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La separacin de lquidos y partculas insolubles se ha dado en la naturaleza

desde que se form el universo. La aplicacin de una fuerza centrfuga ayuda a la


separacin y este proceso se ha venido aplicando recientemente. La separacin
de partculas por medio de la centrifugacin tuvo aplicaciones en procesos
industriales hasta hace aproximadamente 100 aos. Los primeros usos fueron en
la manufactura del azcar y en separar la crema de la leche. Las primeras
separaciones

de

partculas

usando

centrifugacin

fueron

probablemente

inventadas en 1877 por el ingeniero sueco Carl Gustaf Patrik De Laval para
separar crema de leche, estas centrfugas funcionaban a velocidades de hasta 3
000 r.p.m. El desarrollo de la ultracentrfuga se le atribuye a Svedberg quien
trabaj entre 1920 y 1930, l fue quien introdujo el termino de ultracentrfuga y
debido a que era un qumico coloidal, estudiaba la estructura de las protenas (en
esa poca todas las protenas eran consideradas coloides); su grupo utilizaba la
ultracentrfuga para determinar el peso molecular y la subunidad estructural de la
hemoglobina, sus estudios cambiaron las ideas concernientes a la estructura de
las protenas que se tenan en aquel tiempo. El grupo de Svedberg desarrollo
algunas centrfugas y los primeros modelos funcionaban a velocidades de hasta
900 000 g y cuyos rotores eran pequeos; otros modelos funcionaban a
velocidades de hasta 260 000 g. SPINCO produjo en 1940 la primera centrfuga
comercial, el modelo original es mostrado en la siguiente figura.
Una de las tcnicas ms comnmente utilizadas en la actualidad para caracterizar
las macromolculas es la sedimentacin. Utilizando las variantes adecuadas de
esta tcnica, se pueden obtener el peso molecular, la densidad y la forma general
de la macromolcula; adems, se puede detectar cambios en estos parmetros y
cualquiera de ellos se puede aprovechar como base para la separacin de los
componentes de una mezcla con propsitos preparativos o analticos. Debido a la
facilidad con la que se obtienen los resultados en los modernos instrumentos
automticos, hacen de la ultracentrifugacin una tcnica especialmente til.
En realidad, con una ultracentrfuga solamente se hace una cosa: mover a las
partculas por la fuerza centrfuga y medir, una o varias veces a lo largo del

tiempo, la distribucin de la concentracin de las partculas a lo largo del tubo de


la centrifugadora. La medicin realizada mientras las molculas se estn
moviendo a lo largo del eje de la fuerza centrfuga, se denomina determinacin de
la velocidad de sedimentacin y el resultado es un coeficiente de sedimentacin,
cifra que proporciona informacin sobre el peso molecular y la forma de la
partcula. Cuando se mide la distribucin de concentraciones bajo condiciones en
las que la distribucin ya no cambia con el tiempo, se dice que las partculas han
alcanzado el equilibrio de sedimentacin; este segundo tipo de medida
proporciona datos sobre los pesos moleculares, la densidad y la composicin de
las partculas.
TEORIA DE LA SEDIMENTACIN
Las partculas en disolucin pueden sufrir alteracin espacial, es decir, pueden
cambiar de posicin con el tiempo. Esto puede ser debido a procesos de difusin
(en un gradiente de concentracin, las partculas tienden a ir de la zona de mayor
concentracin a la de menor concentracin) o bien a procesos de sedimentacin.
En un proceso de sedimentacin la velocidad a la cual sedimentan las partculas
en una suspensin, no slo depende de su naturaleza, depende tambin de la
naturaleza del medio en el cual estn suspendidas as como, de la fuerza aplicada
a las partculas. Intuitivamente, uno especulara que las partculas ms grandes
sedimentarn ms rpido que las ms pequeas. Un factor que afecta la
sedimentacin de las partculas es la viscosidad del medio. En 1856 Sir Gabriel
Stokes propuso que la fuerza friccional, F, que acta en una partcula esfrica de
radio rp es relacionada a la viscosidad, h, por la siguiente ecuacin:
F= 6 rp dr/dt
Donde dr/dt es la velocidad de la partcula. La fuerza que experimenta una
partcula no est slo determinada por la fuerza gravitacional, g, sino tambin, por
los efectos de flotacin que reflejan las diferencias en la densidad del medio m y
de la partcula p, por lo que tenemos:
(m - p) V g = 6 rp dr/dt
V= volumen de la partcula

Como se asume que la partcula es esfrica, el volumen puede ser expresado en


trminos del radio:
(m - p) (4/3 rp3 ) g= 6 rp dr/dt

En la prctica, la fuerza centrfuga que mueve a la partcula sobre su eje de


rotacin es mucho mayor que la fuerza de gravedad, se puede expresar la fuerza
centrfuga de la siguiente manera:
Fuerza centrfuga = w2r / g
Donde r es la distancia radial de la partcula del eje de rotacin y w es la velocidad
angular en radianes / segundo, haciendo una sustitucin en esta frmula y
simplificando la expresin en trminos de la Velocidad de la partcula, tenemos:
2

dr 2 r p ( p m ) w r
=
dt
9

Esta expresin es cierta para partculas esfricas. Las partculas no esfricas


tienen altos coeficientes de friccin, por lo que, la expresin se puede modificar en
base a los coeficientes de friccin de una molcula dada, f (f= 2 m D), con
relacin al coeficiente de friccin de una partcula esfrica, f o.
fo
f

9
2
dr 2 r p ( p m ) w r
=

dt
2

Por la anterior ecuacin, podemos deducir que:


1) Una partcula con mayor masa tiende a moverse ms de prisa que una de
menos masa.
2) Una partcula ms densa se mueve ms de prisa que otra menos densa
3) Cuanto ms densa sea la disolucin, ms lentamente se mover la
partcula

4) A mayor coeficiente de friccin, ms lento ser el movimiento de la


partcula.

FUERZA CENTRIFUGA RELATIVA


La fuerza centrfuga (RCF) es dependiente de la velocidad de rotacin (N) en
r.p.m. y la distancia de la particula (r) al centro de rotacin. Cuando la distancia es
expresada en cm tenemos que:
RFC=1.18 x r x (r. p. m / 1000)2

RFC= 1.18x r x (N)2


La fuerza centrfuga es dada en trminos de g y N est dada en miles de r. p. m..
Si la fuerza centrfuga es conocida, entonces la velocidad (N) requerida en r.p.m.
para obtener esa fuerza centrfuga a un punto r (cm) del centro de rotacin puede
ser calculada con solo despejar la ecuacin anterior.
COEFICIENTE DE SEDIMENTACIN
Como la velocidad de una molcula es proporcional a la magnitud del campo
centrfugo (w2r) es comn discutir las propiedades de sedimentacin en trminos
de la velocidad por unidad de campo, o sea:
S= (dt/dr)/ w2 r
Donde s es el coeficiente de sedimentacin; el objetivo inmediato de muchos de
los experimentos de velocidad de sedimentacin es la determinacin del valor del
coeficiente de sedimentacin.

Dado que la velocidad de sedimentacin es mucho ms pequea que la velocidad


angular, para la mayora de macromolculas biolgicas la magnitud de s es
alrededor de 10-13
S=10-3 seg
As por ejemplo, tenemos que la constante de sedimentacin de los ribosomas de
eucarotes es 80S, o sea, s=80x 10-13 seg.}
COEFICIENTE DE VARIACIN ESTNDAR
En una centrifugacin el valor del coeficiente de sedimentacin no depende slo
de la velocidad o tipo de rotor, depende tambin del tamao y densidad de la
partcula, as como, de la densidad y viscosidad del medio utilizado para la
centrifugacin. La dependencia de la viscosidad del medio se puede descartar
siempre que se utilice el mismo medio para la centrifugacin. El medio ms
utilizado es el agua, cuya densidad y viscosidad son conocidas

a 20 C. El

coeficiente de sedimentacin de una partcula en agua a esta temperatura se


denotar s20,

y como las condiciones de viscosidad y densidad del medio se

descartan por ser siempre las mismas, ahora, el coeficiente de sedimentacin


depender slo de las parmetros de la partcula.
Entonces tenemos:
S20, w= k [D2 (- 20, W)]/ 20, W
Donde k es 1,18 para una partcula esfrica y 1.12 para una partcula cilndrica, D
es el dimetro en cm, es la densidad de la partcula (g/cm 3), 20, W y 20, W son la
densidad y viscosidad del agua.
Para determinar la constante de sedimentacin no es necesario realizar la
centrifugacin con agua como medio, los datos de la centrifugacin pueden
obtenerse con otro medio cuya densidad y viscosidad sean conocidas. Para
transformar el coeficiente de sedimentacin de una partcula de un experimento
dado a la constante de sedimentacin estndar, s 20,w es dividida entre s, as, se
obtiene la eliminacin de k y D2 :
S20, w= s [(- 20, W) m] / [(- m) 20, W]

Sustituimos s en la ecuacin, tenemos:


S20,w=

v ( 20, W ) m
.
w2 r ( m ) 20,w

Donde es la densidad de la partcula (g/cm 3), v es la velocidad de


sedimentacin, r es la distancia de la partcula al eje de rotacin (cm) y w es la
velocidad angular (red/seg).
El coeficiente de sedimentacin de las macromolculas depende de toda una serie
de factores, puesto que las molculas tienen una forma que depende de la
composicin del disolvente y se deforman a medida que se mueven. Estos efectos
se manifiestan en la dependencia que s presenta respecto a la concentracin, la
velocidad de centrifugacin y la fuerza inica del disolvente.
DEPENDENCIA DE s CON RESPECTO A LA CONCENTRACIN
Considrese una disolucin de macromolculas de un tamao tal que chocan
frecuentemente unas con otras. Esta es una caracterstica de las molculas muy
grandes y muy extendidas en disolucin (protenas y cidos nucleicos), porque a
medida que giran sobre s mismas, ocupan un volumen efectivo de la disolucin
realmente grande. Cuando