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Bactrias

Fitopatognicas
Carlos Hidemi Uesugi

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Nenhuma parte desta publicao poder ser
reproduzida sem a autorizao da Editora.

Ttulo: Bactrias Fitopatognicas


Autor: Carlos Hidemi Uesugi
Editora: CopyMarket.com, 2000

Sumrio
Carlos Hidemi Uesugi

BACTRIAS FITOPATOGNICAS
Introduo.................................................................................................................................................................
1.1. Classificao dos Seres Vivos.........................................................................................................................
1.2. Diferenas Entre Procariotos e Eucariotos .................................................................................................
2. Morfologia e Ultraestrutura de Clulas Bacteriana.........................................................................................
2.1. Estruturas da Clula Bacteriana......................................................................................................................
2.1.1 Estruturas Externas a Parede Celular..........................................................................................................
2.1.2. Estruturas Internas a Parede Celular..........................................................................................................
3. Cultivo de Bactrias ............................................................................................................................................
3.1. Tipos Nutritivos das Bactrias........................................................................................................................
3.2. Condies Fsicas Necessrias ao Crescimento ..........................................................................................
4. Reproduo e Crescimento................................................................................................................................
5. Classificao das Bactrias Fitopatognicas.....................................................................................................
5.1. Diviso I Gracilicutes...................................................................................................................................
5.1.1. Classe Proteobacteria....................................................................................................................................
5.2. Diviso II Firmicutes.....................................................................................................................................
5.2.1. Classe Firmibacteria......................................................................................................................................
5.2.2. Classe Thallobacteria ...................................................................................................................................
5.3. Diviso III Tenericutes................................................................................................................................
5.3.1. Classe Molicuttes ..........................................................................................................................................
5.4. Outras Bactrias................................................................................................................................................
5.5. Bactrias Fastidiosas ........................................................................................................................................
6. Espcies de Bactrias Fitopatognicas..............................................................................................................
7. Aulas Prticas ......................................................................................................................................................
7.1. Caractersticas Culturais das Bactrias ..........................................................................................................
7.2. Roteiro para Diagnose de Doenas Bacterianas .........................................................................................
7.3. Identificao das Bactrias .............................................................................................................................
7.3.1. Chave para Identificao de Bactrias Fitopatognicas ao Nvel De Gnero H.................................
7.4. Meios de Cultura ..............................................................................................................................................
7.5. Isolamento de Microrganismos......................................................................................................................
7.5.1. Postulado de Koc..........................................................................................................................................

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Autor: Carlos Hidemi Uesugi
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1. Introduo
Carlos Hidemi Uesuge

1.1.

CLASSIFICAO DOS SERES VIVOS

Classificao dos organismos vivos


Esquema de classificao

Reinos

Organismos Includos

Linnaeus (1753)

Plantae

Bactrias, fungos, algas, plantas.

Animalia

Protozorios e animais superiores

Plantae

Algas multicelulares e plantas

Animalia

Animais

Protista

Microrganismos,
incluindo
bactrias,
protozorios, algas, bolores e leveduras.

Plantae

Algas multicelulares e plantas

Animalia

Animais

Protista

Protozorios e algas unicelulares

Fungi

Bolores e leveduras

Monera

Todas as bactrias (Procariotos)

Archaebacteria
(Archaea)

Bactrias que produzem gs metano, requerem


altas concentraes de sal ou requerem altas
temperaturas.

Eubacteria
(Bactria)

Todas as outras bactrias, incluindo aquelas mais


familiares aos microbiologistas, tais como
causadores de doenas, bactrias do solo e da
gua e bactrias fotossintticas.

Eucariotas
(Eucarya)

Protozorios, algas, fungos, plantas e animais.

Haeckel (1865)

Whittaker (1969)

Woese (1977)

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Conceito de Classificao dos Cinco Reinos


Robert H. Whittaker (1969)
Ampliou o sistema de classificao de Haeckel e sugeriu trs nveis de organizao celular para acomodar os trs
modos principais de nutrio:
1) Fotossntese, o processo pelo qual a luz fornece energia para converter o dixido de carbono em gua e
acar.
2) Absoro, a captao de nutrientes qumicos dissolvidos em gua.
3) Ingesto, entrada de partculas de alimentos no dissolvidas.
Neste esquema de classificao constituem,
Reino Monera que abriga os procariotos ou seja, organismos que normalmente obtm nutrientes somente por
absoro, e no podem ingerir alimentos ou realizar fotossntese.
Reino Protista inclui os microrganismos eucariticos unicelulares, que representam os trs tipos nutricionais: as
algas so fotossintticas, os protozorios podem ingerir alimentos e os fungos limosos (fungos inferiores)
somente absorvem os nutrientes.
Organismos eucariticos superiores so acomodados nos;
Reino Plantae (plantas verdes fotossintticas e as algas superiores).
Reino Animalia (animais que ingerem os alimentos).
Reino Fungi, organismos que tem parede celular, mas no o pigmento fotossinttico clorofila encontrado em
outras plantas. Eles absorvem os nutrientes.
Desta maneira os microrganismos foram colocados em trs dos cinco reinos: Monera (Bactria), Protista
(protozorios e algas microscpicas) e Fungi (os fungos microscpicos; leveduras e bolores). O sistema de
Whittaker coloca todas as bactrias no reino Monera e sugere um ancestral comum para todos os membros
deste reino. Entretanto, resultados de intensas pesquisas durante dcadas recentes sugerem um ancestral
diferente entre os microrganismos, como descrito a seguir.
As trs categorias filogentica dos seres vivos (Woese, 1977) Arqueobactrias, Eubactrias e Eucariotos
{At 1977 os cientistas achavam que os procariotos eram os mais primitivos de todos os organismos, ficando
subentendido que esses organismos, por causa da simplicidade estrutral, eram os ancestrais de eucariotos mais
complexos. Carl Woese e seus colaboradores na Universidade de Illinois descobriram que nenhum grupo tinha
se desenvolvido do outro. Eles descobriram que os procariotos e eucariotos tinham evoludo por vias
completamente diferentes de uma forma ancestral comum. Evidncias para sustentar esta idia vieram de estudos
com cido ribonuclico ribossmico, ou rRNA que essencial para a sntese de protenas e, portanto, para a
sobrevivncia da clula.
RNA formado por seqncia de quatro tipos de ribonucleotdeos, arranjados em vrias combinaes para formar
uma nica e longa cadeia de centenas de unidades.
- O rRNA de qualquer organismo particular tem um arranjo distinto de ribonucleotdeos, ou uma sequncia
nucleotdica especfica.
- Os genes que controlam a sequncia nucleotdica de rRNA variam lentamente durante milhes de anos de
evoluo. Portanto, o rRNA pode servir como indicador de como os organismos esto intimamente
relacionados. Algumas regies da molcula de rRNA de todos os organismos vivos permanecem quase as
mesmas, a despeito dos 3,5 a 4,5 bilhes de anos de evoluo. Esta constncia sustenta a ideia de que todos os
organismos desenvolveram de formas ancestrais comuns.
- A quantidade de diferenas entre as outras regies de rRNA pode ser usada para medir o grau de
relacionamento entre os organismos. Por ex, se as seqncia de ribonucleotdeos de dois tipos de organismos
diferem em grande extenso, a relao entre ambos muito distante; isto , os organismos divergiram h muito
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tempo de um ancestral comum. Porm se as sequncias mostram mais similaridades, os organismos esto
intimamente relacionados e tem um ancestral comum relativamente recente.
- Usando essas tcnicas, Woese descobriu que as molculas de rRNA em grupos de organismos diferem no
arranjo ou sequncia de seus nucleotdeos. Os eucariotos possuem um tipo geral de sequncia e os procariotos
um segundo tipo. Mas ele descobriu que alguns procariotos tem um terceiro tipo de rRNA e o arranjo desses
rRNA difere dos outros procariotos e eucariotos. Em outras palavras, existem dois tipos principais de bactrias,
as designadas archaeobactria e as eubactrias.
Classificao de Woese
EUCARYA
Reinos:
Plantae
Animalia
Fungi Eumicota (Basidiomicotina) Parede celular com quitina
Protozoa
Fungi Chromista (no tem quitina na parede celular).
ARCHAEA (Archaebacteria); Abriga bactrias Termoacidfilas,
Metanognicas, Halofilicas
Crenarchaeota - Termoflico extremo
Euryarchaeota - Metanognicas, Haloflicas extremas
Korarchaeota
Archaea no definido
A parede celular da archaeobacteria varivel, no contm cido murmico (peptdioglicana).
A membrana possui lipdios ramificados, com ligao ter.
BACTERIA (Eubacteria); abriga as bactrias verdadeiras.

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1.2. DIFERENAS ENTRE PROCARIOTOS E EUCARIOTOS


Alguns elementos diferenciais entre clulas procariticas e eucariticas
Elemento

Clulas procariticas

Clulas eucariticas

Bactrias, Algas verdes-azuis

Algas, fungos, protozorios,


vegetais e animais.

Dimenses do organismo

1-2/1-4 m ou menor

Maior que 5 m em largura ou


dimetro.

Sistema gentico: Localizao

Nucleide, corpo cromatnico


ou material gentico.

Ncleo,
cloroplastos.

No limitada por membrana


nuclear. Um cromossomo
circular

Limitada
por
membrana
nuclear.
Mais
de
um
cromossomo linear

No

Sim

Unidirecional. Transferncia de
DNA de forma diplide parcial

Fuso de gametas forma


diplides que segrega por
meiose

Mitocndria

Ausente

Presente

Estrutura de Golgi

Ausente

Presente

Retculo endoplasmtico

Ausente

Presente

Ausente

Presente

Grupos
nos
quais
encontrados como

so

unidade estrutural.

Estrutura do ncleo
Replicao de cromossoma por
mitose

Recombinao gentica

Vacolos
limitados
membranas verdadeiras
Parede celular
Ribossomo

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por

Peptidioglicana (Mureina ou
mucopeptdeo
como
componente)
Duas subunidades 30S e 50S Tipo 70S

mitocndria,

Ausncia de peptidioglicana
Duas subunidades 40S e 60S Tipo 80S

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2. Morfologia e Ultraestrutura de Clulas Bacteriana


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Dimenses, formas e arranjos das clulas bacterianas


- Tamanhos (largura)
Ex. Streptococcus, 0,5 m
Bacillus, 0,8 m
Pseudomonas, 0,8 m
Comprimento 1,4 - 2,8 m
- Formas

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2.1. ESTRUTURAS DA CLULA BACTERIANA


2.1.1 Estruturas externas a parede celular
Flagelos
Compostos de 3 partes
- Estrutura basal
- Estrutura semelhante a um gancho
- Um longo filamento externo a parede celular.
Comprimento do flagelo:
- Geralmente vrias vezes o da clula, mas o seu dimetro uma pequena frao do dimetro da clula (Ex. 10
a 20 nm).
Flagelao:
- Muitas espcies de bacilos possuem flagelos, mas raramente os cocos possuem.
- Fixao dos flagelos e numero de flagelos
- Atrquica
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- Clavibacter
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- Polar - Monotrquica - Xanthomonas


- Lofotrquica - Pseudomonas fluorescens
- Peritrquica

- Erwinia

Funo do flagelo:
Mobilidade, porm a mecnica exata ainda no conhecida. Segundo algumas suposies, a cadeia protica
contrai e relaxa alternadamente produzindo movimento ondulatrio.
* Flagelos movimentam em velocidade elevada.
Ex: Spirillum serpens - flagelo gira a um ritmo de 2400 rpm e o corpo a 800 rpm. A velocidade calculada de
deslocamento da clula de 50 m/s.
Vibrio comma polar 200 m/s.
Pelos (Fmbrias)
So estruturas que se assemelham aos flagelos, mas no esto envolvidos na mobilidade. So consideravelmente
mais curtos do que os flagelos e mais numerosos. So encontrados tanto em espcies moveis como imveis.
Funes das fmbrias:
Possuem vrias funes associadas com vrios tipos de pelos. Um deles o pelo F (pelo sexual), serve como
porta de entrada de material gentico durante a conjugao bacteriana. Outros tipos funcionam como stios de
adsorso de bacterifago (vrus bacteriano) e como mecanismo de aderncia superfcie do hospedeiro.
Cpsulas
Cobertura viscosa de natureza polissacardica (dextrano, dextrina, levano, celulose).
Funes da cpsula
* Proteo contra dessecamento
* Em algumas bactrias patognicas aumenta seu poder infectante. A perda completa da cpsula pode resultar na
perda do poder invasor ou infectante da bactria.
Membrana externa
Todos os envelopes celulares das bactrias Gram-negativas possuem a membrana externa externamente parede
celular. Ela tem uma estrutura complexa consistindo de fosfolipdios, lipopolissacardeos e vrios tipos de
protenas. A membrana externa ligada covalentemente camada de peptidioglicana pela lipoprotena. As
principais funes da membrana externa inclui 1) proporcionar canais para difuso passiva de nutrientes ou
solutos hidroflicos, 2) estabelecer barreira permeabilidade a antibiticos, detergentes e outras substncias
txicas, 3) proporcionar stios receptores para bacteriocinas e bacterifagos, 4) facilitar a formao e a
manuteno de pareamento durante a conjugao, e 5) dotar de hidrofilicidade superfcie da clula. Estas
funes so realizadas pela protena de membrana externa (Omp) bem como pelos lipopolissacardeos.
- Porina
Porinas so poros relativamente no especficos, ou canais, que so organizados como trimeros de tres
subunidades da protena porina. A protena porina OmpA em Escherichia coli e OmpF em Pseudomonas aeruginosa
e P. syringae. Os genes de OmpF so altamente conservados entre estas duas bactrias, com 72% de homologia de
DNA. Os genes de OmpF P. syringae tem 33% de homologia com genes OmpA de E. coli.

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As bactrias Gram-negativas levam cerca de 105 cpias de porinas por clula na sua membrana externa. As
porinas so grandes canais repletos de gua que permite difuso passiva no especfica de solutos hidroflicos. A
permeabilidade para solutos hidrofbicos pequena. As mais especficas porinas so tambm inducveis
dependendo das condies de crescimento. Eles incluem as protenas responsveis para permeao especfica de
maltose e maltodextrina, anions, ferro-sideroforas, e vitaminas B12.
- Lipopolissacardeos
{Lipopolissacardeos cobre cerca de 40% da superfcie da clula de bactria entrica. LPS so molculas
anfipticas com metade lipdios hidrofbicos A e metade polissacardeos hidroflicos. O lipdio A que comum
para todos os LPS composto por uma espinha de D-glucosamyl--D-glucosamina e cinco e sete cadeias de
cidos graxos saturados de 12 - 16 tomos de carbonos. O polissacardeo subdividido em estrutura central e
cadeias laterais de antgeno-O. A estrutura central consiste de sries no repetitivas de resduos de acares. A
estrutura do antgeno-O exibe considervel variao entre espcies e isolados, e as diferenas so de importncia
taxonmica. O LPS de algumas bactrias fitopatognicas tem sido sugeridos como tendo importante papel no
reconhecimento da hospedeira. Em isolados de Ralstonia solanacearum avirulentos e reao de hipersensibilidade
positiva possuem LPS que perderam o antgeno-O consistindo de rhamnose, 2-amino-2-deoxyglucose e xylose
com proporo molar de 4: 1: 1.
Parede celular
* Formao rgida que da forma clula
* Espessura em mdia de 10 a 25 nm (100 a 250 )
Gram negativas possui membrana externa e camada de peptdioglicana, porm, a peptdioglicana delgada.
Gram positivas possui uma camada espessa de peptdioglicana.
Estrutura da peptdioglicana
Polmero insolvel constituinte da parede celular da bactria.
Composio qumica e estrutura variam de espcie para espcie, havendo, contudo semelhanas bsicas.
So formadas por trs tipos de unidades
1)cido acetilglucosamina (AGA)
2)cido acetilmuramico (AMA)
3)Peptdio constitudo por 4 ou 5 aminocidos de variedade limitada.
2.1.2. Estruturas internas parede celular
Periplasma
Periplasma a matriz de polipeptdeos e sacardeos. Ela contm diversas enzimas incluindo enzimas
degradadoras de tecidos vegetais tais como celulases e pectinases. Algumas enzimas localizadas no periplasma
funcionam como conversora que processa a converso de metabolitos no transportveis em transportveis. O
oligossacardeo do periplasma tais como -1,2-D-glucan, derivado de membrana externa responsvel pela
manuteno da presso osmtica do periplasma equivalente ao do citoplasma. Os oligossacardeos tambm
funcionam para gerar carga lquida negativa para a clula bacteriana atravs do equilbrio de Donnan resultante
dos resduos de anions deles.
Protoplasto, esferoplasto
- Clula sem parede celular
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Membrana citoplasmtica
*Fica imediatamente abaixo da parede celular, conhecida tambm como membrana protoplasmtica ou
simplesmente membrana plasmtica e incorpora vrias protenas intrinsecas. A membrana celular consiste de
camada dupla de lipdio de 50 a 75% de protena e 20 a 35% de lipdio base peso seco. O lipdio das bactrias,
com exceo da archaeobacteria, do tipo cido graxo-glicerol ester.
*A membrana celular contm vrias enzimas para metebolismo produtor de energia tais como citocromos,
citocromo oxidase, desidrogenases, ATPases, sintetese de protenas e permeases e tem importante papel na
respirao, transporte ativo, rotao flagelar ou segregao de material nuclear na diviso celular.
A energia para o transporte ativo e rotao flagelar fornecido pela fora motiva de proton., ou diferena de
potencial eletroquimica protonica atravs da membrana. A fora motiva protonica gerada pela translocao de
protons da matrix do periplasma em consonncia com a cadeia respiratria e/ ou hidrlise de ATP pela ATPase.
* semipermevel, seletiva, controla a passagem de nutrientes e de escrias para dentro e para fora da clula
respectivamente.
Invaginaes membranosas e sistemas de membrana (mesossomo)
*Em algumas bactrias tais como Clavibacter, Streptomyces e Bacillus, uma parte da membrana invagina para dentro
do citoplasma para formar complexa dobra membranosa chamado mesossomo
*Mesossomo est associado com a atividade respiratria, diviso nuclear, formao de septo, formao de
esporos e secreo de enzimas hidrolticas. Associa-se de modo complexo com o material nuclear e sua
replicao.
Citoplasma
O material celular contido dentro da membrana citoplasmtica pode ser dividido em:
* rea citoplasmtica rica em RNA
* rea nuclear rica em DNA
*Material nuclear; Clulas bacterianas no contm o ncleo tpico das clulas animais e vegetais superiores.
Possui dentro de citoplasma corpsculos que so encarados como estrutura nuclear confinando o DNA da clula
bacteriana nesta rea (no um ncleo definido). Proposto, Nucleide, cromossomo bacteriano etc.
Endospros
Corpo oval de parede espessa (um por clula) que uma clula altamente resistente. Chamados tambm de
esporos.
Ex: Bacillus, Clostridium
Composio dos esporos: cido dipicolnico, substncia no detectada nas clulas vegetativas. Esta substncia
est restrita aos esporos bacterianos onde formam de 5 a 10% do peso seco total.

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3. Cultivo de Bactrias
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Para o cultivo de bactrias necessrio o conhecimento de suas exigncias nutritivas e das condies fsicas
requeridas.
Exigncias nutritivas
-Todas as formas de vidas, dos microrganismos ao homem repartem certas exigncias nutritivas em termos de
substncias qumicas indispensveis ao seu crescimento e ao funcionamento normal.
-Todos os organismos vivos requerem uma fonte de energia. Alguns seres vivos, como as plantas verdes, podem
utilizar a energia radiante e so denominadas fototrficos. As formas de vida incapazes de utilizar a energia
radiante, como a vida animal, dependem da oxidao de compostos qumicos para obteno da energia. Por isso
recebem o nome de quimiotrficos. Esses dois tipos de comportamento existem entre as bactrias
(fototrficos e quimiotrficos).
-Todos os organismos vivos requerem alguma forma de carbono; todos exigem, ao menos, pequenas
quantidades de dixido de carbono, mas a maior parte tambm requer certos compostos orgnicos de carbono
como os acares e outros carboidratos. As plantas usam o dixido de carbono, convertendo-o pela fotossntese,
em carboidratos. Muitas bactrias tambm exigem apenas o dixido de carbono como sua fonte nutritiva e
falando sob o ponto de vista nutritivo, tais organismos so autotrficos. Caso possam obter sua energia da luz,
recebem o nome de fotoautotrficos; se a energia for obtida pela oxidao de compostos qumicos so
chamados de quimioautotrficos. outras bactrias so semelhantes aos animais, no sentido de serem incapazes
de usar o CO2 como nica fonte de carbono e de dependerem de organismos autotrficos para a produo de
carboidratos e outros compostos utilizados como alimentos. As formas de vidas que exigem uma fonte orgnica
de carbono so heterotrficas.

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3.1. TIPOS NUTRITIVOS DAS BACTRIAS


Principais tipos nutritivos das bactrias.
Tipo

Fonte de energia para Fonte de carbono Exemplo de gnero


crescimento
para crescimento

FOTOTRFICO
Fotolitotrfico (autotrfico) Luz

CO2

Chromatium

Fotorganotrfico
(heterotrfico)

Comp. orgnico

Rhodopseudomonas

Luz

QUIMIOTRFICO
Quimiolitotrfico
(autotrfico)

Oxidao
de CO2
composto inorgnico

Thiobacillus

Quimiorganotrfico
(heterotrfico)

Oxidao
de Comp. orgnico
composto orgnico

Escherichia

Adaptado de Pelczar/Reid/Chan Microbiologia vol 1.


Fototrficas
Algumas utilizam CO2 como fonte de carbono - fotolitotrficas
Outras necessitam de compostos orgnicos - fotorganotrficas
Quimiotrficas
Organismos do gnero Nitrobacter so capazes de oxidar nitrito a nitratos e fixar o CO2, preenchendo, assim, suas
necessidades de energia de carbono - quimiolitotrficos.
Muitos outros microrganismos quimiotrficos, contudo requerem compostos orgnicos de carbono, dos quais
obtm energia por oxidao - quimiorganotrficos. As bactrias fotolitotrficas e quimiolitotrficas so
conhecidas comumente, como autotrficas, ao passo que as espcies fotorganotrficas e
quimiorganotrficas recebem a designao de heterotrficas.
As bactrias patognicas s plantas so todas quimioheterotrficas, as quais obtm suas energias do metabolismo
de carboidratos, aminocidos ou outros componentes de carbono orgnico, a qual serve tambm como
principais fontes de carbono.
Eutrficas e oligotrficas
{Eutrficas so grupos de bactrias que crescem bem em meio completo rico em nutrientes, enquanto as

oligotrficas podem crescer somente em meio altamente diludos, por exemplo, 10-2 a 10-3 vezes. As oligotrficas
so muito sensveis a vrios compostos orgnicos do meio de cultura, mas o efeito inibitrio da peptona
particularmente pronunciado. Portanto o crescimento de oligotrfas imensamente suprimido em meio
nutriente gar no diludo. Oligotrficas so comuns em bactrias do solo, colnias contadas em meio rico, so
em menor nmero se comparados quelas contadas em meio altamente diludo.
Todas as bactrias patognicas s plantas so eutrficas. Porm Rhizobacter daucus e Rhizomonas suberifaciens,
patgenos descobertos recentemente de galhas da cenoura e raiz corticosa de alface, respectivamente, tem
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comportamento oligotrfico. A descoberta destas bactrias implica se meio altamente diludo for usado para
estudo, mais patgenos de planta oligotrficos pode ser isolado de razes de plantas afetadas por causas no
conhecidas.
- Fontes de carbono:
Todos os organismos requerem alguma fonte de carbono.
*Fonte de dixido de carbono, carboidratos.
*Plantas usam dixido de carbono e converte pela fotossntese em carboidratos.
*Muitas bactrias tambm exigem apenas dixido de carbono como sua fonte nutritiva.
- Tais organismos so: autotrficos.
Quando recebe energia da luz: fotoautotrficos
Quando a energia for obtida pela oxidao de compostos qumicos chamados quimioautotrficos.
* Aqueles que dependem de organismos autotrficos para a produo de carboidratos e outros compostos
utilizados como alimentos so ditos heterotrficos.
- Fonte de nitrognio
* Plantas utilizam nitrognio na forma de sais inorgnicos como nitrato de potssio
* Animais exigem compostos orgnicos como protenas e produtos da sua degradao (peptdeos, aminocidos)
* Bactrias so versteis - Algumas utilizam nitrognio atmosfrico, outros crescem na presena de compostos
nitrogenados inorgnicos ou ainda existem aqueles que retiram nitrognio das protenas ou praticamente
qualquer composto orgnico nitrogenado.
Nitrognio Inorgnico - Sais de amnio e nitratos so comumente utilizados como fonte de nitrognio. Alguns
isolados de Ralstonia solanacearum e B. caryophylli realiza denitrificao, isto , produzem gs a partir de nitrato sob
condies anaerbias.
Nitrognio orgnico - nitrognio orgnico comumente fornecidos na forma de aminocidos, peptona,
extrato de carne, extrato de levedura. Peptona um excelente nutriente porque contem quase todos os
aminocidos necessrios para o crescimento das bactrias, e ainda proporciona um bom efeito tamponante ao
meio. Extrato de carne e extrato de levedura so fontes ricas em vitaminas e so usados em combinao com a
peptona para acelerar o crescimento bacteriano.
Fsforo e enxofre
* Alguns organismos exigem compostos orgnicos de enxofre, outros so capazes de utilizar compostos
inorgnicos, um terceiro grupo pode mesmo utilizar enxofre elementar.
* Fsforo suprido usualmente na forma de fosfato.
- Elementos minerais
Bactrias exigem vrios elementos minerais para o seu desenvolvimento normal. (sdio, potssio, clcio
magnsio, mangans, ferro, zinco, cobre, fsforo e cobalto).

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- Vitaminas
Bactrias apresentam comportamento varivel. Embora todas as bactrias exijam vitaminas para o seu processo
metablico normal, alguns so capazes de sintetizar todas as vitaminas.
- gua Todos os nutrientes devem ser dissolvidos em gua antes de poderem ser absorvidos pelas bactrias.
Os dez principais bio-elementos, suas fontes e funes no microrganismo.
Elemento

Fonte

Composto orgnico, CO2

O2, H2O, Composto orgnico.

H2, H2O, Composto orgnico.

NH4+, NO3-, N2, Composto orgnico.

Funo no metabolismo

Principais constituintes do material celular

SO42-, HS-, S0, S2, S2O32-, Composto Constituinte da cistena, metionina, fosfato
orgnico.
de tiamina, coenzima A, biotina e cido lipico.

HPO4-2

Constituinte
do
cido
fosfolipdeos, e nucleotdeos.

K+

Principal ction inorgnico na clula,


cofator de algumas enzimas.

Mg
Ca

Fe

nuclico,

Cofator de diversas enzimas. Presente na


parede celular, membranas e ster fosfato.

Mg2+

Cofator de enzimas; presentes em


exoenzimas
(amilases
e
proteases);
dipicolinato de clcio, o componente mais
importante dos endospros.

Ca2+

Presente nos citocromos, ferrodoxinas, e


outras protenas ferro-sulforosas; cofator de
enzimas (algumas desidratases)

Fe2+ , Fe3+

Adaptado de Pelczar/Reid/Chan Microbiologia vol. 1

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Bio-elementos de menor importncia, suas fontes e funes nos microrganismos.


Elemento

Fonte

Funo no metabolismo

Zn

Zn2+

Presente em lcool dehydrogenase, fosfatase alcalina,


aldolase, RNA e DNA polimerase.
Presente no superxido dismutase da bactria, cofator de
algumas enzimas (PEP carcoxikinase, re-citrato sintase).

Mn

Mn2+

Na

Na+

Cl

Cl-

Mo

MoO42-

Presente em nitrato reductase, nitrogenase, e formato


desidrogenase.

Se

SeO32-

Presente em glycine reductase e formato dehydrogenase.

Co

Co2+

Presentes em enzimas contendo coenzima B12 (glutamate


mutase, methylmalonyl-CoA mutase).

Cu

Cu2+

Presente em citocromo oxidase e oxigenases.

WO42+

Presente em algumas desidrogenases de formato.

Ni

Ni2+

Presente em urease; requerido para crescimento autotrfico


de bactrias oxidadora de hidrognio.

Requerido por bactrias haloflicas.

3.2. CONDIES FSICAS NECESSRIAS AO CRESCIMENTO


- Temperatura
Uma vez que todos os processos de crescimento dependem de reaes qumicas, e que essas reaes so
influenciadas pela temperatura, o crescimento bacteriano pode ser profundamente afetado por estas condies.
* Temperatura determina em parte ritmo e quantidade total de crescimento.
* Variao trmica pode influenciar os processos metablicos e a morfologia celular.
- Cada espcie de bactria cresce sob temperaturas situadas em faixas caractersticas.
1) Bactrias psicrfilas: so aquelas capazes de crescerem a zero C ou menos embora seu timo esteja
dependendo de temperaturas mais elevadas prximo de 15 ou 20 C. Diversas espcies da Antrtida podem
crescer a -7 C, mas com o timo entre 20 e 30 C.
2) Bactrias mesfilas: so aquelas que crescem melhor em temperaturas situadas entre 25 e 40 C.
3) Bactrias termfilas: so aquelas que crescem melhor em temperaturas entre 45 e 60 C.
- Exigncias atmosfricas
Os principais gases que afetam o crescimento bacteriano so o oxignio e o dixido de carbono.
1) Bactrias aerbias so aquelas que crescem na presena de oxignio livre.

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2) Bactrias anaerbias so aquelas que crescem na ausncia de oxignio livre.


3) Bactrias anaerbias facultativas so aquelas que crescem tanto na presena como ausncia de oxignio
livre.
4) Bactrias microaerfilas so aquelas que crescem na presena de pequena quantidade de oxignio livre 1015%

- Acidez e alcalinidade (pH)


Para a maioria das bactrias, o timo de pH para o crescimento se situa entre 6,5 e 7,5, mas alguns podem viver
nos limites extremos de pHs. Variaes mnimas e mximas para a maioria das espcies esto entre 4 e 9.
* Alterao de pH corrigido com tampes. Combinao de KH2PO4 e K2HPO4

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4. Reproduo e Crescimento
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Reproduo
No crculo de crescimento das bactrias o processo mais comum e sem dvida o mais importante a fisso
binria transversal na qual uma nica clula se divide em duas aps desenvolver uma parede celular transversal.
um mtodo de reproduo assexuada.
-A fisso binria no o nico mtodo de reproduo entre bactrias.
Streptomyces: produzem muitos esporos reprodutivos (cada esporo da origem
a um novo indivduo).
Nocardia: produz filamentos que se fragmentam e produzem clulas bacilar ou cocides.

Crescimento
Velocidade de crescimento e tempo de gerao
- Processo de reproduo: fisso binria, uma clula se divide formando 2 clulas.
20 21 22 23 24 ......2n
* Tempo de gerao: tempo necessrio para que uma se divida ou para que a populao se duplique.
* O tempo de gerao no o mesmo para todas as bactrias.
Ex. Para E. coli de 17 min. j para outras pode ser de muitas horas.
Para fins de ilustrao, imagine-se a situao hipottica seguinte. Uma bactria inoculada num meio de cultura
e, aps ter decorrido o tempo de gerao deste microrganismo, h duas clulas; depois de outra gerao, quatro
clulas; aps 3 geraes, oito clulas em cada uma das geraes sucessivas, admitindo-se a ausncia de mortes, a
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populao dobra em nmero de seus indivduos. A relao entre os nmeros de clulas e de geraes pode ser
expressa numa srie de equaes.
B = nmero de bactrias inoculadas no meio ou contagem bacteriana no tempo zero;
b = nmero de bactrias ao fim de um dado perodo de tempo;
t = perodo de tempo
G = tempo de gerao;
n = nmero de geraes;
log = logaritmos decimais (logaritmos comuns).
Iniciando a experincia com uma nica clula, a populao total b, ao fim de um dado tempo, seria expressa
como:

b = 1 x 2n
onde, 2n a populao bacteriana aps a n-sima gerao. Em termos prticos, contudo, o nmero de bactrias
B, introduzido no meio da cultura no tempo zero, no igual a 1, mas vrios milhares, de modo que a formula se
modifica:
b = B x 2n (2)
Resolvendo a equao (2) para n, obtm-se:
log b = log B + n log 2
log b - log B
n =

(3)

log 2
Substituindo o valor de log 2, que 0,301, chega-se a:
b
n = 3,3 log (4)
B
Assim, usando a equao (4), pode-se calcular o nmero de geraes ocorridas, desde que se conhea a
populao inicial B e a populao b, aps o tempo t.
O tempo de gerao G igual ao tempo t (tempo decorrido entre b e B), dividido pelo nmero de geraes n,
ou:
tt
G = =
n 3,3 log (b/B)

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Tempos de gerao de diversas espcies de bactrias.


Bactria

Meio

Temp. C

Tempo de gerao
(minutos)

Bacillus mycoides

caldo

37

28

B. thermophilus

caldo

55

18,3

Escherichia coli

caldo

37

17

leite

37

12,5

Lactobacillus acidophilus

leite

37

66-87

Mycobacterium tuberculosis

sinttico

37

792-932

Rhizobium japonicum

sais minerais + extrato de 25


levedura + manitol

344-461

Staphilococcus aureus

caldo

37

27-30

Streptococcus lactis

caldo lactose

37

48

leite

37

26

teste em coelho

37

1980

Treponema pallidum

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Tempo de gerao de bactrias fitopatognicas


Bactria

Tempo
(min)

Erwinia amylovora

78

Estacionria

E. carotovora subsp. carotovora

25-30

Agitao

E. chrysanthemi pv. zeae

25

Estacionria

E. herbicola

25-30

Estacionria

Pantoea aglomerans pv. milletiae

25-30

Estacionria

Ralstonia solanacearum

66

Estacionria

P. syringae pv. syringae

73

Estacionria

P. syringae pv. apii

80

Estacionria

Xanthomonas axonopodis pv. citri

90

Estacionria

X. a. pv. phaseoli

134

Estacionria

X. oryzae pv. oryzae

90

Agitao

X.arboricola pv. pruni

92

Agitao

Rhodococcus facians

88

Estacionria

pv. 80

Estacionria

Curtobacterium
Flaccumfaciens
Clavibacter
michiganensis

flaccumfaciens
michiganensis

de

duplicao Mtodo de cultivo

subsp. 115

Estacionria

Agrobacterium tumefaciens

78

Estacionria

A. rhizogenes

121

Estacionria

Adaptado de Goto, M. Fundamentals of Bacterial Plant Pathology.


Ciclo normal de crescimento (curva de crescimento de cultura bacteriana).
* Fase lag: populao bacteriana permanece inalterada temporariamente, mas no significa que as clulas
estejam em repouso ou dormente; ao contrrio durante esta etapa as clulas aumentam de tamanho alm de suas
dimenses normais. So fisiologicamente ativas e esto sintetizando um novo protoplasma, adaptando ao novo
ambiente.
- Ao final da fase lag cada clula se divide.
- Nem todos completa a sua etapa lag simultaneamente.
- Ocorre um aumento gradual da populao at o trmino dessa fase.
* Fase logartmica ou exponencial: durante este perodo as clulas se dividem firmemente, num ritmo
constante, e o logaritmo do nmero de clulas relacionado com o tempo resulta numa linha reta. Em condies
apropriadas, o ritmo de crescimento mximo durante esta fase.
* Fase estacionria: A fase logartmica do crescimento comea a diminuir depois de vrias horas, outra vez de
forma gradual, representada por uma curva de transio entre uma linha reta (fase logartmica) e outra, que a
fase estacionria. Esta tendncia para o fim do crescimento pode, ser atribudo a uma srie de circunstncias,
particularmente, exausto de alguns nutrientes e, com menos frequncia, produo de produtos txicos. A
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populao permanece constante durante um certo tempo, talvez como resultado da completa cessao das
divises ou do equilbrio entre o ritmo de reproduo e o equivalente ritmo de morte.
* Fase de declnio ou de morte. Depois do perodo estacionrio, as bactrias podem morrer mais rapidamente
do que a produo de novas clulas, se, de fato, algumas bactrias ainda estiverem reproduzindo-se.
{Indubitavelmente vrias condies contribuem para a morte da bacteriana, mas as mais importantes so a
depleo de nutrientes essenciais e o acmulo de substncias inibidoras tais como os cidos. Durante a fase de
morte, o numero de clulas viveis decresce geometricamente (exponencialmente), em essncia, o inverso do
crescimento durante a fase log. As bactrias morrem em velocidades diferentes, tal como se comportam em
relao ao crescimento. Algumas espcies de cocos Gran-negativos muito rapidamente, de modo que podem
restar algumas poucas bactrias vivas aps 72 horas ou menos de incubao. Outras, porm, morrem to
lentamente que h clulas viveis depois de meses e at anos.

Curva de crescimento tpica de bactrias. (A) fase lag; (B) fase log (logartmica); (C) fase estacionria; (D) fase de
morta ou de declnio.

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5. Classificao das Bactrias Fitopatognicas


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REINO PROCARIOTAE
5.1. DIVISO I - Gracilicutes
Procariotos com parede celular fina, contendo o tipo de parede Gram-negativa, com clulas tipo esfera,
bastonete ou curvo e hlice. As bactrias fitopatognicas so todas, do tipo bastonete com raras excees. A
maioria das bactrias fitopatognicas de importncia econmica esto includas aqui.
5.1.1. CLASSE - Proteobacteria - maioria bactrias unicelulares.
Famlia Pseudomonadaceae (antiga clasificao)

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Espcies, biovares e patovares de pseudomonas organizadas de acordo com a homologia de rRNA e DNA.
Reclassificao do grupo de homologia de rRNA do gneros Pseudomonas (antiga denominao)
(Fitopatognicas).
Grupo
rRNA

de

homologia Gneros

Pseudomonas (Fluorescentes)

II

Burkholderia, Ralstonia (Grupo Burkholderia)

III

Acidovorax (Comamonadaceae)

IV
V

Xanthomonas (Grupo Xanthomonas)

GRUPO Pseudomonas
{Gnero Pseudomonas - (espcie tipo - Pseudomonas aeruginosa) (Grupo I rRNA). Bastonete reto,
raramente curvo, Mvel com, normalmente, mais de um flagelo polar (lofotrquio). Colnia, branca, cinza-claro
ou creme. So estritamente aerbios. Este gnero, alm de bactrias fitopatognicas, contm espcies epfitas e
saprfitas, cujos habitats so a rizosfera, o solo, a superfcie de plantas, os restos de cultura e gua. H tambm
patgenos de animais. Causa numerosas manchas foliares, queimas, murchas vasculares, podrides moles,
cancros e galhas.
Gnero Rhizobacter - (espcie tipo - Rhizobacter daucus). So bastonetes retos ou ligeiramente curvos e
Gram negativos. Mveis por flagelos polar ou lateral ou ambos ou imveis. So aerbios. Colnia branca ou
branca-amarela. Crescimento flocular consistindo de unidade globular em meio lquido. Causa a galha bacteriana
da cenoura.
Gnero Rhizomonas - (espcie tipo - Rhizomonas suberifaciens). Bastonetes retos ou ligeiramente curvos.
Mveis, por um flagelo lateral, subpolar ou polar, ou imveis. Colnias brancas ou amareladas lisa ou vincada.
So aerbias. Causa a raiz corticosa da alface
Grupo Burkholderia
Gnero Burkholderia - (espcie tipo - Burkholderia cepacia) (Grupo II rRNA). Bastonete reto, raramente
curvo, Mvel com, normalmente, mais de um flagelo polar (lofotrquio). Colnia, branca, cinza-claro ou creme.
So estritamente aerbios Causa numerosas manchas foliares, queimas, murchas vasculares, podrides moles,
cancros e galhas.
Gnero Ralstonia - (espcie tipo - Ralstonia picketii) (Grupo II rRNA). Bastonete reto, raramente curvo,
Mvel com, normalmente, mais de um flagelo polar (lofotrquio). Colnia, branca, cinza-claro ou creme. So
estritamente aerbios. Causa numerosas manchas foliares, queimas, murchas vasculares, podrides moles,
cancros e galhas. Ex. murcha bacteriana do tomateiro (Ralstonia solanacearum).
Grupo Xanthomonas
Gnero Xanthomonas - (Homologia DNA-rRNA Grupo V). Bastonete reto mvel por um nico flagelo
polar (monotrquia). Colnia quase sempre amarela, havendo trs espcies que apresentam colnia branca. So
estritamente aerbios. Produo de pigmento amarelo (xanthomonadina). Causa manchas em folhas frutos,
queimas em plantas anuais, perenes. Murcha vascular e cancro em citrus.
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Gnero Xylella - (espcie tipo - Xylella fastidiosa). Bastonete reto (pode haver bastonete ligeiramente curvo).
No mvel. Colnia de dois tipos: lisa e rugosa, ambas opalescentes e circulares. So estritamente aerbios. No
cresce em meios comuns usados em fitopatologia, pois exigente em vrios componentes qumicos. Habitante
do xilema. Causa; a pierce disease da videira, phony disease do pessegueiro, a clorose variegada do citrus (CVC)
etc..
Famlia Comamonadaceae
Gnero Acidovorax - (espcie tipo - Acidovorax avenae) (Grupo III rRNA). Bastonetes retos ou
ligeiramente curvos, mveis por um nico flagelo polar. Causa; mancha foliar em milho, orqudias e melncias.
Gnero Xylophilus - (espcie tipo - Xylophilus ampelinus). So bastonetes retos ou ligeiramente curvos,
Gram negativos, moveis por um flagelo polar. So aerbios estritos. Causa a necrose bacteriana e cancro da
videira.
Famlia Rhizobiaceae
Gnero Agrobacterium - Bastonete reto. Mvel por um a seis flagelos subpolares ou peritquios. Colnia
branca. So estritamente aerbios. O processo da doena devido presena de plasmdeo especfico na clula
da bactria, A. tumefaciens (galha) A. rhizogenes (raiz), A. radiobacter (avirulento).
Gnero Liberobacter - Causa o greening dos citros. Bactria de floema.
Famlia Enterobacteriaceae
Gnero Enterobacter - E. cloacae tem sido reportado causando a descolorao marrom do fruto do mamo
atraves da infeco oportunistica. Erwinia herbicola, epfita comum, muitas vezes referidos como sinnimo de
Enterobacter agglomerans.
Gnero Erwinia - (espcie tipo - Erwinia amylovora). Bastonete reto Gram-negativo anaerbio facultativo.
Mvel por flagelos peritrquios, com uma exceo (E. stewartii). Colnia branca ou amarela. Algumas espcies
possuem enzimas pectinolticas e, portanto, so capazes de provocar a podrido mole em tecido vegetal.
A classificao dos isolados em Pantoea spp. baseado nas difernas na hibridao de
Gnero Pantoea DNA-DNA. A investigao desta parte da Enterobacteriaceae incompleta, e a aplicao da nomenclatura
necessita ser levada em conta espcies altamente relacionadas da Enterobacter e Erwinia.
Gnero Serratia - So membras das enterobacterias gram negativas com flagelos peritriquios. Geralmente
formam colnias roseas. S. proteomaculans e S. marcescens tem sido reportado como patogenicos a plantas. O
primeiro tem sido reportado causando mancha bacteriana em Protea cynaroides e o segundo causando a podrido
da coroa em alfafa.
5.2. DIVISO II - FIRMICUTES: procariotos com parede celular espessa e forte, indicando o tipo Grampositivo de parede celular.
5.2.1. CLASSE FIRMIBACTERIA
Gram positivas, bastonetes formadoras de espros com ou sem flagelos peritrquios.
Gnero Bacillus - So aerbios ou aerbioas facultativos. Causa varias doenas tais como podrido da batata
em armazenamento (Bacillus sp.), podrido da folha do fumo em processo de secagem (Bacillus sp.), podrido da
muda de tomate (Bacillus sp.), podrido da soja (Bacillus sp.), estrias brancas do trigo (B. megaterium pv. cerealis).
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Gnero Clostridium - So estritamente anaerbios. Causa a podrido da folha do fumo em processo de


secagem e Sindrome da madeira molhada do lamo e do olmo.
5.2.2. CLASSE THALLOBACTERIA
Bastonetes irregulares, sem esporos, Gram-positivas.
Gnero Arthrobacter - (espcie tipo - Arthrobacter globiformis). A nica espcie fitopatognica deste
gnero Arthrobacter ilicis, que a nova designao de Corynebacterium ilicis. Bastonete e coco. Mvel. Aerbio
estrito. Colnia amarela. Causa a queima bacteriana do azevinho americano.
Gnero Clavibacter - (espcie tipo Clavibacter michiganensis). Bastonetes pleomrficos, ou seja, com
formas diversas. No mvel. Aerbio estrito. Colnia amarela. (Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis). Causa
murcha bacteriana em tomate, alfafa, batata e cancro em tomateiro (Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis).
Gnero Curtobacterium - (espcie tipo Curtobacterium citreum). Bastonete curto, irregular. Mvel por
flagelos laterais. Aerbio estrito.Colnia amarela, alaranjada ou rsea. (Curtobacterium flacunfaciens pv. flacunfaciens).
Causa murcha em feijoeiro e outras plantas.
Gnero Rathayibacter - (espcie tipo Rathayibacter rathayi). R. iranicus, R. rathayi, R. tritici. Estas espcies
causam exudaes amareladas (gomose) na inflorescncia, nos gros em formao e tambm nas folhas e
distores foliares em trigo e em vrias espcies de gramneas anuais. So bactrias associadas com nematoides
do gnero Anguina, necessitando destes como vetores.
NOCARDIFORMES
Gnero Nocardia - Apenas uma espcie tem sido relatada como patgeno de planta (N. vaccinii).
Gnero Rhodococcus - (espcie tipo Rhodococcus rhodochrous). A nica espcie fitopatognica deste
gnero Rhodococcus facians. Clulas de vrias formas (pleomrficas), podendo haver formao de hifas, mas no
de esporos. Aerbio estrito. No mvel. Colnia alaranjada, cor-de-rosa ou vermelha. Causa a fasciao da
ervilha doce.
STREPTOMYCETOS
Gnero Streptomyces - (espcie tipo Streptomyces albus). Apresenta colnia de crescimento lento com
aspecto granular, pulverulento e aveludado. H desenvolvimento areo de miclio, que ramificado, no
fragmentado e com cadeia de trs ou mais esporos redondos, ovais ou cilndricos. Gram positiva. So aerbios.
Causa a sarna da batatinha (S. scabies).
5.3. DIVISO III - TENERICUTES: procariotos desprovidos de parede celular, envolvido apenas pela
membrana plasmtica. So denominados de micoplasmas, incluindo a Classe Mollicutes. Tem reao Gramnegativa. Alguns requerem meios complexos para crescimento e penetram a superfcie do meio de cultura,
formando colnias do tipo ovo-frito.
5.3.1. CLASSE - MOLICUTTES
Famlia - Spiroplasmataceae
Gnero Spiroplasma - (espcie tipo - Spiroplasma citri). No possui parede celular. Insensvel penicilina.
Sensvel tetraciclina. Forma variada (pleomorfismo), inclusive helicoidal. No mvel alguma espcies tem
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movimento por deslizamento em superfcie mida e a forma helicoidal tem movimento rotatrio e por flexo.
Requer esteris (colesterol) para crescer. A principal espcie fitopatognica a Spiroplasma citri agente causal da
Stubborn disease (doena teimosa) do citrus.
Famlia (s) - ainda no conhecidas
Gnero no definido, MLO (Mycoplasma-Like-Organism). Organismos pleomorficos sem parede celular.
Morfologicamente se assemelha ao micoplasma. Atualmente mais conhecido como fitoplasmas. Causam
numerosas doenas conhecidas como, amarelo, superbrotamento e declnio em rvores e algumas plantas anuais.
5.4. OUTRAS BACTRIAS.
Vrios outros gneros incluem bactrias relatadas como patognicas para as plantas.
Gnero Acetobacter e Gluconobacter - Causa a chamada doena rosea do abacaxi e a podrido marrom da
ma e da pera. Estes patgenos so oportunistas e no tem capacidade de afetar outros orgos alm do fruto.
5.5. BACTRIAS FASTIDIOSAS
So aquelas que no crescem em meios de cultura utilizados rotineiramente em bacteriologia.
Grupo das Riquetsias: Bactrias baciliformes, de parede celular rgida; patgenos dos sistemas vasculares.
Grupo dos Micoplasmas: Bactrias sem parede celular e sem forma definida.
Grupo dos Espiroplasmas, sem parede celular rgida.
Bactrias do raquitismo da cana de acar e de outras gramneas
Xylella fastidiosa - bactria causadora da clorose variegada dos citros.
Clavibacter xyli subsp. cynodontis - causa o raquitismo da grama bermuda (Cynodon dactylon); Bermuda-grass stunting.
Clavibacter xyli subsp. xyli - raquitismo da soqueira da cana-de-acar; ratoon stunting disease.
Obs: A diagnose de doenas causadas por bactrias fastidiosas so, feitas atravs de exames de cortes ultra-finos
em microscpio eletrnico e pela reao ou reproduo de sintomas em plantas testes inoculadas mecanicamente
com o suco do tecido da planta doente, atravs de vetores ou por enxertia.

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Classificao das categorias superiores de Procariotos e afiliao das bactrias fitopatognicas


Reino

Diviso

Classe

Atributo

Famlia

Gracilicutes

Proteobacteria

No fotos- Enterobacteriaceae
sinttico

Gnero
Enterobacter
Erwinia
Pantoea
Serratia

Pseudomonadaceae

Pseudomonas
Rhizobacter
Rhizomonas

Grupo Burkholderia

Burkholderia
Ralstonia

Grupo Xanthomonas

Xanthomonas
Xylella

Comamonadaceae

Acidovorax
Xylophilus

Rhizobiaceae
Procariotae

Agrobacterium
Liberobacter

Firmicutes

Firmibacteria

Simples
(G+)

Bacillus Clostridium

Tallobacteria

Ramifi-cado
(G+)

Arthrobacter
Clavibacter
Curtobacterium
Nocardia
Rathayibacter
Rhodococcus
Streptomyces

Tenericutes

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Mollicu-tes

ProcariotoSe Spiroplasmataceae
m parede

Spiroplasma

Afiliao incerta

Fitoplasma

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6. Espcies de Bactrias Fitopatognicas


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Classificao atualizada, segundo Sub-Comit de Taxonomia de Bactrias Fitopatognicas - ISPP. Names of


plant pathogenic bacteria 1864-1995. Review of Plant Pathology 75(9): 721-763, 1996.)
Grupo Pseudomonas
Fluorescentes:
Gnero Pseudomonas
P. agarici
P. amygdali
P. asplenii
P. betle
P. caricapapayae*
P. cichorii*
P. cissicola
P. corrugata*
P. ficuserectae
P. flectens
P. fuscovaginae
P. hibiscicola
P. marginalis*
pv. alfalfae
pv. marginalis*
pv. pastinacae
P. meliae
P. rubrisubalbicans
P. savastanoi
pv. glycinea*
pv. phaseolicola
pv. savastanoi
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28

P. syringae* (51 patovares)


pv. apii*
pv. coronafaciens
pv. garcae*
pv. helianthi
pv. hibisci
pv. lachrymans*
pv. passiflorae
pv. pisi
pv. sesami
pv. striafaciens
pv. syringae*
pv. tabaci*
pv. tomato*
P. syzygii
P. tolaasii
P. viridiflava*
Comamonadaceae
No fluorescentes
Gnero Acidovorax
A. avenae (Pseudomonas avenae)
subsp. avenae (P. rubrilineans; P. alboprecipitans) *
subsp. cattleyae (P. cattleyae)
subsp. citrulli (P. pseudoalcaligenes subsp. citrulli)
A. konjaci (P. pseudoalcaligenes subsp konjaci)
Grupo Burkholderia
No Fluorescentes
Gnero Burkholderia
B. andropogonis (Pseudomonas andropogonis; P. woodsii)
B. caryophylli (P. caryophylli)*
B. cepacia (P. cepacia)*
B. gladioli (P. gladioli)
pv. agaricicola
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pv. alliicola*
pv. gladioli*
B. glumae (P. glumae)
B. plantarii (P. plantarii)
Gnero Ralstonia
R. solanacearum*
R. pickettii
R. syzigii
(P. rubrisubalbicans)
Grupo Xanthomonas
GNERO, Xanthomonas spp.

Xanthomonas albilineans*

X. Cucurbitae

X. fragariae*

X. hortorum

X. oryzae*

X. hyacinthi

X. populi*

X. melonis

X. campestris*

X. pisi

X. axonopodis

X. sacchari

X. arboricola

X. theicola

X. bromi

X. translucens

X. cassavae

X. vasicola

X. codiaei

X. vesicatoria

* Espcies existentes antes da reclassificao


Reclassificao de Xanthomonas
Em Julho de 1995, foi proposta a reclassificao de Xanthomonas baseado no estudo da hibridao DNA-DNA
(Valterim et al.).
Nomes validados pela reviso de 1996 (Young, J. M. et al. Names of plant pathogenic bactria 1864-1995. Review
of Plant Pathology 75: 721- 763. 1996).
Patovares de Xanthomonas arboricola
pv. celebensis

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pv. corylina

pv. juglandis

pv. populi

pv. pruni

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Patovares de Xanthomonas axonopodis


axonopodis

alfafae

bauhiniae

begoniae

beticola

biophyti

cajani

cassiae

citri

clitoriae

coracanae

cyamopsidis

desmondii

desmondiigangentici

desmondiilaxiflori

desmondiirotundifolii

dieffenbachiae

erythrinae

fascicularis

glycines

khayae

lespedezae

maculifoliigardeniae

malvacearum

manihotis*

martyniicola

mehlusii

nakataecorchori

patelii

pedalii

phaseoli

phillanthi

physalidicola

poinsettiicola

punicae

rhynchosiae

ricini*

Sesbaniae

tamarindi

vasculorum

vignaradiatae

Vignicola

vitians

* Apigmentada
Patovares de Xanthomonas campestris
pv. aberrans

pv. armoraciae

pv. barbareae

pv. campestris

pv. incanae

pv. plantaginis

pv. raphani

pv.alangii

pv. amaranthicola

pv. amorphophalli

pv. aracearum

pv. arecae

pv. argemones

pv. arracaciae

pv. asclepiadis

pv. azadirachtae

pv. badrii

pv. betae

pv. bilvae

pv. blepharidis

pv. boerrhaaviae

pv. brunneivaginae

pv. cannabis

pv. cannae

pv. carissae

pv. centellae

pv. clerodendri

pv. convovuli

pv. coriandri

pv. daturae

pv. durantae

pv. esculenti

pv. eucalypti

pv. euphorbiae

pv. fici

pv. guizotiae

pv. gummisudans

pv. heliotropii

pv. ionidii

pv. lantanae

pv. laureliae

pv. lawsoniae

pv. leeana

pv. leersiae

pv. malloti

pv. mangiferaeindicae*

pv. merremiae

pv. mirabilis

pv. musacearum

pv. nigromaculans

pv. obscurae

pv. olitorii

pv. papavericola

pv. parthenii

pv. passiflorae

pv. paulliniae

pv. pennamericanum

pv. phormiicola

pv. physalidis

pv. sesami

pv. spermacoces

pv. syngonii

pv. tardicrescens

pv. thespesiae

pv. thirumalscharii

pv. tribuli

pv. trichodesmae

pv. uppalii

pv. vernoniae

pv. viegasii

pv. viticola*

pv. vitiscarnosae

pv. vitistrifoliae

pv. vitiswoodrowii*

pv. zantedeschiae

pv. zingibericola

pv. zinniae
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*Apigmentada
Patovares de Xanthomonas hortorum
pv. carotae

pv. hederae

pv. pelargonii

pv. taraxaci

Patovares de Xanthomonas oryzae


pv. oryzae

pv. oryzicola

Patovares de Xanthomonas translucens


pv. arrhenatheri

pv. cerealis

pv. graminis

pv. phlei

pv. pheipratensis

pv. poae

pv. secalis

pv. translucens

pv. undulosa
ESPCIES ATUALMENTE VLIDAS DE CORINEBACTRIAS FITOPATOGNICAS E AS
DOENAS CAUSADAS.

Arthrobacter
Arthrobacter ilicis

Clavibacter spp.
Clavibacter michiganensis subsp. insidiosus
Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis
Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus
Clavibacter michiganensis subsp. tesselarius.
Clavibacter michiganensis subsp. nebraskensis
Clavibacter tritici
Clavibacter xili subsp. xili
Clavibacter xili subsp. cynodontis

Curtobacterium spp.
Curtobacterium flaccumfaciens pv. betae
Curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccumfaciens
Curtobacterium flaccumfaciens pv. oortii
Curtobacterium flaccumfaciens pv. poinsetiae

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Rathayibacter spp.
R. iranicus,
R. rathayi,
R. tritici.

Rhodococcus sp.
Rhodococcus facians
MEMBROS DA FAMLIA ENTEROBACTERIACEAE
GNEROS (Erwinia, Enterobacter, Pantoea e Serratia)
ESPCIES de Erwinia
{As diferentes espcies do gnero Erwinia podem ser divididas em trs principais grupos: amylovora, ou no
causadora de podrido mole; herbicola ou erwinias amarelas; e carotovora ou causadora de podrido mole. Esta
diviso, no entanto, mais uma forma didtica que permite ter uma melhor visualizao dos diferentes tipos que
compe o gnero Erwinia. Na realidade impossvel colocar uma linha divisria entre estes grupos devido
existencia de muitas formas intermedirias.
Grupo amylovora
As espcies deste grupo so:

E. amylovora.
E. tracheiphila.
E. mallotivora.
E. rubrifaciens.
E. quercina.
E. salicis.
E. psidii. Agente causal do crestamento foliar e das brotaes da goiabeira. Ocorre apenas no Brasil e aqui a
nica representante do grupo amylovora.
Grupo herbicola
Constituida praticamente pelas variantes de E. herbicola que so predominantemente epfitas, tanto da parte
area como das raizes
E. herbicola,
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Espcie deste grupo:


E. herbicola pv. gypsophilae
Grupo carotovora
Agrupa as erwinias causadoras de podrido mole. As mais importantes so a Erwinia carotovora e a E.
chrysanthemi.
E. carotovora distinguida em cinco subespcies
subsp. atroseptica,
subsp. betavasculorum,
subsp. carotovora,
subsp. odorifera
subsp. wasabiae
E. chrysanthemi possui seis patovares.
pv. chrysanthemi
pv. zeae
pv. dianthicola
pv. dieffenbachiae
pv. paradisiaca
pv. partheni
As outras erwinias colocadas neste grupo so:
E. cypripedii
E. rhapontici
GNERO Enterobacter
Enterobacter cancerogenus
Enterobacter dissolvens
Enterobacter minipressuralis
Enterobacter pyrinus
GNERO Pantoea

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A classificao dos isolados em Pantoea spp. baseado nas difernas na hibridao de DNA-DNA. A
investigao desta parte da Enterobacteriaceae incompleta, e a aplicao da nomenclatura necessita ser levada
em conta espcies altamente relacionadas da Enterobacter e Erwinia.
As espcies deste gnero so:
Pantoea aglomerans
P. aglomerans pv millettiae (E. herbicola pv. millettiaea) encontrada no Brasil.
Pantoea ananas
P. ananas pv. ananas (E. ananas = E. herbicola pv. ananas).
P. ananas pv. uredovora
Pantoea stewartii (E. stewartii) e estava incluida no grupo herbicola por ser uma bactria que forma colnia amarela.
Considerada Enterobacteriaceae por ser fermentativa (anaerbia facultativa), mas no possui flagelos.
P. stewartii subsp. indologenes
P. stewartii subsp. stewartii

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reproduzida sem a autorizao da Editora.

Ttulo: Bactrias Fitopatognicas


Autor: Carlos Hidemi Uesugi
Editora: CopyMarket.com, 2000

7. Aulas Prticas
Carlos Hidemi Uesugi
7.1. CARACTERSTICAS CULTURAIS DAS BACTRIAS
Para descrever as caractersticas culturais das colnias bacterianas necessrio considerar quanto aos diferentes
aspectos que estas colnias apresentam. Os mais relevantes so:
1) Quanto ao crescimento.
avaliado em funo do tempo necessrio para que uma colnia, desenvolvida a partir de uma clula, se torne
claramente visvel e definida sobre o meio de cultura. Para a identificao de bactrias fitopatognicas o
crescimento das colnias podem ser classificadas em:
Muito rpido: Menos de um dia.
Rpido: Entre 1 e 2 dias.
Mdio: Entre 2 e 3 dias.
Lento: Entre 3 e 4 dias.
Muito lento: Mais de 4 dias.
2) Quanto forma:
Puntiforme Circular Irregular
3) Quanto elevao:
Convexa Elevada Achatada Umbonada Irregular
4) Quanto margem:
Lisa Serrilhada Ondulada Lobada Filamentosa
5) Quanto consistncia:
Mucosa, fluida, micelial.
6) Quanto superfcie:
Lisa, rugosa.
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7) Quanto ao brilho:
Brilhante, translcido, opaco.
8) Quanto cor:
Amarela, amarela creme, branca, branca acinzentada, etc..
9) Outras caractersticas.
- Estas caractersticas so definidas em funo do meio de cultura e temperatura de incubao utilizada e da idade
da cultura.
- Para as bactrias fitopatognicas so utilizados normalmente os meios NDA (nutriente, dextrose, agar) e 523
(de Kado e Hesket) e a temperatura de 25 a 30 C.
- A idade da cultura para a observao das caractersticas culturais varia com o seu crescimento. Nas bactrias de
crescimento rpido feita at 2 dias; nas de crescimento mdio pode ser de 3 a 4 dias; nas lentas, de 4 a 6 dias e
nas muito lentas, de 5 a 10 dias ou mais.
7.2. ROTEIRO PARA DIAGNOSE DE DOENAS BACTERIANAS
I. Sintomas de doenas bacterianas
Os primeiros dados a serem considerados na diagnose de uma doena de planta so os sintomas causados na
hospedeira e as condies ambientais sob as quais esta doena foi constatada.
Os principais sintomas de doenas bacterianas esto listados abaixo:
01. Manchas foliares:
a) Manchas
b) Manchas angulares pequenas (geralmente numerosas) leses do limbo foliar delimitada pelas nervuras
secundrias.
c) Manchas com halo - Causadas pelas bactrias produtoras de certas toxinas que, ao difundirem nos tecidos
adjacentes, causam degeneraes da clorofila, formando um halo amarelo ao redor da leso ou da mancha.
d) Crestamento - Grandes leses necrticas. Podem ser tambm resultantes da coalescncia de leses menores.
e) Estrias - Leses alongadas, geralmente observadas em folhas de gramneas.
Obs: Uma das caractersticas peculiares das leses bacterianas o encharcamento dos tecidos afetados no
incio do desenvolvimento das doenas. Exudao de pus outra caracterstica comum em leses bacterianas.
02. Leses nas hastes, pecolos e frutos:
a) Manchas
b) Podrides
c) Cancros (Leses abertas)
03. Murchas vasculares ou infeces vasculares:
a) Murcha
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b) Morte descendente
04. Podrides moles
a) Podrides moles ( comum em hortalias tenras em perodos midos, tanto no campo, como em pscolheita).
b) Canela preta (Podrido mole da medula das hastes da batata)
c) Talo oco (Podrido mole da medula da haste do tomateiro)
Obs: A podrido mole, causada pelas bactrias que produzem grande quantidade de enzimas pectolticas. As
enzimas pectolticas destroem rapidamente a lamela mdia e, ocorre ao mesmo tempo, a morte e a liberao
rpida do contedo celular.
05. Hipertrofia dos tecidos.
a) Galhas - Desenvolvimento anormal desordenado do tecido afetado.
b) fasciao - Estado achatado e muito ramificado da parte terminal da haste.
06. Sarna
Leses resultantes do crescimento desordenado e posterior decomposio dos tecidos epidrmicos.
II. Exame de fluxo ou exsudao bacteriana
A exsudao ou fluxo bacteriano nos cortes dos tecidos afetados indica a presena de bactrias. Quando
abundante nas leses novas ou nos tecidos afetados recentemente, uma indicao bastante segura de que a
bactria o agente causal da doena em questo.
A presena ou no do fluxo em leses velhas no permite, no entanto, nenhuma concluso.
Por outro lado, caso no for constatado fluxo bacteriano mesmo examinando-se vrias leses de diferentes
estgios de desenvolvimento da doena, pode-se concluir que a doena no bacteriana.
O exame de fluxo permite ainda verificar em que parte do rgo ou do tecido afetado se encontra a maior
concentrao bacteriana (tecido interno, vascular, parenquimatoso, etc.), possibilitando a escolha da parte mais
adequada para o isolamento da bactria.
O conhecimento da localizao da bactria permite tambm definir se pode ou no efetuar a desinfeco
superficial do tecido com desinfetantes antes de se fazer o isolamento.
Como observar o fluxo bacteriano.
1. Manchas foliares - selecionar a leso mais nova possvel e, com uma lmina bem afiada, retirar uma seo de
aproximadamente 5mm de largura, de maneira que o corte passe pelas partes necrosada de transio e sadia.
Colocar a seo sobre a lmina de vidro com gua destilada e cobrir com lamnula. No deixar espao vazio sem
gua sob a lamnula. Examinar ao microscpio. A massa bacteriana quando presente, flui para a gua como uma
nuvem. Quando muito abundante, pode ser vista at a olho nu.

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2. Tecidos internos - Remover a parte externa e cortar o tecido lesionado em sentido horizontal, de maneira
que possa obter uma lmina de, no mximo, um mm de espessura. Cortar uma seo desta em sentido
transversal aos vasos e montar em lmina de vidro com gua e observar como no caso anterior.
3. Murchas vasculares - Nos casos de murchas vasculares, especialmente as causadas por Ralstonia solanacearum,
quando a haste cortada, ela flui abundantemente como pus sobre o corte ou em fluxos densos, quando
mergulhados em gua (copo ou tubo de ensaio), perfeitamente visveis a olho nu, contra fundo claro.
III. Isolamento
Como as bactrias apresentam pouca variao morfolgica impossvel identifica-las pelo exame direto dos
materiais afetados ao microscpio como normalmente se faz com fungos e nematides.
Assim sendo, a bactria deve ser isolada para ser posteriormente identificada atravs das suas caractersticas
culturais, morfolgicas, fisiolgicas, bioqumicas e reao aos tratamentos com corantes.
Nas leses de plantas so encontradas, alm, de bactrias fitopatognicas, varivel gama de bactrias saprfitas
que invadem rapidamente os tecidos mortos. A primeira etapa do trabalho de isolamento consiste, portanto em
separar esta mistura de bactrias encontradas na leso atravs da diluio do extrato do tecido afetado sobre a
superfcie do meio de cultura adequado, de maneira que as diferentes bactrias cresam separadamente,
formando colnias puras, sem se misturarem entre si.
A identificao das bactrias fitopatognicas entre as inmeras bactrias saprfitas que cresceram separadamente
na placa de isolamento feita atravs de exames e testes rpidos mais adequados para cada caso e todas as no
fitopatognicas devem ser descartadas.
Este trabalho de isolamento est detalhado nos itens abaixo.
a) Escolher a leso mais nova possvel, preferivelmente a que apresenta um fluxo bacteriano abundante.
b) Efetuar uma lavagem ou desinfeco superficial adequada. Quando se trata de tecido espesso ou a parte
lesionada se situa na parte interna do rgo, ou ainda, a bactria se localiza nos vasos do xilema, a desinfeco
externa pode ser efetuada mergulhando-se o material no lcool. Quando a localizao do patgeno superficial
ou no tecido parenquimatoso das folhas, a utilizao de desinfetantes como lcool e hipoclorito prejudicial,
pois pode matar tambm a bactria que se pretende isolar. Neste caso, uma boa lavagem em gua o mximo
que se pode fazer.
c) Obteno do extrato bacteriano do tecido afetado
c.1. Das manchas foliares e manchas superficiais das hastes, pecolos e frutos. Aps a desinfeco com lcool ou
lavagem com gua, recortar em condies assptica possvel, uma pequena seco do tecido afetado (2 a 3 mm
de largura) da leso nova ou da regio de transio entre tecido necrosado e sadio. Transferir para uma lmina de
vidro esterilizada e macerar com basto de vidro, acrescentando-se uma ou mais gotas de gua estril.
c.2. Das leses vasculares, podrides e leses internas de tecidos volumosos.
Aps a desinfeco externa com lcool, retirar o mais assepticamente possvel, a casca, epiderme ou camada
superficial com o auxilio de uma lmina fina (gilete) ou bisturi. Cortar e remover o tecido onde deve estar a
maior concentrao bacteriana e transferir para tubo de ensaio com 2 a 3 ml de gua estril e deixar a bactria
fluir para a gua durante 5 a 10 min. Quando se tratar de tecido lenhoso (infeco vascular), a parte do tecido em
que se observa o escurecimento dos vasos deve ser cortada em fatias finas e transferidas para o tubo com gua.
Para forar a sada da bactria, o tubo pode ser agitado, ou mais, o tecido macerado com um basto de vidro. O
extrato bacteriano obtido neste caso uma suspenso com uma leve turvao esbranquiada.

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d) Diluio na placa em riscas sucessivas


Tomar uma pequena gota do extrato bacteriano com a ala previamente flambada e espalhar no canto da placa
sobre o meio da cultura, riscando-se varias vezes no mesmo lugar com um movimento alternado.
Este meio de cultura, preparado com 2 a 3 dias de antecedncia deve absorver rapidamente o liquido(em
aproximadamente 30 segundos) sem deixar vestgios de guas na superfcie.
Aps esta operao, flambar a ala, esfriar e passar novamente 1 a 2 vezes sobre o mesmo local onde foi
espalhado a gota do extrato e, depois, riscar sucessivamente em linhas paralelas e bem prximas uma da outra,
toda a superfcie da placa.
Estes detalhes so fundamentais e devem ser seguidos a risca para se obter um bom gradiente de diluio do
extrato bacteriano de maneira a obter colnias separadas sem se misturarem entre si.
e) Incubar a 25 - 30 C durante 2 a 4 dias.
As colnias que aparecem inicialmente ou que tem crescimento muito rpido formando colnias grandes nos
primeiros dias so geralmente bactrias saprfitas, no fitopatognicas.
Verificar se h colnias isoladas com as caractersticas da bactria ou das bactrias consideradas na diagnose
preliminar.
Ao identificar o tipo da colnia da bactria que se esta pretendendo isolar, transferir o mesmo para um tubo de
ensaio com meio inclinado.
Quando no se conhecem as caractersticas culturais da bactria que se pretende isolar ou se elas so confusas ou
incertas, deve selecionar as colnias mais provveis e transferi-las para os tubos. A bactria que se pretende isolar
deve ser separada atravs de testes rpidos de identificao de bactrias fitopatognicas para descartar quanto
antes possvel as bactrias no fitopatognicas ou saprfitas e possibilitar desta maneira, a execuo dos demais
testes de identificao.
IV. Caractersticas culturais das bactrias fitopatognicas mais freqentes no Brasil
1. Agrobacterium - Bactrias de crescimento mdio a rpido, colnia circular, lisa, convexa, esbranquiada
brilhante ou levemente opaca e consistncia mucosa.
2. Clavibacter michiganensis (Corynebacterium michiganense) - Bactrias de crescimento lento, colnia circular, lisa,
convexa, amarela creme clara e consistncia semi fluida.
3. Erwinias do grupo carotovora (Erwinia carotovora subsp. carotovora, E. carotovora subsp. atroseptica e E.
chrysanthemi). Bactrias de crescimento rpido. Colnia opaca, esbranquiada com tonalidade cinza ou levemente
esverdeada. Bordos irregulares.
4. Pseudomonas andropogonis, P. caryophylli e P. rubrilineans. Bactrias de crescimento mdio, circular, lisa
esbranquiada com tonalidade levemente amarelada, ou castanhas. P. caryophylli forma um pigmento castanho em
4 a 5 dias, que se difunde no meio de cultura.
5. P. cichorii, P. marginalis e P. viridiflava - Bactrias de crescimento rpido, colnia circular, bordo irregular,
esbranquiada opaca, levemente esverdeada ou amarelada.
6. Burkholderia. gladioli e B. cepacia - Bactrias de crescimento mdio a rpido, colnia circular com bordos lisos ou
irregulares esbranquiados, com tonalidades levemente amareladas, castanhas ou acinzentadas.
7. Ralstonia solanacearum (Pseudomonas solanacearum) (compreende um grande numero de estirpes, variveis em
patogenicidade, virulncia e caractersticas culturais). Bactrias de crescimento mdio. Colnias brancas, opacas
ou brilhantes. Quando desenvolvem isoladamente so circulares de crescimento lento. Normalmente formam-se
colnias irregulares. Consistncia fluida. Vrias estirpes produzem pigmentos castanhos que difundem no agar.
8. Pseudomonas syringae (compreende vrios patovares). Bactrias de crescimento mdio a rpido. Colnia circular,
esbranquiada, levemente esverdeada ou amarelada, bordo liso ou irregular.
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9. Streptomyces - Bactrias de crescimento mdio. Colnia micelial ou cotonosa. Torna-se pulverulenta depois de 4
a 5 dias. Branca com tonalidade cinza ou castanha. Pode produzir pigmento castanho que se difunde no meio de
cultura.
10. Xanthomonas albilineans - Bactrias de crescimento muito lento. Colnia circular, lisa, convexa, amarela
cremosa e consistncia fluida.
11. Xanthomonas axonopodis - Compreende grande numero de patovares. Bactrias de crescimento mdio. Colnia
amarela, circular, lisa, brilhante, convexa e consistncia mucosa.
12. Xanthomonas campestris - Compreende a alguns patovares com origem em brssicas. Bactrias de crescimento
mdio. Colnia amarela, circular, lisa, brilhante, convexa e consistncia mucosa.
13. Xanthomonas fragariae - Bactrias de crescimento muito lento. Colnia amarela circular, lisa, brilhante, convexa
e consistncia mucosa.
V. Testes rpidos para identificao de bactrias fitopatognicas
1. Teste de hipersensibilidade em folha de fumo.
a) Preparar suspenso bacteriana em gua estril de cada uma das culturas a serem testadas (5 ml de cada em
tubo de ensaio). Utilizar somente culturas novas em desenvolvimento (Culturas de 2-3 dias a 28-30 C).
A turbidez da suspenso deve ser aproximadamente equivalente a escala 7 de McFarland(*) (concentrao MF-7),
avaliada por comparao, sob o fundo claro.
(*) Escala 7 de McFarland: Misturar em um tubo de ensaio, 9,6 ml de H2SO4 1% (v/v do cido concentrado em
gua destilada) e 0,4 ml de BaCl2 1%. Agitar bem antes de usar. Pode ser utilizada por tempo indeterminado,
desde que esteja selada hermeticamente.
b) Infiltrar a suspenso bacteriana sob a epiderme, no espao internerval da face inferior da folha por meio de
uma seringa sem agulha. Para isso fazer um pequeno ponto no centro do espao internerval com alfinete, ajustar
bem o ponto no centro do orifcio da seringa, pressionando levemente com o dedo pelo lado oposto da folha e
infiltrar lentamente a suspenso ate formar uma rea encharcada de aproximadamente 1 cm de lado.
possvel testar vrias bactrias em folha, dependendo do seu tamanho. A rea infiltrada toma uma colorao
verde escura, de aspecto encharcado, a qual desaparece dentro de 20 a 30 minutos. Deve preferir as folhas mais
desenvolvidas ou maduras para o teste, evitando-se, no entanto, aquelas que j est em fase de declnio.
c) Manter a planta em local iluminado, porm, ao abrigo da chuva.
d) Observar a reao no dia seguinte. A reao positiva quando a parte infiltrada se necrosa dentro de 12 a 24
horas.
2. Teste de podrido mole em pimento.
O mtodo consiste em infestar a ponta do palito de dente com massa bacteriana (cultura nova de 1 a 2 dias em
meio solido) e fincar no pimento verde previamente desinfetado com lcool. Em cada pimento e possvel
testar 4 a 5 bactrias. Incubar a 28 a 32 C por 24 a 36 horas dentro de saco plstico para manter a condio de
cmara mida. Em caso positivo, o palito fica solto devido podrido dos tecidos ao redor. Em caso positivo, o
palito continua firme no lugar.
3. Teste de podrido mole em batata.
O mtodo consiste em:

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a) Recortar ascepticamente a batata em rodelas finas de 3mm de espessura e colocar em placas de Petri. Sobre
um suporte de vara de vidro, retorcido em forma de U. Para manter uma condio de cmara mida, colocar um
papel de filtro na tampa de placa e embeber com gua estril.
b) Inocular com ala a bactria a ser testada no centro da rodela e incubar a 28 - 32 C por 24 horas. Manter
sempre o papel bem umedecido.
Quando o resultado e positivo ha uma podrido aquosa a partir do ponto de inoculao, enquanto que em caso
negativo a rodela da batata se mantm intacta.
VI. Mtodos de inoculao em plantas suceptiveis para testes rpido em patogenicidade.
1. Puntuao da folha.
Consiste em fazer inmeras perfuraes na folha com a ponta de uma agulha e depois passar a suspenso
bacteriana com pincel ou cotonete estril.
2. Puntuao na haste.
Consiste em colocar a massa bacteriana ou suspenso bacteriana na haste e efetuar puntuaes com uma agulha.
3. Corte da ponta das folhas com tesoura.
Consiste em "molhar" a tesoura com suspenso bacteriana e cortar a ponta das folhas. usado para bactrias que
invadem o sistema vascular das folhas.
4. Palito de dente.
Consiste em infestar o palito de dente com massa ou suspenso bacteriana e introduzir no tecido da planta
susceptvel (haste tenra ou fruto). usado para bactrias que causam cancros na haste, mortes descendentes,
murchas e podrides.
Em todos setes mtodos (item 1 a 4) as plantas inoculadas devem ser mantidas em condies de cmara mida,
sob o abrigo da luz solar para assegurar a infeco.
5. Infiltrao na folha.
o mesmo mtodo utilizado para infiltrao em fumo, porm, com suspenso muito menos concentrada (1/100
de MF-7). o mtodo mais rpido e seguro para teste de patogenicidade de Xanthomonas axonopodis pv. citri e X.
vesicatoria em folha de citrus e pimento respectivamente.
6. Inoculao por asperso.
Consiste em preparar uma suspenso bacteriana 1/100 de MF-7 e aspergir principalmente na parte inferior da
folha, onde se encontra o maior numero de estomatos. Aplicar ate ficar bem mido. Aps a infestao manter a
planta por no mnimo 24 horas em cmara mida.
7.3. IDENTIFICAO DAS BACTRIAS
CHAVE PARA IDENTIFICAO DE BACTRIAS FITOPATOGNICAS AO NVEL DE
GNERO.
A chave abaixo valida somente para bactrias fitopatognicas que crescem em meios de cultura, utilizados
normalmente em bacteriologia. Estas bactrias, excetuando-se as Streptomyces que possuem estrutura micelial, so
baciliformes que no formam endosporos. Variam no tamanho de 0,5 a 1,0 m de dimetro por 0,3 a 3,0 m de
comprimento.

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1. Tipo de colnia: Micelial......................................Streptomyces


Mucosa ou fluida.......................(2)
2. Teste de Gram: Gram (+).....................................Clavibacter (Corynebacterium)
..................................................Arthrobacter
.................................................Curtobacterium
................................................. Rathayibacter
.................................................Rhodococcus
Gram (-).....................................(3)
3. Teste OF: Fermentativo.......................................Erwinia, Pantoea
Oxidativo...................................(4)
4. Colnias amarelas em NDA: (+). ........................Xanthomonas amarelas
(-).............................................(5)
5. Pigmento fluorescente em King-B:
(+).............................................Pseudomonas
(-)..............................................(6)
6.Crescimento em meio de asparagina:
(+)...........................................Acidovorax, Burkholderia e Ralstonia
(-)............................................Xanthomonas apigmentada

TESTE DE GRAM (Colorao)


-PROCEDIMENTO
1) Diluio
Sobre uma lmina para microscpio limpa e desengordurada (mergulhar em lcool e enxugar com papel
higinico de alta qualidade) colocar algumas gotas de gua destilada estril, transferir uma pequena quantidade de
massa bacteriana e diluir, produzindo uma suspenso ligeiramente turva.
2) Esfregao
-Limpar e desengordurar uma lmina, aquecer ligeiramente e transferir com auxilio de uma ala uma alada da
suspenso preparada no item anterior, espalhando sobre a lmina em crculo de dimetro de aproximadamente 1
cm. Esperar secar e fazer a colorao.
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3) Colorao
-Sobre a lmina com o esfregao colocar algumas gotas do corante cristal violeta de Hucker. Esperar
aproximadamente 30 segundos e lavar com gua.
-Colocar algumas gotas de soluo iodo lugol e esperar aproximadamente 30 seg.
-Lavar com lcool etlico 95%.
-Observar a lmina contra a luz. Bactrias Gram-positivas retm a colorao azul violeta, enquanto que as
bactrias Gram-negativas ficam completamente incolores.
As Gram-positivas podem ser observadas ao microscpio com a objetiva de 100X com leo de imerso, e
apresenta uma colorao azul violeta.
As Gram-negativas, para serem visualizadas ao microscpio, devem ser coloridas novamente. Usa-se safranina
(vermelha) para diferenciar das Gram-positivas azuis.
ESTUDO DAS CARACTERSTICAS MORFOLGICAS DAS BACTRIAS
-PROCEDIMENTO
1) Diluio
Sobre uma lmina para microscpio limpa e desengordurada (mergulhar em lcool e enxugar com papel
higinico de alta qualidade) colocar algumas gotas de gua destilada estril, transferir uma pequena quantidade de
massa bacteriana e diluir, produzindo uma suspenso ligeiramente turva.
2) Esfregao
-Limpar e desengordurar uma lmina, aquecer ligeiramente e transferir com auxilio de uma ala uma alada da
suspenso preparada no item anterior, espalhando sobre a lmina em crculo de dimetro de aproximadamente 1
cm. Esperar secar e fazer a colorao.
3) Colorao
-

Colorir o esfregao preparado no item anterior colocando algumas gotas de safranina.

Esperar por 2 a 3 minutos, lavar com gua, secar e observar com objetiva de 100 x. Use leo de imerso.

7.4. MEIOS DE CULTURA


Meio de cultura o substrato utilizado para o desenvolvimento de microrganismos, de clulas, e de tecidos de
plantas e de animais, contendo para isso, os nutrientes necessrios.
Elementos do meio de cultura
1. Elementos essenciais:
a) gua
b) Carbono

Orgnico: carboidratos. (Ex: dextrose, sacarose, maltose, amido etc..).

c) Nitrognio

Orgnico: protenas e aminocidos.


Inorgnicos: nitratos e sais de amnio.

d) Elementos minerais: exigidos em maiores quantidades, P, K, Mg, S, Ca, Na.


Microelementos Mn, Fe, B, Zn, Co, Cu, Mo.
e) Fatores de crescimento: Vitaminas do complexo B, Aminocidos e outros.
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2. Estimulantes: Ex. MgSO47H2O, CaCO3, etc..


3. Tamponante: (estabilizador de pH). Exs. K2HPO4, Na2HPO4, CaCO3
4. Solidificante: Ex. gar.
5. Inibidores: Ex. Antibiticos, cidos orgnicos, etc.
6. Indicadores: Substncias que conferem uma caracterstica especial a colnia da bactria que se pretende isolar.
Materiais de composio definida: Ex. Dextrose, KNO3, K2HPO4, Tiamina, ZnSO4.
Materiais de composio Indefinida: Muitos materiais de composio indefinidos so utilizados para o preparo
de meios de cultura. Exs:
Caldo de batata: Contm grande quantidade de amido (Carboidrato), contm ainda quantidade suficiente de
fonte de nitrognio orgnico, elementos minerais (macro e micro) e alguns fatores de crescimento para permitir o
desenvolvimento de fungos e bactrias.
Caldo de verduras: Em comparao com o caldo de batata, mais pobre em carboidratos e mais rico em sais
minerais, e muito rico em fatores de crescimento.
Extrato de malte: Malte a semente de cevada germinada. Extrato de malte parte solvel (desidratada) do malte
triturado e fervido, rico em maltose, protenas solveis, aminocidos, sais minerais e fatores de crescimento.
Extrato de carne: a parte solvel (desidratada) da carne moda fervida e desengordurada, rico em protenas
solveis, sais minerais e fatores de crescimento.
Extrato de Levedura: a parte solvel (desidratada) das clulas de leveduras autolisadas. muito rico em
aminocidos essenciais e vitaminas do complexo B, assim como em sais minerais.
Peptona: um produto da digesto cida ou enzimtica de protenas. Existem as mais variadas qualidades de
peptonas, dependendo dos materiais utilizados (carnes de diferentes animais, peixes, resduos de matadouro, soja,
amendoim etc.) e do processo de digesto e tambm da enzima utilizada. As melhores peptonas so aquelas
obtidas de carne de boa qualidade. Nestes casos so ricos em protenas solveis, aminocidos essenciais e sais
minerais.
Casena hidrolisada: uma peptona obtida da digesto cida ou enzimtica do leite, muito rico em protenas
solveis, aminocidos essenciais e sais minerais.
gar: uma substncia utilizada como solidificante de meios de cultura. As principais qualidades do gar como
solidificante do meio so: a) o seu ponto de liquefao entre 90 e 100 C que permite cultivar os
microrganismos nas mais variadas temperaturas; b) o seu ponto de solidificao entre 40 e 50 C permite
incorporao de muitas substncias termolbeis antes da solidificao; e c) no digerido ou hidrolisado pelos
microrganismos. gar um polmero de galactose extrados de algas marinhas do grupo das agarfitas. A
qualidade do gar varia em funo do material original e do grau de purificao o qual foi submetido durante a
extrao.
Meios para fungos: (frmula para 1 litro)
a) BDA (Batata-Dextrose-gar): Caldo de 200 g de batata picada e fervida durante 10 a 15 minutos. gua para
completar 1 litro. 10 g de dextrose ou sacarose e 20g de gar.
b) Meio de malte: Extrato de malte, 20g ; gar 20g.
c) Meio de verduras: Caldo de 200 g de verduras. gua para completar 1 litro, 3g de CaCO3 e 20g de gar.
Aos meios de cultura para fungos, quando so usadas para trabalhos de isolamentos, pode-se adicionar inibidores
de bactrias para evitar a contaminao. Os inibidores mais utilizados so o cido ltico e os antibiticos:
estreptomicina, penicilina, cloranfenicol. Estes inibidores so adicionados ao meio aps a esterilizao em
autoclave.
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Meios para bactrias.


a) NDA (Nutriente, dextrose, gar): Extrato de carne, 5g; peptona, 10g; dextrose, 10g e gar. 20g.
b) Meio 523 de Kado e Heskett: Dextrose ou sacarose, 10g; casena hidrolisada, 8g; extrato de levedura, 4g;
fosfato de potssio dibsico (K2HPO4), 2g; Sulfato de magnsio (MgSO47H2O), 300 mg; gar 20 g.
c) NDLA (Nutriente, dextrose, levedura, gar): Extrato de carne, 5g; peptona, 10g; extrato de levedura, 4g;
dextrose, 5g, K2HPO4, 2g; KH2PO4, 0,5g e agra 10g.
d)YD (Extrato de levedura, dextrose e carbonato de clcio): Extrato de levedura, 20g; dextrose, 10g e carbonato
de clcio 20g.
e) BA (Batata, sacarose, agra) : caldo de 300g de batata picada e fervida; Na2HPO4, 2g; Ca(NO3)2, 0,5g; Peptona,
5g; sacarose, 15g e gar, 20g.
Aos meios de cultura para bactrias, quando usado para trabalho de isolamento, pode-se adicionar o
cicloexamida, conhecido tambm como actidione ou outros fungicidas para impedir a contaminao com fungos.
Correo de pH. Os fungos no so exigentes quanto ao pH e, por isso, o meio de cultura pode apresentar
variaes desde 5 a 8 sem afetar o seu desenvolvimento. Em meio muito cido, no entanto, o gar tende a se
hidrolisar durante a autoclavagem, devendo ser corrigido para, no mnimo pH 6. Quanto s bactrias a grande
maioria exige o pH prximo de 7 (neutro).
O pH medido no potencimetro ou atravs de fita de papel universal; em alquotas de 50 a 100 ml. A correo
feita adicionando-se gotas de solues de base (KOH, NaOH, etc.) ou cidos (HCl, H2PO4, etc),
tentativamente at obter o pH desejado. Atravs da regra de trs simples, calcula-se a quantidade necessria para
corrigir o volume todo.
Preparo de meio de cultura em placas: Os ingredientes devem ser colocados em frascos com dobro do volume
do meio de cultura que est sendo preparado, tampado e autoclavado durante 15 a 20 minutos efetivos a 121 C
(presso de vapor de 1 atm.). Depois de baixar naturalmente a presso, deve ser esfriado a aproximadamente 50
C para depois verter em placas previamente esterilizadas. Este esfriamento necessrio para reduzir a
evaporao e a condensao da gua na tampa da placa. Coloca-se aproximadamente 20 ml de meio por placa.
Depois de vertido o meio, as placas devem ser mantidas em uma estufa de 30 a 35 C por 12 a 24 horas ou a
temperatura ambiente por 2 dias em um local arejado e assptico possvel para eliminar a gua de condensao
da superfcie da placa do meio de cultura.
Preparo de meios de culturas em tubos: Os ingredientes devem ser colocados em frascos e aquecidos at a
fervura para fundir o gar. Depois de bem misturados, o meio transferido para os tubos de ensaio (8 a 10 ml
por tubo) e os tubos tampados com algodo, acompanhados em um recipiente, coberto com uma folha
impermevel e autoclavados a 1 atm. de presso de vapor durante 15 a 20 min. Depois de autoclavado, os tubos
so inclinados sobre um suporte de aproximadamente 1 cm de altura at completa solidificao.
Esterilizao em autoclave: Autoclave um equipamento para esterilizao de materiais a 110-120 C sob
presso de vapor de 0,5 a 1 atm. So utilizadas para esterilizao de meios de cultura, lquidos e materiais que no
podem ser esterilizados no forno. O tempo de esterilizao varia com o material e volume. 500 ml de meio de
cultura geralmente autoclavado a 121 C (1 atm.) por 20 min.
Esterilizao no forno: Vidrarias e materiais cirrgicos so geralmente esterilizados a 160-200 C por tempo
efetivo de 2 a 3 horas.
Tindalizao: o processo utilizado para esterilizar meios que no podem ser aquecidos acima de 100 C.
Consiste em ferver durante 30 min. eliminando-se, desta maneira, todas as formas vegetativas. Deixa-se, depois,
em temperatura de 28 -32 C durante 1 dia para que as estruturas de resistncia, como endospros, germinem e
passem para a forma vegetava, para ento ferver novamente durante 30 minutos. Para assegurar a esterilizao,
repete-se esta operao mais uma vez, totalizando-se 3 fervuras de 30 min. por trs dias consecutivos.
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Filtrao: Solues ou suspenses de substncias que no podem ser aquecidas acima de 50 C so esterilizadas
atravs de filtrao. a filtrao mais utilizada para esterilizao de carboidratos termolbeis, aminocidos e
vitaminas. Existem vrios tipos de filtros, sendo o mais utilizado o de membrana de poros inferiores a 0,4 .
7.5. ISOLAMENTO DE MICRORGANISMOS
1) Isolamento de microrganismos do solo, ar, filoplano e rizoplano.
2) Isolamento de fungos fitopatognicos.
3) Observao de fluxo bacteriano em leses de plantas causadas por bactrias fitopatognicas.
4) Isolamento de bactrias fitopatognicas.
Primeira parte:
1. Isolamento de microrganismos do ar.
- Abrir as placas sobre a mesa durante 30 minutos.
- Incubar a 28 - 30 C por 2 a 3 dias e observar.
2. Isolamento de microrganismos do filoplano
- Lavar bem as folhas, eliminar o excesso de gua e deixar secar.
- Pressionar levemente a superfcie da folha sobre o meio de cultura da placa de Petri.
- Incubar a 28 - 30 C por 2 a 3 dias e observar.
3. Isolamento de microrganismos do solo.
- Coletar o solo, secar sombra, peneirar e pesar 1g.
- Suspender em 100 ml de gua esterilizada (diluio 10-2).
- Efetuar mais 3 diluies em srie de 1/10 cada para se obter suspenses diludas a 10-3, 10-4 e 10-5.
- Transferir 0, 05 ml de cada diluio para placas de BSA com 3 repeties e espalhar uniformemente com ala
de Drigalsky.
- Incubar a 28 - 30 C por 2 a 3 dias e observar.
Esquema de diluio:

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4. Isolamento de microrganismos do rizoplano.


- Coletar razes de uma planta.
- Lavar e deixar secar a sombra por 15 a 30 min.
- Pesar 1g e macerar em um cadinho com almofariz.
- Suspender o extrato em 100 ml de gua esterilizada.
- efetuar diluio em srie, de maneira a obter suspenses diludas de 10-4, 10-5 e 10-6.
- Transferir 0,05 ml de cada diluio para placas de BSA com 3 repeties e espalhar uniformemente
com ala de Drigalsky.
- Incubar a 28 - 30 C por 2 a 3 dias e observar.
Esquema de diluio:

Segunda parte: Isolamento de fungos fitopatognicos.


1. De leses foliares:
- Observar as frutificaes do fungo sobre as leses se for o caso.
- Recortar a parte da folha onde esto as leses.
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- Imergir em soluo de lcool 70% por 30 segundos.


- Transferir para soluo de hipoclorito de sdio a 1% (gua sanitria diluda a 1/2) e deixar por 2 a 3 minutos.
- Transferir para gua esterilizada e deixar por 2 a 3 minutos
- Enxugar sobre papel toalha.
- Recortar asspticamente sees da leso de 1 a 3 mm de lado, preferivelmente da regio de transio entre o
tecido necrosado e o tecido sadio.
- Transferir as sees recortadas sobre o meio de BDA com antibitico contra bactria (estreptomicina). Colocar
5 a 6 sees por placa.
- Incubar a 28 - 30 C por 5 a 7 dias e observar.
2. De leses profundas (de frutos, hastes ou razes):
- Observar frutificaes do fungo sobre as leses, se for o caso.
- eliminar a parte superficial externa da leso com uma lmina previamente esterilizada com lcool.
- Recortar asspticamente a parte interna da leso da regio de transio entre o tecido necrosado e sadio e
transferir diretamente sobre meio de BDA com antibitico.
- Incubar a 28 - 30 C por 5 a 7 dias e observar.
Terceira parte: Observao de fluxo bacteriano em leses de plantas causadas por bactrias fitopatognicas.
1. Em leses foliares ou superfcies.
- Recortar uma seco de aproximadamente 3 mm de largura por 1 cm de comprimento, abrangendo uma rea
necrosada, rea de transio e rea sadia. Se a leso for pequena, corta-se ao meio de tal maneira que na seco
recortada fique localizada a metade da leso. A espessura da leso deve ser no mximo 0,5 mm para poder fechala com lamnula. Para isso, deve-se evitar nervuras espessas ou, se necessrio, deve-se efetuar um corte horizontal
para eliminar a parte muito espessa.
-Transferir 2 a 3 sees recortadas sobre uma lmina de vidro, cobrir com lamnula e encher o espao com gua.
Coloca-se 2 a 3 sees para que a lamnula no fique inclinada.
- Observar ao microscpio com objetiva de menor aumento. A massa bacteriana, quando presente, flui para a
gua com um aspecto semelhante a uma nuvem que se dissipa lentamente no ar.
2. Em leses profundas de hastes, razes ou fruto.
- Eliminar a parte externa e tomar uma seco fina de no mximo 0,5 mm de espessura e 3 mm de largura
- Transferir sobre a lmina e cobrir com lamnula, encher o espao com gua e observar ao microscpio como
no item anterior.
3. Em leses vasculares causadas por Ralstonia solanacearum.
- Cortar uma seco de 2 a 3 cm da haste ou do tecido onde se observa o enegrecimento dos vasos e prender no
tubo de ensaio ou no copo de vidro, com gua, de maneira que somente a parte inferior fique mergulhada na
gua. O fluxo bacteriano desce em forma de filete branco dentro de 1 a 3 minutos, o qual visvel a olho nu,
quando se deixa incidir uma luz lateral contra um fundo escuro. Para que se possa observar o fluxo, no se deve
movimentar bruscamente o tubo ou o copo. O exame de fluxo muito til para diagnose de doenas
bacterianas, uma vez que, quando positivo, uma indicao bastante segura de que a leso bacteriana.
Entretanto, quando negativo, no se pode afirmar que no bacteriana. Leses velhas ou muito novas
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geralmente tem poucas bactrias e no podem ser visualizadas em fluxo. necessrio, portanto, observar vrias
leses das diferentes fases de desenvolvimento da doena e, se mesmo assim no se observar nenhum fluxo,
pode-se concluir que a doena no bacteriana.
O exame de fluxo til tambm para se saber o tipo de leso ou o local da leso onde h maior concentrao
bacteriana para se fazer o isolamento, ou ainda, para se saber se a bactria esta localizada nos vasos ou no tecido
parenquimatoso. Quando a bactria esta no tecido parenquimatoso, a desinfeco deve ser rpida para no matar
tambm a bactria que se quer isolar. Se a localizao for no vaso, possvel fazer uma boa desinfeco
superficial sem afetar as bactrias que esto no seu interior.
Quarta parte: Isolamento de bactrias fitopatognicas.
1. De leses foliares ou superficiais
- Lavar bem o material coletado (Planta com sintoma da doena) com gua corrente (de torneira).
- Preparar ao mesmo tempo, a lmina de vidro desinfetando-a inicialmente com lcool. Limpar a seguir com
papel (Guardanapo higinico) e depois, passar rapidamente na chama.
- Recortar a parte da planta onde esta a leso e imergir em soluo de lcool 70% por 30 segundos.
- Transferir para a soluo de hipoclorito de sdio a 1% por 1 a 3 min.
- Transferir para gua esterilizada por 2 a 3 min.
- Enxugar sobre uma folha de papel toalha ou papel higinico.
- Recortar asspticamente, pequenas sees de 1 a 3 mm de lado das leses novas ou da regio de transio entre
parte necrosada e sadia.
- Transferir as sees sobre a lmina desinfetada, colocar 1 a 2 gotas de gua e macerar com basto de vidro
previamente flambado.
- Tomar uma alada do extrato em riscas sucessivas. (seguir orientao do Professor).
2. De leses ou podrides internas.
- Eliminar a parte superficial da leso. No necessrio fazer a desinfeco superficial como no item anterior.
- Retirar pequenas sees ou pores do tecido lesionado interno e transferir para a lmina desinfetada, macerar
e plaquear, seguindo os mesmos procedimentos descritos no item anterior.
{- As sees ou pores do tecido lesionado pode ser transferido para tubo de ensaio com 2 a 3 ml de gua
esterilizada em vez de macerar em lmina. Deixa-se algum mi nuto (1 a 15 min.) para que a bactria saia
naturalmente do tecido para a gua. Pode-se agitar o tubo para apressar o processo. Uma alada deste extrato
plaqueado sobre o meio de cultura, da mesma maneira descrita no item anterior. O mtodo de extrao de
bactria em tubo de ensaio melhor do que a macerao em lmina quando a quantidade de bactria presente no
tecido grane, como nos casos de infeces vasculares (Ex. murcha bacteriana causada por Ralstonia solanacearum)
e podrides moles.
Postulado de Koch
- Isolar microrganismos associados doena ou sintoma.
- Obter cultura pura.
- Inocular e reproduzir a mesma doena ou sintoma em hospedeira susceptvel.
- Reisolar o mesmo microrganismo de hospedeira susceptvel.

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