuamente en diversos proceso qumicos.
2. CINETICA Y CRECIMIENTO MICROBIANO

2.1.
RESUMEN
Mediante esta prctica pretendimos analizar la relacin del crecimiento microbiano con
respecto al tiempo. El mtodo de lectura de crecimiento se hizo por Espectrofotometra
(Absorbancia) (lectura a 600nm), donde la diferencia visual es la turbidez del medio de
cultivo a medida que el microorganismo crece.
2.2.
OBJETIVOS
Identificar y comparar las diversas fases de crecimiento del microorganismo E. coli, en
diferentes medio de cultivo.
Determinar las diferencias en el tiempo de duplicacin y la velocidad especfica de
crecimiento del microorganismo en diferentes fuentes de carbono.
Expresar la biomasa en unidades de concentracin mediante la elaboracin de una curva
patrn.
2.3.
DIAGRAMA DE FLUJO (METODOLOGA)
2.4.
2.5.
MATERIALES Y REACTIVOS
MATERIALES
Cepa de Escherichia coli 1
Esptula 1
Gradillas para tubos de ensayo 1
Pipetas estriles (5 y 10 ml) 2 de cada una
Pipeteador 1
Tubos de ensayo ( 10 ml) 12
Elenmeyer (250 ml) 14
Vaso de precipitado (250 ml) 2
EQUIPOS Y UTENSILIOS
REACTIVOS
Bao termostatado o Shaker con

agitacin 1
Balanza analtica 1
Mechero bunsen 1
Vortex 1
Equipos
Incubadora 1
Autoclave 1
Cronmetro 1
Espectrofotmetro ( : 600 nm)
Sacarosa 5 g
Glucosa 5 g
Lactosa 5 g
Maltosa 5 g
Hipoclorito de sodio NaClO, 500 p.p.m.
400 ml
RESULTADOS
Muestra
Hora
Tiempo
10:00
ABSORBANCIA (600NM) SEGN SUSTRATO

GLUCOSA
MALTOSA
LACTOSA
SACAROSA
0,029
0,021
0,052
0,042
11:00
60
0,024
0,039
0,093
0,023
11:30
90
0,043
0,088
0,140
0,198
12:00
120
0,117
0,203
0,202
0,253
12:30
150
0,220
0,260
0,270
0,273
13:30
210
0,413
0,507
0,499
0,606
14:00
240
0,471
0,587
0,421
0,651
14:30
270
0,541
0,659
0,544
0,444
15:00
300
0,624
0,740
0,639
0,408
Tabla 1. Lectura de Absorbancia para determinacin de Cintica de crecimiento microbiano
Grafico 1. Relacin Tiempo y Absorbancia
2.6.
DISCUSION DE RESULTADOS
El microorganismo trabajado en la prctica fue la E. Coli. El cual se comport de una
manera muy variable para cada uno de los sustratos empleados. Como podemos
observar en la grfica en el sustrato que report mayor absorbancia fue en la Maltosa.
Ninguno de los medios una concentracin demasiado elevada (cerca a 1.0), lo que
sugiere que falto tiempo de incubacin para analizar el punto mximo de concentracin
alcanzado por la bacteria.
Segn los datos recopilados y la grfica 1, se puede analizar que con la Sacarosa la fase
de adaptacin es ms rpida para la E. Coli, pero as mismo su metabolismo aumenta, es
la nica donde se puede evidenciar las fases de crecimiento exponencial y muerte.
Para la glucosa, maltosa y lactosa a las 5 horas an se evidencia crecimiento, lo que indica
que an hay sustrato que le puede asegurar un poco ms de tiempo en la fase
exponencial.
Si se habla de etapas del crecimiento, podemos ver que la fase de latencia se dio para
todos los sustratos durante la primera hora. Pues a partir de la segunda hora (Tiempo 1)
el crecimiento fue aumentando de manera exponencial.
2.7.
CONCLUSIONES
La E. coli, present en la practica una mejor adaptacin al medio con Sacarosa como
sustrato. Sin conocer la concentracin con la que se trabaj, no podemos generalizar,
pero si se puede ver que en esta prctica fue el sustrato en el cual se obtuvo un mayor
crecimiento aparente.
En cuanto al desarrollo de la prctica, cabe destacar la importancia de factores y

variables claves para el estudio del crecimiento microbiano. Temperatura, tiempo,
concentracin y tipo de sustrato; adems la accin de la refrigeracin dada al momento
de finalizar la incubacin, son claves en la definicin de la Adaptacin de la bacteria a
los diferentes medios.
Para esta prueba la sacarosa fue el sustrato con mayor explosin en el crecimiento de
microorganismos, sin embargo se consumi tan rpido que para asegurar un proceso
biolgico por mayor tiempo se requiere aplicar el sustrato en mucha ms concentracin.
3. EXTRACCIN DE ADN
3.1.
RESUMEN
Para el desarrollo de esta prctica se tom una muestra del medio de cultivo de E. Coli y
mediante centrifugacin se obtuvo cierta cantidad de Biomasa. A la Biomasa se le hizo un
tratamiento qumico con el fin de romper las clulas bacterianas y obtener una muestra
compuesta por cidos nucleicos y otras sustancias proteicas.
3.2.
OBJETIVOS
Comprender y analizar la metodologa establecida para la extraccin y purificacin de
cidos.
Conocer el fundamento fisicoqumico de la extraccin de cidos nucleicos, la
electroforesis de estas macromolculas y su importancia como herramienta analtica.
3.3.
METODOLOGA
Propagar un cultivo de E. coli en 50 ml de medio

LB en un matraz de 250 ml, durante toda la
noche (14 -16 h) a 37C con agitacin orbital
constante (>150 rpm aproximadamente).
Transfiera 15 ml de la suspensin de clulas a un

tubo plstico de centrfuga (polipropileno) de 40
a 50 ml de capacidad con tapa rosca.
Centrifugar en refrigeracin durante 5 min. a

6000 g.
Descartar el sobrenadante, resuspenda las

clulas en 5 ml de solucin SSE en frio agitando
peridicamente.
Recolecte las clulas por centrifugacin
(refrigeracin, 5 min. a 6000 g), descarte el
sobrenadante y resuspenda homogneamente
en 1200 l de solucin SSE; subdivida en dos
micro tubos de 1,5 ml.
Adicione a cada tubo 300 l de solucin SDS al
10%, mezcle suavemente en vortex e incube en
un bao en agua a 60C durante 10 min. o hasta
que se observe un cambio significativo de la
viscosidad; deje enfriar a temperatura ambiente.
Mientras se enfra la suspensin de clulas
lisadas, prepare un capilar para colectar el ADN.
Con ayuda del mechero bunsen y pinzas
metlicas, cierre uno de los extremos del capilar
y doble la punta tratando de hacer pequeo el
tringulo.
Localice la punta doblada del capilar en la

interface, gire el capilar en remolinos hacia abajo
y recoja el precipitado que se va formando a
medida que se mezclan las dos fases. Este paso
deber hacerse rpidamente para evitar que se
precipite ARN.
Drene el exceso del liquido, presionando la punta
del capilar en la pared interna del tubo. Traslade
cada capilar a un tubo microcentrfuga de 2 ml
que contiene 200 l de etanol al 70%.
Este ADN es llamado ADN crudo.
Disuelva el ADN en 700 l de buffer TE con muy

suave agitacin.
(Si se desea obtener ADN cromosomal altamente
polimerizado es mejor permitir que el ADN se
disperse libremente, incubando durante varias
horas a 4 C).
Adicione 20 l de NaCl 4M para ajustar la fuerza
inica, antes de extraer con fenol y solventes
orgnicos.
Purificacin de ADN (Extraccin fenlica):

15. A los 700 l de ADN disuelto en TE, adicione igual volumen de fenol saturado, mezcle
invirtiendo el tubo suavemente (evitando el fraccionamiento excesivo del ADN) varias veces
durante 5 minutos.
16. Centrifugue a temperatura ambiente durante 5 minutos a 16800 g (10000 r.p.m aprox)
para separar las fases.
17. Transfiera el mayor volumen posible de la fase superior acuosa a un nuevo tubo,
evitando transferir material de la interfase.
18. Adicione a la fase acuosa 500 l de una mezcla: Alcohol isoamlico; mezcle invirtiendo
el tubo suavemente varias veces durante 5 minutos; centrifugue a temperatura ambiente
durante 5 minutos a 16800 g para separar las fases.
19. Transfiera la fase acuosa a un nuevo microtubo de ensayo y adicione 500 l de una
mezcla cloroformo-isoamlico, mezcle invirtiendo el tubo suavemente varias veces durante
5 minutos; centrifugue a temperatura ambiente durante 5 minutos a 16800 g para separar
las fases.
20. Transfiera la fase superior a un nuevo microtubo de ensayo.
Concentracin del ADN por precipitacin:
21. Adicione 600 l de etanol absoluto frio (utilice etanol almacenado a -10 oC evitando la
hidratacin de este producto).
22. Mezcle invirtiendo el tubo dos o tres veces e incube en hielo durante 10 minutos.
23. Centrifugue a 23500 g (14000 aprox.) durante 15 minutos en refrigeracin.
24. Elimine con cuidado el sobrenadante evitando desprender el pellet de ADN.
25. Invierta el tubo sobre un papel absorbente para retirar el exceso de alcohol, deje
invertido para que se evapore los residuos de etanol.
26. Disuelva el ADN en 500 l de buffer TE y prepare diluciones para evaluacin

electrofortica y espectrofotomtrica. Conserve la solucin en refrigeracin. Recuerde
marcar el tubo apropiadamente.
3.4.
REACTIVOS
Acrilamida
Bis-acrilamida (N.N-metilenobisacrilamida)
Tris (2-hidroximetil-2-metil-1,3 propanodiol)
Sodio dodecilo sulfato (SDS)
TEMED (N,N,N,N-tetrametilenoetilenodiamina)
Persulfato de amonio (PSA)
2-mercaptoetanol
Glicerol
Azul de bromofenol
Glicina
cido Clorhdrico (HCl)
Azul de Coomassie R-250
Metanol - CH3OH
cido actico glacial - CH3COOH
Cmara de electroforesis Bio-Rad Mini
Preotean III
Fuente de poder (capacidad 300 V, 400 mA)
Beaker con agua para ebullicin (92 C)
Flotador para microtubos
3.5.
RESULTADOS
RESULTADOS CUALITATIVOS
Centrfuga eppendorf
Contenedores de plstico o de vidrio
(12x16x3 cm)
Tubos eppendorf
Vortex
3.6.
Todos los tipos de macromolculas biolgicas tienen una caracterstica en comn que va a
permitir el desarrollo de un mtodo de separacin especfico para ellas. Estos mtodos
deben ser completamente biocompatibles para que puedan ser posteriormente tiles al
investigador y, al mismo tiempo, lo suficientemente potentes para permitir el aislamiento
de la molcula deseada de entre un mezcla compleja de multicomponentes que hacen las
veces de contaminantes de nuestra molcula en cuestin.En el proceso de extraccin de
cidos Nucleicos requiere de precisin en cada uno de sus pasos evitando en lo posible
prdidas o mermas teniendo en cuenta las pequeas cantidades de masa; especialmente
las re-suspensiones en donde los riesgos de perdida son mayores, por un deficiente
centrifugado o por perdidas en la eliminacin del sobrenadante.
El rompimiento de las clulas (membranas celulares) se hace por medio qumico, la
dosificacin y la eficiencia del agente activo debe ser la adecuada garantizando la mayor
cantidad de clulas fraccionadas, pues de este paso depende la cantidad de cidos
nucleicos a extraer.
La extraccin de los cidos nucleicos crudos se hace de manera manual, as pues se pudo
observar que la cantidad de material nucleicos extrado depende en un gran porcentaje
de la habilidad del operario.
3.7.
CONCLUSIONES
No hay una eficiencia del 100% en la extraccin o separacin de cidos nucleicos, esto
se deduce una vez se han fraccionado las clulas ya que la etapa es demasiado artesanal.
Los cidos Nucleicos Crudos extrados de la E. Coli se identifican como una sustancia
translucida y viscosa.
4. ELECTROFORESIS PROTEICA
4.1.
RESUMEN
La electroforesis se aplica para el anlisis de ADN y de protenas, esta nos permite separar
estas molculas de acuerdo con su tamao. El principio de esta tcnica es muy simple: si
sometemos una molcula con carga electrosttica a la accin de un campo elctrico, las
molculas tendern a moverse: las de carga negativa hacia el electrodo negativo. La
velocidad a la que se mueva depender de la carga que tengan y del tamao que sean.
Adems, se puede mejorar la separacin poniendo obstculos en su camino. Aqu las
molculas ms pequeas se podrn mover ms gil y rpidamente que las grandes. En la
actualidad se utiliza varios polmeros que forman tales enrejados o mallas y adems
impiden la difusin o prdida de resolucin de la separacin. Estos polmeros forman geles,
especie de gelatinas que permiten mantener un registro estable de las molculas que se
mueven dentro de ellos.
En forma rutinaria, las molculas de ADN se analizan mediante electroforesis en gel. El gel
es una red compleja de molculas polimricas y la distancia que el ADN migra a travs del
gel refleja su tamao, el cual se puede estimar usando fragmentos de ADN marcador como
referencia. La agarosa se usa en el anlisis de molculas de varios cientos hasta 20 000 pares
de bases. El ADN se observa usando luz UV despus de teirlo con bromuro se etidio.
4.2.
OBJETIVOS
Establecer el peso molecular de algunas protenas y la metodologa para lograrlo.
Comprender las diferencias conceptuales de las diversas electroforesis, su variacin,
utilidad y limitacin.
Ensayar la separacin de ADN por medio de electroforesis en gel de agarosa.
Ensayar la revelacin de un gel de agarosa con bromuro de etilio.
Aislar ADN de la bacteria Escherichia Coli
4.3.
JUSTIFICACIN
La electroforesis constituye parte importante del procedimiento rutinario del anlisis delos
cidos nucleicos y protenas. La electroforesis nos ayuda a observar los cidos nucleicos y
protenas al final del procedimiento .El principio bsico de la electroforesis consiste en la
migracin de las molculas a travs de un gel, La agarosa que es un polisacrido, cuyas
disoluciones (tpicamente de 0.5 a 2 %) poseen la propiedad de permanecer liquidas por
encima de 50 grados C y formar un gel, semislido al enfriarse. Este gel est constituido por
una matriz otrama tridimensional de fibras polimricas embebida en gran cantidad de
mediolquido, que retarda el paso de las molculas, se usa usualmente para separar
molculas grandes de alrededor 20.000 nucletidos, en el cual, por accin de un campo

elctrico, sern separadas de acuerdo a su tamao o peso molecular. Para controlar el
avance de la separacin de las molculas en la matriz y establecer un patrn de fragmentos,
las molculas debern ser teidas con diferentes colorantes. Estos pasos facilitan la
visualizacin de las molculas a manera de simples bandas las cuales sern posteriormente
analizada se interpretadas.
La electroforesis en gel de agarosa es de las ms utilizada para analizar y caracterizar cidos
nucleicos de distintas procedencias. Los geles se comportan como un tamiz molecular y
permiten separar molculas cargadas en funcin de su tamao y forma. As, molculas de
DNA de diferente tamao van a emigrar de forma distinta en una electroforesis en gel de
agarosa. Adems, si en dicha electroforesis se aplican marcadores de peso molecular
(fragmentos de DNA de tamao conocido) se puede calcular el tamao aproximado del DNA
en estudio. En biologa molecular, la mayora de los estudios bsicos y aplicados requieren
el uso de la electroforesis; sin embargo, este procedimiento presenta variaciones de
acuerdo al tipo de estudio que se piensa ejecutar. En la electroforesis de tipo vertical, se
analizan tanto molculas de ADN como protenas, mientras que en la electroforesis
horizontal generalmente se trabaja con ADN o ARN.
4.4.
METODOLOGA
Para la muestra del ADN se utiliza E. colli. (Ver practica: Extraccion de ADN)
Preparacin del gel.
Se utiliz una cmara de electroforesis horizontal disponible en el laboratorio.
Preparar 100 mL de solucin de agarosa al 0,8% en un Erlenmeyer:
Pesar 0,8g de agarosa
Agregar 100mL de buffer TBE 10X
Calentar hasta que la agarosa este disuelta, mezclar constantemente, no dejar hervir.
Dejar gelificar la agarosa y retirar los peines.
Colocar los peines en la cmara de electroforesis para hacer las separaciones (pozos).
Verter la solucin tibia, lentamente por uno de los extremos de la bandeja de la cmara
de electroforesis.
Llenar el tanque de la cmara de electroforesis con buffer de carga con pH 8,2
Dejar gelificar la agarosa y retirar los peines.
Colocar los peines en la cmara de electroforesis para hacer las separaciones (pozos).
Verter la solucin tibia, lentamente por uno de los extremos de la bandeja de la cmara
de electroforesis.
Llenar el tanque de la cmara de electroforesis con buffer de carga con pH 8,2.
4.5.
MATERIALES
Cmara de electroforesis Bio-Rad Mini
Preotean III
Fuente de poder (capacidad 300 V, 400
mA)
Beaker con agua para ebullicin (92 C)
Flotador para microtubos
Centrfuga eppendorf
Contenedores de plstico o de vidrio
(12x16x3 cm)
Tubos eppendorf
Vortex
4.6.
RESULTADOS
REACTIVOS
Tris (2-hidroximetil-2-metil-1,3 propanodiol)
Sdio dodecilo sulfato (SDS)
TEMED (N,N,N,N-tetrametilenoetilenodiamina)
Persulfato de amonio (PSA)
2-mercaptoetanol
Glicerol
Azul de bromofenol
Glicina
Azul de Coomassie R-250
Metanol - CH3OH
4.7.
La preparacin de los Buffer se puede considerar como la etapa ms importante del
proceso de separacin por electroforesis, a travs de la prctica se observa que, de la
preparacin y de las caractersticas de los mismos depende el xito de la separacin de
los sectores.
El voltaje marca la rapidez de transicin de cada fragmento del cido nucleico a travs
del buffer de corrido, un voltaje alto har una separacin rpida pero ineficiente asi que
es importante controlar esta variable.
Las celdas de carga se utilizan de acuerdo al objetivo de la separacin, dependiendo de
las caractersticas del cido se puede utilizar las grandes o las pequeas; para efectos de
la prctica se usaron las celdas grandes y las pequeas, fue ms fcil observar la
separacin en las celdas de carga grandes.
4.8.
CONCLUSIONES
Los tres componentes del sistema deben estar en ptimas condiciones para un
funcionamiento adecuado, hallar el balance entre ellos permite una separacin ms
clara al final de la electroforesis.
El principio del mtodo radica en la atraccin de cargas elctricas, la separacin por

filtrado (poros) y la estabilidad de un medio heterogneo por diferencia en densidades.
Pudimos realizar el corrimiento electrofortico de cidos nucleicos extrados y
purificados de la bacteria E. coli.
Y los colocamos en el revelador, en este caso bromuro de etidio y dejamos los geles
aproximadamente 5 minutos.
Precaucin: El bromuro de etidio es u n carcingeno y debe manejarse con cuidado.
Hay que evitar que se derrame la solucin o tener contacto directo con esta.
Po ltimo examinamos el gel bajo la lmpara de luz ultravioleta para determinar la
posicin de las bandas en el gel.
5. CINETICA ENZIMATICA
5.1.
RESUMEN
La cintica enzimtica estudia la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas. Estos
estudios proporcionan informacin directa acerca del mecanismo de la reaccin cataltica y
de la especificidad del enzima. La velocidad de una reaccin catalizada por un enzima puede
medirse con relativa facilidad, ya que en muchos casos no es necesario purificar o aislar el
enzima.
La velocidad de la reaccin catalizada enzimticamente, es directamente proporcional a la
concentracin de sustrato, hasta cierto punto. Cuando la concentracin del sustrato es baja,
una parte de las molculas enzimticas tienen su sitio activo libre. Si aumentamos la
cantidad de sustrato, estos sitios activos libres se unirn a l, acelerando la velocidad de la
reaccin sustrato a productos. Si continuamos aumentado la cantidad de sustrato, llegar
un momento en donde ya no habr ms sitios activos libres, entonces la velocidad de la
reaccin ya no puede aumentar ms. Cuando se llega a este punto se dice que la enzima
est saturada.
5.2.
OBJETIVOS
Comprender y analizar la metodologa establecida para la determinacin de la actividad
enzimtica de la glucosa oxidasa.
Analizar la relacin entre la concentracin de sustrato y su influencia en la actividad
enzimtica.
Conocer el procedimiento experimental para la obtencin de los parmetros cinticos
de la glucosa oxidasa.
Determinar el tipo de inhibicin enzimtica presentada y su fundamento bioqumico
segn los modelos matemticos establecidos.
5.3.
MATERIALES
Esptula 1
Pipetas (5 y 10 ml) 2 de cada una
Pipeteador 1
Baln aforado 25 ml 1
Tubos de ensayo ( 10 ml) 12
Vaso de precipitado (50 ml)
REACTIVOS
Reactivo para la determinacin de

glucosa (GOD POD) 1
Glucosa 1 g
Agua destilada
Espectrofotmetro ( : 510 nm) 1

Balanza analtica 1
Micropipetas 200 l y 1000 l 1 de cada una
Puntas para micropipetas
5.4.
RESULTADOS
Datos y Clculos Iniciales:
En la tabla 1 se muestran los clculos de la concentracin real de las soluciones teniendo
en cuenta la cantidad mezclada con la enzima:
Tabla.1
Cantidad de Sln Total
Cantidda de Enzima
1100 ul
100 ul
CONCENTRACIONES
SOLUCION
[S] Teorica mg/ml
[S] Real mg/ml
1
40
3,636364
2
20
1,818182
3
10
0,909091
4
5
0,454545
5
2,5
0,227273
6
1,25
0,113636
7
0,62
0,056364
A partir de los datos de la tabla 2 se realizan los clculos para las tablas y grficos que se
encuentran posteriormente para cada una de las soluciones:
Tabla 2.
PARAMETROS
Valor
Unidades
Absorbancia a 510um
Concentracion a 510 um
PM Glucosa
PM Acido Gluconico
0,322
0,1
180,1
196,16
mg/ml
g/mol
g/mol
Prueba Solucin N 1.
Los datos tomados en el espectrofotmetro inician en un tiempo cero (cero seg) hasta
estabilizar lectura de absorbancia:
Tabla 3. Datos para la muestra [40 mg/mL]
SOLUCION 1
Tiempo (s)
Absorbancia
[ ] Glucosa (mg/mL)
0,0
4,0
6,5
9,1
14,7
19,6
26,7
0
0,206
0,400
0,600
0,740
0,810
0,868
0
0,06397516
0,12422360
0,18633540
0,22981366
0,25155280
0,26956522
mol glucosa mol Acido

0
0,000355
0,000690
0,001035
0,001276
0,001397
0,001497
0
0,000355
0,000690
0,001035
0,001276
0,001397
0,001497
[ ] Acido
0
0,0696800
0,1353010
0,2029514
0,2503068
0,2739844
0,2936031
37,4
48,6
57,6
60,0
0,882
0,885
0,885
0,885
0,27391304
0,27484472
0,27484472
0,27484472
0,001521
0,001526
0,001526
0,001526
0,001521
0,001526
0,001526
0,001526
0,2983386
0,2993534
0,2993534
0,2993534
Para determinar la concentracin de la glucosa [mg/mL], se utiliz la siguiente ecuacin:

(510 )
(510 )
Para determinar la cantidad de moles de la glucosa, se utiliz la siguiente ecuacin:
Para determinar la concentracin de cido Gluconico, se utiliz la siguiente ecuacin:
NOTA: Se sabe que las moles de cido glunico son equivalentes a las moles de glucosa.
Una vez calculados cada uno de los tems antes mencionados, se procede a graficar la
concentracin del cido gluconico vs el tiempo. (Ver Grfica No. 1)
Grfica 1. Solucin 1: Concentracin Acido vs. Tiempo
Prueba Solucin N 2.

SOLUCION 2
Tiempo (s)
0,0
0,5
5,0
8,9
11,8
15,7
20,2
25,3
29,8
36,4
42,8
54,6
Absorbancia
0
0,077
0,257
0,548
0,684
0,781
0,873
0,911
0,927
0,936
0,938
0,939
[ ] Glucosa (mg/mL)
0
0,02391304
0,07981366
0,17018634
0,21242236
0,24254658
0,27111801
0,28291925
0,28788820
0,29068323
0,29130435
0,29161491

0
0
0,000133
0,000133
0,000443
0,000443
0,000945
0,000945
0,001179
0,001179
0,001347
0,001347
0,001505
0,001505
0,001571
0,001571
0,001598
0,001598
0,001614
0,001614
0,001617
0,001617
0,001619
0,001619
[ ] Acido
0
0,0260454
0,0869309
0,1853623
0,2313646
0,2641751
0,2952943
0,3081479
0,3135600
0,3166042
0,3172807
0,3176190
Prueba Solucin N 3.

SOLUCION 3
Tiempo (s)
0,0
1,2
4,5
7,3
10,2
13,0
15,6
19,2
23,4
28,6
33,4
39,9
50,3
59,0
70,0
Absorbancia
0
0,068
0,155
0,296
0,442
0,583
0,668
0,810
0,902
0,962
0,989
0,999
1,003
1,003
1,003
[ ] Glucosa (mg/mL)
0
0,02111801
0,04813665
0,09192547
0,13726708
0,18105590
0,20745342
0,25155280
0,28012422
0,29875776
0,30714286
0,31024845
0,31149068
0,31149068
0,31149068

0
0
0,000117
0,000117
0,000267
0,000267
0,000510
0,000510
0,000762
0,000762
0,001005
0,001005
0,001152
0,001152
0,001397
0,001397
0,001555
0,001555
0,001659
0,001659
0,001705
0,001705
0,001723
0,001723
0,001730
0,001730
0,001730
0,001730
0,001730
0,001730
[ ] Acido
0
0,0230012
0,0524291
0,1001227
0,1495076
0,1972011
0,2259526
0,2739844
0,3051037
0,3253988
0,3345316
0,3379141
0,3392671
0,3392671
0,3392671
Prueba Solucin N 4.

SOLUCION 4
Tiempo (s)
0,0
1,3
3,2
6,7
9,8
12,5
16,0
19,1
24,4
28,5
33,1
38,9
43,0
49,8
64,0
72,0
Absorbancia
0
0,010
0,084
0,172
0,267
0,366
0,464
0,593
0,716
0,851
0,937
1,007
1,041
1,061
1,068
1,069
[ ] Glucosa (mg/mL)
0
0,00310559
0,02608696
0,05341615
0,08291925
0,11366460
0,14409938
0,18416149
0,22236025
0,26428571
0,29099379
0,31273292
0,32329193
0,32950311
0,33167702
0,33198758

0
0
0,000017
0,000017
0,000145
0,000145
0,000297
0,000297
0,000460
0,000460
0,000631
0,000631
0,000800
0,000800
0,001023
0,001023
0,001235
0,001235
0,001467
0,001467
0,001616
0,001616
0,001736
0,001736
0,001795
0,001795
0,001830
0,001830
0,001842
0,001842
0,001843
0,001843
[ ] Acido
0
0,0033825
0,0284132
0,0581794
0,0903134
0,1238004
0,1569491
0,2005837
0,2421887
0,2878528
0,3169425
0,3406202
0,3521207
0,3588858
0,3612535
0,3615918
Prueba Solucin N 5.
Tabla 7. Datos para la muestra [2,5 mg/mL]

SOLUCION 5
Tiempo (s)
0,0
2,6
5,9
9,4
12,2
17,6
21,0
29,0
35,2
41,6
48,0
54,1
63,0
90,0
113,0
Absorbancia
0
0,033
0,078
0,129
0,200
0,291
0,365
0,489
0,593
0,700
0,800
0,900
1,000
1,094
1,096
[ ] Glucosa (mg/mL)
0
0,01024845
0,02422360
0,04006211
0,06211180
0,09037267
0,11335404
0,15186335
0,18416149
0,21739130
0,24844720
0,27950311
0,31055901
0,33975155
0,34037267

0
0
0,000057
0,000057
0,000135
0,000135
0,000222
0,000222
0,000345
0,000345
0,000502
0,000502
0,000629
0,000629
0,000843
0,000843
0,001023
0,001023
0,001207
0,001207
0,001379
0,001379
0,001552
0,001552
0,001724
0,001724
0,001886
0,001886
0,001890
0,001890
[ ] Acido
0
0,0111623
0,0263837
0,0436346
0,0676505
0,0984314
0,1234621
0,1654054
0,2005837
0,2367767
0,2706019
0,3044271
0,3382524
0,3700481
0,3707246
Prueba Solucin N 6.
SOLUCION 6
Tiempo (s)
0,0
9,2
16,2
19,0
31,1
39,6
44,5
48,8
57,8
75,0
80,0
87,0
104,0
112,0
121,0
140,0
160,0
199,0
213,0
Absorbancia
0
0,018
0,080
0,100
0,200
0,250
0,300
0,325
0,400
0,500
0,550
0,600
0,700
0,750
0,800
0,900
1,000
1,100
1,107
[ ] Glucosa (mg/mL)
0
0,00559006
0,02484472
0,03105590
0,06211180
0,07763975
0,09316770
0,10093168
0,12422360
0,15527950
0,17080745
0,18633540
0,21739130
0,23291925
0,24844720
0,27950311
0,31055901
0,34161491
0,34378882

0
0
0,000031
0,000031
0,000138
0,000138
0,000172
0,000172
0,000345
0,000345
0,000431
0,000431
0,000517
0,000517
0,000560
0,000560
0,000690
0,000690
0,000862
0,000862
0,000948
0,000948
0,001035
0,001035
0,001207
0,001207
0,001293
0,001293
0,001379
0,001379
0,001552
0,001552
0,001724
0,001724
0,001897
0,001897
0,001909
0,001909
[ ] Acido
0
0,0060885
0,0270602
0,0338252
0,0676505
0,0845631
0,1014757
0,1099320
0,1353010
0,1691262
0,1860388
0,2029514
0,2367767
0,2536893
0,2706019
0,3044271
0,3382524
0,3720776
0,3744454
Prueba Solucin N 7.
SOLUCION 6
Tiempo (s)
0,0
8,6
14,2
19,0
23,6
28,5
39,2
51,2
65,0
77,0
92,0
105,0
121,0
137,0
155,0
173,0
213,0
238,0
260,0
Absorbancia
0
0,010
0,030
0,060
0,080
0,100
0,150
0,200
0,225
0,300
0,350
0,400
0,450
0,500
0,550
0,600
0,700
0,750
0,800
[ ] Glucosa (mg/mL)
0
0,00310559
0,00931677
0,01863354
0,02484472
0,03105590
0,04658385
0,06211180
0,06987578
0,09316770
0,10869565
0,12422360
0,13975155
0,15527950
0,17080745
0,18633540
0,21739130
0,23291925
0,24844720

0
0
0,000017
0,000017
0,000052
0,000052
0,000103
0,000103
0,000138
0,000138
0,000172
0,000172
0,000259
0,000259
0,000345
0,000345
0,000388
0,000388
0,000517
0,000517
0,000604
0,000604
0,000690
0,000690
0,000776
0,000776
0,000862
0,000862
0,000948
0,000948
0,001035
0,001035
0,001207
0,001207
0,001293
0,001293
0,001379
0,001379
[ ] Acido
0
0,0033825
0,0101476
0,0202951
0,0270602
0,0338252
0,0507379
0,0676505
0,0761068
0,1014757
0,1183883
0,1353010
0,1522136
0,1691262
0,1860388
0,2029514
0,2367767
0,2536893
0,2706019
CINETICA ENZIMATICA
Para la construccin de la siguiente tabla se tomaran los clculos de las concentraciones
reales de la Tabla 1, as como cada una de las pendientes calculadas en las grficas (graficas
del 1 al 7).
Tabla 10. Cintica enzimtica
[S] Terica mg/ml [S] Real mg/ml [U] Actividad
1/[S]
1/U
40
3,636363636
0,0035
0,275
285,714
20
1,818181818
0,0052
0,550
192,308
10
0,909090909
0,0045
1,100
222,222
0,454545455
0,0053
2,200
188,679
2,5
0,227272727
0,0035
4,400
285,714
1,25
0,113636364
0,0018
8,800
555,556
0,62
0,056363636
0,0010
17,742
1000,0
NOTA: como es una reaccin enzimtica linealizada se debe calcular el inverso de la concentracin
del sustrato y de la actividad para cada una de las pruebas.
A travs de la grfica No.8, se obtiene la ecuacin que nos permite determinar la velocidad
de reaccin y posteriormente la cintica enzimtica.
Grfica 8. Sustrato vs. Actividad
Ecuacin obtenida de la grfica:

1
= 45,618 1
+ 161,5
Por lo tanto la velocidad mxima que se puede dar es:

1
=
161,5
= 0,00619
As la cintica enzimtica es:
=
5.5.
45,618
= 0,282
En las siete concentraciones evaluadas se observan graficas con un comportamiento
similar en cuanto a la actividad enzimtica, en todas hay un aumento del contenido de
cido glucnico, as pues queda demostrado que hay actividad enzimtica en los ocho
ensayos.
Una vez se analizan los grficos obtenidos, se establece que la mayora de ellos se pueden
considerar como curvas de actividad enzimtica de tipo Micheliano en donde la etapa de
actividad de la enzima es proporcional y as mismo lo es la produccin del acido
glucnico, dando como resultado que el punto de Km se logra en un periodo de tiempo
ms corto.
Una vez se efectan todas las lecturas en el espectrofotmetro, se realizan los clculos
a partir de las absorbancias generadas por el equipo y que al final permite correlacionar
la cantidad de glucosa con la cantidad de cido glucnico generado, de acuerdo a las
tablas se observa que a la concentracin de 1.25 mg/ml se logra tener una mayor
actividad enzimtica pues el valor de cido glucnico producido al final del tiempo es
mayor (0.374 mg/ml) que el del resto de concentraciones de glucosa, aunque requiera
de mayor tiempo para hacerlo.
La muestra con mayor actividad en el tiempo es la solucin con una concentracin de
40mg/ml, se pudo establecer que a los 4 segundos ya llega a reportar absorbancias por
encima de 0.2.
Segn la tabla y la grfica 10, la actividad enzimtica para este ensayo se da de manera
lineal, la enzima utilizada (kit enzimtico) Glucosa Oxidasa y Peroxidasa mantiene una
actividad constante a travs del tiempo. Las unidades de actividad enzimtica calculadas
son directamente proporcionales al tiempo transcurrido en el proceso.
5.6.
CONCLUSIONES
En general el proceso enzimtico con la glucosa es exitoso, en la mayora de
concentraciones se evidencia actividad de las enzimas evaluadas Glucosa Oxidasa y
Peroxidasa (Kit enzimtico).
Las grficas obtenidas para cada concentracin se describen con un comportamiento
Micheliano, en donde el aumento del es producto progresivo para la mayora de
concentraciones.
La actividad enzimtica de la Glucosa Oxidasa y Peroxidasa es lineal, las unidades de
actividad enzimtica crecen de manera proporcional al tiempo que dure el proceso
(produccin de cido glucnico y agua).
6. INMOVILIZACION ENZIMATICA Y CELULAR

6.1.
RESUMEN
El principal objetivo de esta prctica es la inmovilizacin de una enzima, referida como el
confinamiento de la enzima en un material inerte, insoluble, para separarla y retener su
actividad cataltica y reutilizarla posteriormente.
6.2.
OBJETIVOS
Inmovilizar una enzima libre en alginato de sodio por atrapamiento.
Inmovilizar clulas de levadura en alginato de sodio por atrapamiento.
6.3.
PRINCIPIOS TEORICOS
El mtodo de atrapamiento est basado en la localizacin de una enzima dentro de un
enrejado de una matriz polimrica o membrana de tal forma que previene la liberacin de
protena mientras permite la penetracin de substrato. Este mtodo es de los ms
utilizados, es recomendable procurar que la inmovilizacin incremente la afinidad por el
sustrato, disminuya la inhibicin, ampli el intervalo de pH ptimo y reduzca las posibles
contaminaciones microbianas.
Ventajas de las enzimas inmovilizadas:
Enzimas estables.
Reutilizacin, por ende disminuyen los costos.
Desventajas de las enzimas inmovilizadas:
Posible modificacin en la conformacin de la enzima, frente a su estado natural.
Puede haber una prdida de actividad de la enzima durante la inmovilizacin.
6.4.
METODOLOGA:
Procedimiento Con Invertasa
A. Preparar 100 ml de disolucin de Alginato de Sodio al 3.0%. Para lograr la disolucin
completa se debe calentar la mezcla a temperatura aproximadamente 80C con
agitacin constante y luego enfriar la disolucin a una temperatura de 30C.
B. Agregar a la disolucin de alginato, con agitacin constante, 1 ml de la disolucin de
acuosa de la enzima invertasa 0,1 g/L.
C. Extruir la mezcla anterior a travs de una jeringa, sta se debe llevar a cabo gota a gota
y en forma continua.
D. Recoger la mezcla extruida en un vaso precipitado de 250 ml que contenga una
disolucin de Cloruro de Calcio, con un sistema de agitacin constante. Por la accin del
in del calcio las gotas se gelifican espontneamente formando perlas de alginato de

calcio con la enzima invertasa atrapada dentro de la estructura gelificada.
E. Lavar la perlas gelificadas con agua y colocarlas luego en una solucin de Sacarosa al 4%
y llevarlo a una temperatura de 40C.
F. Medir una alcuota de la disolucin de Sacarosa y colocarlos en dos microtubos
marcados.
Procedimiento Con Levadura:
A. Preparar 100 ml de disolucin de Alginato de Sodio al 3.0%. Para lograr la disolucin
completa se debe calentar la mezcla a temperatura aproximadamente 80C con
agitacin constante y luego enfriar la disolucin a una temperatura de 30C.
B. Agregar a la disolucin de alginato, con agitacin constante, 2 ml de la disolucin de
acuosa de la enzima levadura 0,1 g/L.
C. Extruir la mezcla anterior a travs de una jeringa, sta se debe llevar a cabo gota a gota
y en forma continua.
D. Recoger la mezcla extruida en un vaso precipitado de 250 ml que contenga una
disolucin de Cloruro de Calcio, con un sistema de agitacin constante. Por la accin del
in del calcio las gotas se gelifican espontneamente formando perlas de alginato de
calcio con la enzima levadura atrapada dentro de la estructura gelificada.
E. Lavar la perlas gelificadas con agua y colocarlas luego en una solucin de Glucosa al 1%
y llevarlo a una temperatura de 40C.
F. Medir una alcuota de la disolucin de glucosa y colocarlos en dos microtubos marcados.
6.5.
MATERIALES
Balanza analtica 1
Micropipetas 200 l y 1000 l
Puntas para micropipetas
Esptula 1
Pipetas estriles (5 y 10 ml) 2 de cada una
Pipeteador 1
Tubos de ensayo cnicos para

centrifuga de 20 ml 4
Tubos de ensayo (10 ml) 12
Elenmeyer (250 ml) 14
Vidrio de Reloj
Vaso de precipitado (250 ml)
REACTIVOS
Alginato de Calcio
Cloruro de Calcio
Invertasa
6.6.
Levadura
Sacarosa
Agua destilada
RESULTADOS
6.7.
Como producto del avance de la biotecnologa y su aplicacin en procesos industriales
para la obtencin de productos qumicos, farmacuticos o alimentarios se ha recurrido al
uso de enzimas. stas presentan grandes ventajas sobre catalizadores no biolgicos, entre
ellas gran actividad cataltica, a temperatura ambiente y presin atmosfrica, y gran
especificidad de sustrato. La inestabilidad que presentan en los procesos qumicos
industriales y la dificultad de poder separarse de sustratos y productos, todos solubles en
agua, hacen que las enzimas no se puedan reutilizar. Como alternativa se ide el mtodo
de inmovilizarlas a un soporte inerte para hacer factible que un proceso biotecnolgico
sea rentable
6.8.
CONCLUSIONES
No es posible observar la actividad enzimtica de la Invertasa, el tiempo en el que el
jarabe de sacarosa estuvo en contacto con las capsulas fue muy corto y con una
temperatura algo baja.
Respecto a la reaccin de la levadura no se observa generacin de gas carbnico en la
reaccin con la solucin azucarada, se requiere mejorar las condiciones ambientales y
mayor tiempo para asegurar una reaccin mas efectiva.

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BIOTECNOLOGIA ALIMENTARIA

UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA

CINETICA Y CRECIMIENTO MICROBIANO ................................................................................ 5

DIAGRAMA DE FLUJO (METODOLOGA) .......................................................................... 5

MATERIALES Y REACTIVOS .............................................................................................. 6

DISCUSION DE RESULTADOS ........................................................................................... 7

EXTRACCIN DE ADN ............................................................................................................. 9

MATERIALES Y REACTIVOS ............................................................................................ 13

DISCUSION DE RESULTADOS ......................................................................................... 14

ELECTROFORESIS PROTEICA ................................................................................................. 15

MATERIALES Y REACTIVOS ............................................................................................ 17

DISCUSION DE RESULTADOS ......................................................................................... 18

CINETICA ENZIMATICA ......................................................................................................... 20

MATERIALES Y REACTIVOS ............................................................................................ 20

DISCUSION DE RESULTADOS ......................................................................................... 30

INMOVILIZACION ENZIMATICA Y CELULAR............................................................................ 32

MATERIALES Y REACTIVOS ............................................................................................ 34

DISCUSION DE RESULTADOS ......................................................................................... 34

2. CINETICA Y CRECIMIENTO MICROBIANO

DIAGRAMA DE FLUJO (METODOLOGA)

Bao termostatado o Shaker con

ABSORBANCIA (600NM) SEGN SUSTRATO

Tabla 1. Lectura de Absorbancia para determinacin de Cintica de crecimiento microbiano

Grafico 1. Relacin Tiempo y Absorbancia

En cuanto al desarrollo de la prctica, cabe destacar la importancia de factores y

Propagar un cultivo de E. coli en 50 ml de medio

Transfiera 15 ml de la suspensin de clulas a un

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Descartar el sobrenadante, resuspenda las

Localice la punta doblada del capilar en la

Disuelva el ADN en 700 l de buffer TE con muy

Purificacin de ADN (Extraccin fenlica):

26. Disuelva el ADN en 500 l de buffer TE y prepare diluciones para evaluacin

molculas grandes de alrededor 20.000 nucletidos, en el cual, por accin de un campo

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Reactivo para la determinacin de

Espectrofotmetro ( : 510 nm) 1

mol glucosa mol Acido

Para determinar la concentracin de la glucosa [mg/mL], se utiliz la siguiente ecuacin:

Para determinar la cantidad de moles de la glucosa, se utiliz la siguiente ecuacin:

Para determinar la concentracin de cido Gluconico, se utiliz la siguiente ecuacin:

Tabla 4. Datos para la muestra [20 mg/mL]

mol glucosa mol Acido

Tabla 5. Datos para la muestra [10 mg/mL]

mol glucosa mol Acido

Tabla 6. Datos para la muestra [5 mg/mL]

mol glucosa mol Acido

Tabla 7. Datos para la muestra [2,5 mg/mL]

mol glucosa mol Acido

mol glucosa mol Acido

Grfica 6. Solucin 6: Concentracin Acido vs. Tiempo

mol glucosa mol Acido

Grfica 7. Solucin 7: Concentracin Acido vs. Tiempo

Ecuacin obtenida de la grfica:

Por lo tanto la velocidad mxima que se puede dar es:

6. INMOVILIZACION ENZIMATICA Y CELULAR

in del calcio las gotas se gelifican espontneamente formando perlas de alginato de

Tubos de ensayo cnicos para

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