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UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEAR


INSTITUTO SUPERIOR DE CINCIAS BIOMDICAS
CURSO DE MESTRADO ACADMICO EM CINCIAS FISIOLGICAS

ANA CAROLINA CARDOSO TEIXEIRA

EFEITO DOS MONOTERPENIDES LIMONENO, CARVEOL E


LCOOL PERLICO NO MSCULO LISO VASCULAR

FORTALEZA CE
2013

ANA CAROLINA CARDOSO TEIXEIRA

EFEITO DOS MONOTERPENIDES LIMONENO, CARVEOL E


LCOOL PERLICO NO MSCULO LISO VASCULAR

Dissertao apresentada ao Curso de


Mestrado
Acadmico
em
Cincias
Fisiolgicas da Universidade Estadual do
Cear como requisito parcial para obteno
do grau de Mestre em Cincias Fisiolgicas.
Orientador: Prof. Dr. Jos Henrique Leal
Cardoso

FORTALEZA - CE
2013

Dados Internacionais de Catalogao na Publicao


Universidade Estadual do Cear
Biblioteca Central Prof. Antnio Martins Filho
Bibliotecrio (a) Leila Cavalcante Stiro CRB-3 / 544

T266e

Teixeira, Ana Carolina Cardoso.


Efeitos dos monoterpenides limoneno, carveol e lcool perlico no msculo liso
vascular/Ana Carolina Cardoso Teixeira. 2013.
CD-ROM 79f. : il. (algumas color.) ; 4 pol.
CD-ROM contendo o arquivo no formato PDF do trabalho acadmico,
acondicionado em caixa de DVD Slin (19 x 14 cm x 7 mm).
Dissertao (mestrado) Universidade Estadual do Cear, Centro de Cincias da
Sade, Mestrado Acadmico em Cincias Fisiolgicas, Fortaleza, 2013.
rea de Concentrao: Fisiologia de rgos e sistemas Sistemas Cardiovascular.
Orientao: Prof. Dr.Jos Henrique Leal Cardoso.
1. Relao estrutura-efeito. 2. Grupo hidroxila. 3. Monoterpenos. 4. Msculo liso
vascular. I. Ttulo.

CDD: 574.1

Aos meus amados pais, Antonio Teixeira e Ftima Teixeira


Dedico este trabalho

AGRADECIMENTOS

O caminho percorrido para a realizao desta pesquisa foi rduo, porm repleto de
oportunidades, desafios e alegrias. No se constri nada sozinho. A troca de experincias e
a amizade foram essenciais para o crescimento e o amadurecimento deste trabalho. Dessa
maneira, nada seria to adequado quanto o agradecimento todos que contriburam, direta
e indiretamente, para a realizao dessa jornada, e de maneira especial gostaria de
agradecer:
Deus. Poderia, aqui, citar inmeros motivos pelos quais tenho que agradec-lo, porm
dois parecem definir o meu sentimento. Agradeo por ser o pilar de sustentao que no me
deixou cair quando as foras pareciam se esvair. Agradeo pelas oportunidades fornecidas
que possibilitaram ricas experincias e um grande aprendizado.
Aos meus pais, Antonio Teixeira e Ftima Teixeira. Agradeo pelas palavras de apoio, olhar
carinhoso, abrao acolhedor e por estarem presentes em todos os momentos, dos mais
alegres queles em que pensei que no teria foras para continuar. Obrigada por
possibilitarem a realizao dos meus sonhos, por acreditarem na minha capacidade e pelo
amor incondicional a mim dedicado.
minha famlia. Agradeo a Ana Cardoso, Cecilia Cardoso, Lourdes Cardoso, William
Cardoso, Junior Cardoso, Wilton Cardoso, Camilly Cardoso, Vitria Cardoso, minhas avs,
Delvirgem Teixeira e Maria Clotilde (in memoriam) e meus avs, Manoel Teixeira (in
memoriam) e Jos Cardoso (in memoriam) por serem a minha inspirao, por me fazer
querer ser uma pessoa melhor a cada dia.
Ao Klausen Abreu, pela cumplicidade, amor, pacincia, apoio. Obrigada por acreditar em
mim, muitas vezes, mais do que eu. Obrigada por enxugar as minhas lgrimas e por brigar
(muito) comigo quando pareo desistir dos meus sonhos.
Emmanuely Diogo e Viviane Alves pelo apoio, amizade, conversas e pelas inmeras
risadas.
Ao Aldair de Frana Neto, quele quem chamo carinhosamente de chefe mas considero
um irmo. Obrigada pela ajuda no treinamento laboratorial, contribuio intelectual, auxlio
na escrita desse trabalho, pela amizade, por sempre acreditar em mim e por ser um
exemplo de pessoa e profissional.

Kerly Shamyra e Dieniffer Neves, pelo carinho, compreenso, amizade, pelas risadas e
contribuio intelectual. Obrigada pelo auxilio na escrita do trabalho, anlise de dados, pelas
dicas e por serem modelos de perseverana e dedicao.
Ao

Dr.

Walber

Ferreira.

Obrigado

pelos

valiosos

ensinamentos,

discusses

questionamentos. Obrigada pela amizade, pacincia, compreenso e conselhos. Tenho


certeza que h mais o que agradecer, mas vou resumir com: obrigada por tudo!
Dra. Andrelina Noronha, pelas discusses, pelo auxlio na escrita do trabalho, pela ajuda
no desenvolvimento da pesquisa, pelo carinho, pela confiana e por ter sido to prestativa e
solidria comigo.
Universidade Estadual do Cear, Instituto Superior de Cincias Biomdicas e todos os
seus funcionrios.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientfico e Tecnolgico (CNPq),
Coordenao de Aperfeioamento de Pessoal de Nvel Superior (CAPES) e Fundao
Cearense de Apoio ao Desenvolvimento Cientfico e Tecnolgico (FUNCAP) pelo suporte
financeiro das pesquisas do Laboratrio de Eletrofisiologia e pela bolsa concedida.
Aos professores e funcionrios do Curso de Mestrado Acadmico em Cincias Fisiolgicas,
em especial as professoras Dra. Cladia Ferreira e Dra. Aline Albuquerque por terem
aceitado o convite de participar da banca contribuindo, dessa maneira, para o
enriquecimento dessa pesquisa.
todos os membros do Laboratrio de Eletrofisiologia, pela convivncia, momentos de
descontrao e auxlio intelectual.
Aos alunos de iniciao cientfica Jssica Ribeiro e Alan Avelino pelo auxilio nos
experimentos e pela companhia agradvel.
Ao Pedro Milito, pelo zelo com o laboratrio e por nunca deixar faltar material para a
realizao dos experimentos. Obrigada Pedim!
Ao Frank, pelo cuidado com os animais utilizados nessa pesquisa.
Ao Ded, Sr. Ivan, Sr. Rocha, Sr. Osternes, Sr. Albano, Sr. Walter e Sr. Barros pelos
cuidados com o ISCB e por tornar o dia mais seguro e alegre apenas por estarem
presentes.

E para no perder o hbito, de ter sempre o nome citado por ltimo, mas desempenhando
um papel essencial para a realizao desse trabalho, agradeo ao meu orientador Dr. Jos
Henrique Leal Cardoso. Obrigada por ser um pesquisador exemplar e pessoa admirvel.
Obrigada pelos valiosos ensinamentos, pacincia, oportunidades e ateno dedicada.
Obrigada por possibilitar a realizao desse trabalho que de extrema importncia para o
meu crescimento intelectual e profissional. uma honra inestimvel ser sua aluna e
orientanda. Obrigada!

Foi o tempo que dedicastes tua rosa que a fez to importante


(Antoine de Saint-Exupry)

RESUMO
Diversas medidas teraputicas so utilizadas para o tratamento de enfermidades
que afetam a populao mundial. Dentre as opes de tratamento, a utilizao de
produtos derivados de plantas medicinais, como por exemplo, os leos essenciais,
tem ganhado destaque no meio cientfico. Nos ltimos anos, a pesquisa com os
constituintes dos leos essenciais tem crescido a fim de se compreender quais
substncias so responsveis pelas atividades atribudas a esses leos. Dentre os
constituintes dos leos essenciais, encontram-se os monoterpenos e os
monoterpenides. Nos ltimos anos, diversos estudos tm sido realizados com a
finalidade de relacionar o efeito da droga com sua estrutura qumica. Essa
ferramenta possui grande importncia, uma vez que possibilita tanto a compreenso
dos mecanismos de ao dos compostos, quanto a produo de drogas com grande
valor comercial e teraputico. Dessa maneira, esta investigao teve como objetivos
comparar o efeito do carveol, lcool perlico e limoneno em msculo liso vascular de
ratos, relacionando esses efeitos com a estrutura qumica destes compostos. Para
tanto, foram utilizados ratos Wistar, com massa corprea compreendida entre 200300 g e sacrificados por inalao de CO2. Aps o sacrifcio, a aorta torcica foi
retirada e seccionada em anis que foram presos por uma haste a uma extremidade
fixa e a um transdutor de fora acoplado a um polgrafo computadorizado. O
limoneno, o carveol e o lcool perlico apresentaram efeito relaxante sobre anis de
aorta de rato pr-contrados sob estmulo eletromecnico e farmacomecnico. O
efeito relaxante foi independente da integridade do endotlio, embora este tenha
alterado a potncia farmacolgica dos compostos. O limoneno, o carveol e o lcool
perlico tambm apresentaram efeito sobre a contrao induzida por DBF com
diferentes eficcias. Em concluso, o limoneno, o carveol e o lcool perlico
apresentam efeito relaxante, sendo esse efeito independente do endotlio vascular.
A presena da hidroxila nas estruturas dos compostos no foi essencial para a
atividade biolgica dos mesmos, embora sua presena e localizao tenham
exercido influncia sobre a potncia e a eficcia vasorelaxantes.
Palavras-chaves: Relao estrutura-efeito. Grupo Hidroxila. Monoterpenos. Msculo
liso vascular.

ABSTRACT
Several therapeutic measures are used for the treatment of diseases affecting the
world's population. Among the treatment options, the use of products derived from
medicinal plants, for example the essential oils, has gained prominence in the
scientific world. In recent years, research on the constituents of essential oils has
grown to understand which substances are responsible for the activities assigned to
these oils. Among these constituents are the monoterpenes and monoterpenoids.
Currently, several studies have been conducted in order to relate the effect of the
drug with its chemical structure. These studies have great importance as it allows
both the understanding of the mechanisms of action of compounds, as well as
enables the production of drugs with great commercial and therapeutic value. Thus,
this research aimed to compare the effect of carveol, perillyl alcohol and limonene in
vascular smooth muscle of rats, relating these effects with its chemical structure.
Thereby, Wistar rats were used, with body mass between 200-300 g and sacrificed
by CO2 inhalation. After the sacrifice, the thoracic aorta was removed and sectioned
into rings that were attached by a rod to a fixed endpoint and a force transducer
coupled to a computerized polygraph. The limonene, carveol and perillyl alcohol
showed relaxing effect on rat aortic rings in both electromechanical
and
pharmacomechanical coupling. The relaxant effect was endothelium independent
although there was change in the pharmacological potency of the compounds. The
limonene, carveol and perillyl alcohol also had effect on the contraction induced by
PDB, with different efficacy. In conclusion, the limonene, carveol and perillyl alcohol
have relaxing effect, which is independent of the vascular endothelium. The presence
of hydroxyl in the structures of the compounds was not essential for the biological
activity of the compounds, although their presence and position exert influence on
the potency and efficacy vasorelaxant.
Key words: structure-activity relationship. Hydroxyl group. Monoterpenes. Vascular
Smooth Muscle.

10

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Unidade de isopreno ................................................................................. 22

Figura 2 Frmula estrutural do limoneno ................................................................ 24

Figura 3 - Formula estrutural do carveol ................................................................... 25

Figura 4 - Formula estrutural do lcool perlico ......................................................... 25

Figura 5 - Estrutura vascular bsica .......................................................................... 27

Figura 6 - Acoplamento excitao-contrao do msculo liso................................... 30

Figura 7 - Mecanismo de controle da concentrao de clcio intracelular ................ 32

Figura 8 - Mecanismo de relaxamento do msculo liso dependente do endotlio .... 34

Figura 9 Equipamentos para experimentos de reatividade muscular. .................... 41

Figura 10 - Esquema ilustrativo da srie experimental 1 ........................................... 42

Figura 11 - Esquema ilustrativo da srie experimental 2 ........................................... 43

Figura 12 - Esquema ilustrativo da srie experimental 3 ........................................... 43

Figura 13 - Esquema ilustrativo da srie experimental 4 ........................................... 44

Figura 14 - Efeito do limoneno, carveol e lcool perlico sobre o tnus basal em anis
de aorta com endotlio .............................................................................................. 45

11

Figura 15 - Efeito do limoneno, carveol e lcool perlico sobre o acoplamento


eletromecnico em anis de aorta com endotlio ..................................................... 47

Figura 16 - Efeito do limoneno, carveol e lcool perlico sobre o acoplamento


eletromecnico em anis de aorta sem endotlio ..................................................... 48

Figura 17 - Efeito do limoneno, carveol e lcool perlico sobre o acoplamento


farmacomecnico em anis de aorta com endotlio ................................................. 50

Figura 18 - Efeito do limoneno, carveol e lcool perlico sobre o acoplamento


farmacomecnico em anis de aorta sem endotlio ................................................. 51

Figura 19 - Efeito do limoneno, carveol e lcool perlico sobre o acoplamento


farmacomecnico em anis de aorta com endotlio na presena de L-NAME ......... 53

Figura 20 - Efeito do limoneno, carveol e lcool perlico sobre a contrao induzida


por dibutirato de forbol .............................................................................................. 56

12

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Valores de CE50 e intervalo de confiana para o efeito relaxante do


limoneno, carveol e lcool perlico em anis de aorta de ratos. ................................ 54

13

LISTA DE SIGLAS E ABREVIAES

ACh

Acetilcolina

AMPc

Adenosina monofosfato cclico

ANOVA

Anlise de varincia

Cam

Calmodulina

CCOR

Canais para clcio operados por receptor

CCOV

Canais para clcio operados por voltagem

CEUA

Comit de tica para Uso de Animais

COE

Canais operados por estoque

COEM

Canais operados por estresse mecnico

DC

Dbito cardaco

DBF

Dibutirato de forbol

DG

Diacilglicerol

EGTA

cido etileno-bis (-amino-etil-ter)-N,N,N,N-tetractico

E. P. M

Erro padro da mdia

E(+)

Anis de aorta com endotlio

E(-)

Anis de aorta sem endotlio

FHDE

Fator hiperpolarizante derivado do endotlio

GMPc

Guanosina monofosfato cclico

IP3

Inositol 1,4,5 trifosfato

IP3R

Receptores de IP3

KHB

Krebs Henseleit Buffer

14

LCIC

Liberao de clcio induzida por clcio

L-NAME

N (G)-nitro-L- arginine metil ester

MLV

Msculo Liso Vascular

MLCK

Quinase de cadeia leve da miosina

MLCP

Fosfatase de cadeia leve da miosina

NCX

Trocador sdio-clcio

NOs

xido ntrico sintase

NO

xido ntrico

OE

leos essenciais

PA

Presso arterial

FE

Fenilefrina

PIP2

fosfatidilinositol 4,5 bifosfato

PKC

Protena quinase C

PLC

Fosfolipase C

PMCA

Ca2+-ATPase na membrana plasmtica

RhoK

Rho cinase

rMLC

Cadeia leve regulatria da miosina

ROS

Espcies reativas de oxignio

RS

Reticulo sarcoplasmtico

Rp

Resistncia perifrica

RyR

Receptores de rianodina

SBCAL

Sociedade Brasileira de Cincia em Animais de Laboratrio

15

SERCA

Ca2+/Mg+ ATPase do retculo sarcoplasmtico

TRP

Receptores de potencial transiente

0Ca2+

Soluo de Krebs isenta de Ca2+

[Ca2+]i

Concentrao de clcio intracelular

16

SUMRIO
1 INTRODUO ___________________________________________________ 18

2 REFERENCIAL TERICO __________________________________________ 20


2.1 Plantas medicinais ______________________________________________ 20
2.2 leos essenciais e terpenos ______________________________________ 21
2.2.1 Limoneno ___________________________________________________ 23
2.2.2 Carveol _____________________________________________________ 24
2.2.3 lcool perlico ________________________________________________ 25
2.3 Sistema Cardiovascular __________________________________________ 26
2.4 O msculo liso vascular _________________________________________ 28
2.4.1 Acoplamento excitao-contrao do msculo liso ___________________ 28
2.4.2 Contrao do msculo liso ______________________________________ 30
2.4.3 Relaxamento do msculo liso vascular ____________________________ 31
2.5 Endotlio vascular ______________________________________________ 33
3 JUSTIFICATIVA __________________________________________________ 36

4 OBJETIVOS _____________________________________________________ 38
4.1 Objetivo geral __________________________________________________ 38
4.2 Objetivos especficos____________________________________________ 38
5 MATERIAIS E MTODOS __________________________________________ 39
5.1 Animais _______________________________________________________ 39
5.2 Sais, frmacos e solues________________________________________ 39
5.3 Procedimentos experimentais ____________________________________ 40
5.4 Reatividade muscular em anis de aorta ____________________________ 40
5.5 Sries experimentais ____________________________________________ 42
5.6 Anlise estatstica ______________________________________________ 44
6 RESULTADOS ___________________________________________________ 45
6.1 Efeito do limoneno, carveol e lcool perlico sobre o tnus basal intrnseco
em anis de aorta. _________________________________________________ 45

17

6.2 Efeito relaxante do limoneno, carveol e lcool perlico sobre o acoplamento


eletromecnico em anis de aorta. ____________________________________ 46
6.3 Efeito relaxante do limoneno, carveol e lcool perlico sobre o acoplamento
farmacomecnico em anis de aorta. __________________________________ 49
6.4 Estudo da modulao nitrrgica no efeito relaxante do limoneno, carveol e
lcool perlico sobre o acoplamento farmacomecnico em anis de aorta ___ 52
6.5 Efeito relaxante do limoneno, carveol e lcool perlico sobre a contrao
induzida por DBF (1 M) independente dos estoques intracelulares ________ 55
7 DISCUSSO _____________________________________________________ 57

8 CONSIDERAES FINAIS _________________________________________ 64

REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS ____________________________________ 65

ANEXO __________________________________________________________ 77

18

1 INTRODUO

Desde os primrdios da humanidade, os produtos naturais tm


despertado o interesse da populao na busca de tratamento para diversas
patologias, no somente pelo fator econmico, mas tambm pela transmisso
secular das tradies culturais de cada comunidade.
Dentre as enfermidades que acometem grande parte da populao
mundial esto as doenas cardiovasculares, que so uma das principais causa de
morte no mundo. As doenas cardiovasculares so responsveis por cerca de 17
milhes de mortes por ano, quase um tero da mortalidade total. Entre essas
doenas, complicaes oriundas da hipertenso somam, aproximadamente, 9,4
milhes de mortes no mundo a cada ano. A hipertenso responsvel por pelo
menos 45% das mortes devido doena cardaca e 51% das mortes devido a
acidente vascular cerebral (WHO, 2013).
A hipertenso arterial uma condio clnica multifatorial caracterizada
por nveis elevados e sustentados de presso arterial (PA) e que associada,
frequentemente, a alteraes funcionais e/ou estruturais dos rgos alvo (corao,
encfalo, rins e vasos sanguneos) e a alteraes metablicas. Ela um dos fatores
de risco mais importantes para outras doenas cardiovasculares, como doena
cerebrovascular, a insuficincia cardaca, doena arterial coronariana, dentre outras
(KAPLAN, 1998; SOCIEDADE BRASILEIRA DE CARDIOLOGIA, 2006; BRANDO,
2010)
O aumento da resistncia perifrica total est entre os vrios fatores que
levam elevao dos nveis de PA (SHEPHERD, 1990). O fluxo sanguneo regional
e a perfuso dos capilares so influenciados por diversos fatores, como o
metabolismo tecidual e mediadores de ao local. Entretanto, os principais fatores
que regulam o fluxo contnuo nos capilares so a distensibilidade das grandes
artrias e a resistncia na microcirculao (FOLKOW, 1982).
A resistncia hemodinmica, que influencia o fluxo sanguneo, varia,
principalmente, por mudanas dimensionais dos vasos em resposta a variao da
presso transmural. Devido ao perfil elstico dos grandes vasos sanguneos, quanto
maior a presso, maior ser o calibre do vaso e menor ser sua resistncia.
importante salientar que a contrao e o relaxamento do msculo liso vascular

19

(MLV) desempenham um papel importante na regulao da resistncia vascular


perifrica e PA (KHALIL, 2010).
Diversas medidas teraputicas so utilizadas para o tratamento das
doenas cardiovasculares e outras enfermidades que afetam a populao mundial.
Dentre as opes de tratamento dessas enfermidades, a utilizao de produtos
derivados de plantas medicinais tem ganhado destaque no meio cientfico.
A utilizao de plantas medicinais pela populao mundial tem crescido
nos ltimos anos. Pases com grande biodiversidade e com amplos conhecimentos
tradicionais, como o Brasil, possuem um grande potencial para o desenvolvimento
de novas drogas (FUNARI; FERRO, 2005). Os fitoterpicos, alm de constiturem
um recurso teraputico de grande parte da populao brasileira e de mais de 2/3 da
populao do planeta, movimentam cerca de US$ 22 bilhes por ano no mercado
mundial e vem seduzindo, a cada ano, mais adeptos nos pases desenvolvidos
(PINTO et al, 2002).
Estudos com plantas odorferas do nordeste brasileiro apontam vrios
leos essenciais (OE) e constituintes com potencial importncia econmica (LEALCARDOSO; FONTELES, 1999). Esses trabalhos mostram que os OEs possuem
atividade antibacteriana (AL-MARIRI et al., 2013), antioxidante, antiinflamatria,
antinociceptiva ( JEENA; LIJU; KUTTAN, 2013; BAKKALI et al, 2008), efeito
vasorelaxante associado a uma baixa toxicidade aguda (DE FRANA-NETO et al,
2012), alm de mostrarem atividade coerente com o uso popular. Dentre os
constituintes de diversos OE os monoterpenos e monoterpenides apresentam
aes farmacolgicas em diversos tecidos biolgicos. Dentre esses compostos
encontramos o limoneno, o carveol e o lcool perlico.

20

2 REFERENCIAL TERICO

2.1 Plantas medicinais

O relato sobre a utilizao de plantas para o tratamento de enfermidades


remonta s sagradas escrituras e ao papiro de Ebers, onde esto descritas diversas
doenas e muitas preparaes de origem animal e vegetal. Diversos achados
arqueolgicos demonstram que o uso de substncias de origem vegetal amplo em
diversas culturas (PINTO et al, 2002).
A utilizao das plantas medicinais para o tratamento de doenas
comeou de forma emprica e, durante muitos sculos, elas constituram a nica
alternativa teraputica para o homem. Ainda hoje, em feiras livres ou mercados
populares, verifica-se a utilizao de plantas para o tratamento e a cura de
enfermidades. Tal fato oriundo das observaes populares e da divulgao sobre
os efeitos dessas plantas que foram passados de gerao em gerao durante
sculos (LPEZ, 2006).
Com o crescimento de pesquisas na rea farmacutica, as plantas
medicinais passaram a ser um importante objeto de estudo, deixando de se
fundamentar apenas no uso tradicional e passando a se apoiar em aspectos de
qualidade, eficcia e segurana. Atualmente so bastante utilizadas como fonte de
substncias para a sntese de fitoterpicos (CUNHA; SILVA; ROQUE, 2003).
O estmulo ao desenvolvimento e a utilizao de fitoterpicos tem
crescido nos ltimos anos com o objetivo de prevenir, curar ou amenizar os sintomas
de diversas doenas, sendo mais acessvel populao e aos servios pblicos de
sade (TOLEDO et al. 2003). Aliado a isto, os fitoterpicos possuem como
vantagens: vrios compostos com efeitos similares; associao de mecanismos por
compostos agindo em alvos moleculares diferentes; menores riscos de efeitos
colaterais, pois os compostos ativos esto presentes em concentraes reduzidas
nas plantas e; demandam menores custos para a pesquisa (YUNES; PEDROSA;
CHECHINEL FILHO, 2001).
Dentre os agentes teraputicos oriundos de plantas medicinais podemos
encontrar os OEs.

21

2.2 leos essenciais e terpenos

O termo leo essencial foi usado pela primeira vez no sculo XVI por
Paracelsus von Hohenheim. Por volta do sculo XX, os OE eram utilizados,
principalmente, para a fabricao de perfumes e cosmticos, enquanto que sua
utilizao em preparaes farmacuticas era pouco explorada (EDRIS, 2007).
Atualmente os leos essenciais so utilizados em diversos campos. Alm
do setor de perfumaria e cosmticos, eles tambm so utilizados na nutrio e
fitoterapia, onde esta utilizao destaca-se pelo aspecto tradicional. Tal fato tem
despertado interesse do meio cientfico que, passou a estudar as propriedades
qumicas e farmacolgicas dessas substncias, visando investigar seu possvel
efeito teraputico (LAHLOU, 2004).
Os leos essenciais so compostos complexos, volteis e que
apresentam odor forte. So extrados de vrias plantas aromticas de regies de
clima temperado ou quente e so resultantes do metabolismo secundrio dessas
plantas. Podem ser sintetizados por todas as partes da planta, ou seja, brotos,
flores, folhas, caules, galhos, sementes, frutos, razes ou cascas e so armazenados
em clulas secretoras, cavidades, canais, clulas epidrmicas ou tricomas
glandulares (BAKKALI et al., 2008).
A composio qumica dos leos essenciais pode variar pela influncia de
diversos fatores como, por exemplo, a poca de coleta, tcnica de extrao utilizada,
as condies climticas e de solo e, o rgo do vegetal do qual ele foi extrado
(RODRIGUES, 2002). Esses compostos so constitudos, principalmente, por
terpenos, fenilpropanides, steres e outras substncias de baixo peso molecular
(BAKKALI et al., 2008).
Os

terpenos

so

substncias

que

possuem

diversos

efeitos

farmacolgicos e biolgicos, formadas por uma unidade bsica denominada


isopreno (figura 1), que contem apenas hidrognio e carbono em sua estrutura. Eles
podem

ser

classificados

como

monoterpenos,

sesquiterpenos,

diterpenos,

sesterpenos e triterpenos de acordo com a quantidade de tomos de carbono em


sua estrutura (RODRIGUES, 2010).

22

Figura 1 - Unidade de isopreno (JOCA, 2012).

Diversos estudos tm demonstrado as atividades farmacolgicas de


terpenos. Dentre essas destacam-se: atividades antifngica (ZORE et al, 2011),
anti-inflamatria (PASSOS et al., 2006; SANTOS; RAO, 1998), antinociceptiva
(MELO et al., 2010; BATISTA et al., 2008), neuroprotetora (CHANG; KIM; CHUN,
2007) e vasorelaxante (PEIXOTO-NEVES et al., 2010).
Lima-Accioly et al., 2006 demonstraram o efeito do 1,8-cineol sobre a
excitabilidade em nervo citico de ratos. Tambm foi demonstrado que o 1,8-cineol
bloqueia a excitabilidade de neurnios do gnglio cervical superior de ratos, alm de
deprimir a contratilidade do miocrdio de um modo dependente da concentrao,
provavelmente agindo como um bloqueador de canais de clcio (SOARES et al.,
2005). O 1,8-cineol tambm possui atividade gastroprotetora, hipotensora,
bradicrdica e anti-inflamatria (JUERGENS et al., 2004; NEVES et al., 2007).
O carvacrol apresenta efeito vasorelaxante em aorta isolada de ratos
(AYDIN et al., 2007; PEIXOTO-NEVES et al., 2010), e em artria cerebral e
cerebelar de ratos (EARLEY et al., 2010). Tambm foi demonstrado que esse
monoterpenide bloqueia o potencial de ao composto no nervo citico de ratos
(GONALVES et al., 2010) e inibe corrente de sdio dependentes de voltagem no
gnglio da raiz dorsal de ratos, bloqueando a excitabilidade neuronal (JOCA et al.
2012). Assim, estes autores sugerem que o carvacrol pode atuar como um
anestsico local. Alm disso, o carvacrol apresenta efeito antibacteriano, antifngico
e antioxidante (ULTEE et al., 2002; LEE, JIN, 2008; GUIMARES et al., 2010;
VALE-SILVA et al., 2010).

23

O timol, ismero do carvacrol, tambm apresenta efeito vasorelaxante em


aorta isolada de ratos (PEIXOTO-NEVES et al., 2010). O terpineol possui efeito
hipotensor (RIBEIRO et al., 2010) e vasorelaxante em leito mesentrico de ratos
(MAGALHES et al., 1998).
Bastos et al. (2010), mostraram que o citronelol possui efeito hipotensor
em ratos normotensos e efeito vasorelaxante em artria mesentrica de ratos.
Sousa et al. (2006) ao estudarem o efeito anticonvulsivante do citronelol,
demonstraram que este composto reduziu significativamente o nmero de animais
com convulses induzidas por petilenotetrazol e eliminou o reflexo extensor induzido
por eletrochoque em 80% dos animais.
A rotundifolona, o principal constituinte do leo essencial de Mentha x
villosa induz efeito vasorelaxante em aorta isolada de ratos (GUEDES et al., 2004).
2.2.1 Limoneno
O limoneno, 4-isoprenil-1-metil-ciclo-hexeno (figura 2) com frmula
molecular C10H16, um monoterpeno monocclico presente na composio dos
leos essenciais de diversas espcies de plantas aromticas, dentre as quais,
encontram-se a Lippia alba e Artemisia dracunculus, alm de ser encontrado nos
leos essenciais dos ctricos como limo laranja e tangerina (AMARAL, et al,
2007). Devido a seu odor ctrico, o limoneno muito utilizado como fragrncia em
perfumes, sabonetes, alimentos e bebidas (SUN, 2007).
Devido a sua baixa solubilidade em gua e alta tendncia autoxidao e
polimerizao, este constituinte vem se tornando um subproduto industrial adequado
a bioconverses em compostos de alto valor comercial (MARSTICA JUNIOR;
PASTORE, 2007).
Diversos estudos tm sido realizados para demonstrar os efeitos desse
monoterpeno. Hirota et al. (2010) sugeriram que o limoneno pode ser eficaz no
tratamento da asma brnquica devido ao seu efeito anti-inflamatrio que,
provavelmente, ocorre pela inibio de citocinas, produo de espcies reativas de
oxignio (ROS) e inativao da migrao de eosinfilos. Rozza et al. (2011)
demonstraram que o limoneno possui atividade gastroprotetora em modelos de
lcera gstrica induzidos por indometacina e etanol. Alm disso, O limoneno
apresenta atividade quimiopreventiva para cncer de mama, pulmo, pele e fgado
(CROWELL,1997).

24

limoneno

tambm

possui

atividade

antinociceptiva

devido,

provavelmente, a inibio da sntese ou da ao de mediadores inflamatrios alm


de atividade antihiperglicmica em ratos diabticos induzidos por estreptozotocina.
(AMARAL, et al., 2007; MURALI; SARAVANAN, 2012).

Figura 2 Frmula estrutural do limoneno (SANTOS et al., 2011b)

2.2.2 Carveol
O carveol, p -Mentha-6,8-dien-2-ol (Figura 3), um monoterpeno de peso
molecular 152,24 Da e frmula molecular C10H16O. utilizado no setor de
cosmticos como fragrncia de xampus, sabonetes e perfumes e no setor de
limpeza e detergentes (BHATIA et al, 2008a).
Em

estudo

comparativo,

verificou-se

que

carveol

outros

monoterpenides que possuem o grupo hidroxila em sua estrutura qumica,


apresentaram maior efeito nematicida sobre Meloidogyne incognita, sugerindo que a
presena desse radical importante para essa atividade

(ECHEVERRIGARAY;

ZACARIA; BELTRO, 2010).


Carveol, administrado na dieta diria, foi eficaz contra o cncer mamrio
de rato induzido por DMBA (7-12-dimetilbenzantracena) durante a fase inicial
(KARL-HEINZ; IBRAHIM, 2003).
Omolo et al. (2004) demonstraram o efeito repelente do Carveol sobre
Anopheles gambiae. Esses autores tambm sugerem que a presena do grupo
hidroxila pode ser importante para a atividade repelente de diversos compostos.

25

Figura 3 - Formula estrutural do carveol (SANTOS et al, 2011b).

2.2.3 lcool perlico


O lcool perlico, p-Mentha-1,8-dien-7-ol, com frmula molecular
C10H16O (Figura 4), um monoterpenides encontrado nos leos essenciais do
limo, lavanda, hortel e gengibre. Devido ao seu aroma agradvel, ele utilizado
em produtos cosmticos, perfumes, xampus, sabonetes, produtos de limpeza e no
setor alimentcio (GARCIA, et al, 2010; BHATIA et al, 2008b).

Figura 4 - Formula estrutural do lcool perlico (BHATIA et al, 2008b).

Relatos na literatura apontam que o lcool perlico capaz de inibir a


proliferao de clulas cancergenas do pulmo (XU et al., 2004) e mama (YURI et
al., 2004), alm de promover a regresso de gliomas malignos no sistema nervoso

26

central,

podendo

ser

considerado

um

promissor

agente

anticarcinognico

(FONSECA et al, 2008).


O tratamento com lcool perlico foi benfico na preveno da toxicidade
heptica induzida por etanol provavelmente pela inibio de citocinas inflamatrias e
inibio da peroxidao lipdica (KHAN; NAFEES; SULTANA, 2011). Omolo et al.
(2004) demonstraram o efeito repelente do lcool perlico sobre A. gambiae.

2.3 Sistema Cardiovascular

O sistema cardiovascular composto pelo corao e vasos sanguneos


(veias, artrias e capilares). Atravs dele, substncias essenciais para o organismo
so transportadas e distribudas por todo o corpo. Alm disso, esse sistema remove
subprodutos metablicos, regula a temperatura corporal, mantm o balano de
fluidos e distribuio de oxignio (BERNE; LEVY, 2009).
O corao, que possui controle autnomo, capaz de impulsionar
volumes de sangue para todo o corpo, atravs de vasos sanguneos. composto
por duas bombas que interagem com a circulao pulmonar (onde ocorre o processo
de hematose) e a circulao sistmica (onde o sangue distribudo para todos os
tecidos do corpo). Alm disso, o corao possui vlvulas que promovem um fluxo
unidirecional do sangue (BERNE; LEVY, 2009).
Por sua vez, os vasos sanguneos funcionam como capacitor passivo que
mantm a presso arterial durante a distole, bem como um controle autoregulatrio que permite a adequao do rgo s respostas locais (KASSAB, 2006).
A estrutura dos vasos sanguneos varia de acordo com as diferentes
funes. Em geral, eles so compostos por trs camadas: tnicas ntima, mdia e
adventcia (figura 5). A camada ntima composta por um tecido fibroso coberta por
clulas endoteliais. A camada mdia composta por vrias camadas de clulas
musculares lisas, dispostas de maneira circunferencial e separadas por colgeno e
fibras elsticas. A camada adventcia possui vrias fibras de colgeno e tecido
elstico (KASSAB, 2006).
As grandes artrias, como a aorta e a artria pulmonar so bastante
distensveis devido grande quantidade de elastina na tnica mdia, sendo
conhecidas como artrias elsticas. J as mdias e pequenas artrias, artrias

27

musculares, possuem maior quantidade de msculo liso. As arterolas, vasos com


menos de 100 m de dimetro determinam a resistncia ao fluxo sanguneo. Os
capilares, vasos de troca, possuem pequeno dimetros e sua parede basicamente
composta por clulas endoteliais. Sua espessura facilita a troca de substncias com
os tecidos. As vnulas e veias permitem a regulao do volume venoso e o
armazenamento sanguneo, respectivamente. Elas apresentam vlvulas que
previnem o fluxo retrgrado do sangue (AIRES, 2008).

Figura 5 - Estrutura vascular bsica (MAIA-JOCA, 2012)

A principal funo do sistema cardiovascular, a distribuio de nutrientes


para as diversas partes do organismo, feita atravs de um fluxo sanguneo, que
passa de pulstil a contnuo. O fluxo arterial pulstil ocorre devido a uma ejeo
intermitente do sangue pelo corao e passa a ser contnuo ao nvel dos capilares.
Tal fator de extrema importncia para uma troca eficiente de nutrientes entre o
sangue e os tecidos (BERNE; LEVY, 2009). Alm disso, vale ressaltar que este
sistema fundamental para o controle da PA e, consequentemente, da
homeostasia.
A PA pode ser descrita pelos seus dois determinantes bsicos: o dbito
cardaco (DC) e resistncia perifrica (Rp), representada pela seguinte frmula:

28

PA = DC x Rp

A PA determinada pela fora propulsora cardaca, capacidade de


dilatao da aorta e pela resistncia ao fluxo de sangue, exercida, principalmente,
pelas arterolas e artrias de calibre inferior a 200 m, como as presentes no leito
mesentrico vascular. Logo, alteraes na presso sangunea podem estar
relacionadas a alteraes no dbito cardaco e/ou na resistncia vascular perifrica
(AIRES, 2008). A regulao da PA ocorre em curto, mdio ou longo prazo como, por
exemplo, a ao de barorreceptores e liberao de renina pelas clulas do aparelho
justaglomerular.
importante salientar que a contrao e o relaxamento do MLV
desempenham um papel importante na regulao da resistncia vascular perifrica e
PA. Sua desregulao pode levar a doenas vasculares, como doena arterial
coronariana e hipertenso (KHALIL, 2010).

2.4 O msculo liso vascular

O msculo liso est presente em diversos rgos como as vias areas,


bexiga, trato gastrointestinal e vasos sanguneos. As clulas do msculo liso
possuem aspecto fusiforme, medindo de 40 a 600 m de comprimento. Ao contrrio
das clulas do msculo esqueltico, as clulas musculares lisas no apresentam
tbulos T, e sim, cavolas que aumentam a superfcie das clulas e esto prximas
ao retculo sarcoplasmtico, rede de membranas intracelulares que regulam a
concentrao de clcio. Tambm no h um sarcmero bem definido, como ocorre
nas clulas do msculo esqueltico. Estas clulas apresentam uma disposio que
varia de acordo com o rgo, podendo ser longitudinal ou circunferencial. Nas vias
areas e nos vasos sanguneos, elas esto dispostas de maneira circunferenciale a
sua contrao leva a uma diminuio do dimetro do vaso (KAO; CARSTEN 1997).
2.4.1 Acoplamento excitao-contrao do msculo liso
A contrao da musculatura lisa ocorre devido a um estmulo que
aumenta a concentrao de Ca2+, principalmente, no meio intracelular.

O Ca2+

29

necessrio para a contrao pode ser oriundo do meio externo (extracelular) e/ou do
meio interno (intracelular). O Ca2+ do meio interno oriundo de estoques
intracelulares como o reticulo sarcoplasmtico (RS). Os ons Ca2+ provenientes do
meio externo penetram na clula por canais inicos na membrana plasmtica, como
por exemplo, canais para Ca2+ operados por voltagem (CCOV), canais para Ca2+
operados por receptor (CCOR), canais operados por estoque (COSs) e aqueles
ativados por estresse mecnico (CAEMs) (REMBOLD, 1992; MCFADZEAN;
GIBSON, 2002).
O estmulo para a contrao da musculatura lisa vascular pode ocorrer
por quatro fatores: despolarizao da membrana das clulas musculares lisas
(promovendo o influxo de clcio por CCOV, como ocorre quando a clula exposta
a alta concentrao de potssio); agonistas contrteis (que promovem o influxo de
Ca2+ atravs dos CCOR); agonistas que liberam clcio de estoques de clcio
intracelular; agonistas que aumentam a sensibilidade das protenas contrteis ao
clcio (BRNY, 1996).
O primeiro desses estmulos chamado de acoplamento eletromecnico
(figura 6). A alterao do potencial transmembrana pelo disparo de potenciais de
ao ou por ativao de canais inicos dependentes de estiramento, torna o
potencial transmembrana das clulas do msculo liso menos negativo, ou seja, a
clula sofre um processo de despolarizao. Tal fato ocasiona um aumento na
probabilidade de abertura de canais para clcio, permitindo um influxo desse on
atravs da membrana plasmtica, desencadeando, assim, o processo de contrao
muscular (HAEUSLER, 1985). Essa despolarizao aumenta a concentrao de
clcio no meio intracelular, principalmente, pela ativao de canais para clcio do
tipo L (BRNY,1996). A concentrao do Ca2+ intracelular ([Ca2+]i) pode aumentar,
ainda mais, pela liberao de Ca2+ induzida por Ca2+ dos estoques intracelulares.
(HILL et al., 2001).
Quando o aumento da [Ca2+]i ocorre pela associao de agonistas a
receptores de membrana sem alterao no potencial transmembrana da clula, o
acoplamento excitao-contrao do musculo liso nomeado de acoplamento
farmacomecnico (figura 6) (SOMLYO; SOMLYO, 1968). Esse acoplamento envolve,
tanto a liberao de clcio dos estoques intracelulares como mecanismos que
aumentam a sensibilidade do aparato contrtil ao clcio. Agonistas como a
norepinefrina, angiotensina II e endotelina, se ligam a receptores de membrana

30

acoplados a proteina heterodimrica G, que ativa a fosfolipase C. Esta, por sua vez,
ativa a hidrlise do fosfatidilinositol 4,5 bifosfato (PIP2) em inositol 1,4,5 trifosfato
(IP3)

e diacil glicerol (DG). O IP3 se liga a receptores localizados no reticulo

sarcoplasmatico liberando clcio para o citosol enquanto que o DG, juntamente com
o clcio, ativa a proteina kinase C (WEBB, 2003).
O IP3 causa a liberao de clcio do RS atravs da abertura de canal para
clcio na membrana do RS, chamado de receptor de IP3 (IP3R). Os ons clcio que
saem do RS pelos IP3R juntamente com o clcio oriundo do meio extracelular ativam
os receptor de rianodina (RyR) na membrana do retculo sarcoplasmtico. Essa
liberao do clcio atravs dos RyR denominado liberao de clcio induzida por
clcio (LCIC) (WEBB, 2003; CHENG; LEDERER, 2008).

Figura 6 - Acoplamento excitao-contrao do msculo liso (WEBB,2003)

2.4.2 Contrao do msculo liso


O aumento da [Ca2+]i permite que esse on se ligue calmodulina (Cam)
formando o complexo Ca2+-Cam. Este complexo ativa a quinase de cadeia leve da
miosina (MLCK), formando o complexo Ca2+-Cam-MLCK que deslocar a seqncia
auto-inibitria da MLCK. Esses eventos levam a ativao da MLCK e a fosforilao

31

do aminocido Ser19 da cadeia leve regulatria da miosina (rMLC), que ativa a


ATPase da miosina (figura 6). Essa ativao promove a interao entre a actina e a
miosina capaz de produzir o incio da contrao no msculo liso (BERRIDGE, 1993;
NILSSON; JENSEN; MULVANY, 1994; MASUO et al. 1994, TAYLOR et al., 1999,
REMBOLD, 1992, WEBB 2003).
Alm da contrao dependente de Ca2+, o aumento da sensibilidade do
aparato contrtil a esse on se configura como outra forma de contrao do MLV.
Esta sensibilizao o aumento da afinidade dos filamentos grossos e finos
baseados no nvel de fosforilao da rMLC (REMBOLD, 1992).
A fosforilao da rMLC aumenta a fora do ciclo das pontes cruzadas e
regulada pelas protenas quinases, RhoA e fosfatase de cadeia leve da miosina
(MLCP). A RhoA leva ativao do seu efetor, Rho quinase (RhoK), que fosforila a
subunidade ligada miosina resultando na inibio da MLCP e, assim, favorecendo
a contrao. Outro mecanismo regulatrio envolve a protena CPI-17 que serve
como substrato tanto para a RhoK quanto para a protena quinase C (PKC). Quando
fosforilada, ela inibe a atividade enzimtica da subunidade PP1c da MLCP
aumentando a fosforilao da rMLC e prolongando a contrao do msculo liso
(SOMLYO E SOMLYO, 1994; KIMURA et al., 1996; KITAZAWA et al., 2000).
O msculo liso apresenta dois tipos de contraes: as contraes fsicas
e as tnicas. As fsicas caracterizam-se por contraes e relaxamentos com
velocidade rpida, comum nos msculos lisos viscerais e veia porta. J as
contraes tnicas so lentas e mantm o tnus contrtil, encontradas nos msculos
lisos vasculares, principalmente na aorta (SOMLYO; SOMLYO, 1968).

2.4.3 Relaxamento do msculo liso vascular


O relaxamento do msculo liso necessita do aumento da atividade da
MLCP e a diminuio da concentrao de clcio do meio intracelular, que pode
ocorrer devido remoo do estmulo contrtil ou pela ao de agentes
vasorelaxantes (figura 7) (WEBB, 2003).
O relaxamento do MLV tem incio com a diminuio da [Ca2+]i que pode
ocorrer por inmeros fatores como, por exemplo, pela recaptao do Ca2+ pelo RS.
Essa recaptao ocorre pela ao de um polipeptideo de 110 kDa localizado no
retculo sarcoplsmtico chamado de SERCA. Essa molcula possui duas funes

32

principais: 1) possibilitar o relaxamento muscular pela diminuio da [Ca2+]i e 2)


restaurar os estoques intracelulares de Ca2+ necessrios para a contrao muscular
(PERIASAMY; KALYANASUNDARAM, 2007).
Outro mecanismo que causa um vasorelaxamento pela diminuio da
[Ca2+]i o efluxo de Ca2+ pela membrana plasmtica. Esse efluxo pode ocorrer por
dois meios: pelo trocador Na+/ Ca2+ (NCX), de baixa afinidade e alta capacidade e
pela Ca2+ -ATPase (MPCA), uma bomba de Ca2+ da membrana plasmtica de alta
afinidade e baixa capacidade (BRINI, CARAFOLI, 2011).

Figura 7 - Mecanismo de controle da concentrao de clcio intracelular (AKATA, 2007)

KARAKI et al. (1997) afirmam que a hiperpolarizao tambm contribui


para o relaxamento muscular. Diversas substncias abrem canais de potssio,
hiperpolarizando a membrana e inibindo canais de Ca2+ do tipo L, impedindo o
influxo de Ca2+ pela membrana. Tal fato diminui a [Ca2+]i, impedindo a contrao
muscular.
O vasorelaxamento do msculo liso tambm pode ocorrer por intermdio
de agentes farmacolgicos que promovem o aumento de adenosina monofosfato
cclico (AMPc) ou guanosina monofosfato cclico (GMPc).
Mecanismos que aumentam a atividade da MLCP, tambm levam ao
relaxamento do MLV pela remoo do fosfato presente na rMLC. Essa fosfatase
consiste de 3

subunidades:

uma

subunidade

regulatria

MYPT1,

uma

33

subunidade

cataltica

PP-1C e

uma

subunidade

com funo desconhecida

(HARTSHORNE; ITO ; ERDODI, 1998). Trabalhos relatam que a MLCP


ativada

por

GMPc, por fosforilao

da

Telokin

ou por inibio

da

RhoA

(PFTIZER et al., 1986; LEE; LI; KITAZAWA, 1997; SURKS et al., 1999; WU et
al., 1998; SAUZEAU et al., 2000).

2.5 Endotlio vascular

O endotlio vascular, alm de desempenhar um papel de extrema


importncia para a manuteno do tnus vascular, auxilia no processo de
relaxamento vascular.
O endotlio vascular uma fina camada de clulas que est presente na
superfcie luminal dos vasos sanguneos e tem uma grande superfcie de troca de
nutrientes entre o sangue e os tecidos. Ele controla o tnus muscular pela produo
de mediadores que provocam vasorelaxamento (xido ntrico, fator hiperpolarizante
derivado do endotlio e prostaciclinas) e vasoconstrio (prostaglandina H2, a
tromboxana A2, a angiotensina II, a endotelina-1 e os nions superxido ou espcies
reativas de oxignio) (JIN et al., 2010; CARVALHO et al., 2001).
O xido ntrico (ON) produzido pelas clulas endoteliais a partir da
converso de L-arginina para L-citrulina pela ao da enzima ON-sintase (NOs). O
NO possui uma variedade de funes, sendo sua ao como fator relaxante
derivado do endotlio uma das principais para a manuteno da homeostase
vascular (KAWASHIMA; YOKOYAMA, 2004).
De acordo com Hove et al (2009) o NO pode causar vasodilatao pela
diminuio da sensibilidade do aparato contrtil ao Ca2+ atravs da estimulao da
MLCP. Esse efeito ocorre pela ativao da guanilato ciclase que ao produzir GMPc
afeta o influxo e o efluxo de Ca2+, pela inibio da liberao da Ca2+ por IP3, cADPribose e cafena, por acelerar a recaptao do Ca2+ pelo RS e pela ativao de
canais de K+.
As prostaciclinas (PGI2) e a prostaglandina E2 tambm so substncias
que promovem o relaxamento do msculo liso vascular. As prostaciclinas facilitam a
liberao de ON pelas clulas endoteliais, que, por sua vez, potencializa os efeitos
das prostaciclinas no msculo liso. O NO aumenta a sntese de GMPc e inibe a

34

fosfodiesterase, evitando a degradao do AMPc, que prolonga o efeito das


prostaciclinas no msculo liso (STANKEVICIUS et al., 2003).
O fator hiperpolarizante derivado do endotlio (FHDE) outro fator que
promove vasorelaxamento e que tem sido amplamente estudado. Apesar de no ter
sido identificado, muitos autores acreditam que esse FHDE pode ser ons K+, AMPc,
produtos do citocromo P450, entre outros. O efeito vasodilatador do FHDE
mediado pela ativao de canais de K+, ainda no identificados, na musculatura lisa
que hiperpolarizam a membrana levando a uma diminuio da [Ca2+]i. O ON e as
PGI2 atuam predominantemente em vasos de conduo, enquanto o FHDE
predomina em artrias de resistncia (CARVALHO et al., 2001; SCOTLAND et al.,
2005; JIN et al. 2010) (figura 8).

Figura 8 - Mecanismo de relaxamento do msculo liso dependente do endotlio

(STANKEVICIUS et al., 2003).

Entre os fatores contraturantes derivados do endotlio encontramos a


angiotensina II e as endotelinas, ambos causando vasoconstrio pelo aumento da
[Ca2+]i.
A angiotensina II um peptdeo derivado do angiotensinognio na via do
sistema renina-angiotensina. Ao se ligar aos seus receptores (AT1) acoplados a

35

protena G, a angiotensina II promove a ativao do PLC, gerando IP 3 e DG,


aumentando a [Ca2+]i, ou seja, promove contrao por estimular a liberao de Ca2+
dos estoques intracelulares. J as endotelinas so peptdeos de 21 aminocidos
produzidos por vrios tecidos. Ao se ligarem aos seus receptores promovem a
despolarizao da membrana plasmtica, causando o influxo e o aumento da [Ca2+]i
e, consequentemente, uma contrao muscular sustentada (CARVALHO et al, 2001;
WYNNE; CHIAO; WEBB, 2009)

36

3 JUSTIFICATIVA

Diversos estudos tm sido realizados relacionando a estrutura dos


monoterpenos

com

suas

atividades

biolgicas.

Gonalves

et

al.

(2010),

demonstraram que a presena do grupo hidroxila em molculas como carvacrol e


carveol refora o bloqueio do potencial de ao composto, enquanto que molculas
como o limoneno, sem o grupo hidroxila, tem essa ao atenuada ou abolida.
Ultee;

Bennik;

Moezelaar

et

al.

(2002)

estudaram

atividade

antibacteriana de alguns monoterpenos. O timol, o carvacrol e o mentol apresentam


atividade antibacteriana contra Bacillus cereus, enquanto que o p-Cimeno e o
Carvacrol metil ster, sem o grupo hidroxila, no afetam o desenvolvimento dessa
bactria. Santos et al. (2011) demonstraram que a presena de grupo hidroxila
diminui a potncia larvicida de alguns monoterpenos.
Vogt-Eisele et al. (2007) em um estudo sobre a ativao de receptores de
potencial transiente (TRP) por monoterpenos, demonstraram que os seis compostos
mais potentes apresentavam o grupo hidroxila em sua estrutura qumica. Eles
tambm demonstraram que quando esses grupos sofriam uma oxidao, a atividade
reduzia drasticamente, indicando que a presena do grupo hidroxila importante
para a ativao dos TRPs. A presena de hidroxila em terpenos tambm
importante na modulao de receptores GABA, canais inicos dependentes de
ligante encontrados no sistema nervoso central. Foi demonstrado que terpenos com
grupo hidroxila apresentavam efeito estimulatrio sobre esses receptores enquanto
diversas molculas sem o grupo hidroxila como o p-cimeno no apresentam este
efeito (MOHAMMADI et al., 2001).
O conhecimento de diferenas na interao de drogas com canais e
receptores em nvel molecular tem contribudo para uma compreenso das
diferenas entre o perfil farmacolgico observado clinicamente. Consequentemente,
uma anlise estrutura-funo de efeitos de drogas em diferentes canais e receptores
pode proporcionar uma base para a concepo de drogas que tem como alvo
receptores diferentes, com diferentes potncias, traduzindo-se em um padro
desejvel de efeitos inibitrios ou excitatrios (MOHAMMADI et al., 2001).
Baseado em diversos trabalhos na literatura que demonstram a
importncia de estudos relacionando a estrutura qumica com o efeito farmacolgico,

37

alm da ausncia de trabalhos sobre o efeito do limoneno, do carveol e do lcool


perlico em msculo liso vascular, esse trabalho teve como finalidade disponibilizar
dados sobre a ao desses monoterpenos no msculo liso vascular (MLV) de vasos
de complacncia relacionando os efeitos encontrados com a estrutura qumica
desses compostos.

38

4 OBJETIVOS

4.1 Objetivo geral

Estudar os efeitos do limoneno, carveol e lcool perlico sobre a contratilidade do


msculo liso vascular de ratos e relacionar esses efeitos com a estrutura qumica
desses compostos.
4.2 Objetivos especficos

Verificar o efeito do limoneno, carveol e lcool perlico sobre o tnus basal de anis
de aorta.
Investigar o efeito do limoneno, carveol e lcool perlico sobre o acoplamento
eletromecnico e farmacomecnico em anis de aorta.
Investigar o efeito do limoneno, carveol e lcool perlico sobre a sensibilidade das
protenas contrteis ao clcio.
Comparar o efeito do limoneno, carveol e lcool perlico em msculo liso vascular
relacionando a potncia e a eficcia com a estrutura molecular desses trs
monoterpenos.

39

5 MATERIAIS E MTODOS

5.1 Animais

Foram utilizados ratos machos adultos, da espcie Rattus norvegicus da


linhagem Wistar, com massa corprea compreendida entre 200 e 300 g, fornecidos
pelo Biotrio da Universidade Estadual do Cear.
Os animais foram mantidos sob condies adequadas de luz (ciclo
claro/escuro de 12/12 hs), sob temperatura controlada de 22 2C e com gua e
rao ad libitum. Os animais foram tratados de acordo a Diretriz Brasileira para o
Cuidado e a Utilizao e Animais para fins Cientficos e Didticos DBCA
estabelecida pelo Conselho nacional de controle de experimentao animal
(CONCEA).
O presente estudo foi devidamente submetido Comit de tica para Uso
de Animais da Universidade Estadual do Cear (CEUA-UECE) e aprovado com o
nmero de protocolo: 12237313-0

5.2 Sais, frmacos e solues

Os sais, com grau de pureza analtica, foram obtidos das companhias


Sigma Chemical Corporation (St. Louis, Missouri, USA) e VETEC (Rio de Janeiro,
RJ, Brasil).
Os frmacos utilizados tais como, limoneno, carveol, lcool perlico,
12,13-dibutirato de forbol (DBF), acetilcolina (ACh), fenilefrina (PHE),
tetractico etilenoglicol

(EGTA),

cido

cido etileno-bis (-amino-etil-ter)-N,N,N,N-

tetractico (EDTA), N -nitro-L-arginina metil ster (L-NAME) e tapsigargina foram


obtidos da empresa Sigma Chemical Corporation (St. Louis, Missouri, USA).
O limoneno, carveol e lcool perlico foram diludos em Tween 80
(concentrao final mxima de 0,05%) e soluo nutridora Krebs-Henseleit, DBF em
dimetil sulfxido (DMSO, Sigma Chemicals Co., St Louis, MO, USA) e os demais
frmacos e seus estoques foram diludos em gua destilada.

40

Como soluo nutridora para os experimentos de reatividade muscular foi


utilizada o Krebs Henseleit Buffer (KHB), com a seguinte composio expressa em
mM: NaCl (118), KCl (4,7), NaHCO3 (25), CaCl2 (2,5), KH2PO4 (1,2), MgSO47H2O
(1,2) e glicose (11). A soluo nutridora foi gaseificada com mistura carbognica
(95% O2 5% CO2), temperatura de 37C e com pH ajustado para 7.4 com HCl 1
M e/ou NaOH 1 M.
A soluo isenta de clcio ou zero clcio (0Ca2+) foi obtida pela omisso
do CaCl2 da soluo de KHB e adio de 2 mM de EGTA.

5.3 Procedimentos experimentais

Os animais foram pesados e, em seguida, sacrificados pela inalao de


CO2. Em seguida, foi realizada uma inciso no apndice xifide, sendo ento
removida a regio ventral do trax e todos os rgos intratorcicos para a exposio
da artria aorta. Esta foi removida e transferida para uma placa de Petri contendo
soluo nutridora de KHB, onde foi possvel a retirada do tecido periadventcio. A
aorta torcica foi, ento, seccionada em segmentos transversos circulares de 4 - 5
mm de comprimento. Quando necessrio, o endotlio vascular foi removido atravs
de uma leve raspagem da superfcie luminal de cada segmento artico.

5.4 Reatividade muscular em anis de aorta

Os segmentos da aorta torcica foram fixados, atravs de dois fios


metlicos, em cmaras de perfuso para rgos isolados com capacidade para 5 ml.
Os tecidos foram mantidos em soluo de KHB a temperatura de 37C, com pH 7,4
e constantemente gaseificados por mistura carbognica. Uma das extremidades da
preparao foi conectada a um transdutor de fora isomtrico (Grass, modelo F03,
Quincy, Mass., EUA) atravs de segmentos de ao inoxidvel e a outra extremidade
ficou acoplada a uma base fixa. As respostas mecnicas foram transformadas em
sinais eltricos pelo transdutor que, por sua vez, estava ligado a um amplificador
(DATAQ, modelo PM-1000, EUA) e este a uma placa conversora analgico digital
(DI-200, DATAQ Instrumentos, Inc. EUA) instalada em um computador. Os dados

41

experimentais foram armazenados em arquivos atravs do software WINDAQ verso


1.65 (DATAQ Instrumentos, Inc. EUA) para posterior anlise (Figura 9).

Figura 9 Equipamentos para experimentos de reatividade muscular.

Aps a montagem, as preparaes biolgicas foram mantidas sob tenso


basal de 1g por um perodo de 50 minutos para estabilizao e adaptao do tecido
s novas condies. Aps o perodo de estabilizao foram induzidas duas
contraes consecutivas com 60 mM de KCl adicionados diretamente ao banho
atravs de soluo hipertnica para verificar a resposta contrtil do tecido, sendo
consideradas viveis, as preparaes que apresentaram contraes superiores a 1g.
O endotlio vascular foi testado pela induo de uma contrao por 0,1
M de PHE seguida pela adio de 1 M

de ACh na preparao. Foram

considerados com endotlio os anis de aorta que apresentaram relaxamento


superior a 80% para a resposta contraturante induzida pela PHE.

42

5.5 Sries experimentais

Srie 1: Para investigar o efeito do limoneno, carveol e lcool perlico sobre o tnus
basal em anis de aorta com endotlio, foram adicionadas, separadamente, s
cmaras para rgos isolados concentraes crescentes e cumulativas desses trs
constituintes nas concentraes de 1, 3, 10, 30, 60, 100, 300, 600, 1000, 2000,
3000, 5000 M (figura 10). As preparaes controle foram incubadas com o mesmo
volume de tween80 das preparaes experimentais.

Figura 10 - Esquema ilustrativo da srie experimental 1. (*) Concentraes dos monoterpenos.

Srie 2: Com a finalidade de investigar o efeito do limoneno, carveol e lcool perlico


sobre o acoplamento farmacomecnico em anis de aorta, com e sem endotlio,
foram adicionadas s cmaras para rgos isolados concentraes cumulativas e
crescentes (1-5000 M) do limoneno, carveol e lcool perlico sobre uma contrao
induzida por PHE (1 uM). Em algumas preparaes de aorta com endotlio, o
inibidor de xido ntrico sintase (100 M), L-NAME, foi administrado 10 minutos
antes da contrao induzida por PHE. Sobre o plat desta contrao, foram
administradas as mesmas concentraes dos monoterpenides de maneira
crescente e cumulativa(1-5000 M)(figura 11). As preparaes controle foram
incubadas com o mesmo volume de tween80 contido nas concentraes das
preparaes experimentais.

43

Figura 11 - Esquema ilustrativo da srie experimental 2. (*) Concentraes dos monoterpenos/


veculo.

Srie 3: Para investigar o efeito do limoneno, carveol e lcool perlico sobre o


acoplamento eletromecnico em anis de aorta com e sem endotlio, aps uma
contrao induzida por KCl (60 mM), foram adicionadas s cmaras para rgos
isolados concentraes cumulativas e crescentes (1-5000 M) desses trs
compostos (figura 12). As preparaes controle foram incubadas com o mesmo
volume de tween80 contido nas concentraes das preparaes experimentais.

Figura 12 - Esquema ilustrativo da srie experimental 3. (*) Concentraes dos monoterpenos/


veculo.

Srie 4: com a finalidade de testar o efeito do limoneno, carveol e lcool perlico


sobre a via de aumento de sensibilidade ao Ca2+ ativada pela PKC, anis de aorta,
sem endotlio foram pr-contrados com dibutirato de forbol (DBF, 1 M), na
presena de tapsigargina. Em meio 0Ca2+ e com estoques depletados, o limoneno, o
carveol e o lcool perlico foram adicionados s preparaes nas concentraes de
300, 1000, 2000 e 3000 M. A preparao controle apresentava apenas tween 80
(figura13).

44

Figura 13 - Esquema ilustrativo da srie experimental 4. (*) Concentraes dos monoterpenos/


veculo.

5.6 Anlise estatstica

Os dados foram expressos como mdia erro padro da mdia (E.P.M),


com n indicando o nmero de experimentos. Os grficos e as CE50 foram
confeccionados e calculados utilizando o software Sigma Plot 11.0. As curvas
concentrao-resposta foram ajustadas pelo software Sigma Plot 11.0. baseadas na
equao de Hill seguindo a seguinte equao:

Onde %contrao o valor da contrao medida; %min e % mx so os


valores mnimos e mximos da contrao observada, [monoterpeno] a
concentrao do monoterpeno, CE50 o valor da concentrao onde o efeito de
relaxamento de 50% e k a inclinao da curva.
Foi utilizado o software Sigma Stat para as anlises estatsticas nas quais
foram considerados estatisticamente significantes os resultados que apresentarem
probabilidade de ocorrncia da hiptese nula menor que 5% (p < 0,05). A
significncia (p <0,05) dos resultados para mais de dois grupos experimentais foi
realizado por anlise de varincia (ANOVA) seguido de apropriado ps teste.

45

6 RESULTADOS

6.1 Efeito do limoneno, carveol e lcool perlico sobre o tnus basal intrnseco
em anis de aorta.

Preparaes arteriais, com endotlio intacto, foram estabilizadas com 1g


de tenso de repouso que foi considerado como tnus basal.
Como pode ser observado na figura 14, preparaes controle, expostas
apenas ao veculo (tween80), no apresentaram nenhuma alterao do tnus basal.
O limoneno, o carveol e o lcool perlico adicionados isoladamente em
concentraes crescentes e cumulativas (1 - 5000 M) tambm no causaram
alteraes estatisticamente significantes no tnus basal destas preparaes (p >
0,05, ANOVA de uma via)

Figura 14 - Grfico representativo das alteraes induzidas pelo limoneno, carveol e lcool perlico
sobre o tnus basal em anis de aorta com endotlio. Os valores foram expressos como mdia
E.P.M. No houve diferena estatisticamente significante entre o efeito do limoneno, carveol e lcool
perlico
em
relao
ao
controle
(P>0,05,
ANOVA
de
uma
via).

46

6.2 Efeito relaxante do limoneno, carveol e lcool perlico sobre o acoplamento


eletromecnico em anis de aorta.

Para avaliar os efeitos do limoneno, carveol e lcool perlico sobre o


acoplamento eletromecnico, foram utilizados anis de aorta, com e sem endotlio
(E(+) e E(-), respectivamente). A adio de 60 mM de K+ a essas preparaes
promoveu uma contrao sustentada cuja amplitude mdia foi de 1,55 0,06 g.
Conforme pode ser observado nas figuras 15 e 16, todos os
monoterpenides, adicionados sobre o plat da contrao induzida por K+, em
concentraes crescentes e cumulativas (1 - 5000 M), apresentaram efeito
relaxante, com similar eficcia farmacolgica (efeito mximo), sendo esse efeito
dependente de concentrao.
Em preparaes E(+) (figura 15), o limoneno apresentou efeito relaxante
diferindo estatisticamente do controle a partir da concentrao de 600 M (p < 0,05,
ANOVA de uma via, Holm-Sidak). O carveol e o lcool perlico apresentaram efeito
relaxante que diferiu estatisticamente do controle a partir da concentrao de 300
M (p < 0,05, ANOVA de uma via, Holm-Sidak). Os valores de CE50 para esse efeito
relaxante (835,33 33,49; 576,17 50,21 e 271,06 7,37 M respectivamente para
limoneno, carveol e lcool perlico), foram estatisticamente diferentes (p < 0,05,
ANOVA de uma via, Holm-Sidak) (tabela 1).
Nas preparaes E(-) (figura 16), o efeito relaxante do limoneno foi
estatisticamente significante a partir de 1000 M enquanto o do carveol e o do lcool
perlico foi estatisticamente significante a partir da concentrao de 100 M (p <
0,05, ANOVA de uma via, Holm-Sidak). Para essas preparaes os valores de CE50
foram 1477,30 26,68; 717,01 41,52 e 261,78 5,05 M para o limoneno, carveol
e lcool perlico, respectivamente, e diferiram estatisticamente entre si (p < 0,05,
ANOVA de uma via, Holm-Sidak) (tabela 1).
Preparaes controle, incubadas com o mesmo volume de tween80
contido

nas

concentraes

das

preparaes

relaxamento da contrao induzida por K+.

experimentais,

no

sofreram

47

Figura 15 - Efeito do limoneno, carveol e lcool perlico sobre o acoplamento eletromecnico em


anis de aorta com endotlio a) Traados experimentais originais das respostas relaxantes induzidas
pelo limoneno, carveol e lcool perlico sobre a contrao evocada por 60 mM de KCl em anis de
aorta com endotlio. b) Grfico representativo do efeito relaxante induzido pelo limoneno, carveol e
lcool perlico sobre a contrao induzida por 60 mM de KCl em anis de aorta de rato com endotlio.
Valores expressos como mdia E.P.M. (n) representa o nmero de experimentos. *(p<0,05, ANOVA
de uma via, seguido pelo teste de Holm-Sidak), concentrao a partir do qual houve efeito
significativo em relao ao controle.

48

Figura 16 - Efeito do limoneno, carveol e lcool perlico sobre o acoplamento eletromecnico em


anis de aorta sem endotlio a) Traados experimentais originais das respostas relaxantes induzidas
pelo limoneno, carveol e lcool perlico sobre a contrao evocada por 60 mM de KCl em anis de
aorta sem endotlio. b) Grfico representativo do efeito relaxante induzido pelo limoneno, carveol e
lcool perlico sobre a contrao induzida por 60 mM de KCl em anis de aorta sem endotlio.
Valores expressos como mdia EPM. (n) representa o nmero de experimentos. * (p<0,05, ANOVA
de uma via, seguido pelo teste de Holm-Sidak), concentrao a partir do qual houve efeito
significativo em relao ao controle.

49

6.3 Efeito relaxante do limoneno, carveol e lcool perlico sobre o acoplamento


farmacomecnico em anis de aorta.

Para avaliar os efeitos do limoneno, carveol e lcool perlico sobre o


acoplamento farmacomecnico foram utilizados anis de aorta E(+) e E(-). As
preparaes foram pr-contradas com 1 M de PHE, que promoveu uma contrao
sustentada com amplitude mdia de 1,346 0,06 g.
O limoneno, o carveol e o lcool perlico, adicionados sobre o plat da
contrao induzida pela PHE, em concentraes crescentes e cumulativas (1 - 5000
M), apresentaram efeito relaxante, com semelhante eficcia, sendo esse efeito
dependente de concentrao.
Em preparaes E(+) (Figura 17) o limoneno apresentou duas respostas
distintas. Nas concentraes de 300, 600 e 1000 M o limoneno potencializou a
contrao da PHE apresentando diferena estatstica na concentrao de 600 uM (p
< 0,05, ANOVA de uma via, Holm-Sidak). Ele tambm apresentou um efeito
relaxante, que foi estatisticamente significante a partir da concentrao de 2000 M
(p < 0,05, ANOVA de uma via, Holm-Sidak). O carveol e lcool perlico apresentaram
efeito relaxante que diferiu estatisticamente do controle a partir da concentrao de
600 M (p < 0,05, ANOVA de uma via, Holm-Sidak). Os valores de CE50 para esse
efeito foram 2170,74 185,63; 1089,06 277,31 e 572,99 73,53 M, para o
limoneno, carveol e lcool perlico, respectivamente. Houve diferena estatstica
entre a CE50 para o efeito relaxante do limoneno quando comparado com a CE 50 dos
monoterpenides hidroxilados (tabela 1).
Nas preparaes E (-) (figura 18), o efeito relaxante do limoneno, do
carveol e do lcool perlico foi estatisticamente significante a partir 1000, 600 e 300
M, respectivamente (p < 0,05, ANOVA de uma via, Holm-Sidak). Para essas
preparaes os valores de CE50 foram 1204,65 64,15; 1001,06 156,17 e 466,27
48,29 M para o limoneno, carveol e lcool perlico, respectivamente. A CE50 do
lcool perlico apresentou diferena com relao a CE 50 dos outros compostos
(tabela 1). Preparaes controle, incubadas com o mesmo volume de tween80
contido

nas

concentraes

das

preparaes

relaxamento da contrao induzida por PHE.

experimentais,

no

sofreram

50

Figura 17 - Efeito do limoneno, carveol e lcool perlico sobre o acoplamento


farmacomecnico em anis de aorta com endotlio a) Traados experimentais originais das
respostas relaxantes induzidas pelo limoneno, carveol e lcool perlico sobre a contrao evocada por
PHE (1 M) em anis de aorta com endotlio. b) Grfico representativo do efeito relaxante induzido
pelo limoneno, carveol e lcool perlico sobre a contrao induzida por PHE (1 M) em anis de aorta
com endotlio. Valores expressos como mdia E.P.M. (n) representa o nmero de experimentos. *
(p<0,05, ANOVA de uma via, Holm-Sidak), concentrao a partir do qual houve efeito significativo em
relao ao controle.

51

Figura 18 - Efeito do limoneno, carveol e lcool perlico sobre o acoplamento


farmacomecnico em anis de aorta sem endotlio a) Traados experimentais originais das
respostas relaxantes induzidas pelo limoneno, carveol e lcool perlico sobre a contrao evocada por
PHE (1 M) em anis de aorta sem endotlio. b) Grfico representativo do efeito relaxante induzido
pelo limoneno, carveol e lcool perlico sobre a contrao induzida por PHE (1 M) em anis de aorta
sem endotlio. Valores expressos como mdia E.P.M. (n) representa o nmero de experimentos. *
(p<0,05, ANOVA de uma via, Holm-Sidak), concentrao a partir do qual houve efeito significativo em
relao ao controle.

52

6.4 Estudo da modulao nitrrgica no efeito relaxante do limoneno, carveol e


lcool perlico sobre o acoplamento farmacomecnico em anis de aorta

Com a finalidade de avaliar o papel do NO sobre o efeito do limoneno,


carveol e lcool perlico, foram utilizados anis de aorta E(+) incubados com LNAME (100 M), um inibidor inespecfico da oxido ntrico sintase, por 10 minutos
antes da exposio do tecido PHE (1 M), que promoveu uma contrao
sustentada com amplitude mdia de 2,125 0,07 g.
Nas

preparaes

expostas

ao

limoneno,

relaxamento

foi

estatisticamente significante a partir da concentrao de 1000 M. Nos anis de


aorta expostos aos compostos hidroxilados, o efeito relaxante foi estatisticamente
significante a partir das concentraes de 2000 e 300 M para o carveol e lcool
perlico, respectivamente (p < 0,05, ANOVA de uma via, Holm-Sidak). As CE50 para
o efeito relaxante foram de 1881,09 92,53; 2024,03 87,88 e 1132,66 84,28 M
para limoneno, carveol e lcool perlico, respectivamente. A CE50 do lcool perlico
diferiu estatisticamente da CE50 dos demais compostos em estudo. Preparaes
controle, submetidas s mesmas concentraes do veculo, no sofreram
relaxamento da contrao induzida por PHE

53

Figura 19 - Efeito do limoneno, carveol e lcool perlico sobre o acoplamento farmacomecnico em


anis de aorta com endotlio na presena de L-NAME a) Traados experimentais originais das
respostas relaxantes induzidas pelo limoneno, carveol e lcool perlico sobre a contrao evocada por
PHE (1 M) em anis de aorta com endotlio na presena de L-NAME. b) Grfico representativo do
efeito relaxante induzido pelo limoneno, carveol e lcool perlico sobre a contrao induzida por PHE
(1 M) em anis de aorta com endotlio na presena de L-NAME. Valores expressos como mdia
E.P.M. (n) representa o nmero de experimentos. * (p<0,05, ANOVA de uma via, Holm-Sidak),
concentrao a partir do qual houve efeito significativo em relao ao controle.

54

Tabela 1 - Valores de CE50 e intervalo de confiana para o efeito relaxante do


limoneno, carveol e lcool perlico em anis de aorta de ratos.
AC

LIMONENO

CARVEOL

KCl (E+)

835,33 [769,67;900,98]

576,17 [477,74;674,59]

271,06 [256,61;285,50]

KCl (E-)

1477,30 [1424,99;1529,60]

717,01 [635,61;798,40]

261,78 [251,86;271,69]

PHE (E+)

2170,74 [1806,90;2534,57]

PHE (E-)

PHE (LN)

. PERLICO
a

1089,06 [545,53;1632,58]

572,99 [428,86;717,11]

1204,65 [1078,90;1330,39]

1001,06 [694,96;1307,15]

466,27 [371,62;560,91]

1881,09 [1699,72;2062,45]

2024,03 [1851,77;2196,28]

1132,66 [967,46;1297,85]

AC: Agente contraturante; (E+): anis de aorta com endotlio; (E-): anis de aorta sem endotlio;
(LN): anis de aorta incubados com L-NAME;
a
p < 0,05, vs. limoneno (KCl E+) e carveol (KCl E+);
b
p < 0,05, vs. limoneno (KCl E+);
c
p < 0,05, vs. limoneno (KCl E-) e carveol (KCl E-);
d
p < 0,05, vs. limoneno (KCl E-);
e
p < 0,05 vs. carveol (PHE E+) e lcool perlico (PHE E+);
f
p < 0,05 vs. carveol (PHE E-) e limoneno (PHE E-);
g
p < 0,05 vs. limoneno (PHE LN) e carveol (PHE LN)

55

6.5 Efeito relaxante do limoneno, carveol e lcool perlico sobre a contrao


induzida por DBF (1 M) independente dos estoques intracelulares

Para avaliar os efeitos do limoneno, do carveol e do lcool perlico sobre


sensibilidade das protenas contrteis ao Ca2+, foram utilizados anis de aorta E(-),
em meio 0Ca2+ e na presena de tapsigargina, um inibidor da SERCA.
A adio dos compostos s preparaes induziu um efeito relaxante
sobre a contrao, lenta e sustentada, evocada pelo DBF. O lcool perlico relaxou
significativamente a contrao induzida pelo DBF, nas concentraes de 2000 e
3000 M (p < 0,001, ANOVA de uma via, Holm Sidak). O carveol e o limoneno, sob
as mesmas condies impostas ao lcool perlico tambm apresentaram efeito
relaxante estatisticamente significante na concentrao de 3000 M. (p < 0,001,
ANOVA de uma via, Holm Sidak)

56

Figura 20 - Efeito do limoneno, carveol e lcool perlico sobre a contrao induzida por dibutirato de
forbol Grfico representativo do efeito do lcool perlico (a), carveol (b) e limoneno (c) sobre a
contrao induzida por PDBu (1 M). * P<0,001 (ANOVA de uma via, Holm Sidak)

57

7 DISCUSSO

Nesse estudo foi demonstrado que o limoneno, carveol e lcool perlico


induziram efeito relaxante em anis de aorta de ratos, sendo capazes de agir tanto
no acoplamento eletromecnico como no farmacomecnico.
A habilidade em induzir relaxamento no msculo liso que certas
substncias extradas de produtos naturais apresentam j bem conhecida na
literatura cientfica. O timol e o carvacrol apresentam efeito vasorelaxante em
msculo liso vascular sendo esse efeito independente do endotlio (PEIXOTONEVES et al., 2010). Lahlou et al. (2001) demonstraram o efeito do 1,8-cineol, mais
conhecido como eucaliptol, no sistema cardiovascular de ratos normotensos. De
acordo com esses autores, o 1,8-cineol reduz a frequncia cardaca e induz uma
hipotenso por um mecanismo vasorelaxante. Rodrigues (2010) mostrou que o
linalol, um monoterpeno alcolico, possui efeito antiespasmdico e hipotensor no
sistema cardiovascular de ratos.
O efeito relaxante induzido pelos compostos aqui testados em anis de
aorta poderia ser ocasionado por uma possvel atividade txica, uma vez que houve
relaxamento da contrao induzida tanto por mecanismos eletromecnicos como,
tambm, farmacomecnicos. No entanto essa hiptese pode ser refutada, pois o
efeito relaxante do carveol e do lcool perlico foi revertido atravs de lavagens da
preparao ao final dos respectivos experimentos, demonstrando recuperao da
resposta contrtil. Alm disso, esses compostos apresentam baixa toxicidade aguda
(BELSITO et al., 2008).
Na literatura cientfica inmeros trabalhos demonstram que outros
terpenos apresentaram toxicidade baixa ou atoxicidade (BELSITO et al., 2008).
Dentre os constituintes testados, o limoneno, para o qual foi mais difcil a
recuperao da preparao, pode ser classificado como um constituinte de baixa
toxicidade, apresentando, de acordo com Sun (2007), uma DL50 em camundongos
machos e fmeas de 5,6 e 6,6 g/kg respectivamente. J em ratos a DL50 de 4,4 e
5,1 g/kg, respectivamente.
O on Ca2+ desempenha um papel crucial na contrao da musculatura
lisa. O aumento da concentrao de Ca2+ no meio intracelular pode ocorrer por meio
de despolarizao da membrana plasmtica (acoplamento eletromecnico) ou por

58

um estimulo que no provoque a alterao do potencial de transmembrana


(acoplamento farmacomecnico).
Como mencionado anteriormente, o acoplamento eletromecnico
caracterizado

por

uma

despolarizao

da

membrana

plasmtica.

Essa

despolarizao, ativa canais de clcio operados por voltagem (CCOV). A abertura


desses canais permite o influxo de clcio atravs da membrana, culminando com um
aumento da concentrao de clcio no meio intracelular e, consequentemente, com
a contrao muscular (SOMLYO;SOMLYO, 1968; BOLTON et al., 1999)
Na presente investigao, o limoneno, o carveol e o lcool perlico
induziram efeito relaxante sobre contraes evocadas pelo K+. Esse efeito ocorreu
tanto na presena quanto na ausncia de endotlio, sugerindo que esses compostos
podem ter agido atravs de um mecanismo miognico.
Os canais de K+ desempenham um papel importante na regulao do
potencial de membrana de clulas excitveis, como as clulas do msculo liso. A
fora que move os ons atravs da membrana baseada no gradiente eletroqumico
do on. Em clulas de msculo liso as condies que levam abertura de canais
para K+ permitem um efluxo desse on, tornando o meio intracelular mais negativo,
ou seja, hiperpolarizando a clula. Essa hiperpolarizao leva a um fechamento de
CCOV resultando em uma diminuio da entrada de clcio e, consequentemente,
em vasodilatao. Sabe-se que em clulas de musculo liso o potencial de
membrana de aproximadamente -40 mV com [K+]e de 5 mM. Uma alta
concentrao de K+ no meio extracelular provoca uma despolarizao da membrana
das

clulas

de

msculo

liso

trazendo

potencial

transmembrana

para

aproximadamente 20 mV, um valor muito prximo do novo potencial de equilbrio


para K+. Essa despolarizao leva ao desenvolvimento de fora contrtil devido
abertura de CCOV e ao aumento da concentrao intracelular de Ca2+ (QUAST,
1993; NELSON; QUAYLE, 1995; KO et al., 2008; SOMLYO; SOMLYO, 1968)
Dessa maneira, seria improvvel que o vasorrelaxamento induzido pelo
limoneno, carveol ou lcool perlico esteja relacionado com mecanismos de
hiperpolarizao

da membrana, pois a
+

despolarizao

induzida

pela alta

concentrao extracelular de K ativa a condutncia do canal de K retificador para


fora, tornando improvvel que esses agentes possam deslocar o potencial
transmembrana do potencial de equilbrio do K+ para gerar uma corrente
hiperpolarizante.

59

De acordo com os achados, pode-se sugerir, que os compostos


hidroxilados, carveol e lcool perlico, induzem atividade vasorelaxante em anis de
aorta por, possivelmente, estarem agindo sobre canais de clcio na membrana
plasmtica. Tal hiptese justificada porque trabalhos anteriores demonstram a
importncia do grupo hidroxila como uma estrutura necessria para atuar sobre
canais inicos (MOHAMMADI et al., 2001; VOGT-EISELE et al., 2007). Outro fato
que suporta essa ideia, que, de maneira geral, todos os compostos em estudo
foram mais potentes em relaxar o acoplamento eletromecnico (onde a atividade
dos canais inicos desempenha um papel crucial no desenvolvimento da fora de
contrao) do que o farmacomecnico.
Alm do acoplamento eletromecnico, a contrao da musculatura lisa
pode

ocorrer

por

um

estmulo

independente

da

alterao

do

potencial

transmembrana, tal mecanismo conhecido por acoplamento farmacomecnico.


Verificamos que o limoneno, carveol e lcool perlico induziram efeito relaxante
sobre esse acoplamento tanto na presena quanto na ausncia de endotlio.
No

acoplamento

farmacomecnico,

aumento

da

concentrao

intracelular de Ca2+, que leva a contrao muscular, ocorre pela ligao de agonistas
contrteis a receptores na superfcie das clulas alvo, sem alteraes prvias no
potencial de membrana (AKATA, 2007). Esse acoplamento envolve a ligao de
agonistas a receptores acoplados a protena G. A cascata de segundos mensageiros
leva a uma liberao de clcio dos estoques intracelulares, aumento da
sensibilidade do aparato contrtil e influxo de clcio atravs da membrana (atravs
de CCOV e operados por ligante), sem, no entanto, alterar o potencial de membrana
(JACKSON, 2000).
O mecanismo de ao de alguns terpenos envolve efeitos mediados por
receptores de membrana (TURINA et al., 2006). Apesar da potncia dos
monortepenides ter sido maior para o acoplamento eletromecnico do que para o
farmacomecnico no podem ser descartados outros alvos para a ao desses
compostos, podendo, estes apresentarem efeito sobre receptores na membrana
celular, bem como apresentarem efeito sobre receptores intracelulares.
Nesse estudo, tambm investigamos a participao do endotlio sobre o
efeito relaxante dos terpenos estudados em aorta isolada de rato. Nessa
investigao, observamos que os compostos com grupo hidroxila, lcool perlico e
carveol, no apresentaram diferena estatstica entre preparaes com e sem

60

endotlio. No entanto, quando as preparaes foram expostas ao L-NAME, a


potncia farmacolgica desses compostos foi significativamente reduzida, sugerindo
que o NO pode estar participando do efeito relaxante desses dois monoterpenides
hidroxilados.
Como bastante relatado na literatura, o endotlio, alm de funcionar
como barreira passiva, tambm origina diversos mediadores que auxiliam na
manuteno do tnus vascular. Dentre esse mediadores encontram-se o FHDE, o
NO, as endotelinas e as prostaglandinas (CARVALHO et al., 2001). Dessa maneira
pode-se sugerir que o carveol e o lcool perlico (compostos hidroxilados) podem
estar atuando independente do endotlio ou agindo sobre todos os mediadores
derivados do endotlio de tal maneira que as aes destes permanecem em
equilbrio. Embora em preparaes sem endotlio o efeito relaxante desses
compostos hidroxilados no tenha sido diferente de preparaes com endotlio,
houve uma reduo na potncia desse efeito quando a sntese de ON foi bloqueada
pela presena de L-NAME. Isso sugere uma possvel quebra do equilbrio entre as
aes de diversos fatores oriundos do endotlio, permitindo que, na ausncia do
ON, fatores contrteis possam exercer maior efeito sobre o musculo liso vascular.
Por outro lado, o efeito relaxante do limoneno (composto sem o grupo hidroxila), ao
contrrio dos compostos hidroxilados, foi estatisticamente diferente em preparaes
com e sem endotlio, em ambos os acoplamentos.
No acoplamento eletromecnico, o limoneno foi mais potente em
preparaes com endotlio, enquanto no acoplamento farmacomecnico, o efeito foi
inverso, ou seja, foi mais potente em relaxar anis de aorta sem endotlio. No
acoplamento farmacomecnico, quando a liberao de ON foi bloqueada pela
exposio da preparao ao L-NAME, a potncia do limoneno foi semelhante quela
de preparaes com endotlio intacto. Tais resultados sugerem que o efeito
relaxante do limoneno pode ser modulado pelo endotlio, via outros fatores, que no
ON.
Alguns

estudos

demonstram

que

vrios

monoterpenos

monoterpenides podem ter seu efeito farmacolgico modulado pelo endotlio.


Dentre esses, encontramos o terpinen-4-ol que, apesar de apresentar efeito
relaxante direto sobre o msculo liso em aorta torcica de ratos, possui modulao
endotelial (MAIA-JOCA, 2012). Pinto et al. (2009) demonstraram que o 1,8-cineol
apresenta efeito vasorelaxante em aorta de ratos e que esse efeito dependente da

61

integridade funcional do endotlio vascular. O -terpineol e o metileugenol


apresentaram efeito vasorelaxante em aorta de ratos, sendo esse efeito mediado
pelo endotlio (MAGALHES et al., 1998). Todos estes trabalhos demonstram que o
endotlio pode influenciar no efeito dos compostos, porm o mecanismo de ao
mais complexo, no dependendo exclusivamente do endotlio vascular.
Muitos trabalhos demonstram que o aumento da concentrao de Ca 2+ no
meio intracelular desempenha um papel fundamental na contrao do msculo liso
formando um complexo com a protena calmodulina que ativa a MLCK. Esta, uma
vez ativada, fosforila a cadeia leve da miosina iniciando o ciclo das pontes cruzadas.
Entretanto sabe-se que, em msculo liso a contrao sustentada pode estar
relacionada com outros fatores e envolver outras enzimas, como, por exemplo, a
PKC, a qual age por vias independentes do Ca2+. A protena kinase C, bem como a
Rho-GTPase, desempenham um papel importante na contrao de msculos lisos
por vias independentes do Ca2+. Ao fosforilar a CPI-17, A PKC potencializa
significativamente as aes dessa protena sobre a fosfatase de cadeia leve da
miosina (MLCP), inibindo esta. Estudos tm demonstrado que diversos steres de
forbol, entre eles o DBF, so ativadores farmacolgicos da PKC que induzem a
contrao devido ao aumento de sensibilidade ao Ca2+ sem que haja aumento da
concentrao intracelular desse on (WHITNEY et al., 1995; YANAGITA et al., 1999;
BAEK et al., 2009; DENG et al., 2001)
Este estudo tambm mostrou o efeito do limoneno, carveol e lcool
perlico sobre a sensibilidade das protenas contrteis ao clcio. Embora com
eficcia diferente, todos os compostos, na concentrao de 3000 uM, relaxaram de
maneira significativa a contrao evocada pelo DBF, em meio isento de clcio e na
presena de tapsigargina. Assim pode-se sugerir uma possvel interferncia desses
terpenides na via de sensibilidade ativada pela PKC.
Nos ltimos anos, diversos estudos tm sido realizados com a finalidade
de relacionar o efeito da droga com sua estrutura qumica. Essas investigaes
possuem grande importncia tanto para a compreenso dos mecanismos de ao
de diferentes substncias como para a sntese de estruturas moleculares mais
potentes e mais especificas para um determinado efeito.
No presente estudo objetivou-se relacionar a potncia e a eficcia
farmacolgica com a estrutura molecular do limoneno, do carveol e do lcool
perlico. Vale ressaltar que a estrutura qumica destes compostos apresenta uma

62

particularidade importante: a presena ou ausncia do radical hidroxila e seu ponto


de insero.
Neste estudo foi possvel observar que, dentre os monoterpenides
investigados, aqueles que continham o grupo hidroxila, carveol e lcool perlico, em
sua estrutura, apresentaram, de maneira geral, maior potncia quando comparados
com o composto sem o grupo hidroxila, o limoneno. Isso sugere que a presena da
hidroxila importante para a potncia farmacolgica dos compostos estudados.
Os resultados aqui encontrados esto de acordo com vrios trabalhos que
mostram que no somente a presena mas tambm a posio de grupamentos,
entre eles o grupo hidroxila, desempenham um papel importante sobre atividade
farmacolgica de diversos compostos. Em um estudo comparativo, Cardoso-Lima et
al. (2012) demonstraram que, embora a presena de um grupo oxigenado no seja
essencial para a atividade de um composto, a posio do grupo pode revelar
aspectos sobre a eficcia e potncia desse composto. Em seu estudo comparativo,
ele observou que a rotundifolona apresentou maior potncia farmacolgica em
relaxar artrias mesentricas de ratos quando comparada com a carvona epoxido,
sugerindo que a posio do grupo cetnico tem influncia na atividade espasmoltica
do composto. De Sousa et al. (2008) observaram que a presena e a posio de
grupos funcionais contribuem para a atividade espasmoltica em leo isolado de
cobaio, entretanto a presena de estruturas moleculares oxigenadas no
indispensvel para a atividade da molcula. Ao estudar o efeito do mentol e seus
derivados, observou-se que a adio de um grupo hidroxila ou carboxila
importante para a inibio do potencial de ao composto em nervo citico de sapos
(KAWASAKI et al., 2013).
Sabe-se que a estrutura de monoterpenides tem influncia na sua
atividade inseticida, no grau de penetrao na cutcula do inseto e na capacidade de
interao com o stio de ligao. Foi observado que os compostos mais potentes
continham hidroxila em sua estrutura, sugerindo que este afeta positivamente a
atividade repelente contra T. castaneum (GARCA et al., 2005). Em outro estudo em
que se avaliou a atividade tpica, fumigante e ovicida de diversos monoterpenides,
verificou-se que a atividade dos monoterpenides variava de acordo com a estrutura
molecular, a quantidade de saturao e os grupos funcionais associados aos
monoterpenides (RICE; COATS, 1994).

63

De acordo com Nerio; Olivero-Verbel; Stashenko, (2010) muitos


compostos repelentes de artrpodes possuem um grupo hidroxila ligado a um
carbono primrio, secundrio ou aromtico. importante notar que, para alguns
metablitos com o grupo hidroxila ligado a um tomo de carbono tercirio, ou sem o
grupo hidroxila (linalol, -terpineol e o limoneno), tal atividade suprimida, sugerindo
que o tipo de carbono onde a hidroxila est presente, modula o efeito repelente.
Mohammadi et al., (2001) demonstraram em seu trabalho que um grupo
metil ligado ao anel benznico na posio meta (em comparao posio da
hidroxila), e localizado entre a hidroxila e o anel benznico no apresentava
nenhuma atividade sobre o receptor para GABA, nem efeito modulatrio quando
aplicado com o agonista. Eles concluram que somente a ligao de um grupo metil
e isopopril ligado posio orto ativava as correntes de cloro para dentro atravs de
receptores GABA. Tambm demonstraram que a quantidade de grupamentos
influencia na potncia pois a ligao de um outro grupo na posio orto reduzia a
potncia do composto.
A atividade biolgica de um composto depende, dentre outros fatores, da
capacidade deste em atravessar ou, pelo menos, se dividir em membranas
biolgicas. Uma das ferramentas mais utilizadas para verificar a distribuio de
compostos atravs de membranas biolgicas o coeficiente de partio octanolgua (logPow ).Usando cromatografia liquida de alta performance, o coeficiente de
partio octanol-gua foi calculado, sendo 4.38, 3.12 e 3.17 para limoneno, carveol e
lcool perlico, respectivamente (GRIFFIN; WYLLIE; MARKHAM, 1999).
Em um estudo sobre a atividade larvicida de diversos monoterpenos e
seus derivados, demonstrou-se que a presena da hidroxila ligada estrutura cclica
resultou em uma diminuio da potncia, provavelmente, devido a um aumento da
polaridade. Essa polaridade torna a molcula mais hidroflica, sugerindo, desta
maneira, que a lipofilicidade desempenha um papel importante no efeito desses
compostos (SANTOS et al., 2011a). Dessa maneira, pode-se sugerir, ainda, que a
maior potncia apresentada pelo lcool perlico e a menor potncia apresentada
pelo limoneno pode estar relacionada com a solubilidade desses compostos.
Tomados conjuntamente, os resultados sugerem que o efeito do
limoneno, do carveol e do lcool perlico pode ser influenciado por sua estrutura
qumica. Embora a presena do grupamento hidroxila no seja essencial para a
atividade biolgica , ela aumenta a potncia farmacolgica dos composto estudados.

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8 CONSIDERAES FINAIS

O limoneno, carveol e lcool perlico apresentam efeito vasorelaxante sobre


aorta isolada de ratos, sendo esse efeito independente do endotlio vascular.
De maneira geral, o limoneno, carveol e lcool perlico apresentaram maior
potncia no acoplamento eletromecnico que no farmacomecnico, sugerindo
que eles podem estar atuando sobre canais de clcio na membrana
plasmtica.
O efeito relaxante do limoneno, carveol e lcool perlico pode ser mediado por
vias que envolvem a PKC, receptores intracelulares e receptores na
membrana plasmtica.
Tanto os monoterpenides hidroxilados quanto o monoterpeno sem a
hidroxila apresentaram efeito relaxante em aorta de rato, sugerindo que a
presena da hidroxila no essencial para a atividade farmacolgica.
Embora a presena do grupo no seja essencial para a atividade
farmacolgica, a presena e a posio da hidroxila sobre a estrutura
molecular influenciam a potncia e a eficcia farmacolgica.

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ANEXO Parecer de aprovao: CEUA-UECE

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