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YACs tentativa de criar um cromossoma artificial eucariota.

O primeiro
problema e que o DNA muito grande. Queremos criar um cromossoma de 1
milhao de pbs. Para ter molculas grandes de DNA, tendo em conta que os
cromossomas humanos tm 30 milhoes de pbs, tem de se cortar o DNA ainda
dentro do ncleo, antes de meter agarose, com enzimas de restrio muito
diludas, de forma a cortar o DNA muito poucas vezes. Depois extrai-se o DNA do
gel, para poder voltar a utiliz-lo. A primeira questo do cromossoma eucariota e
que no circular, possui um centrmero elemento que vou ter de inserir no
plasmdeo, para dar origem ao vetor. O vetor inicialmente um plasmdeo, com
sequencias telomericas que correspondem espcie com que estou a trabalhar,
a levedura, tem de ter origem de replicao e centrmero. Tem ainda dois stios
de restrio que servem para linearizar o plasmdeo. Fica-se com a extremidade,
telmero, sitio de restrio, centrmero depois de linearizado. O marcador
utilizado utilizado na sntese de aminocidos histidina, adenina,etc. Se
plaquear em histidina, so crescem as leveduras que tm o vetor. O gDNA
cortado para dar fragmentos muito grandes, e liga-se o brao esquerdo do vetor
ao gDNA no sitio de corte da EcoRI, e este ao brao direito do vetor. Crescem-se
as leveduras na ausncia de histidina e de metionina e so crescem os que tm
os dois lados do vetor. A eficincia muito baixa e o crescimento difcil, no
produtivo. Mesmo tendo o centrmero no meio, h uma taxa de perda do
cromossoma. Alm disso, de difcil manipulao. A ideia de utilizao disto
fazer terapia gnica. Se pudesse reconstruir um gene para refazer a medula
ssea --- partindo desta tcnica.
Porque que precisamos de um fragmento de 1 milhao de pbs? Contexto
gentico importante para a sua regulao. O ambiente gentico fica mais
parecido com o original. No conseguimos selecionar um gene particular de um
cromossoma: o cromossoma tem varias colonias. Como saber que uma das
colonias tem o gene que eu quero? Fazendo hibridao transferncia das
colonias para suporte solido e marcao do gene para a sua identificao.
Podemos pegar numa copia de um mRNA e produzir a protena que ele produz.
Faz-se a partir de vetores de expresso: plasmdeo que volta a utilizar o opero
da lactose como indutor, onde colocamos o nosso gene, de modo que quando for
induzido, se tivermos inserido la um ORF correspondente protena que
queremos produzir, aparece uma quantidade significativa de protena podemos
chegar a ter 30% do peso seco de uma bactria correspondente protena que
queremos obter. (NOTA: IPTG equivalente a lactose).
Este vetor tem de ter resistncia a ampicilina, promotor da lactose e um
polylinker. Tem de ter o gene da b-galactosidase, mas esta uma protena muito
grande a bactria tem problemas em produzir protenas grandes, por isso
eliminou-se este gene. Os vetores agora utilizados so pET, que tem uma
condicionante especial: fazendo a clonagem, crescimento a 37 graus, no posso
fazer a induo logo partida tenho de permitir primeiro o crescimento
bacteriano, e quando ele atingir quase a saturao, adiciono a lactose, para s a
comear a produo. Mesmo durante o perodo de crescimento sem lactose, as
bactrias produzem a protena; o promotor mesmo sem lactose produz uma
dada quantidade de protena. Isso significa que 20% dos genes para os quais nos
queremos produzir a protena so txicos para a bactria ela produz e nunca
chega a atingir nveis muito altos. Entao construiu-se um plasmdeo em que no

ocorresse esta produo de protenas. Tentou-se fechar o promotor ao mximo,


para que so comeasse a funcionar quando ns quisssemos. Este vetor tem
duas componentes: sitio de ligao operador da lac, tem sitio de clonagem no
meio, onde se introduz um fragmento de DNA, mas o gene que devia fechar o
vetor no o LacI este est sob o controlo de outro promotor que se encontra
na bactria. Esta produz, sob o controlo do opero da lactose, RNA polmera T3,
e no pET encontra-se o sitio de iniciao desta RNA polimerase T3. A lactose
introduz com o gene LacI, este deixa de funcionar, produz a polimerase T3 que
vai ao plasmdeo e o ativa. como se tivssemos mais um controlo adicional o
repressor LacI controla a T3. S se T3 estiver ativo que temos produo de
protena.--- a T3 s pode ser produzida pelo genoma da E.coli.
Estas protenas precipitam, formando corpos de incluso dentro da bactria.
Seria interessante conseguir purificar facilmente. O vetor pET foi modificado, foi
retirado o sitio de ligao da RNA polimerase da bactria. Tem um sitio de
clonagem com um promotor (T3 ou T7) e um conjunto de 6 Histidinas, e depois
termina. A ideia inserir o fragmento num dos stios de clonagem, de forma a
ficar junto das histidinas finais (h vetores com His na cauda C terminal ou N
terminal). Insere-se o quadro de leitura aberto e assegura-se que este continua
aberto, incorpora as histidinas, e para no fim. Constroem-se protenas de fuso,
que tm um pedao do que ns queremos, mais qualquer coisa que nos
interessa, porque nos serve por qualquer motivo protena mista. A protena de
fuso neste caso tem 6 histidinas no C terminal, que servem para ligar ao nquel
com grande afinidade. Entao, tendo uma protena de fuso neste tipo, rebenta-se
a bactria (que tinha corpos de incluso), solubilizam-se essas protenas em
ureia com SDS, e estas ficam quase lineares, com uma cauda pendurada de 6
His. Mistura-se esta soluo com bolas magnticas carregadas com Ni, e a
histidina liga especificamente l. As protenas que no tm histidinas no ligam,
podem ser separadas. No fim, posso soltar a protena usando algo que compete
com a ligao Ni-His purificao.
Tendo um vetor com sitio de clonagem para ORF, com His no terminal seguidas
de peptidase, existe uma protase de um vrus, TEV, que tem um conjunto de
aminocidos muito especficos e raros adiciona mais um componente
protena: os aminocidos de TEV. Agora teremos um lisado com Ni, que liga s
Histidinas, com o TEV, e purifica-se. Depois de ter a protena purificada, posso
trata-la com uma protase, o que liberta dois fragmentos: a histidina com o local
TEV e o quadro de leitura aberto. O fragmento de His-TEV volta a ir para a coluna
de Ni, e retira-se o sobrenadante (ORF), que estar contaminado com a
peptidase (problema por resolver) da voltar a ir para a coluna o complexo HisTEV. Isto necessrio porque por exemplo em cristalografia ela tem de ser
produzida pura.
Bibliotecas de DNA: para poder trabalhar com o genoma do organismo, nunca
posso t-lo todo junto num cromossoma seria enorme. Era preciso cort-lo em
fragmentos, inseri-lo num vetor e orden-lo da a construo de bibliotecas
genmicas cada uma um conjunto de bactrias, em que cada uma tem um
pedao de dado DNA nenhuma tem o genoma completo. O que se pretende :
tendo um genoma de 1 milho de bases, tem de se separar em fragmentos A, B,
C, D, e pegar num vetor (por exemplo, BAC) que pudesse ter cada um destes
fragmentos clonados (vetor A, vetor B, ). Como posso dar vrios tratamentos

s bactrias, posso ter os pedaos de DNA armazenados. Num BAC teria 10 tipos
de fragmentos (depende do tamanho do vetor). Quando o DNA replicado
dentro da bactria, tem os processos de replicao bacteriana, no envolvendo
erros. Ento, trabalhando com matrizes com 96 poos, no A1 guardo a bactria
A, no A2 a bactria B, e o conjunto de todas estas bactrias a biblioteca
genmica: o conjunto das bactrias que tm plasmdeos com fragmentos
diferentes. Se quisesse encontrar nesta biblioteca um dado gene? Fazia
hibridao em todas as colnias. Mas h um problema: fazendo a clonagem
desta forma, um dado gene pode ficar separado, em bactrias diferentes s
clonamos parte do genoma a parte que no est clonada so as junes entre
fragmentos, o que dificulta a ordenao. Entao o DNA no pode ser cortado com
uma enzima de restrio que gere fragmentos separados: tenho de cort-la com
uma enzima que corte em fragmentos que se complementem:
------ ------ ------ ----------- ------ ------ -----Como fazer isto? Uma das formas , em vez de cortar com uma enzima de
restrio, que corta num sitio especifico, utilizar o corte mecnico: envolve o
problema de as extremidades do DNA no serem coesivas. Imagine-se que se
utiliza uma enzima chamada Sau3A, que corta 4pb, que se repetem no DNA a
cada 200 pb ento, como posso usar esta enzima? Se tivermos muito pouca
enzima, ela no vai cortar em todos os locais, vai apenas cortar em alguns deles,
aleatoriamente, de forma a termos fragmentos que se completam deixa de
haver junes que no so clonadas at all, passamos a ter toda a sequncia. Se
cortar o DNA genmico utilizando muita enzima, o que acontece que ela corta
sempre, a maior parte dos fragmentos so pequeninos se tiver menos enzima,
os fragmentos diminuem de tamanho. Tenho de fazer eletroforese em agarose e
ver que fragmentos tm o tamanho que eu pretendo. Uma das coisas que vai ser
acontecer que vai haver muitos fragmentos com pedaos repetidos, o que
timo. Pelo menos no h blanks. Depois faz-se a clonagem, e a hibridao para
identificar fragmentos.
Para representar o genoma completo, tenho de o clonar 6 vezes, para que todos
os clones se sobreponham uns aos outros. No interessa de que organismo o
genoma, nem do seu tamanho. O Sau3A liberta uma extremidade que pode ser
ligada a um fragmento cortado com BamHI. Tenho milhares de clones e no sei
qual deles tem o gene que eu quero. H duas formas de resolver o problema:
podemos sequenciar tudo, ou ento fazer chromosome walking, que no
depende da sequencia. Posso comear com qualquer clone, e vou ver dentro
desse clone um pedao dele. Aqui uso coisas como o T3 ou o T7, porque o T3
produz DNA de uma extremidade para a outra, o que me d o fim. Entao, posso
ir a procura do clone seguinte, por hibridao. Pergunto: que clone desta
biblioteca hibrida com este que tenho? Fazendo isto sequencialmente, percorro
todo o cromossoma. NOTA: h fragmentos de DNA que por motivo desconhecido
no possvel clonar: sequncias muito repetidas, umas a seguir s outras o
sistema de DNA bacteriano patina (slippage). Uma das coisas que no est
muito representada nas bibliotecas o centrmero e os telmeros. Ao tirar um
fragmento de uma extremidade, tenho de marc-lo. At h pouco tempo atrs, o
DNA marcava-se radioactivamente: colocava-se na posio do fosfato 5 um
fsforo 32 (radioativo). Agora o que se faz pegar num nucletido, que tem um

linker que est ligado a uma dioxigenina, que produz luz, entao o que se faz
usar estes nucletidos com dioxigenina para a marcao. Usa-se para a
marcao aquilo a que se chama multiprimer, um conjunto de 6 nucleotidos
completamente aleatrios (mistura que vai de 6As at 6Ts, tem todas as
sequencias possveis). Rapidamente estes nucletidos encontram o seu parceiro.
Fao isto de forma mais ou menos diluda, e segue-se uma reao de
polimerizao, em presena do multiprimer. O DNA fica marcado.
Posso fazer uma cpia da biblioteca numa pelcula de nylon, fixo as bactrias
com calor, fao a desnaturao do DNA e junto a sonda. A reao de luz, e vai
haver colonias em que a molcula encontra o seu parceiro. Posso fazer sondas
especificas para a molcula sense ou anti-sense. Tendo o genoma mais ou
menos representado, posso dizer que um conjunto de clones seguidos formam
um contig. Entre dois contigs, fica um espao no meio. (neste momento, o
genoma humano est clonado volta de 30 contigs, ainda no se conseguiu
clonar tudo). Como que sei a posio dos contigs? No sei quanto DNA tenho
entre dois contigs. Posso voltar ao cromossoma, e fazer hibridao outra vez
chromosome painting: marco o DNA, e vejo onde hibridam as extremidades dos
contigs no prprio esquema do cromossoma. Ficamos com um gap entre duas
bandas.
Imagine-se que o clone B22 seguido de sequencias repetidas do tipo X, e ao
hibridar encontro um clone que hibrida. Mas na parte em que no consigo
hibridar, no sei se o clone varia, se o mesmo. A biblioteca genmica guarda o
genoma de espcies em extino. Tambm h bibliotecas de cDNA, que guardam
o que o mRNA produz. Se quiser estudar o promotor de um gene vou biblioteca
genmica, se quiser estudar o que ele produz vou biblioteca de cDNA. Este tipo
de biblioteca parte do mRNA processado, citoplasmtico. A RNAse a nica
enzima difcil de controlar. Tem uma subunidade no muito grande, mas hper
resistente, e a purificao dos RNAs vai ser entao difcil de controlar. Aquilo que
distingue os RNAs a cauda poly-A, que pode ser identificada atravs de
hibridao.
Uma protena tem menos de 100000 Da, ou seja 1000 aas no mximo tem em
media entre 2 a 5 kbp, por isso o vetor de clonagem prefervel o plasmdeo.
Entao, vamos transformar o mRNA em DNA, por isso se chama cDNA, porque so
copias em DNA do mRNA. Ento, tenho uma mistura de muitos mRNAs
diferentes, todos com cauda poly-A. Utilizo um oligonucleotido de Ts como
primer, e uso a transcriptase reversa, que permite fazer a primeira cadeia.
Depois desta estar feita, utilizo uma RNAse para remover o RNA, e adiciono uma
enzima que adiciona nucletidos especficos posio 3.
Ento, fico com um plasmdeo cDNA1, cDNA2, etc, cada bactria possui um
destes cDNAs diferentes. O conjunto destas bactrias a biblioteca de cDNA.
Pego nas bactrias e coloco-as na matriz ordenadamente, numa placa de 96
poos, e o conjunto destas placas a minha biblioteca. Mas existe uma
biblioteca de cDNA de cada rgo, fgado, pulmo, crebro, etc. Enquanto na
biblioteca genmica os clones representam equitativamente o genoma, no cDNA
no assim. O numero de clones do cDNA depende da expresso de cada mRNA
a tubulina ter mais clones, mas um fator de transcrio que so funciona numa
molcula especifica ter muito menos. Para identificar o cDNA que queremos,

voltamos a fazer hibridao partindo do clone genmico compara-se com o


DNA original, encontrando as mltiplas cpias do clone na placa.