Ao de la consolidacin del

Mar de Grau

CARRERA: FARMACIA Y BIOQUIMICA

CURSO:

microbiologa

PROFESOR: Osorio ivan

TEMAS: TECNICAS DE TINCION Y MICROSCOPIA
ALUMNA: ASANZA CRUZ LUCERO mAYLIN
CICLO:

VII

AULA: 411

TRUNO: NOCHE

2016

OBJETIVOS

Determinar y definir el concepto de tcnica d e tincin.

Determinar y aplicar las tcnicas bsicas de tincin ms frecuentes.
Determinar y reconocer las partes del microscopio y funcionamiento.
Determinar una buena tcnica para el correcto empleo del microscopio.

INTRODUCCION

El tamao de la mayora de las clulas bacterianas es tal que resultan difciles

de ver con el microscopio ptico. La principal dificultad es la falta de contraste
entre la clula y el medio que la rodea, y el medio ms simple de aumentar el
contraste entre la clula y el medio que la rodea es la utilizacin de colorantes.
Estos pueden emplearse tambin para localizar estructuras especficas en la
clula o para distinguir entre tipos diferentes de clulas. Las clulas
generalmente son tratadas para coagular el protoplasma antes de teirlas,
proceso llamado fijacin. Para las bacterias la fijacin por el calos es lo ms
corriente, aunque tambin puede fijarse con sustancias qumicas como
formaldehdo, cidos y alcoholes. Despus de la fijacin se realiza
habitualmente en clulas que han sido secadas sobre un portaobjetos, tratando
despus ste con el agente fijador y siguiendo inmediatamente el proceso de
tincin. La fijacin produce generalmente el encogimiento de las clulas, la
tincin, por el contrario, hace que las clulas aparezcan mayores que lo que
son realmente, de manera que las medidas de las clulas que han sido fijadas
o teidas no pueden realizarse con mucha precisin.
Un microscopio simple (de un lente o varios lentes), es un instrumento que
amplifica una imagen y permite la observacin de mayores detalles de los
posibles a simple vista. El microscopio ms simple es una lente de aumento o
un
par
de
anteojos.
El poder de resolucin del ojo humano es de 0,2 mm es decir que para ver dos
objetos separados estos deben estar como mnimo a esa distancia.
El microscopio aumenta la imagen hasta el nivel de la retina, para captar
la informacin.
La resolucin depende de la longitud de onda de la fuente luminosa, el espesor
del
espcimen,
la calidad de
la
fijacin
y
la
intensidad
de
la
coloracin.
Tericamente la mxima resolucin que se puede alcanzar es de 0,2 um dada
por una luz con longitud de onda de 540 nm, la cual pasa por un filtro verde
(muy sensible por el ojo humano) y con objetos condensadores adecuados. El
ocular aumenta la imagen producida por el objetivo, pero no puede aumentar la
resolucin.
Existen distintos microscopios pticos generales y de investigacin que se
diferencian en factores tales como la longitud de onda de la iluminacin del
espcimen,
la
alteracin fsica de
la
luz
que
incide
en
la muestra y procesos analticos que se aplican a la imagen final.

MARCO TEORICO

TEMA 1

TCNICAS DE TINCIN
El tamao de la mayora de las clulas bacterianas es tal que resultan difciles
de ver con el microscopio ptico. La principal dificultad es la falta de contraste
entre la clula y el medio que la rodea, y el medio ms simple de aumentar el
contraste es la utilizacin de colorantes. Estos pueden emplearse para
distinguir entre tipos diferentes de clulas o para revelar la presencia de
determinados constituyentes celulares, tales como flagelos, esporas, cpsulas,
paredes celulares, centros de actividad respiratoria, etc.
Las clulas generalmente son tratadas para coagular el protoplasma antes de
teirlas, proceso llamado fijacin. Para bacterias, la fijacin por el calor es lo
ms corriente, aunque tambin puede fijarse con sustancias qumicas como
formaldehido, cidos y alcoholes. Despus de la fijacin, si se aade el
colorante, no se producen ulteriores cambios estructurales en el protoplasma.
La fijacin se realiza habitualmente en clulas que han sido fijadas sobre un
portaobjetos, tratando despus ste con el agente fijador, y siguiendo
inmediatamente el proceso de tincin. La fijacin produce habitualmente el
encogimiento de las clulas; la tincin, por el contrario, hace que las clulas
aparezcan mayores que lo que son realmente, de manera que las medidas de
las clulas que han sido fijadas o teidas no pueden realizarse con mucha
precisin.
La mayora de los colorantes son compuestos orgnicos que tienen alguna
afinidad especfica por los materiales celulares. Muchos colorantes utilizados
con frecuencia son molculas cargadas positivamente (cationes) y se combinan
con intensidad con los constituyentes celulares cargados negativamente, tales
como los cidos nucleicos y los polisacridos cidos. Ejemplos de colorantes
catinicos son el azul de metileno, el cristal violeta y la safranina. Otros
colorantes son molculas cargadas negativamente (aniones) y se combinan
con los constituyentes celulares cargados positivamente, tales como muchas
protenas. Esos colorantes incluyen la eosina, la fucsina cida y el rojo Congo.
Otro grupo de colorantes son sustancias liposolubles; los colorantes de este
grupo se combinan con los materiales lipdicos de la clula, usndose a
menudo para revelar la localizacin de las gotculas o depsitos de grasa. Un
ejemplo de colorante liposoluble es el negro Sudn.

Algunos colorantes teirn mejor slo despus de que la clula haya sido
tratada con otra sustancia qumica, que no es un colorante por s mismo. Esta
sustancia se denomina mordiente; un mordiente habitual es el cido tnco. El
mordiente se combina con un constituyente celular y lo altera de tal modo que
ahora s podr atacar el colorante.
Si se desea simplemente incrementar el contraste de las clulas para la
microscopa, son suficientes los procedimientos simples de tincin. El azul de
metileno es un buen colorante simple que acta sobre todas las clulas
bacterianas rpidamente y que no produce un color tan intenso que oscurezca
los detalles celulares. Es especialmente til para detectar la presencia de
bacterias en muestras naturales, puesto que la mayor parte del material no
celular no se tie.
La tincin negativa es el reverso del procedimiento de tincin usual: las clulas
se dejan sin teir, pero se colorea en cambio el medio que las rodea. Lo que se
ve, por tanto, es el perfil de las clulas. La sustancia utilizada para la tincin
negativa es un material opaco que no tiene afinidad por los constituyentes
celulares y que simplemente rodea las clulas, tal como la tinta china (que es
una suspensin de partculas de carbono coloidal) o la nigrosina (un colorante
negro insoluble en agua). La tincin negativa es un modo satisfactorio de
aumentar el contraste de las clulas en la microscopia ptica, pero su mxima
utilidad est en revelar la presencia de cpsulas alrededor de las clulas
bacterianas.
Los mtodos de tincin son de gran utilidad, pero deben usarse siempre con
precaucin, ya que pueden conducir a errores. Las molculas de colorante
forman en ocasiones precipitados o agregados que parecen estructuras
celulares autnticas, pero que son formaciones completamente artificiales
inducidas por el mismo colorante. Tales estructuras se denominan artefactos, y
deben tomarse muchas precauciones para tener la seguridad de que no nos
estamos equivocando al creer que un artefacto es una estructura realmente
existente.

PREPARACIN DE UN FROTIS
Sobre un portaobjetos de vidrio, limpio y seco, se coloca una gota del material
que se va a teir (si es lquido) o se hace rodar el hisopo con que se tom la
muestra. Una vez que el hisopo ha tocado la superficie del portaobjetos, que no

est estril, ya no puede ser empleado para inocular los medios de cultivo.
Puede usarse una aguja estril para transferir una pequea cantidad de un
cultivo bacteriano a la superficie del portaobjetos. Este material es suspendido
en una gota de agua o solucin salina previamente colocada sobre el
portaobjetos. Cuando se trata de colonias muy pequeas que pueden perderse
en una gota de lquido se emplea una varilla delgada de madera estril con la
cual se toca la colonia obtenindose as una fraccin apreciable del desarrollo.
El material se frota directamente sobre el portaobjetos, donde puede
visualizarse con facilidad. El material colocado en el portaobjetos se deja secar
al aire o bien se pasa varias veces por la zona azul de la llama de un mechero
de Bunsen hasta que el vidrio est tan caliente que moleste al tacto pero no
queme.

EXAMEN DE MUESTRAS AL MICROSCOPIO Y ANEXOS

Segn la manipulacin que efectuemos sobre la muestra a observar y segn
los colorantes que empleemos durante el proceso, podemos hablar de
diferentes modalidades de tincin.
Examen microscpico directo de las
muestras clnicas Sin Tincin
No se utiliza ningn tipo de colorante.
Es el montaje directo hmedo o examen en
fresco: las muestras se extienden directamente
sobre la superficie de un portaobjetos para su
observacin. El material que es demasiado espeso para permitir la
diferenciacin de sus elementos puede diluirse con igual volumen de solucin
salina fisiolgica estril. Se deposita suavemente un cubreobjetos sobre la
superficie del material.
Este tipo de preparacin se emplea para detectar trofozotos mviles de
parsitos intestinales como Giardia, Entamoeba, huevos y quistes de otros
parsitos, larvas y gusanos adultos,Trichomonas, hifas de hongos, etc
En la imagen: Candida sp en un examen en fresco.

Examen microscpico de las muestras clnicas levemente modificadas

Tincin Simple
Se utiliza un solo colorante, por lo que todas las estructuras celulares se tien
con la misma tonalidad (Tinta china, Azul
Metileno de Loeffler, Azul de lactofenol).
El Hidrxido de potasio al 10% (solucin de
KOH) permite ver elementos de hongos ya que
el KOH digiere parcialmente los componentes
proteicos, por ejemplo de la clula husped,
pero no acta sobre los polisacridos de las
paredes celulares de los hongos.

La tinta china o Nigrosina permite observar clulas levaduriformes capsuladas

(Cryptococcus), sobre todo en LCR. Los polisacridos capsulares rechazan la
tinta china y la cpsula aparece como un halo claro alrededor de los
microorganismos. Azul de metileno de Loeffler puede agregarse a las
preparaciones en fresco de heces para observar la presencia de leucocitos.
En la imagen: Cryptococcus neoformans en una tincin con tinta china.
Examen microscpico de las muestras clnicas muy modificadas
Tincin Diferencial
Se utilizan varios colorantes combinados. Las estructuras celulares se
diferencian en funcin de los diferentes colorantes
que fijan de acuerdo con su propia constitucin
qumica.
Los ejemplos clsicos sera la tincin de GRAM o
la de Ziehl-Neelsen
En la imagen: BGN y levaduras en una tincin
GRAM

TEMA 2

MICROSCOPA

La microscopa (o tambin sin tilde: microscopia)1 es el conjunto de

tcnicas y mtodos destinados a hacer visible los objetos de estudio que por su
pequeez estn fuera del rango de resolucin del ojo normal.
Si bien el microscopio es el elemento central de la microscopa, el uso del
mismo se requiere para producir las imgenes adecuadas, de todo un conjunto
de mtodos y tcnicas afines pero extrnsecas al aparato. Algunas de ellas son,
tcnicas de preparacin y manejo de los objetos de estudio, tcnicas de salida,
procesamiento, interpretacin y registro de imgenes, etc.
Exceptuando tcnicas especiales como las utilizadas en microscopio de fuerza
atmica, microscopio de iones en campo y microscopio de efecto tnel, la
microscopa generalmente implica la difraccin, reflexin o refraccin de algn
tipo de radiacin incidente en el sujeto de estudio.

MICROSCOPIO PTICO
Un microscopio ptico es un microscopio basado en lentes pticas. Tambin se
le conoce como microscopio de luz, (que utiliza luz o fotones) o microscopio
de campo claro. El desarrollo de este aparato suele asociarse con los trabajos
de Anton van Leeuwenhoek. Los microscopios de Leeuwenhoek constaban de
una nica lente pequea y convexa, montada sobre una plancha, con un
mecanismo para sujetar el material que se iba a examinar (la muestra o
espcimen). Este uso de una nica lente convexa se conoce como microscopio
simple, en el que se incluye la lupa, entre otros aparatos pticos.

PARTES DEL MICROSCVOPIO Y DEFINICIONES

1 * Ocular: lente situada cerca del ojo del observador. Capta y ampla la
imagen formada en los objetivos.

2 * Objetivo: lente situada en el revlver. Ampla la imagen, es un elemento

vital que permite ver a travs de los oculares.

3 * Condensador: lente
preparacin.

que

concentra

los rayos

luminosos sobre

la

4 * Diafragma: regula la cantidad de luz que llega al condensador.

5 * Foco: dirige los rayos luminosos hacia el condensador.

6 * Tubo: es la cmara oscura que porta el ocular y los objetivos. Puede estar
unida al brazo mediante una cremallera para permitir el enfoque.

7 * Revlver: Es el sistema que porta los objetivos de diferentes aumentos, y

que rota para poder utilizar uno u otro, alinendolos con el ocular.

8 * Tornillos macro y micromtrico: Son tornillos de enfoque, mueven la

platina o el tubo hacia arriba y hacia abajo. El micromtrico permite
desplazamientos amplios para un enfoque inicial y los micromtricos
desplazamientos muy cortos, para el enfoque ms preciso. Pueden llevar
incorporado un mando de bloqueo que fija la platina o el tubo a una
determinada altura.

9 *Platina: Es una plataforma horizontal con un orificio central, sobre el que se

coloca la preparacin, que permite el paso de los rayos procedentes de la
fuente de iluminacin situada por debajo. Dos pinzas sirven para retener el
portaobjetos sobre la platina y un sistema de cremallera que permite mover la
preparacin. Puede estar fija o unida al brazo por una cremallera para permitir
el enfoque.

10 *Brazo: Es la estructura que sujeta el tubo, la platina y los tornillos de

enfoque asociados al tubo o a la platina. La unin con la base puede ser
articulada o fija.

11 * Base o pie: Es la parte inferior del microscopio que permite que ste se
mantenga de pie.

MICROSCOPIO OPTICO Y SUS PARTES

ANEXOS

Tubo, cremallera de enfoque

y tornillo micromtrico.

Tornillos macro y
micromtrico

Revlver

Platina y base

Diafragma - Condensador

Objetivos
desmontados

oculares intercambiables de
diferentes aumentos

BLIOGRAFIA

 www.google academico
Libro: Microbiologa en un laboratorio
Autor: Ftima Fuentes, Panozo, Cardozo
Articulo microscopia pdf.

Articulo pdf. Mtodos de tincin