28/3/2016

Diagnsticomicrobiolgicodelasinfeccionesviralesrespiratorias| EnfermedadesInfecciosasyMicrobiologaClnica

Diagnsticomicrobiolgicodelasinfeccionesviralesrespiratorias
Microbiologicaldiagnosisofviralrespiratoryinfections
JosM.Eirosa ,RalOrtizdeLejarazua ,AlbertoTenorioa ,InmaculadaCasasb ,FranciscoPozob ,GuillermoRuizb ,Pilar
PrezBreab
a CentroNacionaldelaGripe,FacultaddeMedicinadeValladolid,Valladolid,Espaa.
b CentrodeGripedelCentroNacionaldeMicrobiologa,Majadahonda,Madrid,Espaa.

PalabrasClave
Virusrespiratorios.Diagnsticovirolgico.Virusdelagripe.Diagnsticomicrobiolgicomolecular.

Keywords
Respiratoryviruses.Virologicaldiagnosis.Influenzavirus.Molecularmicrobiologydiagnosis.

Resumen
Lainfeccinrespiratoriaagudaeslaenfermedadmsfrecuentealolargodetodalavidadelserhumano,conuna
variacinencuantoasuetiologacondicionada,fundamentalmente,porlaedad,lascircunstanciasmedioambientales,el
mbitoasistencialylaenfermedaddebase.Sehanidentificadomsde200virusdiferentesdistribuidosenseisfamilias
implicadosenlapatogeniadelasinfeccionesdeltractorespiratorio.Estoshechosgeneranunademandadiagnstica,
cuyaincorporacinalmbitoasistencialnodebeserretrasada.ConscientedeellolaSociedadEspaolade
EnfermedadesInfecciosasyMicrobiologaClnicaharedactadounprocedimientosobrediagnsticomicrobiolgicodelas
infeccionesviralesrespiratorias.Ensteseefectaunapuestaaldadelasinfeccionesdebidas,enprimertrmino,alos
virusdelagripey,ensegundolugar,aotrosvirusrespiratoriosconvencionalesyemergentes.Entodosloscasosse
revisanlosmtodosdediagnsticovirolgicodirecto(cultivocelular,deteccindeantgenosydecidonucleico),con
particularreferenciaalastcnicasdedeteccinmolecularydecaracterizacingentica.

Abstract
Acuterespiratoryinfectionisthemostcommondiseaseoccurringoveraperson'slifetime,withetiologicalvariations
determinedmainlybyage,environmentalcircumstances,thehealthcaresetting,andtheunderlyingpathology.Morethan
200differentvirusesdistributedinsixviralfamilieshavebeenimplicatedinthepathogenesisofrespiratorytractinfection.
Thesefactsaregeneratinganincreasingdiagnosticdemandthatshouldbeincorporatedintothehealthcaresettingwithout
delay.Tomeetthisdemand,theSpanishSocietyofInfectiousDiseasesandClinicalMicrobiologyhasupdateditsStandard
Procedureforthemicrobiologicaldiagnosisofviralrespiratoryinfection.Thisdocumentcontainsanupdateprimarilyof
infectionscausedbyinfluenzaviruses,andsecondarily,infectionsduetootherconventionalandemergingrespiratory
viruses.Inallcases,themethodsfordirectvirologicaldiagnosis(cellculture,anddetectionofantigensandnucleicacid)are
reviewed,withspecialreferencetotechniquesformoleculardetectionandgeneticcharacterization.

Artculo
Introduccin
Lainfeccinrespiratoriaagudaeslaenfermedadmsfrecuentealolargodetodalavidadelserhumano,convariacinen
cuantoasuetiologacondicionada,fundamentalmente,porlaedad,lascircunstanciasmedioambientales,elmbito
asistencialylaenfermedaddebase.Ennuestroentornolasenfermedadesinfecciosassonelmotivomsfrecuentedelas
consultasenpediatraextrahospitalariadeellas,aproximadamenteel70%correspondeaunainfeccinrespiratoriayms
delamitadsondeorigenviral.Lamayoradelasinfeccionesrespiratoriassloafectanaltractorespiratoriosuperiory
puedenserconsideradasleves,decursobenignoyautolimitado(catarrocomn,rinitisyfaringoamigdalitis).Seestimaque
alrededordel5%puedeimplicaraltractorespiratorioinferior(bronquitis,bronquiolitisyneumona),sonpotencialmente
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msgravesy,enmuchoscasos,requierenelingresohospitalario.Enedadadultalasinfeccionesrespiratoriasdeorigen
viralsonunacausaimportantedemorbilidadsinembargo,loscuadrosclnicosqueprecisanatencinmdica
prcticamenteselimitanaancianos,pacientesconinmunodeficienciagraveoaaquellosconenfermedadpulmonar
subyacente.
Sehanidentificadomsde200virusdiferentes,distribuidosenseisfamilias(tabla1),implicadosenlapatogeniadelas
infeccionesdeltractorespiratorio.
Tabla1.Diferentesvirusdistribuidosporfamiliasygnerosrelacionadosconsndromesrespiratoriosenelser
humano

Familia

Gnero

Orthomyxoviridae InfluenzavirusA

Virus

VirusdelagripeA

Tiposy
subtipos
H1N1,
H3N2,
H5N1,
H7N7,
H7N3,
H9N2

VirusdelagripeB
VirusdelagripeC
Virusparainfluenza1,virus

Paramyxoviridae Respirovirus
parainfluenza3
Virusparainfluenza2,virus VPI4A,

Rubulavirus
parainfluenza4
VPI4B

Metapneumovirus
Metapneumovirushumano
VRSA,

Virusrespiratoriosincitial
Pneumovirus
VRSB

Picornaviridae
Enterovirus,Rhinovirus
Coronavirus229E,
CoronavirusOC43,
Coronaviridae
Coronavirus
CoronavirusSARS,

CoronavirusNL63,
CoronavirusHKU1
Adenovirus

Adenoviridae
Mastadenovirus
Bocavirushumano

Parvoviridae
Bocavirus
InfluenzavirusB
InfluenzavirusC

Comocaractersticageneral,cadaunodelosviruspuedeserelagenteetiolgicodemsdeunsndromediferente(tablas
2y3).Sinembargo,cadaunodeellosserelacionamayoritariamenteconuntipoparticulardeenfermedad,segnelrea
geogrfica,laestacionalidadylaedaddelpaciente.Enestesentido,ennuestroentornolosrinovirussonlacausams
frecuentedecatarrocomnenlosadultos,elvirusrespiratoriosincitial(VRS)eselmsprevalenteenlasbronquiolitisde
niosdecortaedadyelvirusparainfluenzatipo1eselagentecausaldelmayornmerodecasosde
laringotraqueobronquitisaguda.Lascaractersticasepidemiolgicasdealgunosdeestosviruslesconfierenpropiedades
quetambinpuedenseridentificativas.Losvirusparainfluenza1y2,virusdelagripeyVRSsuelenaparecerdeforma
epidmica,convariabilidadestacionalentreellos.
Tabla2.Etiologaviraldelossndromesrespiratoriosmsfrecuentementedocumentadosenadultos
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Virus
Virusrespiratorio
sincitial
Virusparainfluenza1
Virusparainfluenza2
Virusparainfluenza3
Virusparainfluenza4
Metapneumovirus
humano
VirusinfluenzaA
VirusinfluenzaB
Rinovirus
Coronavirus
Enterovirus
Adenovirus

Catarro
comn

Faringitis Traqueobronquitis Neumona

+
+
+
+

+
+
+
+

+
+
+
+

+
+
4+
+
+
+

2+
2+
2+
+
+
+

3+
2+
+
+
+
+

2+
+
+
+
+
+

Smbolosdefrecuenciarelativa:+(casoaislado),2+(pequeaproporcindecasos),3+(proporcinconsiderablede
casos),4+(mayoradeloscasos).
Tabla3.Etiologaviraldelossndromesrespiratoriosmsfrecuentementedocumentadosennios

Virus

Catarro
Laringotraqueobronquitis
Faringitis
Neumona Bronquiolitis
comn
(crup)

Virusrespiratorio
3+
sincitial
Virus
3+
parainfluenza1
Virus
2+
parainfluenza2
Virus
3+
parainfluenza3
Virus
2+
parainfluenza4
Metapneumovirus
2+
humano
VirusinfluenzaA 2+
VirusinfluenzaB 2+
Rinovirus
2+
Coronavirus
+
Enterovirus
+

2+

2+

4+

4+

2+

4+

2+

2+

2+

2+

3+

3+

2+

3+

2+
2+
2+
+
+

2+
+
+
+
+

3+
+
+
+
+

3+
+
+
+
+

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Adenovirus
Bocavirus
humano

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3+

2+

2+

2+

2+

3+

Smbolosdefrecuenciarelativa:+(casoaislado),2+(pequeaproporcindecasos),3+(proporcinconsiderablede
casos),4+(mayoradeloscasos).
Lasfocalidadesinfecciosas,consideradasconuncriteriodidctico,sonlassiguientes:resfriadocomn,faringitisaguda,
laringitisaguda,laringotraqueobronquitisaguda,otitismediaaguda,sinusitis,epiglotitis,bronquitisaguda,exacerbacin
delaenfermedadpulmonarobstructivacrnica,bronquiolitisyneumona.

Diagnsticovirolgicodelosvirusdelagripe
Eneldiagnsticodelagriperesultafundamentalsudocumentacinvirolgica,querepresentaunaayudaprimordialenel
manejodelpacienteyelcontroldelosbrotesepidmicosanuales 1 .Desdeunpuntodevistaterico,estediagnstico
puedeadoptarunadobleestrategia.Deunaparte,laquesefundamentaenmtodosdirectos,comolosquesoncapaces
derecuperarelvirusmediantesuaislamientoencultivocelularyaquellosquepermitendetectarelvirusenlas
secrecionesrespiratoriasdelpaciente(deteccindeantgenosydecidosnucleicos).Deotraparte,eldiagnstico
indirectoquevalora,porelmomento,lainduccindeunarespuestainmunitariadetipohumoralmedianteladeteccinde
anticuerposespecficosensuero2 .
Ladeteccindeantgenosycidosnucleicospermitelarealizacindeundiagnsticorpido,queayudaalatomade
decisionesteraputicas.Porelcontrario,elaislamientoencultivocelularesundiagnsticolentoytardoenlahistoria
naturaldelainfeccingripal,perodeextraordinariaimportanciaenlacaracterizacinepidemiolgica,antignicay
filogenticadeestosvirus.Enlaactualidad,elintersdelaserologaseencuentraprincipalmenteenlarealizacinde
estudiospoblacionalesdecoberturavacunal.
Recogidaytransportedemuestras
Elrequisitoprincipalalahoradevalorarlasmuestrasdeltractorespiratorioesquestasdebencontenerelmayornmero
posibledeclulasepiteliales,quesonenlasquefundamentalmentesereplicaelvirus.Enestesentido,resultan
apropiadasparalainvestigacindevirusgripaleslasmuestrasrespiratoriastalescomolosfrotisdefaringeonasofaringe
yloslavadosoaspiradosnasalesobronquiales,obtenidosdurantelosprimerosdasdelaenfermedad.
Eltransportedelasmuestrasdeberealizarsea4C(oensudefectocongeladasa70C)conobjetodeasegurarla
infectividaddelaspartculasvirales.Larecuperacindelosvirusgripalessefavorececonunmediodetransporte
adecuado,queconsisteenunasolucinsalinaapHneutroconestabilizadoresdeprotenas,comoelsuerodealbmina
bovina,yantibiticosparareducirelcrecimientodebacteriasqueintegranlamicrobiotaacompaante.
Aislamientomediantecultivo
Losvirusdelagripesoncapacesdereplicarseendiferenteslneascelularesprimarias,diploidesocontinuas,aunquela
susceptibilidadalainfeccinesbajaenlamayoradeellas.Lalneacelularmscomnmenteutilizadasonlasclulas
MadinDarbyderindeperro(MDCK).Laslneascelularesinoculadasconlasmuestrasrespiratoriasdelospacientesse
incubana3335Cenpresenciadetripsinaparaasegurarlaactivacinproteolticadelosvirus.Laidentificacinde
crecimientodelvirussobrelamonocapadeclulasserealizademodoconvencionalmediantelaobservacindelefecto
citopticocausadoenellas,queconsisteenlaaparicindeclulasdegenerativasyredondeadasquesedesprendende
lamonocapa.Lacaracterizacindelvirusaisladoseefectaporinmunofluoresceniamediantelautilizacindeanticuerpos
monoclonales.Enocasiones,elefectocitopticoesdifcildeapreciarporloqueesnecesariodisponerdeotrosmtodos
paraidentificarelcrecimientoviralenloscultivoscelulares,comolahemaglutinacin,lahemadsorcinoladeteccinde
antgenosviralescontcnicasdeinmunofluorescencia.
Unadelasprincipaleslimitacionesdelaislamientodelosvirusdelagripeeseltiemponecesariodecrecimientoe
identificacinencultivocelular(47das).Hayvariosmtodoscapacesdedetectarlosvirusdelagripedemodoms
precoz,entre1y3dasdespusdelainoculacindelalneacelularyantesdelaaparicindelefectocitoptico.Elms
comnmenteutilizadoeselShellvial,enelquelasmuestrassondirectamentecentrifugadassobrelamonocapacelular
parafacilitarlaadherenciaylapenetracinviral.Posteriormente,alas2448hsedetectalapresenciadeprotenasvirales
medianteinmunofluorescencia.
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Losvirusdelagripetambinpuedenaislarsetrasinocularlamuestraenlacavidadalantoideadehuevosdegallina
embrionados,yaqueestosvirussereplicanprofusamenteenlasclulastrassuincubacina3335Cdurante3das
paralosaisladosdevirusdelagripeprocedentesdemamferos,ya37CparalosaisladosaviaresdevirusdelagripeA.
Unavezfinalizadalaincubacin,sedebeanalizarporhemaglutinacinlosfluidosamniticoyalantoideoenbuscade
actividadviral.LosvirusdelagripeC,sinembargo,solamentecrecenenlacavidadamniticadelosembrionesdepollo.
Deteccindeantgenosvirales
Laprincipalventajadelosmtodosbasadosenladeteccindelosantgenosviralesessuindependenciadela
infectividaddelvirus,aunquelacalidaddelamuestraesmuyimportante.Entresusventajasdestacaelhechodeque
permiteunarpidaobtencinderesultados,generalmenteenunaspocashorasdespusdelarecepcindelamuestra.
Comolimitacinreseablecabeapuntarquelosresultadosamenudosondifcilesdeinterpretar,laespecificidad
dependerdelaexperienciadelpersonalquelosrealiceylasensibilidadsueleserbaja.Losmtodosde
inmunofluorescenciayenzimoinmunoanlisis(EIA)seempleanhabitualmenteparaladeteccindelosantgenosvirales
directamenteenlamuestraclnicaobienenlasclulasdelcultivoenlasquepreviamentesehainoculadolamuestra.
Losantgenosviralesutilizadosgeneralmenteparaeldiagnsticoson,enprincipio,lasmolculasquesesitanenla
superficiedelvirus,lahemaglutininaylaneuraminidasa,yquetambinpuedenencontrarsefrecuentementeenla
superficiedelasclulasinfectadas.Noobstante,puestoqueestasmolculasestnsometidasaunacontinuavariacin
evolutiva,tambinesposibleemplearotrasprotenasmenosaccesiblesdelvirus,comolanucleoprotena,yporello
menosvariables.Unaspectoadicionalderivadodenuestraactividadenlaboratoriosdereferenciadegripeesque,con
objetoderealizarvigilanciayestudiosepidemiolgicos,esimportanterealizarlasubtipificacindelosvirusdelagripeA.
LadiferenciacindelvirusdelagripeAdeltipoBestanimportantecomoladiferenciacindelossubtiposH1yH3dentro
delosvirusdelagripeA.
Adicionalmente,sehancomercializadotcnicasdeinmunocromatografacapilarydeenzimoinmunoanlisisdemembrana
queposibilitandetectarvirusgripalesosusantgenosenpocosminutosycuyalecturaesvisual.Noobstante,suutilidad
sevelimitadadebidoasucosteybajassensibilidadyespecificidad.Porsuampliaimplantacinenlaasistenciaurgentey
enelmbitopeditricorecogemosenlatabla4diferentespruebasdedeteccinrpidadisponiblesenelmomentoactualy
sealudeasuscaractersticasoperacionalesintrnsecas.
Tabla4.Diferentespruebasdedeteccinrpidadeantgenosdisponiblesparavirusgripales,conalusinasus
caractersticasoperacionalesintrnsecas

Denominacin Compaa Virus Muestras

Aspiradoy
DirectigenFlu
lavadonasal,
BD
A

torunda
A
nasofarngea
Aspiradoy
DirectigenFlu
lavadonasal,
BD
AyB

torunda
A+B
nasofarngea
Aspiradonasal,

Biostar
AyB esputo,torunda
FLUOIA
nasofarngea
Aspiradonasal,

Biostar
AyB esputo,torunda
FLUOIAA/B
nasofarngea
Lavadonasal,
XPECTFLU
Remel
AyB torunda
A&B
nasofarngea
Lavadonasal,
NOWInfluenza

Sensibilidad Especificidad
6796%

88100%

A:96%B:
88%

A:99%B:
97%

6288%

528%

8095%

6070%

A:89100% A:100%B:
B:93100% 100%
A:100%B: A:9293%B:

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Binax

A&B

QuickVue
Quidel
InfluenzaTest
QuickVue
Influenza
A+BTest

Quidel

SASFluAlert

SA
Scientific

ZstatFlu

ZymeTx

ClearviewExact
Inverness
InfluenzaA&B

AyB torunda
nasofarngea
Aspiradoy
lavadonasal,
AyB
torunda
nasofarngea
Aspiradoy
lavadonasal,
AyB
torunda
nasofarngea
Aspiradoy
AyB lavado
nasofarngeo
Torunda
AyB
nasofarngea
Lavadonasal,
AyB torunda
nasofarngea

92100%

9499%

7381%

9699%

A:7277% A:9699%B:
B:7382% 9699%

6584%

9599%

6596%

7798%

A:81,7%B: A:98%B:
88,6%
97%

Deteccindecidosnucleicos
Losmtodosmolecularesdediagnsticoquepermitenladeteccindecidosnucleicosestnbasadosenlabsqueday
elreconocimientodelgenomaviralenlamuestraclnicaoenelcultivoviralyenlatabla5estnresumidoslosmtodos
molecularesquepuedenserutilizadosenladetecciny/olacaracterizacindevirusgripales.
Tabla5.Caractersticasdelosmtodosmolecularesdisponiblesparaladeteccindevirusgripales

Mtodo

Ventajas
Sensibley
especfico.Permite
PCRsimple anlisisposteriores
delproducto
amplificado
Sensibley
especfico.Permite
PCR
detectarmsdeuna
mltiple
dianaporensayo.
Permiteanlisis
posteriores
Sensibley
especfico.Elevado
PCREIA
rendimiento.Puede
sermltiple
Sensibley

Desventajas

Unadianaporensayo

Losmtodosnocomercialesrequierenuna
optimizacinexhaustivaparaasegurarla
ausenciadefalsosnegativosylacompeticin
entreiniciadores
Nopermiteelanlisisposteriordelos
productos.Requiereevaluacinyvalidacin
minuciosaantesdelaintegracinsistemtica
Requiereequipamientoespecfico.No
siempreesposibleelanlisisdelproducto.

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PCRa
especfico.Rpido.
tiemporeal Permitecuantificar.
Puedesermltiple

Lacapacidaddeanalizarvariosgeneso
patgenosenformatomltipleestlimitada
porlascaractersticasdeltermociclador

Sensibley
Utilizatresenzimas.Procedimientolargoy
especfico.Permite costoso.Nosiempreesposibleelanlisis
cuantificar
delproducto
Sensibley
especfico.
Requiereequipamientoespecficoyamplio
Microarrays Deteccinde
desarrollo.Nopermiteelanlisisposteriorde
muchasdianasenun losproductos
soloensayo
NASBA

Tcnicasdeamplificacingenmicabasadasenlareaccinencadenadelapolimerasa
Lareaccinencadenadelapolimerasa(PCR)eslatcnicamsempleada,tantoensuvertienteclsicaoatiempofinal
comoenladetiemporeal.Enambaslareaccindeamplificacintienequeirprecedidadeunatranscripcininversapara
transformarenADNcualquieradelos8segmentosdeARNquecontieneelgenomadelosvirusdelagripeAyBodelos7
segmentosdelgenomadelvirusdelagripeC.
NormalmenteestastcnicasdePCRseencuentrandiseadasengenesmuyconservados,comolosquecodificanpara
laprotenamatriz(M),lanucleoprotena(NP)oelsegmentognicoNS,quenospermitirndiferenciarentrelostres
gneros:InfluenzavirusA,BoC.OtrosgenesdianaenladeteccindeInfluenzavirusA,sonlahemaglutinina(HA)yla
neuraminidasa(NA),loscualesnospermitirnconocerelsubtipodelvirusgripal.Lossubtiposmsimportantesdesdeel
puntodevistaclnicoepidemiolgicosonH3N2yH1N1,porquecirculanenelserhumanodurantelastemporadasde
gripe.Desde1997,cuandoseprodujoelsaltointerespecficodelvirusgripalAdelsubtipoH5N1,sudeteccinsuponeun
granintersporsupotencialpandmicoyporquesuinstauracinconunatransmisineficienteentrepersonasimplicara
unaurgenciasanitariaderepercusinmundial3 .
ConrespectoaladeteccinmediantetcnicasdePCRconvencionalatiempofinal,ademsdelastcnicasartesanales
(caserasoinhouse),haykitscomerciales,enformatomltiple,comoelSeeplexRVDetection16Kit(Seegene,Seoul,
Korea),basadoentecnologaDPO(dualprimingoligonucleotide)queconsisteeneldiseodecebadoresformadospor
dossegmentosconelobjetodeaumentarlaespecificidad,unomslargoqueelotroyseparadosentresporun
espaciadordepolideoxiinosinas.Estekit,ademsdepermitireldiagnsticodelainfeccingripalporvirusAyB,
proporcionaeldiagnsticodiferencialconadenovirus,metapneumovirus,coronavirushumano229E,OC43yNL63,virus
parainfluenza1,2y3,VRStiposAyByrinovirus.UnodelosprincipalesinconvenientesdelaPCRconvencionaloatiempo
finalesquesetratadeunmtodocualitativo,quemuchasvecesrequierelaaplicacindeunaPCRsecuencial(PCR
anidadaonestedPCR)paraobtenerunasensibilidadsimilaralaquesealcanzaconunaPCRatiemporeal,loque
comportamscargadetrabajo,unincrementodeltiemponecesariohastalaobtencindelosresultadosyunmayor
riesgodecontaminaciones.
Elempleodediferentessondasmarcadasfluorognicamente(TaqMan,sondasdehibridacin,molecularb eacon),
cebadoresmarcadosquedanlugaraunamplicnautofluorescente(primersscorpions,primerssunrise)odeagentes
intercalantes,comoelSybrGreen,enunsistemadePCRatiemporeal,estndesplazandoelusodelaPCRconvencional.
EstosmtodosdePCRatiemporealpermitenlacuantificacin,ademsdereducirelriesgodecontaminacionesyel
tiemporequeridoenlaemisindelosresultados,conloqueseminimizalanecesidaddeunanlisisposteriordelos
ampliconesobtenidos.SiaestoseaadelaposibleutilizacindeunaPCRmltiplequeademsdedetectarlostres
gnerosdevirusgripalesconintershumanopermitanlasubtipificacindelosvirusgripalesAy/oladeteccinsimultnea
deotrosvirusimplicadosenlainfeccinrespiratoria,elvalordeestametodologaseveincrementadonotablemente.No
obstante,sedebetenerencuentaqueunpasolimitanteparaeldesarrollodetcnicasbasadasenPCRatiemporealcon
formatomltipleeselnmerodecanalesdedeteccinqueposeaeltermociclador.
Otratcnicapocoutilizadaenladeteccindevirusgripalesenhumanos,peroqueestadquiriendomayorprotagonismo
enveterinariaparaladeteccindevirusgripalesdelsubtipoH5enavesdegranja,eselmtodoNASBA(nucleicacid
sequenceb asedamplification),quesefundamentaenunaretrotranscripcinamplificacinyposteriordeteccinbasada
enunmtododeelectroquimioluminiscencia.
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Decaraagarantizarlanecesidaddeefectuarundiagnsticorpidoestndisponiblesdiversosensayoscomercialesde
PCRatiemporealalgunospermitenslodetectarInfluenzavirusAyB,mientrasqueotrosposibilitandiagnosticarla
infeccinporH5N1(tabla6).LaFDAhaaprobadounensayodePCRatiemporealparalaidentificacindelsublinaje
asiticodevirusgripalesAdelsubtipoH5desarrolladoenlosCDC.LaOMStambinhapublicadoprocedimientosparala
deteccindeinfeccinporH5N1enhumanosmedianteRTPCRconvencionalyPCRatiemporeal(disponibleen:
http://www.who.int/csr/disease/avian_influenza/guidelines/labtests/en/index.html).
Tabla6.Ensayoscomercialesparaladeteccindevirusgripalesmedianteamplificacingenmicaatiemporeal

Ensayo

Proveedor Termociclador Dianas

ArtusInfluenza
RTPCRKit

Qiagen,
Bonsai

Lightcycler

ArtusInfluenza/H5 Qiagen,
Bonsai
LCRTPCRKit

Lightcycler

LightMixfor
InfluenzaAH5N1
detection(TIB
Molbiol)

Roche

Lightcycler

LightMixforthe
detectionofAvian
InfluenzaAVirus Roche
(subtipoAsia)H5
(TIBMolbiol)

Lightcycler

FluA/BAnalyte
SpecificReagent IZASA
(Cepheid)

SmartCycler

TaqManInfluenza Applied
ABIPRISM
A/H5DetectionKit Biosystems

Caractersticas
Detectaambos,
peronopermite
InfluenzavirusA+B diferenciarentre
virusgripalesAy
B
Detectaambos,
peronopermite
InfluenzavirusA+B
diferenciarentre
yH5
virusgripalesAy
BdistintosdeH5
Debemos
transformarel
ARNviralen
InfluenzavirusA, ADNcenun
H5N1
ensayo
independiente.
nicoensayoque
detectaN1
Debemos
transformarel
ARNviralen
H5
ADNcenun
ensayo
independiente
Diferenciaentre
InfluenzavirusAy
ambostiposde
B
virus
Deteccin
deInfluenzavirusA
InfluenzavirusA,
yH5peroen
H5
ensayos
separados

Tcnicasdehibridacin
Sontcnicasquepermitenelprocesamientodeunaelevadacantidaddemuestrasporcadaensayoy,entreellas,cabe
destacarlasbasadasenPCRacopladaaenzimoinmunoanlisis(PCREIA)ylosmicroarraysobiochipsqueposibilitanel
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anlisissimultneodevariosgenespertenecientesaunmismoorganismo.
LaPCREIAconsisteenunaamplificacincuyosproductossedetectanmediantesondasensolucinmarcadas.Launin
delasondasedetectamedianteunenzimoinmunoanlisiscuyoanticuerpoesreactivofrentealmarcador.Enlaactualidad
hayunatcnicacomercialbasadaenlaPCREIA:Hexaplex(Prodesse,Milwaukee,EstadosUnidos)capazde
diferenciarInfluenzavirusAyB,ademsdedetectarvirusparainfluenza1,2,3yVRS4 .
Elcrecimientoennmerodeinfeccionesenhumanosporvirusgripalespertenecientesasubtiposdistintosdelos
habitualesyladiseminacindelaepizootiaporvirusdelsubtipoH5N1hanacrecentadoelintersporlacaracterizacin
detalladadelosvirusgripalescirculantes,tantoenelmbitodelasaludhumanacomoenelterrenoveterinario.Estos
acontecimientoshanderivadoeneldesarrollodeunaseriedemicroarraysobiochipsparalatipificacinysubtipificacin
devirusgripalesqueutilizanlahibridacinconsondas,enestecasoinmovilizadasenunasuperficie,yqueseincubancon
elmaterialgenticoaanalizarmarcado.Enlaactualidadhaypublicadosdiversossistemasartesanalesnocomerciales
yespecficosparatipificacinysubtipificacindevirusgripalesbasadosenestatecnologacabedestacarentreellos:el
Mchipqueesunmicroarraydebajadensidad(15oligonucletidosmarcados)dirigidofrentealgenquecodificaparala
protenaMdelosvirusgripalesA,quealcoevolucionarconlosantgenosdesuperficie(hemaglutininayneuraminidasa)
permiteobtenerinformacinsobreelsubtipo5 ,yelFluChip,compuestopor55sondascapacesdedetectarvirusgripalesB
ydiferenciartodoslossubtiposdeInfluenzavirusA6 .
Eldescubrimiento,enlosltimosaos,denuevosvirusimplicadosenafeccionesrespiratoriashaestimuladoelinters
porelconocimientodelainfeccinviralrespiratoriayladisponibilidaddetcnicascomercialesbasadasenla
amplificacinmltipleconposteriordeteccinmediantesondasdehibridacin.ElNGENRVAASR(Nanogen,SanDiego,
EstadosUnidos)combinalaamplificacinmltipleconunarrayelectrnico(NanoChip400)queutilizasondas
fluorescentesmarcadas,capazdedetectarvirusgripalesAyB,ademsdevirusparainfluenza1,2,3yvirusrespiratorio
sincitial.
Tambinestndisponiblesmtodoscomercialesparalaaplicacinexclusivaenlatipificacinysubtipificacindevirus
gripales,comoelequipoCombiMatrixInfluenzaADetectionSystem(CombiMatrix)quecontieneunmicroarraycapazde
subtipificartodaslashemaglutininasylasneuraminidasasdelosvirusgripalesA,juntoconunanalizadory
elsoftwareparainterpretarlosresultados.
ElkitResPlexIII(GenacoBiomedicalProducts,Huntsville)estbasadoenuntipodetecnologamuyrecienteque
permiteladeteccinylaidentificacinsimultneasdelosgenesH1,H2,H3,H5,H7,H9,N1yN2delosvirusgripalesA,y
losgenesNSdeInfluenzavirusAyB,loqueproporcionaalatcnicaunagranversatilidad,nosloalahorade
genotipificarvirusgripalesquecirculanhabitualmentedurantelastemporadasdegripe(H3N2yH1N1),sinotambinpara
aquellosquepuedaninfectardeformaespordicaahumanos(H5,H7,H9).Elensayoutilizaunatecnologadenominada
XMAP,fundamentadaenunaPCRmltiplequeoriginaproductosdeamplificacinmarcadosconbiotinaque
posteriormentesondetectadosmediantemicroesferas,enestecasomarcadasconestreptavidina,yanalizadosconun
instrumentoLuminex(LuminexCorporation)cuyatecnologaestbasadaenlosprincipiosdelacitometradeflujo.El
planteamientoessimilaraldeunmicroarray,peroconlaventajadeutilizarsondasimpresassobrepartculasen
suspensin,enlugardefijassobreunasuperficie,conobjetodeaumentarlasensibilidad7 .Emparentadoconesteequipo
ydesarrolladoporlamismacompaaestdisponibleeldenominadoResPlexII,elcualutilizalamismatecnologapara
ladeteccindeInfluenzavirusAyB,virusparainfluenza1,2,3y4,VRSAyB,metapneumovirus,rinovirus,enterovirusy
SARSCoValigualqueelIDTagRespiratoryViralPanel(TmBioscience17,Toronto,Canad)quepermiteeldiagnstico
deinfeccionesporvirusdelagripeA,subtipificacindelosvirusgripalesAH1,H3yH5,virusdelagripeB,adenovirus,
metapneumovirus,coronavirushumano229E,OC43,HKU1yNL63,SARSCoV,virusparainfluenza1,2,3y4,VRSAyBy
rinovirus 810 .
Caracterizacingenticadelosvirusgripales
ElmaterialgenticofragmentadodelosvirusgripalesestcompuestodeARNmonocatenariodepolaridadnegativa,la
replicacinylatranscripcindeestossegmentosacargodelaARNpolimerasaocasionanerroresporcarecerdeactividad
reparadora,originandomutacionesqueseconocencomovariacionesmenores,derivagenticaodrift.Lafrecuenciaconla
queocurrenespontneamenteestasmutacionesesmselevadaparalasprotenasdesuperficie,hemaglutininay
neuraminidasa,quesonlosprincipalesdeterminantesantignicoslastasasdemutacinsonmenoresparaelrestode
lossegmentosgnicos.
OtraparticularidadgenticaquepresentanlosvirusgripalesAessucapacidadderecombinacin,quepuedetenerlugar
entrelossegmentosgnicosdevirusdedistintosorgenes(mamferos,aves).Sienestereordenamientoestn
implicadoslossegmentosquecodificanparalasglucoprotenasdesuperficie,puedeoriginarseunnuevosubtipodevirus
quenuncahayacirculadoentrelapoblacinhumana,quedaralugaraunvirusconpotencialpandmico.
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Estosfenmenosdecambioeintercambiogenticosonlosquedeterminanlaaltavariabilidaddelosvirusgripalesyla
importanciaylanecesidadderealizarunacaracterizacingenticaenelcontextodelavigilanciadelainfeccingripal.
LaamplificacindeloscidosnucleicosporPCRpuedellevarseacabodirectamenteenlasmuestrasrespiratorias,lo
queproporcionaunmtododiagnsticoquepuedeacoplarseatcnicasdetipificacinrpidaycaracterizacin,comola
determinacindelpolimorfismodelvirusenfuncindelosfragmentosobtenidostrassudigestinconenzimasde
restriccin(RFLP:restrictionfragmentlengthpolymorphism)y,especialmente,lasecuenciacindefragmentosdelos
genes.
Lacaracterizacingenticahaexperimentadoungranavanceenlosltimosaosgraciasaldesarrollodetcnicasrpidas
dePCRyalaintroduccindesecuenciadoresautomticosquepermitenlacaracterizacingenticadeloslinajesdevirus
circulantes,loquehamejoradoelseguimientodelaevolucindelosvirusdelagripeylacalidaddelosdatosdevigilancia
desucirculacin.stasecentraenelestudiodelosvirusgripalesAyBdebidoaquelosInfluenzavirusCapenassufren
cambiosgenticos,engeneralcarecendeestacionalidadyhabitualmenteproducencasosespordicos.
Secuenciacin
Unacaracterizacingenticaconcisaserealizamediantelasecuenciacindelahemaglutininaylaneuraminidasa,
seguidadesuanlisisfilogenticoydelestudiodeposiciones(aminocidos)claveimplicadasenalgunaactividad
biolgica:uninareceptores,capacidadantignica,actividadenzimticaounindeantiviralesycuyocambiopuedatener
repercusinclnicaypatognicadelacepaestudiada.Nohayunacorrelacinabsolutaentrelosperfilesdecaracterizacin
antignicamedianteinhibicindelahemaglutinacindelascepasvariantesdentrodeundeterminadosubtipoyelrbol
filogenticooriginadoalcompararsussecuenciasdehemaglutinina.Sehapodidocomprobarquelaevolucingentica
avanzadeformagradual,mientraslaantignicalohacedeformadiscontinuadebidoaquenosiempreloscambios
genticosreflejanvariacionesantignicasenlasprotenas 1 .
Enelcasodelanlisisdelosvirusgripalesactuales,ladisponibilidaddeampliasbasesdedatosydeproyectosnuevos
paraeldepsitodesecuencias(http://www.niaid.nih.gov/dmid/genomes/mscs/influenza.htm)hafacilitadolacomparacin
deunelevadonmerodevirusaisladosalolargodeunperododehasta90aos.Enestasbasesinclusopodemos
encontrarsecuenciasdelvirusgripalcausantedelapandemiade1918.EnelcasodelaemergenciadelvirusgripalH5N1,
losestudiosfilogenticosrealizadoshanpermitidosituarloentresusancestros,enellinajeeuroasitico,eidentificar
mutacionesrelacionadasconsuvirulenciaysuposibletransmisibilidad,yayudanacomprenderelbroteysusposibles
consecuencias.
Lahemaglutininaeselprincipaldeterminanteantignicodelosvirusgripales.Formaespculasenlaenvolturamediantela
unindetresmolculasomonmerosidnticos.Elmonmerodehemaglutininacontienedossubunidades:HA1yHA2,
enlasubunidadHA1esdondeseencuentranlosaminocidoscausalesdelaantigenicidadylauninalreceptorcelular,
porlotanto,lasecuenciacindeestareginaportainformacinreferentealascaractersticasantignicasydeafinidadpor
elreceptorquesepuedencompararconlasdevirusoriginariosdeunbrote,virusvacunalesocepasdereferencia.
Laneuraminidasaesunaglucoprotenadesuperficieconactividadenzimticaque,aligualquelahemaglutinina,presenta
capacidadantignica,aunqueenmenorgradoquesta.Desdeeldesarrolloylacomercializacinen1999delos
antiviralesinhibidoresdelaneuraminidasa(zanamiviryoseltamivir),unadelasprincipalesaplicacionesdela
secuenciacindeestegeneslamonitorizacindelasresistenciasgenotpicasaestegrupodeantivirales.El
conocimientodelasensibilidadalosinhibidoresdelaneuraminidasadelosviruscirculantestieneparticularintersen
nioseinmunodeficientesquerecibanovayanarecibirtratamiento.Enestegrupodepacienteslaprobabilidadde
seleccionarvirusresistentesestincrementadaporpresentarmayortasadereplicacinviralyunaexcrecinms
prolongadadeviruseneltiempo11 .
Deigualmanera,lasecuenciacindelsegmentoMy,enconcreto,lazonaquecodificaparalaprotenaM2permitedetectar
loscambiosqueconfierenresistenciaalosadamantanos(amantadinayrimantadina).Laadquisicinderesistenciaa
estegrupodeantiviralespuedeserindependientedelapresinselectivaejercidaporelfrmaco.Loscambiosgenotpicos
quecausanlaresistenciapuedenoriginarsedeformaespontnea,ydanlugaravirusgenticamenteestablesque
conservansucapacidaddereplicacinytransmisibilidad12 .Mediantetecnologabasadaenlapirosecuenciacin
(Pirosequencing)lacompaaBiotagehadesarrolladounmtodoparaladeteccinderesistenciasaadamantanos.Este
mtododesecuenciacinconsisteenunacascadadereaccionesenzimticasparadetectarlaincorporacinde
nucletidosdurantelasntesisdeADN,deformaquecuandounnucletidoesincorporado,seproduceunareaccin
lumnica.Lasventajasqueofreceestesistemadesecuenciacinsonsurapidezyrelativobajocosto.Encomparacincon
otrastcnicasdesecuenciacinautomtica,estemtodotieneladesventajadepermitirsolamentelasecuenciacindeun
mximode100paresdebases.
Polimorfismosdelongituddefragmentosderestriccin
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LatcnicadeRFLP(restrictionfragmentlengthpolymorphism)opolimorfismosdelongituddefragmentosderestriccin
consisteenunaprimeraamplificacinmedianteRTPCRdeel(los)gen(es)diana,seguidodeuntratamientomediante
enzimasderestriccinqueoriginafragmentosy,porlotanto,patronesdebandacaractersticosdelacepaestudiadayque
secomparanconunacepacontrol.Dependiendodelabordaje,estemtododegenotipificacinescapazdecaracterizar
genesquecodificanparalahemaglutininaylaneuraminidasa(subtipificacin)yalavezgenesinternos,loquefacilitala
deteccinderecombinantesyladeterminacindelorigendelosdistintossegmentos(humanoozoontico)13 .LaPCR
RFLPtambinsehautilizadoparaladeteccinderesistenciasaadamantanos.Tienelosinconvenientesdenopermitirla
automatizacinniladiferenciacinentregenesconbajogradodepolimorfismo.
Lasecuenciacin,alproporcionarunacaracterizacingenticamsprecisa,hadesplazadoaestemtodoquepuede
resultartilenloslaboratoriosquenodispongandeunsecuenciadorodeunserviciocentralizadodesecuenciacin
automtica.
Deteccindelarespuestainmunitariahumoralespecfica
Ladocumentacinindirectadelainfeccinporlosvirusdelagripeserealizamedianteensayosserolgicos,enloscuales
sedetectalapresenciadeanticuerposfrentealantgenohemaglutininadelvirusgripalenelsuerodeunpaciente.Esta
aproximacinaldiagnsticodelagriperaramenteseutilizaenlaprcticaclnicahabitual,aunquepuedeseruna
herramientabsicaenlavigilanciaepidemiolgicadelacirculacindelosvirusgripales.Noobstante,unanlisis
retrospectivopuedeestablecerundiagnsticoclnicoenausenciadeaislamientodevirusapartirdelamuestraode
deteccindesusantgenosocidosnucleicos 2 .
Unadelasprincipalesdificultadesdeldiagnsticoserolgicoeslanecesidaddeevaluarmuestrasdesuerosenpares.
Estoserequieredebidoaquelainfeccinporlosvirusdelagripeesfrecuentementeunareinfeccin.As,debe
constatarseunincrementosignificativodelttulodeanticuerposentredosmuestrasconsecutivasseparadasentre2y4
semanas.Losanlisismsfrecuentementeutilizadossonlareaccindefijacindelcomplemento,lainhibicindela
hemaglutinacinylaneutralizacin.Noobstante,losdosltimosconstituyenlabasedelanlisisdelarespuesta
serolgicafrentealainfeccingripalypermitendeterminarlaconcentracindeanticuerposfrentealosantgenos
especficosdesubtipoydevariante.
Lareaccindefijacindelcomplementoseutilizaparadeterminaranticuerposfrentealanucleoprotenadelosvirusdela
gripe,queesaltamenteconservada,adiferenciadelahemaglutinina,seempleabsicamenteparadiferenciarenelsuero
depacienteslapresenciadeanticuerposdirigidoscontralosvirusdelagripetiposAyB.Estosensayostienenunvalor
importanteenelcasodelacirculacindenuevasvariantesantignicas,frentealasquenohayadisponibilidadde
anticuerposmonoclonalesfrentealahemaglutinina,altamentevariableenfuncindeladerivagenticadelosvirus
gripales.TambintieneutilidadenelcasodetransmisindelossubtiposdelvirusdelagripeAentredistintasespecies.
Noobstante,elaumentoenelttulodefijacindelcomplementodespusdeunainfeccingripaleslentoyelensayo,por
ssolo,tieneunasensibilidadrelativamentebaja.Porotrolado,esteensayosolamentemidelasclasesdeanticuerpos
queestnimplicadasenlafijacindelcomplemento.
LainhibicindelahemaglutinacinseusahabitualmenteparaeldiagnsticoylatipificacindelosvirusdelagripeAyBy
paralasubtipificacindelosvirusdelagripeA(H1yH3).Elttulodeanticuerpospresentesenunamuestradesuero,
calculadomedianteestatcnica,serelacionademanerafidedignaconlaproteccinolasusceptibilidaddelpaciente
frentealainfeccingripal.Porello,seutilizaampliamenteparamedirlarespuestadelpacientealaadministracindela
vacunadelagripe.Sinembargo,larealizacinylainterpretacindeestatcnicasoncomplejasy,frecuentemente,
subjetivas,porloqueprecisaparasurealizacindepersonalcualificado.Esporellomuyhabitualqueestatcnicacarezca
dereproducibilidadcuandoesrealizadapordistintoslaboratorios.Porotrolado,aunquesuventajamsevidenteessu
elevadaespecificidad,secontrarrestaporlabajasensibilidad.
Elprincipiobsicodelensayodeneutralizacindelsueroeslainhibicindelareplicacinviralmedianteanticuerpos
especficos.Losttulosdeanticuerposneutralizantespresentesenelsuerodelpaciente,obtenidosmedianteestatcnica,
secorrelacionanperfectamenteconlosobtenidosenlosensayosdeinhibicindehemaglutinacin.Elmayor
inconvenientequepresentaestatcnicaesquelosanticuerposmonoclonalesutilizadostienenqueservalidadosa
menudoconobjetodecomprobarquesoncapacesdereaccionarfrentealasnuevasvariantesdevirusdelagripe.

Diagnsticodeotrosvirusrespiratorios
Habidacuentadequetodoslosvirusrespiratoriospuedenestarimplicadosenlamayorpartedeloscuadrosdeinfeccin
respiratoria,yquestossuelenocasionarsntomasbastanteinespecficos,almenosensuscomienzos,larealizacinde
undiagnsticoetiolgicoesdesumaimportanciastepuedeestarencaminado:a)altratamientoespecficodelpaciente
conelantiviraladecuado,siprocedeb )alatomadelasmedidasoportunasdeaislamiento,oc)alaobtencinde
informacinepidemiolgicaquepermitaestablecerlaincidenciadeundeterminadovirusenlosdiferentesprocesosde
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infeccinrespiratoria,enfuncindelaedaddelospacientesodelasvariacionesobservadasensudistribucingeogrfica
yestacional.
Eldiagnsticovirolgicodelainfeccinrespiratoriadependerdelacalidaddelamuestra,sutransporteylascondiciones
deconservacinoalmacenamientohastaqueesprocesada.Lamuestradeeleccineselaspiradonasofarngeo,
preferiblementeobtenidoenlosprimeros3dasdespusdeliniciodelossntomas,dadoquecontieneabundantes
clulasepitelialesysecrecionesinfectadas.Otrasmuestrasdeltractorespiratoriosuperiorquetambinsonadecuadas,
peroenlasquecabeesperarunmenorrendimiento,sonlosexudadosnasalesofarngeos,lavadosnasalesy
gargarismos.Paraobtenerlosexudadosesrecomendablequeloshisoposutilizadosseandepolisterocualquierotro
materialsinttico,nuncadealgodn,alginatodecalciooconvstagosdemadera.
Enelcasodequeelpuntoderecogidadelasmuestrasyellaboratorioencargadodesuprocesamientonoestn
prximos,stasseenviarnrefrigeradasyenmediodetransportedevirus.Losmejoresrendimientosseobtienensilas
muestrassonprocesadas23hdespusdeserobtenidasparaladeteccindeantgenosviralesmedianteensayosde
inmunofluorescenciayantesde48hparaaislamientodevirusencultivocelular.Cuandolasmuestrasnopuedanser
procesadasenelperiodosealado,debernconservarsecongeladasa80C.
Elelevadonmerodevirusquepuedenestarinvolucradosenlasenfermedadesrespiratorias,ysuenorme
heterogeneidad,hacedeldiagnsticoetiolgicounalaborarduaycondicionaalautilizacindetcnicasdeamplio
espectro,queabarquenladeteccindeunnmeroconsiderabledevirus.Losmtodosdedeteccindirectos,que
permitenelaislamientodelvirusencultivoscelularesodeterminanlapresenciadealgunodesuscomponentes,yasean
antgenosogenes,sonlosmsextendidosenloslaboratoriosdemicrobiologaclnica.Losmtodosindirectos,basados
enladeteccindeanticuerposespecficosensuero,presentanmenorutilidadyestnsiendorelegadoscomo
herramientasdeestudioepidemiolgico.

Aislamientomediantecultivo
Desdehacemsde50aossehautilizadoelaislamientoviralencultivoscelularesparaestablecerundiagnstico
virolgico.Traslainoculacindelasmuestrasendiferenteslneascelulares,sepuedeobservarunefectocitopticoque
demuestreelcrecimientodelvirusendichasclulas.Unavezquestehacrecido,suidentificacinserealizapor
diferentesmtodos.Engeneral,elaislamientoviraldependedediferentesfactores,entrelosquedestacanlacalidaddela
muestraclnicayquestaseaadecuada,laviabilidaddelaslneascelulareselegidasylosreactivosrequeridosenel
procesoylacapacitacintcnicadelpersonalquerealizalosdiferentesprocedimientos.Unavezaisladosenclulas
susceptibles,facilitanestudiosposteriores,centradosenlacaracterizacindecepascirculantes,eldescubrimientode
nuevosvirusoserotiposnoesperadosylosestudiosfenotpicosderesistenciasaantivirales.
Elaislamientoviralsehaconsideradoelestndarparaladeteccindevirusyeselmtododereferencia.Sinembargo,
desdehacemsdeunadcadalosavancestecnolgicoseneldiagnsticohanpermitidoutilizarotrastcnicasque
incluyenlosanticuerposmonoclonalesomtodosmoleculares,quehanresultadoserherramientaspoderosasalahora
deestablecerundiagnsticodelainfeccinviral.
Laventajafundamentaldelcultivocelulareslaconfirmacindelaviabilidadylainfectividaddelvirusyladiferenciacin
entreviruscapacesdeinfectareincapacesdehacerlo.Estainformacinnoesposibleobtenerlaconlosmtodosde
amplificacinmolecularylosmtodosantignicosdedeteccinviral.Adems,sepuedeestudiarlosvirusaisladospara
conocerlasensibilidadadeterminadosantiviralesylarealizacindeestudiosfenotpicos 14 .
Laseleccin,larecogida,eltransporteylapreparacindelasmuestrasclnicassonfactoresmuyimportantesque
considerarenelaislamientodelosvirusencultivoscelularesy,especialmente,enlosrespiratoriosyaqueson
particularmentefrgiles.

Factoresqueintervienenenelaislamientoviral
Ademsdelacargaviraldelamuestra,otrosfactoressoneltiempotranscurridodesdelatomademuestrahastasu
procesamiento,latemperaturadeconservacinyelmediodetransporte.Elperododeexcrecinviraldelosvirus
respiratorioses,engeneral,muycorto,porloquelatomadelamuestradebeserentrelas48ylas72hdelcomienzode
lossntomasparaevitarresultadosfalsosnegativos.Sisesospechainfeccinhospitalaria,lamuestradelpaciente
hospitalizadodebesertomadadurantelasprimeras24hdelingreso.Latemperaturadeconservacinincideenlacalidad
delamuestraparaelaislamientoviral,yaquesilamuestraesconservadaytransportadaaunatemperaturamayorde4
C,esposibleobtenertambinfalsosnegativos.Cuandolatemperaturadisminuyea0Coincluso20C,lainfectividad
viralsepierde.Haydiferentesmediosdetransportequepuedenafectaralaintegridaddelapartculaviralporloque
puedenserrecomendadosonopararealizaralaislamientoviral.Elmedioesencialmnimo(MEM)seconsideralamejor
alternativacomomediodetransporte,alqueseaadenestabilizadoresprotenicoscuyafuncineslaproteccindela
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partculaviralelsuerobovinofetal,laalbminabovinaylalactoalbminasonlosmscomunes.Adems,laadicinde
antibiticosesobligatoria,paraprevenircontaminacionesbacterianas(penicilinayestreptomicina)yfungicidas,para
prevenirlacontaminacinporhongos,elmscomnmenteusadoesanfotericinaB.Elusodeconcentracionesaltasde
estassustanciaspuedeproducirunefectotxicoenelcultivocelular.

Principaleslneascelularesparaaislamientodevirusrespiratorios
Laslneascelularescomnmenteempleadasparaelaislamientodevirusrespiratoriossedetallanacontinuacin:
NCIH292:obtenidaapartirdeuncarcinomamucoepidermoidedepulmn.Puedesustituiraloscultivosprimarios
derindemonoparaelaislamientodelosParamyxovirushumanos.Ademsessensibleaadenovirus
yEnterovirus.CreceenmedioRPMI1640suplementadocon20moldeglutamina,Hepes25mmolyel10%de
suerobovinofetal.ElmediodeinoculacinesRPMI1640con20moldeglutaminay1,5g/mldetripsinay
antibitico(penicilina100U/mlestreptomicina100mg/ml).
HeLa:lneacelularcontinua,obtenidadeuncarcinomadecrvixhumano.Essensibleapoliovirustipo1y
adenovirustipo3.CreceenMEMconaminocidosnoesencialesyglutaminasuplementadoconel10%desuero
bovinofetal.ElmediotraslainoculacinesMEMconel2%desuerobovinofetalyantibiticodel0,1%(penicilina
100U/mlestreptomicina100mg/ml).
HEp2:lneacontinua,derivadadeuncarcinomaepidermoidedelaringehumano.Essensibleapoliovirustipo1,
adenovirustipo3.CreceenEagleMEMsuplementadoconel10%desuerobovinofetal.Elmediotraslainoculacin
esEagleMEMconel2%desuerobovinofetalyantibiticodel0,1%(penicilina100U/mlestreptomicina100
mg/ml).
Vero:obtenidaen1952apartirdeunrindeunmonoverdeafricanoadultonormal.Essensibleanumerosos
virusrespiratorios.ElmediodecultivoempleadoesMEMconel5%desuerobovinofetalyelmediotrasla
inoculacinesMEMconel2%desuerobovinofetalyantibiticodel0,1%(penicilina100U/mlestreptomicina100
mg/ml).
MDCK:lneacontinuaobtenidaapartirderindeCockerSpanieladultoaparentementenormal.Essensiblealos
virusdelagripetiposAyB,yacomentados,yalosadenovirustipos4y5,CoxsackievirusB5.Elmediodecultivo
empleadoesEagleMEMsuplementadoconglutamina2,5g/l,Hepes25mmolysuerobovinofetalal5%.
MRC5:obtenidadepulmnnormaldeunfetomasculinode14semanas.Sehadescritoqueessensiblea
numerososvirusrespiratorios.Seempleacomomediodecultivo,medioEagleMEMconaminocidosno
esencialesyglutaminasuplementadoconel10%desuerobovinofetal.ElmediotraslainoculacinesEagleMEM
conel2%desuerobovinofetalyantibiticodel0,1%(penicilina100U/mlestreptomicina100mg/ml).

Crecimientodelosprincipalesvirusrespiratorios
Enlatabla7seexponen,paradiferentesvirusrespiratorios,laslneascelularesyeltiemponecesarioparalaobservacin
delefectocitopticoenloscultivosconvencionales.
Tabla7.Virusrespiratorios,lneascelularesytiempodeobservacindeefectoscitopticos

Virusrespiratorio

Tipodelneacelular

Hep2Clulasprimariasderin
demono.Fibroblastoshumanos
Clulasterciariasderinde
Metapneumovirushumano
mono.LLCMK2.VERO.Hep2
LLCMK2,VERO,NCIH292
Parainfluenzahumano
mediocontripsinaPIV1y2no
paraPIV3
Adenovirus
Hep2,HeLa
Rinovirus
Fibroblastos,HeLa
VRS

Observacinde
efecto
citoptico
37das
37das
Msde10das

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Amplificacingenmicaportcnicasmoleculares
Lautilizacingeneralizadademtodosdeamplificacinmolecularenladeteccindevirusrespiratorioshapermitido
incrementardemaneraconsiderableelnmerodemuestrasrespiratoriasenlasquesedetectaalgunodelosvirus
respiratorios,yhacontribuidoamejorarelconocimientodelasenfermedadesenqueestnimplicadosestosvirus 15,16 .
Estehechoesparticularmenteevidenteenvirusdedifcilaislamientocomo,porejemplo,VPI4,quehapasadodeser
consideradounpatgenopocofrecuenteycausantedeinfeccionesrespiratoriaslevesdevassuperioresateneruna
repercusinclnicaalmenostanimportantecomolaquetienenotrosvirusincluidoseneldiagnsticosistemticodela
infeccinrespiratoriadevasbajas.
Ademsdemejorarelrendimientoeneldiagnstico,laaplicacindetcnicasmoleculareshapermitidoidentificarnuevos
virusrelacionadosconlaafeccinrespiratoriaensereshumanos.Enlosltimosaossehaidentificadoel
metapneumovirushumano,elbocavirushumanoytresnuevoscoronavirus:CoVSARS,CoVNL63yCoVHKU11719 .
Porotrolado,lasecuenciacindelosproductosobtenidosenlaamplificacinposibilitalarealizacindeestudios
adicionalesdegenotipificacin,epidemiologamolecularysensibilidadadeterminadosantivirales.Sinembargo,la
elevadasensibilidaddelosensayosdeamplificacindecidosnucleicostambinhaaportadoalgunosinconvenientes,
comolafrecuentedeteccindevirusenpersonasasintomticas,ascomoladeteccinprolongadadevirusenpacientes
queyaestnrecuperadosdeunainfeccinrespiratoriapasada.Sinduda,elgranretoqueplanteanlasinfeccionesvirales
respiratoriasnoesotroquepoderdeterminarsiunvirusdetectadoeneltractorespiratorioeselcausantedelaafeccin
respiratoria.
Unhallazgoparticularmentecomnenlasinfeccionesviralesrespiratoriaseslarelativafrecuenciaconlaqueseobservan
lasdenominadasinfeccionesdobles,coinfeccionesoinfeccionespormltiplesvirus.Enefecto,ladeteccindedos(o
ms)agentesviralesenunmismoprocesorespiratoriopuedeinterpretarsecomoinfeccindoble(mltiple)delasclulas
deltractorespiratoriosinembargo,tambindeberacontemplarselaposibilidaddequeslounodelosvirusseael
verdaderocausantedelsndromeyelsegundo(oelresto)reflejeunacolonizacinasintomticadeltractorespiratorio.Por
lotanto,seramsprecisohablardecodeteccinodeteccinmltipledevirusenunamismamuestrarespiratoria.Las
infeccionesrespiratoriasatribuidasamsdeunagenteviralnoesunfenmenoquehayasurgidoconlageneralizacinde
lastcnicasmolecularesenloslaboratoriosdemicrobiologadiagnstica.Seadmiteque,conindependenciadela
utilizacindelaPCR,elporcentajedeestasinfeccionesaumentaproporcionalmenteconelnmerodemtodos
empleadospararealizareldiagnstico20 .Unaopcinmsqueplausibleparatratardedeterminarlaverdaderaimplicacin
deunvirusenlaafeccinrespiratoriapodrasersucuantificacinenlasmuestrasrespiratoriasmediantetcnicasdePCR
entiemporeal.Noobstante,debemosserconscientesdelosproblemasqueplanteaestetipodemuestras,muyvariables
enloquerespectaalocalizacin,cantidaddemuestraobtenidayhomogeneidad.
EnlaPCRentiemporeal,losprocesosdeamplificacinydeteccinseproducendemanerasimultneaenelpropiotubo
dereaccin.Ladeteccindelosproductosamplificadosseproducemediantedeteccindefluorescencia,quees
proporcionalalacantidaddeADNquesevayasintetizando.Lafluorescenciaenunareaccinpuedeserdebidaalempleo
deagentesintercalantes,queaumentannotablementelaemisindefluorescenciacuandoseunenalADNbicatenario,o
biensondasmarcadasconfluorocromos.Ademsdelarapidezyladisminucindelriesgodecontaminacinpor
productosdeamplificacin,lossistemasdePCRentiemporealpermitencuantificar,demanerasencilla,laconcentracin
inicialdeADNoARNpresenteenunamuestraclnica.Paraello,slosenecesitaincluirunoscontrolesexternoscon
concentracionesconocidasycrecientesdelADNdianaparagenerarunacurvapatrn.
AunquelacomercializacindesistemasdePCRentiemporealparaeldiagnsticodevirusrespiratoriosselimita,enel
mejordeloscasos,comoyasehaexpuesto,alvirusdelagripeA,particularmenteelsubtipoH5N1,yCoVSARS,
comienzanaaparecerenelmercadokitsparalosdemsvirusrespiratoriosque,conrespectoalosmtodoscaseros,y
demanerageneralizada,representanunagarantaenloqueconcierneacorrectasevaluacin,estandarizaciny
actualizacindelosoligonucletidosysondasutilizados.Estoskitssuelenincorporar,adems,uncontrolinternode
reaccinparaevitarlosfalsosnegativosporsustanciasinhibidorasdelaADNpolimerasaenlasmuestras
respiratorias 21,22 .
UnalimitacinimportantedelosmtodosdePCRentiemporealesladeteccinmltiple.Enestesentidolosbiochipsde
ADNofrecenunasposibilidadessinprecedentessinembargo,lasensibilidaddeestastcnicasannoescomparable
conlosmtodostradicionalesdeamplificacinmltiple.Laaportacinmsnovedosaaldiagnsticodeinfeccin
respiratoriaestllegandodelamanodelosdenominadoschipsdeADNenfaselquida.Enestossistemasla
accesibilidaddelassondasnucleotdicassehamejoradodemaneraquesehaincrementadolasensibilidaddela
tcnica,comodemuestranvariosestudiospublicadosrecientemente.
http://www.elsevier.es/esrevistaenfermedadesinfecciosasmicrobiologiaclinica28articulodiagnosticomicrobiologicolasinfeccionesviralesrespiratoria

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28/3/2016

Diagnsticomicrobiolgicodelasinfeccionesviralesrespiratorias| EnfermedadesInfecciosasyMicrobiologaClnica

Autorparacorrespondencia.
JosM.Eiros
Direccin:eiros@med.uva.es

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