TCNICAS DE TINCIN

BUELVAS MONTES, Yaleyvis1.

MORALES MOLINA, Laura2; ; MEDINA, Pedro2; Long Xu2; SARMIENTO PIERES,
Yadira2; SANCHEZ CASTILLA, Andres2
UNIVERSIDAD DE CARTAGENA, FACULTAD DE INGENIERA.
Ingeniera de alimentos 26/09/16
RESUMEN.
El objetivo principal de la prctica desarrollada consiste en identificar de manera correcta y
precisa las distintas colonias obtenidas en los medios de cultivos presentes en el laboratorio
de microbiologa de la universidad de Cartagena, para ello se realiz como procedimiento
experimental los mtodos propuestos por la tcnica diferencial de Cristian Gram la cual se
basa en el contenido de peptidoclugano que tienen ciertas bacterias en su pared celular
obteniendo de esta manera la clasificacin de Gram positivas o Gram negativas, por otra
parte tambin se desarroll la tincin selectiva de capsulas, en la cual se buscaba identificar
la presencia de esta estructura que pueden desarrollar algunas bacterias. Las colonias
estudiadas de E. Coli , Staphylococcus aueres. Streptococcus aureus, mostraron
resultados coherentes con respecto a la informacin bibliogrfica obtenida de ambos en
cuantos a sus caractersticas morfolgicas microscpicas, por su parte la tincin de
capsulas mostro, la presencia de esa estructura en la colonia tomada a partir de un cultivo
de agar nutritivo. De los resultados se puede concluir que los cultivos estudiados presentan
cierto grado de pureza en el ambiente en cual estn siendo incubados, ya que no mostraron
crecimiento contaminante.
PALABRAS CLAVES.
Bacterias, tincin, capsula, gram.
ABSTRACT.
The main objective of the developed practice is to correctly and accurately identify different
colonies obtained in the media of crops present in the laboratory of Microbiology of the
University of Cartagena, it conducted as experimental procedure the methods proposed by
the differential technique of Cristian Gram which is based on the content of peptidoclugano
who have certain bacteria in their cell wall thus obtaining the classification of Gram positive
or Gram negative, on the other part also developed the selective staining of capsules, in
which we sought to identify the presence of this structure which can develop some bacteria.
The colonies studied in E. Coli, Staphylococcus aueres. Streptococcus aureus, showed
consistent results with respect to the bibliographic information obtained both in many
microscopic morphological characteristics, on the other hand the staining of capsules
showed, the presence of this structure in the colony taken from a crop of nutrient agar. The
results it can be concluded that crops studied have some degree of purity in the environment
in which are to be incubated, since they showed no polluting growth.
KEYWORDS.
Bacteria, staining, capsule, gram.

 INTRODUCCIN
Los
microorganismos
se
encuentran
ampliamente
distribuidos, pero no requieren de
mayor espacio para su continua
reproduccin, el
principal en
microscopio ptico es la falta de
contrast entre la clula en
observacin y el medio que la
rodea, la manera masa simple de
facilitar el contrast es la
utilizacin
de
colorantes,
revelndola
presencia
de
determinados
constituyentes
celulares, talles cmo flagelos,
esporas,
capsulas,
paredes
celulares, centros de actividad
respiratoria, etc. Para bacterias, el
proceso de fijacin por calor es lo
ms habitual, fijacin produce
habitualmente el encogimiento de
las clulas; latincito, por el
contrario, hace que las clulas
parezcan mayores de lo que son
realmente. La mayora
de los
colorantes
son
compuesto
orgnicos que tienen alguna
afinidad
por
los
materiales
celulares.
Algunos colorantes teirn mejor
slo despus de que la clula haya
sido tratada con otra sustancia
qumica, que no es un colorante
por s mismo. Esta sustancia se
denomina mordiente; un mordiente
habitual es el cido tnico. El
mordiente se combina con un
constituyente celular y lo altera de
tal modo que ahora s podr atacar
el colorante.Una tcnica de
coloracin y la ms conocida es la
tincin de Gram, denominada as
por
el bacterilogo dans Christian Gr
am, quien desarrollo esta tcnica
en 1844. Sobre la base dela
tincin de gran, las bacterias se
clasifican en dos grupos: gran

positivos y gran negativos. En

cuanto a la tincin de gran la
secuencia es la siguiente: el frotis
bacteriano se fija con calor se tie
con cristal violeta por min, se lava
con agua, se la aplica un
mordiente por 1 min y se lava
nuevamente con agua, despus se
decolora con una mezcla alcohol
etlico/acetona. Escurrir y cubrir
con safranina (color de contraste)
durante 1min lavar y secar.
Las bacterias Gram positiva y
Gram negativas tien de forma
distinta debido a las diferencias
constitutivas en la estructura de
sus paredes celulares. La pared de
la clula bacteriana sirve para
definir su tamao y su forma al
organismo as como para prevenir
la lisis osmtica. La pared dela
clulas Gram positivas es gruesa y
consiste
en
varias
capas
interconectadas
de
pptido
galicano (cadenas lineales de un
polisacrido formado por residuos
alternativos
de
N-acetil
glucosamina y N-acetil muritico
unidos mediante un enlace) y un
poco de cido tcnico (forman
parte de la gruesa capa de pptido
galicana que rodea a la membrana
plasmtica y estn directamente
unidos a l mediante un enlace
fosfodister. De este modo pueden
conectar varias capas de pptido
glicina), mientras que las bacterias
Gram negativas se componen de
una capa delgada de pptido
galicana y est rodeada por una
capa exterior de Limpopo lis
acridos
(forma
parte
de la pared de la pared celular de l
as bacterias Gram-negativas.
Tienen
carcter
antiptico,
presentan carga negativa, y
repelen molculas hidrofbicas.
Son txicos para el hombre, y
tambin se llaman endotoxinas)

por lo cual estas dos tipos

de bacterias se tien de diferente c
olor y es posibleidentificarlas como
Gram positiva o Gram negativa.
MARCO TERICO.
Tincin de Gram
Tambin
puede
utilizarse
a
menudo un mtodo que no tie
igualmente todas las clulas, un
proceso
denominado
tincin
diferencial. La tincin de este tipo
ms extensamente utilizada es la
tincin de Gram, denominada as
por el bacterilogo dans Hans
Christian
Gram,
quien
la
desarrollo. Sobre la base de su
reaccin a la tincin de Gram, las
bacterias pueden dividirse en dos
grupos,
grampositivas
y
gramnegativas.
Debido a su importancia en
taxonoma bacteriana y a que
indica diferencias fundamentales
de la pared celular de las distintas
bacterias, describiremos aqu con
cierto detalle la tincin de Gram.
Las clulas fijadas al calor sobre
un portaobjetos se tien primero
con una solucin de cristal violeta
(otros colorantes bsicos no son
tan efectivos) y son lavadas
despus para quitar el exceso de
colorante. En este estado todas las
clulas, tanto las gramnegativas
como las grampositivas, estn
teidas de azul. El portaobjetos se
cubre entonces con una solucin
de yodo (I2) yoduro potsico
(KI). El ingrediente activo es aqu
el yodo, el yoduro potsico
simplemente hace soluble el yodo
en agua. El yodo entra en las
clulas y forma un complejo
insoluble en agua con el cristal
violeta. De nuevo tanto las clulas
grampositivas
como
las

gramnegativas se encuentran en la
misma situacin. Se lleva a cabo
despus de la decoloracin,
usando bien alcohol o bien
acetona, sustancias en las que es
soluble el complejo yodo cristal
violeta.
Algunos
organismos
(grampositivos) no se decoloran
mientras
que
otros
(gramnegativos) lo hacen. La
diferencia esencial entre esos dos
tipos de clulas est, por lo tanto,
en la resistencia a la decoloracin.
Despus de la decoloracin las
clulas grampositivas son todava
azules, pero las gramnegativas
son incoloras. Para poner de
manifiesto
las
clulas
gramnegativas se utiliza una
coloracin
de
contraste.
Habitualmente es un colorante de
color rojo, como la safranina o la
fucsina bsica. Despus de la
coloracin de contraste las clulas
gramnegativas son rojas mientras
que las grampositivas permanecen
azules.
Deben destacarse dos aspectos
cruciales de la tincin de Gram:
1) El tratamiento con cristal violeta
debe preceder al tratamiento de
yodo. El yodo por s solo tiene
poca afinidad con las clulas.
2) La decoloracin debe realizarse
con poco agua para evitar que
pierdan la tincin las clulas
grampositivas. El proceso de
decoloracin debe ser corto y es
esencial un clculo preciso del
tiempo para obtener resultados
satisfactorios.
Finalmente,
el
carcter
de
grampositivo no es siempre un
fenmeno del todo o nada.
Algunos organismos son ms
grampositivos que otros y algunos

son gramvariables, es decir, unas

veces grampositivos y otras
gramnegativos. La tincin de Gram
es uno de los mtodos de tincin
ms importantes en el laboratorio
bacteriolgico

Tincin
cido
resistencia

alcohol

Esta tincin sirve principalmente

para clasificar micobacterias y
actinomicetos, que tienen un alto
contenido en lpidos y en cidos
miclicos y que no pueden ser
calificadas por la tincin de Gram.
Para empezar se hecha sobre el
portaobjetos una mezcla de
fucsina fenol, en la que la fucsina
hace de colorante rosa y el fenol
de mordiente. Las clulas se tien
de rosa, tanto los cidos alcohol
sensible como las resistentes.
Despus se usa un decolorante
orgnico que hace que las
bacterias cido alcohol sensibles
se decoloren mientras que las
cido alcohol resistentes se
quedan rosa. Como en la tincin
de Gram se utiliza un colorante de
contraste que en este caso es el
azul de metileno que tie las
clulas cido alcohol sensible de
color azul quedando las clulas
cido alcohol resistente de color
rosa.

Tincin de esporas

Se utiliza para teir las estructuras

de
resistencia
llamadas
endosporas bacterianas. Sobre el
portaobjetos con la preparacin se
echa verde malaquita que tie las
clulas de verde. Luego se lava
con agua destilada con lo que las
clulas se quedan incoloras y las
endosporas permanecen verde.
Finalmente se usa la safranina
para obtener bacterias de color

rosa mientras que las endosporas

continan con su color verde del
verde malaquita.
Tincin negativa Es el reverso del
procedimiento de tincin usual: las
clulas se dejan sin teir pero se
colorea un cambio el medio que
las rodea. Lo que se ve, por tanto,
es el perfil de las clulas. La
sustancia utilizada para la tincin
negativa es un material opaco que
no
tiene
afinidad
por
los
constituyentes celulares y que
simplemente rodea las clulas, tal
como la tinta china (que es una
suspensin de partculas de
carbono coloidal) o la nigrosina (un
colorante negro insoluble en
agua). La tincin negativa es un
modo satisfactorio de aumentar el
contraste de las clulas en
microscopia ptica, pero su
mxima utilidad est en revelar la
presencia de cpsulas alrededor
de las clulas bacterianas.
MATERIALES Y EQUIPOS
Placas con cultivos de bacterias:
o Placas de Agar Nutritivo
con Bacillius sp. (bacterias
Gram positivas)
o Placas de King B con
Pseudomonas fluorescens,
Escherichia
coli,
Streptococcus
sp,
Stafilococcus sp (bacterias
Gram negativas).
Cubeta para recoger colorantes.
Frasco para desechar colorantes.
Frasco con decolorante: agua (1:1)
para desechar preparados.
Papel absorbente.
Colorante de Gram: cristal violeta,
solucin de yodo, alcohol acetona,
safranina.
Aceite de inmersin.
Microscopio.
Laminas portaobjeto
Asa de siembra

muestro se aadi el alcohol

cetona con el fin de remover las
sustancias
mencionadas
anteriormente, por ltimo se
aadi el colorante de contraste o
fucsina, Luego se lavaron con
agua las preparaciones teidas y
dejando secar para examinar la
preparacin en el microscopio con
un objetivo de inmersin de 100x.

Azul de metileno
Tinta china

PROCEDIMIENTOS
Procedimiento de frotis
Se tomaron porta-objetos limpios,
marcado 3 de Gram y uno para
capsulas por cada grupo. A cada
uno se le adiciono una gota de
agua, luego se esteriliz el asa en
la flama proveniente del mechero
hasta tener un color rojo vivo.
Posteriormente se enfro el asa
tocando el borde del medio de
cultivo proporcionado para as
retirar despus una pequea
porcin de la colonia de bacterias
a emplear, dispersando una gota
de esta en el centro de uno de los
porta objetos formando una
pelcula delgada. Nuevamente se
realiz el mismo proceso con las
dems colonias, teniendo en
cuenta que se deba esterilizar el
asa reiteradamente al realizar
cada proceso.

Tincin selectiva o negativa

As mismo se deposit una gota de
la
suspensin
de
microorganismos, con el asa
previamente esterilizada, sobre un
portaobjetos.
Aadiendo
una
solucin
de
tinta
china,
mezclndola totalmente por la
muestra y secndola al aire. Por
ltimo se analiz los distintos
microorganismos que aparecan
sin teir en contraste con el fondo
oscuro,
mirando
sus
caractersticas en el microscopio.
DISCUSIN DE RESULTADOS.
Tincin diferencial de Gram.

Procedimiento de fijacin:
Los frotis de cultivos se fijaron
pasndolo repetida y rpidamente
en el interior de la flama del
mechero.
Observando que el
porta objetos quedara seco.
Tincin diferencial de gram
Se utilizaron dos gotas de cristal
violeta para cubrir cada frotis de
los porta objetos dejndolo actuar
durante 30 segundos. Luego e
aadio el lugol el cuales la
sustancia necesaria para la fijacin
de colorante primario, posterior a
esto una vez limpiado el lugol de la

imagen 1. Muestra de cocos Gram negativos.

para este microorganismo en

primera instancia se obtiene que
es una bacteria Gram positiva con
forma circular o de cocos, de esta
manera mediante su tincin
diferencial se puede concluir que
este microorganismo contiene un
pared celular una pared gruesa
conformado
principalmente
peptidoglucano, dicha estructura le
confiere la capacidad de retencin
del primer colorante. La imagen 3,
nos muestra una serie de bacillus
Gram negativos, los cuales hacen
referencia al gnero E. Coli. De los
cuales tambin se puede inferir
que los resultados obtenidos
concuerdan con los establecidos
por las claves bioqumicas de este
gnero de bacteria, de lo que
podemos concluir que los cultivos
de la imagen 2 y 3, son cultivos
que han mantenido su pureza
durante el tiempo que llevan en
incubacin.

Imagen 2. Cocos Gram positivos.

Tincin selectiva.

Imagen 3. Bacillus Gram negativo.

Los resultados obtenidos durante

el desarrollo de la prctica de
tincin diferencial de Gram arrojan
los siguientes resultados. La
imagen 1 , estable e una serie de
coccos Gram positivos, de lo cual
mediante
los
resultados
microscpicos obtenidos no se
puede diferenciar o establecer la
especie de la muestra o la colonia
estudiada presente en el medio.
Por su parte la imagen 2. Muestra
una ser de coccos Gram positivos,
pertenecientes a la especie
Staphylococcus
areus.
Dicha
especie si s toma n cuenta las
claves bioqumicas establecidas

Imagen 4. Tincin de capsulas.

La tincin selectiva con tinta china

muestra que la colonia estudiada
presenta capsulas, ya que se
evidencia como hay ciertas
regiones la imagen donde la tinta
china no logro penetrar la

estructura estudiada, lo que

permite
deducir
que
el
microorganismo puede sobrevivir
en condiciones de estrs con el
medio ya que puede producir
cpsulas o mtodos de proteccin
a ambientes adversos.
CONCLUSIN:
Debido a la dificultad a la hora de
observar

microorganismos,

la

tincin se convierte en una tcnica

por excelencia para lograr este
objetivo porque permite crear un
contraste entre la clula y el medio
que la rodea. Adems, tras haber
analizado los distintos tipos de
tincin

que

existen,

podemos

resaltar que la tincin de Gram

aparte de ser una de las tcnicas
ms

usadas,

ofrece

tambin

muchas ventajas sobre las dems.

Logrando que se afirme que sea
una de las ms importantes debido
a su practicidad, entre otras cosas,

Gracias a estas se hace posible

comprender

causan enfermedades o el uso de

bacterias

algunas de ellas en la ciencia y la

industria. Por lo tanto, las tinciones
en

general

son

de

suma

importancia debido a que:

Permiten observar el contraste

entre el microorganismo y su

entorno, lo que permite apreciar su

estructura,
clasificarlo.

esto

su

vez

las

REFERENCIAS
BIBLIOGRFICAS.

SANTAMBROSIO,
Eduardo;
ORTEGA, Marta; Trabajo prctico
n 4;Tincin y observacin de
microorganismos.;
2009
UNIVERSIDAD
TECNOLOGICA
NACIONAL
FACULTAD
REGIONAL
ROSARIO
DEPARTAMENTO
DE
INGENIERIA QUIMICA CATEDRA
DE BIOTECNOLOGIA
DARNELL, J., et al. Biologa
Celular y Molecular. Editorial
Mdica Panamericana, Barcelona,
2003. Cuarta edicin.
LODISH Harvey and Arnold Berk.
2005. Biologa Celular y Molecular.
5 edicin Editorial Panamericana
Revista colombiana
ciencia e
ingenieria al dia: UNIVERSIDAD
DE CARTAGENA; CARTAGENACOLOMBIA; enero julio de 2013;
volumen 8 N1; ISSN 1900-768X

reconocer

estudiar

estructuras de la clula analizada.

que

para