f hi UNIVERSIDADE ESTADUAL DE FEIRA DE SANTANA, & Curso: Engenharia de Alimentos a Componente Curricular: EXA-411 — Quimica Organica Il Docente: Carla C. Mendes EXPERIMENTO Extragao e separagio cromatografica de pigmentos de folhas verdes Objetivos: 41. Introduzir os fundamentos dos métodos cromatogréficos em laboratério de Quimica Organica 2. Introduzir os métodos cromatograficos de separacao e isolamento de produtos naturais 3. Avaliar 0 poder de eluica0 e 0 poder de resolucao de diferentes fases méveis para separacso ‘rometogréfica de pigmentos de folhas verdes 4, Separar pigmentos de folhas verdes por cromatografia em camada delgada 5. Separare isolar pigmentos de folhas verdes por cromatografia em coluna ciéssica Introdugao ‘Accromatogratia é um método fisico-quimico de separagso dos componentes de uma mistura que se baseia ra distribuigdio dos componentes entre duas fases em contato. Uma das fases permanece fixa (fase estacionaria) € @ outra se desioca através dela (fase mével). A cromatogratia é utiizada para analisar, identiicar ou separar os componentes de uma mistura. Por esta razo, métodos cromatograficos so eficientes e muito utlizados para a Separagéo de misturas quimicamente complexas, ‘Atualmente, a cromatografia ¢ amplamente utilizada em diversas éreas. Por exemplo, por métodos cromatograficos pode-se analisar a urina ou 0 sangue de um atleta para a investigagao do uso de dopping durante uma competi¢go, analisar amostras em quimica forense, controlar a qualidade quimica de medicamentos, de alimentos e do ar, purficar compastos, monitorar 0 progresso de reagées quimicas, separar e isolar compostos de interesse farmacolégico de fontes vegetais e animais, entre outras aplicagdes. © termo “cromatografia’ foi utilizado pela primeira vez pelo botdnico russo Tewett, em 1906. Visando separar as substancias presentes no extrato de folhas, uma amostra do extrato foi adicionada no topo de um tubo de vidro contendo carbonato de calcio (fase estacionaria). A passagem de éter de petréleo (fase mével) através da fase estacionaria e da amostra de extrato de folhas resultou na separacéo dos componentes, os quais foram observados em bandas coloridas ou zonas méveis. O conjunto das bandas foi denominado cromatograma. Chrom = cor e graphie = escrita Durante a passagem da fase mével sobre a fase estacionétia, os compostos da mistura so distribuidos entre as duas fases. Esta distribuigao € governada pelos mecanismos de interacdo fisica os quais se estabelecem entre a amostra, a fase estaciondria e a fase mével. A fase estacionaria retém seletivamente cada componente, resultando na migragao diferencial das moléculas no sistema cromatogréfico e, consequentemente, na sua separacéo. Existem varios mecanismos responséveis pela separaco dos componentes da amostra por cromatografia, ‘como partig&o, excluséo por tamanho molecular, troca iénica, adsorco e bioafinidade. A fase mével deve ser livre de impurezas; no deve reagir com a amostra nem com a fase estacionéria; nao deve dissolver a fase estacionaria @ deve ser facilmente separada dos componentes da amostra. A fase estacionaria deve ser seletiva endo deve reagir com a amostra nem com a fase mével. ‘Na cromatografia por adsoreao, a fase estacionairia é sdlida, porém a fase movel pode ser um liquido ou um gas inerte, O processo de adsorgao dos componentes da amostra se dé na superficie do adsorvente. O equilibrio de adsorgao-dessoreao € governado pelas constantes de adsorcao (K) de cada componente no sistema fase estacionaria (FE) - fase movel (FM). A constante de adsorgéo € igual a raz8o entre as concentragdes do ‘componente nas diferentes fases, a uma dada temperatura. Para os compostos genéricos x e y, presentes em uma amostra, Pelee! Exlew ; Ky = fylre! [yew Se Kx > Ky, ento 0 componente x interage mais fortemente com a fase estacionaria do que o componente . Dessa forma, o componente y sera dessorvido mais facilmente pela fase mével e se deslocara mais rapidamente no sistema cromatografico do que o componente x, sendo possivel a separacao. A constante de adsorcéo de cada composto depende da natureza da fase estacionaria, da natureza da fase mével, da temperatura e da estrutura do composto. Tanto o grau de adsorgo das moléculas dos componentes da amostra na fase estacionéria quanto o grau de dessorcéo destas para a fase mével dependem das intensidades das forcas de interago que se estabelecem entre moléculas da amostra, fase estacionaria e fase mével, como ion-dipolo, coordenagfo, ligagdes de hidrogénio, dipolo-dipolo van der Waals. kxExistem varios tipos de classificago da cromatografia: de acordo com a natureza da fase estacionaria e da fase movel (or exemplo, cromatografia sélido-liquido, liquido-liquido, sélido-gas): de acordo com o mecanismo de Separagao (por exemplo, cromatografia por adsoreao, por traca iGnica, por excluséo), entre outros. De acordo com © sistema fisico que suporta a fase estacionaria, a cromatografia pode ser classificada como cromatografia planar ui cromatograffa em coluna, ‘A cromatografia em camade delgada (CCD) consiste em um método de separagéo dos componentes de uma mistura através da sua migracao diferencial sobre uma camada delgada de adsorvente (fase estacionéria) retida sobre uma superficie plana. Esta técnica surgiu em 1938, mas s6 foi largamente utiizada a partir da década de 60, Atualmente, ainda é praticamente indispensavel em qualquer laboratorio que envolva andlise de substéncias organicas. A CCD & uma técnica simples, barata e muito importante para a separagdo répida e para anélise Quantitativa de pequenas quantidades de material. A CCD é usada para determinar @ pureza do composto, identificar componentes em uma mistura por comparacao com padrSes; monitorar curso de uma reac&o pelo aparecimento dos produtos e desaparecimento dos reagentes e ainda para isolar componentes puros de uma rmistura (cromatografia delgada preparativa - CCDP), Na cromatografia em camada delgada a fase mével ascende, por agéo capilar ou capilaridade, por uma camada fina do adsorvente depositada sobre um suporte, normalmente uma placa de vidro. A utiizagao de aglutinantes, como gesso, permite que o adsorvente permanesa aderido ao suporte. Para o preparo das placas, uma suspensao da fase estacionaria com um aglutinante € depositada uniformemente sobre toda a placa, formando uma camada fina, As placas so expostas 20 ar para secar & temperatura ambiente e mantidas protegidas da contaminacao por poeira. Altemativamente, podem ser utlizadas placas comerciais. Uma pequena guantidade da solucdo da amostra que se deseja separar os componentes é aplicada na placa cromatogratica (cromatoplaca) com o auxilio de um capilar de vidro. Em seguida, a placa colocada verticalmente na cuba cromatografica contendo uma pequena quantidade de fase mével. A cuba deve ser previamente saturada com vapores da fase mével. A fase mével (eluente) se desloca pela camada do adsorvente por aco capilar © os Componentes da amostra se distribuirdo entre a fase mével e a fase estacionaria, Durante este processo, os diversos componentes da mistura so separados a depender do grau de interaco com a fase estacionéria e a fase mével (Fig. 1). cuba cromatogratics oe 05a tem mu r (Ponto de ale apio (2) Pace em deservonsmento na Sosa Suba comatografen frente do solvente |-— frente do sovente mancha ou ‘bande of — “pt origina {3) desenvolvimento lugs) (4) Cromatograma Figura 1, Seperacso dos componentes de uma amostra por cromatografia em camada delgada Um parametro frequentemente usado em cromatografia € 0 “ator de retencdo" de um composto (Rf definido como a razéo entre a distancia percorrida pela banda do componente e a distancia percorrida pela fase mével, tomando como referéncia 0 ponto de aplicacao da amostra na placa. Na CCD, o Rf ¢ fungao da natureza e da espessura da camada da fase estacionéria, da natureza da fase mével e da estrutura quimica do componenteda amostra que esta sendo separado, fator de retenco pode ser calculado (Fig. 2) pela expresso: Rf = de/ds Onde: istancia (em cm) percorrida pelo componente da mistura. jistancia (em cm) percorrida pela fase mével, Figura 2. Medidas para o calculo do fator de retencto (Rf} em CCD. Para que um componente de uma amostra possa ser separado eficientemente por CCD. 0 seu Rf naquale sistema cromatogréfico deve ser um numero situado entre 0,4 € 0,6, Valores de Rfs préximo a zero indicam forte interagao do componente da amostra com a fase estacionéria @ baixo poder de eluigéo da fase mével. Por outro lado, valores de Ris proximos a 7,0, indicam fraca intera¢ao do componente da amostra com a fase estacionéria € alto poder de elui¢ao da fase mével. Quando os componentes da amostra apresentam colorago, 0 cromatograma é facilmente visualizado & olho ni € 0 calculo dos Rf pode ser feito diretamente por inspecdo das bandas cromatograticas na place. No caso de no visualizacdo de bandas coloridas, uma inspecdo adicional pode ser realizada através da revelacdo das placas por métodos fisicos e/ou quimicos. Dentre os métodos utlizados, podem ser citados a revelagdo das placas com vapores de iodo, por nebulizagao de reagentes quimicos especificos e por irradiago com luz ultravioleta, neste ultimo caso, para a detecgo da presenca de compostos fluorescentes. Em geral, qualquer placa cromatografica apés 0 desenvolvimento é revelada por um destes métodos ou pela sua combinacdo, visando a detecgdo de determinadas classes de compostos e a avaliacao do grau de complexidade quimica da amostra. Métodos cromatograficos podem ser realizados em uma coluna (por exemplo, tubo de vidro ou ago inox) echeada com a fase estacionaria, genericamente chamados de cromatografia em coluna. A sepatag&o dos compostos se da pela passagem continua da fase mével através da coluna. Na cromatografia em coluna cléssica, 0 fluxo da fase movel se dé pela agao da forca da gravidade. Os diferentes componentes da mistura deslocam-se na coluna cromatografica com velocidades distintas dependendo do grau de sue afinidade pelo adsorvente e pela fase movel. Por exemplo, moléculas polares interagem melhor com um adsorvente poler do que com moléculas de menor polaridade. Entao, se um sistema cromatogréfico contem uma fase estacionaria polar, as moléculas da ‘amostra com maior polaridade migraro mais lentamente na coluna do que as de menor polaridade. ‘A capacidade de um determinado eluente dessorver (‘arrastar’) um composto adsorvido na fase estacionaria depende da polaridade do solvente relativamente ao composto e a fase estacionéria. A dessorgso de moléculas componentes da amostra ocorre quando moléculas da fase mével substituem as primeiras nos sitios de adsoreao da fase estacionaria e/ou quando moléculas da fase mével interagem fortemente com moléculas da ‘mostra. Quanto maior @ capacidade de uma fase mével em dessorver moléculas da amostra adsorvidas na fase estacionaria, maior sera 0 seu poder de eluicdo. Se, por exemplo, a fase estacionéria for poler, quanto maior a Polaridade da fase mével, maior seul poder de eluigdo. Normalmente, a literatura indica a série eluotrépica de solventes para cromatografia, como exemplificado na tabela abaixo. Tabala 1, Série de eluenies de baixo ponto de ebulgSo, em ordem crescente de polaridade Hexano toro ptrseo * Cicloexana Tetraclreto de carbono Benzeno Telueno Diclorometano Glorotemio Ever etico ‘Acsato ola Prraina Acatona Etanol Motanol ‘Acido acca _ Nao é desejavel que a fase mével apresente o mesmo poder de eluigo para todos os componente da ‘mostra, pois isso poder comprometer a eficiéncia da separacdo cromatogrsfica, Para que a separacdo ocorra, os componentes da amostra_dever apresentar velocidades diferentes de migrago no sistema cromatografico, Eniéo,2 eficiéneia da separagao dos componentes de uma amostra por cromatografia depende do grau de seletividade de fase estacionéria aliada & capacidade de eluigdo da fase mével. A medida que os compostos da mistura so separados, bandas cromatograficas ou zonas moveis comegam a ser formadas. Se estas bandas forem coloridas ou facilmente reveladas (no caso de compostos incolores), & possivel visualizar a separagao e isolar os ‘componentes monitorando a coluna e recolhendo cada frag3o cromatografica (banda) em diferentes recipientes (Fig. 3). A eluigao dos componentes da amostra na coluna pode acorrer pelo métado isocrético, no qual a mesma fase mével é mantida durante todo 0 experimento, ou por gradiente de polaridade, no qual a polaridade da fase mével € modificada gradativamente, permitindo a dessorg30 e consequente eluigéo de compostos fortemente adsorvidos na fase estacionaria Figura 3. Separagto de componentes de uma amosifa por romatograia em coluna cssica, Uma das intimeras aplicagdes da cromatografia ¢ a separagao e 0 isolamento de produtos naturais. Os terpenos $40 uma classe importante de produtos naturais amplamente elaborados no metabolismo de plantas. Carotenos so uma subclasse dos terpenos e so também chamados genericamente de carofenoides se possuem coxigénio na estrutura. O mais conhecido dos carotenas é o -caroteno (Fig. 4), que & encontrado nomalmente nas plantas e que, junto com outros carotenos presentes em menor proporeéo, é o principal responsével pela colorago. das cenouras. Xantofilas, uma diviséo do grupo de carotenoides, sao pigmentos amarelos presentes em vegetais e {que possuem estrutura molecular semelhante aos carotenos, porém com oxigénio na molécula (Fig. 5). De uma forma geral, carotenos e carotenoides so 0s composios principais responsaveis pelas coloragées amarelalaranja de flores e frutos e, em alguns casos, pela coloragéo vermelha, como exemplo do tomate e pimentao. Estes pigmentos amarelos geralmente 80 encontrados em folhas junto com as cloroflas, As clorofilas 80 os pigmentos naturais mais abundantes presentes nas plantas e ocorrem nos cloroplasios das folhas e em outros tecidos vegetais, sendo responsaveis pela colorago verde nas plantas. Elas atuam como moléculas fotorreceptoras absorvendo luz visivel, a qual é convertida em energia quimica potencialmente usada no proceso de fotossintese. Em geral, as clorofilas so relativamente instaveis e sensiveis a luz, aquecimento, oxigénio e pH. Cerca de 10 tipos de clorofilas tém sido isoladas de partes verdes de plantas. A composiggo quimica varia em fungao do tipo de organismo: apenas uma clorofila pode ser detectada ou a clorofila majortaria & ‘acompanhada por outros pigmentos verdes (chamados pigmentos auxiliares). A clorofila a (verde azulada) é a mais ‘abundant no reino vegetal, sendo encontrada junto com a clorofila b (verde amarelada) (Fig. 6) em uma proporeao de 3:1, respectivamente. A substituigao do atomo de magnésio por dois atomos de hidrogénio na clorofila a, forma a estrutura da feoftina a (Fig. 7), de coloragdo verde oliva e com tons variando de marrom a cinza, RAL ARES Figura 4. Estrutura do frcaroteno LOH SAA IER Ho! Figura 5. Estutura de uma xantofla @Zeaxantina) Mee chy Me Me Procedimento experimental © experimento sera realizado em duas partes: Cromatografia em camada delgada (CCD) (Parte I) e cromatogratia ‘em coluna (CC) (Parte Il) Na Parte | sero realizadas as seguintes atividades: preparacdo de placas cromatogréficas (uma semana antes do experimento); preparo dos extratos orgénicos (de folhas verdes de cenoura) e utiizacdo da CCD para a selecdo da fase mével para a separagao de dois grupos de compostos presentes no extrato de folhas: 0 grupo das clorofilas e 0 grupo dos carotenos (carotenoides paderdo ser facilmente separados, a depender das fases méveis, utiizadas e do tempo do experimento). A visualizacao das bandas correspondentes @ cada grupo de compostos no ‘cromatograma é possivel apés a eluigéo dos compostos em um sistema de solvente (fase mével) indicado. ‘Na Parte Il, a cromatografia em coluna (CC) seré empregada para a separagdo € o isolamento destes grupos de compostos por gradiente de polaridade da fase mével selecionada na parte I do experimento.PARTE | — Experimento de cromatografia em camada delgada IA) Obtencéo do extrato orgénico de folhas verdes e do extrato de cenoura Usando luvas, cortar as folhas (espinatre, coentro, agrido, salsa etc) em pequenos pedacos (sem nervuras) © pesar cerca de 15 a 20 g do material vegetal. Transferir para um almofariz e triturar com o auxilio de um pistilo, adicionando pequenas porc6es de diclorometano para faciltar a extrago dos pigmentos. Pressionar as folhas com Cuidado até que a fase organica obtida apresente uma coloracgo verde escufo. Caso se formem duas fases, no f (normalmente de coloragao marrom).Transferir a fase organica (liquide verde escuro), livre de residuos de folhas, com auxilio de pipeta tipo Pasteur (contendo um pequeno chumago de algodéo na ponta) para um béquer (béquer 1). Secar a fase organica com uma pequena porcao de sulfato de sédio anidro. Transfer, com auxilio de outra pipeta Pasteur, a fase organica livre de umidade para um recipiente seco, rotulado e pesado em balanca analitica (béquer 2). Retirar do béquer 2 cerca de 2 mi do extrato organica, transferir para uma cépsula de Porcelana e deixar secar ao ar (néo secar na capela para evitar condensacao de agua!) para concentrar 0 extrato. Apés evaporacao do solvente, esse material sera utilizado no experimento de CCD. Cobrir o béquer 2 (contendo o resto do extrato de folhas) com papel de filtro ou papel aluminio e levar @ capele para evaporar lentamente 0 excesso de solvente. Reservar o extrato, em local escuro, para a parte Il do experimento. Preparar um extrato hexénico de cenoura da seguinte forma: ralar um pedaco de cenoura crua (cerca de % de uma cenoura média) em um frasco de vidro seco. Adicionar um volume suficiente de hexano para cobrit levemente 0 material solide. Tampar o frasco. Deixar em repouso por cerca de 20 minutos. Retirar uma porco de cerca de 2 mL do extrato com auxilio de uma pipeta tipo Pasteur e transferir para uma cépsula de porcelana. Tampar 0 frasco. Deixar evaporar 0 solvente ao ar para concentrar o extrato (ndo secar na capela para evitar condensacao de agual). O extrato de cenoura seré usado como amostra padrao para carotenos. 1B) Separagéo dos pigmentos por cromatografia em camada delgada 2) Preparo das placas cromatogrificas (uma semana antes da pratica) - Lavar, desengordurar e secar 4 placas de vidro. Em um béquer de 50 mL preparar uma suspensdo uniforme e livre de bolhas com cerca de 3g de gel de silica 806 e cerca de 10 ml de agua destilada (atencdo: pesar cuidadosamente a silica para nao respirar 0 6: uilizar mascara pata_posira até que a suspensao esteia preparada). Durante o preparo, adicionar dgua lentamente @ agitar com bastéo de vidro. A suspenséo deve ser fluida, porém com boa consistencia. Se necessério, Adicionar cuidadosamente mais dgua ou silica para alingir a consisténcia adequada. Agitar a suspensdo com um bastéo de vidro até que esteja livre de bolhas de ar e com aparéncia uniforme (sem gros de silica). Adicionar ‘sobre uma das extremidades da placa uma pequena quantidade de suspenséo (cerca de % da placa). Com auxilio de um basiéo de vidro, espalhar a suspensdo cuidedosamente e de maneita uniforme sobre a placa de vidro, mantendo-a na posigéo horizontal. Ao final, @ placa deve apresentar uma camada de silica fina e uniforme. Repousar as placas em superficie plana livre de posira e deixar secar ao ar. b) Preparo da cuba cromatografica e das fases méveis ~ Uiiizar vidravia live de umidade. Preparar 20 mL de cada fase mével, indicadas a seguir: hexano puro, mistura de hexano-acetona (6:2) e mistura de hexano~ acetona (1:1) (no preparo da mistura de solventes, homogeneizar a solucdo em proveta com auxllio de bastdo de Vidro). Adicionar cada fase mével em um béquer de 250 mL. (cuba eromatografica) contendo papel de fitro aderido em uma das paredes intemas (Fig.1). Se certiicar de que a altura do solvente nao ultrapasse 1,0 cm de altura ‘Tampar imediatamente o béquer com uma placa de Petri para saturago com os vapores do solvente, ©) Aplicagao na placa do extrato de folhas e do extrato de cenoura (padrao). Desenvolvimento dos cromatogramas ~ Utlizar uma placa cromatogréfica (preparada no item a) previamente ativada por aquecimento em estufa a 110°C, por 30 minutos. Com a placa ainda _quente e com o auxilio de uma régua, marcar cuidadosamente nas bordas laterais da placa pontos de referéncia (Fig. 1) 2 uma distancia de 1,0 cm da borda inferior e a 0,5 cm da borda superior (ponto de aplicacéo da amostra e ponto de chegada da frente de migrago do solvente, respectivamente). Nesta placa sero aplicados 0s dois extratos preparados no item A da parte |. Adicionar algumas gotas de diclorometano em cada cépsula de porcelana (contend 0 extrato seco de folhas © contendo o extrato seco de cenoura) para obter, em cada caso, uma pequena quantidade de solugéo concentrada do extrato & de coloracso intensa (extrato concentrado). Com © auxilio de um capilar de vidro, aplicar uma gota do extrato concentrado de folhas a 1,0 cm da parte inferior da placa (ponto de aplicago da amostra) © a uma distancia de 7,0 cm da borda lateral da placa. Utilzando outro capil, fazer 0 mesmo procedimento com o extrato concentrado de cenoura: aplicar o extrato a 1,0 cm da base da placa e a 1,0 cm da outra borda lateral em relagao ao ponto de aplicagao do extrato de folhas. Intfoduzir cuidadosamente a placa dentro da cuba cromatografica, tampar a cuba e esperar que a fase mével atinja a marca de chegada (Fig.1). Retirar a placa com auxio de uma pinga metalica e esperar que © solvente evapore em capela de exaustdo. Nas placas secas, observar as bandas © as suas ‘colorapées. Documentar o cromatograma no cademo de laboratério (Toto ou desenho). Medir as distancias (em cm) percorridas pela fase movel e por cada banda observada (lomando como referéncia o centro das bandas) para os céleulos dos fatores de retencao (Fig. 2). Repetir todo o procedimento para a eluigdo dos dois extratos com as demais tases méveis,PARTE Il - Separaeao por cromatogratia em coluna do extrato orgénico de folhas verdes Antes de realizar 0 experimento, pesar o extrato organico (seco) em balanca analitica e anotar a massa. Usar vidraria livre de umidade. a) Empacotamento da coluna cromatogréfica — Cortar um pedaco de papel de fro na forma de circulo ‘com diametro compativel a0 da coluna. Com auxilio de um bastdo de vidro, cobrir a placa de vidro sinterizado da coluna com o papel. Fixer a coluna verticalmente em um suporte universal. Manter um béquer abaixo da coluna Pesar cerca de 7 9g de gel de silica 60 e preparar uma suspensao com hexano (pasta fluida). Agitar com bastéo de vidro para eliminar as bolhas. Com a tomneira fechada, adicionar hexano na coluna até completar cerca de 1/3 do volume da coluna, Adicionar a suspensdo de slica dentro da coluna com auxilio de um furil de vidro e abrir a tomeira da coluna, Passar varias vezes hexano na coluna para o sélido assentar gradualmente. Nao deixar a coluna secar durante o enchimento. Fechar a tomeira apés 0 empacotamento, b) Aplicacao do extrato na coluna cromatografica - Empregar um dos métodos a seguir. Método 1 (extrato liquido): Abrir a tomeira da coluna até o nivel do solvente se aproximar da superficie da silica (cerca de 0,5 cm acima), porém sem deixar a coluna secar. Com a tomeira fechada e com auxilio de uma pipeta tipo Pasteur de ponta ionga (ou conta-gotas), transferir cuidadosamente @ solug&o concentrada do extrato (dissolvido em pequena quantidade de diclorometano) para o topo da coluna. A solucéo do extrato nao deve tocar as paredes da coluna. Espalhar uniformemente a solugéo do extrato sobre a silica durante a aplicago. Abrir lentamente a tomeira até 0 extrato ser totalmente adsorvido na silica. Fechar a torneira e colocar cuidadosamente ‘sobre o extrato uma camada de silica de cerca de 1 cm de espessura ou um pequeno chumago de aigodao. Método 2 (extrato sélido): Abrir a tomeira da coluna até o nivel do solvente se aproximar da superticie da silica (cerca de 0,5 cm acima), porém ser luna secar. Adicionar uma pequena quantidade de slica 60 solugdo concentrada do extrato organico de folhas (dissolvido em diclorometano) e agitar, usando um basto de vidro, até obter uma mistura séiida totalmente seca e homogénea. Com a tomeira da coluna fechada e com auxilio de uma espétula, aplicar cuidadosamente o extrato no topo da coluna m goluna. Durante a aplicagdo, espalhar uniformemente o extrato sobre a silica. Apés a aplicacéo, colocar ‘cuidadosamente sobre o extrato uma camada de silica de cerca de 1 cm de espessura ou um pequeno chumago de algodao, ©) Eluigo do extrato na coluna cromatografica ‘Selecionar e rotular (em sequéncia numérica) cerca de 08 frascos coletores ou tubos de ensaio, sendo o primelro denominado ‘volume morto" (um erlenmeyer de 125 mL). Com a tomeira da coluna fechada, adicionar ‘cuidadosamente hexano sobre a camada de silica. Abrir a torneira e iniciar @ eluigao da amostra, mantendo 0 fluxo da fase mevel em cerca de uma gota por segundo por todo o experimento, Durante todo o experimento, a coluna ‘do alingi- a amostra-e provocar buracos na camada sdlia, Recolher o ‘volume mort" da coluna no primeiro frasco coletor.Trocar de frasco quando primeira banda (amarela)alingit a placa de vidro sinterizado (prsximna & tomeira da coluna). Manter @ adicSo de hexano até coletar a primeira banda no segundo frasco (Fig.3). Adicionar cuidadosamente uma mistura de hexano-acetona (9:1) e recolher as bandas seguintes, trocando de frasco quando necessério alé que a banda cinza escuro (feoftina a) seja recolhida. Trocar a fase mével para hexano-acetona (6:2) @ eluro extrato até recolher as bandas verdes (cloroflas). Deivar a coluna secar, remover a silica e transfer para Um béquer rotulado para evaporar os residuos de solvente em capela de exaustdo. Observar as coloracces de cada fragdo cromatogrica obtidas.e documentar os resultados. Bibliografia 1. Pavia, D. L; Lampman, G. M.; Kriz, G. S, Introduction Laboratory Techniques ~ A Contemporary Approach. 3. ed. Orlando: Saunders College Publishing, 1988 2. Wilcox, C. F.; Wilcox, M. F. Experimental Organic chemistry ~ A small scale approach. 2. ed, New Jersey: Prentice — Hall, 1988. 3. Collins, C. H.; Braga, G. L; Bonato, P. S. Introdugdo a métodos cromatograficos, 6. ed, Campinas, Editora da UNICAMP. 1995, 4, Streit. N, M.; L. P., Cantertel; Cantoll, M. W.; Hecktheuerll, L. H.H. As Clorofilas. Cione. Rural, v.36, n. 3. p. 748-758, 2008.Questionério Por que as folhas foram moidas? Por que fol adicionado diclorometano? Poderia ser ulizado hexano? Qual a fnaidade do uso da CCD neste experimento? Qual a finaidade do papel de fro dentro da cuba cromatogréfica? Explicar. Se ndo fosse uliizado, o que setia observado? 4. Nos cromatogramas obtidos, foram observadas mais de uma banda de colorago amarela e mais de uma banda de coloragao verde? Indicar/sugerr os compostos (ou classe de composios) que comespondern ow odem corresponder a cada uma dessas bandas, Justice, 5, Caleular os valores dos fatores de retencao para cada banda, Explicar as dferencas encontradas, 6. Analsar os cromalogramas oblidos por CCD e classifcar as fases movels testadas quanto ae poder de resolucso @ quanto a0 poder de eluicdo (salisfatérioido-satisfatoro),Indiear a melhor fase mavel pore a separagdo dos pigmentos. 7. Considerando as estruturas quimicas dos grupos de composios separades, as polatidades da fase estacionéria e da fase mével, comparar e explicar 08 cromatogramas obtidos na parte Ido experinecte, ue grupo de compostos elu primeiro na coluna? Que grupo de compostos fleou rrals redo? 8, Explcar brevemente a particinagio da fase mével e da fase estacioneria na separagao dos componentes de uma amostra por cromatografia s6lido-iquido. Qual foi o mecanismo de separacae dos dois grupos de Compostos neste experimento? 9. Por que a coluna foi empacotada com hexano? Este procedimento poder realizado com a melhor fase mével, selecionada na parte | do experimento? 10, Porque a coluna néo deve possuirbolhas e ndo deve secar? 11. Comparar 0 comportamento cbservado das bandas na CC com o observado na CCD. 12. Que tipo de elvicao fo realizado no experimento de CC? Por qué? 18. Foi possivel separa e isolarclorofila a, clorflab e feotina 4? Caso afimativo, qual a ordem de eluigao destes compostos? Justiear. Quais as coloragdes observadas das bandas? Caso negatvo, sugent Keio menos duas raz6es. 14, Calcular 0 rendimento da extracéo 15. Porque a virara utiizada nos experimentos deve ser lve de umidade? 16. Em um experimento de cromatograia em coluna, utilzando silica como fase estaciondria a partir de 2.500 g de uma amostra de composico quimica conhecida, foram oblidas 8 fragbes cromalogréfcas conforme ‘labelaasegur | Fracao a] Messa(g) | 00823 | 008 «| =——O.azea '. Qual a percentagem de recuperagio da amostia? ». Qual a massa da amostraperdida na coluna? Dé uma possivel expicagao para essa perda €: Como vocé utlizaria a CCD para avaiar a pureza e a composi a 4. Considerando que todas as fragdes oblidas sejam puras (substancia pura), qual o componente que ficou mais tempo retido na coluna’ Qual o componente de menor polardade? ®. Considerando que a fraglo D seja impura (uma mistura), que procecimento seria mais adequado para purficar esta frag? Justia 8 3