PRACTICA: TINCIN DE GRAM

PRINCIPIO
La tincin diferencial requiere el uso de al menos 3 reactivos qumicos que
se aplican en secuencia a un frotis fijado por calor. El primer reactivo es
llamado tincin primaria o colorante primario. Su funcin es impartir color a
todas las clulas. Con el objetivo de establecer un contraste de color, el
segundo reactivo usado es un agente decolorante, el cual puede decolorar la
clula completa o solo parte de ella. El reactivo final, el colorante de contraste,
le da a las clulas decoloradas un color que contrasta con el del colorante
primario. El colorante de contraste no puede ser absorbido por clulas que no
han perdido el colorante primario. De esta manera, tipos de clulas o sus
estructuras se pueden distinguir unas de otras en funcin del colorante que es
absorbido. El mtodo de tincin diferencial ms importante usado en
bacteriologa es la tincin de Gram, llamada as en honor al Dr. Hans Christian
Gram.

MATERIALES:
CULTIVOS: Escherichia coli y Staphylococcus aureus
REACTIVOS: Cristal violeta, Yodo Lugol, Alcohol acetona Safranina.
EQUIPOS Y MATERIALES: Mechero de alcohol, asa de siembra, portaobjetos,
papel de absorcin y microscopio.
PROCEDIMIENTO
1. En un portaobjetos limpio

2. Prepare un frotis de cada uno de los microorganismos. Para preparar los

frotis se sigue el siguiente procedimiento:
a. Colocar una pequea gota de agua en el centro de un portaobjetos limpio. Es
necesaria muy poca cantidad de agua, por lo que se puede usar el asa de
siembra, ya que en el extremo curvo de su filamento queda retenida una
mnima gota de agua, que es suficiente.
b. Flamear el asa de siembra y dejar enfriar. Tomar, en condiciones aspticas,
una pequea cantidad del cultivo bacteriano en medio slido y transferirlo a la
gota de agua. Remover la mezcla con el asa de siembra hasta formar una
suspensin homognea que quede bastante extendida para facilitar su secado.
c. Esperar hasta que el lquido se evapore o acelerar su evaporacin acercando
el portaobjetos a la llama del mechero. En este caso hay que tener mucha
precaucin de no calentar demasiado el portaobjetos pues las clulas pueden
deformarse o romperse.
3. Permita que los frotis se sequen al aire y luego fjelos con calor.
4. Tia con cristal violeta agregando suficiente colorante y deje que acte
durante 1 minuto.
5. Lave suavemente con agua.
6. Inunde suavemente con el mordiente, yodo lugol y deje actuar durante 1
minuto.
7. Lave suavemente con agua.
8. Decolore con alcohol acetona (15-45 segundos).
9. Lave suavemente con agua.
10. Agregue la safranina para la tincin de contraste.
11. Lave suavemente con agua.
12. Seque la preparacin.
13. Examine al microscopio con el objetivo 100X de inmersin de aceite.

AEXOS
Explique qu reaccin de Gram darn las levaduras. Estos tendrn la misma
importancia que para las bacterias.
A qu se debe el distinto comportamiento de las bacterias segn sean Gram+
o Gram-?
Para que se necesita el aceite de inmersin?
Puede hacerse tincin de gram en glbulos rojos?