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INFORME DE LA PRCTICA
EXTRACCIN, CUANTIFICACIN Y ELECTROFORESIS DE DNA
RESUMEN
Uno de los ms importantes aportes a la biologa ha sido el reconocimiento del DNA como la molcula de la vida. Para
su estudio y la aplicacin de tcnicas moleculares es necesario la extraccin de DNA ntegro y puro. La extraccin
consiste en el aislamiento y purificacin de molculas de DNA y se basa en las caractersticas fisicoqumicas de la
molcula. Una vez obtenido el material gentico, es importante determinar el rendimiento mediante espectrofotometra,
ya que una caracterstica del DNA es que absorbe la luz ultravioleta (UV) a 260 nm, lo que permite estimar su
concentracin. Adems de conocer la cantidad y calidad del DNA por espectrofotometra, es importante conocer si el
DNA obtenido est integro, lo cual se puede observar mediante electroforesis en gel de agarosa, debido a las bandas
que se forman. Los objetivos de la prctica son cuantificar DNA extrado por 2 diferentes mtodos (por perclorato de
sodio y por fenol-cloroformo) mediante espectrofotometra, as como evaluar la pureza e integridad del DNA por
electroforesis, para comparar los resultados obtenidos por ambos mtodos. Los resultados obtenidos por el mtodo de
perclorato de sodio fueron: relacin 260/280 = 1.577, concentracin = 22.371 ng/L, bandas difusas; mientras que por el
mtodo de fenol-cloroformo fueron: relacin 260/280 = 1.92, concentracin = 1342.28 ng/L, bandas muy difusas. Como
conclusiones, se logr extraer DNA humano por los mtodos de perclorato de sodio y de fenol-cloroformo, siendo que por
el mtodo de perclorato de sodio se obtuvo menor cantidad de DNA y contaminado, en contraste al mtodo de fenolcloroformo, con el cual se obtuvo mayor cantidad de DNA y alta pureza; y al no evaluarse la integridad de ambas
muestras por fallas en la electroforesis, se concluye que el mtodo ms eficaz es el de fenol-cloroformo.
Palabras clave: Nucletidos, espectrofotometra, absorbancia, densidad ptica, electroforesis.
SUMMARY
One of the most important contributions to biology has been the recognition of DNA as "the molecule of life". For their
study and application of molecular techniques is necessary the extraction of DNA full and pure. The extraction involves the
isolation and purification of DNA molecules and is based on the physicochemical characteristics of the molecule. After
obtaining the genetic material, it is important to determine the performance by spectrophotometry, as a feature of DNA is
that it absorbs ultraviolet (UV) at 260 nm, which allows estimation of their concentration. Besides knowing the quantity and
quality of DNA by spectrophotometry, it is important to know if the DNA obtained is integral, which can be observed by
agarose gel electrophoresis, because the bands are formed. The objectives of the practice are quantified DNA extracted
by 2 different methods (sodium perchlorate and phenol-chloroform) by spectrophotometry, and to assess the purity and
the integrity of the DNA by electrophoresis, to compare the results obtained by both methods. The results obtained by the
method of perchlorate were: ratio 260/280 = 1.577, concentration = 22.371 ng/L, diffuse bands; while by the phenolchloroform method they were: 260/280 ratio = 1.92, concentration = 1342.28 ng/L, very diffuse bands. In conclusion, it
was possible to extract human DNA by the methods of sodium perchlorate and phenol-chloroform, being that by the
method of sodium perchlorate less DNA and contaminated was obtained, in contrast to the method of phenol-chloroform,
the which greater amount of DNA and high purity was obtained; because the integrity of both samples evaluated by
electrophoresis failures, it is concluded that the most effective method is phenol-chloroform.
Keywords: Nucleotides, spectrophotometry, absorbance, optical density, electrophoresis.
INTRODUCCIN
Uno de los ms importantes aportes a la biologa ha sido
el reconocimiento del DNA como la molcula de la
vida. Para el estudio de DNA existen diferentes
muestras que pueden ser obtenidas y analizadas de un
paciente; sangre, semen, saliva, cabello, hueso, diente o
tejido, la forma ms rpida y fcil de obtener es la
sangre. La sangre est compuesta por clulas y restos
celulares en una solucin acuosa: el plasma. Dentro de
las clulas, estn los eritrocitos, leucocitos y plaquetas,
de las cuales, los leucocitos son las nicas clulas
nucleadas que se presentan como granulocitos,
monocitos y linfocitos, y, por lo tanto, las nicas de las
que se puede obtener DNA por la presencia de este
ncleo. (Koolman y Rhm, 2005)
Debido a que en el DNA se encuentran cifradas las
instrucciones que definen las caractersticas propias de
cada organismo, diversas tecnologas y sistemas de
anlisis se han desarrollado para la caracterizacin de
esta molcula. La aplicacin de tcnicas moleculares
inicia con la extraccin de DNA y la obtencin exitosa de
datos confiables y reproducibles depende, en gran
medida, de la extraccin de DNA ntegro y puro (Rocha,
2009).
El DNA est constituido por dos cadenas de nucletidos
unidas entre s formando una doble hlice. Los
nucletidos estn
integrados por un
azcar
(desoxirribosa), un grupo fosfato y una base nitrogenada
(adenina, guanina, timina o citosina). La unin de los
nucletidos ocurre entre el grupo fosfato y el azcar,
mediante enlaces fosfodister, dando lugar al esqueleto
de la molcula. Las bases de cadenas opuestas se unen
mediante puentes de hidrgeno y mantienen estable la
estructura helicoidal. Los grupos fosfato estn cargados
negativamente y son polares, lo que le confiere al DNA
una carga neta negativa y lo hace altamente polar
(Rocha, 2009).
La extraccin consiste en el aislamiento y purificacin de
molculas de DNA y se basa en las caractersticas
fisicoqumicas de la molcula. Los mtodos tradicionales
de extraccin utilizan solventes orgnicos para separar a
las protenas del DNA y, una vez suspendido en la fase
acuosa, aislarlo por precipitacin con etanol. En general,
la extraccin consiste de cinco etapas principales:
homogeneizacin del tejido, lisis celular, separacin de
protenas y lpidos, precipitacin y redisolucin del DNA
(Alejos, 2014).
Los mtodos de extraccin del DNA ms utilizados son
por perclorato (Salting Out) y por fenol-cloroformo. El
mtodo por perclorato de amonio o sodio a altas
concentraciones se fundamenta en el cambio de
solubilidad que experimentan las protenas cuando son
sometidas a modificaciones en la concentracin salina,
inicia con una lisis celular con un detergente aninico
que solubiliza los componentes celulares e inhibe la
accin de las nucleasas intracelulares, a continuacin se
desnaturalizan y se eliminan las protenas por
de
las
determinaciones
Mtodo de
extraccin
Lectura
260 nm
Lectura
280 nm
Relacin
260/280
Concentracin
DNA (ng/L)
Perclorato
0.022
0.014
1.577
22.371 ng/L
FenolCloroformo
1.342
0.699
1.92
1342.28 ng/L
DISCUSIN DE RESULTADOS
La pureza de la muestra est relacionada con el valor de
mxima absorbancia de los cidos nucleicos detectada
a una longitud de onda de 260 nm, la relacin de
absorbancia a 260 nm y 280 nm se utiliza para evaluar
la pureza de ADN, una proporcin de 1.7-1.9 es
generalmente aceptada como DNA puro (Alejos, 2014).
En el caso de la extraccin por perclorato se obtuvo una
proporcin de 1.577 mientras que en la extraccin por
fenol-cloroformo se obtuvo 1.92. Estas relaciones
indican que por el mtodo de perclorato se obtuvo un
DNA impuro lo cual se puede deber a la presencia de
protena, fenol u otros contaminantes que absorben
fuertemente en o cerca de 280 nm. Mientras que por el
mtodo de fenol-cloroformo el DNA obtenido fue casi
puro, con alguna leve presencia de contaminantes, pero
en muy poca cantidad. Tambin es necesario considerar
que ambas muestras de sangre se encontraban
lipmicas, por lo cual los lpidos pudieron participar en la
contaminacin por el mtodo de perclorato, mientras
que esto no ocurre en el mtodo de fenol-cloroformo ya
que el cloroformo se encarga de disolver a los lpidos
(Riera, 2010).
REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS
Alejos, L. (2014). Extraccin y purificacin de DNA.
Herramientas moleculares aplicadas en ecologa:
aspectos tericos y prcticos (Compilado). Mxico:
SEMARNAT. Pgs. 1-3.
Fierro, F. (2014). Electroforesis de DNA. Herramientas
moleculares aplicadas en ecologa: aspectos tericos y
prcticos (Compilado). Mxico: SEMARNAT. Pgs. 2729.
Koolman, J. & Rhm, K. (2005). Bioqumica: texto y
atlas. (3 ed.). Espaa: Mdica Panamericana. Pg. 274.
Riera, M. (2010). Protocolo de extraccin de DNA por
salting-out para pequeos volmenes de sangre.
Revista de Ciencia y Tecnologa; 12(14): 4-7 pp.
Rocha, P. (2009). Teora y prctica para la extraccin y
purificacin del ADN de palma de aceite. Palmas; 23(3):
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Sepp, R. (2004). Rapid techniques for DNA extraction
from routinely processed archival tissue for use in PCR.
J Clin Pathol; 47(4): 318-323 pp.