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INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLGICAS


DEPARTAMENTO DE BIOQUMICA

MTODOS DE ANLISIS

Prctica (Ciclo 3)

DETERMINACIN DEL PESO


MOLECULAR DE UNA PROTENA
USANDO CROMATOGRAFA POR
EXCLUSIN MOLECULAR.
Seccin 2

5QM2
Daz Lpez Mnica/ Equipo: Trejo Solrzano Alejandra

CROMATOGRAFIA POR EXCLUSION MOLECUALR

Introduccion
La cromatografa es una tcnica que permite la separacin de molculas diferentes
presentes en una misma muestra. El mtodo est basado en la circulacin de una
fase mvil (que arrastra a la mezcla de compuestos a separar), a travs de una
fase estacionaria. Dependiendo de la afinidad relativa que por ambas fases tengan
los distintos compuestos presentes en la mezcla resultar su separacin.
La cromatografa de exclusin molecular (a menudo tambin llamada filtracin en
gel o de tamiz molecular) es una de las tcnicas ms sencillas de las empleadas
en la separacin de protenas y cidos nucleicos. Este tipo de cromatografa se
realiza en columnas cilndricas rellenas con algunos de los geles que se fabrican
con este fin y que pueden ser de varios tipos: dextranos con enlaces cruzados
(sephadex), agarosa (sepharose, Bio-gel A), poliacrilamida (Bio-gel B), etc. Todos
estos geles (fase estacionaria) se hallan constituidos por grnulos (partculas) de
un material esponjoso hidratado, que contiene poros con un tamao de dimetro
determinado. Hypothetical partial structure of sephacryl Cuando se hace pasar una
mezcla de molculas de distinto tamao, a travs de una columna de filtracin en
gel; aquellas molculas con un tamao mayor que el dimetro de los poros de las
partculas, slo podrn moverse en su camino, a travs de la fase estacionaria, en
el espacio que queda entre las partculas; y por lo tanto, no se vern retrasadas en
su descenso. En cambio aquellas molculas capaces de penetrar en las partculas
se vern retrasadas por la fase estacionaria; en mayor medida, cuanto menor sea
su tamao. Por lo tanto, las molculas eluyen en este tipo de cromatografa por
orden decreciente de tamao molecular. Mecanismo de la cromatografa de
exclusin Las mallas del gel permiten la entrada selectiva de las partculas de
menor masa molecular. De ah que las partculas de mayor peso molecular salgan
primero.

Mecanismo de la cromatografa de exclusin Las mallas del gel permiten la entrada selectiva de las
partculas de menor masa molecular. De ah que las partculas de mayor peso molecular salgan primero.

Pgin 1

CROMATOGRAFIA POR EXCLUSION MOLECUALR

Objetivos

Utilizar el gel apropiado para eluir protenas de peso molecular conocido y


determinar su volumen de elucin (Ve)

Realizar una grfica que relacione los volmenes de elucin relativos (Ve/Vo),
y el logaritmo de los pesos moleculares de las protenas patrn.

Determinar el peso molecular de una protena problema

Resultdos
A. DETERMINACION DEL VOLUMEN VACIO DE LA COLUMNA.
Tabla 1. Determinacin de volumen vaco (Vo) de la Columna.
No. de fraccin
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12

Volumen de elucin
(mL)
3
6
9
12
15
18
21
24
27
30
33
36

A 615nm
0,002
0,002
0,002
0,002
0,002
0,002
0,528
0,843
0,083
0,018
0,007
0,003

Volumen Vco
de l column

1. Cul es el volumen vaco de la columna?


- El volumen vaco de la columna es de 21 mL, esto depende de la altura de la
misma.

Pgin 2

CROMATOGRAFIA POR EXCLUSION MOLECUALR

Perfil de Elucin de Dextrana Azul 2000


0,9
0,8

Absorbancia (nm)

0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
-0,1

12

15

18

21

24

27

30

33

36

Volumen de Elucin (mL)

Fig. 1 Perfil de Elucin de Dextrana Azul 2000 para la determinacin del volumen
vaco en la columna cromatografica.
B. DETERMINACION DEL VOLUMEN DE ELUCION (Ve), DE LAS PRTEINAS
PATRON Y PROBLEMA.
Tabla 2. Determinacin de volumen de elucin de las protenas.
Volumen de
elucin (mL)
3
6
9
12
15
18
21
24
27
30
33
36
39
42
45
48
51
54
Pgin 3

Albmina
(Problema)
0,03
-0,015
0,114
0,804
0,721
0,202
0,041
0,101
0,026
-0,006
0,039
-0,01
0,089
0,052
-0,023
-0,031
0,008
0,024

Absorbancia
Lisozima
Hemoglobina
-0,014
-0,039
0,007
0,028
0,039
0,062
0,331
-0,333
0,672
0,995
1,186
1,047
0,87
0,572
0,298
0,167
0,034
0,142

-0,012
-0,013
-0,015
-0,009
0,958
1,378
0,968
0,558
0,27
0,118
0,045
0,013
0,009
-0,002
-0,002
-0,001
-0,001

Tripsina
0,007
0,034
0,013
0,043
-0,015
0,128
0,049
0,164
0,273
0,337
0,368
0,203
0,282
0,368
0,481
0,553
0,251
0,103

CROMATOGRAFIA POR EXCLUSION MOLECUALR


57
60
63
66
69
72
75

0,002
0,075
0,042
0,009
0,034
0,019
0,086

0,004
-0,021
-0,003
-0,042
-0,032
0,014
0,08

0,06
0,063
-0,023
-0,023
0,034
0,086

1,3
1,2
1,1
1
0,9
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
-0,1 3
-0,2
-0,3
-0,4
-0,5

1,5
1,4
1,3
1,2
1,1
1
0,9
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
12 15 18 21 24 27 30 33 36 39 42 45 48 51 54 57 60 63 66 69 72 75
0,2
0,1
0
-0,1

Volumen de Elucin (mL)

Albumina (Problema)

Lizosima

Tripsina

Hemoglobina

Fig. 2 Perfil de Elucin de las protenas patrn utilizadas y la protena problema.

C. DETERMINACION DE LA RELACION Ve/Vo.


Tabla 3. Relacin de Ve/Vo y el logaritmo del peso molecular de las protenas
patrn y problema.
Protenas

Vo (mL)

Ve (mL)

PM

Log PM

Ve/Vo

Lisozima
Tripsina
Hemoglobina
Albumina

15
24
24
15

33
51
21
15

14400
24000
64500
67000

4,16
4,38
4,81
4,83

2,20
2,13
0,88
1,00

Pgin 4

Absorbancia a 405 nm

Absorbancia a 280 nm

Perfil de Elucin de protenas patrn y protena problema

CROMATOGRAFIA POR EXCLUSION MOLECUALR


Clculos.
= /
Relacin de volmenes= (24)(21)= 0.88

Volumen de Elucion Relativo Ve/Vo

Curva tipo
2,50
2,00
1,50
y = -2,1535x + 11,315
R = 0,9175

1,00
0,50
0,00
4,10

4,20

4,30

4,40

4,50

4,60

4,70

4,80

4,90

Log PM

Fig. 3. Curva tipo empleando el mtodo de Andrews y Whitaker del volumen e


elucin relativo respecto al logaritmo del peso molecular.
Calculo del PM con la ecuacin de la recta.
Y=mx+b
Ve/Vo= m (logPM) + b
Utilizando el valor de que obtuvimos en la relacin Ve/Vo de nuestra protena
problema:
1= -2.16 (logPM) +11.33
111.33
2.16

= 4.78

Antilog PM (4.78)= 60200 Daltones


a) Cul es el peso molecular
Segn los clculos realizados, de acuerdo a la curva tipo, el peso molecular es de
60200 daltones, por lo tanto el valor obtenido experimentalmente para nuestra
protena problema (albmina), no esta tan alejado del valor calculado, es similar.
b) Mencionar 5 mtodos para determinar peso molecular.
Electroforesis: La electroforesis en gel de SDS se usa comnmente para obtener
estimaciones de peso molecular fiables para polipptidos desnaturalizados. Las

Pgin 5

CROMATOGRAFIA POR EXCLUSION MOLECUALR


protenas migran a travs del gel hacia el electrodo positivo a una velocidad que es
inversamente proporcional a su peso molecular.
Mtodo de Kjeldah mediante la determinacin del nitrgeno orgnico: Primero
reaccionan las protenas en una mezcla con H2SO4 en presencia de catalizadores,
donde el nitrgeno orgnico pasa a sulfato de amonio. La mezcla se neutraliza con
una base y se destila recogiendo en cido brico. Luego se titula, el contenido de
nitrgeno es proporcional a las protenas de la muestra
Espectrometra de masas: Por un mtodo de tincin con plata superficial
compatible con la digestin proteica.
c) Mencionar ventajas y limitaciones del mtodo empleado.
Ventajas
-Utiliza materiales comunes para el montaje del sistema cromatografico.
-No utiliza mucha cantidad de muestra.
Desventajas
-No es posible observar el desarrollo cuando la muestra es incolora.
-Para una buena resolucin es necesario mantener todos los parmetros
controlados.
-El tiempo de separacin delas molculas pequeas es mucho mas prolongado.

Discusion
En esta prctica se llev a cabo un mtodo cromatogrfico para determinar el peso
molecular de una protena problema, que en este caso fue Albmina.
Primero se llev a cabo el empaquetamiento de la columna con el gel Sephadex G75, que es un gel de dextrana con un intervalo de fraccionamiento de 3000-80000
daltones, luego se realiz la determinacin del volumen vaco para conocer el
volumen intersticial que existe entre las esferas del gel de la fase estacionaria
(Sephadex G-75), esta determinacin se realiz con dextrana azul 2000 con un peso
molecular de 2000 kDa, asegurando que no entrara en los poros del gel y solo pase
entre las esferas del mismo, el volumen vaco resulto de la fraccin de volumen a la
que se present mayor absorbancia (Tabla 1.), para observar la representacin
grfica de los resultados obtenidos durante la cromatografa se realiz el perfil de
elucin (Fig 1) esperndose un nico pico a 615 nm, este volumen vaco depender
de la velocidad de elucin y de la altura de la columna utilizada para el experimento.
Para la determinacin de la curva tipo se trataron diferentes muestras patrn:
Lisozima, Tripsina y Hemoglobina, en nuestro caso se trabaj con Hemoglobina,
siendo esta una protena colorida se ley a 405 nm. En la Fig 2 Se puede observar
que en las diferentes protenas patrn se presentan diferentes picos de absorcin
mxima la razn es que la integracin de la muestra se llev a cabo en diferentes
bloques; la protena no est integra y hubo cierta degradacin de la misma por lo
cual alguno de los picos pueda ser por fragmentos de pptidos.

Pgin 6

CROMATOGRAFIA POR EXCLUSION MOLECUALR


El peso molecular de la protena problema fue determinado con la ecuacin de la
recta de la Fig. 3, que representa la relacin del volumen de elucin relativa de cada
una de las protenas patrn respecto al logaritmo del peso molecular, se encontr
que el valor obtenido experimentalmente es muy similar al calculado.

Conclusiones
Se determin el peso molecular de una protena problema mediante la
ecuacin de la recta de la curva tipo.
Se determinaron algunas de las ventajas y desventajas del mtodo de
separacin empleado.
Se realiz el perfil de elucin de la dextrana azul para determianr volumen
vaco.
El volumen de elucin es la cantidad de tiempo que se invierte para que la
fase mvil salga sin interferencia del analito y depende relativamente de la
altura de la columna cromatografica.

Bibliogrf.
TCNICAS DE SEPARACIN. CROMATOGRAFA URL:
http://ocw.uc3m.es/ciencia-e-oin/caracterizacion-de-materiales/materialde-clase-1/Tecnicas_de_separacion_cromatografica.pdf (Consulta
25/10/16)
SEPARACIN DE PROTENAS POR CROMATOGRAFA DE
EXCLUSIN MOLECULAR URL:
http://acasti.webs.ull.es/docencia/practicas/6.pdf (Consulta 24/10/16)

Pgin 7