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UNIVERSIDADE DE SO PAULO

FACULDADE DE CINCIAS FARMACUTICAS


Programa de Ps-graduao em Farmcia
rea de Anlises Clnicas

Dietilamida do cido lisrgico (LSD) e


N,N-dimetiltriptamina (DMT) como substratos de peroxidases:
uma possvel rota de metabolizao

Melissa Medrano Gomes

Dissertao para obteno do grau de


Mestre

Orientadora:
Profa. Dra. Ana Campa

So Paulo
2008
1

Melissa Medrano Gomes


Dietilamida do cido lisrgico (LSD) e N,N-dimetiltriptamina
(DMT) como substratos de peroxidases: uma possvel rota de
metabolizao
Comisso Julgadora da
Dissertao para obteno do grau de Mestre

__________________________
Profa. Dra. Ana Campa
Orientadora / Presidente

Profa. Dra. Regina Vicenzi Oliveira


1o. examinador

Prof. Dr. Josef Willhen Baaden


2o. examinador

So Paulo, 25 de fevereiro de2008.


2

minha amiga e orientadora Profa. Dra. Ana Campa, que sempre


apostou em mim e nunca duvidou de minha vitria. Obrigada pela
oportunidade que me ofereceu de ter participado de seu respeitado grupo,
onde no s cresci como profissional, mas tambm como pessoa. Levarei
sempre comigo todos esses momentos maravilhosos que pudemos
compartilhar. Por fim, obrigada pela confiana, respeito e amizade.

A mente que se abre a uma nova idia,


jamais voltar a seu tamanho original.
Albert Einstein

Quero oferecer esse mrito conquistado minha querida av


Manoela e memria dos meus queridos avs Caetano e Ardevan, que
sempre quiseram que meus estudos estivessem em primeiro lugar e
nunca negaram ajuda para que isso fosse possvel. Graas ao incentivo
de minha av, consegui realizar um sonho que pensava estar fora de
minha realidade. Assim, quero agradec-la pelo incentivo persistente, pelo
carinho e amor me oferecidos. Tenho certeza tambm de que, onde quer
que meus avs estejam eles estaro igualmente orgulhosos de mim...

Nossas dvidas so traidoras e nos fazem


perder o que, com freqncia, poderamos
ganhar pelo simples medo de arriscar.
William Sheikespeare

Ao meu querido companheiro Felipe Augusto Drr, que se tornou


em to pouco tempo, uma das pessoas mais especiais da minha vida. Foi
quem me forneceu todo suporte tcnico-profissional para que este
trabalho fosse bem sucedido, assim como todo apoio emocional
necessrio durante esse perodo. Serei infinitamente grata a voc!

No espere realizar seus sonhos


se voc no estiver disposto a ajudar
os outros a realizar os deles.
Kaughee Vill

Agradecimentos
A Deus pela grande oportunidade me oferecida e a toda minha
famlia que compartilhou comigo os momentos de alegrias e dificuldades.
s minhas queridas amigas Paula Kujbida, Grasiela Magnani e
Silene Migliorini pelo carinho e amizade sempre me oferecidos.
Aos meus colegas de trabalho Silvana Sandri, Sabrina Okada,
Andressa Franco, Alziana Pedrosa, Siddartha Sacadura e Sidney
Moura, por toda ajuda tcnica, convvio e apoio moral.
Aos professores doutores Maurcio Yonamine e Ernani Pinto
Jnior pelo incentivo quando precisei e pela amizade que se formou.
Faculdade de Cincias Farmacuticas da Universidade de So
Paulo (FCF/USP) e a todos os funcionrios que ajudaram direta ou
indiretamente na realizao deste trabalho.
Fundao de Amparo pesquisa do Estado de So Paulo
(FAPESP) pela concesso de bolsa e suporte financeiro, bem como ao
Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientfico e Tecnolgico (CNPq).

ndice
1. LISTA DE ABREVIATURAS ....................................................................................... 1
2. RESUMO .................................................................................................................... 3
3. ABSTRACT................................................................................................................. 4
4. INTRODUO............................................................................................................ 5
5. REVISO DA LITERATURA....................................................................................... 9
5.1 COMPOSTOS INDLICOS COM ATIVIDADE ALUCINGENA ............................................... 9
5.1.1 DIETILAMIDA DO CIDO LISRGICO (LSD) ....................................................... 11
5.1.2 N,N-DIMETILTRIPTAMINA (DMT) ...................................................................... 14
5.2 NEUTRFILOS, CLULAS MONONUCLEARES E BURST OXIDATIVO.................................. 18
5.3 PEROXIDASES ........................................................................................................ 20
5.3.1 MIELOPEROXIDASE ....................................................................................... 20
5.3.2 PEROXIDASE DE RBANO .............................................................................. 22
5.4 CROMATOGRAFIA LQUIDA DE ALTA EFICINCIA (HPLC) ............................................... 24
5.4.1 DETECTORES DE ABSORBNCIA ..................................................................... 25
5.4.2 DETECTOR DE FLUORESCNCIA ..................................................................... 26
5.5 ESPECTROMETRIA DE MASSAS ................................................................................ 27
5.6 CROMATOGRAFIA LQUIDA DE ALTA EFICINCIA ACOPLADA ESPECTROMETRIA DE
MASSAS (LC/MS) .......................................................................................................... 28
5.7 QUIMILUMINESCNCIA ............................................................................................. 29
6. OBJETIVOS.............................................................................................................. 31
7. MATERIAL E MTODOS ......................................................................................... 33
7.1 MATERIAL .............................................................................................................. 33
7.1.1 REAGENTES ................................................................................................ 33
7.1.2 EQUIPAMENTOS ........................................................................................... 33
7.1.3 LEUCCITOS E URINA ................................................................................... 34
7.2 MTODOS ............................................................................................................. 34
7.2.1 PREPARO DE SOLUES ...................................................................................... 34
7.2.2 ISOLAMENTO DE LEUCCITOS ........................................................................ 35
7.2.3 REAO DE LSD COM HRP E H2O2 .............................................................. 35
7.2.4 REAO DE LSD COM LEUCCITOS ATIVADOS ................................................ 36
7.2.5 DETECO DOS PRODUTOS DA REAO DE LSD POR HPLC COM DETECTORES
PDA E FLUORESCNCIA, E POR LC/MS ..................................................................... 36
7.2.6 REAO DE LSD COM DE NEUTRFILOS ATIVADOS E ADIO DE INIBIDORES DE
ERO .......................................................................................................................... 37
7.2.7 ANLISE DE URINA DE USURIO DE LSD......................................................... 37
7.2.8 QUIMILUMINESCNCIA DA REAO DE LSD COM LEUCCITOS ATIVADOS E COM
HRP E H2O2 ............................................................................................................... 38
7.2.9 REAO DE LSD COM H2O2 29% E ANLISE POR LC/MS ............................... 38
7

7.2.10 EXTRAO DE DMT A PARTIR DO CH DE SANTO DAIME (AYAHUASCA) ...........39


7.2.11 SNTESE DE DMT A PARTIR DE INDOL ...........................................................39
7.2.12 REAO DE DMT COM HRP E H2O2 ............................................................40
7.2.13 REAO DE DMT COM NEUTRFILOS ATIVADOS ............................................40
7.2.14 DETECO DOS PRODUTOS DA REAO DE DMT POR HPLC COM DETECTORES
PDA E FLUORESCNCIA, E POR LC/MS..........................................................................41
7.2.15 REAO DE DMT COM NEUTRFILOS ATIVADOS E ADIO DE INIBIDORES DE
ERO ...........................................................................................................................41
8. RESULTADOS ..........................................................................................................43
8.1 LSD .......................................................................................................................43
8.1.1. REAO DE LSD COM HRP E H2O2 ..............................................................43
8.1.2 REAO DE LSD COM NEUTRFILOS ATIVADOS ...............................................54
8.1.3 ANLISE DE URINA DE USURIO DE LSD .........................................................58
8.1.4. QUIMILUMINESCNCIA DA REAO DE LSD COM LEUCCITOS ATIVADOS E COM
HRP/H2O2 ..................................................................................................................59
8.1.5 REAO DE LSD COM H2O2 29% ..................................................................62
8.2 DMT ......................................................................................................................63
8.2.1 EXTRAO DE DMT A PARTIR DA AYAHUASCA (CH DE SANTO DAIME)..............63
8.2.2 OBTENO DE DMT A PARTIR DE SUA SNTESE ...............................................64
8.2.3 REAO DE DMT COM HRP E H2O2 ..............................................................65
8.2.4 REAO DE DMT COM NEUTRFILOS ATIVADOS ..............................................72
9. DISCUSSO .............................................................................................................75
9.1 LSD .......................................................................................................................75
9.1 DMT ......................................................................................................................80
10. CONCLUSES .......................................................................................................85
11. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS ........................................................................87
12. ANEXOS..................................................................................................................95
12.1 PARECER DO COMIT DE TICA EM PESQUISA .........................................95
12.3 FICHA DO ALUNO ............................................................................................98
12.3 CURRCULO LATTES.....................................................................................101

1. LISTA DE ABREVIATURAS
AFMK: N-acetil-N-formil-5-metoxiquinuramina
AIA: cido 3-indolactico
AMK: N-acetil-5-metoxiquinuramina
AOMBK: N,N-dietil-7-amino-4-metil-6-oxo-2,3,4,4a,5,6-hexahidrobenzo[f]quinolina-2carboxamida
CONAD: Conselho Nacional Anti Drogas
Da: Dalton (unidade de massa atmica)
DC: corrente contnua
DMFK: N,N-dimetil-N-formilquinuramina
DMK: N,N-dimetilquinuramina
DMSO: dimetilsulfxido
DMT: N,N-dimetiltriptamina
DPI: difeniliodnio
ERO: espcies reativas de oxignio
ESI: ionizao por electrospray
FOMBK: N,N-dietil-7-formamido-4-metil-6-oxo-2,3,4,4a,5,6-hexahidrobenzo[f]quinolina
-2-carboxamida
HClO: cido hipocloroso
HPLC: cromatografia lquida de alta eficincia
H2O2: perxido de hidrognio
HRP: horseradish peroxidase
5-HT: 5-hidroxitriptamina (serotonina)
LC/MS: cromatografia lquida acoplada espectrometria de massas
LC/MS/MS: LC/MS em srie
LSD: dietilamida do cido lisrgico
MAO: monoamina oxidase
MPO: mieloperoxidase
MS: espectrometria de massas
m/z: relao massa/carga
NADPH: nicotinamida adenina dinucleotdeo fosfato
9

nor-LSD: N-demetil-LSD
O2- : nion superxido
O-H-LSD: 2-oxo-3-hidroxi-LSD
ONU: Organizao das Naes Unidas
PBMC: clulas mononucleares perifricas sangneas
PBS: tampo fosfato salina
DAD: detector de arranjo de diodos
PMN: neutrfilos
PMA: acetato de forbol miristato
RF: rdio freqncia
RMN: ressonncia magntica nuclear
SNC: sistema nervoso central
SOD: superxido dismutase
TA: aminas trao
TFA: cido trifluoractico
TR: tempo de reteno
UV/Vis: ultravioleta/visvel
ZO: zimosan opsonizado

10

2. RESUMO

Aps um intervalo de duas dcadas, ressurgiu um novo interesse em estudos


sobre alucingenos que visam a compreenso de como estes compostos interagem
com o sistema nervoso central (SNC). Sabendo-se que enzimas do tipo peroxidases
esto presentes em clulas do tipo leuccitos, neurnios e microglia, e que, so
capazes de oxidar compostos indlicos, esta, portanto, poderia representar uma rota
ativa

de

metabolizao

de

alucingenos

no

SNC,

ainda

no

conhecida.

Nesta perspectiva, este trabalho contribui com a descrio da metabolizao da


dietilamida do cido lisrgico (LSD) e da N,N-dimetiltriptamina (DMT) por peroxidase
de rbano (HRP) e mieloperoxidase (MPO) proveniente de neutrfilos ativados. A
formao de produtos de reao foi acompanhada por HPLC com detectores de
arranjo de diodos (DAD) e fluorescncia, e a identificao por espectrometria de
massas (MS). Ambas as peroxidases foram capazes de metabolizar LSD a compostos
que coincidem com produtos de sua metabolizao in vivo, como 2-oxo-3-hidroxi-LSD
(O-H-LSD) e nor-LSD, por enzimas hepticas do complexo P450. Entretanto, um
terceiro produto formado no havia sido descrito anteriormente. Apresenta como
caracterstica principal a abertura do anel indlico e foi nomeado pelo nosso grupo
como N,N-dietil-7-formamido-4-metil-6-oxo-2,3,4,4a,5,6-hexahidrobenzo[f]quinolina-2carboxamida (FOMBK). De uma maneira semelhante, HRP e MPO tambm
metabolizaram DMT a um produto hidroxilado (OH-DMT), que possivelmente
apresenta considervel ao alucingena, e a um segundo produto nomeado N,Ndimetil-N-formil-quinuramina (DMFK). Visto que peroxidases esto presentes em
diferentes tipos celulares, razovel supor que a formao dos produtos descritos
neste estudo possa ocorrer in vivo, numa possvel via alternativa de metabolizao de
LSD e DMT ainda no descrita em humanos.

11

3. ABSTRACT
After a gap of two decades a new interest in hallucinogen studies that aim the
comprehension of how these compounds interact with the central nervous system
(CNS) rose again. It is known that peroxidases enzymes are present in cells such as
leukocytes, neurons and microglia and that they are capable of oxidizing indolic
compounds. Then it could represent an active metabolization pathway for
hallucinogens in the CNS, not known yet. In this perspective, this study contributed with
the description of the metabolization of lysergic acid diethylamide (LSD) and N,Ndimethyltryptamine (DMT) by horseradish peroxidase (HRP) and myeloperoxidase
(MPO) from activated neutrophils. The formation of the reaction products was attended
by HPLC with diode array and fluorescence detectors, and the identification by mass
spectrometry (MS). Both peroxidases were capable of metabolizing LSD to compounds
that coincide with products from its in vivo metabolization, as 2-oxo-3-hydroxy-LSD (OH-LSD) and nor-LSD by the liver enzymes from P450 complex. However, a third
compound had not been described before. It has the opened indolic ring as main
characteristic and was named by our group as N,N-diethyl-7-formamido-4-methyl-6oxo-2,3,4,4a,5,6-hexahydrobenzo[f]quinoline-2-carboxamide (FOMBK). In a similar
way, HRP and MPO also metabolized DMT to a hydroxylated product (OH-DMT) that
possibly shows a considerable hallucinogen action and to a second product named as
N,N-dimethyl-N-formyl-kynuramine (DMFK). Since peroxidases are present in different
cell types, it is reasonable to assume that the formation of the products described in
this study may occur in vivo as well, in a possible alternative metabolic pathway for
LSD and DMT that has not been described in humans yet.

12

4. INTRODUO
Os alucingenos constituem uma das classes de agentes farmacologicamente
ativos mais antigos que se conhece (Schuster & Kuhar, 1996). Aps 1943, ano em que
se descobriu a ao alucingena da dietilamida do cido lisrgico (LSD) (Hofmann,
1980), muitos estudos sobre esta e demais substncias alucingenas comearam a
ser feitos. Alm da descrio da metabolizao heptica, prevaleceram estudos
clnicos sobre o potencial teraputico dessas substncias, rendendo centenas de
artigos publicados entre 1950 e meados dos anos 70.
Aps este perodo, houve uma queda acentuada no nmero de publicaes,
uma vez que, alm de no ter sido possvel encontrar atividades teraputicas
satisfatrias para estas substncias, em 1972, seu uso foi proibido pela ONU em todo
o mundo, inclusive para fins mdicos. Isto porque durante os anos 60, milhes de
jovens vivenciavam o movimento hippie, onde, ao mesmo tempo em que faziam uso
recreacional destas substncias com o intuito de buscar novas experincias,
contestavam as autoridades.
Entretanto, a partir dos anos 90, surge um novo crescimento no nmero de
publicaes sobre alucingenos que se deu graas aos resultados provenientes do
avano

da

tecnologia,

onde

modernos

equipamentos

de

cromatografia

espectrometria foram desenvolvidos, tornando-se poderosas ferramentas analticas,


favorecendo assim, os estudos na rea da Toxicologia Forense. Alm disso, na era da
neurocincia, a utilizao de modernas tcnicas bioqumicas e de genmica propiciam
uma nova seqncia de estudos que visam a compreenso de como os alucingenos
interagem com o crebro, que vias de sinalizao so ativadas, que genes so
expressos e qual o impacto desses processos sobre a percepo, memria, ateno,
aprendizado e doenas afetivas e cognitivas.
Nessa perspectiva, este trabalho contribui com a descrio da metabolizao
dos alucingenos LSD e N,N-dimetiltriptamina (DMT) por enzimas do tipo peroxidases,
que so encontradas em diferentes tipos celulares (inclusive em neurnios e microglia)
e que, portanto, poderiam representar uma rota ativa de metabolizao no sistema
nervoso central (SNC).
Inicialmente, percebemos que LSD e DMT apresentam uma similaridade
estrutural com compostos de amplo e variado espectro de atividades biolgicas, como
13

o aminocido triptofano, o neurotransmissor serotonina e o hormnio melatonina (Fig.


1), bastante abundantes in vivo (Ximenes et al., 2001 a).
N
O

N
H

NH

DMT
O

LSD
HO

OH

NH2

NH2

HN

N
H

N
H

triptofano

serotonina

N
H

melatonina

Figura 1: Estrutura qumica dos alucingenos DMT e LSD em comparao aos compostos
triptofano, serotonina e melatonina, evidenciando o anel indlico em comum.

Estes

compostos

so

oxidados

por

diferentes

peroxidases,

incluindo

mieloperoxidase (MPO) presente em clulas do sistema imune, como neutrfilos e


moncitos, por uma via dependente de nion superxido (Ximenes et al., 2005). Estas
reaes de oxidao geram compostos denominados genericamente de quinureninas,
que apresentam como caracterstica principal a abertura do anel indlico (Fig. 2) (Silva
et al., 2000).
A lista de atividades biolgicas dos compostos da classe de anlogos de
quinurenina tem se ampliado bastante nos ltimos tempos. A utilizao desses
compostos na teraputica e como alvo para o desenvolvimento de novos frmacos tem
sido considerado (Klivenyi et al., 2004; Stone & Darlington, 2002). A exemplo disso, a
quinurenina, composto proveniente da oxidao de triptofano (Fig.2), tem atividade
reportada em linfcitos (Fallarino et al., 2003), SNC e perifrico (Nemeth et al., 2005).
Nosso grupo de pesquisa mostrou que AFMK, anlogo de quinurenina
produzido a partir da oxidao de melatonina (Fig.2), inibe a produo de citocinas
pr-inflamatrias por neutrfilos, e est presente em altas concentraes em lquido
cefalorraquidiano de indivduos com meningite viral (Silva et al., 2005). Dessa forma,
14

possvel que no processo inflamatrio, caracterizado pela elevada mobilizao e


migrao de leuccitos, a metabolizao de melatonina por clulas do foco
inflamatrio seja responsvel pela formao de produtos com expressiva atividade
imunomodulatria.
O

OH

OH

NH2

HN

N
H

NH 2

OH
NH 2 O

triptofano

quinurenina

N-formil-quinurenina
O

O
O

HN

HN
N
H

NH 2

HN

O
NH

O
NH 2

melatonina

AFMK

AMK

Figura 2: Reaes de oxidao de triptofano e melatonina por peroxidases com a formao de


seus respectivos produtos de abertura do anel indlico. (AFMK: N-acetil-N-formil-5metoxiquinuramina, AMK: N-acetil-5-metoxiquinuramina).

De qualquer forma, proposto que a oxidao de compostos indlicos por MPO


seja uma rota alternativa especialmente ativa na inflamao e na vigncia de algumas
doenas, que levem gerao de compostos biologicamente ativos. Entretanto, a
possibilidade de que essas reaes tambm ocorram fora do processo inflamatrio
ganhou novo amparo a partir da identificao de MPO em clulas neuronais,
especialmente em pacientes portadores de Alzheimer (Green et al., 2004) e esclerose
mltipla (Nagra et al., 1997).
Sendo assim, se considerarmos que anlogos de quinurenina podem ser
formados por diferentes tipos celulares via reaes catalisadas por MPO, amplia-se
bastante a possibilidade de que novos compostos deste tipo sejam formados in vivo.
Evidentemente, a formao desses compostos depender da concentrao de um
dado composto indlico, da presena de MPO e da eficincia da reao.
Para tanto, dando continuidade aos trabalhos do nosso grupo de pesquisa
sobre metabolismo de compostos indlicos, houve o interesse em identificar novos
15

substratos indlicos de peroxidases. Uma classe especialmente interessante para


esse estudo foram os compostos indlicos com atividade alucingena, como o LSD e a
DMT, onde ambos apresentam ao no SNC, mas suas vias de metabolizao so
pouco elucidadas.

16

5. REVISO DA LITERATURA
5.1 Compostos indlicos com atividade alucingena
Os alucingenos, tambm chamados de drogas psicodlicas, apresentam uma
rica e fascinante histria folclrica e constituem uma das classes de agentes
farmacologicamente ativos mais antigos que se conhece (Schuster & Kuhar, 1996).
Muitos compostos alucingenos ocorrem na natureza, outros so sinteticamente
produzidos em laboratrios, muitos dos quais clandestinos. Os que ocorrem
naturalmente tm sido usados h milhares de anos, principalmente pelos efeitos sobre
a percepo sensorial. At antes dos anos 60, estes compostos eram estritamente
usados em rituais religiosos e muitas pessoas mal sabiam de sua existncia; para
outras, apresentavam propriedades mgicas e msticas (Julien, 1998).
Estruturalmente, os alucingenos clssicos so divididos em duas categorias:
(a) a que possui um ncleo indolamina; (b) e a que possui uma poro fenilamina. O
grupo das indolaminas (Fig. 3) pode ser dividido em trs subgrupos (Schuster &
Kuhar, 1996):
1) triptaminas simples N-substitudas, como DMT, psilocina e bufotenina;
2) carbolinas, como alcalides relacionados harmalina;
3) ergolinas, como LSD.
Farmacologicamente, os alucingenos so classificados como um grupo da
classe das drogas psicotrpicas, isto , que tem ao no SNC, que afetam o humor e o
comportamento (Rang et al., 1997). So capazes de alterar o sentido da percepo da
realidade e dos processos cognitivos, causando alucinaes visuais e auditivas
(Nichols, 2004).
Pouco tempo depois da descoberta da serotonina (5-HT) (Fig. 3) em 1948, e da
confirmao de que 5-HT e LSD apresentavam em comum o ncleo indolamina, foi
postulado que os alucingenos deveriam agir via um mecanismo serotonrgico. Os
receptores

5-HT

(serotonrgicos)

so

encontrados

na

musculatura

lisa

principalmente na membrana celular de neurnios. A 5-HT extensivamente


sintetizada a partir de triptofano (cerca de 90%) no trato gastrintestinal, sendo
estocada principalmente em plaquetas (Aghajanian & Marek, 1999).
17

HO

OH
N

N
H

N
H
N,N-dimetiltriptamina

N
H

4-OH-N,N-dimetiltriptamina

5-OH-N,N-dimetiltriptamina

(psilocina)

(bufotenina)

(DMT)

N
O

N
N
H
harmalina

HO
NH2

O
NH
dietilamida do cido

N
H
5-OH-triptamina
(5-HT ou serotonina)

lisrgico (LSD)

Figura 3: Estrutura qumica dos alucingenos clssicos do grupo das indolaminas e do


neurotransmissor serotonina.

As funes associadas com as vias serotonrgicas incluem vrias respostas


comportamentais, o controle do humor, da emoo, do sono e da viglia, das vias
sensitivas, da temperatura corporal, do comportamento da alimentao e do vmito
(Rang et al., 1997). Os neurnios com receptores serotonrgicos esto concentrados
nos ncleos da rafe da linha mdia na ponte e no bulbo, projetando-se difusamente
para o crtex, sistema lmbico, hipotlamo e medula espinhal (Berne et al., 2000). Os
principais receptores serotonrgicos so: 5-HT1, 5-HT2, 5-HT3, 5-HT4, 5-HT5, 5-HT6 e 5HT7, e compartilham um alto grau de homologia (Squire et al., 2003).
No se sabe ainda qual o real mecanismo de ao dos alucingenos, mas
acredita-se que se comportam como agonistas de receptores 5-HT2A e 5-HT2C, sendo
que para o segundo, so agonistas parciais (Nichols, 2004; Aghajanian & Marek, 1999;
Glennon et al., 1984). Entretanto, estudos recentes vm desenvolvendo tcnicas
avanadas de genmica e protemica com a finalidade de caracterizar os mecanismos
moleculares de sinalizao de receptores 5-HT acoplados protena G (Weinstein,
2006).

18

5.1.1 Dietilamida do cido lisrgico (LSD)


O doutor Albert Hofmann, qumico da indstria farmacutica sua Sandoz
desde 1929, estudou e manipulou alcalides do fungo Claviceps purpurea, mais
conhecido como ergot (Hofmann, 1980), que infesta gros como centeio e trigo em
regies do continente europeu e Amrica do Norte (Julien, 1998). Um grande nmero
de compostos preparado a partir de alcalides do ergot como ergotamina,
ergometrina, entre outros, sendo compostos utilizados terapeuticamente em
obstetrcia, ginecologia e endocrinologia, como frmacos no tratamento de
enxaquecas e no controle de hemorragias ps-parto (Rang et al., 1997).
Como parte de um programa de pesquisa com intuito de ampliar o espectro de
ao destes compostos (Julien, 1998), Hofmann decidiu sintetizar e testar uma nova
srie de derivados de um dos alcalides do ergot: o cido lisrgico (Fig. 4). Em 1938,
foi produzida a vigsima quinta alterao na molcula, nomeada dietilamida do cido
lisrgico, abreviada como LSD-25 (do alemo Lyserg-sure-dithylamid) para uso do
laboratrio (Fig. 4). A sntese desta substncia foi planejada com a inteno de se
obter um estimulante respiratrio (analptico) e da circulao sangnea, entretanto,
estudos farmacolgicos do composto com animais pareceram ser pouco promissores,
sendo posto parte. Nos cinco anos seguintes, nada mais se falou sobre LSD-25
(Hofmann, 1980).
OH
O

N
N

NH
cido lisrgico

NH
LSD-25

Figura 4: Estrutura qumica do cido lisrgico e do composto semi-sinttico LSD-25.

Os estudos de Hofmann com derivados de alcalides do ergot no estavam


trazendo resultados satisfatrios e ele no havia esquecido o relativo desinteresse de
farmacologistas e mdicos sobre o composto LSD-25. Ento, um sentimento peculiar
19

de que o composto pudesse apresentar outras propriedades alm daquelas


estabelecidas nas primeiras investigaes, o induziram a produzir LSD-25 novamente.
Assim, em 1943, Hofmann repetiu a sntese, mas, no ltimo passo da reao, durante
o processo de purificao e cristalizao na forma de tartarato, comeou a sentir
sensaes estranhas e bizarras. Interrompeu o trabalho e descreveu minuciosamente
os sintomas: alucinaes visuais, fadiga e falta de concentrao (Hofmann, 1980).
Devido toxicidade conhecida das substncias do ergot, Hofmann sempre
manteve hbitos meticulosos no laboratrio. Possivelmente, uma gota da soluo de
LSD-25 caiu sobre sua mo durante a cristalizao, e um trao da substncia foi
absorvida pela pele. A partir de ento, pensou que se LSD-25 foi, de fato, a causa das
sensaes estranhas que experimentou, muito provavelmente tratava-se de uma
substncia de extraordinria potncia (Hofmann, 1980).
Para tirar a dvida, decidiu ingerir uma quantidade muito pequena do composto.
Aps experimentar os mesmos sintomas, provou realmente que a substncia que
havia sintetizado apresentava evidentes caractersticas alucingenas (Hofmann,
1980). Por fim, Hofmann ajudou a descobrir uma nova rea da psicofarmacologia,
tornando-se uma autoridade em qumica e psicologia de substncias alucingenas
(Drummer et al., 2001).
Incapaz de encontrar um uso teraputico para o composto LSD-25, a empresa
Sandoz o tornou disponvel para pesquisadores e psicoterapeutas (Drummer et al.,
2001). Os efeitos do LSD em humanos propiciavam um modelo de psicose, como a
esquizofrenia, que instigava os pesquisadores. Esse modelo poderia fornecer
informaes importantes sobre processos fisiolgicos e bioqumicos de doenas
mentais e, consequentemente, descobertas de possveis tratamentos. Alguns
terapeutas utilizaram LSD como adjuvante na psicoterapia, mas no provou ser um
tratamento efetivo. O trabalho com LSD em voluntrios humanos nos anos 60 acabou
por introduzir o composto em vrias universidades, aumentando sua popularidade
(Julien, 1998).
Contudo, desde quela poca, LSD tem sido amplamente usado principalmente
por adolescentes de diversas partes do mundo. Sua popularidade parcialmente
devida grande disponibilidade e seu preo relativamente baixo (Laing, 2003). Doses
comuns variam de 25 a 300 g, sendo suficientes para promover os efeitos
alucingenos (Julien, 1998). A droga utilizada na forma de blotters (pedaos muito
20

pequenos de papel), solues alcolica ou aquosa, comprimidos e at mesmo em


cpsulas gelatinosas (Drummer et al., 2001).
Usualmente, LSD administrado por via oral e fcil e rapidamente absorvido.
Cerca de uma hora aps sua ingesto, totalmente absorvido atingindo o pico da
concentrao plasmtica em 3 horas. bem distribudo pelo organismo, atingindo
facilmente o SNC e placenta. Apresenta tempo de meia-vida de aproximadamente 3,6
horas e seus efeitos podem ter durao entre 6 a 12 horas, dependendo da dose
ingerida (Julien, 1998).
Pouco se sabe sobre a farmacocintica de LSD. Sabe-se que extensivamente
metabolizado no fgado pelas enzimas do complexo P450, responsveis pela catlise
das reaes de oxidao, hidroxilao, demetilao e conjugao (Canezin et al.,
2001). Seus principais metablitos, 2-oxo-3-hidroxi-LSD (O-H-LSD) e N-demetil-LSD
(nor-LSD) (Fig. 5), so excretados na urina em uma porcentagem muito maior que a
prpria droga apenas 1% de LSD eliminado na forma inalterada na urina (Klette et
al., 2000). Devido ao fato de serem muito polares, esses metablitos, ao passarem
pelos tbulos coletores nos nfrons, no so reabsorvidos, sendo rapidamente
eliminados na urina. Esta elevada excreo pode explicar o fato de no serem
encontrados no plasma em concentraes significativas (Canezin et al., 2001).

N
O

N
N

N
N

NH
H

OH
O
NH

LSD

NH

NH

O-H-LSD

nor-LSD

Figura 5: Estrutura qumica de LSD e seus principais metablitos, 2-oxo-3-hidroxi-LSD (O-HLSD) e N-demetil-LSD (nor-LSD).

LSD considerado como droga de abuso devido ao seu potente efeito


alucingeno, que leva perda da percepo da realidade. Os efeitos adversos incluem
os chamados flashbacks e bad trips, experincias alucingenas repetidas e distoro
dos sentidos, como medo e parania, que ocorrem alguns dias aps o uso da droga
21

(Rang et al., 1997). Entretanto, no causa dependncias psicolgica e qumica,


ausentando o usurio da sndrome de abstinncia (Nichols, 2004).
Por ser usado em baixas concentraes, a identificao e quantificao de LSD
e seus metablitos em fluidos biolgicos sempre foi um desafio para os laboratrios
forense e de toxicologia clnica. A cromatografia gasosa tem mostrado alta
sensibilidade para anlises de amostras contendo LSD, apesar de sua termolabilidade
e da necessidade de derivatizao prvia (Hoja et al., 1997). Nos ltimos anos, o uso
da cromatografia lquida acoplada espectrometria de massas (LC/MS) vem
substituindo a cromatografia gasosa, bem como a prpria cromatografia lquida
acoplada fluorescncia (Hoja et al., 1997). A tcnica de LC/MS e LC/MS em srie
(LC/MS/MS) mostra alta sensibilidade e especificidade na deteco de quantidades
muito baixas de LSD e de seus metablitos em urina.

5.1.2 N,N-dimetiltriptamina (DMT)


A N,N-dimetiltriptamina (DMT), estruturalmente muito semelhante 5-HT (Fig.
3), uma substncia natural da famlia das triptaminas, presente em uma gama de
organismos como fungos, vegetais, anfbios e at mesmo em alguns porferos (Jacob
& Presti, 2005). Entretanto, em 1965, foi reportada como constituinte normal de
sangue e urina de humanos juntamente com a triptamina e a bufotenina (5-OH-N,Ndimetiltriptamina) (Fig. 3) (Franzen & Gross, 1965).
No entanto, a DMT provavelmente mais conhecida por sua presena nas
folhas de Psycotria viridis, popularmente conhecida como chacrona, utilizadas em
combinao com o caule de Banisteriopsis caapi, vulgo cip mariri, para a preparao
do ch de Santo Daime, tambm conhecido como ayahuasca, que na linguagem
quchua significa ch espiritual (Jacob & Presti, 2005). A bebida cor de terra e gosto
amargo tem ao alucingena e consumida em cultos religiosos genuinamente
brasileiros como a Unio do Vegetal, o Santo Daime e a Barquinha (Costa et al.,
2005).
Nos ltimos anos, estes grupos religiosos tm se espalhado por toda Europa e
Estados Unidos, chamando a ateno de pesquisadores internacionais quanto aos
efeitos do uso da ayahuasca. Calcula-se que, em 1997, apenas na Amrica do Sul, o
nmero de pessoas que faziam uso regular chegaria a 15 mil (Costa et al., 2005). No
22

Brasil, seu uso no contexto religioso foi oficialmente reconhecido e protegido por lei
(CONFEN, 1992), entretanto, no existem muitos estudos sobre seus efeitos. Segundo
o relatrio final do Grupo Multidisciplinar de Trabalho, de novembro de 2006, foi
recomendada ao Conselho Nacional Anti-Drogas (CONAD) a promoo de estudos
bioqumicos mais detalhados sobre o uso e efeitos da ayahuasca (da Silveira Filho et
al., 2006).
A seita do Santo Daime, fundada na dcada de 20 pelo maranhense Raimundo
Irineu Serra, um tipo de culto ecltico que mistura o catolicismo romano, o
espiritismo e o candombl. Sua principal caracterstica o canto, onde todos os
ensinamentos so ministrados por hinos. Durante as cerimnias, todos os
participantes ingerem cerca de 200 mL de ayahuasca, suficientes para produzir os
efeitos alucingenos. Alm disso, a bebida pode provocar irritaes gastrintestinais
causando vmito e diarria, vistos como uma desintoxicao do organismo em que, a
partir de ento, o indivduo estar apto a receber o Esprito Santo (Costa et al., 2005).
Entretanto,

DMT

no

tem

ao

alucingena

quando

administrada

isoladamente por via oral, pois sofre rpida metabolizao pela enzima monoamino
oxidase (MAO) tipo A encontrada no trato gastrintestinal (Julien, 1998). Mas,
curiosamente, o caule do cip B. caapi possui em sua composio inibidores da MAO
em concentraes que variam de 0,05% a 1,95%. Estes inibidores constituem as carbolinas, tais como harmina, harmalina e tetra-hidro-harmalina (Fig. 6). Dessa forma,
as -carbolinas presentes na ayahuasca inibem a MAO, protegendo a DMT de sua
metabolizao, evidenciando assim seu efeito alucingeno. Anlises quantitativas
revelam que 200 mL de ayahuasca possuem aproximadamente 30 mg de harmina, 10
mg de tetra-hidro-harmalina e 25 mg de DMT (McKenna et al., 1998).
N

N
N
H

harmina

HN
N
H

harmalina

N
H

tetra-hidro-harmalina

Figura 6: Estrutura qumica das -carbolinas inibidoras da MAO-A, encontradas em caule de


Banisteriopsis caapi.

23

A DMT um composto interessante por si s, no apenas por induzir efeitos


alucingenos na mente humana, mas tambm por sua sntese endgena, que
comeou a ser significativamente estudada nos anos 70 (Barker et al., 1981), embora
sua funo exata nos organismos ainda no esteja totalmente elucidada (Jacob &
Presti, 2005). Sabe-se que formada a partir do aminocido triptofano mediante duas
reaes distintas. Primeiramente ocorre uma reao de descarboxilao do
aminocido catalisada pela enzima aminocido aromtico descarboxilase, formando
triptamina. Em seguida, a triptamina monometilada graas enzima indoletilaminaN-metiltransferase, que transfere um grupamento metil proveniente de S-adenosilmetionina. Essa reao ocorre novamente, onde outro grupamento metil introduzido
N-metiltriptamina, gerando a DMT (Fig. 7) (Jacob & Presti, 2005).
O
OH

HN

NH 2

NH 2
N
H

AADC

INMT

N
H
CO2

triptofano

SAM

triptamina

INMT

N
H
SAH

SAM

N
H

SAH

DMT

N-metiltriptamina

Figura 7: Biossntese de DMT a partir de triptofano. (AADC) aminocido aromtico


descarboxilase; (INMT) indoletilamina-N-metiltransferase; (SAM) S-adenosil-metionina; (SAH)
S-adenosil-homocistena.

Existem poucos estudos sobre a metabolizao de DMT em humanos. De uma


dose administrada por via intramuscular, apenas 0,07% so excretados na urina na
forma inalterada (Kaplan et al., 1974); 25% so metabolizados a cido 3-indolactico
(AIA) (Fig. 8) (Szara, 1956). Esse perfil de biotransformao sugere a existncia de
outros possveis metablitos ainda no identificados (Hryhorczuk et al., 1986).
N
N
H
DMT

OH
MAO - A

N
H

cido 3-indolactico (AIA)

Figura 8: Metabolizao da DMT pela enzima MAO-A e formao do cido 3-indolactico


como principal metablito.

24

Um estudo feito sobre metabolizao in vitro de DMT com eritrcitos isolados


mostrou a formao de um novo composto identificado por espectrometria de massas
como sendo N,N-dimetilquinuramina (DMK) (Hryhorczuk et al., 1986). Este composto
foi formado via uma reao de oxidao, onde ocorreu a abertura do anel indlico da
molcula de DMT. Entretanto, nada foi concludo a respeito deste novo composto, isto
, no se sabe ainda se DMK formado in vivo ou se apresenta alguma atividade
biolgica (Hryhorczuk et al., 1986). Atualmente, sabe-se apenas que a reao de
oxidao

provavelmente

ocorreu

graas

atividade

pseudoperoxidsica

da

hemoglobina presente nos eritrcitos (Kawano et al., 2002).


Em 2001, foi descoberta em crebro e sistema perifrico de vertebrados a
presena de receptores para aminas trao (TA), como triptamina e tiramina. Assim
como os receptores 5-HT2A e 5-HT2C, os receptores TA tambm so acoplados
protena G e esto envolvidos com centros emotivos do corpo, mostrando possveis
conexes com muitas condies psiquitricas (Borowsky et al., 2001). Alguns estudos
reportaram uma maior ativao dos receptores TA por alucingenos em relao aos
receptores serotonrgicos (Jacob & Presti, 2005).
Logo aps a descoberta de DMT endgeno em humanos, alguns pesquisadores
comearam a analisar correlaes entre o aumento dos nveis de DMT em urina de
humanos e a esquizofrenia (Jacob & Presti, 2005; Tanimukai, 1970). Entretanto, foi
descoberto pouco depois, que nem todos os pacientes com esquizofrenia excretavam
altas quantidades de DMT. Assim, concluiu-se que DMT no apresentava uma funo
causal na esquizofrenia, mas poderia ser um fator intermedirio, exacerbando certas
caractersticas da psicose (Jacob & Presti, 2005).
A hiptese da ligao de DMT com receptores TA gera uma nova interpretao
da sua presena em urina de esquizofrnicos. Alguns pesquisadores sugerem que o
aumento da produo de DMT seja uma resposta homeostsica para suprimir a
atividade psictica. Consequentemente, DMT em baixas concentraes pode agir
como ansioltico endgeno, enquanto que em altas, tais como aquelas associadas
atividade alucingena, produzem mudanas extremas na conscincia (Jacob & Presti,
2005).
Analiticamente, a DMT pode ser detectada em plasma e urina de usurios por
cromatografia gasosa e lquida, e por LC/MS, que mostra alta sensibilidade e

25

especificidade na deteco de quantidades muito baixas de DMT e de seu metablito


AIA em fludos biolgicos (Forsstrm et al., 2001).
5.2 Neutrfilos, moncitos e o burst oxidativo
Os

neutrfilos,

tambm

chamados

de

polimorfonucleares

(PMN)

por

apresentarem ncleo segmentado, representam cerca de 50 a 70% da populao das


clulas brancas (leuccitos) do sangue. Constituem a primeira linha de defesa contra
antgenos e agentes infecciosos, particularmente em conseqncia da infeco
bacteriana e fngica, que penetram as barreiras fsicas do corpo. Durante a fase
aguda da inflamao, os neutrfilos deixam a circulao e migram para o local da
inflamao em um processo chamado de quimiotaxia (Goldsby et al., 2000).
Apresentam em seu citoplasma grnulos primrios e secundrios. Os primrios,
tambm chamados de azurfilos, so mais densos e contm enzimas digestivas,
peroxidase (principalmente mieloperoxidase), lisozima e outras enzimas hidrolticas. J
os grnulos secundrios esto em menor quantidade, contendo colagenase,
lactoferrina e lisozima (Segal, 2005). Assim, aps aderncia aos microrganismos
invasores, os neutrfilos so capazes de fagocit-los, englobando-os para o interior do
citoplasma originando o fagossomo, onde as enzimas digestivas tero ao sobre o
material fagocitado (Haptom et al., 1998).
J as clulas mononucleares (PBMC) so compostas por aproximadamente
30% de moncitos e 70% de linfcitos, e constituem a segunda maior populao de
leuccitos. Tambm participam dos processos inflamatrios, mas apenas os moncitos
so considerados fagcitos, assim como neutrfilos (Babior et al., 2002). Quando os
moncitos circulantes migram para os tecidos, so chamados de macrfagos e
apresentam alta capacidade fagoctica (Goldsby et al., 2000).
Durante o processo inflamatrio, citocinas interagem com receptores na
superfcie dos fagcitos, interferindo em sua atividade funcional e na evoluo da
resposta inflamatria. A membrana celular dos fagcitos tem receptores para alguns
anticorpos e componentes do complemento, que tambm podem se ligar aos
antgenos. Caso o antgeno contenha em sua membrana o anticorpo ou componente
do complemento apropriado, ligar-se- mais rapidamente membrana dos fagcitos,
resultando em imediata fagocitose. Assim, anticorpo e complemento funcionam como
26

opsoninas, molculas que se ligam tanto ao antgeno quanto aos fagcitos,


estimulando a fagocitose. O processo pelo qual antgenos particulados so mais
susceptveis fagocitose chamado de opsonizao (Goldsby et al., 2000).
A eficincia microbicida dos fagcitos depende de dois eventos confluentes: da
gerao de espcies reativas de oxignio (ERO) produzidas durante o processo
metablico conhecido como burst oxidativo (mecanismo dependente de oxignio), e da
liberao e ao das enzimas contidas nos grnulos citoplasmticos (mecanismo no
dependente de oxignio) (Goldsby et al., 2000). O processo de burst oxidativo resulta
na ativao do sistema NADPH oxidase formado no interior dos fagcitos, que catalisa
a reduo do oxignio molecular a nion superxido (O2-), uma ERO extremamente
txica para microrganismos fagocitados.
O sistema NADPH oxidase um complexo enzimtico formado por protenas
encontradas no citoplasma (p40phox, p47phox e p60phox) e na membrana dos fagcitos
(p22phox e gp91phox). As protenas de membrana em conjunto constituem a chamada
flavohemoprotena heterodimrica conhecida por citocromo b588. Duas outras protenas
de baixo peso molecular ligadas ao nucleotdeo guanina tambm esto envolvidas
neste sistema: Rac2, localizada no citoplasma, e Rap1A, localizada na membrana
(Babior et al., 2002).
Quando o fagcito ativado, a protena C quinase responsvel pela
fosforilao do componente p47phox, resultando no acoplamento de todos os outros
componentes membrana do fagcito, tornando assim, o sistema cataliticamente ativo
(Fig. 9) (Segal, 2005). Dessa forma, h formao de nion superxido por meio da
transferncia de um eltron para o oxignio molecular pela ao da coenzima NADPH.
Por sua vez, o nion superxido convertido a perxido de hidrognio (H2O2)
por dismutao espontnea ou por ao da enzima superxido dismutase (SOD),
responsvel pela adio de um eltron e de dois prtons (H+) ao nion superxido,
formando H2O2 e oxignio molecular. A presena de H2O2 no fagossomo em altas
concentraes de fundamental importncia para a formao de HClO por ao da
MPO, conferindo um alto poder microbicida aos fagcitos (Babior, 1984).

27

Figura 9: Organizao dos componentes do sistema NADPH oxidase no interior de fagcitos


aps ativao, e formao de H2O2 a partir de nion superxido.

5.3 Peroxidases
Peroxidases so um grupo de enzimas que catalisam reaes de oxidao, via
transferncia de um eltron, de uma gama de substratos orgnicos, estando presentes
em diversas espcies animais, vegetais, fungos e bactrias (Jantschko et al., 2002).
Apresentam

uma

grande

variedade

de

isoenzimas,

exibindo

assim,

baixa

especificidade (Dunford, 1999).


So denominadas hemeprotenas por apresentarem um grupo prosttico heme
em sua estrutura, que contm um on Fe3+ ligado a quatro anis pirrlicos. Participam
de vrios processos fisiolgicos e apresentam um largo espectro de atividade, que
envolve diversas reaes como de hidroxilao (Jantschko et al., 2002) e Ndemetilao

(Guengerich

&

MacDonald,

1996),

comumente

realizadas

pela

hemogloina, mioglobina e pelas enzimas do complexo P450 encontradas em


hepatcitos. Normalmente, as peroxidases requerem H2O2 como aceptor de eltrons
(Haptom et al., 1998).

5.3.1 Mieloperoxidase
Mieloperoxidase (MPO) est presente no citoplasma de fagcitos e tem
importante papel na atividade microbicida destas clulas. Representa 5% do peso
28

seco de neutrfilos, sendo o maior constituinte dos grnulos azurfilos (Haptom et al.,
1998). Apresenta quatro cadeias polipeptdicas (estrutura tetrmera) constituda de
duas subunidades - alfa e beta (Fig. 10A). Apresenta o grupo prosttico heme m (Fig.
10B), derivado da ferriprotoporfirina IX ligado covalentemente sua poro protica
(Furtmller et al., 2006).

(Referencia: Furtmller et al., 2006)

Figura 10: (A) Estrutura tridimensional da MPO, mostrando as subunidades alfa (azul) e beta
(vermelho); (B) Estrutura qumica do grupo prosttico heme m, encontrado em MPO.

Embora MPO esteja presente em moncitos circulantes e em altas


concentraes em neutrfilos, no detectada em microglia (macrfagos especficos
do SNC) de tecido cerebral normal (Reynolds et al., 1999). Entretanto, a presena de
MPO tem sido observada em microglia de portadores de doenas neurodegenerativas
como esclerose mltipla (Nagra et al., 1997) e doena de Alzheimer (Green et al.,
2004), sugerindo que a enzima tenha um importante papel na execuo da resposta
inflamatria iniciada pela microglia (Reynolds et al., 1999).
O mecanismo de reao da MPO envolve a utilizao de H2O2 para catalisar a
oxidao de uma srie de compostos orgnicos. A princpio, MPO se encontra em sua
forma nativa ou frrica (Fe3+) que, ao reagir com H2O2 proveniente do sistema NADPH
oxidase, forma o intermedirio redox denominado composto I (Fe5+.O), que nada mais
que a prpria MPO na forma cataliticamente ativa (Furtmller et al., 2006; Hansson
et al., 2006). Por sua vez, o composto I capaz de reagir com o nion cloreto e gerar
HClO (Fig. 11), conferindo importante ao microbicida aos neutrfilos (Haptom et al.,
1998).
O composto I tambm pode reagir com diversos compostos orgnicos (RH) e
formar o composto II (Fe4+.O) e um radical R. Da mesma forma, o composto II
tambm pode reagir com outra molcula do composto orgnico ou com nion
29

superxido, e gerar R ou oxignio molecular (O2), e a enzima na sua forma nativa,


fechando um ciclo conhecido como ciclo peroxidsico clssico (Fig. 11) (Hansson et
al., 2006). Existe tambm a possibilidade da formao de um composto III (Fe2+.O2)
por uma reao reversvel da MPO na forma nativa com nion superxido. Existe uma
atividade cataltica reportada para o composto III, mas menos eficiente que os
compostos I e II (Fig. 11) (Furtmller et al., 2006; Haptom et al., 1998).
sistema NADPH oxidase
O2

O2-

SOD

MPO
(Fe3+)

H2O2

H2O

HClO

O2-

Cl

Composto I
(Fe5+.O)

O2-

Composto III
(Fe2+. O2)

RH =
composto indlico

RH

R / O2

O 2 / O 2RH / O2

intermedirio
dioxetnico

Composto II
(Fe4+. O)
produto de abertura
do anel indlico

Figura 11: Ciclo peroxidsico clssico: [MPO (Fe3+)] MPO na forma frrica ou nativa; (R )

radical indoil.

J o radical R formado pode reagir com nion superxido ou O2 e formar um


intermedirio dioxetnico (Fig. 11). Na possibilidade deste composto orgnico (RH) ser
um composto indlico, este intermedirio dioxetnico gera um produto de abertura de
anel, a exemplo do que acontece com melatonina, visto anteriormente (Fig. 1).
MPO catalisa a oxidao de diversos compostos indlicos biologicamente
importantes como o triptofano e a melatonina (Jantschko et al., 2002). Entretanto,
triptofano um bom substrato de composto I, mas reage lentamente com o composto
II (Kettle & Candaeis, 2000). Por outro lado, quando melatonina reage com o composto
I, forma-se um radical que, na presena de oxignio molecular ou nion superxido,
forma um intermedirio dioxetnico que se cliva produzindo a abertura do anel indlico
(Silva et al., 2000). Essa reao gera um produto do tipo quinurenina num estado
eletronicamente
30

excitado

denominado

de

N-acetil-N-formil-5-metoxiquinuramina

(AFMK), composto que mostrou diversas atividades biolgicas especialmente


imunomodulatrias (Silva et al., 2005). Para este substrato, o ciclo peroxidsico
mantido custa da reao do nion superxido com o composto II e conseqente
regenerao de MPO na forma frrica (Ximenes et al., 2005).

5.3.2 Peroxidase de rbano


Peroxidase de rbano (HRP), comumente conhecida como horseradish
peroxidase, esta presente em raiz de rbano da espcie Amoracia rusticana, e tem
como papel a produo de hormnio de crescimento de plantas, o cido indolactico.
uma glicoprotena que contm o grupamento prosttico ferriprotoporfirina IX (heme
b) (Fig. 12) ligado no covalentemente poro protica da enzima (Babior, 1984).

Figura 12: Estrutura qumica do grupo prosttico heme b encontrado em HRP.

Analogamente MPO, HRP tambm atua sobre seus substratos por meio do
ciclo peroxidsico clssico (Fig. 13) (Jantschko et al., 2002). O primeiro passo envolve
a oxidao da enzima na forma nativa ou frrica (Fe3+) por H2O2 ou de um
hidroperxido orgnico, resultando na formao do composto I, um instvel
intermedirio redox que representa HRP na forma cataliticamente ativa. Aqui tambm
existe a possibilidade da formao de um composto III (Fe2+.O2) por uma reao
reversvel da HRP na forma nativa com nion superxido (Furtmller et al., 2006;
Haptom et al., 1998).
A HRP catalisa a oxidao de diversos compostos indlicos biologicamente
importantes a produtos anlogos de quinureninas (Ximenes et al., 2001 b). Essa
reao ocorre com a formao do radical indoil (R) que pode reagir com nion
superxido ou O2 e formar um intermedirio dioxetnico (Fig. 13). Na possibilidade
31

deste composto orgnico (RH) ser um composto indlico, este intermedirio


dioxetnico gera um produto de abertura de anel, a exemplo do que acontece com
triptofano, visto anteriormente (Fig. 1).
H2O2

HRP
(Fe3+)
O2-

R / O2

H2O

HClO

Cl -

Composto I
(Fe5+.O)

O2-

Composto III
(Fe2+. O2)

RH

RH =
composto indlico

O 2 / O2 RH / O2

intermedirio
dioxetnico

Composto II
(Fe4+. O)
produto de abertura
do anel indlico

Figura 13: Ciclo peroxidsico clssico: [HRP (Fe3+)] HRP na forma frrica ou nativa; (R )

radical indoil.

Nosso grupo de pesquisa mostrou tambm que a oxidao de uma srie de


derivados indlicos catalisada por HRP altamente quimiluminescente, quando
comparada ao luminol (Ximenes et al., 2001 a), isto , durante a reao, h formao
de produtos eletronicamente excitados capazes de emitir luz. Sendo assim, este tipo
de reao de oxidao pode ser analisado pela tcnica de quimiluminescncia.
5.4 Cromatografia lquida de alta eficincia (HPLC)
A tcnica de cromatografia um mtodo fsico-qumico de separao no qual os
componentes a serem separados so distribudos em duas fases: uma fase
estacionria, que pode ser um lquido, um slido ou at mesmo um gel, e uma fase
mvel que pode ser um lquido, um gs ou um fluido supercrtico. A fase mvel percola
pela fase estacionria em uma direo definida (Weston & Brown, 1997).
Cromatografia lquida (LC) uma tcnica analtica usada para separar uma
mistura em soluo em seus componentes individuais onde a fase mvel um lquido.
J o termo cromatografia lquida de alta eficincia (HPLC) usado para descrever LC
32

onde a fase mvel um lquido que passa sob alta presso no interior da fase
estacionria para assegurar um fluxo constante e assim, garantir uma separao mais
eficiente (Ardrey, 2003).
O sistema cromatogrfico consiste de cinco componentes principais: injetor,
bombas, fase mvel, fase estacionria e detector. Embora o sistema seja padronizado,
existe uma considervel diversidade de modos cromatogrficos utilizados para
promover a separao de compostos com melhor eficincia. Os modos esto
relacionados polaridade dos analitos em relao a ambas as fases. Dentre os
diferentes modos esto a cromatografia de fase normal e a de fase reversa (Weston &
Brown, 1997).
A identificao dos analitos a serem separados baseada na comparao de
suas propriedades de reteno com materiais de referncia (padres) determinados
sob condies experimentais idnticas. As caractersticas de reteno de um analito,
especificamente do tempo de reteno, so determinadas pela sua interao relativa
entre a fase estacionria e a fase mvel (Weston & Brown, 1997).
A fase estacionria, geralmente de slica, est empacotada em uma coluna
capaz de resistir s altas presses necessrias. Com relao fase mvel, sua
escolha depender do modo cromatogrfico e da fase estacionria que sero
utilizados. Uma separao que envolve uma composio constante da fase mvel
denominada eluio isocrtica, enquanto que naquela onde a composio da fase
mvel constantemente modificada denominada de eluio gradiente (Weston &
Brown, 1997).
O detector responsvel por converter uma mudana no efluente da coluna em
um sinal eltrico, que gravado em um sistema de dados. Deve apresentar
versatilidade, alta sensibilidade e alta linearidade resposta. Existem diferentes tipos
de detectores, dentre estes o detector de absorbncia e o de fluorescncia (Weston &
Brown, 1997).

5.4.1 Detectores de absorbncia


Os detectores de absorbncia respondem somente a compostos que absorvem
radiao no comprimento de onda gerado pela fonte de luz (Weston & Brown, 1997).
Detectores que medem absorbncia apenas na regio entre 190 e 350 nm so
33

chamados de detectores de absorbncia ultravioleta (UV), enquanto que aqueles que


medem na regio entre 350 e 700 nm so chamados de detectores visveis (Vis).
Entretanto existem aqueles capazes de medir entre as regies 190 e 700 nm, sendo
denominados de detectores UV/Vis (Kaplan et al., 2002). J os detectores de arranjo
de diodos (DAD) so detectores UV/Vis capazes de monitorar mais de um
comprimento de onda durante uma nica anlise. Todos estes utilizam uma lmpada
de deutrio como fonte de luz UV, e uma lmpada de tungstnio como fonte de luz
visvel (Weston & Brown, 1997).
A grande maioria dos compostos absorve radiao na regio UV graas a
caractersticas eletrnicas especficas que so capazes de absorver a radiao.
Geralmente so compostos que apresentam uma ou mais duplas ligaes, assim
como compostos com eltrons no pareados. O nome dado ao grupo responsvel pela
absorbncia eletrnica cromforo e, os compostos que apresentam esses grupos
so chamados de cromofricos (Weston & Brown, 1997).
A funo do detector monitorar a luz que passa pelo eluente. Assim, a
diferena entre a intensidade de luz do eluente puro (branco) e do eluente contendo o
composto de interesse (amostra) resulta em um sinal eltrico que mandado do
detector para o sistema de dados. A concentrao do soluto e a intensidade de luz
transmitida atravs da cubeta esto relacionadas de acordo com a lei de Lambert-Beer
(Weston & Brown, 1997).
Tal lei diz que a concentrao de um analito diretamente proporcional
quantidade de radiao absorvida, ou indiretamente proporcional ao logaritmo da
radiao transmitida. Para tanto, a absorbncia tambm diretamente proporcional
distncia percorrida pela radiao atravs da cubeta. Desta forma, segue a seguinte
relao matemtica: A = x c x l, onde A a absorbncia; o coeficiente de
extino molar; c a concentrao do analito de interesse; e l a distncia percorrida
pela luz em centmetros. O coeficiente de extino molar uma constante relacionada
natureza qumica do soluto e sua unidade recproca s unidades de c e l. Esta
equao consiste a base da anlise quantitativa da espectrofotometria de absoro
(Kaplan et al., 2002).

34

5.4.2 Detectores de fluorescncia


Fluorescncia um tipo especfico de luminescncia onde compostos que
apresentam tal caracterstica so capazes de absorver radiao na forma de luz em
determinado comprimento de onda (excitao) e instantaneamente, reemitem esta
radiao em um comprimento de onda maior (emisso) (Weston & Brown, 1997).
A caracterstica de fluorescncia esperada em compostos aromticos ou em
compostos que contenham mltiplas duplas ligaes conjugadas com alto grau de
estabilidade de ressonncia. Grupos doadores de eltrons presentes no anel, tais
como -NH2, -OH, -F, -OCH3 e -N(CH3)2, tendem a intensificar a fluorescncia. Devido
ao fato de a deteco por fluorescncia ser uma tcnica ptica, est, comumente
deteco por absorbncia, sujeita lei de Lambert-Beer (Weston & Brown, 1997).
A fase mvel apresenta um papel importante na fluorescncia, pois se no for
escolhida com cautela, pode eliminar a caracterstica fluorescente do composto a ser
analisado. A maioria dos solventes que no contm halognios, usados em HPLC,
pode ser usada. A polaridade do solvente e o pH da fase mvel tambm podem
influenciar no processo de fluorescncia, caso alterem a carga do cromforo (Weston
& Brown, 1997).
5.5 Espectrometria de massas
Espectrometria de massas (MS) uma tcnica analtica usada para identificar e
quantificar compostos atravs da relao massa/carga (m/z) de seus ons. Uma das
vantagens desta tcnica que, alm de fornecer o peso molecular do analito, pode
promover tambm informaes estruturais da molcula investigada. Esta tcnica
apresenta altssima sensibilidade podendo fornecer dados qualitativos a partir de
quantidades muito baixas (10-9 g) do analito, bem como dados quantitativos com alta
preciso e exatido (Ardrey, 2003).
Os componentes bsicos de um espectrmetro de massas incluem um sistema
de alto vcuo, fonte de ionizao, analisador de massas, detector e sistema de
controle de dados. O alto vcuo possibilita uma transmisso mais eficiente dos ons
pelo sistema, pois caso funcionasse presso atmosfrica, o caminho que os ons
deveriam percorrer seria muito maior, possibilitando choques com o ar e assim,
35

desviando sua trajetria. Alm disso, poderiam ocorrer possveis fragmentaes no


desejveis dos ons ao longo do percurso (Weston & Brown, 1997).
A fonte de ionizao por electrospray (ESI) um dos mtodos de ionizao que
atua de forma branda capaz de gerar trs tipos de ons por trs processos
essencialmente distintos, que ocorrem no interior do capilar. Podem ocorrer reaes
do tipo redox (oxidao/reduo), que produzem ons moleculares (M+ ou M-);
reaes cido/base (protonao/desprotonao), que resultam na formao de
molculas protonadas ([M+H]+) ou desprotonadas ([M-H]-); e, coordenao com
ctions (geralmente os da famlia 1A) ou nions (principalmente cloretos), que leva
formao de molculas cationizadas ([M+Na]+ ou [M+K]+) ou anionizadas ([M+Cl]entre outras) (Crotti et al., 2006).
Em relao aos processos eletroqumicos envolvidos, a fonte de ESI pode ser
considerada como uma clula eletroltica corrente controlada. O potencial eltrico
aplicado no capilar metlico (em kV) promove a migrao de cargas para a interface
capilar/soluo, formando uma dupla camada eltrica. Este processo resulta na
formao de gotas com superfcies carregadas. A evaporao do solvente, devido
ao do gs nebulizador e secante (N2), diminui o tamanho destas gotas e,
conseqentemente, aumenta a repulso eletrosttica entre as cargas em suas
superfcies. A tenso superficial das gotas vai se tornando cada vez menor at ocorrer
o fenmeno de exploso coulmbica das mesmas, que resulta na formao de gotas
menores, com posterior liberao dos ons. Forma-se, assim, um spray de partculas
carregadas, ou seja, uma corrente eletroltica (Crotti et al., 2006).
O ion trap um analisador de massas de baixa resoluo e alta sensibilidade,
que tem como princpio o confinamento de todos os ons gerados pela fonte em um
tipo de armadilha composta por trs eletrodos. Uma combinao de voltagens de
corrente contnua (DC) e rdio freqncia (RF) aplicada aos eletrodos, gerando um
campo eltrico capaz de confinar os ons com determinado potencial energtico no
centro do analisador (Bramer, 1997).
O espectro de massas adquirido pela variao gradual e contnua das
voltagens DC e RF, com o intuito de desestabilizar os ons. medida que os ons so
desestabilizados, so ejetados do analisador e atingem o detector. Aps todos os ons
terem sido expulsos do analisador, um novo conjunto de ons admitido para seu
interior, para que um novo espectro de massas seja adquirido (Bramer, 1997).
36

Os espectrmetros de massas de baixa resoluo permitem diferenciar


compostos cujas massas diferem em pelo menos uma unidade de massa (um Dalton),
sendo incapazes de diferenciar compostos isbaros, ou seja, de mesma massa. J os
de alta resoluo permitem diferenciar compostos cujas massas apresentam
diferenas muito pequenas, permitindo a determinao da composio atmica da
substncia. A capacidade de alta resoluo de um espectrmetro de massas confere
confiabilidade ao resultado onde a composio atmica a ser determinada seja
importante (Ardrey, 2003).
5.6 Cromatografia lquida de alta eficincia acoplada espectrometria de massas
(LC/MS)
Em diversas anlises, o(s) componente(s) de interesse so encontrados como
parte de uma mistura complexa, e a funo da tcnica cromatogrfica separar os
componentes da mistura para permitir sua identificao ou determinar sua quantidade.
De uma perspectiva qualitativa, a principal limitao da cromatografia no isolamento de
compostos sua incapacidade de promover uma identificao inequvoca dos
componentes de uma mistura, mesmo que sejam completamente separados uns dos
outros (Ardrey, 2003).
O poder da espectrometria de massas est no fato de os espectros de massas
de diversos compostos serem suficientemente especficos para permitir sua
identificao com alto grau de confiabilidade, se no com completa certeza.
Entretanto, se um analito de interesse faz parte de uma mistura, o espectro de massas
obtido conter ons de todos os compostos presentes e, caso o analito de interesse
seja o componente minoritrio da mistura, a identificao com qualquer grau de
certeza tornar-se- muito mais difcil, quando no impossvel (Ardrey, 2003).
A combinao da capacidade de separao da cromatografia, que permite a
introduo de compostos isolados no espectrmetro de massas, com a capacidade de
identificao da espectrometria de massas claramente vantajosa. Embora muitos
compostos apresentem caractersticas de reteno similares ou algumas vezes
idnticas, exibem espectros de massas completamente diferentes, podendo assim ser
diferenciados. Alm disso, a especificidade da espectrometria de massas permite a
quantificao do analito, o que apenas com a cromatografia no seria possvel. Dessa
37

maneira, a combinao de HPLC com a espectrometria de massas exibe precisa


identificao e quantificao de compostos que no so inteiramente resolvidos
cromatograficamente (Ardrey, 2003).
5.7 Quimiluminescncia
Reao de quimiluminescncia qualquer reao qumica na qual um dos
produtos da reao luz. Este processo promove a formao de estados
eletronicamente excitados de tomos ou molculas que, quando retornam ao estado
fundamental, emitem radiao na forma de luz (Kaplan et al., 2002). Para que a reao
ocorra, o estado eletronicamente excitado deve ser capaz de perder energia na forma
de um fton ou de transferir a energia para uma molcula capaz de emitir luz (Hasting
& Wilson, 1976).
um mtodo analtico quantitativo bastante seletivo e sensvel, onde a
sensibilidade limitada somente habilidade do fotodetector em contar os ftons
produzidos durante a reao (Weston & Brown, 1997). A grande maioria das reaes
quimiluminescentes, e todas as reaes bioluminescentes, so direta ou indiretamente
oxidaes que envolvem oxignio ou alguns de seus derivados, como H2O2, nion
superxido ou radical hidroxila (OH) (Hasting & Wilson, 1976).

38

6. OBJETIVOS
Os objetivos deste trabalho so: verificar a possibilidade de os alucingenos
indlicos LSD e DMT, serem substratos de peroxidases (HRP e MPO) e, assim,
investigar rotas alternativas de sua metabolizao. Para tal, seguem as principais
etapas:
1-

Obter DMT a partir do ch de Santo Daime (ayahuasca) e/ou a partir de sua


sntese;

2-

Verificar a ocorrncia da reao de LSD e de DMT com o sistema HRP/H2O2,


bem como com MPO presente em neutrfilos humanos ativados;

3-

Otimizar e padronizar as condies de reao e de anlise;

4-

Identificar e caracterizar os produtos formados.

39

40

7. MATERIAL E MTODOS
7.1 Material

7.1.1 Reagentes
Solues padro de LSD (1 mg/mL), O-H-LSD (100 g/mL) e bufotenina (1
mg/mL) em acetonitrila foram obtidas da Radian International (Austin, TX, USA). HRP
tipo VI, dextran, Histopaque-1077, 5-amino-2,3-diidro-1,4-ftalazinediona (luminol),
SOD, catalase, difeniliodnio (DPI), indol e triptamina foram provenientes da SigmaAldrich. D-glicose-anidra, KH2PO4, Na2HPO4 x 12 H2O, NaCl, H2O2 29% foram obtidos
da Synth, e azida sdica, KCl, CaCl2, MgCl2, acetato de amnio, formiato de amnio,
amonaco 25%, metanol e acetonitrila grau HPLC, KOH, NaOH, cido triflor actico
(TFA), cido frmico e n-hexano foram obtidos da Merck. O ch de Santo Daime
(ayahuasca) foi proveniente de uma seita do Santo Daime em Sorocaba, SP.

7.1.2 Equipamentos
Balanas analtica e semi-analtica Shimadzu, banho seco (Thermomixer
Compact) Eppendorf, banho-maria Fanem (modelo 100), centrfugas Eppendorf
(modelo 5804 R refrigerada e MiniSpin), pr-coluna e colunas de cromatografia de fase
reversa Luna C18(2), Synergi Polar-RP e Fusion-RP (250 x 4.60 mm, 5 m)
Phenomenex, espectrofotmetro UV/Vis UV-1601-C Shimadzu, filtro Milli-Q Synthesis
Millipore, HPLC (SLC-10A VP) com detectores DAD (SPD-M 10A VP) e fluorescncia
(RF 10A XL) Shimadzu, LC/MS (HPLC SIL-20AC Prominence Shimadzu e
espectrmetro de massas Esquire-HCT Bruker com ionizao por electrospray e
analisador do tipo ion trap), luminmetro LB 96V MicroLumat Plus (EG&G Berthold
Microplate), mesa agitadora para tubos Tecnal (TE-143), Micro TOF LC Bruker,
microscpio ptico (modelo 81186) Nikon, pH-metro Quimis (modelo SC09),
rotaevaporador Tecnal.

41

7.1.3 Leuccitos e urina


Neutrfilos e PBMC foram isolados de sangue humano de voluntrios sadios do
laboratrio de Bioqumica Clnica da Faculdade de Cincias Farmacuticas da USP. A
amostra de urina foi proveniente da Clnica Vila Serena de So Paulo, especializada
em dependentes qumicos. O estudo foi aprovado pelo Comit de tica e Pesquisa da
Faculdade de Cincias Farmacuticas da USP, com permisso para as coletas sob
protocolo nmero 356, em anexo.

7.2 Mtodos

7.2.1 Preparo de solues


Foram preparadas solues estoque de acetato de forbol miristato (PMA - 100
g/mL) e DPI (2 mM) por solubilizao em dimetilsulfxido (DMSO). As solues de
SOD (1 mg/mL) e catalase (1 mg/mL) foram preparadas em soluo salina 0,9%. As
solues estoque de luminol (1 mM) e azida sdica foram obtidas por solubilizao em
gua deionizada. Foram preparadas solues estoque de 5 mM de H2O2 29% e 10 M
de HRP tipo VI, ambas preparadas com gua deionizada e protegida da luz. Tampo
acetato (10 mM) foi preparado com acetato de amnio e gua ultra pura (quando
necessrio, era ajustado o pH a 8 com amonaco 25%). Tampo fosfato salino (PBS)
10 mM e PBS 10 mM glicosado (adio de d-glicose-anidra, CaCl2 e MgCl2) foram
preparados com gua ultra pura em pH 7.4 (preparados apenas no momento do uso).
A opsonizao do zimosan foi realizada misturando-se 3,0 mL de uma mistura de soro
humano fresco com 1,0 mL de zimosan (10 mg/mL). A mistura foi incubada por 1 hora
sob agitao bem lenta a 37 C. Aps este procedimento, centrifugou-se a mistura a
1800 g por 10 minutos a 4 C. O sobrenadante foi desprezado e o sedimento foi
lavado trs vezes com tampo PBS. Aps a ltima lavagem, o sedimento foi
ressuspendido em 1,0 mL de tampo PBS e as partculas foram contadas em cmera
de Neubauer. Soluo estoque de zimosan (10 mg/mL) foi preparada uma por
dissoluo em tampo PBS. Aps sonicao e centrifugao, a soluo foi estocada a
-20 C.

42

7.2.2 Isolamento de leuccitos


Neutrfilos (PMN) foram obtidos a partir de sangue perifrico de doadores
voluntrios e isolados segundo o mtodo de Boyum (1968). Foram coletados 10 mL de
sangue em heparina (10 UI/mL de sangue), e adicionou-se 25 mL de tampo PBS.
Aps leve homogeneizao, transferiu-se cuidadosamente o material sobre 10 mL de
Histopaque-1077, e o material foi centrifugado a 2300 g (25 C) por 20 minutos. O
sobrenadante composto por plasma e Histopaque foi descartado e a camada rica em
clulas mononucleares foi reservada. Ao pellet foram adicionados 20 mL de soluo
de dextran 4%. O tubo foi mantido em banho de gelo por 30 minutos a 45 para
sedimentao dos eritrcitos. O sobrenadante rico em PMN foi recuperado e lavado
com tampo PBS. Aps outra centrifugao a 2300 g (25 C) por 5 minutos, o
sobrenadante foi descartado e o sedimento foi submetido a tratamento hipotnico com
10 mL de gua destilada gelada para promover a lise dos eritrcitos contaminantes. A
soluo foi agitada por 1 minuto e restabeleceu-se a isotonicidade das clulas com a
adio de 5 mL de soluo NaCl 2,7% gelada. Mais uma vez, a soluo foi lavada com
tampo PBS e, pela ltima vez, centrifugou-se a 2300 g (25 C) por 5 minutos,
descartando-se o sobrenadante. As clulas isoladas foram ressuspendidas em 1 mL
de tampo PBS gilcosado e contadas em cmara de Neubauer. Com relao s
clulas mononucleares (PBMC), a camada reservada foi lavada com tampo PBS e
centrifugada por trs vezes a 1500 g, 1300 g e 1200 g, respectivamente, a 25 C por
10 minutos. O sobrenadante final foi descartado e as clulas isoladas foram
ressuspendidas em 1 mL de tampo PBS gilcosado. A contagem foi feita em cmara
de Neubauer.
7.2.3 Reao de LSD com HRP e H2O2
Em tampo PBS, 0,15 mM de LSD foram adicionados a 1 M de HRP e 0,5 mM
de H2O2 com volume final de 300 L. A reao foi incubada por uma hora em banho
seco (37 C) sob agitao (850 rpm) constante e protegida da luz. Alquotas da reao
foram retiradas nos tempos zero, 5, 10, 15, 30, 45 e 60 minutos e o mesmo volume de
acetonitrila gelada foi adicionado para interromper a reao e precipitar protenas,

43

seguido de banho de gelo por 10 minutos. As alquotas foram centrifugadas a 9600 g


por 5 minutos e os sobrenadantes injetados em HPLC.
7.2.4 Reao de LSD com neutrfilos ativados
Pelo fato de o padro comercial de LSD estar em acetonitrila, foi necessrio
evaporar o solvente sob N2 temperatura ambiente para evitar a morte celular. Aps
secagem total do solvente, LSD foi ressuspendido em mesmo volume de gua ultra
pura, mantendo sua concentrao inicial. Neutrfilos foram isolados de sangue
humano perifrico total e 2,0 x 106 clulas foram ativadas com 50 ng/mL de PMA. Em
tampo PBS glicosado, foram adicionados s clulas ativadas, 0,15 mM de LSD com
volume final de 300 L. A reao foi incubada por uma hora em banho seco (37 C)
sob agitao branda (350 rpm) e constante, protegida da luz. Alquotas da reao
foram retiradas nos tempos zero, 5, 10, 15, 30, 45 e 60 minutos e o mesmo volume de
acetonitrila gelada foi adicionado para interromper a reao e precipitar as protenas,
seguido de banho de gelo por 10 minutos. As alquotas foram centrifugadas a 9600 g
por 5 minutos e os sobrenadantes injetados em HPLC.
7.2.5 Deteco dos produtos da reao de LSD por HPLC com detectores DAD e
fluorescncia, e por LC/MS
Os sobrenadantes das reaes de LSD com o sistema HRP/H2O2 e com
neutrfilos ativados por PMA, e seus respectivos controles foram injetados
primeiramente em HPLC com detectores DAD e fluorescncia. Os produtos da reao
foram separados pela coluna Synergi Fusion-RP, no modo isocrtico (acetato de
amnio 0,01M pH 8/ acetonitrila 60:40) em fluxo de 1,0 mL/min. As anlises foram
monitoradas por DAD ( = 254 nm e 310 nm) e por fluorescncia (exc = 330 nm e em
= 420 nm). Paralelamente, foram feitas anlises por LC/MS do tipo ion trap, equipado
com uma fonte de ionizao por electrospray. As condies de anlise em LC foram as
mesmas descritas previamente, onde do fluxo de 1,0 mL/min, apenas 0,2 mL/min
foram destinados ao espectrmetro de massas. A fonte de electrospray foi operada no
modo positivo (ESI+) com a voltagem do capilar ajustada para - 3500 V. Nitrognio
ultra-puro foi utilizado como gs nebulizador (35 psi) e secante (5,0 L/min a 300 C).
44

7.2.6 Reao de LSD com de neutrfilos ativados e adio de inibidores de ERO


Para este experimento foram utilizados SOD (10 g/ensaio), catalase (10
g/ensaio), azida sdica (1 mM) e DPI (20 M) como inibidores de ERO. Neutrfilos
foram isolados de sangue humano perifrico total e 2,0 x 106 clulas em tampo PBS
glicosado foram utilizadas para cada inibidor, separadamente. Em seguida, foram
adicionados 50 ng/mL de PMA previamente preparado e 0,15 mM de LSD, nesta
ordem. O volume final de cada tubo foi de 300 L e as reaes foram incubadas em
banho seco (37 C) sob agitao branda (350 rpm) e constante, protegidas da luz. Foi
feito tambm um controle positivo. Aps 15 minutos, uma alquota de cada reao foi
retirada e o mesmo volume de acetonitrila gelada foi adicionado para interromper a
reao e precipitar as protenas, seguido de banho de gelo por 10 minutos. As
alquotas foram centrifugadas a 9600 g por 5 minutos e os sobrenadantes injetados em
LC/MS sob as mesmas condies previamente descritas.
7.2.7 Anlise de urina de usurio de LSD
Uma amostra de urina de usurio de LSD proveniente da Clnica Vila Serena foi
analisada segundo o mtodo de Canezin et al. (2001), com algumas modificaes,
como descrito abaixo:

amostra

branco

eficincia da

recuperao

extrao
10 mL de urina
+
5 mL de tampo
+
6 mL de ter

extrao

evaporao

10 mL de urina
+
5 mL de tampo
+
6 mL de ter

extrao

evaporao

10 mL de urina
+
5 mL de tampo
+
150 L de reao
+
6 mL de ter

extrao

evaporao

10 mL de urina
+
5 mL de tampo
+
6 mL de ter

extrao
+
150 L de reao

evaporao

45

Foi utilizado tampo acetato de amnio (1 M; pH 9), ajustado com amonaco


25%. A reao adicionada recuperao foi feita com 0,15 mM de LSD, 1 M de HRP
e 0,5 mM de H2O2, com volume final de 600 L. A reao procedeu-se por 20 minutos
em banho seco (37C) sob agitao constante (850 rpm). As anlises foram feitas em
duplicatas e aps a evaporao do solvente orgnico, foram ressuspendidas em 100
L de gua e acetonitrila (1:1). Injetou-se 50 L em LC/MS sob as mesmas condies
previamente descritas.
7.2.8 Quimiluminescncia da reao de LSD com leuccitos ativados e com HRP
e H2O2
Foram utilizadas para este experimento, microplacas brancas opacas de 96
poos, com capacidade mxima para 300 L/poo. Aps o isolamento de PMN e de
PBMC, 2,0 x 106 clulas foram ora ativadas com 50 ng/mL de PMA, ora com 1,0 x 107
partculas/ensaio de zimosan opsonizado (ZO), previamente preparados. Em tampo
PBS glicosado, 0,15 mM de LSD foram adicionados s clulas ativadas. J na reao
com HRP, 1 M da enzima foi adicionada a 0,15 mM de LSD e 0,5 mM de H2O2.Todas
as reaes foram feitas em duplicata com volume final de 300 L. Sob as mesmas
condies de anlise, foram feitos os controles de ambas as reaes. Para se testar a
viabilidade de neutrfilos e PBMC ativados e de HRP, utilizou-se 10 M de luminol
como substrato em tampo PBS glicosado. O luminmetro foi programado para
mensurar a intensidade de luz por 1 hora a 37 C.
7.2.9 Reao de LSD com H2O2 29% e anlise por LC/MS
A uma soluo de H2O2 29% foi adicionado 1 mM de LSD com volume final de
100 L. A mistura permaneceu sob agitao durante 2 horas temperatura ambiente,
protegida da luz. Em seguida, 5 L da soluo foram injetados em LC/MS, onde os
produtos da reao foram separados pela coluna Synergi Fusion-RP no modo
isocrtico (acetato de amnio 0,01M pH 8/acetonitrila 60:40) em fluxo de 1,0 mL/min.
Utilizou-se um divisor de fluxo de modo a destinar 0,2 mL/min para a fonte de ESI, a
qual foi operada no modo positivo sob as mesmas condies previamente descritas.

46

7.2.10 Extrao e purificao de DMT a partir do ch de Santo Daime (ayahuasca)


A extrao de DMT a partir do ch de Santo Daime foi realizada segundo o
mtodo de Yritia et al. (2002), com algumas modificaes. A fim de se realizar uma
extrao lquido-lquido, foram adicionados ao ch, soluo saturada de NaCl, soluo
de KOH 5N e n-hexano. A mistura permaneceu sob agitao leve (60 rpm) em posio
horizontal por 20 minutos. Aps centrifugao a 1800 g por 10 minutos, a fase
orgnica foi separada e o solvente foi evaporado sob N2 temperatura ambiente. O
material foi ressuspendido em metanol, filtrado e injetado em HPLC com detector DAD.
A DMT foi separada das demais substncias tambm extradas do ch em coluna
Luna C18(2) com acetonitrila (solvente A) e tampo fosfato 0,1 M pH 7.4 (solvente B),
em fluxo de 1 mL/min no seguinte gradiente de eluio: de zero a 2 minutos 95% de
solvente B; de 2 a 15 minutos diminuio do solvente B para 80%; de 15 a 25 minutos
diminuio do solvente B para 0%. Colheu-se o pico de DMT em tempo de reteno de
8.9 minutos, em 288 nm e evaporou-se o volume da fase mvel em rotaevaporador.
Aps pesagem do produto final, fez uma soluo 0,1 mM em metanol/cido actico
(1:1), que permaneceu estocada sob refrigerao e protegida da luz.
7.2.11 Sntese de DMT a partir de indol
A sntese de DMT (Fig. 14) foi realizada seguindo-se o mtodo descrito por
Brand et al. (2005), o qual baseado na rota sinttica de Speeter e Anthony (1954).
Esta rota parte de 5,44 mmol de indol, o qual foi dissolvido em 150 mL de ter anidro e
agitado em banho de gelo por 30 minutos. Em seguida, 16,3 mmol de cloreto de oxalila
foram adicionados lentamente, mantendo-se a agitao por mais 30 minutos. O
produto formado foi filtrado e lavado trs vezes com 50 mL de ter anidro gelado e
secado sob vcuo por 3 horas temperatura ambiente. E seguida, 5 mmol deste
produto foram dissolvidos em 100 mL de THF anidro, e ento, 15 mmol de
dimetilamina foram adicionados lentamente a esta soluo, agitando-se em banho de
gelo por 4 horas. O solvente foi evaporado e o resduo cromatografado em coluna de
slica (diclorometano-metanol; 9:1). O produto purificado (1,5 mmol) foi posteriormente
dissolvido em 40 mL de THF anidro e adicionado a 100 mL de uma suspenso de
hidreto de ltio e alumnio (15 mmol) em THF, sob atmosfera inerte e em banho de
47

gelo. Esta mistura foi aquecida temperatura de refluxo por 15 horas e em seguida,
resfriada em banho de gelo. O excesso de hidreto foi destrudo adicionando-se
lentamente 5 mL de gua, seguidos de 5 mL de NaOH 20% e mais 5 mL de gua. Os
sais inorgnicos precipitados foram filtrados e lavados 3 vezes com 30 mL de THF. O
filtrado foi evaporado sob presso reduzida e o resduo oleoso resultante dissolvido em
75 mL de diclorometano, lavado 3 vezes com gua e uma vez com soluo saturada
de NaCl. fase orgnica foi adicionado MgSO4 anidro, e em seguida, esta foi filtrada e
evaporada presso reduzida para fornecer a DMT.
+
N
H

indol

O
Cl

Cl

O
cloreto de oxalila

H
N

N
O

N
H

dietilamina

LiAlH4

intermedirio

N
H
DMT

Figura 14: Reao de sntese da DMT, segundo o mtodo descrito por Brandt et al., 2005.

A purificao foi realizada por HPLC em coluna Luna C18(2) utilizando-se gua
+ 0,1% de TFA (solvente A) e acetonitrila + 0,1% de TFA (solvente B) como fase
mvel, em fluxo de 1 mL/min no seguinte gradiente de eluio: de zero a 10 minutos
20% de solvente B; de 12 a 13 minutos aumento do solvente B para 80%; e de 14 a 18
minutos diminuio do solvente B para 20%. Coletou-se o pico de DMT em tempo de
reteno de 8.19 minutos, em 288 nm e evaporou-se o volume da fase mvel em
rotaevaporador. Aps pesagem do produto final, fez uma soluo estoque de 2 mM em
metanol/gua/cido actico (80:20:0,1), que permaneceu estocada sob refrigerao e
protegida da luz.
7.2.12 Reao de DMT com HRP e H2O2
Em tampo PBS, 0,1 mM de DMT foi adicionado a 1 M de HRP e 0,5 mM de
H2O2 com volume final de 300 L. A reao foi incubada por uma hora em banho seco
(37 C) sob agitao (850 rpm) constante, protegida da luz. Sob as mesmas condies
de anlise, foram feitos os controles da reao. Alquotas da reao foram retiradas
nos tempos zero, 5, 10, 15, 30, 45 e 60 minutos e o mesmo volume de acetonitrila
gelada foi adicionado para interromper a reao e precipitar protenas, seguido de
48

banho de gelo por 10 minutos. As alquotas foram centrifugadas a 9600 g por 5


minutos e os sobrenadantes injetados em HPLC.
7.2.13 Reao de DMT com neutrfilos ativados
Foi utilizada DMT proveniente de sua sntese como padro. O solvente foi
evaporado sob N2 temperatura ambiente para evitar a morte celular. Aps secagem
total do solvente, a DMT foi ressuspendida em mesmo volume de gua ultra pura,
mantendo sua concentrao inicial. Neutrfilos foram isolados de sangue humano
perifrico total e 2,0 x 106 clulas foram ativadas com 50 ng/mL de PMA, previamente
preparado. Em tampo PBS glicosado, foram adicionados s clulas ativadas, 0,1 mM
de DMT com volume final de 300 L. A reao foi incubada por uma hora em banho
seco (37 C) sob agitao branda (350 rpm) e constante, protegida da luz. Alquotas
da reao foram retiradas nos tempos zero, 5, 10, 15, 30, 45 e 60 minutos e o mesmo
volume de acetonitrila gelada foi adicionado para interromper a reao e precipitar
protenas, seguido de banho de gelo por 10 minutos. As alquotas foram centrifugadas
a 9600 g por 5 minutos e os sobrenadantes injetados em HPLC.
7.2.14 Deteco dos produtos da reao de DMT por HPLC com detectores DAD
e fluorescncia, e por LC/MS
Os sobrenadantes das reaes de DMT com o sistema HRP/H2O2, com
neutrfilos ativados, e seus respectivos controles foram injetados primeiramente em
HPLC com detectores DAD e fluorescncia. Os produtos da reao foram separados
pela coluna Synergi Polar-RP utilizando-se acetato de amnio 10 mM com 0,01% de
cido frmico (solvente A) e acetonitrila (solvente B) como fase mvel, em fluxo de 1
mL/min no seguinte gradiente de eluio: de zero a 6 minutos 20% de solvente B; de 6
a 10 minutos aumento do solvente B para 80%; e de 10 a 14 minutos mantm o
solvente B a 80%; e de 14 a 15 minutos diminuio do solvente B para 20%. As
anlises foram monitoradas por DAD ( = 288 nm) e por fluorescncia (exc = 232 nm e
em = 351 nm). Paralelamente, foram feitas anlises por LC/MS do tipo ion trap,
equipado com uma fonte de ESI. As condies de anlise em LC foram as mesmas
descritas previamente, onde do fluxo de 1,0 mL/min, apenas 0,2 mL/min foram
49

destinados ao espectrmetro de massas. A fonte de electrospray foi operada no modo


positivo (ESI+) com a voltagem do capilar ajustada para - 3500 V. Nitrognio ultra-puro
foi utilizado como gs nebulizador (35 psi) e secante (5,0 L/min a 300 C).
7.2.15 Reao de DMT com neutrfilos ativados e adio de inibidores de ERO
Para este experimento foram utilizados SOD (10 g/ensaio), catalase (10
g/ensaio), azida sdica (1 mM) e DPI (20 M) como inibidores de ERO. Neutrfilos
foram isolados de sangue humano perifrico total e 2,0 x 106 clulas em tampo PBS
glicosado foram utilizadas para cada inibidor, separadamente. Em seguida, foram
adicionados 50 ng/mL de PMA previamente preparado e 0,1 mM de DMT, nesta
ordem. O volume final de cada tubo foi de 300 L e as reaes foram incubadas em
banho seco (37 C) sob agitao branda (350 rpm) e constante, protegidas da luz. Foi
feito tambm um controle positivo. Aps 15 minutos, uma alquota de cada reao foi
retirada e o mesmo volume de acetonitrila gelada foi adicionado para interromper a
reao e precipitar as protenas, seguido de banho de gelo por 10 minutos. As
alquotas foram centrifugadas a 9600 g por 5 minutos e os sobrenadantes injetados em
LC/MS sob as mesmas condies previamente descritas.

50

8. RESULTADOS
8.1 LSD
8.1.1 Reao de LSD com HRP e H2O2
A HRP comercial foi utilizada como um modelo de peroxidase para avaliarmos a
princpio, se a enzima reagiria com LSD. Antes de dar incio aos experimentos, foi
necessrio, primeiramente, padronizar as condies de anlise de LSD por HPLC e
LC/MS. Para isso, foram feitas diversas tentativas, variando-se a concentrao do
substrato, coluna, fase mvel e tempo de corrida, at chegar condio mais
adequada, descrita no item procedimentos.
Inicialmente, as concentraes de LSD, HRP e H2O2 se basearam no ciclo
peroxidsico clssico onde, para cada molcula de HRP utilizada, consumida uma
molcula de substrato e meia de H2O2. Entretanto, as concentraes utilizadas nos
experimentos foram 1 M de HRP, 0,5 mM de H2O2 e 0,15 mM de LSD, pois testes
prvios mostraram que a utilizao de LSD na concentrao de 1 mM foi adequada.
A Figura 15 apresenta os cromatogramas de HPLC obtidos pelos detectores
DAD e fluorescncia de alquotas do tempo zero (Painis A e B), 15 minutos (Painis
C e D) e uma hora de reao (Painis E e F). Foi possvel verificar a presena de
novos picos cromatogrficos, indicando a formao de produtos de reao. Sob as
mesmas condies, nem HRP, nem H2O2 (controles) foram capazes de reagir com
LSD isoladamente (resultados no mostrados).

51

Detector B-254 nm
0811G
0811g.dat

m AU

60

40

20

800

600
mV

Flurescncia relativa (mAU)

Absorbncia relativa (mAU)

B
LSD

LSD

80

Detector A (Ex:330nm, Em:420nm)


1411
1411lsd.dat

1000

400

200

0
-200

10

12

14

16

18

20

10

12

14

16

18

20

Minutes

Minutes

Tempo (min)

Tempo (min)

Detector B-254 nm
0711G
0711g.dat

80

Detector A (Ex:330nm, Em:420nm)


0711G
0711g.dat

1000

Fluorescncia relativa
(mAU)
mV

60

Pico 2
m AU

Absorbncia relativa (mAU)

Pico 5 = LSD

Pico 4

40

Pico 5 = LSD
Pico 1

Pico 3

20

Pico 6

800

Pico 6

600

Pico 1

400

Pico 2
Pico 3
200

10

12

14

16

18

20

Minutes

Fluorescncia
m V relativa (mAU)

Absorbnciam AU
relativa (mAU)

250

Pico 4

40

Pico 2
Pico 1

Pico 5 = LSD

20

12

14

16

18

Detector A (Ex:330nm, Em:420nm)


1311C
1311c.dat

60

10

20

Minutes

Detector B-254 nm
1311C
1311c.dat

80

Tempo (min)

Tempo (min)

Pico 3

200

Pico 6

Pico 5 = LSD
150

Pico 1
100

Pico 2
Pico 3

50

10
Minutes

Tempo (min)

12

14

16

18

20

10

12

14

16

18

20

Minutes

Tempo (min)

Figura 15: Cromatogramas (HPLC) de 25 L da reao de LSD (0,15 mM) com o sistema
HRP (1 M) e H2O2 (0,5 mM) nos tempos zero (A e B), 15 minutos (C e D) e uma hora (E e F).
Os cromatogramas da esquerda mostram deteco por DAD ( = 254 nm) e os da direita por
fluorescncia (ex = 330 nm e em = 420 nm). A reao foi incubada sob agitao constante a
37 C em tampo PBS pH 7.4. Condies de anlise: coluna Synergi Fusion-RP, fluxo 1
mL/min em tampo acetato de amnio (0,01 M; pH 8.0) / acetonitrila (60:40) no modo
isocrtico.

52

Em seguida, na tentativa de identificar os produtos formados, foi feita uma


anlise por LC/MS. A Figura 16 mostra o cromatograma reconstitudo dos principais
ons (compostos) encontrados (m/z 356, m/z 328, m/z 334, m/z 336 e m/z 310) aps
uma hora de reao, onde o on de m/z 324 correspondeu ao LSD. O cromatograma
revela a presena de dois picos cromatogrficos correspondentes a produtos com m/z
356, com tempos de reteno de 4,3 e 7,3 minutos, sugerindo a presena de
compostos isbaros, isto , distintos, porm com a mesma relao massa/carga (m/z).
Intens.
x10 5

Pico 5 = LSD
m/z 324

Pico 2

m/z 356
4

Pico 1
Pico 3
m/z 328

m/z 356

Pico 4
m/z 334

Pico 6
m/z 310

m/z 336

0
0

10

12

14

16

Time [min]

Figura 16: Cromatograma (LC/MS) reconstitudo dos ons de m/z 356, m/z 328, m/z 334, m/z
336, m/z 324 e m/z 310 (ESI+) aps 1 hora de reao. Condies de reao e analtica: as
mesmas da Figura 15.

Anlises de fragmentao destes compostos foram posteriormente realizadas.


No espectro de fragmentao do on de m/z 324 ([M+H]+) (Fig. 17), caracterstico de
LSD quando ionizado por electrospray no modo positivo (ESI+), pde-se observar a
presena de fragmentos com m/z 281, m/z 251, m/z 223 e m/z 197, que
representaram perdas neutras caractersticas deste composto, j descritas na
literatura (Borowsky et al., 2001).

53

Intens.
x10 7

+MS2(324.2), 0.3min #25


223

281

251

N
H

223
2

197

281

NH

LSD
m/z 324

197
251

208

324
192
309

293

182
0
100

150

200

250

300

350

m/z

Figura 17: Espectro de fragmentao (MS2) do on de m/z 324 (ESI+), correspondente ao


composto LSD, eludo em 13,9 minutos.

A Figura 18 ilustra o espectro de fragmentao (MS2) do primeiro composto de


m/z 356, eludo em 4,3 minutos. Pde-se verificar a presena de um fragmento de m/z
338, com 18 Da de diferena em relao ao precursor (m/z 356), sugerindo a perda
neutra de uma molcula de gua. Experimentos subseqentes (MS3) revelaram que
este mesmo on (m/z 338) sofre as perdas neutras caractersticas de LSD (dietilamina
e dietilformamida), gerando os ons de m/z 265 e m/z 237, respectivamente (dados
no mostrados).
Intens.
x10 4

+MS2(356), 4.8min #187


338

265
1.5

N
H

237
1.0

O
0.5

O-H-LSD
m/z 356

NH

100

150

265

237

OH

356

338

295

222

313

0.0
50

200

250

300

350

m/z

Figura 18: Espectro de fragmentao (MS ) do on de m/z 356 (ESI+), eludo em 4,3 minutos.

54

Comparando estes resultados com os da literatura, verificou-se que o on de


m/z 356 representou o composto 2-oxo-3-hidroxi-LSD (O-H-LSD) (Canezin et al.,
2001), o principal metablito de LSD in vivo. Por fim, sua identidade foi confirmada
com uma anlise de fragmentao do padro comercial do composto O-H-LSD (Fig.
19).
Intens.
x10 4

+MS2(356), 4.8min #187


338

265
1.5

N
H

237
1.0

O
0.5

O-H-LSD
m/z 356

NH

100

150

265

237

OH

356

338

295

222

313

0.0
50

200

250

300

350

m/z

Figura 19: Espectro de fragmentao (MS ) do padro comercial de O-H-LSD em


acetonitrila/gua (50:50) + 0,1% de cido frmico, ionizado por electrospray no modo positivo
(ESI+).

Em seguida, procedeu-se fragmentao (MS2) do segundo on de m/z 356


com tempo de reteno de 7,3 minutos (Fig. 20). Diferentemente de O-H-LSD, esse
composto apresentou uma perda neutra de 28 Da, sugerindo a eliminao de
monxido de carbono (CO), gerando o on de m/z 328.
Experimentos de MS3 revelaram que o on de m/z 328 tambm sofreu perdas
neutras de dietilamina e dietilformamida, gerando os ons de m/z 227 e m/z 255,
respectivamente (Fig. 21). Esses resultados sugerem fortemente que o composto
eludo em 7,3 minutos seja um produto de abertura do anel indlico da molcula de
LSD, o qual denominamos como N,N-dietil-7-formamido-4-metil-6-oxo-2,3,4,4a,5,6hexahidrobenzo[f]quinolina-2-carboxamida (FOMBK), bem como o on de m/z 328
como

N,N-dietil-7-amino-4-metil-6-oxo-2,3,4,4a,5,6-hexahidrobenzo[f]quinolina-2-

carboxamida (AOMBK), que representou sua forma deformilada.

55

Intens.
x10 5

+MS2(356), 10.3min #407


328

1.25

N
255

1.00

N
H

227
0.75

356

0.50

FOMBK
m/z 356

0.25

NH

227

328

313
255

201

212

0.00
50

100

150

200

250

300

350

m/z

Figura 20: Espectro de fragmentao (MS2) do on de m/z 356 (TR = 5,9 minutos) (ESI+).
Intens.
x10 4

+MS3(356->328), 10.3min #670


227

255
O
6

N
H

227

AOMBK
m/z 328

NH 2

255
201
196

328
210

0
50

100

150

200

250

300

350

m/z

Figura 21: Espectro de fragmentao (MS3) do on de m/z 356>328 (ESI+).

A presena de um pico cromatogrfico correspondente a um on de m/z 328


tambm foi investigada. Anlises de MS2 revelaram que sua fragmentao foi idntica
fragmentao de AOMBK (dados no mostrados). Dessa forma, sugere-se que este
pico seja decorrente da deformilao espontnea de FOMBK no meio analtico ou no
prprio meio de reao.
Com relao ao on de m/z 310, experimentos de fragmentao (MS2) (Fig. 22)
mostraram as mesmas perdas neutras caractersticas de LSD e de O-H-LSD. A
comparao destes resultados com dados da literatura revelou que o composto em
questo era o N-demetil-LSD (nor-LSD), o segundo principal metablito do LSD in vivo
(Canezin et al., 2001).

56

Intens.
x10 5

+MS2(310.0), 10.4min #408


208.9

2.0

183

237
1.5

NH

209

236.9

1.0

0.5

183.0

NH

nor-LSD
m/z 310

280.9

192.0

128.1

310.0

292.9

0.0
50

100

150

200

250

300

350

m/z

Figura 22: Espectro de fragmentao (MS2) do on de m/z 310 (ESI+).

Em colaborao com o Prof. Dr. Luiz Henrique Catalani do Instituto de Qumica


da USP, fizemos a anlise dos compostos FOMBK e AOMBK, em um espectrmetro
de massas de alta resoluo (Micro TOF). O composto FOMBK foi isolado por HPLC
(Fig. 15 C) e fez-se uma infuso direta no espectrmetro de massas.
Intens.
x10 4

+MS, 0.4-0.7min #(13-24)

356.1973
2.0

N
N

O
1.5

O
1.0

N
H

362.9264

FOMBK
m/z 356,1969

0.5

357.2003

358.2037
0.0
346

348

350

352

354

356

358

360

362

364

366

m/z

Figura 23: Espectro de massas (Micro TOF) do composto FOMBK (ESI+), proveniente da
reao LSD/HRP/H2O2 em condies de reao iguais Figura 15.
Intens.

+MS, 0.4-0.7min #(13-24)

1500

328.2028

N
1250

1000
335.1384

750

NH 2

322.9711

AOMBK
m/z 328,2020

500
329.2006

332.3156

250

334.1592

336.1530
340.2000

336.9891

0
322

324

326

328

330

332

334

336

338

340

m/z

Figura 24: Espectro de massas (Micro TOF) do composto AOMBK (ESI+), proveniente da
reao LSD/HRP/H2O2 em condies de reao iguais Figura 15.

57

Os espectros de massas provenientes desta anlise (Fig. 23 e 24) mostram a


presena de ons de m/z 356,1973 e m/z 328,2028, correspondentes a FOMBK e
AOMBK, respectivamente. Para que a identificao estrutural fosse confirmada, foi
necessrio calcular o erro (ppm) do equipamento mediante a seguinte frmula:
valor encontrado valor de referncia
________________________________ X 106
valor de referncia

O valor de referncia para o composto FOMBK 356,1969 [(M+H)+], e para


AOMBK 328,2020 [(M+H)+]. Aps os clculos dos erros, valores abaixo de 2 ppm
foram obtidos para ambos os compostos, confirmando a composio molecular das
estruturas propostas.
O espectro de absoro do composto FOMBK foi determinado (355 nm), como
mostrado na Figura 25 em comparao aos compostos O-H-LSD (254 nm) e LSD (310

Absorbncia (mAU)

nm), os quais j apresentavam absorbncias conhecidas (Clarks, 2003).

Comprimento de onda (nm)

Figura 25: Espectros UV/Vis dos compostos O-H-LSD (TR: 4,59 min), FOMBK (TR: 7,40 min)
e LSD (TR: 14,23 min), provenientes da reao de LSD (0,15 mM) com o sistema HRP (1 M)
e H2O2 (0,5 mM), analisados por HPLC com detector DAD. As condies de anlises so as
mesmas da Figura 15.

58

Os grficos da Figura 26 representam as cinticas do consumo de LSD pelo


sistema HRP/H2O2 e a de formao dos principais produtos, durante uma hora de
reao. possvel notar que aps 15 minutos de reao a formao do produto
FOMBK comea a decair, medida que a formao do produto AOMBK comea a
aumentar. Isto mostra que AOMBK seja formado pela deformilao de FOMBK.
7

6x10

rea

4x10

2x10

LSD

10

20

30

40

50

60

Tempo (min)

rea

2x10

rea

3x10

1x10

4x10

3x10

2x10

1x10

AOMBK

FOMBK

0
10

20

30

40

50

10

60

20

Tempo (min)

40

50

60

1x10

nor-LSD

rea

2x10

2x10

1x10

rea

3x10

30

Tempo (min)

O-H-LSD

0
10

20

30

40

Tempo (min)

50

60

10

20

30

40

50

60

Tempo (min)

Figura 26: Cinticas do consumo de LSD decorrente da reao com sistema HRP (1 M) e
H2O2 (0,5 mM), e da formao de seus principais metablitos (FOMBK, AOMBK, nor-LSD e OH-LSD). A anlise foi feita por LC/MS, e as condies de reao e analticas so as mesmas
da Figura 15.

59

Outro parmetro estudado foi o efeito da concentrao de H2O2 no sistema


LSD/HRP/H2O2. Duas reaes idnticas foram processadas, mudando-se apenas as
concentraes de H2O2 (0,1 mM e 0,5 mM). A Figura 27 apresenta cromatogramas de
HPLC obtidos por detector DAD de alquotas do tempo zero (Painis A e B) e aps 15
minutos de reao (Painis C e D). possvel verificar a presena de novos picos
cromatogrficos, indicando a formao de produtos de reao. Sob as mesmas
condies, HRP ou H2O2 (controles) no foram capazes de reagir com LSD
(resultados no mostrados).
[H2O2] = 0,1 mM
Detector B-254 nm
0811G
0811g.dat

[H2O2] = 0,5 mM
A

LSD

Detector B-254 nm
14110
1411a.dat

100

LSD

40

20

80

60
m AU

Absorbncia relativa (mAU)

60

m AU

Absorbncia relativa (mAU)

80

40

20

10

12

14

16

18

20

10

Pico 2
Pico 4
Pico 1

18

20

Pico 6

Pico 3

60

Pico 2
m AU

Pico 5
LSD

60

20

16

Detector B-254 nm
1311B
1311b.dat

80

Absorbncia relativa (mAU)

Absorbncia relativa
(mAU)
m AU

40

14

Tempo (min)

Detector B-254 nm
0811H
0811h.dat

80

12

Minutes

Minutes

Tempo (min)

Pico 4

40

Pico 5
LSD

Pico 1

20

Pico 3

Pico 6

10

12

Minutes

Tempo (min)

14

16

18

20

10

12

14

16

18

20

Minutes

Tempo (min)

Figura 27: Cromatogramas (HPLC) de 25 L da reao LSD/HRP/H2O2 nos tempos zero (A e


B) e aps 15 minutos de reao (C e D). A coluna da esquerda representa H2O2 0,1 mM e a da
direita H2O2 0,5 mM. As condies de reao e de anlise so as mesmas da Figura 15.

60

O efeito do pH na reao de LSD com o sistema HRP/H2O2 tambm foi


estudado. Os valores de pH testados foram: pH 5,0, 7,4 e 8,0. Embora o consumo de
LSD durante a reao tenha ocorrido em todos os pHs analisados (Fig. 28), a enzima
HRP apresentou melhor eficincia em pH 7.4 (Fig. 29).
8

8x10

rea

6x10

pH 5,0
pH 8,0

4x10

2x10

pH 7,4
0

10

20

30

40

50

60

Tempo (min)

Figura 28: Efeito do pH sobre o consumo de LSD durante a reao com HRP/H2O2. Tampo
PBS utilizado em diferentes pHs: 5.0, 7.4 e 8.0.As condies de reao e de anlise so as
mesmas da Figura 15.

2x10

3x10

FOMBK

rea

2x10

0
pH 5,0

pH 7,4

pH 8,0

2,0x10

1,5x10

1,0x10

5,0x10

O-H-LSD

2,1x10

1,8x10

2x10

1x10

nor-LSD

rea

rea

3x10

0,0
pH 5,0

pH 7,4

pH 8,0

pH 5,0

pH 7,4

pH 8,0

Figura 29: Efeito do pH sobre a formao dos produtos FOMBK, O-H-LSD e nor-LSD gerados
durante a reao de LSD/HRP/H2O2. Tampo PBS utilizado em diferentes pHs: 5,0, 7,4 e 8,0.
As condies de reao e de anlise so as mesmas da Figura 15.

61

8.1.2 Reao de LSD com neutrfilos ativados


Analogamente reao de LSD com o sistema HRP/H2O2, foi avaliado se MPO
proveniente de neutrfilos ativados com PMA tambm seria capaz promover a
formao dos mesmos produtos, em uma reao semelhante. A Figura 30 apresenta
os cromatogramas de HPLC obtidos pelos detectores DAD e fluorescncia de
alquotas do tempo zero (Painis A e B) e aps 45 minutos (Painis C e D) de reao
de LSD com neutrfilos ativados. Foi possvel verificar a presena de novos picos
cromatogrficos, indicando a formao de produtos de reao. Sob as mesmas
condies, neutrfilos inertes ou PMA (controles) no foram capazes de reagir com
LSD (resultados no mostrados).
Detector B-254 nm
1112G
1112g.dat

30

LSD

20

10

Detector A (Ex:330nm, Em:420nm)


1112G
1112g.dat

1000

800

600

400

200

10

12

14

Minutes

12

14

Tempo (min)

Detector B-254 nm
1112I
1112i.dat

m AU

30

Pico 3 = LSD

20

Pico 2

10

Detector A (Ex:330nm, Em:420nm)


1112H
1112h.dat

1000
V
Fluorescnciam relativa
(mAU)

40

Pico 1

10

Minutes

Tempo (min)

Absorbncia relativa (mAU)

LSD
Fluorescncia relativa
(mAU)
mV

40

m AU

Absorbncia relativa (mAU)

50

Pico 3 = LSD

800

600

400

Pico 2
Pico 1
200

0
0

8
Minutes

Tempo (min)

10

12

14

10

12

14

Minutes

Tempo (min)

Figura 30: Cromatogramas (HPLC) de 25 L da reao de LSD (0,15 mM) com neutrfilos
(2,0 x 106 clulas/ensaio) ativados por PMA (50 ng/ensaio) nos tempos zero (A e B) e 45
minutos (C e D). Os cromatogramas da esquerda mostram deteco por DAD ( = 254 nm) e
os da direita por fluorescncia (ex = 330 nm e em = 420 nm). A reao foi incubada sob
agitao constante a 37 C em tampo PBS pH 7.4. Condies de anlise: coluna Luna
C18(2), fluxo de 1 mL/min em tampo acetato de amnio 0,01 M pH 8 / acetonitrila (60:40) no
modo isocrtico.

62

Em seguida, na tentativa de identificar os produtos formados, o meio de reao


foi analisado por LC/MS. A Figura 31 mostra o cromatograma reconstitudo dos
principais ons (compostos) encontrados aps uma hora de reao (m/z 356, m/z 336,
m/z 334, m/z 310 e m/z 328). O on de m/z 324, correspondente ao LSD intacto,
estava presente em grande quantidade e no ser mostrado para evitar disparidade
nas escalas.
O

cromatograma

revela

presena

de

dois

picos

cromatogrficos

correspondentes a produtos com m/z 356, com tempos de reteno de 3,2 e 5,9
minutos, sugerindo a presena de compostos isbaros, isto , distintos, porm com a
mesma relao m/z. Novamente foram feitas fragmentaes (MS2) de todos os ons
encontrados (resultados no mostrados), comprovando-se que se tratavam dos
mesmos compostos formados pelo sistema LSD/HRP/H2O2, sendo estes: FOMBK,
AOMBK, O-H-LSD e nor-LSD.
Intens.
x104

m/z 336

Pico 2

m/z 356

Pico 1

m/z 310
3

m/z 356

m/z 328

m/z 334

0
0

10

Time [min]

Figura 31: Cromatograma (LC/MS) reconstitudo dos ons de m/z 356, m/z 336, m/z 334, m/z
310 e m/z 328 (ESI+) aps 1 hora de reao. As condies de reao e analticas so as
mesmas descritas na Figura 15.

63

Os grficos da Figura 32 apresentam as cinticas do consumo de LSD por


neutrfilos ativados por PMA e a de formao dos principais produtos, durante uma
hora de reao. De uma maneira semelhante reao de LSD com o sistema
HRP/H2O2, possvel notar que aps 15 minutos de reao a formao do produto
FOMBK comea a decair medida que a formao do produto AOMBK comea a
aumentar. Isto, mais uma vez, mostra que AOMBK seja formado pela deformilao de
1,2x10

8,0x10

LSD

rea

FOMBK.

4,0x10

0,0
10

20

30

40

50

60

Tempo (min)

6x10

4x10

3x10

2x10

1x10

4x10

rea

rea

AOMBK

2x10

FOMBK

0
10

20

30

40

50

60

10

20

Tempo (min)

1,2x10

8,0x10

nor-LSD

40

50

60

1,2x10

O-H-LSD

8,0x10

4,0x10

rea

rea
4,0x10

30

Tempo (min)

0,0
10

20

30

40

50

60

Tempo (min)

0,0
10

20

30

40

50

60

Tempo (min)

Figura 31: Cinticas do consumo de LSD e a de formao de seus principais metablitos


(FOMBK, AOMBK, nor-LSD e O-H-LSD) decorrentes de sua metabolizao promovida por
neutrfilos (2,0 x 106 clulas/ensaio) ativados com PMA (50 ng/ensaio). As condies de
reao e analticas so as mesmas da Figura 30.

64

Outro parmetro estudado foi a avaliao do efeito de inibidores de ERO na


formao dos compostos FOMBK, O-H-LSD e nor-LSD, pela reao de LSD com
neutrfilos ativados por PMA (Fig. 33). Nota-se que as enzimas catalase e SOD, bem
como azida sdica e DPI, inibem consideravelmente a formao dos compostos
FOMBK e O-H-LSD. Por outro lado, no tm efeito, ou ento tm um efeito mais
modesto sobre a inibio da formao de nor-LSD. A catalase atua sobre o H2O2
formando gua e oxignio e a azida sdica um inibidor clssico de MPO. J a SOD
responsvel por transformar o nion superxido em H2O2, e o DPI por inibir o sistema
NADPH oxidase.
7

1,2x10

FOMBK 6x10

O-H-LSD

nor-LSD

1x10
6

2x10

8x10

rea

4x10

rea

rea

9,0x10

6,0x10

5x10

3,0x10

3x10

0,0
controle + catalase

+ azida

+ SOD

+ DPI

0
controle

+ catalase

+ azida

+ SOD

+ DPI

controle + catalase

+ azida

+ SOD

+ DPI

Figura 33: Formao de FOMBK, O-H-LSD e nor-LSD pela reao de LSD (0,15 mM) com
neutrfilos (2,0 x 106 clulas/ensaio) ativados por PMA (50 ng/ensaio) e adio de catalase (10
g/ensaio), azida sdica (1 mM), SOD (10 g/ensaio) e DPI (20 M/ensaio). Dados
provenientes de anlise por LC/MS. Condies de anlises: as mesmas da Figura 29.

65

8.1.3 Quimiluminescncia da reao de LSD com neutrfilos e PBMC ativados, e


com o sistema HRP/H2O2
Foi analisada a quimiluminescncia da reao de LSD com neutrfilos e
moncitos, bem como com o sistema HRP/H2O2. Primeiramente, foi testada a
capacidade de MPO proveniente de neutrfilos (Fig. 35 A) e PBMC (Fig. 35 B)
ativados com PMA e zimosan opsonizado, em oxidar luminol.
B
5x10

4x10

3x10

2,5x10

2,0x10

1,5x10

2x10

1,0x10
5,0x10

1x10

PMN + PMA
PMN + ZO

10

20

30

40

50

Tempo (min)

RLU/s

RLU/s

PBMC + PMA
PBMC + ZO

10

20

30

40

50

Tempo (min)

Figura 35: Cintica de emisso de luz da reao de luminol (1mM) com (A) neutrfilos (1,0 x
106 clulas/ensaio) e (B) PBMC (1,0 x 106 clulas/ensaio) estimulados com PMA (16
ng/ensaio) e zimosan opsonizados (1,0 x 107 partculas/ensaio), separadamente, incubados
em tampo PBS glicosado pH 7.4 a 37C.

Aps verificar a viabilidade da enzima MPO proveniente dos leuccitos


ativados, foi estudada a cintica de emisso de luz da reao de LSD com neutrfilos
estimulados com PMA (Fig. 36 A) e com zimosan opsonizado (Fig. 36 B),
separadamente.

66

A
LSD + PMN + PMA
LSD + PMN
LSD + PMA

35
30

LSD + PMN + ZO
LSD + PMN
LSD + ZO

25

20

25

RLU/s

RLU/s

20

15

15
10

10
0

10

20

30

40

50

10

Tempo (min)

20

30

40

50

Tempo (min)

Figura 36: Cintica de emisso de luz da reao de LSD (0,15 mM) com neutrfilos (1,0 x 106
clulas/ensaio) estimulados com (A) PMA (16 ng/ensaio) e (B) com zimosan opsonizado (1,0 x
107 partculas/ensaio), incubados em tampo PBS glicosado pH 7.4 a 37 C.

Igualmente, foi estudada a cintica de emisso de luz da reao de LSD com


PBMC estimulados com PMA (Fig. 37 A) e zimosan opsonizado (Fig. 37 B),
separadamente.
LSD + PBMC + PMA
LSD + PBMC
LSD + PMA

25

LSD + PBMC + ZO
LSD + PBMC
LSD + ZO

20

RLU/s

RLU/s

20

15

15

10

10
0

10

20

30

Tempo (min)

40

50

10

20

30

40

50

Tempo (min)

Figura 37: Cintica de emisso de luz da reao de LSD (0,15 mM) com PBMC (1,0 x 106
clulas/ensaio) estimulados com (A) PMA (16 ng/ensaio) e (B) com zimosan opsonizado (1,0 x
107 partculas/ensaio), incubados em tampo PBS glicosado pH 7.4 a 37 C.

67

Sob as mesmas condies de anlise foi estudada a cintica de emisso de luz


da reao de LSD com o sistema HRP/H2O2 (Fig. 38).
LSD + HRP + H2O2
LSD + HRP
LSD + H2O2
HRP + H2O2

600
400
RLU/s

200
16
12
8
0

10

20

30

40

50

Tempo (min)

Figura 38: Cintica de emisso de luz da reao de LSD (0,15 mM) com o sistema HRP (1
M) e H2O2 (0,5 mM), incubados em tampo PBS pH 7.4 a 37 C.

Foi avaliado o efeito de inibidores de ERO na quimiluminescncia da reao de


LSD com neutrfilos ativados por PMA (Fig. 39). Observamos que a cintica de
emisso de luz foi marcadamente diminuda pela adio dos inibidores azida, SOD e
DPI, mas, no entanto, no consideravelmente afetada pela adio de catalase.
60

60

controle

controle
45

+ catalase
30

RLU/s

RLU/s

45

30
+ azida
15

15
0

10

15

20

25

10

15

20

60

60
controle

controle
45

45
RLU/s

RLU/s

25

Tempo (min)

Tempo (min)

30
+ SOD

15

30

15
+ DPI

10

15

20

25

Tempo (min)

10

15

20

25

Tempo (min)

Figura 39: Cintica da emisso de luz da reao de LSD (0,15 mM) com neutrfilos (1,0 x 106
clulas/ensaio) ativados com PMA (16 ng/mL) na presena de catalase (10 g/ensaio), azida
sdica (1 mM), SOD (10 g/ensaio) e DPI (20 M). Condies de reao: tampo PBS
glicosado pH 7,4, 37 C e volume final de 300 L.

68

8.1.4 Anlise de urina de usurio de LSD


Com o intuito de avaliarmos a presena do composto FOMBK na urina de um
usurio de LSD, uma amostra proveniente da clnica de dependentes qumicos Vila
Serena foi analisada por LC/MS. A amostra foi colhida pelo usurio 22 horas aps a
ingesto de um blotter de LSD.
Os resultados obtidos revelaram a presena dos compostos O-H-LSD e norLSD, os principais metablitos descritos, bem como o prprio LSD em sua forma
inalterada. Entretanto, como pode ser visto na Figura 34 (B), no foi possvel detectar
a presena do composto FOMBK na amostra analisada.

Intens.
x105
8

LSD

FOMBK

O-H-LSD

A
nor-LSD

6
4
2
0
0

Intens.
x104

10

12

14

16

18

LSD

O-H-LSD

Time [min]

nor-LSD
4
2
0
0

10

12

14

16

18

Time [min]

Figura 34: Cromatogramas (LC/MS) reconstitudos dos ons correspondentes aos compostos
(A) O-H-LSD, FOMBK, LSD e nor-LSD (ESI+) de urina (branco) adicionada de 150 L de uma
alquota de 15 minutos da reao de LSD (0,15 mM) com o sistema HRP (1 M) e H2O2 (0,5
mM) aps; (B) O-H-LSD, LSD e nor-LSD (ESI+) de urina de usurio de LSD.

69

8.1.5 Reao de LSD com H2O2 29%


Da mesma forma que nosso gupo de pesquisa sintetizou AFMK a partir da
reao de melatonina e H2O2 29% (Ximenes et al., 2005), foi verificado se o mesmo
ocorreria com o padro comercial de LSD com o intuito de produzir FOMBK. Aps 2
horas de reao, os produtos da reao foram analisados por LC/MS. A Figura 40
mostra o cromatograma reconstitudo dos principais ons (compostos) encontrados
aps duas horas de reao (m/z 356, m/z 374 e m/z 340). O on de m/z 324,
correspondente ao LSD intacto, estava presente em grande quantidade e no ser
mostrado para evitar disparidade nas escalas.
Anlises de fragmentao destes compostos foram posteriormente realizadas
(resultados no mostrados). Conclumos mediante estes resultados que o on de m/z
356 correspondeu ao composto FOMBK, embora a reao no tenha sido muito
eficiente. J os ons de m/z 340 e m/z 374 representam sucessivas inseres de
grupamentos hidroxila (-OH) na molcula de LSD.
Intens.
x10 6

m/z 374

m/z 340

m/z 356
1

0
0

10

12

14

16

Time [min]

Figura 40: Cromatograma (LC/MS) reconstitudo dos ons de m/z 356, m/z 374 e m/z 340
(ESI+) aps 2 horas de reao. LSD (3 mM) e H2O2 29% foram incubados sob agitao
constante. As condies de anlise so as mesmas descritas na Figura 15.

70

8.2 DMT

8.2.1 Extrao de DMT a partir da ayahuasca (ch de Santo Daime)

Primeiramente, a DMT foi extrada da ayahuasca segundo o mtodo de Yritia et


al. (2002), o qual descreve sua extrao em plasma humano. Na tentativa de
reproduzir esta metodologia, o plasma foi substitudo por ayahuasca e as condies de
anlise foram adaptadas aos materiais e equipamentos que possumos em nosso
laboratrio (todas as reaes foram realizadas no Laboratrio de Anlise Toxicolgica
em colaborao com o Prof. Dr. Maurcio Yonamine do Departamento de Anlises
Clnicas e Toxicolgicas da Faculdade de Cincias Farmacuticas da USP).
A DMT foi separada dos outros alcalides e flavonides encontrados na bebida
por HPLC com detector DAD (Fig. 41 A). Aps a padronizao da metodologia,
colheu-se o pico de DMT no tempo de reteno de 8,9 minutos. O espectro de
absoro UV/Vis) da DMT (Clarks, 2003) est mostrado na Figura 41 B. Entretanto,
esta extrao requer muito tempo, consumo de solventes, e, alm disso, fornece uma
quantidade relativamente baixa de DMT. Desta forma, optamos por tentar realizar sua
sntese.
700

288 nm
0803dmt
0803dmt

DMT

B
Absorbncia (mAU)

500

400
mAU

Absorbncia relativa (mAU)

600

300

200

100

0.0

2.5

5.0

7.5

10.0

12.5

15.0

17.5

20.0

22.5

25.0

27.5

30.0

Comprimento de onda (nm)

Minutes

Tempo (min)

Figura 41: (A) Cromatograma (HPLC) de 200 L de material obtido pela extrao da
ayahuasca. Condies da extrao: solvente n-hexano, N2 como gs secante, ressuspenso
em metanol. Condies analticas: coluna Luna C18(2), fluxo de 1 mL/min em tampo acetato
fosfato 0,1 M pH 7.4 / acetonitrila em gradiente de eluio, detector DAD ( = 288 nm); (B)
Espectro de absoro UV/Vis ( = 288 nm) de DMT isolado por HPLC (TR= 8,9 minutos).

71

8.2.2 Obteno de DMT a partir de sua sntese


As tentativas iniciais para a sntese de DMT basearam-se em variaes do
mtodo clssico de Eschweiler-Clark para metilao de aminas (Kapnang et al., 1977;
Guimanini et al., 1976; Sondengam et al., 1973; Pine & Sanchez, 1971; Borch & Hassi,
1972). Partindo-se de triptamina, tentou-se a dimetilao atravs da reao com
formaldedo e diferentes agentes redutores. Aps diversos testes e em funo dos
baixos rendimentos obtidos, optou-se pela rota sinttica de Speeter e Anthony (1954),
utilizando-se indol como material de partida. Todas as reaes foram realizadas no
Laboratrio de Sntese de Molculas Bioativas em colaborao com o Prof. Dr. Hlio
Alexandre Stefani do Departamento de Farmcia da Faculdade de Cincias
Farmacuticas da USP. Aps a reao de sntese, a DMT foi isolada por HPLC (Fig.
42) de acordo com a metodologia padronizada e descrita no item procedimentos.
Detector B-288 nm
0103E
0103e

800

DMT

600

m AU

Absorbncia relativa (mAU)

1000

400

200

0
0

10

12

14

16

18

Minutes

Tempo (min)

Figura 42: Cromatograma (HPLC) de 20 L de material obtido pela sntese de DMT a partir de
indol. Condies analticas: coluna Luna C 18(2), fluxo de 1 ml/min em acetonitrila + 0,1% de
TFA / gua + 0,1% de TFA (50:50), em gradiente de eluio, = 288 nm.

Em seguida, na tentativa de confirmar o produto isolado, o material


ressuspendido foi analisado por MS (Fig. 43). Pde-se verificar a presena de um
fragmento de m/z 144, com 45 Da de diferena em relao ao precursor (m/z 189),
sugerindo a perda de uma molcula de dimetilamina (C2H7N). Tambm foi observado
um fragmento de m/z 58, caracterstico da molcula de DMT [40].

72

Intens.
x10 6

+MS2(189.0), 1.2-1.3min #(47-50)

144

58.6
2.5

144.0

2.0

58

1.5

N
H
1.0

DMT
m/z 189

189.0
0.5

0.0
60

80

100

120

140

160

180

200

220

240

m/z

Figura 43: Espectro de fragmentao (MS2) do on de m/z 189 (ESI+). Pico isolado por HPLC
de DMT em acetonitrila / gua (50:50).

8.2.3 Reao de DMT com HRP e H2O2


A HRP comercial foi utilizada como um modelo de peroxidase para avaliarmos a
princpio, se a enzima reagiria com DMT. Antes de dar incio aos experimentos, foi
necessrio primeiramente padronizar as condies de anlise de DMT por HPLC e
LC/MS. Para isso, foram feitas diversas tentativas, variando-se a concentrao do
substrato, coluna, fase mvel e tempo de corrida, at chegar condio mais
adequada, descrita no item procedimentos. Para este experimento foi utilizada DMT
proveniente da sntese do indol, previamente isolada e purificada.
Inicialmente, as concentraes de DMT, HRP e H2O2 se basearam no ciclo
peroxidsico clssico onde, para cada molcula de HRP utilizada, consumida uma
molcula de substrato e meia de H2O2. Entretanto, as reais concentraes utilizadas
nos experimentos foram 1 M de HRP, 0,5 mM de H2O2 e 0,1 mM de DMT, pois testes
prvios mostraram que a utilizao de DMT na concentrao de 1 mM foi inadequada.
A Figura 44 apresenta os cromatogramas de HPLC obtidos pelos detectores
DAD e fluorescncia de alquotas do tempo zero (Painis A e B) e 15 minutos (Painis
C e D). Foi possvel verificar a presena de novos picos cromatogrficos, indicando a
formao de produtos de reao. Sob as mesmas condies, nem HRP, nem H2O2
(controles) foram capazes de reagir com DMT isoladamente (resultados no
mostrados).

73

DMT

Absorbncia relativa (mAU)

Fluorescncia relativa (mAU)

DMT

Tempo (min)

Tempo (min)

Pico 2

Pico 1

Pico 3 = DMT
Fluorescncia relativa (mAU)

Absorbncia relativa (mAU)

Pico 3 = DMT

Tempo (min)

Pico 1

Tempo (min)

Figura 44: Cromatogramas (HPLC) de 25 L da reao DMT (0,1 mM) com o sistema HRP (1
M) e H2O2 (0,5 mM) nos tempos zero (A e B) e 15 minutos (C e D). Os cromatogramas da
esquerda mostram deteco por DAD ( = 288 nm) e os da direita por fluorescncia (ex = 232
nm e em = 351 nm). A reao foi incubada sob agitao constante a 37 C em tampo PBS
pH 7.4. Condies de anlise: coluna Polar-RP, fluxo de 1 mL/min em tampo acetato de
amnio 0,01 M / acetonitrila, em gradiente de eluio.

74

Em seguida, na tentativa de identificar os produtos formados, foi feita uma


anlise por LC/MS. A Figura 45 mostra o cromatograma reconstitudo dos principais
ons (compostos) encontrados (m/z 205, m/z 221 e m/z 193) aps uma hora de reao,
onde o on de m/z 189 correspondeu DMT.
Intens.
x106

Pico 1
m/z 205

2.5
2.0

Pico 3 = DMT
m/z 189

Pico 2
m/z 221

1.5
1.0

m/z 193

0.5
0.0
0

10

12

14

Time [min]

Figura 45: Cromatograma (LC/MS) reconstitudo dos ons encontrados no tempo 1 hora da
reao de DMT com HRP/H2O2 mostrando os ons segundo a seqncia de eluio.
Condies de reao e analticas so as mesmas da Figura 44.

Anlises de fragmentao destes compostos foram posteriormente realizadas. A


Figura 46 ilustra o espectro de fragmentao (MS2) do on de m/z 205, eludo em 7,5
minutos. Pode-se verificar a presena de um fragmento de m/z 160, com 45 Da de
diferena em relao ao precursor (m/z 205), sugerindo a perda de uma molcula de
dimetilamina (C2H7N).
Foi observado tambm um segundo fragmento de m/z 132 onde a diferena de
28 Da em relao ao on de m/z 160 sugere a perda neutra seqencial de uma
molcula de etileno (C2H4). Este resultado foi confirmado atravs de experimentos de
MS3, onde o on de m/z 160 quando submetido fragmentao gerou o on de m/z 132
(dados no mostrados).

Intens.
x10 4

+MS2(205.0), 5.1min #131


160.1

HO

5
4

N
H

3
2

132

OH-DMT
m/z 205

1
205.1

132.2

160

0
50

75

100

125

150

175

200

225

250

275

300

m/z

Figura 46: Espectro de fragmentao (MS2) do on de m/z 205 (ESI+).

75

Comparando esses resultados com os da literatura, verificou-se que o on de


m/z 205 apresentou o mesmo perfil de fragmentao dos alucingenos j conhecidos
bufotenina (5-OH-DMT) (Fig. 47 A e B) e psilocina (4-OH-DMT) [40]. Entretanto, por
esta tcnica, no foi possvel determinar o real posicionamento do grupo hidroxila no
anel aromtico do on de m/z 205, sendo nomeado por hora como OH-DMT.
Intens.
x106

+MS2(205), 0.8min #34

58

160

OH

3
205

N
H

160

bufotenina
m/z 205

58
0
50

75

100

125

150

175

200

225

250

275

m/z

Figura 47 A: Espectro de fragmentao (MS2) do padro comercial de bufotenina (5-OH-DMT)


em acetonitrila/gua (50:50) + 0,1% de cido frmico, ionizado por electrospray no modo
positivo (ESI+).
Intens.
x104

+MS3(205->160), 1.8min #69


132

OH

2.5

2.0

N
H

1.5
1.0
115

0.5

bufotenina
m/z 205

160

142

132

0.0
50

75

100

125

150

175

200

225

250

275

m/z

Figura 47 B: Espectro de fragmentao (MS3) do padro comercial de bufotenina (5-OH-DMT)


em acetonitrila/gua (50:50) + 0,1% de cido frmico, ionizado por electrospray no modo
positivo (ESI+).

Em seguida, procedeu-se fragmentao (MS2) do on de m/z 221 com tempo


de reteno de 10,0 minutos (Fig. 48). Igualmente OH-DMT, esse composto sofreu
perdas neutras de dimetilamina (C2H7N) e dimetiletilamina (C4H11N), gerando os ons
de m/z 176 e m/z 148, respectivamente. Alm disso, apresentou uma perda neutra de
28 Da, sugerindo a eliminao de monxido de carbono (CO), gerando o on de m/z
193. Esses resultados sugerem fortemente que este o composto seja um produto de
abertura do anel indlico da molcula de DMT, o qual denominamos como N,N-dimetilN-formil-quinuramina (DMFK).
76

Intens.
x104
2.5

+MS2(221.0), 7.9min #636

203.8

2.0

176

1.5

58.4

176

1.0

220.8

0.5
72.3

88.1

129.8

147.7

NH

DMFK
m/z 221

175.7

148

193

0.0
50

100

150

200

250

300

m/z

Figura 48: Espectro de fragmentao (MS2) do on de m/z 221 (ESI+).

Por fim, a fragmentao (MS2) do on de m/z 193, tambm encontrado no meio


de reao, gerou as mesmas perdas neutras encontradas nos compostos DMT, OHDMT e DMFK. Esses resultados sugerem que este composto seja a forma deformilada
do composto DMFK, denominado N,N-dimetil-quinuramina (DMK).
Intens.
x10 4

+MS2(193.0), 6.7min #361


176.1

1.0

0.8

148

0.6
148.1

0.4

NH2

176

0.2

DMK
m/z 193

193.0
0.0
50

75

100

125

150

175

200

225

250

275

300

m/z

Figura 49: Espectro de fragmentao (MS2) do on de m/z 193 (ESI+).

Novamente, em colaborao com o Prof. Dr. Luiz Henrique Catalani do Instituto


de Qumica da USP, fizemos a anlise dos compostos OH-DMT (m/z 205) e DMFK
(m/z 221), no espectrmetro de massas de alta resoluo (Micro TOF). Os compostos
foram isolados por HPLC (Fig. 44 C) e fez-se uma infuso direta isoladamente no
espectrmetro de massas.

77

Intens.
x104

+MS, 0.2-0.4min #(7-11)

1.25

HO

205.1332

1.00

OH-DMT
m/z 205,1335

N
H

0.75
0.50
0.25

198.9566

201.1018

0.00
195

200

205

210

215

220

m/z

Figura 50: Espectro de massas (Micro TOF) do composto OH-DMT (ESI+), proveniente da
reao DMT/HRP/H2O2 em condies de reao iguais Figura 44.
Intens.

+MS, 0.6-0.6min #(18-19)

1000

221.1280

800

O
NH

600
219.0188
400

DMFK
m/z 221,1285

222.1255

200
0
210

215

220

225

230

m/z

Figura 51: Espectro de massas (Micro TOF) do composto DMFK (ESI+), proveniente da
reao DMT/HRP/H2O2 em condies de reao iguais Figura 44.

Os espectros de massas provenientes das anlises (Fig. 50 e 51) mostram a


presena de ons de m/z 205,1332 e m/z 221,1280, correspondentes a OH-DMT e
DMFK, respectivamente. Para que a identificao estrutural fosse confirmada, foi
necessrio calcular o erro (ppm) do equipamento mediante a seguinte frmula:
valor encontrado valor de referncia
________________________________ X 106
valor de referncia

O valor de referncia para o OH-DMT 205,1335 [(M+H)+], e 221,1285 [(M+H)+]


para DMFK. Aps os clculos dos erros, valores abaixo de 2 ppm foram obtidos para
ambos os compostos, confirmando a composio molecular das estruturas propostas.

78

Uma ltima etapa foi a tentativa de anlise do composto OH-DMT por


ressonncia magntica nuclear (RMN), uma vez que por MS no foi possvel
determinar a real posio do grupamento hidroxila em seu anel aromtico. Mas devido
a quantidades insuficientes do composto, estes resultados no foram conclusivos,
sendo necessrios mais estudos para confirmar sua identidade.
Os grficos da Figura 52 apresentam as cinticas do consumo de DMT pelo
sistema HRP/H2O2 e a de formao dos principais produtos, durante uma hora de
reao. possvel notar que aps 45 minutos de reao a formao do produto DMFK
comea a decair, medida que a formao do produto DMK comea a aumentar. Isto
mostra que DMK formado pela deformilao de DMFK.
8

6x10

4x10

OH-DMT

3x10
8

rea

rea

4x10

2x10

2x10

DMT

1x10

10

20

30

40

50

60

10

20

Tempo (min)

30

40

50

60

Tempo (min)

DMK

3x10

rea

DMFK

1,5x10

1,0x10

5,0x10

rea

2x10

2,0x10

1x10

0,0

10

20

30

40

Tempo (min)

50

60

10

20

30

40

50

60

Tempo (min)

Figura 52: Cinticas do consumo de DMT decorrente da reao com sistema HRP (1 M) e
H2O2 (0,5 mM), e a de formao de seus principais metablitos (OH-DMT, DMFK, DMK). A
anlise foi feita por LC/MS, e as condies de reao e analticas so as mesmas da Figura
44.

79

8.2.4 Reao de DMT com neutrfilos ativados


Analogamente reao de DMT com o sistema HRP/H2O2, foi avaliado se MPO
proveniente de neutrfilos ativados com PMA tambm seria capaz promover a
formao dos mesmos produtos, em uma reao semelhante. Para este experimento
foi utilizada DMT proveniente da sntese do indol, previamente isolada e purificada.
Embora tenha sido feita a anlise desta reao por HPLC com detectores DAD
e fluorescncia, est mostrado aqui somente o cromatograma reconstitudo dos
principais ons (compostos) encontrados em anlise por LC/MS. Isto porque no foi
possvel observar a formao dos produtos da reao por DAD e fluorescncia, devido
ao baixo rendimento da reao.
De qualquer forma, foi possvel verificar por LC/MS (Fig. 53) a formao de
produtos (m/z 205, m/z 221 e m/z 193) aps uma hora de reao. Sob as mesmas
condies, neutrfilos inertes ou PMA (controles) no foram capazes de reagir com
DMT isoladamente (resultados no mostrados). O on de m/z 189, correspondente
DMT intacta, estava presente em grande quantidade e no ser mostrado para evitar
disparidade nas escalas.
Intens.
x106

Pico 1
m/z 205

Pico 2
m/z 221

Pico 3
m/z 193

0
2

10

12

Time [min]

Figura 53: Cromatograma (LC/MS) reconstitudo dos ons de m/z 205, m/z 221 e m/z 193
(ESI+) aps 1 hora de reao. As condies de reao e analticas so as mesmas descritas
na Figura 44.

Novamente foram feitas fragmentaes (MS2) de todos os ons encontrados


(resultados no mostrados), comprovando-se que se tratavam dos mesmos compostos
formados pelo sistema DMT/HRP/H2O2, sendo estes: OH-DMT, DMFK e DMK.

80

Os grficos da Figura 54 apresentam as cinticas do consumo de DMT por


neutrfilos ativados por PMA, e a de formao dos principais produtos, durante uma
hora de reao. De uma maneira semelhante reao com o sistema HRP/H2O2,
possvel notar que aps 45 minutos de reao a formao do produto DMFK comea a
decair, medida que a formao do produto DMK comea a aumentar. Isto, mais uma

8x10

6x10

4x10

2x10

6x10

4x10

2x10

OH-DMT

rea

rea

vez, mostra que DMK seja formado pela deformilao de DMFK.

DMT

10

20

30

40

50

60

10

20

Tempo (min)

30

40

50

60

Tempo (min)
6

1,2x10

DMK

2,0x10

9,0x10

rea

rea

1,5x10

1,0x10

6,0x10

DMFK
5

3,0x10

5,0x10

0,0

0,0

10

20

30

40

Tempo (min)

50

60

10

20

30

40

50

60

Tempo (min)

Figura 54: Cinticas do consumo de DMT e de formao de seus principais metablitos (OHDMT, DMFK e DMK) decorrentes de sua metabolizao promovida por neutrfilos (2,0 x 106
clulas/ensaio) ativados com PMA (50 ng/ensaio). As condies de reao e analticas so as
mesmas da Figura 44.

81

Outro parmetro estudado foi a avaliao do efeito de inibidores de ERO na


formao dos compostos OH-DMT e DMFK, pela reao de DMT com neutrfilos
ativados por PMA (Fig. 55). Nota-se que as enzimas catalase e SOD, bem como azida
sdica e DPI, inibem consideravelmente a formao dos compostos OH-DMT e DMFK.
DMFK

3x10

2x10

2x10

1x10

1x10

rea

rea

OH-DMT
3x10

0
controle + catalase

+ SOD

+ azida

+ DPI

controle + catalase

+ SOD

+ azida

+ DPI

Figura 55: Formao de OH-DMT e DMFK pela reao de DMT (0,1 mM) com neutrfilos (2,0
x 106 clulas/ensaio) ativados por PMA (50 ng/ensaio) e adio de catalase (10 g/ensaio),
azida sdica (1 mM), SOD (10 g/ensaio) e DPI (20 M/ensaio). Dados provenientes de
anlise por LC/MS. Condies de anlises: as mesmas da Figura 44.

82

9. DISCUSSO
9.1 LSD
Tanto neutrfilos ativados com PMA, quanto o sistema HRP/H2O2, foram
capazes de metabolizar LSD via reao catalisada por MPO e HRP, respectivamente,
onde os produtos formados foram identificados por MS. Um dos produtos, proveniente
de uma reao de oxidao, foi identificado como sendo um produto de abertura do
anel indlico da molcula de LSD. Este produto no havia sido relatado anteriormente
e

foi

por

ns

nomeado

de

N,N-dietil-7-formamido-4-metil-6-oxo-2,3,4,4a,5,6-

hexahidrobenzo[f]quinolina-2-carboxamida (FOMBK) (Fig. 56). Sua forma deformilada,


tambm encontrada no meio de reao, foi denominada de N,N-dietil-7-amino-4-metil6-oxo-2,3,4,4a,5,6-hexahidrobenzo[f]quinolina-2-carboxamida

(AOMBK)

(Fig.

56).

Ambos os compostos foram analisados por um espectrmetro de massas de alta


resoluo, confirmando com alto grau de preciso a composio molecular das
estruturas propostas.

N
O

N
N

O
NH

LSD

N
H

FOMBK

O
O

NH 2

AOMBK

Figura 56: Estrutura qumica de FOMBK e AOMBK, em comparao ao LSD.

Dois outros produtos identificados da reao de metabolizao de LSD


catalisada por peroxidases, curiosamente coincidem com os produtos j descritos de
seu metabolismo in vivo, provenientes da ao das enzimas do complexo P450
encontradas em hepatcitos. Os compostos O-H-LSD e nor-LSD (Fig. 5) so
decorrentes de reaes de hidroxilao e N-demetilao, respectivamente (Canezin et.
al, 2001). Vrias hemeprotenas possuem mltiplas atividades, como por exemplo,
hemoglobina, mioglobina e citocromo P 450, que mostram atividade peroxidsica em
83

algumas condies especficas de reao (Kawano et al., 2002; Dunford, 1999;


Guengerich & MacDonald, 1996). O mesmo vale para a atividade de hidroxilao
encontrada em peroxidases (Kettle & Winterbourn, 1994). Neste estudo fica claro a
atividade de hidroxilao e N-demetilao tanto de MPO como de HRP.
Ainda decorrentes da reao de LSD com peroxidases, observamos a presena
de outros dois ons de m/z 334 e m/z 336, em anlise por MS. Embora algumas
anlises tivessem sido feitas na tentativa de identific-los, como por exemplo,
fragmentao dos ons e anlise no modo negativo (ESI-), ainda no foi possvel
chegar a concluses satisfatrias. Graas aos fragmentos gerados, conclumos
apenas que estes produtos possivelmente no foram provenientes de reao de
oxidao da molcula de LSD.
Os produtos gerados da metabolizao de LSD por MPO proveniente de
neutrfilos ativados ou ento, por HRP na presena de H2O2, so semelhantes e
guardam algumas similaridades com a oxidao de outros compostos indlicos
descrita anteriormente. Sabemos que, quando ativados com PMA ou outro estmulo,
neutrfilos geram uma grande quantidade de ERO que podem ser usadas para a
oxidao de compostos de diferentes classes catalizada por MPO (Silva et al., 2004).
Alguns destes compostos eram indlicos e, nestes casos, observou-se, em algum
grau, a formao de produtos que so caracterizados pela abertura do anel indlico
(Silva et al., 2000; Silva et al., 2004). Nesta classe de compostos esto o triptofano,
melatonina e serotonina.
A eficincia de formao do produto de abertura do anel indlico bastante
diferente para estes compostos. No caso de triptofano, a reao pouco eficiente e a
constante de reao est abaixo daquela descrita para melatonina, que ao contrrio de
triptofano bastante eficiente, com uma constante de velocidade com composto I de
aproximadamente 106 e com composto II, aproximadamente 102 (Ximenes et al.,
2005). Ambos os compostos, melatonina e triptofano, so substratos de MPO
composto I (forma originada da reao entre a enzima nativa com H2O2), mas no de
MPO composto II (Kettle & Candaeis, 2000; Allegra et al., 2001). Assim, para que a
reao prossiga h a necessidade da presena de nion superxido.
Para LSD, imaginamos que ocorra o ciclo peroxidsico (Fig. 57), similar ao que
ocorre com triptofano e melatonina. Neste caso, LSD reagiria com o composto I
formando o radical LSD que, pela reao com oxignio molecular ou nion
84

superxido, formaria um intermedirio do tipo dioxetnico que poderia gerar os


produtos O-H-LSD e FOMBK, aps diferentes clivagens (Fig. 58). Em seguida,
FOMBK sofreria deformilao e geraria AOMBK.
H 2O

H 2O 2

PEROXIDASE

Composto I
LSD

LSD / O2

LSD

LSD / O2-

Composto II

+H

O-H-LSD

O 2 / O 2-

intermedirio

- H2CO

FOMBK

dioxetnico

AOMBK

Figura 57: Mecanismo proposto da via de metabolizao de LSD por peroxidases como MPO
e HRP, envolvendo os compostos I e II do ciclo peroxidsico.
N

- 1e-

H+

LSD

+ 2 O2-

+ H+

+ 1e-

+ O2-

+ H+

N
N

LSD

NH

+2H

+ O2

N
N

OH
N

OH-LSD

H
O

OH

NH

intermedirio
dioxetnico

[O]

N
O

H
OH
O
NH

O-H-LSD

- H2CO

O
N
H

FOMBK

O
O

NH 2

AOMBK

Figura 58: Proposta de mecanismo de formao dos produtos O-H-LSD, FOMBK e AOMBK
decorrentes da metabolizao de LSD por peroxidases (MPO e HRP), mediante um
intermedirio dioxetnico.

85

De acordo com este ciclo proposto, os inibidores DPI e azida, respectivamente


do sistema NADPH oxidase e MPO, inibem intensamente a formao dos produtos
FOMBK e O-H-LSD (Fig. 33). Do mesmo modo, como esperado, a adio de
seqestradores de H2O2 e nion superxido, respectivamente catalase e SOD, afetam
a formao destes produtos.
Consideramos, em analogia com o ciclo descrito para melatonina, que LSD
tambm no deve ser um bom substrato para o composto II. O fato de a degradao
de LSD ser depende de H2O2 em concentraes superiories (0,5 mM) ao do prprio
LSD (0,15 mM) indicam, ainda que preliminarmente, o envolvimento de nion
superxido na manuteno do ciclo peroxidsico.
Existe ainda uma outra possibilidade para a formao de um produto hidroxilado
(OH-LSD), que seria atravs de um ciclo envolvendo composto III (Fig. 59) (reao da
forma nativa com nion superxido), a exemplo da hidroxilao de salicilato catalisada
por MPO (Kettle & Winterbourn, 1994). Em seguida, por meio de uma reao de
oxidao, este produto hidroxilado formaria o composto O-H-LSD. Entretanto, tambm
de forma anloga ao que foi descrito para melatonina, esta rota no deve ser
suficientemente eficiente (Ximenes et al., 2005).
O2-

PEROXIDASE

Composto III
O2-

OH-LSD + H2O

O2

[O]
O-H-LSD

Fe2+O22H+

LSD

Fe2+O2- LSD

Figura 59: Proposta da via de metabolizao de LSD por peroxidases como MPO e HRP,
envolvendo o composto III.

Inicialmente, consideramos que nor-LSD poderia ser formado via demetilao


de um produto hidroxilado como descrito para outros substratos (Guengerich &
MacDonald, 1996). Entretanto este composto parece ser formado numa reao, ou
seqncias de reaes totalmente diferentes das propostas para O-H-LSD e FOMBK.
Para nor-LSD no se observou a inibio por azida, catalase ou SOD e houve apenas
uma inibio parcial com DPI. No momento, no temos indicao de quais sejam as
86

possveis rotas de formao de nor-LSD. Apesar da ausncia de inibio pela azida, o


fato de no haver formao significativa de nor-LSD pela incubao de LSD
isoladamente com H2O2 ou ento com peroxidase, indica dependncia de espcies
reativas de oxignio e possivelmente complexos de ferro.
Embora no usamos padro-interno em nossos experimentos, foi feita uma
estimativa em porcentagem da eficincia das peroxidases em metabolizar LSD. De
0,15 mM de LSD que foram adicionados aos neutrfilos ou ao sistema HRP/H2O2, 28%
e 92% foram consumidos, respectivamente. A eficincia de formao do produto
FOMBK parece ser alta para ambas as enzimas. Nota-se que, o aumento da
quantidade do produto AOMBK foi inversamente proporcional quantidade de FOMBK
formado. Isso mostra que FOMBK origina rapidamente sua forma deformilada.
O efeito do pH em reaes catalisadas por peroxidase foi recentemente descrito
para melatonina (Ximenes et al., 2007). Neste estudo, o pH mostrou grande influncia
sobre o sistema HRP/H2O2 e parece ter afetado a distribuio na formao dos
produtos FOMBK, O-H-LSD e nor-LSD. Houve um maior rendimento de todos os
produtos em pH 7.4.
A reao de LSD com H2O2 29% mostrou baixo rendimento na formao do
composto FOMBK, entretanto, alguns compostos hidroxilados tambm foram
caracterizados por LC/MS, no sendo ainda possvel relatar as posies do grupo
hidroxila.
Nosso grupo de pesquisa descreveu recentemente que HRP e MPO catalisam a
oxidao de compostos indlicos na presena de H2O2, formando produtos de
abertura do anel indlico em uma reao que consome oxignio e emite
quimiluminescncia (Silva et al., 2001). Da mesma forma, foi analisada a
quimiluminescncia da reao de LSD com como com leuccitos ativados, bem como
com o sistema HRP/H2O2.
Observamos que a emisso de luz durante as reaes de LSD com leuccitos
ativados e com o sistema HRP/H2O2 durou alguns minutos e foi absolutamente
dependente da adio de todos os reagentes. Para ambos os estmulos testados, PMA
e zimosan opsonizado, tanto neutrfilos quanto PBMC foram bons modelos celulares
para degradar LSD, embora a quimiluminescncia dependa do nmero de clulas
presente. Observou-se tambm que neutrfilos ativados com PMA foram capazes de
gerar uma maior intensidade luz quando comparado aos outros ensaios. A
87

quimiluminescncia proveniente da reao de LSD com leuccitos ativados ou com


HRP/H2O2 deve ser originada da formao de um produto em um estado
eletronicamente excitado. O padro de inibio da quimiluminescncia pela adio de
catalase, azida, SOD e DPI foi equivalente ao padro de inibio da formao tanto de
O-H-LSD quanto de FOMBK (Fig. 33 e Fig. 39). Muito possivelmente FOMBK seja
formado

no

estado

eletronicamente

excitado

seja

responsvel

pela

quimiluminescncia.
A ao de peroxidases na formao de compostos de abertura do anel indlico
j conhecida para compostos como a melatonina e triptofano (Silva et al., 2000;
Ximenes et al., 2001 b; Allegra et al., 2001), porm indita tratando-se de LSD. Visto
que peroxidases esto presentes em diferentes tipos celulares, e que durante o
processo inflamatrio, neutrfilos so ativados por citocinas e outros fatores prinflamatrios, resultando em um aumento da produo de ERO, razovel supor que
a formao de FOMBK possa ocorrer in vivo, especialmente em condies que levem
ativao dessas clulas. Embora o composto FOMBK no foi detectado em urina de
usurio de LSD, ns sugerimos que a metabolizao de LSD por peroxidases pode
estar ativa no SNC, uma vez que neurnios e microglia so capazes de expressar
MPO.
9.2 DMT
Diferentemente de LSD, no foi possvel adquirir um padro comercial do
composto DMT. Conseguimos por meio de sua sntese, utilizando indol como material
de partida, quantidade suficiente para a realizao deste estudo, embora a extrao do
ch de Santo Daime (ayahuasca) tambm tenha sido bem sucedida.
De uma maneira semelhante reao com LSD, neutrfilos ativados com PMA
foram capazes de metabolizar DMT, via reao catalisada por MPO, bem como pelo
sistema HRP/H2O2, onde os produtos formados foram caracterizados e identificados
por MS. Um dos produtos, decorrente de uma reao de oxidao, foi identificado
como sendo um produto de abertura do anel indlico da molcula de DMT, sendo
nomeado como N,N-dimetil-N-formilquinuramina (DMFK) (Fig. 60). Sua forma
deformilada nomeada de N,N-dimetil-quinuramina (DMK)

(Fig. 60), tambm foi

encontrada no meio de reao. O composto DMFK foi analisado por um espectrmetro


88

de massas de alta resoluo, confirmando com alto grau de preciso a composio


molecular da estrutura proposta.
Um outro produto identificado da reao de metabolizao de DMT catalisada
por peroxidases, apresenta a mesma relao m/z e o mesmo perfil de fragmentao
dos alucingenos j conhecidos bufotenina (5-OH-DMT) e psilocina (4-OH-DMT)
(Julien, 1998). Embora este composto tambm tenha sido analisado por um
espectrmetro de massas de alta resoluo, confirmou-se apenas sua composio
molecular proposta. Foi necessria uma anlise por RMN para determinar a real
posio do grupamento hidroxila no anel aromtico do composto. Entretanto, os
resultados no foram conclusivos por quantidade insuficiente de material. Mas de
qualquer forma, o nomeamos de OH-DMT (Fig. 60).
N

HO

N
H

N
H

NH

NH2

DMT

OH-DMT

DMFK

DMK

Figura 60: Estrutura qumica de OH-DMT, DMFK e DMK, em comparao a DMT.

No h muitos relatos sobre a metabolizao de DMT in vivo. Sabe-se apenas


que 25% do total de DMT administrado convertido em AIA, sendo considerado seu
principal metablito (Szara, 1956). Assim, possvel que reaes de DMT com
peroxidases ou ento, com enzimas que expressem atividade peroxidsica, pudessem
gerar tais compostos hidroxilados.
Imaginamos que para a metabolizao de DMT ocorra o ciclo peroxidsico (Fig.
61), similar ao que ocorre com triptofano, melatonina e LSD. Neste caso, DMT reagiria
com o composto I formando o radical DMT que, pela reao com oxignio molecular
ou nion superxido, formaria um intermedirio do tipo dioxetnico que poderia gerar o
composto DMFK, aps diferentes clivagens (Fig. 62). Em seguida, DMFK sofreria
deformilao e geraria DMK.

89

H2O2

PEROXIDASE

H2O

Composto I
DMT

DMT / O2

DMT

DMT / O2-

Composto II

O2 / O2-

intermedirio

DFMK

dioxetnico

- H2CO

DMK

Figura 61: Proposta de via de metabolizao de DMT por peroxidases como MPO e HRP,
envolvendo os compostos I e II.
N

N
- 1 e-

N
H

- H+

DMT

DMT

+ 2 H+ + 2 O2-

+ O2

+ O2-

HO

O O

N
H

N
N
H

intermedirio
dioxetnico

OH-DMT

N
O
NH2
DMK

- H2CO

NH

O
DMFK

Figura 62: Proposta de mecanismo de formao dos produtos OH-DMT, DMFK e DMK
decorrentes da metabolizao de DMT por peroxidases (MPO e HRP), mediante um
intermedirio dioxetnico.

Caso DMT fosse susbtrato de composto II, haveria a manuteno do ciclo


peroxidsico, juntamente com nion superxido. O fato de a metabolizao de DMT
ser depende de H2O2 em concentraes superiories (0,5 mM) prpria DMT (0,1 mM)
indica, ainda que preliminarmente, o envolvimento de nion superxido na
manuteno do ciclo peroxidsico.

90

Existe ainda a possibilidade da formao de OH-DMT por meio de um ciclo


envolvendo composto III (Fig. 63) (reao da forma nativa com nion superxido), a
exemplo da hidroxilao de salicilato catalisada por MPO (Kettle & Winterbourn, 1994).
O2-

PEROXIDASE

Composto III
O2-

OH-DMT + H2O

O2

Fe2+O22H+

DMT

Fe2+O2- DMT

Figura 63: Proposta da via de metabolizao de DMT por peroxidases como MPO e HRP,
envolvendo o composto III.

Tanto a formao de DMFK quanto a de OH-DMT foi fortemente inibida por DPI
e azida, inibidores do sistema NADPH oxidase e da MPO, respectivamente. A inibio
de DMFK por catalase est de acordo com as propostas do ciclo mostradas nas
Figuras 61 e 63, pois enquanto a formao de DMFK depender do ciclo peroxidsico
clssico, e, portanto, de H2O2, a formao do OH-DMT ser menos afetada pelo
sequestro de H2O2.
Por fim, importante salientar que a DMT, ao contrrio do LSD, um composto
endgeno encontrado no SNC e que sua funo ainda no est elucidada. Supe-se
que sua sntese acontea na glndula pineal, assim como o hormnio melatonina
(Callaway, 1993), e que sua funo esteja relacionada com a apario dos sonhos
durante o sono graas a seus efeitos alucingenos (Callaway, 1988). Assim, esta
possvel rota descrita nesta dissertao pode significar uma rota metablica
normalmente ativa para a DMT, ainda no descrita em humanos.

91

92

10. CONCLUSES
1.

Os alucingenos indlicos LSD e DMT foram metabolizados in vitro pelo


sistema HRP/H2O2, e por MPO presente em neutrfilos ativados;

2.

A metabolizao de LSD por peroxidases mostrou a formao de trs produtos


principais: um produto de abertura do anel indlico, que nomeamos de 6-oxo-7formamido-N-metil-hidrobenzoquinolina-2-dietil-formamida (FOMBK), e O-HLSD e nor-LSD que coincidem com produtos formados por sua metabolizao in
vivo por ao das enzimas do complexo P450 presentes em hepatcitos;

3.

Embora no foi possvel encontrar o composto FOMBK em urina de usurio de


LSD, sugerido que a metabolizao de LSD por peroxidases possa estar ativa
no SNC, uma vez que MPO expressa por neurnios e microglia;

4.

A sntese de DMT a partir de indol, segundo a reao de Speeter e Anthony, foi


bem sucedida, e sua extrao a partir da ayahuasca foi adequadamente
realizada, nas mesmas condies de extrao descritas para sua extrao em
plasma;

5.

A metabolizao de DMT por peroxidases mostrou a formao de dois produtos


principais: um produto de abertura do anel indlico, que nomeamos de N,Ndimetil-N-formilquinuramina (DMFK) e um produto hidroxilado (OH-DMT) que
apresenta a mesma relao m/z que os alucingenos bufotenina e psilocina.

6.

Esta possvel rota metablica descrita neste trabalho pode significar uma via
alternativa de metabolizao de LSD e DMT ainda no descrita em humanos;

7.

Devido ao fato de DMT ser uma substncia endgena, esta possvel rota
descrita pode ser uma rota normalmente ativa de sua metabolizao.

93

94

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