1- Qu es y cual es el objetivo del fraccionamiento celular, la

homogenizacin y la centrifugacin diferencial?

El fraccionamiento celular es una tcnica bioqumica utilizada para separar
los distintos orgnulos y componentes celulares para su estudio. La tcnica
se inicia con la homogeneizacin. El tejido se tritura en un homogeneizador
de manera que las clulas se comprimen y se libera su contenido. Lo que
luego se hace con ese extracto es someterlo a diferentes centrifugaciones a
diferentes velocidades y tiempos, de manera que obtenemos fracciones
enriquecidas de los distintos orgnulos.
Para obtener orgnulos celulares intactos el fraccionamiento debe ser
isotnico; decir que la presin osmtica o tonicidad del amortiguador debe
corresponder a la del interior de la clula, en las soluciones hipotnicas los
orgnulos estallaran al captar el agua, en cambio en una hipertnica se
encogeran. Despus de la homogenizacin se realiza una filtracin gruesa
a travs de una gasa gruesa para eliminar restos de tejidos o clulas
intactas que no hayan sido fraccionadas. La separacin de dichos
componentes se inicia con la centrifugacin gradual, cuya velocidad se va
aumentando poco a poco (expresada en mltiplos de la aceleracin
gravitaroria de la tierra). De este modo los orgnulos se sedimentan en la
suspensin una tras otra, de acuerdo con su tamao y densidad.
Los ncleos celulares sedimentan a una velocidad relativamente baja, si se
decanta la capa superior y se suspende cuidadosamente el sedimento en
un medio isotnico se obtiene una fraccin enriquecida con ncleos
celulares, sin embardo pueden haber otros restos celulares como el
citoesqueleto que representa impurezas.
Las partculas de un tamao y densidad menor que el ncleo se pueden
aislar del sobrenadante de la primera centrifugacin incrementado
gradualmente la velocidad de la centrifugacin. Para ello se requieren
centrifugas especiales que permiten obtener una a una las fracciones de las
mitocondrias, las vesculas membranosas y los ribosomas. El sobrenadante
de la ultima centrifugacin adems del amortiguador contiene el citosol con
los componentes solubles de la clula. Estos procesos se llevan a cabo a
temperaturas bajas para retardar la accin degradativa de las enzimas
liberadas y otros factores. A pesar de estas medidas de precaucin los
organelos asilados se pierden rpidamente su actividad biolgica.
Homogenizacin.
Consiste en romper las clulas y liberar sus organelos usando una variedad
de mecanismos (moles, picar, triturar, cambios de presin, choque
osmtico, congelacin y descongelacin etc.)

Las clulas se homogenizan en una solucin isotnica, lo cual previene que

se rompa su membrana por smosis con el pH regulado y a temperaturas
bajas para prevenir daos enzimticos.
La homogenizacin es un paso muy comn en la preparacin de las
muestras biolgicas antes del anlisis de cidos nucledos y protenas, o
del estudio de las clulas, agentes patgenos y otros objetos.
Como resultado queda una pasta fina que consiste de las clulas y sus
organelos por separado.
Se refiere a rompimiento de las clulas o tejido del cual pretende extraer la
organela o molcula de inters.
Centrifugacin diferencial.
En este mtodo, el tubo de la centrfuga es llenado inicalmente con una
mezcla uniforme de la solucin de la muestra, a travs de la centrifugacin
se obtiene una separacin de dos fracciones: un pellet que contiene la
partcula sedimentada y un sobrenadante con la fraccin no sedimentada
de la solucin.
Un particular componente puede terminar en el sobrenadante o en el pellet,
o podra estar distribuido en ambas fracciones, dependiendo de su tamao
y/o de las condiciones de centrifugacin. El pellet es una mezcla de todos
los componentes sedimentados y esta contaminado con cualquier partcula
no sedimentada que estuviera en el fondo de el tubo. Las dos fracciones
son recuperadas por decantacin de la solucin sobrenadante del pellet. El
sobrenadante puede ser recentrifugado a altas velocidades para obtener
una mayor purificacin con la formacin de nuevo pellet y sobrenadante. El
pellet puede ser resuspendido en un pequeo volumen y recentrifugado
dependiendo de lo que se desee separar.
2- qu son las rpm y las g? buscar como se convierte de rmp a g
RMP
la cantidad de vueltas que un cuerpo giratorio completa alrededor de su eje cada
sesenta
segundos.
Esta es la frmula de conversin de la velocidad de centrifugacin de r.p.m.
(revoluciones por minuto) a g (es la fuerza centrfuga relativa, expresada en g).
Para el clculo se debemos conocer el radio del rotor en centmetros, por lo que
es imprescindible calcular de nuevo esta relacin para cada centrfuga.

3- Qu soluciones pueden utilizarse en la homogenizacin qumica, cules

son las ventajas y las desventajas de cada uno de ellos?
Se utilizan sustancias que pueden daar directamente a la pared celular ,
como:
Solventes organicos:
Ventajas: disuelve lpidos que forman parte de la pared celular, y la
desestabilizan, adems es barato
Desventajas: causa un estrs moderado en la clula.
Detergentes:
Ventjas: disuelve a la membrana celular
solubilizndola, adems
proporciona un estrs suave en la clula.
Desventajas: moderadamente caro, y disuelve toas las membranas
plasmticas exponiendo sus componentes.
lcalis.
Ventajas: solubilizan de la membrana por saponificacin de los lpidos que
la componen, adems de ser barato
Desventaja. No es muy recomendable ya que causa un estrs muy fuerte
en la celula.
4- En la centrifugacin diferencial se obtiene fracciones puras?
Aqu el homogenizado es centrifugado repetidas veces a altas velocidades
sedimentando progresivamente en pequeas partculas. La primera
centrifugacin es a 600 g por 10 minutos, el cual sedimenta la fraccin
nuclear. Este pellet contiene el ncleo celular intacto y tejido la prxima
separacin es el sobrenadante post nuclear o partculas suspendidas en el
liquido sobre el pellet nuclear, el cual es transferido a otro tubo de
centrfuga y se centrifuga a 10,000 g por 30 minutos en una centrifuga
rerigerada. El material sedimentado se conoce como fraccin mitocondrial,
este contien mitocondrias y micro cuerpos la centrifugacin diferencial se
basa en la existencia de diferentes partculas en la suspensin que difieren
en su densidad que la del medio. Si se centrifuga en condiciones suaves,
sedimentaran las partculas ms densas presentes y asi sucesivamente .
por lo tanto no se obtienen fracciones puras, ya que en el pellet han
quedado los organelos intactos mientras que en el sobrenadante esta una
mezcla de fracciones de organelos.

5- Qu otras tcnicas adicionales pueden utilizarse para mejorar la purificacin

de organelos celulares? Justifica la respuesta.
Una vez realizado el primer paso de homogenizacin se pueden realizar
varios procedimientos de purificacin como lo es la cromatografa, que
separa los componentes individuales de una mezcla compleja en distintas
porciones o fracciones. Despus de cada paso de este tipo, se utiliza un
tipo de anlisis como por ejemplo una prueba de protenas de algn inters.
Existen tres tipos de cromatografa:
A) Cromatografa por afinidad: tiene una matriz acoplada en forma
covalente a una molcula que interactale modo especifico con la
protenas de inters. Estas se unen especficamente a una columna de
tipo y pueden ser liberadas por un cambio en el pH o mediante
soluciones salinas concentradas.
B) Filtracin de gel: se utilizan para separar protenas en funcin de su
tamao. La matriz consiste en diminutas microesferas porosas. La
molcula de protena es lo bastante pequea para ingresar en los
orificios de las micro esferas se demoran y viajan con mas lentitud a
travs de la columna.
C) Intercambio inico: estn llenas de pequeas microesferas que tienen
carga positiva o negativa, por lo que retardan las protenas con carga
opuesta. La asociacin de la protenas con la matriz depende del pH y la
concentracin inica de la solucin.
Tambin existe la electroforesis que es cuando se aplica un campo elctrico a una
solucin que contiene una protena, estas migraran en una direccin y a una
velocidad que reflejan su tamao y su carga neta.
6- Si se realiza la obtencin de ncleos celulares, an puede realizarse
fraccionamiento celular de este organero?qu obtendra?
Si se puede realizar el fraccionamiento de este orgnulo, teniendo cuidado
necesario mediante una homogenizacin mecnica o una centrifugacin, lo
que se puede obtener es el DNA de la clulas, este mtodo es muy sencillo
y comn adems de ser uno de los ms enseados en el rea de la
bioqumica,
7- Qu efecto tiene la urea sobe las membranas celulares
La urea es una molcula pequea que puede ser filtrada en el sistema renal,
atraviesa fcilmente las membranas celulares. Adems no afecta el pH cuando se
acumula, como ocurre con el amonio, y no es txica. Una limitante que pasa la

urea es que debe excretarse siempre en soluciones, es decir, con cierto volumen
de agua.
Ya que la mayora de los aminocidos en todos los tejidos van a ser transformados
en glutamato a travs de procesos de deaminacion este aminocido se convierte
en pieza central del catabolismo de aminocidos. Es convertido enzimticamente
en glutamato en casi todos los tejidos.
8- Cules son los colorantes vitales y qu aplicacin tiene?qu tipo de
colorante es el acetocarmn y cual es su fundamento qumico?
Son aquellos que ejercen su accin en las partes vivas de las clulas sin alterar
su metabolismo, y poniendo de relieve sus estructuras. Son preferidos los
colorantes vitales que son retenidos por la clula durante el tiempo necesario para
poder realizar la observacin
Colorantes vitales bsicos
Rojo neutro
Es una sustancia soluble en agua. Puede ser administrada a los animales
superiores por va endovenosa o digestiva, en la proporcin del 1%; se aplica
diariamente varios centmetros cbicos de la solucin. Por la va digestiva se usa
cuando se trata de estudiar la mucosa digestiva.
Verde Jano
Es tambin un colorante supravital, utilizado para el estudio de mitocondrios. Se
aplica por inmersin o inyeccin. Los mejores resultados se obtienen con sangre.
En este caso se usa en una solucin al 1 x 10 000 en suero fisiolgico al 0,85%.
Se aplica una gota en el portaobjeto con sangre fresca, y despus, se coloca
un cubreobjeto. Una observacin minuciosa mostrar mitocondrios primero en
los linfocitos y luego en los leucocitos granulares, hasta que todos quedan teidos.
La coloracin dura varias horas, y la corporacin puede evitarse poniendo vaselina
en el borde del cubreobjeto.
Azul Jano
Es otro colorante supravital, que tiene iguales usos y se aplica de idntica forma
que el verde Jano.
Azul naftol
Ha sido ocasionalmente usado como colorante vital.
Violeta neutral
Tiene propiedades similares al rojo neutro, pero ha tenido menos uso en trabajos
microscpicos.
Colorantes vitales cidos
Alizarina roja S
Se ha usado como colorante vital para el tejido nervioso en
pequeos invertebrados.
Prpura brillante R
Usado como colorante vital para la levadura.

Azul trypan
Se emplea disuelto en agua destilada, al 1% o mejor en suero fisiolgico. Se
aplica en inyecciones intraperitoneales o subcutneas, en la proporcin de 0,5-1
cc de solucin por cada 20 gramos de peso del animal. Las inyecciones se repiten
cada 5 das, hasta que el animal tome color azul. La fijacin se hace en formol al
10%, y los cortes se realizan por congelacin.
El acetocarmin es uno de los colorantes ms antiguos, es insoluble en agua y
alcohol, pero soluble en medios alcalinos.
Las molculas del colornte reaccionan con componenetes celulares por uniones
no covantes ionicos, puentes de hidrgeno, o covalentes. El pH de la solucin del
colorante puede determinar la extensin de la tincin mientras la reactividad de
una molcula de colorante con tejidos es dependiente a menudo de cambio.

Bibliografa
Alberts, B. ( 2011, 3a ed.). introduccion a la biologia celular. Mexico D.F:
Panamericana.
Lodish, H. (2016, 7a. ed.). Biologa Celular y molecular. Buenos Aires:
panamericana.

https://www.ecured.cu/Anexo:Colorantes_vitales

imgenes
tomadas
https://es.scribd.com/doc/113185253/Fraccionamiento-Celular

de: