UNIVERSIDADE DE SO PAULO

ESCOLA DE ENGENHARIA DE LORENA

DANIELY GARCIA

Estudo da produo de etanol pela levedura Pichia stipitis, a

partir do hidrolisado hemicelulsico de bagao de malte

Lorena SP
2012

DANIELY GARCIA

Estudo da produo de etanol pela levedura Pichia stipitis, a partir do

hidrolisado hemicelulsico de bagao de malte

Tese apresentada Escola de Engenharia de

Lorena da Universidade de So Paulo para
obteno do ttulo de Doutor em Cincias do
Programa de Ps-Graduao em Biotecnologia
Industrial na rea concentrao de converso de
biomassa.
Orientadora: Prof.a Dr.a Ins Conceio Roberto

LORENA
2012

AUTORIZO A REPRODUO E DIVULGAO TOTAL OU PARCIAL DESTE

TRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRNICO,
PARA FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.

Ficha Catalogrfica
Elaborada pela Biblioteca Especializada em Engenharia de Materiais
EEL/USP
Garcia, Daniely
Estudo da produo de etanol pela levedura
Pichia stipitis a partir do hidrolisado hemicelulsico de
bagao de malte./ Daniely Garcia. 2012.
153 f.: il.
Tese (Doutor em Cincias Programa de Ps
Graduao em Biotecnologia Industrial. rea de
Concentrao: Converso de Biomassa) Escola de
Engenharia de Lorena Universidade de So Paulo.
1. Etanol 2. Pichia stipitis 3. Fermentao 4.
Bagao de malte I. Ttulo.
CDU 662.754

Ao meu marido Luiz pelo amor,

respeito e companheirismo
sempre.
minha famlia e
especialmente aos meus pais
Jos e Eunice, pelo amor
incondicional e apoio em todos
os momentos da minha vida.

AGRADECIMENTOS
A Deus por tudo que sou e tenho.
Prof.a Dr.a Ins Conceio Roberto pelo empenho e dedicao neste
trabalho.
Ao CNPq pelo apoio financeiro.
Aos meus queridos amigos do Laboratrio de Fermentao I: Livia, Joo
Paulo, Dani, Bruno, Rafael, J e mais recentemente, Isabela, Tathi, Tlio e
Brbara, pelos impagveis momentos de desabafo, fofocas e descontrao ao
longo destes anos de convivncia.
Um agradecimento especial aos meus pseudo-co-orientadores: Joo
Paulo, Dani e Livia pelos ensinamentos e, principalmente pela amizade.
Aos colegas do Debiq pelos agradveis momentos de convivncia.
Aos meus primeiros incentivadores na rea acadmica: Dr.a Clarice
Abramo, Dr. Henrique Couto Teixeira e Dr.a Ana Paula Ferreira.
Ao meu amado marido Luiz, por ser meu melhor amigo e por ser to
compreensivo, paciente e generoso durante este perodo.
Aos meus irmos, pelo cuidado e amor que sempre tiveram comigo.
minha av Constncia por ser um exemplo de mulher para mim.
minha tia e madrinha Ondinha pelo amor e carinho.
s minhas fiis e eternas amigas: Eliane Aquino, Jacqueline Oliveira,
Kellen Leal e Patrcia Cleary por fazerem parte da minha vida, mesmo distantes.
Lilia, minha cunhada querida, por me acolher com tanto carinho em sua
famlia.
Aos professores e orientadores do estgio de docncia: Marco Alcntara e
Maria das Graas de Almeida Felipe pela disponibilidade e ensinamentos.
Escola de Engenharia de Lorena (EEL-USP), aos professores e
funcionrios que de alguma forma contriburam para a realizao deste trabalho.

A educao a mais poderosa

arma pela qual se pode mudar o
mundo.
(Nelson Mandela)

RESUMO
GARCIA, D. Estudo da produo de etanol por Pichia stipitis, a partir do
hidrolisado hemicelulsico do bagao de malte. 2012. 153p. Tese (Doutorado
em Cincias) - Escola de Engenharia de Lorena, Universidade de So Paulo,
Lorena, 2012.
O presente estudo teve como objetivo avaliar a produo de etanol pela levedura
Pichia stipitis, a partir do hidrolisado hemicelulsico do bagao de malte (HHBM).
Primeiramente estudou-se o efeito da suplementao nutricional do hidrolisado
adicionando-se extrato de farelo de arroz (0 a 20% v/v), uria (0 a 3 g/L) e extrato
de levedura (0 a 3 g/L). Os resultados mostraram que o hidrolisado suplementado
apenas com extrato de levedura proporcionou os melhores resultados de
converso (YP/S = 0,44 g/g) e produtividade em etanol (QP = 0,33 g/L.h). Em
seguida foi avaliado o nvel timo deste nutriente sobre a bioconverso, sendo
confirmada a suplementao do HHBM com 3,0 g/L de extrato de levedura. Aps
o estabelecimento das condies nutricionais, a levedura foi cultivada em HHBM
aps o crescimento de 24 horas em meio semissinttico, visando aclimatar as
clulas aos inibidores presentes no hidrolisado. Este estudo resultou no aumento
das velocidades do processo, sendo 16% sobre a produtividade volumtrica em
etanol (QP) e 10% sobre a velocidade de consumo de substrato (QS), quando
comparado ao cultivo das clulas somente em meio semissinttico. Na etapa
seguinte utilizou-se um planejamento fatorial 22 com face centrada para
otimizao das condies de pH e concentrao inicial de clulas (X0) na
fermentao em HHBM no destoxificado e aps a destoxificao com carvo
ativado. Foram obtidos modelos para descrever os valores de YP/S e QP na regio
estudada, sendo que para o HHBM no destoxificado os valores destes
parmetros foram 0,40 g/g e 0,65 g/L.h, respectivamente, em pH 6,4 e X0 = 5,0
g/L (modelo 1). Em HHBM destoxificado, as condies timas foram obtidas em
pH 6,0 e 1,36 g/L de clulas (modelo 2), obtendo-se YP/S de 0,40 g/g e QP de 0,46
g/L.h. Nas condies otimizadas foram ento realizados ensaios que confirmaram
a validade dos modelos 1 e 2, obtendo-se a mxima concentrao de etanol (23,4
g/L), YP/S de 0,41 g/g e QP de 0,65 g/L.h em HHBM no destoxificado. Realizouse ensaios para avaliao do efeito do cido actico sobre a fermentao em
meio semissinttico por P. stipitis, empregando-se as condies de pH e X0
otimizadas em HHBM no destoxificado (modelo 1) e destoxificado (modelo 2).
Este estudo mostrou que nas condies do modelo 1, o cido actico favoreceu a
bioconverso sendo os melhores resultados obtidos na presena deste cido (YP/S
= 0,47 g/g e QP = 1,08 g/L.h). Por outro lado, nas condies do modelo 2, os
valores de YP/S foram similares, enquanto que com a adio de cido actico ao
meio de fermentao, o valor de QP foi reduzido em 53%. Na fermentao em
biorreator, o emprego das condies otimizadas em frascos (pH 6,4 e 5,0 g/L de
clulas) resultaram em valores de QP 48% inferiores ao obtido em frascos (0,65
para 0,44 g/L.h), entretanto YP/S foi apenas 10% inferior (0,41 para 0,37 g/g). No
presente estudo, conclui-se que a suplementao nutricional do HHBM e a
otimizao das condies de pH e X0 resultaram em valores promissores para os
principais parmetros da fermentao por P. stipitis, ressaltando o potencial deste
hidrolisado em processos biotecnolgicos para produo de etanol.
Palavras-chave: Etanol. Pichia stipitis. Fermentao. Bagao de malte.

ABSTRACT

GARCIA, D. Study of ethanol production by Pichia stipitis from brewers

spent grain hemicellulosic hydrolysate. 2012. 153 p. Thesis (Doctor of
Science) Escola de Engenharia de Lorena, Universidade de So Paulo, Lorena,
2012.
This study aimed to evaluate the ethanol production by Pichia stipitis in brewers
spent grain hemicellulosic hydrolysate (BSGHH). Initially, the effect of nutritional
supplementation was evaluated by adding rice bran extract, urea and yeast
extract. The results showed that supplementation only with yeast extract promoted
the highest conversion values (YP/S = 0.44 g/L) and ethanol productivity (QP = 0.33
g/L.h). Additional assays showed that the optimal concentration of this nutrient
was 3.0 g/L. To acclimate the cells to inhibitors present in BSGHH the yeast was
cultivated in hydrolysate after growth for 24 hours in semisynthetic medium. This
study resulted in increased of the process rates, 16% of the ethanol productivity
(QP) and 10% on the substrate consumption (QS) when compared to growing cells
only in the semisynthetic medium. In the second step a 22 full factorial centeredface design was employed to optimized the conditions of pH and initial cells
concentration (X0) in fermentation of hydrolysate undetoxified and after
detoxification with activated charcoal. Mathematical models that relate the YP/S and
QP were obtained. For non-detoxified BSGHH (model 1) the optimal conditions of
pH (6.4) and X0 (5.0 g/L) showed values parameters of 0.41 g/g and 0.65 g/L.h,
respectively. In detoxified BSGHH (model 2) the optimum conditions of pH (6.0)
and X0 (1.36 g/L), resulted in YP/S and QP values of 0.40 g/g and 0.46 g/L.h,
respectively. Under these conditions, the the validity of the models were
confirmed. The effect of acetic acid on fermentation by P. stipitis in semisynthetic
medium, employing optimized conditions of pH and X0 in model 1 and model 2
was evaluated. The results showed that under the conditions of model 1 and in a
concentration of 2,9 g/L, the acetic acid favored the bioconversion by P. stipitis,
increasing the YP/S (15 %) and QP (66 %). On the other hand, in the conditions of
the model 2 the YP/S values were similar, whereas the QP values were reduced by
53% when the acetic acid was added. By using these optimized conditions in
bioreactor fermentation it was obtained the ethanol productivity was approximately
48% lower (0.65 to 0.44 g/L.h), however the ethanol production was similar as
compared to fermentation flasks. It is possible conclude that the HHBSG requires
nutritional supplementation and that the optimized conditions of pH and initial cells
concentration can be used as a strategy in order to raising the fermentation
parameters.
Key-words: Ethanol. Pichia stipitis. Fermentation. Brewers spent grain.

LISTA DE FIGURAS

Figura 2.1 Ciclo do carbono e converso da energia solar

26

Figura 2.2 Principais pases produtores de etanol 2008 e 2010

27

Figura 2.3 Estrutura da parede celular dos vegetais mostrando o arranjo das
macrofibrilas de celulose, cadeias de hemicelulose e de lignina, alm
30
de monossacardeos presentes nestas estruturas
Figura 2.4 Produo de etanol a partir da biomassa lignocelulsica

33

Figura 2.5 Representao esquemtica da produo de bagao de malte

40

Figura 2.6 Metabolismo de xilose e glicose em leveduras fermentadoras de

xilose
45
Figura 2.7 Vias de fermentao de xilose

48

Figura 5.1 Consumo de acares (glicose e xilose) (a) e cido actico (b) pela
levedura P. stipitis sob diferentes condies nutricionais, conforme
ensaios do planejamento fatorial 23, em hidrolisado hemicelulsico
de bagao de malte
81
Figura 5.2 Produo de etanol (a) e formao de biomassa (b) pela levedura P.
stipitis sob diferentes condies nutricionais, conforme ensaios do
planejamento fatorial 23, em hidrolisado hemicelulsico de bagao de
malte
83
Figura 5.3 Grficos de Pareto representando as estimativas dos efeitos a 95%
de confiana e erro puro com 3 graus de liberdade (t = 3,18) para as
variveis resposta: YP/S (a), YX/S (b), QP (c), QS (d)
87
Figura 5.4 Consumo de acares (glicose e xilose) (a) e produo de etanol (b)
por P. stipitis, a partir da suplementao do hidrolisado
hemicelulsico de bagao de malte com diferentes concentraes de
extrato de levedura
90
Figura 5.5 Influncia de diferentes concentraes de extrato de levedura na
bioconverso do HHBM por Pichia stipitis, sob os parmetros
fermentativos. (a): rendimento em etanol; (b): rendimento em clulas;
(c): produtividade em etanol; (d): velocidade de consumo de
substrato. EL: extrato de levedura
91
Figura 5.6 Consumo de xilose (a) e produo de etanol (b) por P. stipitis, a
partir do cultivo da levedura em meio semissinttico () e do cultivo
em duas etapas: meio semissinttico seguido pelo cultivo em
hidrolisado de bagao de malte ()
93

Figura 5.7 Consumo de glicose (a), xilose (b) e de cido actico (c) por P.
stipitis em hidrolisado hemicelulsico de BM, sob diferentes
condies de pH e concentrao inicial de clulas, conforme ensaios
do planejamento fatorial 22. Ponto central: mdia dos ensaios
realizados sob pH 5,5 e 3 g/L de clulas
97
Figura 5.8 Produo de etanol (a) e formao de biomassa (b) por P. stipitis em
hidrolisado hemicelulsico de BM, sob diferentes condies de pH e
concentrao inicial de clulas, conforme ensaios do planejamento
fatorial 22. Ponto central: mdia dos ensaios realizados sob pH 5,5 e
3 g/L de clulas
99
Figura 5.9 Superfcie de resposta relacionando a converso do substrato em
etanol (a) e a produtividade volumtrica em etanol (b) com a
concentrao inicial de clulas e pH em nveis codificados
106
Figura 5.10 Comportamento cintico da levedura P. stipitis, observado nas
condies otimizadas pelo modelo, visando produo de etanol
em hidrolisado hemicelulsico de bagao de malte
108
Figura 5.11 Espectros de varredura na regio do hidrolisado hemicelulsico de
bagao de malte concentrado antes ( ) e aps ( ) o processo
de destoxificao
111
Figura 5.12 Consumo de glicose (a), xilose (b) e de cido actico (c) por P.
stipitis em hidrolisado hemicelulsico de BM destoxificado, sob
diferentes condies de pH e concentrao inicial de clulas,
conforme ensaios do planejamento fatorial 22. Ponto central: mdia
dos ensaios realizados sob pH 5,5 e 3 g/L de clulas
114
Figura 5.13 Produo de etanol (a) e formao de biomassa (b) por P. stipitis
em hidrolisado hemicelulsico de BM destoxificado, sob diferentes
condies de pH e concentrao inicial de clulas, conforme
ensaios do planejamento fatorial 22. Ponto central: mdia dos
ensaios realizados sob pH 5,5 e 3 g/L de clulas
116
Figura 5.14 Fator de converso do substrato e produtividade volumtrica em
etanol, obtidos nos ensaios do planejamento 22, realizados em
HHBM no destoxificado () e aps destoxificao (). Ensaios
realizados em pH 5,5 direita e em pH 6,5 esquerda
119
Figura 5.16 Superfcie de resposta relacionando a converso do substrato em
etanol (a) e a produtividade volumtrica em etanol (b) com a
concentrao inicial de clulas e pH, em nveis codificados
124
Figura 5.17 Comportamento cintico da levedura P. stipitis, observado nas
condies otimizadas pelo modelo, visando produo de etanol
em hidrolisado hemicelulsico de bagao de malte destoxificado
126

Figura 5.18 Comportamento cintico observado na bioconverso de acares

pela levedura P. stipitis em meio semissinttico, simulando as
condies otimizadas em HHBM: consumo de glicose e xilose (a)
e arabinose (b); formao de etanol (c) e biomassa (d)
129
Figura 5.19 Comportamento cintico apresentado pela levedura P. stipitis, na
fermentao do hidrolisado hemicelulsico de bagao de malte,
em biorreator e em frascos agitados, empregando-se as
condies otimizadas de pH e concentrao inicial de clulas
(modelo
134
Figura 5.20 Parmetros fermentativos obtidos nas fermentaes por P. stipitis
realizadas em meio semissinttico (MSS), em frascos agitados
(FA) e em biorreator (BR), sendo empregadas as condies
otimizadas de pH (6,5) e concentrao inicial de clulas (5 g/L).
(a): converso de substrato em etanol (YP/S); (b): produtividade
volumtrica em etanol (QP)
136

LISTA DE TABELAS

Tabela 2.1 Potencial de produo de bioetanol a partir de diferentes matriasprimas

30
Tabela 2.2 Principais mtodos utilizados para pr-tratamento da biomassa
lignocelulsica
36
Tabela 2.3 Composio qumica (% peso seco) do bagao de male (BM)

41

Tabela 2.4 Comparao dos ensaios fermentativos realizados em hidrolisados

lignocelulsicos, empregando diferentes linhagens da levedura
Pichia stipitis, visando produode etanol
50
Tabela 4.1 Planejamento fatorial do tipo 23, com triplicata no ponto central, para
a avaliao do efeito da suplementao nutricional do HHBM na
produo de etanol por Pichia stipitis NRRL Y-7124
61
Tabela 4.2 Planejamento fatorial do tipo 22 com face centrada, com triplicata no
ponto central, para a avaliao do efeito do pH e da concentrao
inicial de clulas na produo de etanol a partir de Pichia stipitis
NRRL Y-7124
63
Tabela 5.1 Composio qumica do bagao de malte obtido no processo
cervejeiro
73
Tabela 5.2 Composio do hidrolisado hemicelulsico do bagao de malte
original e concentrado trs vezes
75
Tabela 5.3 Planejamento fatorial do tipo 23, com trs repeties no ponto central
(mdia apresentada), visando avaliar o efeito da suplementao
nutricional do hidrolisado hemicelulsico de BM sobre o consumo de
acares e a produo de etanol pela levedura P. stipitis
79
Tabela 5.4 Planejamento fatorial do tipo 23, com trs repeties no ponto central
(mdia apresentada), visando avaliar o efeito da suplementao
nutricional do HHBM sobre a converso do substrato em etanol e em
clulas, a produtividade em etanol e a velocidade de consumo de
substrato, por P. stipitis
85
Tabela 5.5 Parmetros da fermentao por P. stipitis cultivada em meio
semissinttico e em hidrolisado de bagao de malte, aps 72 horas
de fermentao
93
Tabela 5.6 Planejamento fatorial do tipo 22, com trs repeties no ponto central
(mdia apresentada), visando avaliar o efeito do pH e da
concentrao inicial de clulas (X0) em hidrolisado hemicelulsico de
BM sobre o consumo de acares e a produo de etanol pela
levedura P. stipitis, aps 36 horas de fermentao
96

Tabela 5.7 Matriz do planejamento fatorial composto 22 com face centrada, para
avaliao do efeito do pH e da concentrao inicial de clulas sobre
a fermentao do HHBM pela levedura P. stipitis
101
Tabela 5.8 Anlise de varincia com erro total para os principais efeitos e suas
interaes, durante a fermentao do hidrolisado hemicelulsico de
BM por P. stipitis, sob diferentes condies de pH (1) concentrao
inicial de clulas (2)
103
Tabela 5.9 Anlise de varincia de regresso para os modelos representativos
da converso do substrato em etanol (YP/S) e produtividade
volumtrica em etanol (QP)
105
Tabela 5.10 Equaes do modelo para otimizao de pH e concentrao inicial
de clulas na fermentao do HHBM por P. stipitis, ajustados aos
dados experimentais para o fator de converso em etanol (Y1) e
produtividade volumtrica em etanol (Q1)
105
Tabela 5.11 - Parmetros fermentativos obtidos nos ensaios visando
confirmao do modelo otimizado para a bioconverso de
acares (glicose e xilose) em etanol por P. stipitis, em
hidrolisado hemicelulsico de bagao de malte
108
Tabela 5.12 Acares e principais compostos inibidores, dados em g/L,
detectados durante o processo de destoxificao do HHBM 110
Tabela 5.13 Planejamento fatorial do tipo 22, com trs repeties no ponto
central (mdia apresentada), visando avaliar o efeito do pH e da
concentrao inicial de cluls (X0) sobre a converso do substrato
em etanol pela levedura P. stipitis, em hidrolisado hemicelulsico
de BM destoxificado, aps 48 horas de fermentao
113
Tabela 5.14 Matriz do planejamento fatorial composto 22 com face centrada,
para avaliao do efeito do pH e da concentrao inicial de
clulas em HHBM destoxificado sobre a converso de substrato a
etanol e em clulas, a produtividade em etanol e a velocidade de
consumo de substrato por P. stipitis
118
Tabela 5.15 Anlise de varincia com erro total para os principais efeitos e suas
interaes, durante a fermentao do hidrolisado hemicelulsico de
BM destoxificado, empregando a levedura P. stipitis, sob diferentes
condies de pH (1) concentrao inicial de clulas (2)
121
Tabela 5.16 Anlise de varincia de regresso para os modelos representativos
da converso do substrato em etanol (YP/S) e produtividade
volumtrica em etanol (QP) em hidrolisado de bagao de malte
destoxificado
123

Tabela 5.17 Equaes do modelo para otimizao de pH e concentrao inicial

de clulas na fermentao do HHBM destoxificado, por P. stipitis
ajustados aos dados experimentais para o fator de converso do
substrato (Y2) e produtividade volumtrica em etanol (Q2)
123
Tabela 5.18 Parmetros fermentativos obtidos nos ensaios visando
confirmao do modelo otimizado para a bioconverso de
acares (glicose e xilose) em etanol por P. stipitis, em hidrolisado
hemicelulsico de bagao de malte destoxificado
126
Tabela 5.19 Parmetros fermentativos obtidos na fermentao em meio
semissinttico pela levedura P. stipitis, empregando-se as
condies dos modelos obtidos em hidrolisado no destoxificado
(modelo 1) e destoxificado (modelo 2), na presena ou no de
cido actico
131
Tabela 5.20 Parmetros fermentativos obtidos na fermentao do hidrolisado
hemicelulsico de bagao de malte no destoxificado pela
levedura P. stipitis, sob as condies otimizadas de pH e
concentrao inicial de clulas em biorreator
135
Tabela 5.21 Fator de converso do substrato (YP/S) e produtividade volumtrica
em etanol (QP) obtidos nas fermentaes em frascos (meio
semissinttico e HHBM) e em biorreator (HHBM), por P. stipitis.
Foram empregadas as condies de pH (6,4) e concentrao
inicial de clulas (5,0 g/L) otimizadas em HHBM
136

SUMRIO

INTRODUO

23

REVISO DE LITERATURA

25

2.1 Aproveitamento de biomassas visando produo de etanol

25

2.1.1 Tendncia global da produo de bioetanol

25

2.1.2 Materiais lignocelulsicos

29

2.1.3 Fracionamento de materiais lignocelulsicos

32

2.2 Bagao de Malte: caractersticas e principais aplicaes

40

2.3 Metabolismo de pentose em leveduras

44

2.3.1 Metabolismo de xilose

44

2.3.2 Microorganismos fermentadores de pentoses

46

2.3.3 Pichia stipitis

47

2.4 Fatores nutricionais e ambientais que interferem na bioconverso

50

57

OBJETIVOS

3.1 Objetivo geral

57

3.2 Objetivos especficos

57

58

MATERIAIS E MTODOS

4.1 Obteno e caracterizao do hidrolisado hemicelulsico de bagao de

malte

58

4.2 Microrganismo e preparo do inculo

58

4.3 Meio e condies de fermentao

59

4.3.1 Efeito da suplementao nutricional do HHBM na produo de etanol pela

levedura Pichia stipitis

61

4.3.2 Efeito da concentrao do extrato de levedura e do cultivo de Pichia stipitis

em HHBM sobre a produo de etanol

62

4.3.3 Otimizao do pH e da concentrao inicial de clulas sobre a produo de

etanol por Pichia stipitis em HHBM no destoxificado

62

4.3.4 Otimizao do pH e da concentrao inicial de clulas sobre a produo de

etanol por Pichia stipitis em HHBM destoxificado

63

4.3.5 Efeito do cido actico sobre a produo de etanol por Pichia stipitis em
meio semissinttico

64

4.4 MTODOS ANALTICOS

64

4.4.1 Determinao do teor de umidade

64

4.4.2 Determinao dos teores de celulose, hemicelulose e lignina

64

4.4.3 Determinao do teor de cinzas

67

4.4.4 Determinao do teor de protenas

67

4.4.5 Determinao da concentrao celular

68

4.4.6 Determinao dos teores dos acares, de cido actico e de etanol

68

4.4.7 Determinao dos teores de furfural, hidroximetilfurfural e compostos

fenlicos

68

4.4.8 Determinao dos Teores de Compostos Fenlicos Totais

69

4.4.9 Determinao do pH

69

4.4.10 Determinao da Densidade

69

4.4.11 Determinao do coeficiente volumtrico de transferncia de oxignio

70

4.5 PARMETROS FERMENTATIVOS

70

4.5.1 Fator de Converso (rendimento) de Substrato em Clulas: YX/S (g/g):

71

4.5.2 Fator de Converso de Substrato (rendimento) em Etanol: YP/S (g/g):

71

4.5.3 Produtividade Volumtrica em Etanol: QP (g/L.h):

71

4.5.4 Eficincia de Fermentao

71

4.6 ANLISE ESTATSTICA

72

73

RESULTADOS E DISCUSSO

5.1 Caracterizao do bagao de malte e do hidrolisado hemicelulsico

73

5.2 Efeito da suplementao nutricional do hidrolisado hemicelulsico de

bagao de malte sobre a produo de etanol por Pichia stipitis
5.2.1 Anlise estatstica dos resultados

77
86

5.3 Efeito da concentrao do extrato de levedura e do pr-cultivo de

Pichia stipitis em HHBM sobre a produo de etanol.

88

5.4 Otimizao das condies de pH e concentrao de clulas sobre a

produo de etanol por Pichia stipitis, em HHBM no destoxficado

94

5.4.1 Anlise estatstica do Planejamento Fatorial Composto 22 com face

centrada, para avaliao do efeito do pH e da concentrao inicial de
clulas.
5.4.2 Confirmao experimental das condies otimizadas

102
107

5.5 Otimizao das condies de pH e concentrao inicial de clulas

visando produo de etanol por Pichia stipitis, em HHBM
destoxificado

109

5.5.1 Anlise estatstica do planejamento fatorial 22 composto com face centrada,

para otimizao do pH e da concentrao inicial de clulas, a partir do
HHBM destoxificado.
5.5.2 Confirmao dos Modelos Obtidos

120
125

5.6 Efeito do cido actico sobre a produo de etanol por Pichia stipitis,
em meio semissinttico

128

5.7 Fermentao do hidrolisado hemicelulsico de bagao de malte pela

levedura Pichia stipitis em biorreator

133

CONCLUSES

139

REFERNCIAS

141

23

INTRODUO

Na dcada de 70, a crise mundial do petrleo motivou a busca por fontes

energticas renovveis e alternativas, visando diminuir o consumo de petrleo.
Em resposta crise foi criado o Programa Nacional do lcool (PROLCOOL),
que deu origem atualmente ao maior sistema de produo de energia comercial a
partir de biomassa do mundo, levando substituio de cerca de 40% da gasolina
por etanol. Desse modo, o Brasil tornou-se pioneiro no desenvolvimento de
tecnologia para automveis movidos a lcool hidratado, sendo o PROLCOL
ainda hoje, referncia mundial.
Atualmente as principais matrias primas utilizadas para a produo de
etanol so a cana de acar (Brasil) e o milho (EUA), mas devido ampla
utilizao destes produtos para alimentao, h um crescente interesse por novas
alternativas para a produo de etanol. O interesse pela produo de etanol a
partir de diferentes biomassas tem aumentado sendo os materiais lignocelulsicos
grande alvo de pesquisas nessa rea. Estes materiais representam uma
abundante fonte de energia em todo o mundo, estando disponveis na forma de
resduos agrcolas e florestais. Assim, o desenvolvimento de tecnologias que
possibilitem uma converso eficiente de tais resduos torna-se necessrio, bem
como processos de destoxificao de hidrolisados lignocelulsicos que sejam
capazes de retirar seletivamente os inibidores gerados durante o pr-tratamento
ou ainda estratgias nutricionais e condies do processo que possam minimizar
a presena destes inibidores diminuindo assim, o tempo gasto e o custo gerado
pelo emprego dos processos de destoxificao.
Neste trabalho foi avaliado o potencial para a produo de etanol, de um
dos maiores subprodutos da indstria cervejeira, o bagao de malte, obtido a
partir a produo da cerveja, e que destinado praticamente alimentao
animal. O hidrolisado hemicelulsico do bagao de malte foi utilizado como meio
de fermentao para a converso dos acares presentes em etanol, pela
levedura Pichia stipitis. Alguns aspectos importantes para a bioconverso dos
hidrolisados visando eficientes converso e produtividade em etanol foram
estudados, como a suplementao nutricional, pH e concentrao inicial de
clulas, uma vez que sob o ponto de vista industrial, a otimizao dos nveis dos
nutrientes pode representar uma reduo no custo de formulao do meio e maior

24

simplicidade do processo fermentativo. Do mesmo modo que pH e concentrao

incial de clulas so fatores determinantes para o processo e podem contribuir
para diminuir ou eliminar as etapas dos processos de destoxificao. O presente
estudo est inserido no programa de pesquisas do Grupo de Microbiologia
Aplicada e Bioprocessos (GMBio) do Departamento de Biotecnologia (LOT) da
Escola de Engenharia de Lorena (EEL-USP), que apresenta como objetivo o
desenvolvimento de tecnologias para o aproveitamento de matrias-primas
lignocelulsicas, especialmente resduos agro-indstriais visando produo de
materiais de alto valor agregado por via biotecnolgica.

25

REVISO DE LITERATURA

2.1 Aproveitamento de biomassas visando produo de etanol

2.1.1

Tendncia global da produo de bioetanol

O consumo mundial de energia vem aumentando em ritmos cada vez

maiores e o mundo presencia o esgotamento progressivo de seus recursos
energticos baseados em energia no renovvel. Alm disso, este consumo gera
grandes quantidades de gases na atmosfera aumentando os nveis de poluio
ambiental, com conseqente aquecimento global (MOHAN et al., 2008). De
acordo com Wildeborg e Lokhorst (2005), a queima de combustveis fsseis
responsvel por cerca de 73% do CO2 produzido.
Desse modo, o interesse em biocombustveis est crescendo no mundo
todo e alguns pases tm lanado medidas visando diminuir a poluio atravs da
reduo da dependncia do uso do petrleo como combustvel e da emisso de
gases do efeito estufa. Biocombustveis so importantes porque podem substituir
o petrleo gerando uma srie de benefcios econmicos, como a produo para
uso interno e exportao para outros pases e, ambientais (BALAT; BALAT,
2009).
O biocombustvel possui origem biolgica, no fssil e normalmente
produzido a partir de uma ou mais plantas. Todo material gera energia, mas o
biocombustvel fabricado em escala comercial a partir de produtos agrcolas
como a cana de acar, mamona, soja, canola, babau, mandioca, milho,
beterraba, entre outros. Desse modo, tem-se que combustveis tais como
biodiesel e bioetanol so tipos de biocombustvel.
Como recurso renovvel, a maior vantagem do uso de biocombustveis a
reduo da emisso de CO2 por automveis, pois o fato do bioetanol ser
produzido a partir de matria-prima de origem vegetal faz com que este gs seja
reciclado pelas plantas (Figura 2.1).
Atualmente, o etanol (C2H5OH ou EtOH) o biocombustvel mais
amplamente utilizado em veculos, podendo ser usado diretamente como
combustvel ou misturado gasolina, elevando seu contedo de oxignio e
consequentemente permitindo uma maior combusto da mesma, alm de

26

diminuir a emisso de gases poluentes (WANG et al., 1999; DERMIBAS, 2005). O

bioetanol comumente utilizado em uma mistura conhecida como E10 (10% de
etanol e 90% de gasolina), entretanto existem variaes entre os diferentes
pases. Nos Estados Unidos, a mistura varia de 10 a 15% de etanol adicionados a
90 e 85% de gasolina, respectivamente e entre os pases membros da Unio
Europia observa-se uma porcentagem de etanol adicionado gasolina, que vai
de 5% a 15% (DERMIBAS, 2007). No Brasil, utiliza-se uma mistura conhecida
como gasool que consiste de 25% de etanol e 75% de gasolina, sendo que o
etanol utilizado anidro com menos de 1% de gua. Esta mistura obrigatria no
Brasil e foi fixada entre 20 a 25% de lcool misturado com gasolina convencional
(LEI n 8.723, 1993) e desde julho de 2007, esta a mistura utilizada (E25)
(PORTARIA n 143, 2007). Os veculos flex do mercado brasileiro utilizam E25
ou qualquer mistura com etanol at E100 (etanol hidratado com at 4,9% de
gua). A mistura E100 utilizada somente no Brasil (ANP, 2005).

Figura 2.1. Ciclo do carbono e converso da energia solar (Adaptado de RFA, 2008).

27

Segundo Dufey (2006), cerca de 60% da produo mundial de bioetanol

feita a partir da cana de acar e 40% de outros resduos. Os Estados Unidos e o
Brasil so os lderes em produo, a partir do milho e da cana de acar,
respectivamente, e juntos so responsveis por cerca de 70% do bioetanol
produzido no mundo todo (Figura 2.2). De acordo com a Energy Independence
and Security Act (EISA) dos Estados Unidos, a perspectiva em relao
produo de biocombustvel para 2022 de cerca de 36 bilhes de gales, sendo
que 21 bilhes devem ser derivados de recursos sustentveis,, tais como materiais
lignocelulsicos.

Visando

alcanar

este

objetivo

torna
torna-se

necessrio

desenvolvimento
senvolvimento de tecnologias de custo efetivo e capazes de promover uma
bioconverso eficiente.

Figura 2.2. Principais pases produtores de etanol (Modificado

Modificado a partir de RFA
(Renewable
Renewable Fuels Association)
Association 2008 e 2010.

O Brasil o segundo maior produtor de etanol e o maior exportador

mundial, sendo considerado o lder internacional em matria de biocombustveis e
a primeira economia a ter atingido o uso sustentvel dos combustveis (USDA,
2009). O etanol brasileiro mais
mais barato que o produzido nos Estados Unidos e
Europa devido aos menores custos com o processamento, alm de ser mais

28

favorvel em termos de balano de energia e reduo na emisso dos gases de

efeito estufa (GOLDEMBERG, 2009; NIGAM; SINGH, 2010). O papel do Brasil na
histria da produo de biocombustvel teve incio em 1975 com o Programa
Nacional para a Produo de lcool PROLCOOL, um programa bem sucedido
que teve como objetivo a substituio dos derivados de petrleo. Foi desenvolvido
para evitar o aumento da dependncia externa de divisas quando dos choques de
preo de petrleo (PROCOOL, 2009). Em 1984 grande parte dos carros
produzidos no Brasil exigia o etanol hidratado [(96 bioetanol + 4 gua)/100] como
combustvel (KLINE et al., 2008) e, em 1993, o governo determinou que toda
gasolina produzida no Brasil deveria conter 20-25% de etanol (MARTINES-FILHO
et al., 2006). Entre 1999 aumentaram-se os incentivos privados para a produo
de bioetanol, ao mesmo tempo em que a interveno do governo diminuiu e, em
2000, a grande difuso de automveis flex juntamente com o aumento do preo
do petrleo, culminou num rpido aumento na produo de cana-de-acar e,
consequentemente, de bioetanol (KLINE et al., 2008). De 1975 a 2000, foram
fabricados cerca de 5,6 milhes de veculos a lcool hidratado. Adicionalmente, o
Programa substituiu por uma frao de lcool anidro (entre 1,1% a 25%), um
volume de gasolina pura consumida por uma frota superior a 10 milhes de
veculos a gasolina, evitando nesse perodo, emisses de gs carbnico da
ordem de 110 milhes de toneladas, alm da importao de aproximadamente
550 milhes de barris de petrleo. Com isso, ocorreu uma economia de divisas da
ordem de 11,5 bilhes de dlares (PROLCOOL, 2009).
Em maro de 2007, Brasil e Estados Unidos assinaram um memorando
(MOU-Memorandum of Understanding) cujo objetivo foi o avano bilateral em
pesquisas e desenvolvimento tecnolgico, incentivar a construo de indstrias
em pases em desenvolvimento e incentivar e possibilitar o uso dos
biocombustveis no mundo. Desde janeiro de 2012 o combustvel brasileiro tem
acesso livre ao mercado dos EUA, pela primeira vez em trs dcadas, entretanto
segundo a NICA (NICA, 2012), o mercado brasileiro demorar a sentir os
efeitos positivos devido queda da produo interna do etanol.
De acordo com Balat e Balat, (2009) mais de 80% dos automveis
fabricados no pas so capazes de utilizar combustvel flex, contra 30% em 2004
(BALAT e BALAT, 2009). Entretanto, em 2011 ocorreu a primeira reduo nas
vendas destes veculos devido ao aumento do preo do etanol hidratado. Alm

29

disso, no mesmo ano, a produo deste combustvel foi reduzida em 30% e, com
menos oferta do produto, o preo do combustvel nos postos foi elevado tornandose menos vantajososo para o consumidor, que voltou a utilizar a gasolina
(BIOCANA, 2012). De acordo com a Unio da Indstria de Cana-de-acar
(NICA, 2012), este quadro decorre dos baixos investimentos nos canaviais a
partir de 2008 devido crise financeira que atingiu um tero do setor, juntamente
com os grandes problemas climticos em termos de seca e geada no pas.
Adicionalmente, a valorizao do acar no mercado internacional, responsvel
pelo aumento de cerca de US$ 1 bilho arrecadados com a exportao do
produto entre 2010 e 2011, e o aumento da produo do etanol anidro, adicionado
gasolina, contriburam com este quadro. Segundo o Ministrio de Minas e
Energia (MME), como o etanol somente no fim de 2010 passou a ser classificado
como combustvel, agora ser exigido dos empresrios a estocagem do etanol
visando evitar que a falta do produto pressione ainda mais os preos. Entretanto,
esta regra s vale para o etanol anidro, portanto o etanol hidratado continua sem
uma poltica que garanta uma oferta constante a um preo que compense utilizlo ao invs da gasolina. Desse modo, evidente que o pas precisa investir no
etanol hidratado se quiser tornar o custo-benefcio atrativo novamente.

2.1.2 Materiais lignocelulsicos

Tendo em vista que a relao custo-benefcio um fator importante para a

produo em grande escala do bioetanol e que a produo deste combustvel a
partir de resduos agrcolas elimina a concorrncia existente entre alimento versus
combustvel (produzido a partir da cana-de-acar e/ou do milho), tem-se que os
resduos lignocelulsicos representam uma alternativa de baixo custo e
prontamente disponvel para tal finalidade (SARKAR et al., 2012). De acordo com
Kim e Dale, (2004), estima-se que cerca de 442 milhes de litros de etanol podem
ser produzidos a partir da biomassa lignocelulsica gerada e ainda que, resduos
agrcolas desperdiados poderiam gerar cerca de 491 milhes de litros de etanol
por ano.
Os materiais lignocelulsicos so formados de trs diferentes polmeros
chamados celulose, hemicelulose e lignina, que se apresentam em associao na
matria-prima (Figura 2.3).

30

Figura 2.3. Estrutura da parede celular dos vegetais mostrando o arranjo das
macrofibrilas de celulose, cadeias de hemicelulose e de lignina, alm de
monossacardeos presentes nestas estruturas (Adaptado de RUBIN, 2008)
Tabela 2.1. Potencial de produo de bioetanol a partir de diferentes matriasprimas.
Matria prima

Potencial para produo de

bioetanol (L/ton)

Cana-de-acar

70

Beterraba

110

Batata doce

125

Batata

110

Mandioca

180

Milho

360

Arroz

430

Cevada

250

Trigo

340

Sorgo

60

Bagao e outros resduos

280

lignocelulsicas
Kumar et al. (2006)

31

A celulose formada por subunidades de D-glicose unidas por ligaes

glicosdicas -1,4 e consiste de uma estrutura cristalina organizada. (FENGEL;
WEGENER, 1984). A hemicelulose uma complexa estrutura de carboidratos que
consiste de diferentes pentoses (xilose e arabinose), hexoses (manose, glicose e
galactose) e acares cidos. O componente que predomina na hemicelulose de
madeiras duras e plantas agrcolas a xilana, enquanto a glucomanana
predominante em madeiras porosas. A hemicelulose tem menor massa molar
que a celulose e ramificaes que consistem de diferentes acares, os quais so
facilmente hidrolisveis (FENGEL; WEGENER, 1984). Segundo Laureano-Perez
et al. (2005) a hemicelulose faz a conexo entre as fibras de celulose e lignina,
conferindo maior rigidez ao material.
A lignina, aps a celulose e hemicelulose, o polmero mais abundante na
natureza e est presente por toda a clula. A lignina um heteropolmero amorfo
formado por trs unidades diferentes de fenilpropano (lcool p-cumarlico, lcool
coniferlico e lcool sinaplico) unidas por diferentes tipos de ligaes (FENGEL;
WEGENER, 1984). A principal funo da lignina dar suporte estrutural planta
e proteger contra o ataque de microorganismos e estresse oxidativo.
A relevncia da biomassa lignocelulsica para a produo de etanol
evidente. Os materiais lignocelulsicos so os biopolmeros mais abundantes da
Terra, compreendendo cerca de 50% da biomassa mundial e sua produo anual
foi estimada em 10-50 bilhes de toneladas (CLASSEN et al., 1999). De acordo
com Sanchz e Cardona (2008) muitos materiais lignocelulsicos tm sido
testados para a produo de etanol e incluem resduos agrcolas (bagao de
cana-de-acar e milho, palha de trigo e arroz, casca de cevada, bagao de sorgo
e polpa de oliveira), madeiras, papel reciclado, biomassa herbcea (alfafa e
capim) entre outros. A Tabela 2.1 apresenta uma comparao do potencial de
matrias-primas lignocelulsicas quando comparado a outros recursos de origem
sacarnea e amilcea (KUMAR et al., 2006).
Os principais recursos utilizados para a produo de bioetanol podem ser
divididos em trs categorias: substratos sacarneos solveis como cana-deacar, beterraba, frutas e sorgo; polissacardeos insolveis de natureza amilcea
como milho, trigo, arroz, batata, mandioca, cevada, entre outros; e biomassa
lignocelulsica como madeira, palha e bagao de diferentes materiais (BALAT;
BALAT, 2009). Conforme dados apresentados na Tabela 2.1, a biomassa

32

lignocelulsica representa um recurso promissor para a produo de etanol. A sua

disponibilidade, baixo custo e a ampla variedade de materiais lignocelulsicos
oferece muitas possibilidades para o desenvolvimento de bioindstrias que podem
contribuir para o crescimento do mercado de biocombustvel e para a reduo de
gases poluentes no mundo todo.

2.1.3 Fracionamento de materiais lignocelulsicos

A utilizao de materiais lignocelulsicos para fins biotecnolgicos requer

uma separao seletiva de seus componentes. De acordo com Snchez e
Cardona (2008), a produo de bioetanol a partir da biomassa lignocelulsica
requer o pr-tratamento e a hidrlise da matria-prima. Durante o pr-tratamento,
a matriz de celulose e lignina (ligada por cadeias de hemicelulose) deve ser
rompida visando diminuir a cristalinidade e aumentar a frao amorfa da celulose,
deixando-a mais adequada para posterior hidrlise enzimtica. Alm disso, a
maior parte da hemicelulose se hidrolisa durante este processo e a lignina
liberada ou degradada. Posteriormente, a celulose liberada submetida
hidrlise com enzimas especficas obtendo-se uma soluo de acares
fermentescveis

contendo

principalmente

glicose,

assim

como

pentoses

resultantes da hidrlise inicial da hemicelulose (SNCHEZ; CARDONA, 2005).

Microorganismos so ento empregados para converter os diferentes acares
presentes no material lignocelulsico pr-tratado e hidrolisado. Geralmente
Saccharomyces cerevisiae empregado na fermentao da glicose, enquanto a
xilose usualmente metabolizada por leveduras como Pichia stipitis (P. stipitis).
A Figura 2.4 apresenta um esquema simplificado do fracionamento de
biomassa lignocelulsica visando produo de bioetanol. Processos fsicos,
qumicos, fsico-qumicos e biolgicos tm sido desenvolvidos para promover a
separao ou fracionamento dos materiais lignocelulsicos. Os mtodos fsicos
tm por objetivo reduzir o tamanho da matria-prima e podem ser realizados
atravs da cominuio da mesma, levando reduo da cristalinidade da celulose
para posteriormente facilitar o acesso das enzimas celulases sob a superfcie da
biomassa. A energia necessria para a fragmentao mecnica dos materiais
lignocelulsicos depende do tamanho final da partcula e das caractersticas da
biomassa (GOSH; GHOSE, 2003). Outro mtodo fsico que tem sido testado a

33

pirlise, entretanto, vale ressaltar que a celulose decompe rapidamente quando

submetida a temperaturas superiores a 300C, libera ndo produtos gasosos e
resduos de carvo (SHAFIZADEH; BRADBURY, 1979). Por outro lado, a
decomposio e liberao de produtos volteis so muito menores quando se
utiliza temperaturas mais baixas.

Figura 2.4. Produo de etanol a partir da biomassa lignocelulsica (Adaptado de

RFA, 2008).

Os mtodos fsico-qumicos so considerados mais eficazes que os

mtodos fsicos. A autohidrlise ou exploso a vapor o mtodo fsico-qumico
mais utilizado para o tratamento da biomassa lignocelulsica (McMILLAN, 1994) e
onde a biomassa primeiramente submetida alta presso seguida por uma
rpida reduo da mesma, levando a reaes de autohidrlise e como
consequncia parte da hemicelulose e da lignina so convertidas em oligmeros
solveis (SHAHBAZI et al., 2005). De acordo com Laser et al. (2002), um dos
mais promissores tratamentos fsico-qumicos conhecido como termohidrlise

34

(LHW-Liquid Hot Water) e, quando realizado sob condies ideais (geralmente

210C por 4 minutos) apresenta rendimentos comparv eis aos da hidrlise com
cido diludo, com a vantagem de no utilizar cido. Outro mtodo fsico-qumico
tambm citado na literatura a exploso com amnia, que consiste na exposio
da biomassa a amnia lquida sob altas temperaturas e presso, por um
determinado perodo de tempo, quando ento a presso rapidamente reduzida.
O fundamento deste mtodo o mesmo da exploso a vapor e da exploso com
CO2, entretanto a exploso com CO2 apresenta rendimentos mais baixos (SUN;
CHENG, 2002).
Os pr-tratamentos qumicos utilizam diferentes agentes qumicos como
oznio, cidos, bases, perxido e solventes orgnicos. A ozonlize tem como
agente qumico o oznio e utiliza temperatura e presso ambientes, resultando
principalmente na degradao da lignina, podendo ser utilizada para o tratamento
de palha de trigo, bagao entre outros (SUN; CHENG, 2002). Os cidos
inorgnicos, como H2SO4 e HCl tm sido preferencialmente utilizados para o
tratamento da biomassa lignocelulsica. Os mtodos de pr-tratamento com cido
concentrado possibilitam a hidrlise eficiente da celulose, entretanto so txicos,
corrosivos e necessitam de reatores resistentes corroso (SILVERS; ZACCHI,
1995). Por outro lado, os mtodos que utilizam cido diludo tm sido amplamente
utilizados e podem ser realizados sob duas condies diferentes: altas
temperaturas (> que 160C), favorecendo a hidrlise da celulose (McMILLAN,
1994) e temperaturas mais baixas (< que 160C). A u tilizao de temperaturas
baixas (121C) evita a degradao de hexoses e pent oses em furfural e
hidroximetilfurfural (HMF), respectivamente (SAHA et al., 2005a e b). De acordo
com Mussatto e Roberto (2005b), na hidrlise da biomassa lignocelulsica com
cido diludo, o cido libera os prtons que rompem as ligaes ter entre os
acares existentes na cadeia polimrica, formada por celulose e hemicelulose.
Segundo Palmqzvist e Hahn-Hgerdal (2000), dentre os mtodos descritos na
literatura, a hidrlise com cido diludo o mtodo mais utilizado para a
separao da hemicelulose, pois devido sua estrutura ramificada e grau de
cristalinidade inferior ao da celulose, as ligaes glicosdicas entre os monmeros
de D-xilose so menos estveis do que as ligaes entre os monmeros de Dglicose na celulose. Desse modo, as pentoses so mais facilmente extradas da
hemicelulose atravs desta tcnica, onde geralmente utiliza-se cidos como HCl

35

ou H2SO4 sob temperaturas de 120C a 200C. Mussatto e Robe rto (2005a)

utilizando o bagao de malte proveniente da indstria cervejeira, estudaram as
condies de hidrlise com cido diludo variando a concentrao de cido (8-12
g/g), matria seca (100-140 mg/g) e tempo de reao (17-37 min), e observaram
que em 17 minutos, 100 mg de H2SO4/g de matria seca e sob temperatura de
120C houve uma eficiente recuperao de acares ( 92,7%).
Outro tipo de pr-tratamento qumico a hidrlise alcalina, que utiliza
bases diludas (NaOH) para tratar a biomassa lignocelulsica e tem por objetivo
aumentar a superfcie interna da mesma, diminuir a polimerizao e a
cristalinidade da celulose e destruir as ligaes entre a lignina e outros polmeros.
A eficcia deste mtodo depende do contedo de lignina presente na biomassa
(SUN; CHENG, 2002).
A deslignificao oxidativa um mtodo que resulta na biodegradao da
lignina catalisada pela enzima peroxidase na presena de perxido de hidrognio
(H2O2). O pr-tratamento do bagao de cana-de-acar utilizando esta tcnica
resultou na solubilizao de cerca de 50% da lignina e de quase toda a
hemicelulose, utilizando-se 2% de H2O2, a 30C e no perodo de 8 horas (AZZAM,
1989). Alm disso, a suscetibilidade da biomassa hidrlise enzimtica aumentou
consideravelmente.
O processo conhecido como organosolv utiliza uma mistura de solvente
orgnico ou aquoso (metanol, etanol, acetona, entre outros) com cido inorgnico
(comumente H2SO4 ou HCl) como catalisador e, usado para quebrar ligaes
internas da lignina e hemicelulose (LYND et al., 1999).
De acordo com Schez e Cardona (2008), os tratamentos biolgicos
requerem baixa energia e condies amenas, entretanto a maioria dos processos
utilizados apresenta uma taxa de hidrlise muito baixa. O pr-tratamento utiliza
fungos produtores de enzimas que degradam a lignina da biomassa, como
Pleurotus ostreatus. Khyami et al. (2005) relataram a utilizao uma cultura de
clulas de Pseudomonas putida e Streptomyces setonii para destoxificar uma
soluo diluda de palha de milho.
Os principais mtodos de pr-tratamento esto sumarizados na Tabela 2.2.

36
Tabela 2.2. Principais mtodos utilizados para pr-tratamento da biomassa lignocelulsica.
Mtodo

Procedimento

Observaes

Exemplo de
biomassa

Referncias

Triturao e
moagem.
Moinho
vibratrio ou de
facas (0,2-6,0
mm)

Reduz o tamanho das partculas e a

cristalinidade da biomassa. A
eficincia depende do tamanho final
da partcula e das caractersticas da
biomassa.

Madeira compacta,
palha, bagao de cana
de acar, alfafa

Sun; Cheng (2002);

Cadoche; Lpez (1989)

T>300C ou a
vcuo (400 C,
p=1mm Hg, 20
min)

Formao de produtos volteis e

carvo. Os resduos da pirlise
podem ser submetidos hidrlise
cida branda (1N H2SO4, 2,5h,
T=97C) para produzir 80-85% de
acares (>50% de glicose).

Madeira porosa,
resduos de algodo,
palha de milho

Khiyami et al. (2005);

Sun; Cheng (2002)

Vapor saturado
(160-290 C) e
presso de 0,694,85 MPa por
vrios seg ou
min.

Altas concentraes de slidos.

Recuperao de 80-100% da
hemicelulose, com destruio de parte
da xilose obtida (35-55%). Formao
de inibidores. Menor gasto energtico
e reduo das fibras quando
comparado ao tratamento mecnico.

Pr-tratamentos fsicos

Cominuio mecnica

Pirlise

Pr-tratamentos fsicoqumicos

Exploso a vapor

Bagao, palha de
arroz, palha de trigo,
cevada

Persson et al. (2009);

Duarte et al. (2008);
Carvalheiro et al. (2004);
Sun; Cheng (2002)

37
Tabela 2.2. Principais mtodos utilizados para pr-tratamento da biomassa lignocelulsica.

Procedimento

Observaes

Exemplo de
biomassa

Referncias

Termohidrlise

gua quente
pressurizada
(170-230C) por
1-46 min

Concentrao de slido <20%.

Ocorre certa despolimerizao da
celulose. Recuperao de 80-100%
da hemicelulose com >50% de
oligmeros. Solubilizao parcial da
lignina (20-50%). Formao de
inibidores.

Bagao de cana de
acar

Lynd (1996); Laser et

al. (2002)

Exploso com amnia

Relao
amnia:matria
seca de 12:1(Kg/Kg),
90C, 30 min

No muito eficiente para biomassa

com alto teor de lignina (converso
da celulose <50%). Recuperao de
at 60% de hemicelulose (>90% de
oligmeros). Formao de
inibidores.

Palha de trigo e
cevada, casca de
arroz, resduos slidos
urbanos, alfafa,
bagao

Ko et al. (2009); Sun;

Cheng (2002)

Exploso com CO2

Relao CO2:
fibra de
4:1(Kg/Kg);
p=5,62MPa

Mtodo

Converso da glicose durante a

hidrlise da celulose pode ser >75%.
Baixa formao de inibidores.

Bagao de cana de
acar, alfafa, papel
reciclado

Sun; Cheng (2002)

(Continuao)

38
Tabela 2.2. Principais mtodos utilizados para pr-tratamento da biomassa lignocelulsica.
Procedimento

Observaes

Exemplos de
biomassa

Referncias

Ozonlise

Oznio, temperatura e
presso ambientes

Degradao da lignina.
Converso da celulose durante a
hidrlise pode ser >57%. Baixa
formao de inibidores.

Palha de trigo, bagao,

Pinus, palha de
algodo

Sun; Cheng (2002)

Hidrlise com cido

concentrado

H2SO4 10-30%, 170190C, proporo de

1:1,6 slido/lquido

A recuperao do cido
necessria. Eficiente para a
hidrlise da celulose. O cido
concentrado txico, perigoso e
corrosivo.

Serragem de lamo,
bagao de cana de
acar

Cuzens; Miller (1997);

Teixeira et al. (1999)

Hidrlise com cido

diludo

H2SO4, HCl ou HNO3

0,75-5%, p~1 MPa,
baixas concentraes
de slidos (5-10%),
160-200C; processo
em batelada para altas
concentraes de
slidos (10-40%),120160C

Serragem, bagao,
palhada de milho,
centeio, palha de trigo,
bagao de malte, palha
de arroz

Xiros; Christakopoulos
(2009); Purwadi;
Taherzadeh (2008);
White; Yohannan; Walker
(2008); Mussatto;
Roberto (2005 a e b);
Mussatto; Roberto
(2004); Sun; Cheng
(2002)

Mtodo
Pr-tratamentos
qumicos

Recuperao de 80%-100% da
hemicelulose, com solubilizao
de 75-90% de xilose. Altas
temperaturas favorecem a
posterior hidrlise da celulose. A
lignina parcialmente
solubilizada.

(Continuao)

39
Tabela 2.2. Principais mtodos utilizados para pr-tratamento da biomassa lignocelulsica.
Mtodo

Procedimento

Observaes

Exemplos de
Biomassa

Referncias

Hidrlise alcalina

NaOH diludo, 24 h,
60C; Ca(OH) 2, 4 h,
120C; pode ser
complementada pela
adio de H2O2 (0,52,15 % vol), 35C

Recuperao da hemicelulose
>50% e solubilizao de 6075% de xilose. Baixa formao
de inibidores. 24-55% da
lignina removida de madeiras
compactas e quase nenhum
efeito em madeiras porosas

Madeira compacta,
palhada de milho, palha
com baixo contedo de
lignina (10-18%),
bagao de cana de
acar

Saha; Cotta (2009);

Fukuda et al. (2009);
Mussatto; Roberto
(2007), Sun; Cheng
(2002)

Solventes orgnicos

Solventes orgnicos
(etanol, metanol,
acetona, etilenoglicol,
trietilenoglicol) ou sua
mistura com 1% de
H2SO4 ou HCl; 185198C, 30-60 min,
pH=2,0-3,4

Recuperao quase completa

da lignina e da hemicelulose
com altos rendimentos de
xilose. Necessidade de
remoo do solvente do
sistema.

Serragem de madeira
compacta

Fungos de
decomposio branca,
marrom e branda (soft
rot); decomposio das
fraes orgnicas

As enzimas produzidas
degradam a celulose,
hemicelulose e/ou lignina.
Processo muito lento.

Palha de trigo, palha de

milho

Lynd et al. (2002); Sun;

Cheng (2002)

Pr-tratamentos
biolgicos

Utilizao de fungos

Adaptado de Snchez e Cardona, (2008).

Sun; Cheng (2002)

(final)

40

2.2 Bagao de Malte: caractersticas e principais aplicaes

O bagao de malte (BM) uma biomassa rica em fibras e protenas e pode

ser considerada uma grande fonte de acares para a produo de etanol. De
acordo com White, Yohannan e Walker (2008) o processo de bioconverso do BM
representa uma valiosa contribuio para a produo de biocombustveis de
segunda gerao. Ao contrrio dos biocombustveis de primeira gerao, ou seja,
aqueles que so produzidos a partir de matrias vegetais oriundas da agricultura
(milho, trigo, girassol entre outros), os biocombustveis de segunda gerao so
produzidos a partir de fibras vegetais como a celulose e a hemicelulose presentes
na madeira e outras partes no comestveis dos vegetais, e desse modo no
entram em concorrncia com culturas alimentcias.
O BM consiste basicamente da casca do gro de cevada obtida aps a
elaborao do mosto cervejeiro (Figura 2.5).

Figura 2.5. Representao esquemtica da produo de bagao de malte

(MUSSATTO et al., 2006).

41

Aps o processo de maltagem (obteno do malte a partir da cevada), a

primeira etapa da produo de cerveja consiste na moagem do malte, visando
facilitar sua dissoluo na gua pela reduo de tamanho, e consequentemente
aumento da superfcie de contato. Posteriormente realizado o processo de
mosturao, que consiste na solubilizao do malte modo gua sob diferentes
temperaturas, para que possam ocorrer processos enzimticos, como a
converso do amido em acares fermentveis (maltose e maltotriose) e nofermentveis (dextrinas). Ao final do processo, realiza-se uma filtrao, onde a
frao lquida, denominada mosto, utilizada como substrato para o crescimento
de leveduras, visando produo de cerveja. A frao slida consiste no bagao
de malte produzido a partir da cevada. O bagao constitudo essencialmente
pela casca do malte e atua como coadjuvante na filtrao com peneiras, sendo a
parte do resduo que no solvel pelas enzimas e que apresenta em grande
parte de sua constituio, protenas e fibras (HOUGH, 1996). A Figura 2.5
apresenta um esquema da produo do bagao de malte, adaptada de Mussatto
et al. (2006).
A composio qumica do bagao de malte pode variar de acordo com o
tipo de cevada utilizada e o tempo de colheita, condies de malteao e
mosturao a que esta foi submetida e o tipo de adjuntos como arroz e milho,
adicionados ao processo cervejeiro (HUIGE, 1994; SANTOS et al., 2003). A
Tabela 2.3 mostra a composio qumica do bagao de malte.

Tabela 2.3. Composio qumica (% peso seco) do bagao de malte (BM).

Componentes

BM1

BM2

BM3

Celulose

25,4

16,8

21,2

Arabinoxilana

21,8

28,4

29,6

Lignina

11,9

27,8

22,2

Protena

24,0

15,2

24,6

Cinzas

2,4

4,6

1,1

Lipdeos

10,6

nd

nd

Kanauchi et al. (2001); 2 Mussatto & Roberto, (2005a); 3 Duarte et al. (2008)

42

De acordo com Huige (1994), minerais e vitaminas so usualmente

encontrados no bagao de malte. Os minerais aparecem geralmente em
concentraes abaixo de 0,5% e incluem alumnio, brio, clcio, cromo, cobalto,
ferro, magnsio, mangans, fsforo, potssio, selnio, slica, sdio, cobre, enxofre
e zinco. Entre as vitaminas esto a biotina, cido flico, niacina, cido
pantotnico, riboflavina, tiamina e piridoxina.
O bagao de malte considerado o subproduto mais importante
proveniente da indstria cervejeira (WHITE; YOHANNAN; WALKER, 2008).
Segundo dados do Sindicato Nacional da Indstria da Cerveja, em 2010 o Brasil
alcanou o terceiro lugar no ranking mundial de produo de cerveja, com 12,6
bilhes de litros por ano, estando atrs em volume apenas da China (40,0 bilhes
de litros/ano) e Estados Unidos (35,0 bilhes de litros/ano). Considerando que so
gerados 20 kg de bagao de malte a cada 100 litros de cerveja produzida
(REINOLD, 1997), possvel estimar que em 2010 foram produzidos cerca de 2,0
milhes de toneladas de bagao de malte no Brasil.
O uso do bagao de malte tem sido limitado principalmente alimentao
animal devido ao seu elevado teor de protenas e fibras (REINOLD, 1997). Devido
ao seu relativo baixo custo e alto valor nutritivo, a adio do bagao de malte na
alimentao humana (pes, biscoitos e petiscos) tem sido bastante estudada
(SANTOS et al., 2003; BARTOLOM et al., 2002; ZTRK et al., 2002). Apesar
da ampla possibilidade de aplicaes, o aproveitamento do bagao de malte
ainda muito limitado, e desse modo, h um grande interesse no
desenvolvimento de novas tcnicas de aproveitamento do bagao de malte, visto
que este produzido em grande quantidade o ano todo.
Alguns autores tm relatado o emprego do bagao de malte em processos
biotecnolgicos como substrato para o cultivo de micro-organismos ou para a
produo de enzimas. Wang et al. (2001) encontraram uma boa eficincia
biolgica e valor nutricional do fungo Pleurotus ostreatus quando cultivado em
bagao de malte. Segundo estes autores, o bagao de malte um dos melhores
substratos para cultivo desta espcie de fungo e isto se deve tanto ao elevado
teor de protenas e umidade, como s suas propriedades fsicas incluindo
tamanho da partcula, densidade, porosidade e capacidade de reteno de gua.
Brnyink et al. (2001, 2002) e Kopsahelis, Kanellaki e Bekatorou (2007) utilizaram
o bagao de malte como suporte para a imobilizao das leveduras no processo

43

de produo de cerveja e consideraram o bagao de malte uma alternativa

promissora para imobilizao de leveduras quando comparado a outros materiais
normalmente empregados como suporte, apresentando ainda vantagens sob o
ponto de vista econmico e simplicidade de preparao.
O emprego do bagao de malte visando a obteno de compostos de
interesse comercial foi relatado por Carvalheiro et al. (2004). Esses autores
obtiveram uma mistura de oligossacardeos com diferentes pesos moleculares
aps submeter o bagao de malte ao processo de autohidrlise sob temperaturas
de 150, 170 e 190C.
De acordo com Xiros e Christakopoulos (2009) a presena de um sistema
enzimtico lignocelulsico eficiente essencial para a bioconverso da biomassa
lignocelulsica. Esses autores obtiveram uma produo eficiente de enzimas
celulolticas e xilanolticas pelo fungo Fusarium oxysporum em meio cultivo
submerso utilizando como substrato propores iguais de bagao de malte e
sabugo de milho.
A utilizao do bagao de malte como fonte de carbono em processos de
bioconverso tambm tem sido relatada na literatura. Mussatto et al. (2007),
visando a produo de cido ltico por Lactobacillus delbrueckii, utilizou
hidrolisado celulsico de bagao de malte sem adio de nutrientes e obteve um
fator de converso de substrato em etanol de 0,73 g/g. A utilizao da frao
hemicelulsica (rica em xilose) do bagao de malte para a produo de xilitol por
Candida guilliermondii foi avaliada por Mussatto et al. (2005). Esses autores
compararam a produo de xilitol em meio semi-sinttico (sem compostos txicos
e com as mesmas concentraes de acares presentes no hidrolisado), em
hidrolisado diludo e em hidrolisado concentrado, observando que o hidrolisado de
bagao de malte apresenta grande potencial como substrato para a produo de
xilitol, visto que foram obtidos altos valores de YP/S e QP, 0,65 g/g e 0,38 g/L.h,
respectivamente.
Como matria-prima para a produo de etanol, o bagao de malte tem
sido relativamente pouco estudado. Segundo White, Yohannan e Walker (2008), o
bagao de malte uma biomassa lignocelulsica promissora para a produo de
bioetanol. O hidrolisado celulsico do bagao de malte foi utilizado por estes
autores como meio de fermentao, sob condies no otimizadas, por P. stipitis
e Kluyveromyces marxianus e apresentou um rendimento de 0,32 e 0,23 g/g,

44

respectivamente. A produo de etanol a partir do hidrolisado celulsico de

bagao de malte pelo fungo Fusarium oxysporum foi avaliada utilizando-se o
hidrolisado submetido hidrlise alcalina resultando em 65 g de etanol/g de
matria seca sob condies microaerbias (XIROS et al., 2008). Esses autores
concluram que o baixo custo desta biomassa juntamente com o alto contedo de
pentose apresentado (82,5% de xilose no hidrolisado pr-tratado) torna o bagao
de malte uma matria-prima promissora para a produo de bioetanol,
especialmente quando so empregados microorganismos fermentadores de
xilose.

2.3 Metabolismo de pentose em leveduras

2.3.1

Metabolismo de xilose

Diversos estudos vm sendo conduzidos buscando melhorar o processo de

produo biotecnolgica de etanol a partir de pentoses, pela compreenso e
otimizao das condies empregadas e pelos diferentes micro-organismos
utilizados. A transformao de acares em etanol e CO2 envolve vrias reaes
de forma ordenada, cada qual catalisada por uma enzima especfica, as quais
ocorrem no citoplasma celular e, portanto nesse local onde a fermentao
alcolica se processa. A fermentao um metabolismo anaerbio e os
substratos usados para este processo, tanto podem ser endgenos (constituintes
da levedura, como o glicognio) como exgenos (sacarose, glicose, xilose, entre
outros), os quais so fornecidos levedura atravs do meio de cultivo.
Ao metabolizar o acar anaerobicamente, a levedura visa somente
gerao de energia sob a forma de ATP (adenosina trifosfato) para empreg-lo
em processos como absoro, excreo e biossnteses, os quais so essenciais
ao crescimento e multiplicao celular. O etanol e o CO2 resultantes constituem
produtos de excreo sem utilidade para a clula. No caminho para a produo
de ATP, surgem algumas rotas metablicas destinadas formao de materiais
necessrios formao de biomassa e sobrevivncia e adaptao da clula.
Dessa forma, juntamente com a produo de etanol e CO2, o metabolismo
anaerbio permite a formao e excreo de glicerol, cidos orgnicos, lcoois

45

superiores, acetaldedo, entre outros. Vale ressaltar que simultaneamente ocorre

o crescimento das leveduras, isto , formao de biomassa.
Na maioria das bactrias, a converso de D-xilose em D-xilulose ocorre por
isomerizao, utilizando-se a xilose isomerase. Nas leveduras e na maior parte
dos fungos, a converso ocorre atravs de duas oxidoredutases, a xilose redutase
e xilitol desidrogenase (AGBOGBO; COWARD-KELLY, 2008).
A Figura 2.6 mostra um esquema simplificado do metabolismo de xilose e
glicose em leveduras fermentadoras de xilose.

Figura 2.6. Metabolismo de xilose e glicose em leveduras fermentadoras de xilose

(Adaptada de Hahn-Hngerdal et al., 1994).

46

A eficincia do processo fermentativo essencial para a bioconverso de

acares a etanol. De acordo com Vleet e Jeffries (2009) a maior parte das
hexoses facilmente fosforilada assim que entra na clula, enquanto que os
acares hemicelulsicos devem passar por vrias etapas antes da fosforilao.
Entretanto, a xilose a maior constituinte de grande parte dos materiais
lignocelulsicos presentes nas plantas, e sua assimilao em processos
fermentativos importante para a bioconverso da biomassa lignocelulsica
(JEFFRIES et al., 2007).

2.3.2 Microorganismos fermentadores de pentoses

Ao contrrio da fermentao de pentoses, a fermentao da glicose um
processo completamente estabelecido. Historicamente, Saccharomyces cerevisae
o microorganismo mais comumente usado para produo de etanol (LIN;
TANAKA, 2006). Atravs de seu emprego intensivo em fermentao industrial, j
passou por um processo de seleo natural, apresentando os melhores
desempenhos em converso de glicose a etanol, produtividade e tolerncia
alcolica.
A fermentao de pentoses um processo que procede mais lentamente
que o da glicose e pode ser realizado por bactrias, leveduras e fungos, alm
disso. Alm disso, a converso de pentoses em etanol fundamental para se
atingir a produo eficiente de biocombustveis, a partir de materiais
lignocelulsicos. Segundo Hahn-Hgerdal et al. (1991) o metabolismo das
pentoses exige a presena de um nvel mnimo de oxignio, que deve ser
rigorosamente controlado, desse modo este um fator que deve ser considerado
durante os processos fermentativos.
Vrios estudos vm sendo realizados buscando alternativas para a
produo de etanol a partir de pentoses. Uma alternativa para a produo de
etanol a partir destes carboidratos tem sido o uso de micro-organismos
recombinantes e para esta finalidade so feitas modificaes no metabolismo de
micro-organismos naturalmente produtores de etanol, como Saccharomyces
cerevisiae e Zymomonas mobilis, possibilitando a estas leveduras, a fermentao
de xilose e arabinose. Outro mecanismo visa introduzir genes responsveis pela
produo de etanol em micro-organismos com capacidade de metabolizar

47

pentoses como a Escherichia coli e Klebisiella oxytoca (DUMSDAY et al., 1997;

SAHA,

2003).

Entretanto,

apesar

da

eficincia

dos

micro-organismos

recombinantes, seu uso em processos industriais no vivel, visto que sua

estabilidade insuficiente e muitas vezes necessitam de meios de cultura
complexos, levando ao encarecimento do processo (DUMSDAY et al., 1997).
De acordo com Hahn-Hgerdal et al. (1991), os maiores rendimentos e
produtividade em etanol so obtidos pelas leveduras. Vrias espcies, incluindo
Pachysolen tannophilus, Candida shehatae e P. stipitis tm sido consideradas as
mais eficientes para a converso de xilose em etanol (SANCHZ; CARDONA,
2008). Segundo Prior et al. (1989) P. stipitis e Candida shehatae so capazes de
converter xilose em etanol, com maior eficincia do que outras leveduras
naturalmente fermentadores de xilose. Roberto et al., (1991) comparou a
produo de etanol por P. stipitis, Candida utilis, Candida tropicalis e Pachysolen
tannophilus a partir do hidrolisado hemicelulsico do bagao de cana de acar.
De acordo com estes autores, P. stipitis apresentou a melhor eficincia de
converso xilose em etanol, cerca de 0,38 g/g.
Diversos trabalhos tm relatado P. stipitis como a levedura mais
promissora para converso de xilose a etanol. Esta levedura exibe um grande
potencial para aplicao industrial devido sua capacidade de fermentar uma
ampla variedade de acares, incluindo celobiose. Alm disso, no necessita da
adio de vitaminas ao meio de fermentao e apresenta altos rendimentos em
etanol a partir da xilose (NIGAM, 2001; AGBOGBO et al., 2006).

2.3.3 Pichia stipitis

Segundo Pignal (1967), P. stipitis uma levedura predominantemente
haplide, relacionada Candida shehatae e a outras espcies de leveduras do
Phylum Ascomycota (KURTZMAN, 1990; VAUGHAN, 1984). Diferente de
Saccharomyces cerevisiae que capaz de produzir etanol em meios com baixas
concentraes de acares, sob condies aerbias (Efeito Crabtree), P. stipitis
uma levedura do trato respiratrio que produz etanol em resposta limitao de
oxignio (KLINNER et al., 2005; PASSOTH et al., 2003). Entretanto, quando em
presena de altas taxas de oxignio, a produo de massa celular favorecida.

48

Segundo Agbogbo e Coward-Kelly (2008), P. stipitis uma das poucas

espcies de leveduras capazes de fermentar xilose a etanol sob condies
anaerbias. Isso pode ser explicado pela presena de dois mecanismos que
visam diminuir a produo de xilitol, visto que este um subproduto gerado
durante a converso de xilose e reduz o rendimento final de etanol. O primeiro
mecanismo consiste na utilizao de ambos cofatores (NADH e NADPH) pela
enzima xilose redutase, caracterstica tambm presente em outros microorganismos como Pachysolen tannophilus (VERDUYN et al., 1985). O benefcio
da utilizao do NADH pela xilose redutase o equilbrio total de cofatores e,
portanto, ocorre baixa ou nenhuma produo de xilitol. A Figura 2.7 mostra as
vias de fermentao de xilose para a maioria das bactrias (2.7a), para a maioria
dos fungos e leveduras (2.7b) e para P. stipitis (2.7c).
Estudos de cintica mostram que NADPH a coenzima preferida e sua
afinidade cerca de duas vezes maior que a afinidade pelo NADH (VERDUYN et
al., 1985). Sob condies anaerbias, a fermentao de xilose por Pichia stipitis
deve ocorrer com a utilizao de NADH pela enzima xilose redutase para que
haja o equilbrio dos cofatores. A capacidade de P. stipitis e Pachysolen
tannophilus de utilizar o NADH durante a converso da xilose em etanol faz com
que essas espcies sejam capazes de produzir menos xilitol em comparao a
outras leveduras.

Figura 2.7. Vias de fermentao de xilose (Agbogbo e Coward-Kelly, 2008)

49

Alguns estudos mostram que P. stipitis produz menos xilitol em relao

Pachysolen tannophilus, embora as duas leveduras sejam capazes de utilizar
NADH como cofator da xilose redutase (DEBUS et al., 1983) e isto pode ser
explicado pela presena de um outro mecanismo que est presente somente em
P. stipitis. Esta levedura possui um sistema respiratrio oxidativo complexo na
mitocndria que contm cadeias transportadoras de eltrons via citocromo e nocitocromo. A cadeia transportadora de eltrons no-citocromo denominada
SHAM (salicyl hydroxinamic acid) e gera um fator redox para superar o
desequilbrio dos cofatores. Desse modo, o uso de cofatores especficos
juntamente com o equilbrio redox resulta em baixa ou nenhuma produo de
xilitol.
Recentemente, a sequncia genmica de P. stipitis NRRL Y-11545 foi
publicada e esse sequenciamento mostrou a presena de genes que codificam as
enzimas xylanase, endo-1,4--glucanase, exo-1,3--glucosidase, -manosidase e
-glucosidase (JEFFRIES et al., 2007). A presena desses genes na levedura
favorece a sacarificao e a fermentao simultnea de celulose e hemicelulose.
Desse modo, o mecanismo e a regulao do metabolismo de xilose desta espcie
tm sido bem caracterizados e seus genes tambm tm sido usados para
melhorar o metabolismo de xilose em espcies como Saccharomyces cerevisiae
(JEFFRIES et al., 2007).
Segundo Agbogbo et al. (2006), P. stipitis apresenta grande potencial para
a fermentao de biomassa lignocelulsica, entretanto deve-se considerar vrios
fatores como tipo de substrato e concentraes de acares, pH e aerao.
Esses autores avaliaram a produo de etanol empregando diferentes
concentraes de acares, variando a relao glicose/xilose em meio sinttico e
concluram que maiores valores de YP/S (0,45 g/g) foram obtidos na presena de
uma concentrao de xilose maior (cerca de 75%) ou quando este foi o nico
acar presente.
Vrias linhagens de P. stipitis tm sido usadas em processos fermentativos
empregando hidrolisados de diferentes materiais lignocelulsicos para a produo
de etanol, apresentando resultados promissores (Tabela 2.4).

50

Tabela 2.4. Comparao dos ensaios fermentativos realizados em hidrolisados

lignocelulsicos, empregando diferentes linhagens da levedura Pichia stipitis, visando
produo de etanol.

Biomassa

Linhagem
de P.
stipitis

Bagao de
cana-deacar

NRRL Y7124

xil: 99,0

NaOH, KOH
ou CaO

5,0

3,8

Roberto et
al. (1991)

Palha de
trigo

NRRL Y7124

gli: 1,7

overliming

6,5

0,41

Nigam
(2001)

Gro de
girassol

NRRL Y7124

0,38

Telli-Okur;
EkenSaraoglu
(2008)

0,32

White;
Yohannan;
Walker,
(2008)

Acar
(g/L)

total: 37,0

Destoxificao

overliming

Bagao de
malte

NCYC 1540

total: 56,0

NaOH

Palha de
arroz

BCRC
21777

gli: 3,5-6,4

overliming

BCRC
21777

xil: 17,526,4

BCRC
21777

gli: 3,5-6,4

BCRC
21777

xil: 17,526,4

Palha de
arroz

Jacinto de
gua
(Eichornia
crassipes)

NCIM 3947

pH

6,0

5,0-6,0

5,0

YP/S
(g/g)

Referncia

0,37
Huang et al.
(2009)

0,45
no utilizado

5,0

0,4
0,44

overliming

6,0

0,42

Huang et al.
(2009)

Kumar et al.
(2009)

(Adaptado de Huang et al., 2009); overliming: utilizao de Ca(OH)2

2.4 Fatores nutricionais e ambientais que interferem na bioconverso

Vrios fatores podem influenciar a bioconverso de acares em etanol por

P. stipitis como temperatura, pH, oxigenao, adio de nutrientes e concentrao
inicial de substrato e de inculo. Desse modo, diversos estudos vm sendo
conduzidos visando melhorar a converso de xilose em etanol por esta levedura.
De acordo com Pham et al. (1998), o estabelecimento das condies timas do
meio de cultura uma importante maneira de aumentar a produtividade e

51

melhorar a eficincia de um bioprocesso. A suplementao do meio de

fermentao um importante recurso utilizado no somente para suprir as
necessidades nutricionais do microrganismo, como tambm para promover ou
aumentar a tolerncia deste aos compostos inibidores presentes em hidrolisados.
Sliniger et al. (2009) avaliando a adio de nutrientes ao meio de fermentao
semissinttico,

observaram

que

adio

de

aminocidos

aumentou

significantemente a tolerncia da levedura P. stipitis NRRL Y-7124 ao etanol.

Alm disso, quando a fonte de carbono utilizada foi a xilose, ocorreu um aumento
da resistncia da levedura exposio ao furfural e hidroximetilfurfural. A adio
de aminocidos ao meio de fermentao pode funcionar no somente como fonte
de nitrognio para a biossntese e manuteno celular, mas tambm como agente
redox, promovendo o equilbrio do potencial de oxido-reduo quando sob
condies de restrio de oxignio (MAURICIO et al., 2001). Por outro lado, a
composio mineral parecer ter um efeito pequeno sobre a resistncia de P.
stipitis aos compostos inibidores, quando comparado adio de aminocidos,
conforme obsrvado por Slininger et al., (2006), exceto quando adicionou-se
concentraes excessivas de sulfato de magnsio, durante a fase estacionria de
crescimento. Esses autores observaram que a suplementao do meio com 150
mg/L resultou em maior resistncia ao etanol e aos compostos inibidores. Alm
disso, a adio de uma fonte de nitrognio, como a uria, otimizou a tolerncia da
levedura a estes compostos.
Silva et al. (2011) avaliou a influncia de uria e extrato de levedura na
fermentao de xilose pela levedura P. stipitis NRRL Y-7124. Estes autores
observaram que diferentes fontes de nitrognio podem influenciar de maneiras
diferentes o mesmo processo, visto que quando somente uria foi empregada
como nica fonte de nitrognio, a levedura consumiu pobremente a xilose, no
produzindo etanol. Contudo, quando a nica fonte de nitrognio foi o extrato de
levedura, foram obtidos valores de 0,33 e 0,89 g/L.h para QP e QS,
respectivamente, e ainda, quando os dois nutrientes foram adicionados, estes
valores foram elevados para 0,50 e 1,38 g/L.h, respectivamente.
Outro fator que deve ser considerado durante os processos de fermentao
para obteno de etanol a oxigenao. Diversos trabalhos vm sendo
realizados com o objetivo de se estabelecer um nvel timo de oxigenao
visando uma mxima produo de etanol a partir da xilose. Segundo Hahn-

52

Hgerdal et al. (1991), leveduras naturalmente fermentadoras de xilose como P.

stipitis requerem um nvel reduzido de oxigenao, mas extremamente controlado
para que se obtenha uma produo de etanol eficiente. De acordo com du-Prezz
(1994) a aerao um fator que exerce grande influncia sobre a fermentao de
xilose por leveduras, visto que determina a diviso do fluxo de carbono da xilose
entre a formao de biomassa e produto. Segundo Nigam (2001) a utilizao de
nveis insuficientes de aerao na produo de etanol por P. stipitis NRRL Y-7124
diminuem a velocidade de consumo de xilose, enquanto que nveis excessivos de
aerao reduzem o rendimento devido oxidao do produto ou ao crescimento
celular elevado. Assim, a aerao adequada consiste num fator importante para
atingir elevados valores de converso. Roberto et al. (1994) avaliaram o efeito da
taxa de aerao na fermentao de xilose por P. stipitis CBS 5773 e observaram
que a condio com maior aerao resultou na maior converso de clulas (YX/S =
0,50 g/g) e menor converso em etanol (YP/S = 0,13 g/g). Estes autores
observaram ainda que a maior converso e produtividade volumtrica em etanol
ocorreram em uma condio intermediria.
O pH um fator importante, capaz de exercer grande influncia sobre o
processo de bioconverso. du-Preez (1994) reportou que o rendimento em etanol
pela levedura P. stipitis CBS 7126 foi fortemente afetado por variaes de pH
entre 2,5 e 6,5, sendo o pH timo entre 4,0 e 5,5. Slininger e Bothast (1990)
relataram que para a fermentao de xilose por P. stipitis NRRL Y-7124 a faixa de
pH timo encontra-se entre 4 e 7, no sendo observada grande influncia do pH
sobre os parmetros fermentativos, dentro da faixa de variao estudada.
Adicionalmente, os autores observaram que o valor de pH 4,5 o mais
recomendvel, pois minimiza a possibilidade de contaminao. Entretanto, por
estar prximo do limite inferior da faixa tima de fermentao, seria recomendvel
o uso de um controle automtico de pH. Resultados semelhantes aos relatados
por estes autores foram descritos por Roberto et al., (1994), onde a variao de
pH entre 4,0 e 6,0 exerceu pouca influncia sobre os parmetros fermentativos
avaliados.
Valores de pH mais elevados tambm podem ser empregados visando
aliviar o efeito txico de compostos presentes em hidrolisados. van Zyl et al.
(1991) estudando a fermentao do hidrolisado de bagao de cana-de-acar, por
P. stipitis, verificaram que valores a partir de 6,5 podem ser utilizados para

53

diminuir a toxicidade do cido actico, considerado um dos mais importantes

inibores da fermentao por esta levedura. importante ressaltar que pode haver
variaes entre os valores ou faixas de pH ideal, devido aos diferentes meios de
fermentao, condies de cultivo ou ainda diferentes linhagens de microorganismos.
A temperatura consiste em um dos mais importantes fatores que podem
interferir na atividade dos micro-organismos. Leveduras como as do gnero Pichia
sp e Candida sp utilizam temperaturas entre 30 e 32C, para ass imilao de
pentoses, entretanto este fator pode variar de acordo com a cepa utilizada, tipo de
substrato e concentrao celular (dU-PREZZ, 1994). Vrios autores estudaram a
influncia da temperatura sobre o processo de converso, sendo que a mxima
produtividade e concentrao de etanol foram alcanadas por P. stipitis sob
temperatura de 23 a 30C (SLININGER; BOTHAST, 1990) .
Outro importante aspecto a ser considerado no processo de produo de
etanol o efeito da concentrao inicial de substrato. Roberto et al. (1991),
estudando a produo de etanol a partir do hidrolisado hemicelulsico de bagao
de cana-de-acar pela levedura P. stipitis CBS 5773, observaram que a
produo de etanol no foi afetada quando utilizou-se uma concentrao inicial de
xilose de 20 a 99 g/L (YP/S = 0,38 g/g). Entretanto, quando a concentrao
utilizada foi prxima de 145 g/L, observaram uma reduo da converso em
etanol para YP/S = 0,27 g/g, mostrando que a partir de concentraes muito
elevadas deste acar pode ocorrer reduo da concentrao final de produto,
bem como do fator de converso do acar a etanol. du-Prezz et al. (1986)
obtiveram resultados semelhantes, onde a mxima produtividade em etanol para
P. stipitis CBS 7126 foi de 0,85 g/L, a partir de 50 g/L de xilose. Alm disso,
quando a concentrao inicial de xilose foi de 100 g/L, os autores observaram
uma queda de 50% na produtividade em etanol.
Recentemente, Silva et al. (2011) estudando a fermentao de diferentes
concentraes iniciais de xilose em meio semissinttico (32,0 a 88,0 g/L) por P.
stipitis NRRL Y-7124, observaram que os melhores resultados foram alcanados
a partir de 47,0 g/L de xilose (YP/S = 0,47 g/g e QP = 0,34 g/L.h). Por outro lado, a
partir de concentraes superiores (66,0 e 88,0 g/L), a levedura no foi capaz de
produzir etanol. Estudo similar foi realizado por Ferreira et al. (2011) em
hidrolisado de bagao de cana-de-acar suplementado com extrato de levedura,

54

avaliando-se a produo de etanol por Scheffersomyces stipitis (P. stipitis) UFMGIMH 43.2. Os melhores resultados (YP/S = 0,19 g/g e QP = 0,13 g/L.h) foram
alcanados a partir de 30 g/L de xilose e 5 g/L de extrato de levedura.
A presena de inibidores em hidrolisados hemicelulsicos tambm constitui
uma barreira a ser superada nos processos fermentativos, visto que parte destes
compostos liberada durante o processo de hidrlise, a partir da degradao de
acares e lignina.

A presena de cido actico, furfural, hidroximetilfurfural,

compostos fenlicos, entre outros pode afetar o crescimento celular e

consequentemente a produo de etanol (HAHN-HGERDAL et al., 1991).
Segundo van Zyl et al. (1991) o cido actico um inibidor para leveduras em
geral e concentraes de 2,0 a 5,0 g/L tm sido relatadas como sendo inibidoras
do crescimento de P. stipitis.
Nigam (2001) estudou o efeito da adio de 6,9 g/L de cido actico, 0,27
g/L de furfural e derivados da lignina (extrato bruto de lignina) em meio sinttico,
com o objetivo de simular as condies do hidrolisado hemicelulsico de palha de
trigo. O autor mostrou que a adio desses inibidores individualmente ou em
vrias combinaes diminuiu a converso do substrato e a produtividade
volumtrica em etanol, entretanto a adio simultnea de todos os inibidores
resultou numa reduo mais acentuada. A menor reduo de YP/S (inferior a 10%)
foi observada a partir da adio de furfural (0,27 g/L), contudo quando a
concentrao deste inibidor foi elevada para 1,5 g/L ocorreu uma reduo em
torno de 90% tanto para YP/S (0,43 para 0,04 g/g) quanto para QP (0,47 para 0,07
g/L.h), sugerindo que altas concentraes de furfural inibem a respirao e o
crescimento de P. stipitis. Foi tambm verificado que o furfural foi reduzido a
lcool furfuril, que tambm leva diminuio da taxa de crescimento bem como
produo de etanol. Recentemente foi relatado que P. stipitis capaz de reduzir o
grupo aldedo no anel furano do furfural e hidroximetilfurfural (LIU et al., 2004) e
que esta levedura reduz a concentrao de cido actico durante a fermentao
(Agbogbo et al., 2007), evidenciando a capacidade desta levedura para realizar
uma destoxificao in situ, dos inibidores gerados durante o pr-tratamento.
A presena de compostos inibidores como o cido actico, em hidrolisados
hemicelulsicos, apresenta forte efeito sobre o pH (van ZYL et al., 1991). Em
meios de fermentao contendo cido actico observa-se a reduo do pH devido
sua dissociao dentro do citoplasma celular, influenciando tanto o consumo de

55

acares quanto a formao de biomassa e etanol. De acordo com Telli-Okur e

Eken-Saraoglu (2006), quando o meio de cultivo ou hidrolisado apresenta pH
acima de 5,5 observa-se a reduo dos efeitos inibitrios.
A tolerncia ao etanol um fator relevante para o crescimento das
leveduras, visto que o efeito txico deste composto pode ser atribudo pelo
acmulo intracelular do acetaldedo, que pode levar osmose celular e
alteraes, nas membranas celulares (HAHN-HGERDAL et al., 1994). O nvel de
tolerncia a este produto varia com as cepas e influenciado pelas condies de
cultivo, principalmente a temperatura. Alm disso, a formao de biomassa
parece ser mais sensvel ao etanol do que a formao do produto (du PREEZ;
DRIESSEL; PRIOR, 1989). De acordo com Hahn-Hgerdal et al. (1994), durante a
fermentao em meio semissinttico sob temperatura de 30 C, a levedura P.
stipitis CBS 7126 teve seu crescimento inibido por concentraes de etanol entre
32,0 e 34,0 g/L. Alm disso, os autores tambm observaram que para P. stipitis
CBS 5773, a mxima tolerncia observada foi de 65 g/L a 25 C. Por outro lado,
para a levedura P. stipitis CBS 7126, a mxima tolerncia ocorreu na faixa de
temperatura entre 16 e 22 C, visto que foi observa do crescimento celular at a
concentrao de 60 g/L de etanol e, que esta tolerncia foi diminuda para 27,5
g/L, a partir do aumento da temperatura para 32 C (du-PREEZ; BOSCH; PRIOR,
1987). Adicionalmente, du Preez, Driessel e Prior (1989), observaram que no
existe uma relao entre as concentraes mximas de etanol, toleradas por P.
stipitis CBS 7126 e as fontes de carbono assimiladas pela levedura, isto , a
tolerncia foi a mesma independente do acar disponvel no meio de
fermentao ser glicose ou xilose.
As condies de fermentao podem ser influenciadas pela concentrao
inicial de clulas empregada. Maiores concentraes celulares consistem em um
nmero superior de clulas viveis para a formao de biomassa e produto, e
ainda podem ser empregadas como estratgia para amenizar o efeito txico de
compostos inibidores presentes no hidrolisado (OLSSON; HH-HAGERDAL,
1996; FERREIRA, et al., 2011). Adicionalmente, o aumento da concentrao
inicial de clulas pode resultar em valores superiores de produtividade volumtrica
em etanol, como observado por Agbogbo et al. (2007). Estes autores alcanaram
um aumento de aproximadamente 50% nos valores de QP quando elevaram a

56

concentrao celular inicial de 1,82 para 6,45 g/L, na fermentao de xilose em

meio semissinttico por P. stipitis, sob mesmo pH (6,3).

57

OBJETIVOS

3.1 Objetivo geral

O objetivo principal deste trabalho foi avaliar o potencial do hidrolisado

hemicelulsico de bagao de malte como substrato para a produo de etanol
pela levedura Pichia stipitis NRRL Y-7124.

3.2 Objetivos especficos

Avaliar

efeito

da

suplementao

nutricional

do

hidrolisado

hemicelulsico de bagao de malte, a partir da adio de extrato de farelo de

arroz, uria e extrato de levedura, sobre os parmetros fermentativos da
bioconverso pela levedura Pichia stipitis e, obter a concentrao tima dos
nutrientes que forem estatisticamente significativos para o processo;

Otimizar as condies de pH e concentrao inicial de clulas na

fermentao do hidrolisado hemicelulsico de bagao de malte (destoxificado e
no destoxificado), pela levedura Pichia stipitis;

Avaliar o efeito do cido actico sobre a produo de etanol pela levedura

Pichia stipitis em meio semissinttico, sob as condies de pH e concentrao
inicial de clulas previamente otimizadas em hidrolisado (destoxificado ou no);

Avaliar o perfil cintico da produo de etanol a partir do HHBM em

biorreator de bancada, pela levedura Pichia stipitis, empregando-se as condies
de pH e concentrao inicial de clulas, otimizadas em frascos agitados.

58

MATERIAIS E MTODOS

Os experimentos foram realizados no Laboratrio de Fermentao I do

Departamento de Biotecnologia (LOT) da Escola de Engenharia de Lorena da
Universidade de So Paulo (EEL - USP).

4.1 Obteno e caracterizao do hidrolisado hemicelulsico de bagao de

malte
O bagao de malte (BM) utilizado neste trabalho foi fornecido pela
Microcervejaria do Departamento de Biotecnologia da Escola de Engenharia de
Lorena-USP. Assim que obtido, o bagao de malte foi lavado com gua para a
remoo dos resduos do processo cervejeiro e secado naturalmente ao sol at
apresentar um teor de umidade de aproximadamente 10%, sendo posteriormente
armazenado em temperatura ambiente livre de umidade, at a realizao da
hidrlise.
O bagao de malte foi submetido a um processo de hidrlise com cido
sulfrico, em reator de ao inoxidvel com capacidade de 50 litros, sob condies
previamente otimizadas por Mussatto e Roberto (2005). Foram utilizados 100 mg
de H2SO4 (98% p/p) por grama de matria seca mantendo-se a relao de matria
seca: soluo cida de 1:8 (g/g). A hidrlise foi conduzida temperatura de 120
C por 17 minutos. Ao trmino da reao, o hidrolis ado hemicelulsico do bagao
de malte (HHBM) foi separado do resduo slido contendo celulose e lignina, por
filtrao.

A fim de aumentar em 3 vezes o seu teor de xilose, o hidrolisado

hemicelulsico foi concentrado sob vcuo a 70 + 5 C, em evaporador com

capacidade de 30 litros, aquecido por resistncia eltrica. Aps esta etapa, o
hidrolisado hemicelulsico de bagao de malte (HHBMC) foi mantido em cmara
fria a 4C at sua utilizao.

4.2 Microrganismo e preparo do inculo

Para os ensaios de fermentao foi utilizada a levedura Pichia stipitis
NRRL Y-7124 (CBS 5773), fornecida pela USDA, Peoria, Illinois. A cultura foi
mantida repicada em gar YMDP, composto por extrato de malte (3 g/L), extrato

59

de levedura (3 g/L), peptona (5 g/L), glicose (10 g/L) e gar (20 g/L) e a levedura
foi conservada por transferncias peridicas e mantida em geladeira a 4C.
Inicialmente, aladas de clulas provenientes de repiques de manuteno foram
transferidas para tubos de ensaio contendo cerca de 5 mL de gua destilada
esterilizada. Aps homogeneizao da suspenso, alquotas de 2 mL foram
transferidas para frascos Erlenmeyer de 250 ou 500 mL contendo 25 ou 50 mL do
meio, respectivamente, mantendo-se a proporo de 5:1 de Vfrasco/Vmeio. Os
frascos foram incubados em agitador rotatrio (Tecnal TE-420) a 30 C, sob
agitao de 200 rpm, por 24 horas.
O inculo foi cultivado em meio semissinttico (MSS) ou em hidrolisado
hemicelulsico de bagao de malte. Para o preparo do inculo, inicialmente as
clulas foram separadas por centrifugao em centrfuga Jouan modelo MR 1812, a 1300 x g por 20 minutos e ressuspensas em gua destilada esterilizada de
forma a se obter uma suspenso celular de aproximadamente 10 g/L. Esta
suspenso foi utilizada para inocular os meios de fermentao.
O meio semissinttico foi constitudo por 30,0 g/L de xilose, 1,0 g/L de
MgSO4.7H2O, 3,0 g/L de uria e 3,0 g/L de extrato de levedura. Para o preparo
deste meio foram utilizadas solues-estoque concentradas de cada componente,
previamente esterilizadas em autoclave a 121 oC por 20 min, com exceo da
xilose que foi autocavada a 112 oC por 15 min. O meio base de hidrolisado
hemicelulsico de BM foi preparado utilizando o hidrolisado concentrado (HHBMC)
conforme descrito no item 4.1. Inicialmente, o HHBMC teve seu pH elevado para
5,5 com NaOH (10N) e em seguida centrifugado a 1200 x g por 20 minutos para
remoo de slidos. O hidrolisado foi ento devidamente diludo com H2O
destilada esterilizada de forma a se obter a concentrao 30 g/L de xilose, sendo
em seguida suplementado com 3,0 g/L de extrato de levedura.

4.3 Meio e condies de fermentao

Para os ensaios fermentativos, o hidrolisado hemicelulsico de bagao de
malte foi utilizado como meio de fermentao, tendo o seu pH ajustado para 5,5
com NaOH (10N). Aps alterao do pH, o hidrolisado foi centrifugado a 1200 x g
por 20 minutos para remoo de slidos e em seguida foi devidamente diludo
com H2O destilada esterilizada de forma a se obter uma concentrao inicial de

60

55 g/L de xilose. A adio ou no de nutrientes e o valor de pH inicial e a

concentrao inicial de clulas variaram de acordo com cada experimento.
Os ensaios fermentativos foram conduzidos em frascos Erlenmeyer de 125 mL
contendo 50 mL de meio de fermentao. Os frascos foram incubados em
agitador rotatrio (Tecnal TE-420), temperatura de 30 C, sob agitao de 200
rpm.
As fermentaes realizadas em meio semissinttico simularam as
concentraes de acares (glicose (5,5 g/L), xilose (56 g/L) e arabinose (27 g/L))
e cido actico do hidrolisado (2,9 ou 2,3 g/L) presentes no hidrolisado. Como
controle foram realizados ensaios fermentativos em MSS ausentes de cido
actico. Todos os ensaios realizados em duplicatas. O meio semissinttico foi
suplementado com MgSO4 (1,0 g/L), (NH4)2PO4 (3,0 g/L), KH2PO4 (20,0 g/L)
apresentando composio similar ao meio descrito por Debus et al., (1983) e
igualmente utilizado por Roberto et al., (1991).
Nas fermentaes em biorreator foi utilizado meio base de hidrolisado
contendo 55 g/L de xilose, nas condies de pH e concentrao inicial de clulas
(X0) otimizadas em frascos (pH 6,5 e X0 = 5,0 g/L), sendo conduzidas em
biorreator modelo BIOSTAT B (B. Braun Biotech International) com 2 litros de
capacidade equipado com controlador de temperatura, pH e agitao. A agitao
foi promovida duas turbinas com seis ps planas. O inculo foi preparado
conforme em hidrolisado conforme descrito no item 4.2 e o volume do meio de
fermentao foi de 1,2 L. A temperatura foi mantida a 30 C e as condies de
transferncia de oxignio utilizadas foram kLa de 11,0 h-1, correspondendo a uma
aerao de 0,25vvm e agitao de 320 rpm.
Para

todos

os

ensaios

fermentativos,

foram

retiradas

amostras

periodicamente para acompanhamento do crescimento celular, pH, consumo de

acares e cido actico e produo de etanol. Nos ensaios realizados em
duplicata, a mdia foi utilizada para calcular os resultados.

61

4.3.1 Efeito da suplementao nutricional do HHBM na produo de etanol

pela levedura Pichia stipitis

O efeito da adio de nutrientes ao meio de fermentao, assim como suas

possveis interaes sobre processo de bioconverso do HHBM em etanol pela
levedura P. stipitis foi avaliado com o auxlio da metodologia de planejamento
experimental, conforme matriz mostrada na Tabela 4.1. Os nutrientes avaliados
foram: extrato de farelo de arroz (EFA), uria (U) e extrato de levedura (EL).
Solues concentradas de U (15%) e EL (15%) foram preparadas separadamente
e autoclavadas a 121 C por 20 minutos. Para a utilizao do farelo de arroz, foi
preparada uma suspenso de farelo em gua destilada numa proporo de 10%
(m/v). Aps a autoclavagem, esta suspenso foi centrifugada em condies
asspticas a 1200 x g por 20 min. A frao lquida (extrato de farelo de arroz) foi
transferida para um frasco previamente esterilizado e conservada em geladeira
at a sua utilizao, nunca por um perodo superior a uma semana. Os
componentes foram ento misturados assepticamente, de forma a se obter a
concentrao desejada de cada nutriente no meio de fermentao. O inculo foi
preparado em MSS conforme descrito no item 4.2 e a fermentao foi conduzida
em frascos Erlenmeyers, com concentrao inicial de clulas de 1 g/L, nas
condies descritas no item 4.3.
Tabela 4.1. Planejamento fatorial do tipo 23, com triplicata no ponto central, para a
avaliao do efeito da suplementao nutricional do HHBM na produo de etanol por
Pichia stipitis NRRL Y-7124.
Nveis Codificados das Variveis
Ensaio
1
2
3
4
5
6
7
8
9/10/11

EFA

EL

-1
+1
-1
+1
-1
+1
-1
+1
0

-1
-1
+1
+1
-1
-1
+1
+1
0

-1
-1
-1
-1
+1
+1
+1
+1
0

Nveis Reais da Variveis

EFA
(%v/v)
0
20
0
20
0
20
0
20
10

U
(g/L)
0
0
3
3
0
0
3
3
1,5

EL
(g/L)
0
0
0
0
3
3
3
3
1,5

62

4.3.2 Efeito da concentrao do extrato de levedura e do cultivo de Pichia

stipitis em HHBM sobre a produo de etanol
A partir dos resultados obtidos nos ensaios do planejamento fatorial 23,
foram realizados ensaios fermentativos visando avaliar a influncia de diferentes
concentraes de extrato de levedura sobre a produo de etanol pela levedura
P. stipitis. Nesta etapa, o inculo foi preparado em MSS conforme descrito no item
4.2. O meio de fermentao foi preparado em hidrolisado hemicelulsico de
bagao de malte concentrado (Item 4.3) e os ensaios fermentativos foram
conduzidos em frascos Erlenmeyers, avaliando-se as concentraes de 1g/L,
2g/L, 3g/L, 4g/L e 5 g/L do nutriente.
Visando avaliar o efeito do cultivo da levedura em hidrolisado de bagao de
malte, clulas de P. stipitis previamente cultivadas em MSS por 24 horas, foram
transferidas para o hidrolisado contendo 30 g/L de xilose. Estes ensaios foram
realizados em duplicatas.

4.3.3 Otimizao do pH e da concentrao inicial de clulas sobre a

produo de etanol por Pichia stipitis em HHBM no destoxificado

Para avaliao das condies timas de pH e concentrao inicial de

clulas sobre a produo de etanol por P. stipitis, em hidrolisado de bagao de
malte no destoxificado, foi empregada a metodologia de planejamento
experimental 22 com face centrada. Considerando os resultados obtidos nos
ensaios anteriores, este planejamento foi realizado com o inculo cultivado em
meio base de hidrolisado conforme descrito no item 4.2, eliminando-se a etapa
de cultivo em MSS. Os ensaios fermentativos foram conduzidos em frascos
Erlenmeyers conforme descrito item 4.3, variando-se pH e concentrao inicial de
clulas conforme a matriz experimental apresentada na Tabela 4.2.

63

Tabela 4.2. Planejamento fatorial do tipo 22 com face centrada, com triplicata no
ponto central, para a avaliao do efeito do pH e da concentrao inicial de clulas na
produo de etanol a partir de Pichia stipitis NRRL Y-7124.
Nveis Codificados das Variveis

Nveis Reais das Variveis

Ensaio
1
2
3
4
5
6
7
8
9/10/11

pH

X0

pH

-1
+1
-1
+1
0
0
-1
+1
0

-1
-1
+1
+1
-1
+1
0
0
0

4,5
6,5
4,5
6,5
5,5
5,5
4,5
6,5
5,5

X0
(g/L)
1,0
1,0
5,0
5,0
1,0
5,0
3,0
3,0
3,0

4.3.4 Otimizao do pH e da concentrao inicial de clulas sobre a

produo de etanol por Pichia stipitis em HHBM destoxificado

Para avaliao das condies timas de pH e concentrao inicial de

clulas sobre a produo de etanol por P. stipitis, foi empregada a metodologia de
planejamento experimental 22 com face centrada, em hidrolisado de bagao de
malte destoxificado. Para a destoxificao do hidrolisado foi utilizado o
procedimento descrito por Mussatto, Santos e Roberto (2004) que consiste na
alterao do pH em combinao com o mtodo de adsoro com carvo ativado.
Inicialmente, o pH do hidrolisado concentrado foi elevado para 8,0 pela adio de
NaOH (10N) sendo em seguida ajustado para 2,0 com H2SO4 (98%). Nesta etapa,
foi ento realizado o processo de adsoro adicionando-se ao HHBM o carvo
ativado (CA) na proporo de 3 g de CA para cada 100 g de HHBM (3%). Os
ensaios de adsoro foram realizados em agitador rotatrio a 45 C, sob agitao
de 150 rpm, por 60 minutos. Ao trmino do tratamento, o hidrolisado foi
centrifugado a 1200 x g por 30 minutos para remoo do carvo e filtrado em
papel filtro. Aps cada alterao de pH, o precipitado resultante foi removido por
centrifugao a 1200 x g por 30 minutos.
Nesta etapa, os ensaios foram realizados empregando-se as mesmas
variveis (pH e concentrao inicial de clulas) avaliadas nos ensaios com

64

hidrolisado no destoxificado (item 4.3.3). O inculo foi preparado em hidrolisado

conforme item 4.2 e as fermentaes foram conduzidas conforme condies
descritas no item 4.3. A matriz experimental do planejamento contendo os nveis
das variveis empregados nos diferentes ensaios est apresentada na Tabela
4.2.

4.3.5 Efeito do cido actico sobre a produo de etanol por Pichia stipitis
em meio semissinttico
Com o objetivo de se avaliar o efeito do cido actico sobre os parmetros
fermentativos de P. stipitis foram realizados ensaios fermentativos em meio
semissinttico, empregando-se as condies de pH e concentrao inicial de
clulas previamente otimizadas para o hidrolisado no destoxificado (pH 6,4 e X0
= 5 g/L) e para o hidrolisado destoxificado (pH 6,14 e X0 = 1,36 g/L). O cultivo do
inculo foi realizado em MSS conforme descrito no item 4.2, com exceo da
uria, que foi substituda por (NH4)2PO4 na concentrao de 3,0 g/L.

4.4 MTODOS ANALTICOS

4.4.1 Determinao do teor de umidade

Amostras do material (cerca de 1 g) foram colocadas em uma balana de

secagem por ao de raios infravermelhos (IV 2000 Gehaka). As amostras foram
mantidas a 105 C at alcanar peso constante, send o a umidade do bagao de
malte determinada pela diferena de massa obtida antes e aps a secagem.

4.4.2 Determinao dos teores de celulose, hemicelulose e lignina

O bagao de malte foi caracterizado quanto aos teores de celulose,

hemicelulose e lignina, de acordo com as metodologias descritas por Browning
(1967) e Rocha (2000). Estes ensaios foram realizados em triplicatas, portanto

65

amostras de aproximadamente 2 gramas de bagao (10% de umidade) foram

transferidas um bquer de 50 ml, adicionando em seguida, 10 ml de H2SO4 72%
p/p (pr-aquecido a 45 C). A reao foi mantida em banho termostatizado
(Micronal modelo B.15) a 50 C, por 7 minutos, sob agitao constante com
basto de vidro. Aps esse tempo, a reao foi interrompida pela adio de 50 ml
de gua destilada e o contedo do bquer foi transferido quantitativamente para
um Erlenmeyer de 500 ml, onde o volume total de gua foi elevado para 275 ml.
Em seguida, o Erlenmeyer foi fechado com papel alumnio e autoclavado a 1 atm,
120 C, por 45 minutos, visando hidrolisar completamente os oligmeros
restantes. A etapa seguinte consistiu em resfriar os frascos at temperatura
ambiente e separar o material slido da frao lquida utilizando-se papel de filtro
previamente tarado. O hidrolisado foi ento recolhido em um balo volumtrico de
500 ml e o slido contido no papel de filtro foi lavado com cerca de 1,5 L de gua
destilada, sendo levado para secar em estufa 105 C at atingir peso constante
e em seguida o material foi calcinado para determinao de cinzas (Item 4.43). A
relao entre a massa do resduo seco e o peso inicial da amostra foi utilizada
para determinar a porcentagem de lignina insolvel (lignina Klasson) presente no
bagao de malte (equao 4.1). Aproximadamente 1 mL da frao lquida obtida
foi filtrada em filtro Sep Pak C18 e analisada por Cromatografia Lquida de Alta
Eficincia (CLAE) para determinao das concentraes de glicose, xilose,
arabinose e cido actico, sendo estas utilizadas para o clculo da porcentagem
de celulose, hemicelulose e grupos acetil (IRICK et al., 1988) presentes na
amostra de acordo com as equaes 4.2, 4.3 e 4.4.

0
0
1
0
0
1

Equao 4.2

0
0
1

H
P

F
5
,
0

a
r
a

H
P

l
i
x

e
s
o
l
u
l
e
c
i
m
e
H
%

(
=

Equao 4.1

F A
5 M
,
0

i
l
g

e
s
o
l
u
l
e
C
%

C
A

M A
RM
M
l
e
v

l
o
s
n
i
a
n
i
n
g
i
L
%
=

Equao 4.3

66

0
0
1

e
c
aM
C
l
i
t
e
c
a
s
o
p
u
r
G
%

Equao 4.4

onde:
Fc = fator de converso (0,9 para a celulose e 0,88 para a hemicelulose);
FPH = fator de perda de hidrlise (1,055 para celulose e 1,155 para hemicelulose);
CGli, CXil, CAra, CAcet = concentrao de glicose, xilose, arabinose e cido actico,
respectivamente (g/L);
MA = peso da amostra seca (g);
MR = peso do resduo de lignina (g);
MAC = peso da amostra aps calcinao (g)
Para determinao da lignina solvel, 5 ml do hidrolisado foi alcalinizado
com 1 ml de NaOH 6M at atingir pH 12 e diluda em balo volumtrico de 50 mL,
sendo analisada por espectroscopia de UV (espectrofotmetro Hitachi 1800) em
comprimento de onda de 280 nm. Foram realizadas anlises do hidrolisado
quanto concentraes de furfural e hidroximetilfurfural atravs de CLAE, as
quais juntamente com o resultado da absorbncia, foi utilizada para calcular a
porcentagem de lignina solvel na amostra, de acordo com as equaes 4.5, 4.6
e 4.7 a seguir:

)
Equao 4.5
4
-

Equao 4.6

Equao 4.7

0
0
1
5
,
0

0
1
9
7
2
,
3
]

0
8
2
D
P

0
8
2
D
I
H

A
-

F
M
H

l
e
v

l
o
s
a
n
i
n
g
i
L

C
l
e
v

l
o
s
a
n
i
n
g
i
L
%
=

F
M
H

0
1
7
8
1
,
4
[

l
e
v

l
o
s
a
n
i
n
g
i
L

= (

)
+(

F
R
U
F

F
R
U
F

0
8
2
D
P

=(

onde:
AHID280 = absorbncia do hidrolisado alcalinizado a 280 nm (incluindo a correo
da diliao;
CFURF e CHMF = concentrao de furfural e hidroximetilfurfural, respectivamente, no
hidrolisado (g/L);

67

FURF = absortividade do furfural (146,85 L/g.cm);

HMF = absortividade do hidroximetilfurfural (114 L/g.cm);
CLignina solvel= concentrao de lignina solvel (g/L);
MA= massa da amostra seca

4.4.3 Determinao do teor de cinzas

Primeiramente o bagao de malte foi colocado em dissecador por 50
minutos e em seguida pesou-se 1 grama do mesmo. O teor de cinzas foi
determinado colocando-se o material pesado em um cadinho de porcelana
previamente tarado e aquecido em mufla eltrica a 800 C por 2 h. As cinzas
foram determinadas pela diferena de peso das amostras, antes e aps a
incinerao (equao 4.8).

0
0
1

T
C

M M
s
a
z
n
i
C
%
=

Equao 4.8

onde:
MCT = peso de cinzas totais (g), obtida pela diferena de peso das amostras;
MA = peso seco da amostra (g)

4.4.4 Determinao do teor de protenas

O teor de protenas do bagao de malte foi determinado como o contedo

total de nitrognio pelo mtodo Kjeldahl, utilizando o fator de correo N 6,25.
O teor de protenas do hidrolisado hemicelulsico de bagao de malte foi
determinado pelo mtodo de Bradford. Para tal, empregou-se 100 L de
hidrolisado (diludo ou no), 5,0 mL do reagente de Bradford, agitando-se a
mistura e, em seguida deixou-se incubando por 5 minutos. Aps este tempo foi
realizada a leitura a 595 nm, em espectrofotmetro Hitachi 1800. Para o branco,
utilizou-se gua deionizada em substituio do padro.

68

4.4.5 Determinao da concentrao celular

A concentrao celular da levedura P. stipitis foi determinada pela medida

da absorbncia em espectro (Hitachi 1800) a 600 nm utilizando gua como
branco. Para isso, a levedura foi cultivada em MSS conforme descrito no item 4.2
e a cada 6 horas foram retiradas amostras para acompanhamento at o final de
24 horas. O volume do meio foi centrifugado para recuperao da massa celular
que, posteriormente foi lavada com gua destilada. A massa celular foi ento,
devidamente diluda para uma faixa de leitura entre 0,05 e 0,5 unidades de DO. A
concentrao celular foi determinada utilizando-se a equao obtida por
regresso linear dos dados de uma curva de calibrao entre peso seco e
absorbncia.

4.4.6 Determinao dos teores dos acares, de cido actico e de etanol

As concentraes de glicose, xilose, arabinose, cido actico e etanol

foram determinadas por Cromatografia Lquida de Alta Eficincia (CLAE), em
equipamento Waters com detector de ndice de refrao e coluna BIO-RAD
Aminex HPX-87H (300 X 7,8 mm), nas seguintes condies: temperatura da
coluna de 45 C; eluente: cido sulfrico 0,005 M; fluxo de 0,6 mL/min; volume de
amostra de 20 L. Para serem analisadas, as amostras foram diludas com gua
deionizadas e passadas por filtros C18 Sep-Pack Cartridge (Waters Associate
MILLIPORE). As concentraes dos compostos foram calculadas a partir de
curvas de calibrao obtidas de solues padro.

4.4.7 Determinao dos teores de furfural, hidroximetilfurfural e compostos

fenlicos

As concentraes de furfural e hidroximetilfurfural e compostos fenlicos

(cidos, ferlicos, cumrico, sirngico, vanlico, p-hidroxibenzico e vanilina) foram
determinadas por CLAE, em equipamento WATERS, nas seguintes condies:
coluna Waters Resolve C18 5 m (3,9 x 300 mm); temperatura ambiente; eluente:
acetonitrila/gua (1/8 com 1% de cido actico) degaseificado; fluxo de 0,8
mLmin; volume de amostra: 20 L e detector UV a 276 nm. As amostras foram

69

diludas com gua deionizada e filtradas em membranas do tipo HSWP com poros
de 0,45 m (Waters Associate MILLIPORE). As concentraes destes
compostos foram calculadas a partir de curvas de calibrao obtidas de solues
padro.

4.4.8 Determinao dos Teores de Compostos Fenlicos Totais

concentrao

total

dos

compostos

fenlicos

foi

quantificada

colorimetricamente pelo mtodo modificado de Folin-Ciocalteu (SINGLETON et

al., 1999) usando o cido ferlico como padro de calibrao. Inicialmente, as
amostras foram centrifugadas a 1300x g por 20 min para a remoo de slidos. O
sobrenadante foi ento filtrado em membrana de 0,45 m e devidamente diludo
com gua deionizada. A reao foi realizada em tubo de ensaio adicionado de 3,0
mL da amostra e 0,2 mL de reagente Folin. O sistema foi homogeneizado por
meio de vrtice e mantido em repouso por um perodo de 5 min. Aps este tempo,
foi adicionada mistura reacional, 0,8 mL de soluo de (Na)2CO3 na
concentrao de 150 g/L. Em seguida a mistura foi novamente agitada em vrtice
e mantida em repouso temperatura ambiente, na ausncia de luz por 30 min.
Fez-se ento a leitura em espectrofotmetro (Hitachi High Technologies
Corporation, Tkio, Japan) a 760 nm. Para composio do branco, gua
deionizada foi adicionada em substituio amostra, seguindo-se o mesmo
procedimento.

4.4.9 Determinao do pH

Os valores de pH das amostras foram determinados por potenciometria,

em um aparelho HANNA HI221, com correo de temperatura.

4.4.10 Determinao da Densidade

Os valores de densidade dos hidrolisados foram determinados em

temperatura ambiente, atravs do uso de um picnmetro de 50 ml.

70

4.4.11 Determinao do coeficiente volumtrico de transferncia de oxignio

O coeficiente volumtrico de transferncia de oxignio (kLa) foi estimado

com base no mtodo esttico, descrito inicialmente por Wise (1951).
Primeramente a sonda polarogrfica de oxignio foi calibrada presso
atmosfrica pela injeo de nitrognio ao meio de fermentao base de
hidrolisado, sem a adio de inculo. Numa segunda etapa, definiu-se o 100%
pela saturao do meio de fermentao com a injeo de ar atmosfrico sob
agitao de 400 rpm.
Aps este procedimento, o oxignio removido por introduo de
nitrognio e a variao da porcentagem de oxignio dissolvido em funo do
tempo foi monitorada nas condies de aerao (0,25 vvm) e agitao (320 rpm)
Estes valores de KLa foram determinados atravs da equao 4.9, a qual foi
proposta por Stanbury, Whitaker e Hall (1995).

ln (CS CL) = KLa * t

Equao 4.9

onde:
CS = concentrao de O2 dissolvido na saturao
CL = concentrao de O2 dissolvido no meio
t = tempo

4.5 PARMETROS FERMENTATIVOS

Para a anlise dos resultados das fermentaes foram determinados os
seguintes parmetros: fatores de converso de substrato a etanol; produtividades
volumtricas e eficincia da fermentao. Para os ensaios em biorreator de
bancada foram tambm avaliadas as velocidades instantneas e especficas do
bioprocesso.

71

4.5.1 Fator de Converso (rendimento) de Substrato em Clulas: YX/S (g/g):

X S

(
=
(

X S

X S

S
X

)
)

Equao 4.10

onde:
Xi e Xf = Concentrao inicial e final de clulas (g/L)
Si e Sf = Concentrao inicial e final de acares (glicose e xilose) (g/L)
4.5.2 Fator de Converso de Substrato (rendimento) em Etanol: YP/S (g/g):

i
f

P S

(
=
(

P S

P S

S
P

)
)

Equao 4.11

onde:
Pi e Pf = Concentrao inicial e final de clulas (g/L)
Si e Sf = Concentrao inicial e final de acares (glicose e xilose) (g/L)

4.5.3 Produtividade Volumtrica em Etanol: QP (g/L.h):

Equao 4.12

P t

( )
=
( )

P t

P t

onde:
Pi e Pf = Concentrao inicial e final de clulas (g/L)
ti e tf = Concentrao inicial e final de acares (glicose e xilose) (g/L)

4.5.4 Eficincia de Fermentao

o
c
i
r
o
e
t

S
P

0
0
1

S
P

o
d
a
l
u
c
l
a
c

Equao 4.13

72

onde:
YP/S (terico) = 0,511 g/g.
4.6 ANLISE ESTATSTICA

Os resultados dos ensaios realizados com base nos planejamentos

fatoriais foram analisados estatisticamente, utilizando-se o programa STATSTICA
verso 7.0, para a verificao dos efeitos individuais e de interao das variveis
sobre a resposta, definio das variveis importantes para o processo, avaliao
dos erros experimentais e para a modelagem emprica dos resultados em funo
das variveis escolhidas. Para otimizao dos modelos obtidos, foi utilizado o
programa Design-Expert 6.0.6.

73

RESULTADOS E DISCUSSO

5.1 Caracterizao do bagao de malte e do hidrolisado hemicelulsico

O bagao de malte (BM) utilizado neste trabalho foi analisado quanto aos
teores dos seus principais componentes, conforme apresentado na Tabela 5.1. O
BM foi obtido a partir de 100% de malte de cevada, ou seja, sem adjuntos e, como
pode ser observado um material lignocelulsico composto principalmente por (%
p/p): hemicelulose (35,60), lignina (21,79), celulose (20,18) e protenas (15,30).
Nota-se ainda que a frao hemicelulsica apresenta teores de xilana e arabinana
numa de relao aproximada de 2:1. O teor de hemicelulose observado no
bagao de malte mostra-se consideravelmente maior quando comparado a outros
resduos agrcolas como palha de arroz (22% p/p) (MUSSATTO, 2002), bagao
de cana (25% p/p) (PANDEY et al., 2000) e palha de cevada (23% p/p) (SAHA;
COTA, 2010) evidenciando seu potencial como substrato rico em pentoses, para
sua utilizao em processos biotecnolgicos.

Tabela 5.1. Composio qumica do bagao de malte obtido no processo cervejeiro.

Componentes

(% p/p)

Celulose

20,18

Hemicelulose

35,60

Xilana

24,56

Arabinana

11,04

Lignina total

21,79

Lignina solvel em meio cido

4,64

Lignina insolvel (Klasson)

17,15

Grupos acetil

3,02

Cinzas

2,99

Protenas

15,30

Extrativos*

1,12

* obtido por diferena

74

Os teores de celulose e lignina do bagao de malte situam-se em torno de

20% p/p e so comparveis aos valores encontrados por Duarte et al. (2008), que
observaram valores de 21 e 22% p/p, respectivamente. Alm dos componentes
estruturais, o BM contm elevado teor de protenas (15,3% p/p) e cinzas (2,99%).
Contudo, o teor de protenas encontrado no presente trabalho foi discretamente
inferior aos valores observados por Kanauchi et al. (2001), Russ et al. (2005) e
Duarte et al. (2008), que encontraram teores de 24, 19 e 24,6% p/p,
respectivamente. O teor de protenas est relacionado presena de
aminocidos, os quais so importantes para o crescimento e metabolismo de
leveduras, do mesmo modo que a presena de cinzas relaciona-se presena de
minerais no material.
Quanto ao teor de extrativos, nota-se um valor de 1,12%. Os extrativos
correspondem a ceras, gorduras, gomas, amidos, alcalides, resinas, leos
essenciais e vrios constituintes citoplasmticos e so responsveis pela cor,
cheiro, resistncia ao ataque de deterioradores, diminuio da permeabilidade e
higrospicidade e estabilidade dimensional do material (KLOCK et al., 2005).
importante ressaltar que a composio qumica do bagao de malte pode variar
de acordo com fatores como tipo do gro, tempo de colheita, condies de
malteao e mosturao, alm da adio ou no de adjuntos durante o processo
cervejeiro (HUIGE, 1994; SANTOS et al., 2003).
Posterior sua caracterizao, o bagao de malte foi submetido a um
processo de hidrlise cida, conforme descrito no item 6.4.1, visando recuperar os
acares provenientes da hemicelulose (xilose e arabinose). A eficincia de
converso da hidrlise da hemicelulose (xilose e arabinose) em acares
monomricos foi de 82%, sendo cerca de 63% dos acares hemicelulsicos,
composto por xilose. Adicionalmente, o hidrolisado obtido foi caracterizado quanto
ao pH, densidade, acares (glicose, xilose e arabinose), protenas, cido actico
e compostos provenientes da degradao de acares (furanos) e da lignina
(fenlicos totais), antes e aps ser submetido a um processo de concentrao
(Tabela 5.2).
Observa-se que os teores de acares, protenas e fenlicos totais
apresentaram um aumento proporcional ao fator de concentrao, ou seja, um
aumento de cerca de trs vezes. Entretanto o cido actico e os furanos
apresentaram um aumento inferior ao fator de concentrao empregado,

75

resultando na remoo parcial destes compostos. Isto se deve volatilidade

destes compostos sob as condies de temperatura e presso utilizadas durante
o processo de concentrao, ou seja, 70 C, sob vc uo.

Tabela 5.2. Composio do hidrolisado hemicelulsico do bagao de malte original e

concentrado trs vezes.

Hidrolisado
original

Hidrolisado
concentrado

Fator de
concentrao

Glicose

2,25

6,85

3,0

Xilose

25,56

77,66

3,0

Arabinose

11,81

37,98

3,0

Protenas Totaisa

0,45

1,49

3,0

cido actico

2,92

3,07

1,0

Furfural

0,22

0,17

1,3

5-Hidroximetilfurfural

0,07

0,06

1,1

cido sirngico

nd

0,06

Siringaldedo

nd

0,02

Vanilina

nd

0,11

cido ferlico

nd

0,16

Compostos fenlicos totais b

2,22

6,00

2,7

pH

1,27

0,8

Densidade (g/cm3)

1,02

1,06

Acares

Furanos

Produtos de degradao da lignina

Bradford (1976); Singleton et al. (1999); nd: no detectado

Ainda

em

relao

Tabela

5.2,

observa-se

que

hidrolisado

hemicelulsico de bagao de malte apresenta em sua composio, compostos

originados a partir da degradao de acares (furfural e hidroximetilfurfural) e da
lignina (cidos sirngico e ferlico, bem como vanlina, siringaldedo). Alm destes,
nota-se a presena do cido actico, derivado de grupos acetil presentes na
hemicelulose do bagao de malte. Tais compostos so liberados durante o

76

processo de hidrlise e, dependendo da sua concentrao podem inibir tanto o

crescimento da levedura quanto a produo de etanol (Palmqvist and HahnHgerdal, 2000). Entretanto, difcil se estabelecer a partir de qual concentrao,
tal composto torna-se txico no meio de fermentao, visto que esta toxicidade
dependente de fatores como espcie e grau de adaptao do microrganismo ao
meio.
Verifica-se na Tabela 5.2 que a concentrao de furfural no hidrolisado de
bagao de malte foi cerca de trs vezes superior a de hidroximetifurfural. Esta
diferena pode ser justificada pela elevada concentrao de pentoses no
hidrolisado, visto que o furfural derivado da degradao destes acares
durante o processo de hidrlise. Alm disso, a hemicelulose degradada mais
facilmente do que a celulose, contribuindo assim, para a presena de
concentraes elevadas deste inibidor no hidrolisado.

As concentraes de

furfural (0,17 g/L) e hidroximetilfurfural (0,06 g/L) presentes no hidrolisado de

bagao de malte so relativamente baixas quando comparadas s encontradas
em outros hidrolisados. Por exemplo, no hidrolisado hemicelulsico de sabugo de
milho, obtido por hidrlise com cido diludo, Huang et al. (2009) verificaram que
as concentraes de furfural e hidroximetilfurfural foram de 0,74 g/L e 0,08 g/L,
respectivamente. Estes valores so aproximadamente 4,0 e 1,5 vezes maiores do
que os valores observados em hidrolisado de bagao de malte.
Em um estudo sobre a produo de etanol a partir do hidrolisado
hemicelulsico de palha de trigo por P. stipitis, Nigam (2001a) observou que a
concentrao de furfural (0,25 g/L) presente no hidrolisado, no foi suficiente para
reduzir os parmetros fermentativos (YP/S e QP). Por outro lado, a adio de 1,5
g/L deste composto ao hidrolisado foi capaz de reduzir os valores destes
parmetros em 90 e 85%, respectivamente. Adicionalmente, Delgenes; Molleta;
Navarro (1996), estudando a formao de biomassa na fermentao por P. stipitis
em meio semissinttico, verificaram que a concentrao mnima inibitria de
hidroximetilfurfural foi de 0,5 g/L. Nestas condies os autores observaram uma
reduo de 43% sobre a converso do substrato em clulas. Desse modo, podese sugerir que as concentaes de furfural e hidroximetilfurfural presentes no
hidrolisado de bagao de malte so baixas e provavelmente so inferiores s
concentraes inibitrias mnimas para a levedura P. stipitis.

77

No presente estudo, o cido actico apresentou uma concentrao de

cerca de 3,0 g/L no hidrolisado hemicelulsico de bagao de malte, mostrando-se
inferior s concentraes observadas em hidrolisados hemicelulsicos produzidos
a partir de outros materiais. Por exemplo, no hidrolisado hemicelulsico de
bagao de cana, Kumar et al., (2007) observou uma concentrao de 5,45 g/L de
cido actico, enquanto que Ferrari et al. (1992) obteve 10 g/L deste cido em
hidrolisado hemicelulsico de eucalipto. O cido actico reportado na literatura
como um dos maiores inibidores da bioconverso a etanol por P. stipitis, sendo
esta inibio fortemente dependente da sua concentrao e do pH do meio (van
ZYL et al., 1991). Segundo Lawford e Rousseau, (1998) quando o pH do meio de
fermentao cido, o cido actico (pKa = 4,75) que apresenta-se na forma nodissociada, consegue atravessar a membrana plasmtica, pois lipossolvel
nesta condio. Dentro da clula (pH = 7,4), o cido se dissocia acumulando-se
no citoplasma comprometendo a atividade intracelular, podendo levar morte
celular. Assim, tanto a presena do cido actico, quanto a sua concentrao no
hidrolisado so fatores importantes e devem ser considerados durante o processo
fermentativo. No entanto, a presena de outros compostos inibidores no
hidrolisado, como os liberados pela degradao da lignina, pode potencializar o
efeito no somente do cido actico como tambm dos furanos. Conforme
descrito por Mussatto e Roberto, 2004, a presena do furfural e do
hidroximetilfurfural juntamente com compostos derivados de degradao da
lignina e vrios tipos de cidos, pode resultar em um efeito sinergstico sobre a
bioconverso por leveduras.
5.2 Efeito da suplementao nutricional do hidrolisado hemicelulsico de
bagao de malte sobre a produo de etanol por Pichia stipitis
Diversas estratgias nutricionais vm sendo cuidadosamente estudadas
visando

alcanar

melhores

resultados

na

bioconverso

de

hidrolisados

lignocelulsicos a etanol. Contudo, estes hidrolisados podem ou no necessitar

de suplementao nutricional, sendo este fator dependente no somente do tipo
de material, mas tambm do microrganismo empregado. De acordo com
Slininger, Gorsich e Liu, (2009), a suplementao nutricional pode ainda aumentar

78

tolerncia

da

levedura

compostos

inibidores

como

furfural

hidroximetilfurfural, presentes em meios base de hidrolisados.

Com o objetivo de verificar a necessidade de suplementao nutricional do
hidrolisado hemicelulsico de bagao de malte para a produo de de etanol, pela
levedura P. stipitis NRRL Y-7124, foi realizado um planejamento fatorial 23, onde
se avaliou o efeito da adio de extrato de farelo de arroz (EFA), extrato de
levedura (EL) e uria (U). A escolha destes nutrientes foi baseada principalmente
na necessidade mnima de nitrognio e micronutrientes para o crescimento e
produo de etanol pela levedura. Alm de fonte de nitrognio na forma de
aminocidos, o extrato de levedura uma fonte de vitaminas e minerais, que so
constituintes essenciais para o crescimento e metabolismo de leveduras,
favorecendo tanto a produo de etanol quanto a taxa de fermentao
(BFRNCOV et al. 1999). Por outro lado, o extrato de farelo de arroz foi
escolhido visando possvel substituio do extrato de levedura, por ser uma
opo menos dispendiosa. O extrato de farelo de arroz apresenta em sua
composio cerca de 12% de protenas, 11% de lipdeos, 43% de carboidratos e
10% de cinzas (DAL MORO et al., 2004). De acordo com a literatura, a utilizao
da uria como nica fonte de nitrognio no apresenta influncia positiva sobre o
consumo de acares e a produo de etanol pela levedura P. stipitis NRRL Y7124, entretanto quando associada a fontes de aminocidos, capaz de elevar a
converso de acares a etanol, bem como a velocidade do processo
(SLININGER et al. 2006).
No presente trabalho, os ensaios foram realizados de acordo com a matriz
experimental apresentada na Tabela 5.3, onde esto mostrados os nveis das
variveis e as concentraes utilizadas de cada nutriente, bem como o pH, o
consumo de acares (glicose e xilose) e a produo de etanol pela levedura P.
stipitis em hidrolisado hemicelulsico de bagao de malte, aps 72 horas de
fermentao. Observa-se que somente nos ensaios 1 e 3 (sem adio de
nutrientes e suplementado com uria, respectivamente), o consumo de acares
pela levedura P. stipitis ficou abaixo de 90%. Nota-se ainda que a adio de uria
ao meio de fermentao melhorou o consumo do substrato pela levedura, quando
comparado ao meio sem suplementao. Com relao produo de etanol,
verifica-se que no meio sem suplementao (ensaio 1), a concentrao de etanol
produzida pela levedura (10,7 g/L) foi cerca de 2 vezes menor do que a mxima

79

produo observada, 23,56 g/L no ensaio 5 (suplementado apenas com extrato

de levedura).
Ainda na Tabela 5.3, nota-se que quando o hidrolisado foi suplementado
com todos os nutrientes (ensaio 8), a produo de etanol (18,94 g/L) foi cerca de
20% menor do que a obtida apenas com a adio de extrato de levedura (ensaio
5). Este resultado mostra que a suplementao do hidrolisado hemicelulsico de
bagao de malte com o extrato de farelo de arroz, uria e extrato de levedura foi
prejudicial produo de etanol pela levedura P. stipitis, podendo-se ainda
sugerir um efeito negativo do extrato de farelo de arroz e da uria sobre o
bioprocesso, quando na presena do extrato de levedura.
Quanto ao pH final da fermentao, nota-se uma variao entre os ensaios
do planejamento (5,86 a 6,20), no sendo possvel relacion-la adio de um
nutriente especificamente ou da associao deste com outros.
Tabela 5.3. Planejamento fatorial do tipo 23, com trs repeties no ponto central
(mdia apresentada), visando avaliar o efeito da suplementao nutricional do
hidrolisado hemicelulsico de BM sobre o consumo de acares e a produo de
etanol, pela levedura P. stipitis
Nvel das Variveis

Consumo de
acares (%)

Produo
mxima de
etanol (g/L)

pH
final

Ensaio

EFA
(%v/v)

U
(g/L)

EL
(g/L)

71,63

10,70

5,86

20

92,43

16,05

5,86

82,04

14,24

5,86

20

97,11

16,72

5,86

98,08

23,56

6,15

20

95,95

21,86

5,81

98,50

19,38

6,20

20

98,18

18,94

6,18

9/10/11

10

1,5

1,5

98,63

16,50

6,11

acares: glicose+xilose; EFA: extrato de farelo de arroz; U: uria; EL: extrato de levedura.

Nas Figuras 5.1a e 5.1b so mostrados os perfis de consumo de acares

e cido actico, produo de etanol e formao de biomassa em cada ensaio do
planejamento. Com relao ao consumo de acares (Figura 5.1a), nota-se que

80

para

todos

os

meios

avaliados,

glicose

xilose

foram

assimilados

simultaneamente pela levedura. Alm disso, no foi observado o consumo de

arabinose, independente do meio de fermentao utilizado (dados no
mostrados). Duarte et al. (2008) estudando a produo de biomassa por Pichia
stipitis a partir do hidrolisado hemicelulsico de bagao de malte suplementado
com 3,0 g/L de extrato de levedura, aminocidos e minerais, observaram que a
levedura P. stipitis apresentou o mesmo comportamento observado no presente
trabalho, ou seja, glicose e xilose foram assimiladas simultaneamente e arabinose
no foi consumida pela levedura. Do mesmo modo, White, Yohannan e Walker
(2008), estudando a produo de etanol por P. stipitis em hidrolisado celulsico
de bagao de malte no suplementado, observaram que a levedura no utilizou
arabinose durante a fermentao. De fato, a literatura reporta um discreto
consumo de arabinose pela levedura P. stipitis aps a exausto de xilose,
entretanto este consumo direcionado para a produo de biomassa, mas no
para etanol (NIGAM, 2002). Nota-se que, tanto para o ensaio 1 (meio no
suplementado) quanto para o ensaio 3 (meio suplementado com uria) a xilose
no foi totalmente assimilada aps 72 horas de fermentao. Nestes ensaios
observa-se que as concentraes residuais de xilose no meio de fermentao,
foram superiores a 4,0 g/L (16,55 e 10,34 g/L, respectivamente), diferentemente
do observado para os demais ensaios. Embora a adio de uria ao hidrolisado
(ensaio 3) tenha melhorado o consumo de xilose pela levedura, quando
comparado ao meio no suplementado (ensaio 1), nos meios suplementados com
extrato de levedura e/ou extrato de farelo de arroz, o consumo de xilose foi
superior a 90%.
Estes resultados esto de acordo com dados reportados por Silva et al.
(2012) que estudaram o efeito da suplementao nutricional em meio
semissinttico composto por xilose sobre a produo de etanol. Os autores
observaram que a adio de 3,0 g/L de extrato de levedura e 2,3 g/L de uria
favoreceu o consumo do acar pela levedura P. stipitis NRRL Y-7124, entretanto
quando somente uria foi adicioanada ao meio, a xilose foi pobremente
consumida (<10%), mostrando a que a levedura necessita de outros nutrientes
alm do nitrognio, para uma eficiente converso de acares a etanol.

81

(a)

64
E1 (no suplementado)

56

Acares (g/L)

E2 (EFA)

48

E3 (U)

40

E4 (EFA+U)

32

E5 (EL)

24

E6 (EFA+EL)

16

E7 (U+EL)

E8 (EFA+U+EL)

E9 (ponto central)

24

48

72

96

tempo (h)

(b)

3,0

cido actico (g/L)

E1 (no suplementado)

2,4

E2 (EFA)
E3 (U)

1,8

E4 (EFA+U)
E5 (EL)

1,2

E6 (EFA+EL)
E7 (U+EL)

0,6

E8 (EFA+U+EL)

0,0

E9 (ponto central)

24

48

72

96

tempo (h)

Figura 5.1. Consumo de acares (glicose e xilose) (a) e cido actico (b) pela
levedura P. stipitis sob diferentes condies nutricionais, conforme ensaios do
planejamento fatorial 23, em hidrolisado hemicelulsico de bagao de malte.

82

Na Figura 5.1b nota-se que o cido actico presente (cerca de 2,0 g/L) foi
totalmente consumido aps 72 horas de fermentao, em todas as condies
nutricionais avaliadas, com excesso do ensaio 3 (hidrolisado suplementado
apenas com uria), onde o consumo total deste cido pela levedura foi observado
aps 96 horas. De fato, a literatura reporta a capacidade de P. stipits em utilizar o
cido actico como fonte de carbono para o seu metabolismo, realizando
consequentemente uma destoxificao in situ. Contudo, a capacidade da levedura
em destoxificar o prprio meio de fermentao enquanto produz etanol,
possivelmente s ocorre quando o pH do meio favorvel ao seu crescimento,
conforme relatado anteriormente e reportado por van Zyl et al. (1991).
Com relao produo de etanol (Figura 5.2a), nota-se uma grande
variao nos valores obtidos em funo da suplementao do meio de
fermentao. Verifica-se que a menor produo de etanol (14,33 g/L) foi
observada no ensaio 1 (no suplementado) aps 96 horas e, a maior (23,56 g/L)
no ensaio 5 (suplementado com extrato de levedura) aps 72 horas de
fermentao. Observa-se ainda que no ensaio 6 (suplementado com extrato de
farelo de arroz e extrato de levedura) a concentrao de etanol produzida pela
levedura foi similar (21,86 g/L) observada no ensaio 5 (suplementado apenas
com extrato de levedura), podendo-se concluir que somente o extrato de levedura
apresentou influncia sobre a produo de etanol, visto que a concentrao do
produto no aumentou quando este nutriente foi adicionado ao meio. De fato, a
suplementao de hidrolisados hemicelulsicos com extrato de levedura tem sido
reportada na literatura como sendo necessria para se alcanar uma
bioconverso eficiente, mostrando que este nutriente apresenta em sua
composio nutrientes essenciais ao metabolismo da levedura P. stipitis (SILVA,
et al. 2012; FERREIRA et al., 2011).
Os resultados observados a partir deste estudo reforam a importncia da
suplementao do hidrolisado hemicelulsico de bagao de malte com o extrato
de levedura para uma eficiente converso por P. stipitis. Como reportado por
Slininger et al. (2006), para se alcanar melhores valores de fator de converso e
produtividade em etanol pela levedura P. stipitis, a composio do meio de
fermentao deve apresentar no somente fontes de nitrognio, mas tambm
aminocidos, vitaminas, purinas e pirimidinas.

83

(a)

25
E1 (no suplementado)
E2 (EFA)

Etanol (g/L)

20

E3 (U)

15

E4 (EFA+U)
E5 (EL)

10

E6 (EFA+EL)
E7 (U+EL)

E8 (EFA+U+EL)
E9 (ponto central)

0
0

24

48

72

96

tempo (h)

(b)

10
E1 (no suplementado)

Biomassa (g/L)

E2 (EFA)
E3 (U)

E4 (EFA+U)
E5 (EL)

E6 (EFA+EL)
E7 (U+EL)

E8 (EFA+U+EL)

E9 (ponto central)

24

48

72

96

tempo (h)
Figura 5.2. Produo de etanol (a) e formao de biomassa (b) pela levedura P.
stipitis sob diferentes condies nutricionais, conforme ensaios do planejamento
fatorial 23, em hidrolisado hemicelulsico de bagao de malte.

84

Na Figura 5.2b so mostrados os perfis de crescimento da levedura P.

stipitis nos diferentes ensaios do planejamento. Nota-se que a formao de
biomassa variou de acordo com o meio de fermentao utilizado e que a menor
concentrao (7,27 g/L) foi obtida no ensaio 6 (suplementado com extrato de
farelo de arroz e extrato de levedura), enquanto que a maior (8,97 g/L) no ensaio
5 (suplementado com extrato de levedura).
importante ressaltar que mesmo quando nenhum nutriente foi adicionado
ao hidrolisado (ensaio 1) a levedura foi capaz de crescer, alcanando-se uma
concentrao de 8,67 g/L, aps 96 horas de fermentao. Desse modo, pode-se
inferir que o hidrolisado hemicelulsico de bagao de malte possui nutrientes
essenciais para o crescimento e metabolismo da levedura P. stipitis,
possibilitando seu crescimento mesmo sem suplementao.
Com base nos dados apresentados, pode-se concluir que a produo de
etanol em hidrolisado hemicelulsico de bagao de malte, pela levedura P. stipitis
requer a adio do extrato de levedura para que se obtenha uma converso
eficiente. Isto provavelmente se deve ao fato do hidrolisado empregado neste
estudo no apresentar as fontes nutricionais essenciais ao metabolisamo da
levedura, ou apresent-las em concentraes inferiores.
A Tabela 5.4 apresenta a matriz do planejamento 23 com os nveis reais
das variveis em estudo, assim como o fator de converso do substrato em etanol
(YP/S) e em clulas (YX/S), a produtividade volumtrica em etanol (QP) e a
velocidade de consumo de substrato (QS). Com relao ao YP/S, nota-se que
quando o hidrolisado foi suplementado com extrato de farelo de arroz (ensaio 2)
ou uria (ensaio 3), este parmetro aumentou apenas cerca de 14% em relao
ao meio sem suplementao (ensaio 1). Entretanto, a adio de extrato de
levedura (ensaio 5) resultou em um valor (0,44 g/g) cerca de 40% maior do que
ao observado para o meio sem suplementao (0,25 g/g).
Analisando os valores de QP observa-se um comportamento similiar ao
obtido para YP/S, isto , que a adio de extrato de farelo de arroz ou uria ao
hidrolisado aumentou a velocidade do processo em relao ao hidrolisado no
suplementado, contudo a suplementao com extrato de levedura (ensaio 5)
resultou no maior valor observado dentre todos os ensaios do planejamento,
atingindo um valor de 0,33 g/L.h.

85

A velocidade de consumo de substrato (QS) tambm foi elevada a partir da

suplementao do meio de fermentao com EFA, U ou EL. Observa-se que
somente no ensaio 1 e no ensaio 3, este parmetro apresentou valor abaixo de
0,7 g/L.h. Com relao ao YX/S, no foi possvel observar nenhuma correlao
desta resposta com a adio de extrato de farelo de arroz, uria e/ou extrato de
levedura ao hidrolisado.
Neste trabalho, a adio de 3,0 g/L de extrato de levedura ao hidrolisado
(ensaio 5) resultou em um aumento de 76% (0,25 para 0,44 g/g) e 120% (0,15
para 0,33 g/L.h) nos valores de YP/S e QP, respectivamente, quando comparado
ao ensaio 1 (hidrolisado no suplementado). Vale ressaltar que o estudo de
suplementao nutricional do hidrolisado de bagao de malte proporcionou no
somente um aumento nos parmetros fermentativos de P. stipitis, como tambm
possibilitou a reduo de nutrientes adicionados ao meio simplificando a sua
composio e consequentemente, diminuindo os custos do processo.
Tabela 5.4. Planejamento fatorial do tipo 23, com trs repeties no ponto central
(mdia apresentada), visando avaliar o efeito da suplementao nutricional do HHBM
sobre a converso do substrato em etanol e em clulas, a produtividade em etanol e
a velocidade de consumo de substrato, por P. stipitis.
Nvel das Variveis

Parmetros Fermentativos

Ensaio

EFA
(%v/v)

U
(g/L)

EL
(g/L)

YP/S
(g/g)

YX/S
(g/g)

QP
(g/L.h)

QS
(g/L.h)

0,25

0,13

0,15

0,59

20

0,29

0,09

0,22

0,73

0,29

0,11

0,20

0,66

20

0,30

0,07

0,23

0,77

0,44

0,13

0,33

0,74

20

0,40

0,07

0,30

0,76

0,33

0,07

0,27

0,82

20

0,34

0,10

0,26

0,77

9/10/11

10

1,5

1,5

0,33

0,10

0,23

0,74

EFA: extrato de farelo de arroz; EL: extrato de levedura; YP/S: rendimento em etanol;
YX/S:rendimento em clulas; QP:produtividade volumtrica em etanol; QS: velocidade de consumo
de substrato.

86

5.2.1 Anlise estatstica dos resultados

O efeito da suplementao nutricional do hidrolisado hemicelulsico de
bagao de malte sobre o fator de converso do substrato em etanol (YP/S) e em
clulas (YX/S), a produtividade volumtrica em etanol (QP) e a velocidade de
consumo de substrato (QS), foi estudado de maneira mais detalhada atravs das
anlises estatsticas. A Figura 5.3 apresenta os grficos de Pareto onde so
mostradas as estimativas dos valores padronizados dos efeitos sobre cada
resposta estudada. Os valores dos efeitos (t calculado) so comparados ao t de
Student tabelado (linha pontilhada) para o nmero de graus de liberdade do
experimento e o nvel de confiana desejado, que neste caso foi de 95%. Efeitos
com valores maiores que o t tabelado so considerados significativos e so
representados pelas barras dos grficos.
Com relao ao YP/S (Figura 5.3a) e QS (Figura 5.3d), observa-se que
dentre os nutrientes avaliados, somente o extrato de levedura apresentou efeito
significativo e positivo sobre a converso do substrato em etanol (+4,07) e a
velocidade de consumo de substrato (+3,61). Quanto ao YX/S (Figura 5.3b)
nenhuma das variveis apresentam significncia estatstica sobre este parmetro.
Analisando QP (Figura 5.3c) nota-se que alm do efeito positivo do extrato de
levedura (+10,56), foi observada uma interao negativa entre as variveis 2
extrato de farelo de arroz e uria (-3,84) e extrato de farelo de arroz e extrato de
levedura (-3,36), evidenciando o efeito negativo do extrato de farelo de arroz e da
uria, quando adicionados juntamente com o EL. Com base na anlise estatstica,
verifica-se uma concordncia entre esta e a anlise direta dos resultados, sendo o
extrato de levedura o nico, dentre os nutrientes avaliados, a apresentar efeito
positivo sobre a converso de acares a etanol pela levedura P. stipitis.
Foram realizadas anlises de varincia para as respostas YP/S, YX/S, QP, QS
(anexo) e foram observados coeficientes de correlao (R2) de 0,89, 0,63, 0,98 e
0,87, respectivamente, o que demonstra a relevncia dos fatores experimentais
sobre tais respostas.

87

Figura 5.3. Grficos de Pareto representando as estimativas dos efeitos a 95% de confiana e erro puro com 3 graus de liberdade (t =
3,18) para as variveis resposta: YP/S (a), YX/S (b), QP (c), QS (d).

88

A suplementao nutricional de hidrolisados hemicelulsicos tem sido

amplamente estudada visando melhorar o desempenho da levedura durante o
processo fermentativo, entretanto deve-se considerar a espcie e/ou linhagem da
levedura

utilizada

consequentemente

suas

necessidades

nutricionais.

Adicionalmente, a composio qumica dos hidrolisados, bem como os mtodos

de pr-tratamento utilizados influenciam na constituio final do hidrolisado e na
necessidade ou no de suplementao nutricional do mesmo. Vrios trabalhos da
literatura

relatam

estudos de

suplementao

nutricional de

hidrolisados

objetivando um melhor desempenho da levedura durante o processo fermentativo.

Eken-Saraoglu e Arslan (2000) utilizando o hidrolisado hemicelulsico de sabugo
de milho (35 g/L de acares totais) suplementado com uria (6,4 g/L), KH2PO4
(1,2 g/L), Na2HPO4 (0,18 g/L), extrato de levedura (10 g/L) e diversas fontes
minerais, obtiveram valores para YP/S e QP de 0,34 g/g e de 0,11 g/L.h,
respectivamente, durante a fermentao de P. stipitis NRRL Y-7124. Empregando
o hidrolisado hemicelulsico de madeira (39 g/L de acares totais),
suplementado com extrato de levedura (3 g/L), peptona (5 g/L), KH2PO4 (2 g/L),
(NH4)2SO4 (1 g/L), MgSO4.7H20 (0,5 g/L) e traos de minerais, Nigam (2001b)
obteve um fator de converso de 0,25 g/g e produtividade volumtrica em etanol
de 0,10 g/L.h, a partir da mesma levedura. Verifica-se que os resultados obtidos a
partir da suplementao do hidrolisado de bagao de malte com 3 g/L de extrato
de levedura so promissores quando comparados aos dados acima reportados,
visto que apesar de empregar uma suplementao relativamente complexa, os
autores alcanaram valores de YP/S e QP consideravelmente inferiores aos
reportados no presente estudo (0,44 g/g e 0,33 g/L.h, respectivamente).

5.3 Efeito da concentrao do extrato de levedura e do pr-cultivo de Pichia

stipitis em HHBM sobre a produo de etanol.

Tendo em vista que dentre os nutrientes avaliados, somente o extrato de

levedura apresentou efeito significativo positivo sobre a produo de etanol pela
levedura P. stipitis, foram realizados ensaios visando avaliar a influncia de
diferentes concentraes deste nutriente sobre a bioconverso. Adicionalmente,
foram realizados ensaios onde a levedura foi cultivada no prprio hidrolisado,
aps 24 horas de cultivo em meio semissinttico. Este estudo teve como objetivo,

89

a aclimatao da levedura ao hidrolisado hemicelulsico de bagao de malte e

consequentemente, a reduo dos possveis efeitos inibitrios conferidos pela
presena de compostos de degradao de acares e lignina, bem como de cido
actico neste meio.
O efeito da adio de extrato de levedura sobre o consumo de acares e
a produo de etanol, foi avaliado empregando-se concentraes de 0 a 5,0 g/L
deste nutriente ao HHBM e os resultados so apresentados na Figura 5.4. Os
resultados mostram que a adio deste nutriente em concentraes abaixo de 3,0
g/L ao hidrolisado resultam em um consumo mais lento de acares pela levedura
P. stipitis. Nota-se na Figura 5.4a que a levedura consumiu a xilose mais
rapidamente medida que se elevou a concentrao do extrato de levedura at
3,0 g/L, sendo observada uma assimilao quase que total (90%) aps 72 horas
de fermentao. Entretanto, quando foram adicionados 4,0 e 5,0 g/L deste
nutriente, o consumo de acares no foi favorecido. Comportamento similar foi
observado para a produo de etanol, cerca de 20,0 g/L em todos os ensaios,
independente da concentrao de extrato de levedura utilizada. Contudo, esta
produo foi observada em 72 horas quando utilizou-se 3 e 4 g/L do nutriente.
Desse modo, conclui-se que a adio de 3,0 g/L de extrato de levedura, dentre as
concentraes avaliadas neste estudo, possibilitou alcanar resultados superiores
em relao ao consumo de substrato e produo de etanol.
A Figura 5.5 apresenta os parmetros fermentativos de P. stipitis obtidos a
partir das diferentes concentraes de extrato de levedura avaliadas. possvel
observar que os maiores valores para o fator de converso de substrato (0,40 g/g)
e para a produtividade volumtrica em etanol (0,30 g/L.h) foram obtidos a partir
da adio de 3,0 g/L de extrato de levedura ao HHBM. A velocidade de consumo
de substrato foi cerca de 17% maior (comparado aos valores obtidos pela adio
de 1 e 2 g/L) utilizando-se as concentraes de 3 e 4 g/L de extrato de levedura,
0,7 g/L.h. Por outro lado, o fator de converso do substrato em clulas mostrou
uma reduo at a concentrao de 3,0 g/L de extrato de levedura e manteve-se
praticamente constante nas concentraes de 4,0 e 5,0 g/L. Assim, os resultados
obtidos a partir deste estudo confirmam que a adio de 3,0 g/L de extrato de
levedura ao hidrolisado de bagao de malte favoreceu a bioconverso por P.
stipitis, resultando valores superiores de YP/S e QP, se comparados s outras
concentraes avaliadas.

90

(a)

Acares (g/L)

60
50

sem EL

40

1 g/L
2 g/L

30

3 g/L

20

4 g/L
5 g/L

10
0
0

48

24

72

96

tempo (h)

(b)

25

Etanol (g/L)

20
sem EL

15

1 g/L
2 g/L

10

3 g/L
4 g/L

5 g/L

0
0

24

48

72

96

tempo (h)
Figura 5.4. Consumo de acares (glicose e xilose) (a) e produo de etanol (b) por
P. stipitis, a partir da
a suplementao do hidrolisado hemicelulsico
hemicelulsico de bagao de
malte com diferentes concentraes
ntraes de extrato de levedura.

91
(a)

(b)

0 ,4 0

0 ,2 0

0 ,1 6

(g/L)

0 ,1 2

X/S

0 ,3 0

P/S

(g/g)

0 ,3 5

0 ,0 8

0 ,2 5
0 ,0 4

0 ,2 0

0 ,0 0

(c)

(d)
0 ,8

0 ,2 5

0 ,7

0 ,2 0

0 ,6

Q (g/L.h)

0 ,3 0

0 ,1 5

0 ,5

Q (g/L.h)

E x tra to d e le v e d u ra (g /L)

Extrato d e le ve d u ra (g/L)

0 ,1 0

0 ,4

0 ,0 5

0 ,3

0 ,0 0

0 ,2

E x tra to d e le v e d u ra (g /L)

E x tra to d e le v e d u ra (g /L)

Figura 5.5. Influncia de diferentes concentraes de extrato de levedura na bioconverso do HHBM por Pichia stipitis, sob os parmetros
fermentativos. (a): converso do substrato em etanol; (b): converso do substrato em clulas; (c): produtividade em etanol; (d): velocidade de
consumo de substrato. EL: extrato de levedura.

92

Posterior ao estabelecimento da concentrao de extrato de levedura a ser

adicionada ao hidrolisado de bagao de malte, foram realizados ensaios onde a
levedura P. stipitis foi cultivada em hidrolisado aps o cultivo em meio
semissinttico. Nestes ensaios foram avaliados o consumo de acares e a
produo de etanol, bem como os parmetros fermentativos (YP/S, YP/x, QP, Q/S),
sendo que tais resultados foram comparados aos obtidos a partir do cultivo da
levedura em meio semissinttico (Figura 5.6).
Com relao ao consumo de acares, observa-se que a levedura prcultivada em hidrolisado de bagao de malte foi capaz de consumir cerca de 80%
dos acares presentes (glicose e xilose), aps 48 horas de fermentao,
enquanto que a partir do pr-cultivo em meio semissinttico, apenas 38% dos
acares foram consumidos. Similar ao observado para o consumo de xilose, a
velocidade de produo de etanol foi maior quando a levedura foi cultivada em
hidrolisado. Nestas condies nota-se uma concentrao de etanol de 18,14 g/L,
ou seja, 132% maior do que a observada a partir do cultivo da levedura em meio
semissinttico (7,8 g/L). Entretanto, o consumo total de acares e a mxima
produo de etanol foram alcanados aps 72 horas para a levedura cultivada em
hidrolisado, e neste tempo, os valores observados a partir do cultivo da levedura
em meio semissinttico foram similares.
A partir destes resultados pode-se concluir que o cultivo da levedura em
hidrolisado aumentou a velocidade de consumo de substrato, do mesmo modo
que a produo de etanol foi mais rpida. Contudo, a concentrao mxima de
etanol no foi favorecida.
A Tabela 5.5 apresenta os parmetros fermentativos da levedura P. stipitis
pr-cultivada em meio semissinttico (MSS) e em hidrolisado. Verifica-se que o
cultivo da levedura em HHBM favoreceu as velocidades do processo, isto ,
aumentou a produtividade volumtrica em etanol e a velocidade de consumo de
substrato em 23% (0,26 para 0,32 g/L.h) e 10% (0,71 para 0,78 g/L.h)
respectivamente. Vale ressaltar que, provavelmente o final da fermentao pela
levedura cultivada em hidrolisado foi anterior a 72 horas e desse modo, os valores
para os parmetros obtidos sob esta condio seriam superiores aos observados.

60

25

50

20

40

15

30
10

20
10

0
0

24

48

tempo (h)

72

Etanol (g/L)

Acares (g/L)

93

96

Figura 5.6. Consumo de xilose (a) e produo de etanol (b) por P. stipitis, a partir do
cultivo da levedura em meio semissinttico ()
( e do cultivo em duas etapas: meio
semissinttico pelo cultivo em hidrolisado de bagao de malte ().
).

Tabela 5.5. Parmetros da fermentao por P. stipitis cultivada em meio

semissinttico e em hidrolisado de bagao de malte,
malte, aps 72 horas de fermentao.

Meio de cultivo

Parmetros
Meio semissinttico

MSS + Hidrolisado
Hemicelulsico de BM

YP/S (g/g)

0,40

0,40

YX/S (g/g)

0,14

0,16

QP (g/L.h)

0,26

0,30

QS (g/L.h)

0,71

0,78

MSS: meio semissinttico

94

Assim, verificou-se que o cultivo as clulas em hidrolisado favoreceu a

fermentao de P. stipitis em HHBM, possivelmente por diminuir o efeito inibitrio
dos furanos, compostos de degradao da lignina e principalmente do cido
actico, presentes no meio. Conforme reportado por Nigam (2001b), a adaptao
de leveduras aos meios de fermentao contendo compostos inibidores pode
melhorar os parmetros fermentativos.

5.4 Otimizao das condies de pH e concentrao de clulas sobre a

produo de etanol por Pichia stipitis, em HHBM no destoxficado
Diversos fatores podem influenciar a produo de etanol por leveduras,
entre eles o pH e a concentrao inicial de clulas. O pH um importante fator
para este processo, especialmente quando so empregados hidrolisados
hemicelulsicos como meio de fermentao, os quais apresentam em sua
composio, uma gama de compostos potencialmente inibidores ao metabolismo
microbiano. Du Preez et al. (1994) reportou que na fermentao de xilose em
meio semissinttico por P. stipitis, o pH timo ficou entre 4,0 e 5,5, sendo o pH 4,5
mais recomendvel, por minimizar a possibilidade de contaminao. Contudo,
para o estabelecimento destas condies deve-se considerar no somente a
fisiologia do microrganismo, mas tambm a composio do hidrolisado
empregado no processo. De acordo com van Zyl et al. (1991), o cido actico
presente nos hidrolisados obtidos a partir da hidrlise com cido diludo pode ter
seu efeito minimizado, utilizando-se valores mais elevados de pH. Do mesmo
modo, a concentrao inicial de clulas favorece no somente a velocidade de
fermentao, como tambm pode ser utilizada como estratgia para contornar os
efeitos inibitrios do cido actico e dos produtos de degradao presentes
nohidrolisado, sobre P. stipitis (OLSSON; HAHN-HAGERDAL, 1996; AGBOGBO
et al. 2007).
Desse modo, visando otimizar as condies para a produo de etanol em
hidrolisado de bagao de malte pela levedura P. stipitis, foi empregado um
planejamento fatorial 22 composto com face centrada, onde avaliou-se o efeito da
variao de pH e da concentrao inicial de clulas (X0). A fim de identificar e
quantificar o efeito individual de cada varivel experimental e de suas interaes
sobre o processo, a fermentao foi realizada sob pH 4,5, 5,5 ou 6,5 e as

95

concentraes iniciais de clulas de 1,0, 3,0 e 5,0 g/L foram empregadas. Vale
ressaltar que foram empregadas neste estudo as condies estabelecidas nos
ensaios anteriores, portanto o inculo foi preparado diretamente em hidrolisado de
bagao de malte contendo 30,0 g/L de xilose, suplementado com 3 g/L de extrato
de levedura, eliminando-se portanto, a etapa de pr-cultivo em meio
semissinttico.
A Tabela 5.6 apresenta a matriz experimental com os nveis reais de cada
varivel, assim como o consumo de acares, a produo de etanol de etanol e a
variao de pH nos diferentes ensaios do planejamento, aps 36 horas de
fermentao. Verifica-se que independente da concentrao celular empregada,
quando utilizou-se hidrolisado com pH de 4,5, no houve consumo de acares
(glicose e xilose) e produo de etanol pela levedura, indicando que o aumento da
concentrao inicial de clulas no foi suficiente para superar o efeito inibitrio
causado pelo pH cido do meio. De fato como j reportado por Verduyn et al.
(1990), fermentaes realizadas em pH cido inibem o metabolismo da levedura,
mesmo na ausncia de cidos fracos. Isto se deve ao aumento do gradiente de
prtons atravs da membrana plasmtica, resultando na absoro passiva de
prtons pela clula, acidificando assim, o pH intracelular.
Nota-se ainda que em pH 6,5, a levedura foi capaz de consumir acima de
80% dos acares presentes no hidrolisado e produzir a mxima concentrao de
etanol observada, que ficou em torno de 23,0 g/L, sugerindo portanto, que o
aumento da concentrao inicial de clulas neste valor de pH no mostrou grande
diferena sobre estes resultados. Porm, grandes variaes foram observadas a
partir do aumento da concentrao celular em pH 5,5. Os resultados mostram
claramente que neste pH o aumento da concentrao inicial de clulas resultou
em um aumento aproximadamente 145% a mais de substrato consumido em 36
horas e 67% na concentrao mxima de etanol, quando comparados os ensaios
5 (X0 = 1,0 g/L) e 6 (X0 = 5,0 g/L). Tais resultados esto de acordo com o
observado por Agbogbo et al. (2007) ao estudar o efeito da concentrao inicial
de clulas sobre a fermentao de xilose por P. stipitis, em meio semissinttico
(pH 6,3). Estes autores relataram que o aumento da concentrao celular de 1,82
g/L para 6,45 g/L, elevou a produtividade volumtrica em etanol em 50%, contudo
o fator de converso de substrato em etanol no sofreu alterao. Alm disso, o
aumento do pH do meio de fermentao resulta na forma dissociada de diversos

96

compostos inibidores, tornando-os assim menos txicos para a clula. Desse

modo, o aumento de 1 unidade de pH foi suficiente para que as clulas presentes
conseguissem superar o efeito dos inibidores presentes no hidrolisado.
Com relao variao do pH do meio durante as fermentaes, verificase que os valores no sofreram alterao durante o processo, com exceo do
ensaio 1 (pH 4,5 e X0 = 1,0 g/L) em que foi verificado uma discreta queda, cerca
de 0,25 unidades.
Tabela 5.6. Planejamento fatorial do tipo 22, com trs repeties no ponto central
(mdia apresentada), visando avaliar o efeito do pH e da concentrao inicial de
clulas (X0) sobre o consumo de acares e a produo de etanol pela levedura P.
stipitis, em hidrolisado hemicelulsico de BM aps 36 horas de fermentao.

Nveis das Variveis

Parmetros

Ensaio
pH

X0 (g/L)

Consumo de
acares (g/L)

Produo de
etanol (g/L)

pH

4,5

1,0

0,00

0,00

4,25

6,5

1,0

83,42

22,05

6,40

4,5

5,0

0,00

0,00

4,44

6,5

5,0

100,00

23,42

6,41

5,5

1,0

27,16

8,10

5,49

5,5

5,0

66,68

13,57

5,49

4,5

3,0

0,00

0,00

4,44

6,5

3,0

100,00

22,83

6,49

9/10/11

5,5

3,0

38,02

9,63

5,62

acares: glicose e xilose; X0: concentrao inicial de clulas

A Figura 5.7 mostra o perfil da levedura P. stipitis nos ensaios do

planejamento fatorial 22. Verifica-se que nas fermentaes realizadas em pH 4,5,
tanto o consumo de acares quanto o de cido actico pela levedura foram
fortemente afetados, visto que esta no foi capaz de consumir tais compostos
nesta condio, independente da concentrao celular empregada. Contudo, at
mesmo para o consumo de glicose, que dependente de enzimas constitutivas,
foi observada inibio neste pH, verificando-se apenas um consumo de cerca de
30% quando a concentrao inicial de clulas foi de 5,0 g/L (Figura 5.7a).

(a)

Glicose (g/L)

7,5

5,0

2,5

0,0
0

12

24

36

tempo (h)

48

60

72

(b)
70

Xilose (g/L)

60
50
40
30
20
10
0
0

12

(c)

cido actico (g/L)

3,5
3,0
2,5
2,0
1,5
1,0
0,5
0,0
0

12

Figura 5.7. Consumo de glicose (a), xilose (b) e de cido actico

hidrolisado hemicelulsico de BM,
BM sob diferentes condies de pH e concentrao inicial
de clulas, conforme ensaios do planejamento fatorial 22. Ponto
ensaios realizados sob pH 5,5 e 3 g/L de clulas.

98

Na Figura 5.7b nota-se que o consumo de xilose pela levedura foi

favorecido pelo aumento do pH do meio mostrando uma assimilao mais rpida
em pH 6,5, que por sua vez, no foi influenciado pela concentrao inicial de
clulas, como relatado anteriormente. Por outro lado, em pH 5,5 observa-se que o
consumo foi mais rapidamente consumida medida que a concentrao inicial de
clulas foi aumentada.
Com relao ao consumo de cido actico, verifica-se que a levedura foi
capaz de destoxificar o hidrolisado em pH 5,5 e 6,5, e que tanto pH quanto a
concentrao inicial de clulas favoreceram o consumo mais rpido deste cido.
Isto fica claro quando analisa-se este consumo em pH 6,5, pois a utilizao de
nveis maiores de X0 (3,0 ou 5,0 g/L) resultaram num consumo mais rpido (12
horas antes) quando comparado 1 g/L de clulas (ensaio 2).
Tais resultados mostram que a levedura assimilou mais rapidamente o
cido actico quando foram empregados os nveis mximos de pH e
concentrao inicial de clulas. Estes dados esto de acordo com os relatos de
van Zyl et al. (1991), ou seja, que a utilizao de pH 6,5 pode ser uma estratgia
eficiente para minimizar o efeito inibidor cido actico e dos compostos de
degradao da lignina sobre a bioconverso por P. stipitis. Alm disso, vale
ressaltar que o efeito inibidor do cido actico foi altamente intensificado quando
associado ao pH cido do meio de fermentao.
A Figura 5.8 apresenta a produo de etanol e a formao de biomassa
pela levedura P. stipitis sob diferentes condies de pH e concentrao inicial de
clulas, em hidrolisado de bagao de malte. Do mesmo modo que observado para
o consumo de acares e cido actico, para a produo de etanol (Figura 5.8a),
nota-se que, o pH 6,5 favoreceu a formao do produto pela levedura, quando
comparado ao pH 5,5. Adicionalmente nos ensaios em pH 6,5 a mxima
concentrao de etanol foi observada 12 horas antes (cerca de 23,0 g/L), quando
empregou-se concentraes celulares mais altas (3 ou 5 g/L), mostrando que o
aumento da concentrao inicial de clulas acelerou o processo de bioconverso
por P. stipitis.
Os perfis de crescimento da levedura P. stipitis nas diferentes condies do
planejamento 22, so mostrados na Figura 5.8b.

99

(a)
30

Etanol (g/L)

25

E1 (pH 4,5+1 g/L)

E2 (pH 6,5+1 g/L)

20

E3 (pH 4,5+5 g/L)

15

E4 (pH 6,5+5 g/L)

E5 (pH 5,5+1 g/L)

10

E6 (pH 5,5+5 g/L)

E7 (pH 4,5+3 g/L)

E8 (pH 6,5+3 g/L)

E9 (ponto central)

0
0

12

24

36

48

60

72

tempo (h)

(b)

Biomassa (g/L)

16
14

E1 (pH 4,5+1 g/L)

12

E2 (pH 6,5+1 g/L)

10

E3 (pH 4,5+5 g/L)

E4 (pH 6,5+5 g/L)

E5 (pH 5,5+1 g/L)

E6 (pH 5,5+5 g/L)

E7 (pH 4,5+3 g/L)

E8 (pH 6,5+3 g/L)

E9 (ponto central)

0
0

12

24

36

48

60

72

tempo (h)

Figura 5.8. Produo de etanol (a) e formao de biomassa (b)

( por P. stipitis em
hidrolisado hemicelulsico de BM,
BM sob diferentes condies de pH e concentrao inicial
de clulas, conforme ensaios do planejamento fatorial 22. Ponto central: mdia dos
ensaios realizados sob pH 5,5 e 3 g/L de clulas.

100

Observa-se que nos ensaios realizados em pH 4,5, houve um discreto

crescimento da levedura nas primeiras 12 horas de fermentao, entretanto a
concentrao celular manteve-se estvel aps este tempo. Por outro lado, nos
ensaios realizados em pH 5,5 e 6,5 nota-se crescimento celular at o tempo final
da fermentao (72 horas), com exceo do ensaio 8 (pH 6,5 e X0 = 3,0 g/L) que
apresentou um decrscimo na concentrao celular aps 36 horas de
fermentao. Adicionalmente, a menor formao de biomassa (diferena entre
concentrao de clulas inicial de final) foi observada no ensaio 8 (pH 5,5 e
X0=3,0 g/L) e a maior no ensaio 5 (pH 5,5 e X0=1,0 g/L). Silva (2001) estudando o
efeito do cido actico sobre a produo de xilitol por Candida guilliermondii em
meio semissinttico, observou que o potencial inibitrio do cido actico no est
relacionado somente sua concentrao no meio, mas tambm fase de
crescimento da levedura. Portanto, a sua adio na fase inicial do processo
fermentativo teve maior impacto sobre a formao de biomassa.
Na Tabela 5.7 mostrada a matriz do planejamento fatorial composto 22
com face centrada, assim como o fator de converso de substrato em etanol
(YP/S) e em clulas (YX/S), a produtividade volumtrica em etanol (QP), a
velocidade de consumo de substrato (QS) e a eficincia de converso (%) nos
diferentes ensaios. Quanto ao YP/S e QP, nota-se que os maiores valores (em
torno de 0,40 g/g e 0,64 g/L.h, respectivamente) foram observados nos ensaios
realizados sob pH 6,5, entretanto somente para a produtividade volumtrica em
etanol o aumento da concentrao inicial de clulas foi favorvel, resultando em
um valor de QP 27% maior, quando comparado ao ensaio 2 (X0 = 1,0 g/L).
Comportamento similar foi observado para a velocidade de consumo de substrato,
sendo os maiores valores obtidos a partir da fermentao em pH 6,5 (cerca de 1,7
g/L). Desse modo, as variveis testadas neste estudo (pH e X0) favoreceram o
processo de converso dos acares a etanol em HHBM, medida em que seus
nveis foram elevados.
Considerando a converso do substrato em clulas (YX/S), observa-se que
em pH 4,5 a levedura apresentou um discreto crescimento nas primeiras horas,
resultando em um valor de YX/S em torno de 0,10 g/g.

101

Tabela 5.7. Matriz do planejamento fatorial composto 22 com face centrada, para
avaliao do efeito do pH e da concentrao inicial de clulas sobre a fermentao do
HHBM pela levedura P. stipitis.

Nveis Reais das

Variveis

Parmetros fermentativos

Ensaio
pH

X0 (g/L)

YP/S
(g/g)

YX/S
(g/g)

QP
(g/L.h)

QS
(g/L.h)

4,5

1,0

Nd

0,10

nd

nd

6,5

1,0

0,42

0,15

0,51

1,27

4,5

5,0

Nd

0,10

nd

nd

6,5

5,0

0,40

0,14

0,65

1,60

5,5

1,0

0,39

0,14

0,32

0,84

5,5

5,0

0,35

0,11

0,38

1,05

4,5

3,0

Nd

0,09

nd

nd

6,5

3,0

0,41

0,14

0,63

1,75

9/10/11

5,5

3,0

0,37

0,12

0,38

0,84

X0: concentrao inicial de clulas; nd: no determinado

Tais resultados relacionam-se provavelmente tentativa de adaptao da

levedura a um meio hostil, causado no somente pelo pH cido como tambm
pela presena de compostos inibidores presentes no hidrolisado. Entretanto, nos
meios com pH 5,5 e 6,5 nota-se que tais condies foram favorveis ao
crescimento da levedura, independente da concentrao inicial de clulas
empregada.
Os resultados mostram a grande influncia do pH sobre estes parmetros
e, alm disso, evidencia que o aumento da concentrao inicial de clulas
favorece a produtividade volumtrica em etanol, conforme reportado por Olsson e
Hahn-Hgerdal (1996); Agbogbo et al. (2007); Ferreira et al. (2011). De fato, o
aumento da concentrao celular resulta em maior nmero de clulas viveis,
disponveis para a formao de produto e, portanto uma concentrao de produto
maior pode ser vista num perodo de fermentao mais curto.
A partir dos resultados alcanados pode-se concluir que a utilizao de pH
6,5 juntamente com a concentrao inicial de clulas de 5,0 g/L na fermentao
por P. stipitis, foi uma estratgia eficiente para minimizar o efeito inibidor cido
actico e dos compostos de degradao da lignina presentes no HHBM.

102

5.4.1 Anlise estatstica do Planejamento Fatorial Composto 22 com face

centrada, para avaliao do efeito do pH e da concentrao inicial de
clulas.

A Tabela 5.8 apresenta a anlise de varincia (ANOVA) realizada para as

respostas avaliadas neste estudo (pH e concentrao inicial de clulas), onde so
apresentados os efeitos estatisticamente significativos (em negrito), bem como a
contribuio de cada varivel para o processo.
Os resultados da anlise estatstica confirmaram os efeitos sugeridos pela
anlise direta dos dados, ou seja, o aumento do valor do pH exerceu um efeito
positivo sobre todos os parmetros fermentativos avaliados, enquanto que o
aumento da concentrao inicial de clulas apresentou efeito positivo somente
sobre a produtividade volumtrica em etanol, ao nvel de 95% de confiana. No
foram observados efeitos de interao entre pH e concentrao inicial de clulas
para todas as respostas.
Verifica-se que o coeficiente de correlao (R2) para YP/S, YX/S, QP e QS foi
superior a 0,80 demonstrando a relevncia estatstica dos fatores experimentais
sobre as respostas avaliadas. Nota-se ainda que o pH (linear) foi o fator que
apresentou maior contribuio para todas as respostas. O efeito quadrtico do pH
foi significativo para todas as respostas, exceto para a converso do substrato em
clulas, sendo que para YP/S, esta varivel apresentou uma contribuio de cerca
de 20%. Adicionalmente, com relao produtividade volumtrica em etanol, foi
observado um efeito positivo da concentrao inicial de clulas sobre esta
resposta (contribuio de 1,17%).

103

Tabela 5.8. Anlise de varincia com erro total para os principais efeitos e suas
interaes, durante a fermentao do hidrolisado hemicelulsico de BM por P. stipitis,
sob diferentes condies de pH (1) concentrao inicial de clulas (2).
Varivel
Resposta

YP/S (g/g)

R2 = 0,98
Varivel
Resposta

YX/S (g/g)

R2 = 0,89
Varivel
Resposta

QP (g/L.h)

R2 = 0,99
Varivel
Resposta

QS (g/L.h)

R2 = 0,98

Fatores

SQ

GL

MQ

1 (L)
1 (Q)
2 (L)
2 (Q)
1*2
Erro

0,2521
0,0676
0,0006
0,0000
0,0001
0,0037

1
1
1
1
1
5

0,25215
0,06765
0,00060
0,00006
0,00010
0,00075

334,09
89,64
0,79
0,01
0,13

0,0000
0,0002
0,4134
0,9306
0,7307

Contribuio
(%)
76,62
20,54
0,18
0,00
0,03

Total

0,3290

10

Fatores

SQ

GL

MQ

Contribuio
(%)

1 (L)
1 (Q)
2 (L)
2 (Q)
1*2
Erro

0,0032
0,0000
0,0002
0,0001
0,0000
0,0004

1
1
1
1
1
5

0,00326
0,00003
0,00026
0,00010
0,00002
0,00008

38,83
0,41
3,17
1,20
0,29

0,0015
0,5507
0,1351
0,3230
0,6090

80,00
0,75
5,00
2,50
0,50

Total

0,0040

10

Fatores

SQ

GL

MQ

1 (L)
1 (Q)
2 (L)
2 (Q)
1*2
Erro

0,5340
0,0093
0,0066
0,0016
0,0049
0,0041

1
1
1
1
1
5

0,53401
0,00936
0,00666
0,00168
0,00490
0,00082

645,71
11,31
8,06
2,03
5,92

0,0000
0,0200
0,0362
0,2128
0,0590

Contribuio
(%)
94,71
1,64
1,17
0,28
0,86

Total

0,5638

10

Fatores

SQ

GL

MQ

Contribuio
(%)

1 (L)
1 (Q)
2 (L)
2 (Q)
1*2
Erro

3,5574
0,0741
0,0486
0,0258
0,0272
0,0499

1
1
1
1
1
5

3,55740
0,07412
0,04860
0,02586
0,02722
0,00999

355,84
7,41
4,86
2,58
2,72

0,0000
0,0416
0,0786
0,1686
0,1598

93,22
1,94
1,27
0,67
0,71

Total

3,8160

10

1 (L): pH linear; 2 (L): concentrao inicial do clulas linear; 1 (Q): pH quadrtico; 2 (Q):
concentrao inicial do clulas quadrtico;SQ: soma quadrtica; GL: grau de liberdade; MQ: mdia
quadrtica.

104

Foram realizadas ento, anlises de varincia de regresso onde se

observa que os coeficientes de correlao (R2) para as principais respostas
relacionadas a produo de etanol, isto , YP/S e QP (Tabela 5.9).
Todavia, visando otimizao das condies utilizadas, as respostas foram
maximizadas em conjunto, selecionando convenientemente os critrios de forma
que as variveis independentes fossem mantidas na faixa em estudo e os valores
estimados para as respostas, dentro de uma faixa que permitisse a sobreposio
dos modelos. Portanto, considerando-se o fator de converso de substrato e a
produtividade volumtrica em etanol, os valores encontrados foram pH 6,4 (nvel
codificado +0,92) e concentrao inicial de clulas de 5,0 g/L (valor codificado
+1,0).
Foram excludos termos sem significncia para o modelo visando a
melhora do mesmo. Desse modo, para YP/S foram excludas a concentrao inicial
de clulas linear e quadrtica, assim como a interao entre esta e a varivel pH.
Por outro lado, para a varivel resposta QP, somente a concentrao inicial de
clulas quadrtica foi excluda do modelo. Assim, com base nos resultados
obtidos a partir desta anlise, foi possvel determinar modelos empricos para
descrever o efeito do pH (A) e da concentrao inicial de clulas (B) sobre a
converso do substrato em etanol (Y1) e a produtividade volumtrica em etanol
(Q1), na regio estudada, sendo mostrados na Tabela 5.10.
Os modelos matemticos obtidos mostraram-se significativos (p <0,001) e
no apresentaram falta de ajuste ao nvel de 95% de confiana, o que significa
que a diferena entre os valores obtidos experimentalmente e os valores previstos
pela equao pode ser explicada pelo erro experimental.
As superfcies de resposta descritas pelas equaes do modelo para a
converso do substrato (a) e a produtividade em etanol (b) (Figura 5.9) mostram
claramente que a utilizao dos nveis mximos de pH (5,5) e X0 (6,5)
contribuiram para o aumento da velocidade de produo de etanol. Alm disso, o
aumento do pH tambm favoreceu a converso do substrato em etanol.

105

Tabela 5.9. Anlise de varincia de regresso para os modelos representativos da

converso do substrato em etanol (YP/S) e produtividade volumtrica em etanol (QP).

Variveis Dependentes

Variveis
Independentes

Coeficientes

t (5)

Mdia

0,367

26,06

0,000*

0,205

18,27

0,000*

-0,010

-0,89

0,413

A*B

-0,005

-0,36

0,730

A2

-0,163

-9,46

0,000*

B2

0,001

0,09

0,930

Mdia

0,376

25,50

0,000*

0,298

25,41

0,000*

0,033

2,83

0,003

A*B

0,035

2,43

0,059

A2

-0,060

-3,36

0,002

B2

-0,002

-1,42

0,212

YP/S (g/g)

QP (g/L.h)

A: pH linear; A : pH quadrtico; B: concentrao inicial de clulas; B : concentrao inicial de

clulas; 99% de significncia.

Tabela 5.10. Equaes do modelo para otimizao de pH e concentrao inicial de

clulas na fermentao do HHBM por P. stipitis, ajustados aos dados experimentais
para o fator de converso (Y1) e produtividade volumtrica em etanol (Q1).

Resposta

R2

Equaes do modelo

5
3
0
,
0

7
6
0
,
0

0,98

3
3
0
,
0

Q =

5
6
1
,
0

6
6
3
,
0

QP (g/L.h)

8
9
2
,
0

Y =

5
0
2
,
0

0
7
3
,
0

YP/S (g/g)

A +

AB

0,99

A: pH linear; A : pH quadrtico; B: concentrao inicial de clulas; B : concentrao inicial de

clulas.

106

(a)

(b)

Figura 5.9. Superfcie de resposta relacionando a converso do substrato em etanol

(a) e a produtividade volumtrica em etanol (b) com a concentrao inicial de clulas
e pH em nveis codificados.

107

5.4.2 Confirmao experimental das condies otimizadas

A partir da escolha do ponto determinado como timo, foram realizados
ensaios para a confirmao do modelo obtido, ou seja, empregando-se o
hidrolisado de bagao de malte contendo cerca de 55 g/L de xilose e
suplementado com 3,0 g/L de extrato de levedura. As fermentaes foram
realizadas em pH 6,4 e com 5,0 g/L de clulas de P. stipitis previamente
cultivadas em hidrolisado contendo 30 g/L de xilose.
A Figura 5.10 mostra a cintica obtida a partir das mdias das duplicatas
usando as condies otimizadas de pH (6,4) e de concentrao inicial de clulas
(5,0 g/L). Observa-se que os acares foram completamente assimilados aps 36
horas de fermentao e que a mxima produo de etanol (23,40 g/L) foi
alcanada neste tempo. Tais resultados so similares aos encontrados no
planejamento fatorial, validando experimentalmente os resultados obtidos.
A Tabela 5.11 apresenta os resultados do processo fermentativo nas
condies otimizadas aps 36 horas de fermentao. Observa-se que o modelo
obtido descreveu bem a regio em estudo, visto que os resultados apresentados
esto dentro da faixa de variao (0,38 - 0,45 g/g para YP/S) (0,59 - 0,72 g/L.h
para QP) prevista por este mesmo modelo.
A partir do presente estudo foi possvel otimizar as condies para
produo de etanol a partir do hidrolisado hemicelulsico de bagao de malte por
P. stipitis. Entretanto, torna-se restrita a comparao com outros trabalhos da
literatura, visto que existem poucos relatos de fermentaes utilizando
hidrolisados de bagao de malte para a produo de etanol, empregando a
levedura P. stipiits. A partir do hidrolisado celulsico de bagao de malte, White,
Yohannan e Walker (2008) estudando a produo de etanol por P. stipitis,
observaram uma eficincia de converso inferior a 70% (62,7%). Alm disso, os
valores

observados

para

YP/S

(0,32

g/g)

QP

(0,17

g/L.h)

foram

consideravelmente inferiores aos observados no presente trabalho, isto , 0,41

g/g e 0,65 g/L.h, respectivamente.

108

70

25

Acares (g/L)

20

50
40

15

30

10

20
5

10
0

cido actico, biomassa,

etanol (g/L)

60

Acares
cido Actico
Etanol
Biomassa

0
0

12

24

36

48

60

72

tempo (h)

Figura 5.10. Comportamento cintico da levedura P. stipitis, observado nas condies

otimizadas pelo modelo, visando produo de etanol em hidrolisado hemicelulsico de
bagao de malte.

Tabela 5.11. Parmetros fermentativos obtidos nos ensaios visando confirmao do

modelo otimizado para a bioconverso de acares (glicose e xilose) em etanol por
P. stipitis, em hidrolisado hemicelulsico de bagao de malte.

Parmetros

Resultados

Tempo de fermentao (h)

36

Consumo de acares (%)

99,51

Concentrao celular (g/L)

11,70

Concentrao de etanol (g/L)

23,40

YP/S (g/g)

0,41 (0,42 + 0,01)

QP (g/L.h)

0,65 (0,65 + 0,02)

(% do terico)

80

( ): valores previstos pelo modelo otimizado;

otimizado acares: glicose e xilose; : eficincia de converso

109

Adicionalmente, deve-se considerar que os resultados foram alcanados a

partir do hidrolisado hemicelulsico no destoxificado e que, como relatado
anteriormente, a presena de inibidores pode ter reduzido o potencial deste
hidrolisado durante o processo fermentativo. Dessa forma, a avaliao da
produo de etanol em hidrolisado hemicelulsico de bagao de malte
destoxificado um importante aspecto a ser considerado.

5.5 Otimizao das condies de pH e concentrao inicial de clulas

visando produo de etanol por Pichia stipitis, em HHBM destoxificado
Os mtodos de destoxificao so necessrios quando os hidrolisados
apresentam um alto teor de compostos inibidores e/ou quando um microrganismo
apresentando baixa tolerncia a tais compostos empregado no processo
fermentativo. Alm disso, o mtodo de destoxificao deve remover seletivamente
os compostos inibidores, ser economicamente vivel e facilmente integrado ao
processo. De acordo com Eva Palmqvist e Hahn-Hgerdal, (2000) os hidrolisados
hemicelulsicos

variam

quanto

ao

seu grau

de

inibio,

diferentes

microrganismos apresentam tolerncia a diferentes inibidores.

Embora o hidrolisado hemicelulsico de bagao de malte no destoxificado
tenha apresentado resultados promissores para a produo de etanol,
importante ressaltar que o cido actico foi determinante em condies onde se
empregou pH 4,5, mostrando seu grande potencial inibitrio sobre a levedura P.
stipitis, quando associado ao pH cido. Desse modo, visando reduzir a toxicidade
do hidrolisado pela reduo das concentraes dos compostos inibidores,
especialmente o cido actico, e promover a converso dos acares a etanol
pela levedura P. stipitis em pH 4,5, o hidrolisado de bagao de malte foi
submetido a um processo de destoxificao utilizando-se a metodologia descrita
por Mussatto, Santos e Roberto (2004) que consiste na alterao de pH em
combinao com o mtodo de adsoro utilizando carvo ativado.
A Tabela 5.12 apresenta as concentraes de acares e dos principais
compostos inibidores resultantes deste processo. Observa-se que, aps o
processo de destoxificao, houve uma reduo nas concentraes de todos os
componentes do hidrolisado e ao final do processo, uma perda de cerca de 22%
em volume de hidrolisado. Quanto concentrao de acares, houve uma

110

reduo de cerca de 19, 14 e 16% para glicose, xilose e arabinose,

respectivamente. Reduo similar foi observada para o cido actico (17,72%),
entretanto as concentraes de furfural, hidroximetilfurfural (HMF) e compostos
fenlicos totais foram reduzidas em aproximadamente 86, 66 e 79%,
respectivamente.

Tabela 5.12. Acares e principais compostos inibidores, dados em g/L, detectados

durante o processo de destoxificao do HHBM.

Etapas da destoxificao do HHBM concentrado

Componentes

pH 0,8
(original)

4*

4**

Glicose

8,32

7,33

7,06

7,35

6,93

6,09

7,17

Xilose

77,45

70,99

68,72

70,51

66,18

65,39

68,33

Arabinose

38,25

33,26

32,68

33,5

31,53

31,87

32,55

cido actico

3,61

3,50

3,19

3,05

2,98

2,84

3,11

Furfural

0,07

0,03

0,03

0,02

0,01

0,01

0,01

0,22

0,14

0,10

0,09

0,08

0,08

0,07

6,00

5,10

4,74

1,51

1,27

1,26

1,26

5-HMF
a

Fenlicos Totais

HC: hidrolisado concentrado; 5-HMF: hidroximetilfurfural; ps CA: aps a etapa de adsoro com
a
carvo ativado; Singleton et al. (1999).
1: etapa aps a elevao do pH para 8,0, a partir da adio de NaOH;
2: etapa aps a reduo do pH para 2,0, a partir da adio de H2SO4;
3: etapa aps a adsoro com carvo ativado;
4, 4*, 4**: elevao do pH para 4,5, 5,5 e 6,5, respectivamente, a partir da adio de NaOH.

Verifica-se, portanto que com relao aos compostos inibidores, somente

as concentraes de 5-HMF, furfural e compostos fenlicos totais foram reduzidas
consideravelmente. Os resultados aqui apresentados esto de acordo com relatos
da literatura. Carvalheiro et al. (2005) tambm observou que no houve remoo
do cido actico presente no hidrolisado hemicelulsico de bagao de malte
atravs da adsoro com 10% carvo ativado, aps overliming. Por outro lado,
estes autores observaram uma reduo de 68 e 92% nas concentraes de
furfural e 5-HMF, respectivamente, aps este tratamento.
Resultados similares foram observados por Canilha et al. (2010) e Chandel
et al. (2007) em hidrolisado hemicelulsico de bagao de cana, mostrando que a

111

destoxificao a partir da adsoro com carvo ativado resultou em uma reduo

de 90 e 46% na concentrao de compostos derivados da lignina (CANILHA et
al., 2010; CHANDEL et al., 2007). Por outro lado, tais autores reportaram que
somente a utilizao de resinas de troca inica levou a reduo de cerca de 80%
na concentrao de cido actico.
A Figura 5.11 apresenta os espectros de varredura da regio do ultravioleta
(UV) do hidrolisado hemicelulsico de bagao de malte, antes e aps o processo
de destoxificao. O espectro de varredura na regio do UV uma tcnica
analtica

utilizada

para

caracterizar

hidrolisados

oriundos

de

materiais

lignocelulsicos, fornecendo informaes sobre a presena de compostos

fenlicos derivados da lignina e tambm compostos resultantes da degradao de
carboidratos (MARTINEZ et al., 2000). Nota-se na Figura 5.11, que o hidrolisado
original (no destoxificado) apresenta duas regies de mxima absorbncia, uma
prxima de 280 nm e outra em 210 nm. De acordo com Martinez et al. (2000) o
comprimento de onda de 280 nm caracterstico da presena de furanos e
compostos fenlicos derivados de lignina.

Abs
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0.0
200

250

30 0

350

400

450

nm
500

Figura 5.11. Espectros de varredura na regio do hidrolisado hemicelulsico de

bagao de malte concentrado antes ( ) e aps ( ) o processo de destoxificao.

112

Verifica-se que no comprimento de onda de 280 nm ocoreu uma reduo

de cerca de 80% nos valores de absorbncia, aps o processo de destoxificao,
evidenciando a reduo dos inibidores e confirmando os resultados obtidos a
partir da metodologia de Folin modificada (Tabela 5.12).
Para otimizao das condies de pH e concentrao inicial de clulas
durante a fermentao por P. stipitis, do hidrolisado hemicelulsico de bagao de
malte destoxificado, foi realizado um planejamento 22 composto com face
centrada. Foram utilizadas as mesmas condies empregadas para a otimizao
da fermentao em hidrolisado no destoxificado (Item 5.4), sendo o inculo
preparado em hidrolisado no destoxificado.
A Tabela 5.13 apresenta a matriz experimental com os nveis reais das
variveis, assim como o consumo de acares, a produo de etanol e a variao
de pH nos diferentes ensaios do planejamento, ao final de 48 horas de
fermentao. De modo geral, verifica-se que a levedura apresentou o mesmo
comportamento observado nos ensaios fermentativos em hidrolisado no
destoxificado. Assim, nota-se que independente da concentrao inicial de
clulas, o pH 4,5 empregado em alguns ensaios do planejamento, inibiu
completamente o metabolismo de P. stipitis, no havendo consumo de acares e
formao de etanol. Por outro lado, em pH 6,5, a levedura foi capaz de consumir
mais de 80% dos acares presentes no hidrolisado e produzir a mxima
concentrao de etanol (19,21 g/L). Com estes dados, pode-se inferir que o
aumento do pH foi capaz de reduzir a toxicidade do hidrolisado de bagao de
malte. Alm disso, neste pH, o aumento da concentrao inicial de clulas no
influenciou os resultados. No entanto, sob pH 5,5 observa-se que medida em
que a concentrao celular aumenta, os acares so consumidos mais
rapidamente, ocorrendo tambm aumento na produo mxima de etanol (cerca
de 12%). A partir destes resultados, fica claro que o aumento de apenas 1
unidade de pH (4,5 para 5,5) foi suficiente para melhorar a capacidade de
assimilao das fontes de carbono presentes, pela levedura, para a produo de
biomassa e etanol.
Com relao ao pH do meio, verifica-se que os valores no sofreram
grandes alteraes durante o processo, contudo os ensaios realizados em pH 5,5
apresentaram uma elevao de cerca de 0,60 unidades aps 48 horas de
fermentao.

113

Tabela 5.13. Planejamento fatorial do tipo 22, com trs repeties no ponto central
(mdia apresentada), visando avaliar o efeito do pH e da concentrao inicial de
cluls (X0) sobre o consumo de acares e a produo de etanol, pela levedura P.
stipitis, em hidrolisado hemicelulsico de BM destoxificado, aps 48 horas de
fermentao.

Nveis das Variveis

Parmetros

Ensaio
pH

X0 (g/L)

Consumo de
acares (g/L)

Produo de
etanol (g/L)

pH

4,5

1,0

0,00

0,00

4,60

6,5

1,0

86,12

18,48

6,55

4,5

5,0

0,00

0,00

4,60

6,5

5,0

95,68

17,91

6,64

5,5

1,0

67,03

14,64

6,06

5,5

5,0

78,45

16,38

6,12

4,5

3,0

0,00

0,00

4,61

6,5

3,0

93,22

19,21

6,50

9/10/11

5,5

3,0

71,23

15,40

5,99

acares: glicose+xilose; X0: concentrao inicial de clulas

A Figura 5.12 apresenta os perfis de consumo de glicose, xilose e cido

actico pela levedura P. stipitis em hidrolisado hemicelulsico de bagao de malte
destoxificado. Considerando as fermentaes realizadas em pH 4,5 (ensaios 1, 3
e 7) no foi observado consumo de xilose e cido actico, independente da
concentrao celular empregada (Figuras 5.12a e 5.12b, respectivamente).
Entretanto, nota-se que com o aumento da concentrao inicial de clulas,
ocorreu consumo, embora parcial, de glicose, isto , cerca de 32% e 52% nos
ensaios 7 (X0 = 3,0 g/L) e 3 (X0 = 5,0 g/L), respectivamente. Tais resultados
sugerem que o aumento da concentrao inicial de clulas favoreceu o consumo
de glicose neste valor de pH. Conforme observado para o hidrolisado no
destoxificado, o pH 4,5 tambm inibiu o consumo de acares e cido actico em
hidrolisado destoxificado, especialmente a xilose e, cido actico, j que a
levedura no foi capaz de consumi-los, mesmo com o aumento da concentrao
inicial de clulas.

114

(a)

Glicose (g/L)

7,5
E1 (pH 4,5+1 g/L)

6,0

E2 (pH 6,5+1 g/L)

E3 (pH 4,5+5 g/L)

4,5
3,0

E4 (pH 6,5+5 g/L)

E5 (pH 5,5+1 g/L)

1,5

E6 (pH 5,5+5 g/L)

E7 (pH 4,5+3 g/L)

0,0

E8 (pH 6,5+3 g/L)

E9 (ponto central)

12

24

36

48

60

72

tempo (h)
(b)
70

Xilose (g/L)

60

E1 (pH 4,5+1 g/L)

E2 (pH 6,5+1 g/L)
E3 (pH 4,5+5 g/L)
E4 (pH 6,5+5 g/L)
E5 (pH 5,5+1 g/L)
E6 (pH 5,5+5 g/L)
E7 (pH 4,5+3 g/L)
E8 (pH 6,5+3 g/L)
E9 (ponto central)

50
40
30
20
10
0
0

12

24

36

48

60

72

tempo (h)
(c)

cido actico (g/L)

3,0
E1 (pH 4,5+1 g/L)
E2 (pH 6,5+1 g/L)

2,0

E3 (pH 4,5+5 g/L)

E4 (pH 6,5+5 g/L)
E5 (pH 5,5+1 g/L)

1,0

E6 (pH 5,5+5 g/L)

E7 (pH 4,5+3 g/L)
E8 (pH 6,5+3 g/L)
E9 (ponto central)

0,0
0

12

24

36

48

60

72

tempo (h)
Figura 5.12. Consumo de glicose
licose (a), xilose (b) e de cido actico (c) por P. stipitis em
hidrolisado hemicelulsico de BM destoxificado, sob diferentes condies de pH e
concentrao inicial de clulas,, conforme ensaios do planejamento fatorial 22. Ponto
central: mdia dos ensaios realizados sob pH 5,5 e 3 g/L de clulas.

115

Quando o pH foi elevado para 5,5 ou 6,5 nota-se que a levedura foi capaz
de consumir totalmente a glicose em 12 horas de fermentao (Figura 5.12a).
Alm disso, na Figura 5.12b observa-se que o consumo de xilose foi favorecido
tanto pelo aumento do pH, quanto pelo aumento da concentrao inicial de
clulas. Contudo, isto fica mais evidente nos ensaios realizados em pH 5,5, onde
possvel notar claramente que o consumo desta pentose se torna mais rpido
medida em que a concentrao celular aumentada.
Com relao ao consumo de cido actico (Figura 5.12c), verifica-se que a
levedura foi capaz de realizar uma destoxificao in situ, em pH 5,5 e 6,5. Como
relatado anteriormente, a levedura P. stipitis apresenta esta capacidade,
entretanto, como observado para o hidrolisado no destoxificado, o consumo do
cido actico no ocorreu em pH cido.
Na Figura 5.13 esto mostrados os perfis de produo de etanol e a
formao de biomassa da levedura P. stipitis sob diferentes condies de pH e
concentrao inicial de clulas, em hidrolisado de bagao de malte destoxificado.
Similar ao observado para o consumo de acares e cido actico nota-se que,
em pH 6,5 a formao do produto pela levedura foi favorecida(Figura 5.13a),
quando comparado ao pH 5,5. Entretanto, nos ensaios realizados em pH 5,5
verifica-se que a mxima concentrao de etanol foi alcanada entre 60 e 72
horas (cerca de 20,0 g/L), enquanto que em pH 6,5 a concentrao mxima de
etanol ocorreu aps 48 horas. A partir destes resultados pode-se constatar que o
aumento do pH do hidrolisado para 6,5 resulta em uma diminuio de 12 horas
para se obter a mxima concentrao de etanol.
Os perfis de crescimento da levedura P. stipitis nas diferentes condies do
planejamento 22, so mostrados na Figura 5.8b. Observa-se que nos ensaios
realizados em pH 4,5, houve um discreto crescimento da levedura nas primeiras
12 horas de fermentao, entretanto a concentrao celular manteve-se estvel
aps este tempo. Por outro lado, nos ensaios realizados em pH 5,5 e 6,5 nota-se
crescimento celular at o tempo final da fermentao (72 horas), com exceo
dos ensaios 5 (pH 5,5 e X0 = 1,0 g/L) e 8 (pH 6,5 e X0 = 3,0 g/L) que
apresentaram um decrscimo na concentrao celular aps 60 e 48 horas de
fermentao, respectivamente.

116

(a)

25
E1 (pH 4,5+1 g/L)

Etanol (g/L)

20

E2 (pH 6,5+1 g/L)

E3 (pH 4,5+5 g/L)

15

E4 (pH 6,5+5 g/L)

10

E5 (pH 5,5+1 g/L)

E6 (pH 5,5+5 g/L)

E7 (pH 4,5+3 g/L)

E8 (pH 6,5+3 g/L)

E9 (ponto central)

12

24

36

48

60

72

tempo (h)

(b)

14
E1 (pH 4,5+1 g/L)

Biomassa (g/L)

12

E2 (pH 6,5+1 g/L)

10

E3 (pH 4,5+5 g/L)

E4 (pH 6,5+5 g/L)

E5 (pH 5,5+1 g/L)

E6 (pH 5,5+5 g/L)

E7 (pH 4,5+3 g/L)

E8 (pH 6,5+3 g/L)

E9 (ponto central)

12

24

36

48

60

72

tempo (h)

Figura 5.13. Produo de etanol (a) e formao de biomassa (b) por P. stipitis em
hidrolisado hemicelulsico de BM destoxificado, sob diferentes condies de pH e
concentrao inicial de clulas,, conforme ensaios do planejamento fatorial 22. Ponto
central: mdia dos ensaios realizados sob pH 5,5 e 3 g/L de clulas.

117

Como j relatado anteriormente, um pH na faixa da neutralidade

necessrio para que as clulas continuem viveis, pois como reportado por (IMAI;
OHONO, 1995), a atividade replicativa da clula diminui linearmente com a
reduo do pH intracelular.
A partir da anlise direta dos dados, percebe-se que de um modo geral, o
pH teve grande influncia sobre o processo, mostrando que mesmo aps o
hidrolisado ser submetido a um processo de destoxificao, a levedura no foi
capaz de crescer, assimilar grande parte das fontes de carbono disponveis ou
produzir etanol em pH 4,5. Tais resultados sugerem que mesmo com a retirada de
parte dos compostos inibidores, o hidrolisado ainda apresentou toxicidade
suficiente para influenciar negativamente a bioconverso pela levedura P. stipitis.
De fato, a levedura P. stipitis capaz de crescer e produzir etanol em pH 4,5,
desde que na ausncia de compostos inibidores, conforme observado por Cabral;
Silva; Roberto, (2010) ao avaliar a influncia do pH na produo de etanol pela
levedura em meio semissinttico. Estes autores verificaram que os melhores
resultados (YP/S = 0,40 g/g e QP = 0,50 g/L.h) foram obtidos empregando-se
valores de pH entre 4,0 e 6,0.
Os resultados observados no presente estudo mostram que em hidrolisado
hemicelulsico de bagao de malte destoxificado, as fermentaes devem ser
conduzidas sob valores de pH mais elevados (pH 5,5 e 6,5), por minimizar o efeito
txico dos inibidores presentes. Adicionalmente, tanto o pH 5,5 quanto o pH 6,5
favorecem a bioconverso por P. stipitis, mostrando resultados similares, ao
contrrio do observado em hidrolisado no destoxificado, onde os resultados de
YP/S e QP em pH 6,5 foram superiores aos obtidos em pH 5,5.
Na Tabela 5.14 mostrada a matriz do planejamento fatorial composto 22
com face centrada, assim como o fator de converso de substrato em etanol
(YP/S) e em clulas (YX/S), a produtividade volumtrica em etanol (QP), a
velocidade de consumo de substrato (QS) e a eficincia de converso (%) nos
diferentes ensaios. Nota-se que os valores obtidos para YP/S foram similares,
quando comparados os ensaios realizados em pH 5,5 e 6,5 (cerca de 0,33 g/g) e
o maior fator de converso de substrato em etanol (0,34 g/g) foi observado em
quatro (ensaios 2, 5, 6 e 8) dos seis ensaios do planejamento.

118

Tabela 5.14. Matriz do planejamento fatorial composto 2 com face centrada, para avaliao do
efeito do pH e da concentrao inicial de clulas em HHBM destoxificado sobre a converso do
substrato em etanol e em clulas, a produtividade volumtrica em etanol e a velocidade de
consumo de substrato, por P. stipitis.
Nveis Reais das
Variveis

Parmetros fermentativos

Ensaio
pH

X0 (g/L)

YP/S
(g/g)

YX/S
(g/g)

QP
(g/L.h)

QS
(g/L.h)

4,5

1,0

nd

0,06

nd

nd

6,5

1,0

0,34

0,12

0,34

1,06

4,5

5,0

nd

0,06

nd

nd

6,5

5,0

0,31

0,12

0,37

1,34

5,5

1,0

0,34

0,14

0,35

0,96

5,5

5,0

0,34

0,13

0,34

1,03

4,5

3,0

nd

0,06

nd

nd

6,5

3,0

0,33

0,15

0,40

1,22

9/10/11

5,5

3,0

0,34

0,13

0,34

1,01

X0: concentrao inicial de clulas; nd: no determinado

Com relao s velocidades do processo (QP e QS) nota-se que os maiores

valores (0,40 g/g e 1,34 g/L.h) foram alcanados em pH 6,5 (ensaios 8 e 4,
respectivamente), no mostrando influncia da concentrao inicial de clulas
quando analisados estes parmetros.
Considerando a converso do substrato em clulas (YX/S) nota-se variao
de 0,06 a 0,15 g/g. Em pH 4,5 os valores deste parmetro situam-se em torno de
de 0,06 g/g, em todos os ensaios. J nos meios de fermentao com pH 5,5 e 6,5,
os valores situam-se em torno de 0,13 g/g (0,12 g/g a 0,15 g/g).
A Figura 5.14 apresenta uma comparao entre os resultados obtidos nos
ensaios do planejamento 22, realizados em hidrolisado no destoxificado e aps o
processo de destoxificao, em pH 5,5 e 6,5. Em pH 5,5 (Figuras 5.14a; c) notase que os valores de YP/S e QP foram muito prximos para ambos os hidrolisados
(destoxificado ou no), mostrando uma variao em torno de 10%, independente
da concentrao celular utilizada. Por outro lado, quando foi empregado o pH 6,5,
verificou-se uma reduo de aproximadamente 20% nos valores de YP/S, para o
HHBM destoxificado e que, do mesmo modo independeu da concentrao celular
(Figura 5.14b).

119

(a)
0 ,5

(b)
0 ,5

H H B M n o d e s t o x ific a d o
H H B M d e s t o x if ic a d o

p H 5 ,5

0 ,4

(g/g)

(g/g)

0 ,4

0 ,2

0 ,3

P/S

P/S

0 ,3

0 ,1
0 ,0

0 ,2
0 ,1

1 g/L

3 g/L

0 ,0

5 g/L

1 g/L

(c)
p H 5 ,5

5 g/L

(d)
0 ,8

H H B M n o d e s t o x ific a d o
H H B M d e s t o x if ic a d o

0 ,7

0 ,4

p H 6 ,5

H H B M n o d e s t o x ific a d o
H H B M d e s t o x ific a d o

Q (g/L.h)

0 ,6

0 ,3

0 ,5
0 ,4

Q (g/L.h)

3 g/L
C o n c e n t r a o c e lu la r

C o n c e n t r a o c e lu la r

0 ,5

H H B M n o d e s t o x ific a d o
H H B M d e s t o x if ic a d o

p H 6 ,5

0 ,2

0 ,3
0 ,2

0 ,1

0 ,1
0 ,0

1 g/L

3 g/L
C o n c e n t r a o c e lu la r

5 g/L

0 ,0

1 g/L

3 g/L
C o n c e n t r a o c e lu la r

5 g/L

Figura 5.14. Fator de converso do substrato e produtividade volumtrica em etanol, obtidos nos ensaios do planejamento 22, realizados
em HHBM no destoxificado () e aps destoxificao (). Ensaios realizados em pH 5,5 direita e em pH 6,5 esquerda.

120

Com relao produtividade volumtrica em etanol verifica-se que o valor

deste parmetro foi reduzido aps a destoxificao do HHBM (Figura 5.14d),
sendo dependente da concentrao inicial de clulas empregada. Nota-se uma
reduo de aproximadamente 30, 50 e 43% quando as concentraes celulares
foram 1,0, 3,0 e 5,0 g/L, respectivamente. Apesar do processo de destoxificao
ter eliminado cerca de 66% de furfural, 86% de 5-HMF e 79% dos compostos
fenlicos totais presentes no HHBM, de modo geral, o processo de destoxificao
afetou a bioconverso por P. stipitis, especialmente quando foram empregados
valores de pH de 6,5.
Quando comparado a outros estudos reportados na literatura, os resultados
do presente trabalho, empregando o hidrolidado hemicelulsico de bagao de
malte destoxificado so relevantes. Por exemplo, no estudo realizado por Canilha
et al. (2009), o hidrolisado hemicelulsico de bagao de cana (pH 5,8) foi
submetido alterao de pH e adsoro em carvo ativado e em seguida
suplementado com extrato de levedura, extrato de malte e peptona, visando
produo de etanol por P. stipitis DSM 3651. Estes autores observaram um fator
de converso de substrato e produtividade volumtrica em etanol de 0,30 g/g e
0,13 g/L.h, respectivamente, isto , cerca de 12 e 68% inferiores aos valores
observados no presente trabalho.

5.5.1 Anlise estatstica do planejamento fatorial 22 composto com face

centrada, para otimizao do pH e da concentrao inicial de clulas, a
partir do HHBM destoxificado.

A Tabela 5.15 apresenta a anlise de varincia (ANOVA) realizada para as

respostas avaliadas neste estudo (pH e concentrao inicial de clulas), onde so
apresentados os efeitos estatisticamente significativos (em negrito), bem como a
contribuio de cada varivel para o processo. De acordo com esta anlise, o
aumento do valor do pH exerceu um efeito positivo (linear e quadrtico) sobre
todos os parmetros fermentativos avaliados, enquanto que a elevao da
concentrao inicial de clulas apresentou efeito positivo (+0,76) somente sobre a
velocidade de consumo de substrato, onde tambm foi observado uma interao
positiva entre as duas variveis ao nvel de 95% de confiana.

121

Tabela 5.15. Anlise de varincia com erro total para os principais efeitos e suas
interaes, durante a fermentao do hidrolisado hemicelulsico de BM destoxificado,
empregando a levedura P. stipitis, sob diferentes condies de pH (1) concentrao
inicial de clulas (2).
Varivel
Resposta
YP/S (g/g)

Fatores

SQ

GL

MQ

1(L)
1(Q)
2 (L)
2 (Q)
1*2
Erro

0,1600
0,0801
0,0001
0,0000
0,0002
0,0000

1
1
1
1
1
5

0,16006
0,08017
0,00015
0,00002
0,00022
0,16006

5320,00
2664,58
4,98
0,70
7,47

0,0000
0,0000
0,0758
0,4392
0,0410

Contribuio
(%)
64,62
32,35
0,04
0,01
0,08

Total

0,2476

10

Fatores

SQ

GL

MQ

Contribuio
(%)

YX/S (g/g)

1(L)
1(Q)
2 (L)
2 (Q)
1*2
Erro

0,0073
0,0029
0,0000
0,0000
0,0000
0,0007

1
1
1
1
1
5

0,00735
0,00291
0,00001
0,00003
0,00000
0,00014

49,40
19,62
0,11
0,26
0,00

0,0009
0,0068
0,7514
0,6284
1,0000

R2 = 0,93
Varivel
Resposta

Total

0,0114

10

Fatores

SQ

GL

MQ

Contribuio
(%)

QP (g/L.h)

1(L)
1(Q)
2 (L)
2 (Q)
1*2
Erro

0,2053
0,0592
0,0000
0,0001
0,0002
0,0019

1
1
1
1
1
5

0,20535
0,05922
0,00006
0,00015
0,00022
0,00039

526,42
151,81
0,17
0,40
0,57

0,0000
0,0000
0,6964
0,5526
0,4818

75,14
21,66
0,02
0,03
0,07

R2 = 0,99
Varivel
Resposta

Total

0,2732

10

Fatores

SQ

GL

MQ

Contribuio
(%)

QS (g/L.h)

1(L)
1(Q)
2 (L)
2 (Q)
1*2
Erro

2,1840
0,4000
0,0204
0,0003
0,0196
0,0073

1
1
1
1
1
5

2,18406
0,40001
0,02041
0,00038
0,01960
0,00147

1479,22
270,92
13,82
0,26
13,27

0,0000
0,0000
0,0137
0,6302
0,0148

81,81
14,98
0,76
0,01
0,73

R2 = 0,99

Total

2,6696

10

R2 = 0,99
Varivel
Resposta

64,03
25,43
0,01
0,26

1 (L): pH linear; 1 (Q): pH quadrtico; 2 (L): concentrao inicial do clulas linear; 2 (Q):
concentrao de clulas quadrtica; SQ: soma quadrtica; GL: grau de liberdade; MQ: mdia
quadrtica.

122

Os valores dos coeficientes de correlao obtidos ficaram acima de 0,90

para todas as respostas avaliadas, mostrando que o modelo obtido foi capaz de
explicar mais de 90% da variao observada em cada resposta.
Para todas as respostas avaliadas, as variveis que apresentaram maior
contribuio para o processo foram o pH (efeito linear), seguido pelo efeito
quadrtico desta varivel, sendo capazes de explicar 90% ou mais da variao
observada nestas respostas. Foram realizadas ento, anlises de varincia de
regresso onde se observa que os coeficientes de correlao (R2) para as
principais respostas relacionadas a produo de etanol, isto , YP/S e QP (Tabela
5.16).
Com objetivo de se otimizar as condies utilizadas, as respostas foram
maximizadas em conjunto, sendo os critrios convenientemente selecionados de
forma que as variveis independentes fossem mantidas na faixa em estudo e os
valores estimados para as respostas, foram avaliadas dentro de uma faixa que
permitisse a sobreposio dos modelos. Desse modo, considerando-se YP/S e QP,
os valores encontrados foram pH 6,0 (nvel codificado +0,54) e concentrao
inicial de clulas de 1,36 g/L (valor codificado +0,82).

Adicionalmente, foram

excludos termos sem significncia para o modelo visando melhorar o mesmo.

Assim, para YP/S foram excludas a concentrao inicial de clulas quadrtica e
para a varivel QP, foram excludas a concentrao inicial de clulas linear e
quadrtica, bem como a interao entre pH e concentrao inicial de clulas.
Portanto, com base nos resultado obtidos a partir desta anlise, foi possvel
determinar modelos empricos para descrever o efeito do pH (A) e da
concentrao inicial de clulas (B) sobre a converso do substrato em etanol (Y2)
e a produtividade volumtrica em etanol (Q2), na regio estudada, sendo
mostrados na Tabela 5.17. Os modelos matemticos foram significativos (p
<0,001) e no apresentaram falta de ajuste ao nvel de 95% de confiana, o que
significa que a diferena entre os valores obtidos experimentalmente e os valores
previstos pela equao pode ser explicada pelo erro experimental.
As superfcies de resposta descritas pelas equaes do modelo para a
converso do substrato e a produtividade em etanol (Figura 5.16) mostram
claramente que o aumento no valor da varivel pH favoreceu linearmente e
quadraticamente no s o aumento do etanol produzido, mas principalmente
aumentou a velocidade do processo.

123

Tabela 5.16. Anlise de varincia de regresso para os modelos representativos da

converso do substrato em etanol (YP/S) e produtividade volumtrica em etanol (QP)
em hidrolisado de bagao de malte destoxificado.

Varivel de Resposta

Variveis

Coeficientes

t (5)

Mdia

0,343

121,95

0,000*

0,163

72,93

0,000*

-0,005

-2,23

0,075

A*B

-0,007

-2,73

0,041**

A2

-0,177

-51,61

0,000*

B2

-0,002

-0,84

0,439

Mdia

0,343

33,86

0,000*

0,185

22,94

0,000*

0,003

0,41

0,696

A*B

0,007

0,75

0,481

A2

-0,152

-12,32

0,00*

B2

-0,007

-0,63

0,552

YP/S (g/g)

QP (g/L.h)

A: pH linear; B: concentrao inicial de clulas linear; A : pH quadrtico; B : concentrao inicial

2
de clulas quadrtica; * 99% de significncia; ** 95% de significncia; R =0,99.

Tabela 5.17. Equaes do modelo para otimizao de pH e concentrao inicial de

clulas na fermentao do HHBM destoxificado, por P. stipitis ajustados aos dados
experimentais para o fator de converso do substrato (Y2) e produtividade volumtrica
em etanol (Q2).

AB

6
4
1
,
0
3
9
1
,
0
4
3
,
0

Q =

QP (g/L.h)

1
0
,
0

Y =

R2

7
7
1
,
0
6
0
0
,
0

YP/S (g/g)

5
6
1
,
0
2
4
3
,
0

Equaes do modelo

Resposta

0,99

0,99
2

A: pH linear; A : pH quadrtico; B: concentrao inicial de clulas; B : concentrao inicial de

clulas.

124

(a)

(b)

Figura 5.16. Superfcie de resposta relacionando a converso do substrato em etanol

(a) e a produtividade volumtrica em etanol (b) com a concentrao inicial de clulas
e pH, em nveis codificados.

125

5.5.2 Confirmao dos Modelos Obtidos

A partir da escolha do ponto determinado como timo, foram realizados
ensaios para a confirmao do modelo obtido, ou seja, empregou-se o hidrolisado
de bagao de malte destoxificado contendo cerca de 55,0 g/L de xilose
suplementado com 3,0 g/L de extrato de levedura. Os ensaios fermentativos
foram conduzidos em pH 6,0 e com 1,36 g/L de clulas de P. stipitis previamente
cultivada em hidrolisado contendo 30 g/L de xilose. Deste modo, a cintica obtida
durante a bioconverso de acares a etanol nas condies otimizadas
mostrada na Figura 5.17, assim como os resultados do processo fermentativo,
obtidos com 48 horas de cultivo so apresentados na Tabela 5.17. Vale ressaltar
que tais resultados foram determinados a partir da mdia obtida em dois ensaios
(duplicatas).
A Figura 5.17 apresenta a cintica obtida a partir das mdias das
duplicatas usando as concentraes otimizadas de pH (6,0) e de concentrao
inicial de clulas (1,36 g/L). Nota-se que os acares foram completamente
assimilados aps 48 horas de fermentao. Estes resultados esto de acordo
com

os

observados

no

planejamento

fatorial

e,

portanto

validam

experimentalmente os resultados obtidos.

A Tabela 5.18 mostra os resultados do processo fermentativo nas
condies otimizadas aps 48 horas de fermentao. Nota-se que o modelo
obtido descreveu bem a regio em estudo, visto que os resultados apresentados
esto dentro da faixa de variao (0,39 - 0,45 g/g para YP/S) (0,37 - 0,46 g/L.h
para QP) prevista. Contudo, para efeito de comparao, percebe-se que os
resultados obtidos a partir do hidrolisado destoxificado foram inferiores aos
observados em hidrolisado no destoxificado. Apesar do fator de rendimento em
etanol te sido similar, a produtividade foi cerca de 30% menor quando utilizou-se o
hidrolisado destoxificado.

126

70

25

Acares (g/L)

20

50
15

40
30

10

20
5

10
0

cido actico, biomassa,

etanol (g/L)

60

Acares
cido Actico
Etanol
Biomassa

0
0

12

24

36

48

60

72

tempo (h)

Figura 5.17. Comportamento cintico da levedura P. stipitis, observado nas

condies otimizadas pelo modelo, visando produo de etanol em hidrolisado
hemicelulsico de bagao de malte destoxificado.

Tabela 5.18. Parmetros fermentativos obtidos nos ensaios visando confirmao do

modelo otimizado para a bioconverso
oconverso de acares (glicose e xilose) em etanol por
P. stipitis, em hidrolisado hemicelulsico de bagao de malte destoxificado.

Parmetros

Tempo de fermentao (h)

Consumo de acares (%)
Concentrao celular (g/L)
Concentrao de etanol (g/L)
YP/S (g/g)
QP (g/L.h)

(% do terico)

Resultados

48
89,23
8,27
22,11
0,40 (0,39 + 0,00)
0,46 (0,40 + 0,01)
78

( ): valores previstos pelo modelo otimizado;

otimizado acares: glicose e xilose; : eficincia de converso

127

A partir dos resultados aqui apresentados, possvel sugerir que o cido

actico foi o fator mais influente sobre a converso do hidrolisado hemicelulsico
de bagao de malte a etanol, pela levedura P. stipitis. De fato, este cido tem sido
reportado como sendo um potente inibidor desta levedura, de modo que
concentraes acima de 2,0 g/L foram reportadas como sendo suficientes para
inibir a converso de acares a etanol em hidrolisado de grama-de-prata (GUO
et al., 2008) e que concentraes acima de 6,0 g/L reduziram em 82% a formao
de biomassa em hidrolisado de poda de oliveira (DAZ et al., 2009).
Alguns mtodos descritos na literatura so capazes de remover
eficientemente o cido actico presente nos hidrolisados. Entre eles esto a
utilizao de resinas de troca inica (CARVALHO et al., 2004; NILVEBRANT et
al., 2001) e membranas adsortivas, membranas de filtrao e eletrodilise
(CHENG et al., 2008; STOUTENBURG et al., 2008). Entretanto, tais mtodos so
economicamente inviveis. Por outro lado, mais recentemente, Cho et al. (2010)
empregaram um novo mtodo de pr-tratamento alcalino em hidrolisado de
madeira e alcanaram uma reduo de 90% na concentrao de cido actico,
evidenciando a eficincia deste mtodo.
Tendo em vista que aps a destoxificao do hidrolisado de bagao de
malte com carvo ativado, foi alcanada uma reduo de cerca de 18% na
concentrao de cido actico, faz-se necessrio o emprego de uma metodologia
que remova eficientemente este cido, para que sejam alcanados parmetros
mais elevados na bioconverso do HHBM pela levedura P. stipitis, especialmente
em pH 4,5. Entretanto, importante ressaltar que mesmo em concentraes
reduzidas, compostos fenlicos totais, furfural e 5-HMF, podem ter influenciado
negativamente o processo de bioconverso. Considerando-se que as tcnicas
que reduzem as concentraes de cido actico presente nos hidrolisados
apresentam custo elevado e desta forma, torna seu emprego industrialmente
invivel, uma alternativa seria a realizao de fermentaes sob valores de pH
elevados, associado otimizao de outros fatores e/ou condies influentes
sobre o processo, como reportado por van Zyl et al. (1991) e anteriormente
relatado neste trabalho. Esta estratgia tambm foi utilizada por Cheng et al.,
(2009) com o objetivo de amenizar o efeito dos inibidores presentes no hidrolisado
hemicelulsico de sabugo de milho,

na fermentao por Candida tropicalis

visando produo de xilitol. Os autores alcanaram um aumento de 48 e 52%

128

na converso do substrato e produtividade em xilitol, apenas com a variao do

pH de 4,5 para 6,0.
Os resultados apresentados no presente estudo mostraram que a
destoxificao do hidrolisado hemicelulsico de bagao de malte no foi
vantajosa, considerando tanto a perda de acares e volume, quanto os
resultados alcanados. De fato, foram alcanados valores superiores de YP/S e QP
quando o hidrolisado no foi submetido a este processo, mostrando que a
destoxificao tornou o processo mais lento, embora a produo de etanol tenha
sido similar. possvel que paralelamente adsoro dos compostos inibidores,
possa ter ocorrido a retirada completa ou parcial de alguns nutrientes essenciais
ao crescimento da levedura como vitaminas e minerais. Contudo, h necessidade
de estudos adicionais a fim de se avaliar mais profundamente este processo.

5.6 Efeito do cido actico sobre a produo de etanol por Pichia stipitis, em
meio semissinttico

Tendo em vista a grande influncia do cido actico sobre a bioconverso

do hidrolisado de bagao de malte por P. stipitis, foram realizados ensaios
fermentativos em meio semissinttico, empregando-se as condies de pH e
concentrao inicial de clulas previamente otimizadas para o hidrolisado no
destoxificado (modelo 1: pH 6,4 e X0 = 5,0 g/L) e para o hidrolisado destoxificado
(modelo 2: pH 6,14 e X0 = 1,36 g/L). Para tal propsito foram simuladas as
concentraes

de

acares

cido

actico

presentes

no

hidrolisado

hemicelulsico de bagao de malte.

A Figura 5.18 apresenta os perfis cinticos da fermentao em meio
semissinttico, realizadas a partir dos modelos obtidos (1 e 2), com e sem adio
de cido actico, respectivamente. Verifica-se na Figura 5.18a que os acares
(glicose e xilose) foram totalmente assimilados aps 24 horas para todas as
condies, exceto para modelo 2, na presena de cido actico, que ocorreu 12
horas mais tarde. Vale ressaltar que nos ensaios em meio semissinttico,
diferentemente do observado em hidrolisado, a arabinose foi assimilada pela
levedura e variou com a condio empregada (Figura 5.18b).

129
(b)
30

Modelo 1 + AA

50

Modelo 1

40

Modelo 2 + AA

30

Modelo 2

20
10

Arabinose (g/L)

Glicose + xilose (g/L)

(a)
60

Modelo 1

25

Modelo 2 + AA
Modelo 2

20
15
10

12

24

36

48

60

12

24

36

48

tempo (h)

tempo (h)

(c)

(d)

28
24
20
16
12
8
4
0

60

72

18

Modelo 1 + AA
Modelo 1
Modelo 2 + AA
Modelo 2

Biomassa (g/L)

Etanol (g/L)

Modelo 1 + AA

15
12
9

Modelo 1 + AA

Modelo 1
Modelo 2 + AA

Modelo 2

0
0

12

24

36

tempo (h)

48

60

12

24

36

48

60

tempo (h)

Figura 5.18. Comportamento cintico observado na bioconverso de acares pela levedura P. stipitis em meio semissinttico,
simulando as condies otimizadas em HHBM:: consumo de glicose e xilose (a) e arabinose (b); formao de etanol (c) e biomassa (d).

130

Nota-se que a arabinose foi pobremente consumida enquanto ainda havia

xilose. Verifica-se ainda que aps 72 horas de fermentao, cerca de 21% da
arabinose foi consumido nos meios onde o cido actico foi adicionado e 41% nos
meios onde este cido no esteve presente. De fato, o consumo de arabinose,
pode ter sido responsvel pelo crescimento intermitente da levedura (Figura
5.18d) aps o esgotamento dos outros acares, o que estaria de acordo com
relatos da literatura sobre a capacidade da levedura P. stipitis de produzir
biomassa a partir de arabinose (Nigam, 2002), visto que aps o consumo total de
xilose no houve formao de produto.
Com relao produo de etanol (Figura 5.18c), nota-se que as maiores
concentraes (26,0 e 24,0 g/L) foram obtidas a partir das condies de pH e
concentrao inicial de clulas otimizadas em HHBM no destoxificado (modelo 1:
pH 6,4 e X0 = 5,0 g/L), sugerindo que em meio semissinttico, ausente de furanos
e fenlicos totais, o cido actico no afetou a bioconverso por P. stipitis. A partir
destes resultados possvel constatar que o desempenho da levedura em meio
semissinttico

foi

superior

ao

observado

nos

ensaios

em

hidrolisado

(destoxificado ou no), o que j era esperado devido ausncia de parte dos

compostos inibidores. Como j reportado por Telli-Okur e Eken-Saracoglu, (2008),
as fermentaes em hidrolisados so caracterizadas por uma cintica lenta com
fatores de converso e produtividade em etanol, inferiores ao observado em meio
semissinttico, mesmo aps a destoxificao.
A Tabela 5.19 apresenta os resultados obtidos nestes ensaios, bem como
os parmetros fermentativos obtidos em cada condio avaliada. Considerando o
modelo 1 (hidrolisado no destoxificado), o fator de converso e a produtividade
volumtrica em etanol foram superiores quando comparados aos ensaios de
otimizao em HHBM, cerca de 13% (0,47 para 0,41 g/g) e 66% (1,08 para 0,65
g/g), respectivamente. Por outro lado, para o modelo 2 (hidrolisado no
destoxificado) os valores de YP/S foram similares (0,38 para 0,40 g/g), enquanto
que para QP os valores foram aproximadamente 40% (0,64 para 0,46 g/L.h)
superiores aos obtidos nos ensaios de otimizao em HHBM destoxificado.
Adicionalmente, verifica-se que os melhores resultados de YP/S (0,47 g/g) e QP
(1,08 g/L.h), assim como tambm a eficincia de converso do processo (92%)
foram alcanados a partir do modelo 1,ou seja, hidrolisado no destoxificado (pH
6,4 e X0 = 5,0 g/L) em pH adicionado de cido actico.

131

Com base nos resultados apresentados, sugere-se que nas condies

empregadas em hidrolisado de bagao de malte, o cido actico pode ter sido
utilizado pela levedura como fonte de carbono extra, contribuindo para o
processo. Tais resultados esto de acordo com os dados reportados por Cho et
al., (2010), que estudaram a influncia do cido actico na fermentao em meio
semissinttico, por P. stipitis. Estes autores adicionaram 0,70 g/L de cido actico
ao meio de fermentao composto por 58 g/L de xilose, 3,0 g/L de extrato de
levedura e 1,0 g/L de K2HPO4 e observaram que a adio do cido contribuiu para
o aumento de alguns parmetros fermentativos (YP/S de 0,42 para 0,45 g/g e QP
0,34 para 0,37 g/L.h).

Tabela 5.19. Parmetros fermentativos obtidos na fermentao em meio

semissinttico pela levedura P. stipitis, empregando-se as condies dos modelos
obtidos em hidrolisado no destoxificado (modelo 1) e destoxificado (modelo 2), na
presena ou no de cido actico.
Resultados
Parmetros

Modelo 1

Modelo 2

Tempo de fermentao (h)

+ AA
24

sem AA
24

+ AA
36

sem AA
24

pH inicial

6,40

6,45

6,00

6,10

X0 (g/L)

5,00

5,00

1,36

1,36

Concentrao de cido actico (g/L)

2,80

2,30

Consumo de acares (%)

99,85

100

99,94

98,36

Consumo de arabinose (%)

nd

9,80

3,96

1,50

Concentrao celular (g/L)

13,85

13,41

12,81

9,80

Concentrao de etanol (g/L)

26,02

24,39

23,02

23,50

YP/S (g/g)

0,47

0,42

0,38

0,40

YX/S (g/g)

0,17

0,14

0,19

0,15

QP (g/L.h)

1,08

1,02

0,64

0,98

QS (g/L.h)

2,36

2,53

1,73

2,39

(% do terico)

92

82

74

78

X0:concentrao inicial de clulas; consumo de acares: glicose e xilose; : eficincia de

converso

132

importante ressaltar, que a composio dos meios utilizados para

avaliao do cido actico seria exatamente igual no fosse pela variao de pH,
concentrao inicial de clulas e concentrao de cido. Consequentemente, o
desempenho

superior

da

levedura

nesta

condio,

provavelmente

est

relacionado maior concentrao celular empregada nesta condio (5,0 g/L).

Como mostrado anteriormente, o aumento da concentrao celular
favoreceu principalmente as velocidades do processo fermentativo (QP e QS),
concordando com a literatura, como j relatado neste trabalho. O estudo realizado
por Agbogbo et al., (2007) mostrou claramente o efeito positivo do aumento da
concentrao celular sobre a produtividade em etanol, na fermentao por P.
stipitis CBS 6054 em meio semissinttico. Quando avaliou-se o efeito do cido
actico no presente trabalho, verificou-se que mesmo na presena deste
importante inibidor para a levedura P. stipitis, ocorreu um aumento de cerca de
68% na produtividade em etanol, alm de um fator de converso de substrato em
etanol, 24% superior.
Nota-se que em meio semissinttico, livre de furanos e compostos
derivados da lignina, a fermentao apresentou parmetros mais elevados tanto
em relao converso do substrato, quanto velocidade de formao de
produto. Silva (2001) estudou o efeito do cido actico sobre a fermentao do
hidrolisado hemicelulsico de bagao de cana na produo de xilitol por Candida
guilliermondii. Para efeito de comparao, a autora realizou ensaios utilizando
meio semissinttico simulando as concentraes de acares e compostos
inibidores do hidrolisado e observou que a toxicidade do cido actico se deve a
uma possvel interao do cido com outros compostos como 5-HMF, furfural e
compostos fenlicos totais, uma vez que foram alcanados maiores valores de
rendimento e produtividade em xilitol na fermentao onde somente o cido
actico foi adicionado.
Outro fator importante, a ser considerado a composio do meio
semissinttico utilizado, visto que foram adicionados no somente o extrato de
levedura, mas tambm alguns sais conhecidamente importantes para a levedura.
Armatey e Jeffries, (1994) avaliaram a produo de etanol por P. stipis CBS 6054
em meio sinttico e observaram que peptona, extrato de levedura, sulfato de
magnsio e KH2PO4 contriburam para o aumento produtividade e concentrao
final de etanol. De fato, o uso de meio semissinttico para a produo de etanol

133

proporciona maiores fatores de converso de substrato e produtividade em etanol,

contudo torna-se invivel industrialmente devido ao seu custo elevado. Por outro
lado, representa uma ferramenta importante para se estabelecer condies e
comparaes em processos que utilizam hidrolisados provenientes de resduos
agrcolas.

5.7 Fermentao do hidrolisado hemicelulsico de bagao de malte pela

levedura Pichia stipitis em biorreator
Visando avaliar a cintica da fermentao pela levedura P. stipitis nas
condies de pH e concentrao inicial de clulas previamente otimizadas em
frascos Erlenmeyers, foram realizadas fermentaes em biorreator utilizando-se o
hidrolisado hemicelulsico de bagao de malte no destoxificado em pH 6,4 e
concentrao inicial de clulas de 5,0 g/L.
Na Figura 5.19 mostrada a cintica da fermentao realizada em
biorreator e em frascos, onde so apresentados o consumo de glicose, xilose e
cido actico e a formao de etanol e biomassa pela levedura P. stipitis. Verificase que em biorreator, tanto o consumo total de acares quanto a mxima
produo de etanol foram alcanados em 52 horas de fermentao, isto , cerca
de 16 horas aps a mxima concentrao de etanol observada na fermentao
em frascos (36 horas). No entanto, as concentraes mximas de etanol foram
similares nas duas fermentaes (22,62 g/L em biorreator e 23,40 g/L em
frascos), ocorrendo aps este perodo uma discreta e gradual reduo nestas
concentraes.
Com relao ao cido actico, nota-se que na fermentao em biorreator
este foi lentamente consumido durante as 72 horas, podendo ser a causa do
consumo mais lento de xilose. Vale ressaltar que aps 36 horas, cerca de 60 e
90% deste cido foi consumido nas fermentaes em biorreator e em frascos,
respectivamente. devido presena do cido durante todo o perodo de
fermentao. Quanto formao de biomassa, nota-se que nas primeiras 12
horas de fermentao em biorreator, ocorreu uma fase de adapatao da
levedura, que possivelmente ocorreu devido s diferenas de oxigenao entre os
dois sistemas operacionais empregados.

134

(a)

(b)
Glicose - biorreator

50

Glicose - frascos

40

Xilose - biorreator

30

Xilose - frascos

20
10

3,0

cido actico (g/L)

Acares (g/L)

60

2,5

Biorreator

2,0

Frascos

1,5
1,0
0,5
0,0

0
0

12

24

36

48

60

72

12

24

tempo (h)

15

Biorreator

10

Frascos

16 24 32 40 48 56 64 72

tempo (h)

Biomassa (g/L)

Etanol (g/L)

20

60

72

(d)

25

48

tempo (h)

(c)

36

16
14
12
10
8

Biorreator

6
4
2

Frascos

12

24

36

tempo (h)

48

60

72

Figura 5.19. Comportamento cintico apresentado pela levedura P. stipitis, na fermentao do hidrolisado hemicelulsico de bagao de
malte, em biorreator e em frascos agitados,, empregando
empregando-se
se as condies otimizadas de pH e concentrao inicial de clulas (modelo 1).

135

Na Tabela 5.20 so apresentados os parmetros obtidos nas fermentaes

em biorreator e em frascos Erlenmeyers. Verifica-se que os valores dos
parmetros da fermentao em biorreator so inferiores ao observado na
fermentao em frascos, sendo os valores de produtividade volumtrica em etanol
(0,44 g/L.h) e velocidade de consumo de substrato (1,11 g/L.h) cerca de 30%
mais baixos. Alm disso, observa-se tambm uma reduo de 16% na eficincia
de converso do processo, em relao ao observado em frascos, contudo este
ndice ficou acima de 70%.

Tabela 5.20. Parmetros fermentativos obtidos na fermentao do hidrolisado

hemicelulsico de bagao de malte no destoxificado pela levedura P. stipitis, sob as
condies otimizadas de pH e concentrao inicial de clulas em biorreator e em
frascos agitados.
Resultados
Parmetros
Biorreator

Frascos

Tempo de fermentao (h)

pH inicial

52

36

6,49

6,45

Concentrao inicial de clulas (g/L)

4,85

4,80

Concentrao inicial de cido actico (g/L)

2,58

2,90

Concentrao inicial de acares (g/L)

60,10

58,00

Consumo de acares (%)

95,61

99,51

Concentrao celular (g/L)

12,85

11,70

Concentrao de etanol (g/L)

22,62

23,40

YP/S (g/g)

0,37

0,41

YX/S (g/g)

0,14

0,11

QP (g/L.h)

0,44

0,65

QS (g/L.h)

1,11

1,60

(% do terico)

72

80

acares: glicose e xilose; : eficincia de converso

Apesar da bioconverso do HHBM por P. stipitis, em biorreator ter sido

mais lenta, os resultados obtidos neste estudo so comparveis aos resultados
observados em outros trabalhos. van Zyl, Prior e du Preez, (1988) estudaram a

136

fermentao do hidrolisado de bagao de cana (45,0 g/L de acares) em

biorreator, submetendo este hidrolisado a diversos tratamentos. Os autores
alcanaram os melhores resultados aps neutralizao do hidrolisado com
Ca(OH)2, mostrando valores de 0,38 g/g e 0,25 g/L.h para fator de converso e
produtividade volumtrica em etanol, respectivamente. No presente trabalho, os
valores observados para YP/S e QP foram de 0,37 g/g e 0,44 g/L.h,
respectivamente, como mostrado na Tabela 5.20. Nota-se que a converso do
substrato em etanol foi similar ao observado pelos autores, entretanto a
velocidade de produo do etanol foi aproximadamente 76% maior, a partir do
hidrolisado de bagao de malte, no submetido a qualquer processo de
tratamento.
A Figura 5.20 apresenta uma comparao entre os parmetros
fermentativos obtidos nas fermentaes em frascos, em meio semissinttico
(MSS) e em HHBM no destoxificado, em frascos e em biorreator. So
apresentadas a converso de substrato e a produtividade volumtrica em etanol,
por serem considerados os principais parmetros a serem avaliados na
fermentao de acares a etanol.

YP/S (g/g) e QP (g/L.h)

1,2
YP/S(g/g)

1,0

QP (g/L.h)

0,8
0,6
0,4
0,2
0,0

Frascos - MSS

Frascos - HHBM

Biorreator - HHBM

Figura 5.20. Fator de converso do substrato (YP/S) e produtividade volumtrica em

etanol (QP) obtidos nas fermentaes em frascos (meio semissinttico e HHBM) e em
biorreator (HHBM), por P. stipitis. Foram empregadas as condies de pH (6,4) e
concentrao inicial de clulas (5,0 g/L) otimizadas em HHBM.

137

Nota-se que com relao ao fator de converso do substrato em etanol

(YP/S), a diferena observada entre os ensaios foi relativamente pequena, sendo
12,76% entre a fermentao realizada em meio semissinttico e frascos agitados
e 9,75% entre este ltimo e a fermentao em biorreator. Por outro lado, a anlise
da produtividade volumtrica em etanol mostrou uma variao consideravelmente
maior entre os diferentes ensaios fermentativos.
Em meio semissinttico, a produtividade em etanol foi de 1,08 g/L.h, isto ,
cerca de 66% maior que a obtida em frascos (0,65 g/L.h) e 145% maior que a
obtida em biorreator (0,44 g/L.h).
Ainda assim, os parmetros relacionados produo de etanol em
hidrolisado hemicelulsico de bagao de malte podem ser considerados
promissores, mesmo sendo observada uma reduo dos mesmos quando se
transferiu as condies otimizadas em frascos para o biorreator. De fato, h
necessidade de estudos adicionais visando melhorar o desempenho da levedura
nas fermentaes em biorreator, como a avaliao de diferentes condies de
aerao e agitao. Silva, Mussatto e Roberto, (2011) estudaram a influncia de
aerao e agitao sobre a fermentao do meio semissinttico pela levedura P.
stipitis NRRL Y-7124, em biorreator. Estes autores observaram pequenas
variaes a partir de valores de kLa entre 0,7 a 12,1 h-1, alcanando os melhores
resultados a partir de um kLa de 4,9 h-1 (0,32 g/g e 0,32 g/L.h para YP/S e QP,
respectivamente).
No presente trabalho, foi utilizado um kLa de 11,0 h-1 obtido a partir de uma
aerao de 0,25 vvm e 320 rpm de agitao, entretanto, como observa-se na
literatura, tais condies variam de acordo com vrios fatores empregados no
processo de bioconverso como microrganismo, meio de fermentao, pH, entre
outros, da a necessidade de estudos adicionais.
A Tabela 5.21 apresenta o desempenho da levedura P. stipitis em
diferentes hidrolisados hemicelulsicos reportados na literatura e neste estudo.

138

Tabela 5.21. Produo de etanol pela levedura P. stipitis NRRL Y-7124 em biorreator,
a partir de hidrolisados hemicelulsicos obtidos de diferentes resduos agrcolas.

Hidrolisado

Microrganismo

Substrato
(g/L)

Etanol
(g/L)

YP/S
(g/g)

QP
(g/L.h)

Referncia

Palha de trigo

P. stipitis

60,0

12,90

0,36

0,30

Bagao de cana

P. stipitis

48,5

15,00

0,38

0,25

Jacinto de gua

P. stipitis

67,5

18,00

0,35

0,18

Casca de semente
de girassol

P. stipitis

35,0

9,66

0,41

0,18

Bagao de malte

P. stipitis

60,2

22,62

0,37

0,44

1: Nigam (2001); 2: van Zyl et al. (1988); 3: Nigam (2002); 4: Telli Okur e Eken Saraoglu, (2006);
5: este estudo

Verifica-se que o hidrolisado de bagao de malte empregado neste trabalho

apresentou um desempenho similar aos outros trabalhos, quando avaliada a
converso do substrato em etanol (0,37 g/g). Entretanto, quando se considera a
produtividade volumtrica em etanol, o valor obtido neste estudo (0,44 g/L.h) foi
consideravelmente superior, evidenciando seu potencial para a produo de
etanol, visto que este parmetro considerado o mais importante quando
considera-se a produo industrial de etanol.

139

CONCLUSES

Os resultados do presente trabalho permitem concluir que:

O hidrolisado hemicelulsico de bagao de malte obtido por hidrlise com

cido diludo, apresenta nutrientes essenciais ao metabolismo de P. stipitis, visto
que a levedura foi capaz de crescer e produzir etanol sem suplementao
nutricional. Contudo, a adio de 3,0 g/L de extrato de levedura hidrolisado
favoreceu a bioconverso por P. stipitis, elevando os valores de YP/S e QP em 76 e
120%, respectivamente.
O cultivo da levedura P. stipitis em HHBM, aps o crescimento prvio em
meio semissinttico, elevou as velocidades do bioprocesso em cerca de 15% para
QP e 10% para QS, provavelmente por promover a aclimatao da levedura ao
hidrolisado, o qual contm compostos potencialmente inibidores. Adicionalmente,
esta estratgia tornou o processo de produo de etanol mais vivel
economicamente por eliminar a etapa realizada em meio semissinttico.
Valores elevados de pH e concentrao inicial de clulas podem ser
utilizados como estratgia para contornar a toxicidade dos compostos inibidores
presentes no HHBM, entretanto os valores destas variveis so dependentes do
hidrolisado empregado (destoxificado ou no) no processo fermentativo. Em
HHBM no destoxificado os valores timos de pH (6,4) e X0 (5,0 g/L) resultaram
em valores de QP e QS, cerca de 100% e 120% superiores s condies no
otimizadas. Por outro lado, apesar da destoxificao do HHBM com carvo
ativado ter reduzido a concentrao de furanos e compostos fenlicos totais, as
condies timas de pH (6,0) e X0 (1,36 g/L) resultaram em valores de YP/S, QP e
QS em torno de 29, 85 e 43% inferiores, respectivamente, quando comparados ao
hidrolisado no destoxificado. Assim, o processo de destoxificao parece ter
alterado a composio nutricional do hidrolisado, retirando ou reduzindo o teor de
nutrientes essenciais ao processo de bioconverso por P. stipitis.
Em meio semissinttico, a presena do cido actico nas concentraes
empregadas neste estudo, favorece o processo fermentativo, mostrando que seu
efeito inibitrio pode ser contornado pelo emprego de valores superiores de pH
(6,4) e concentrao inicial de clulas (5,0 g/L), como observado nas
fermentaes realizadas sob as condies do modelo 1. A partir de tais condies

140

foi obtida uma eficincia de converso do processo de 92%, isto , superior

observada em HHBM (80%). J nas condies de pH e concentrao inicial de
clulas do modelo 2, foram obtidos valores inferiores para YP/S e QP quando
comparados aos obtidos com o modelo 1, devido provavelmente ao emprego de
1,36 g/L de clulas.
As fermentaes em biorreator, realizadas sob as condies de pH e
concentrao inicial de clulas otimizadas em HHBM no destoxificado (pH 6,4 e
X0 = 5,0 g/L), resultaram em uma cintica mais lenta quando comparada s
fermentaes em frascos (QP 32% menor), contudo a converso do substrato em
etanol foi apenas 10% inferior. Provavelmente as condies de oxigenao nos
diferentes sistemas empregados (frascos e biorreator) resultou neste decrscimo,
sendo necessria a otimizao de tais condies.
As condies de fermentao para o hidrolisado hemicelulsico de bagao
de malte estabelecidas neste estudo fornecem uma importante contribuio
quanto sua utilizao em processos biotecnolgicos para a produo de etanol
por P. stipitis. Considerando-se a produo de cerveja no Brasil, possvel
estimar que cerca de 650 milhes de litros de etanol poderiam ser produzidos
anualmente, a partir do bagao de malte gerado no pas, levando em conta a
converso alcanada no presente estudo.

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