EFECTO CRNICO DEL ALCOHOL EN LA

FAGOCITOSIS DE LOS MACROFAGOS

PERITONEALES DE LOS RATONES BALB/C
Flores G. A

Guzmn G.D

Martnez H.P

Ros L.

RESUMEN
Introduccin: El consumo crnico de alcohol es toxico para la mayora de los
tejidos esto se asocia con el desarrollo de diversas enfermedades inflamatorias y
degenerativas as como infecciones causadas por agentes oportunistas.
Objetivo: En este estudio se busc demostrar si el consumo crnico de alcohol
afecta la fagocitosis de los macrfagos peritoneales de ratones BALB/c machos.
Material y Mtodo: El grupo experimental fueron tratados con 300ml de agua con
el 20% de alcohol y el grupo control con agua, posteriormente se extrajeron los
macrfagos y se le aplicaron levaduras de Candida Albicans para ver la actividad
fagocitica peritoneal, despus se realiz el conteo de clulas endocitadas y se
vieron cuales tenan NBT(+).
Resultado: Se vio que numricamente el grupo control tuvo una mejor funcin
fagocitica que el grupo experimental con 1294 macrfagos peritoneales que
fagocitaron contra 984.
Conclusin: El alcohol disminuye la respuesta fagicitica de macrfagos
peritoneal, al igual que el estallido respiratorio y la respuesta inflamatoria, aunque
no hubo diferencias significativas estadsticamente.

PALABRAS CLAVE:

Alcohol,
fagocitosis, macrfagos, NBT(+).

consumo

crnico,

sistema

inmune,

INTRODUCCIN
El alcoholismo es considerado una enfermedad polignica y multifactorial, ya que
en ella influyen complejas interacciones, adems de factores ambientales,
sociales, culturales, psicolgicos, educacionales, etc. El consumo de alcohol es
una de las causas que ms peso tiene en la morbilidad y mortalidad mundial. Se

ha estimado que contribuye el 4% de riesgo de muerte global. 1 Las variaciones en

la proporcin de muertes atribuibles al consumo de alcohol se deben en parte a la
cantidad absoluta de alcohol que ingieren las poblaciones y tambin a los patrones
de consumo.1
La Organizacin Mundial de la salud hace referencia que el consumo nocivo de
alcohol puede perjudicar tanto quien la consume como a otras personas, por
ejemplo, a familiares, amigos, compaeros de trabajo y desconocidos. Asimismo,
el consumo nocivo de alcohol genera una carga sanitaria, social y econmica
considerable para el conjunto de la sociedad. 2
En Mxico, se observa que el consumo de alcohol es la cuarta causa de
mortalidad (8.4%), que implica cirrosis heptica, lesiones intencionales y no
intencionales, accidentes de vehculo de motor y homicidios. 3 Se estima que, una
de cada tres personas de 12 a 65 aos de edad mantiene un consumo nocivo de
alcohol. En la Encuesta Nacional de Adicciones (ENA) se observ que en la
poblacin adolescente de entre 12 y 17 aos, hubo un aumento de bebedores en
2011 tanto en hombres como en mujeres. Como tambin que el consumo diario
sigue siendo poco frecuente en el pas pero en contraste de una tercera parte de
la poblacin reporta haber tenido al menos un episodio de alto consumo. 4
Ahora bien como se sabe el alcohol es toxico para el organismo de quien lo
consume creando enfermedades inflamatorias y degenerativas en los tejidos. Es
por eso que al ser toxico va a crear un dao en los diferentes sistemas.
Ahora hablaremos del efecto del alcohol en el sistema inmune especficamente en
el proceso de fagocitosis ya que el alcohol bloquea la capacidad de responder a
las infecciones de distintas clulas del sistema inmunitario, como monocitos y
macrfagos, clulas dendrticas, linfocitos T y neutrfilos. 4 Se sabe que el alcohol
causa dao de la funcin celular alterando la funcin endoctica la cual afecta la
actividad fagoctica as como migracin y expresin de citocinas.
La primera lnea de defensa, conocida como respuesta inmune innata, van a
intervienen clulas fagocitaras as como tambin el sistema de complemento y
molculas proinflamatorias tales como IFN citocinas IL-1, IL-6, IL-12 y TNF que
generan respuesta de tipo Th1. Tambin encontramos, la respuesta inmune
adaptativa ya que es una proteccin especfica contra agentes infecciosos los
cuales pueden ser neutralizados por la produccin de anticuerpos y citocinas
como la IL-4, IL-10 dando una respuesta de tipo Th2. 6
Por otra parte se ha descubierto que tanto el etanol y otros agentes pueden actuar
interfiriendo con la va de sealizacin que conduce a una mayor expresin de IL10 y la menor expresin de IL-12. Estas interleucinas como se sabe son
importantes como puente entre la inmunidad innata y la adaptativa dando una
mejor respuesta inmune adems que su fuente son clulas como macrfagos,
clulas dentriticas, neutrfilos, linfocitos T y B.5

De igual forma al haber lesin heptica crnica mediada por el alcohol se asocia
con la activacin de TLR4 mediante la circulacin de LPS en los macrfagos del
hgado que culmina en la activacin NFkB y la produccin de citocinas pro
inflamatorias.4
Al saber que el alcohol puede ocasionar problemas en el
especialmente en la fagocitosis, se debe tener en cuenta
predisposicin a las infecciones por agentes oportunistas y en
respuesta a los procesos inflamatorios sistmicos del paciente
crnico.

sistema inmune
que hay mayor
general hay una
con alcoholismo

METODOLOGIA
Se realiz un estudio de tipo transversal, experimental, comparativo y prospectivo.
Se trabaj con 20 ratones BALB/c, machos de 4-6 semanas de edad, del bioterio
de la Facultad de Estudios Superiores Iztacala, los cuales se encontraron libres de
patgenos de acuerdo a la norma mexicana NOM 062-ZOO-2001. Se dividieron
en 2 grupos de trabajo (10 ratones de grupo experimental y 10 ratones de grupo
control), en primer grupo (muestra) se le dejo alcohol al 20% de 300 ml de agua
por cuatro semanas. Al segundo grupo (control) se le dejo agua el mismo tiempo
que al grupo muestra.
Criterios de exclusin
La primer exclusin, fue el no poder utilizar macrfagos alveolares, ya que en la
extraccin
se observaron muy pocos, por ello se utilizaron macrfagos
peritoneales. Despus tuvimos que esperar a que los ratones crecieran ya que su
sistema inmune no estaba totalmente desarrollado. Por falta de tiempo, el
experimento se tuvo que acortar a 4 semanas de 7 que se haba previsto.
TIPO DE VARIABLES
V. independiente: Consumo crnico de alcohol
V. dependiente: funcin fagoctica de los macrfagos peritoneales
DEFINICIN OPERACIONAL
Se considera consumo crnico de alcohol a periodos continuos de ingesta por
etanol durante 4 semanas.
Proceso fagocitosis: Las primeras clulas que atraviesan la pared vascular son los
leucocitos polimorfonucleares seguidos por los monocitos. Cuando los monocitos
migran hacia los tejidos son denominados macrfagos. En el proceso inflamatorio
ambos tipos de clulas funcionan como fagocitos.

La fagocitosis es la ingestin de microorganismos o partculas de materia

resultantes de la rotura del tejido por los leucocitos polimorfonucleares, monocitos
o fagocitos hsticos. El proceso de fagocitosis incluye los procesos de
opsonizacin (recubrimiento de inmunoglobulinas o complemento a las bacterias o
antgenos), ingestin (despus de la fijacin la bacteria es incorporada a la clula,
rodendola con seudpodos del fagocito), y por ltimo destruccin de las bacterias
o antgenos (degradacin por enzimas, pH cido en la vacuola, protenas
catinicas, lactoferrinas, anin superxido o perxido de hidrgeno).
Cuando las bacterias o los antgenos agresores son destruidos, puede
comenzar el proceso de la curacin.
Reduccin al NBT:
En cuanto al NBT, tenemos que ste es una sal de tretrazolio soluble en agua, de
color amarillo, con frmula emprica CHNOCl y con peso molecular de 817,674
g/mol
El mtodo se fundamenta en el hecho que el NBT en presencia de O es reducido
a formazn, una sustancia de color azul-negro que se deposita como partculas
insolubles dentro de las clulas, este ensayo es una prueba indirecta utilizada para
evaluar desrdenes de la fagocitosis y del sistema bactericida dependiente del
oxgeno, es la prueba estndar para la deteccin de la EGC, debido a que las
clulas de las personas que sufren este mal dan la reaccin alterada o no la dan
del todo. Solubilizar el formazn obtenido utilizando hidrxido de potasio (KOH) y
dimetil sulfxido (DMSO).

Material y mtodos
El proceso que se realiz durante la intoxicacin de alcohol con los ratones que
se llev a cabo en el bioterio de la Facultad de Estudios Superiores Iztacala, este
se hizo durante cuatro semanas vigilando que tomaran alcohol cada Jueves a
partir del da 14 de abril del 2016; los jueves se tomaron muestra de sangre de dos

ratones muestra y de un ratn control para que despus estas muestras se

centrifuguen y se almacenen los sueros para su estudio posteriormente.
Procedimiento en el bioterio:
1. Se ingres al bioterio con el alcohol de 96,una probeta de 1000 ml, una
hoja de bistur, una caja de dilatacin (esta se llevara solo los jueves) un
tubo de ependort, una hilera con hielo, una bata, gorro, cubrebocas,
guantes y botas (todo lo anterior esterilizado).
2. Se ingres a la zona restringida y pasar por la jerga.
3. Posteriormente se ingres al cubculo 4; en l se comenzaron a poner la
ropa estril de la siguiente manera:
a. Se hizo la preparacin del agua con alcohol, la cual es de 300 ml de
agua con el 20 % de alcohol para cada caja de grupo muestra.
b. Sacaron un ratn de una de las cajas muestra y se colocara en la
caja de dilatacin y los dejaremos unos 3 minutos aproximadamente.
c. Luego se sac de la caja de dilatacin y en la cola se le hace una
pequea incisin para poder obtener su sangre y guardarla en un
tubo de ependort
d. Posteriormente se repite el paso e y f con un raton mas de muestra y
con un raton muestra.
e. Las muestras de sangre se guardan en una hilera llena de hielo.
f. Despus se regresan las cajas a su lugar y se limpia el rea que se
utiliz.
g. Al final y para retirarse se quitaron la bata quirrgica, el gorro, el
cubrebocas, los guantes y las botas y lo depositaran en un bote
especial para ese material.y se llevaron todo el material y sus
muestras de sangre al laboratorio.
4. Una vez en el laboratorio se centrifugo las muestras de sangre durante 5
minutos a 1500 revoluciones, y el suero procedente de las muestras se
rotulara con el nmero de la semana de tratamiento, tambin si es muestra
del grupo muestra o del grupo control y la fecha en que se estn
recolectando las muestras.
5. Despus de rotularlas se mantuvieron en refrigeracin, que posteriormente
se utiliz.
Extraccin de los macrfagos peritoneales
1.- se sacrificaron los ratones en una caja de sacrificios
2.- se colocaron en una charola de diseccin
3.-se le humedeci el pelo al ratn
4.- se le levant el pelo con unas pinzas y se le cort el pelaje sin atravesar el
peritoneo
5.- se le inyect 10 ml de solucin fisiolgica en el peritoneo.

6.- se le dio un pequeo masaje en el abdomen al ratn para poder obtener una
mejor muestra de macrfagos peritoneales
7.- con otra jeringa se sacaron lentamente el lquido del peritoneo y se colocaron
en un tubo.
Tcnica de fagocitosis:
Esta tcnica se realiz despus de haber obtenido los macrfagos peritonelas del
ratn estos estuvieron colocados en un tubo de ensayo.
1. Se decantaron los tubos de ensayo
2. Despus se le agregaron 10 microlitros del medio de DEM ETy se
disuelven
3. En otro tubo se colocaron n 10 microlitros de azul trepano y 10 microlitros
de la solucin anterior.
4. Luego se puso en la estufa la caja de Petri con dos cubreobjetos para
vaciar un mililitro de la solucin recin preparada (se deja una hora dentro)
5. Se lavaron los cubreobjetos con solucin de D-MEM.
6. Se le colocaron levaduras de Candida Albicans (se dej una hora)
7. Posteriormente se sacaron los cubreobjetos de la caja de Petri y se le
agreg agua destilada para enjuagar.
8. Despus de enjuagarlos se pusieron en papel absorbente hasta que
secaran.
9. Se montaron en la caja de Petri nuevamente y se le agreg Safranina (se
dej por siete minutos).
10. Enseguida se quit el excedente de Safranina y se enjuag nuevamente
con agua destilada y se dej secar.
11. Se coloc en el cubreobjetos con resina.

Conteo de clulas
El jueves 19 de mayo se ingres al laboratorio de microscopia para realizar el
conteo de clulas, para ello, se llev a cabo el siguiente procedimiento:
1.- pudimos contar 831 macrofagos de dos grupos control (500 de cada muestra)
2.- Contar el nmero de clulas endocitadas
3.- Observar cuales tenian NBT (+) Y NBT (-)
Escala de medicin: cuantitativas
Categoria de la Variable: alto
Diseo estadstico: se utiliza la prueba t-student para muestras independientes
con un valor de p=0.05

Anlisis estadstico
Se utiliz la prueba t para determinar la significancia de los valores obtenidos.

RESULTADOS
El nmero de clulas que no fagocitaron en el grupo control fue de 1706 con una
desviacin estndar de 97.0127139 en comparacin con el grupo experimental
que fue de 1971 con una desviacin estndar 45.8072047 como se puede ver en
la figura nmero 1.
2000
1950
1900
1850
1800
1750
1700

GRUPO
EXPERIMENTAL
GRUPO CONTROL

1650
1600
1550
NUMERO DE CELULAS NO FAGOCITADAS

FIG 1.- NUMERO DE MACROFAGOS PERITONEALES QUE NO

FAGOCITARON DEL GRUPO CONTROL Y DEL GRUPO EXPERIMENTAL. P=
0.16851745.
El nmero de clulas fagocitadas del grupo experimental fue de 189 con una
desviacin estndar 47.2595669 en comparacin con el grupo control que fue de
236 con una desviacin estndar de 97.0127139 como se puede ver en la figura
numero 2.

1400
1200
1000
800

GRUPO
EXPERIMENTAL

600

GRUPO CONTROL

400
200
0
NUMERO DE CELULAS FAGOCITADAS

FIGURA 2.- NUMERO DE MACROFAGOS PERITONEALES DEL GRUPO

CONTROL Y GRUPO MUESTRA. QUE FAGOCITARON (N=6) P= 0.17424984 EN
RATONES BALB/C.
El nmero de levaduras fagocitadas del grupo experimental fue de 1492 con una
desviacin estndar 97.6353761 en comparacin con el grupo control que fue de
2063 con una desviacin estndar de 252.41903 como se puede ver en la figura
numero 3.
2500
2000
1500

GRUPO
EXPERIMENTAL

1000

GRUPO CONTROL

500
0
NUMERO DE LEVADURAS FAGOCITADAS

FIGURA 3.- NUMERO DE LEVADURAS FAGOCITADAS DEL GRUPO CONTROL

Y EXPERIMENTAL (N=6) P= 0.20462081EN RATONES BALB/C.

El nmero de levaduras que redujeron el NBT del grupo experimental fue de 614
con una desviacin estndar 44.92067082 en comparacin con el grupo control
que fue de 1081 con una desviacin estndar de 143.9825221 como se puede ver
en la figura nmero 4.
1200
1000
800
600
400

GRUPO
EXPERIMENTAL
GRUPO CONTROL

200
0
NUMERO DE LEVADURA QUE REDUJERON EL NBT

FIGURA 4.- NUMERO DE LEVADURAS FAGOCITADAS QUE REDUJERON EL

NBT DEL GRUPO CONTROL Y EXPERIMENTAL (N=6) P= 0.117441929 DE
RATONES BALB/C.

ANALISIS DE RESULTADOS
Despus de observar los resultados se pudo concluir que ambos grupos
(experimental y muestra) se comportaron estadsticamente iguales,
numricamente el grupo control tuvo una mejor funcin fagocitica que el grupo
experimental con 1294 macrfagos peritoneales que fagocitaron, 2063 levaduras
fagocitadas y 1081 macrfagos peritoneales que redujeron el NBT, en
comparacin con el grupo experimental con 984. 1492, 614 respectivamente.

Discusin

CONCLUSIN
Los resultados de la investigacin nos permiten darnos cuenta que nuestra
hiptesis sobre el consumo crnico de alcohol disminuira la funcin fagocitica de
los ratones BALB/c es correcta, ya que si se pudo ver una disminucin de la
actividad fagoctica de macrfagos peritoneales del grupo experimental, pero los
resultados no fueron los esperados, ya que fue mnima la diferencia entre
levaduras fagocitadas y el NBT (+) entre el grupo muestra y control, a lo que lo
atribuimos estos resultados al poco tiempo en el que se llev acabo el
experimento y la cantidad de alcohol administrada a los ratones.

SUGERENCIAS
Aumentar el periodo de administracin de alcohol aproximadamente a
siete semanas
Vigilar que el grupo experimental consuma la dosis indicada de alcohol
al dia, mediante su administracin intramuscular
Aumentar la dosis al 30 % de alcohol

REFERENCIAS:
1.-Gonzlez Guzmn R, Alcal Ramrez Julian. Consumo de alcohol y salud
pblica. FacMed UNAM [internet] 2005 [citado 20 Abr 2016]; 50(1):1-4. Disponible
en: www.ejournal.unam.mx
2.- Organizacin Mundial de la Salud. Centro de prensa. Alcohol. Enero 2015
http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs349/es/ (ultimo acceso 20 abril 2016
OMS)
3.- Consumo de alcohol en Mxico, 2000-2012: estrategias mundiales para reducir
su uso nocivo. Mxico 2010 [actualizado 2012; citado 20 Abr 2016]. Disponible en:
http://ensanut.insp.mx/doctos/analiticos/ConsumoAlcohol.pdf
4.- Mandrekar, P., Dolganiuc, A., Bellerose, G., Kodys, K., Romics, L., Nizamani, R.
and Szabo, G. (2002) Acute alcohol inhibits the induction of nuclear regulatory

factor kappa B activation through CD14/toll-like receptor 4, interleukin-1, and tumor

necrosis factor receptors: a common mechanism independent of inhibitory kappa B
alpha degradation? Alcohol Clin Exp Res, 26, 1609-1614.
5.- Pruett, S.B., Fan, R., Zheng, Q. and Schwab, C. (2005) Differences in IL-10 and
IL-12 production patterns and differences in the effects of acute ethanol treatment
on macrophages in vivo and in vitro. Alcohol, 37, 1-8.
6.- S. Romagnani. Unit the Th1/Th2 paradigm in disease. Moleular Biology
Intelligence. New York, U.S.A. Chapman & Hall; 1997. p.1-5.