MICROBIOLOGIA

PARTE I. BIOSEGURIDAD, METODOS DE ESTERILIZACIN, MANEJO

DEL MATERIAL DEL LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA
PARTE II. METODOS DE SIEMBRA
OBJETIVO GENERAL
Comprender la importancia del laboratorio de microbiologa, para el fomento,
prevencin, diagnstico, seguimiento e investigacin de las enfermedades
infecciosas que afectan la salud pblica.
OBJETIVOS ESPECIFICOS
Reconocer las normas y diferentes niveles de bioseguridad de los
laboratorios de Microbiologa.
Aprender los principales mtodos de esterilizacin, empleados para
laeliminacin de los microorganismos en equipos, materiales e insumos
de laboratorio.
Reconocer los principales materiales utilizados en los procedimientos de
un laboratorio de Microbiologa.
Adquirir destreza en la siembra de diferentes muestras para su
estudiomicrobiolgico.
MARCO TEORICO
En los laboratorios destinados para las prcticas de Microbiologa deben
seguirse normas de bioseguridad e higiene que garanticen la proteccin
contra infecciones tanto de los estudiantes como de los docentes.
Teniendo en cuenta la patogenicidad de los microorganismos presentes en
las muestras procesadas en los laboratorios, el Centro de Control de
Enfermedades (CDE) y el Instituto Nacional de Salud han establecido 4
niveles de seguridad biolgica y han determinado normas especficas para el
trabajo en cada uno de ellos.
Nivel 1: microorganismos no patgenos bien conocidos, y patgenos
oportunistas. Ejemplo: laboratorios de fundamentos de Microbiologa.
Nivel 2: microorganismos y muestras con un potencial patognico moderado
a alto. Ejemplo: laboratorios de enseanza, de diagnstico microbiolgico y
laboratorios de Microbiologa en un centro de atencin primaria.
Nivel 3: microorganismos y muestras de alto riesgo. Ejemplo: laboratorios de
diagnstico especializado.
Nivel 4: microorganismos de altsimo riesgo que requieren mxima
seguridad. Ejemplo: laboratorios para el estudio de virus.

Para trabajar en Microbiologa se deben seguir cuidadosamente las normas

de bioseguridad, poner en prctica los conceptos tericos y concentrar la
atencin en los procesos realizados para obtener un buen aprendizaje y
evitar accidentes biolgicos. Adicionalmente, el material que se utiliza debe
estar completamente libre de toda forma de vida, por lo tanto debe ser lavado
rigurosamente con detergentes, enjuagado repetidamente, secado, envuelto
en papel y, los orificios de los recipientes deben ser tapados con algodn;
para luego ser sometidos a esterilizacin, de acuerdo con las caractersticas
de cada elemento.
METODOS DE ESTERILIZACION
METODOS FISICOS
A. CALOR SECO: Este mtodo utiliza el horno elctrico a temperaturas de
160C durante 1 a 2 horas.
B. CALOR HUMEDO: Se emplea el autoclave a temperatura de 121C, 15
libras /pulgada cuadrada de presin durante 15 a 30 minutos. El autoclave es
una cmara de vapor de doble pared equipada con dispositivos que permiten
que la cmara se llene a saturacin de vapor y mantenga la temperatura y la
presin deseada durante cualquier perodo. La elevada temperatura que
puede alcanzarse cuando el vapor de agua se somete a la presin, facilita la
muerte de todos los microorganismos, incluidas las endosporas resistentes al
calor.
C. ESTERILIZACIN EN FRIO: Se realiza en dispositivos cerrados que se
parecen a autoclaves, pero que emplean un agente qumico como el xido de
etileno, el formaldehdo o el perxido de hidrgeno.
D. RADIACIONES IONIZANTES: Son rayos gamma provenientes de una
fuente de cobalto 68 o cesio 139.
E. RAYOS CATODICOS: Provenientes de generadores o aceleradores de
electrones.
F. RAYOS X: Mortales para todas las clulas. Son muy utilizados en la
industria en artculos que no soportan calor, aunque son radiaciones
costosas.
G. LUZ ULTRAVIOLETA: Es bactericida desde la longitud de onda de 333
nm, aumentando su efectividad a longitudes menores. Se utiliza
frecuentemente para reducir el nmero de bacterias aerotransportadas en
quirfanos, bioterios y laboratorios donde se maneja material altamente
infeccioso. En material de laboratorio es poco efectiva debido a su poca
penetrabilidad.

H. FILTRACIN: Se utiliza para esterilizar lquidos sensibles al calor o

gases. Un filtro es un dispositivo con poros milimetricos para que evitan el
paso de los microorganismos, pero permiten el paso de los lquidos y los
gases. Los principales tipos de filtros son:
Filtro de profundidad: Consiste en placas de papel, asbesto o fibras de vidrio,
cuyas fibras se superponen y en ellas quedan atrapadas las partculas.
Filtros de membrana: Es un disco duro, generalmente compuesto de acetato
de celulosa o de nitrato de celulosa. Las membranas porosas se colocan
dentro del recipiente, en el cual se pone el lquido que se va esterilizar, y ste
pasa a travs del filtro, recogindose en una fiola con presin negativa para
acelerar el paso del lquido a travs del filtro. Es el ms comn en el campo
de la microbiologa.
Filtro de Nucleopore: Se elaboran tratando pelculas muy finas de
policarbonato de 10 micras de grosor, con radiacin nuclear y procesando
luego la pelcula con un qumico. La radiacin causa daos localizados en la
pelcula y el tratamiento qumico agranda esto a puntos daados
convirtindolos en agujeros. Estos filtros se utilizan mucho para la
microscopa electrnica de barrido para observar y analizar microorganismos.
I. FLAMEADO: Proceso de esterilizacin por incineracin que destruye
cualquier forma de vida de superficies como el asa bacteriolgica,
bajalenguas y aplicadores.
METODOS QUIMICOS
A. DESINFECTANTES Y ANTISPTICOS: Los desinfectantes son
productos qumicos que matan a los microorganismos y se utilizan
sobre objetos inanimados. Los antispticos, por otra parte, son
agentes qumicos que matan o inhiben el crecimiento de los
microorganismos y entre ellos hay algunos lo suficientemente
inocuos para ser aplicados a los tejidos vivos. Ver tabla 1.

Tabla 1. Mecanismo de accin, usos y propiedades de las principales

categoras e desinfectantes qumicos
AGENTES

ACCION PRINCIPAL

Alcoholes

Solvente de grasas
Desnaturaliza
protenas

Mercuriales

Nitrato de Plata

Compuestos
fenlicos
Yodo

Compuestos
clorados

Compuestos
cuaternario de
amonio

Glutaraldehido

USOS COMUNES

OTRAS PROPIEDADES

Antisptico de piel
Desinfectantes
superficies

Accin rpida
de Flameable
Seca la piel
Actividad insecticida dbil
Antispticos de piel
Inactiva protenas
Se inactiva con Materia
Desinfecta superficies
orgnica
Se inactiva con materia
Desnaturaliza
Antisptico para ojos y orgnica
protenas
quemaduras
Afecta un
de microbiosrango limitado
Antispticos para
lavar
Altera la
membrana
No se
inactiva por
piel
Celular
materia orgnica estable
Desinfectantes de objetos
Inactiva protenas
Mal olor
inanimados
Soluble en alcohol
Accin rpida
Inactiva Protenas
Antisptico de piel
Se mezcla con jabones
Se inactiva con materia
Tratamiento de
agua orgnica
Oxida enzimas
Desinfectante de objetos Accin relmpago
inanimados
Corrosivo
Irrita piel
Activa
superficie
Altera
membrana Antisptico
de
piel Se neutraliza con jabones
Celular
Desinfectante de objetos Inodoro
Desnaturaliza
inanimados
No irritante
protenas
Inestable
Esterilizar
en
fro
Txico
Inactiva protenas
instrumentos sensibles al Actividad alta en medio
calor
alcalino

DILUCION
EMPLEADA
%
70

0,1

0,5 - 5

2
5
(Como
blanqueador)

<1

1-2

MATERIALES UTILIZADOS EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA

Microscopio ptico
Autoclave
Balanza de precisin
Vasos de precipitado (Beakers)
Incubadora
Probetas
Gradillas
Tubos de ensayo
punta
Cajas de Petri

Embudo
Gotero
Balones de fondo plano
Mecheros
Laminas portaobjetos
Medios de cultivo
Pipetas Pasteur
Asas microbiolgicas: en

y redonda

MICROSCOPIO
La invencin del microscopio permiti el desarrollo de la Microbiologa,
gracias a la visualizacin de los organismos invisibles al ojo.
El primer microscopio se limit a una simple lente biconvexa, con muy poco
aumento, pero permiti el descubrimiento del inmenso mundo microscpico.
As mismo, los avances tecnolgicos han llevado al diseo y la construccin
de microscopios altamente especializados, para el estudio de los
microorganismos de una manera exacta, con mejor poder de resolucin y en
varios planos.

AUTOCLAVE
Es un aparato hermtico que permite la entrada de vapor de agua a presin,
para esterilizar material o medios de cultivo.

ASAS BACTERIOLGICAS:
Instrumento hecho de ferroniquel, que se utiliza para hacer las siembras de
las diferentes muestras en los medios de cultivo. Hay dos tipos de asas: recta
y curva.

ASA EN PUNTA ( RECTA )

ASA REDONDA (CURVA)

CAJAS DE PETRI:
Recipiente en material de vidrio o plstico para medios de cultivo slidos,
ideado por Richard Petri.
COLORANTES:
Los colorantes utilizados en microbiologa son sales, que tienen iones
cargados elctricamente. Para los colorantes aninicos o cidos, el ion
coloreado es el cargado negativamente, por ejemplo la eosina y la fucsina
cida. En cambio, cuando el ion coloreado es el positivo, el colorante se
clasifica como catinico o bsico, por ejemplo azul de metileno, cristal violeta,
safranina.
MEDIOS DE CULTIVOS:

Los medios de cultivo pueden clasificarse segn diferentes criterios, pero los
ms importantes son aquellos que se basan en:
a) Su consistencia
b) Su utilizacin
c) Su composicin
SEGN SU ESTADO FSICO (CONSISTENCIA).
1) Medios lquidos: Son los que se presentan en este estado,
denominndose por esta razn caldos. El medio lquido ms utilizado es el
llamado caldo nutritivo, compuesto principalmente de extracto de carne,
peptona y agua. Se utiliza fundamentalmente cuando se pretende la
obtencin de una suspensin bacteriana de una determinada concentracin.
2) Medios slidos: Se preparan a partir de los medios lquidos,
agregndoles un agente gelificante. Los ms utilizados son la gelatina y el
agar. Gelatina: Es una protena animal obtenida de los huesos. Tiene el
inconveniente de que es hidrolizada por muchas bacterias, y adems su uso
est muy limitado porque su punto de fusin es bajo (lica a temperatura
ambiente) razn por la que no puede utilizarse para cultivos a 37C, que es la
tempera ptima de crecimiento para muchos microorganismos. Agar-agar:Es
un polmero de azcares obtenido de algas marinas. Se trata de una
molcula insoluble enagua pero soluble en agua caliente; una solucin al
1,5% p/v forma un gel firme entre 32 y 39C y nose funde por debajo de
85C. Funde a 90C y solidifica una vez fundido alrededor de los 45C. Tiene
el inconveniente de que introduce compuestos orgnicos indefinidos que
pueden falsear los resultados de las necesidades nutritivas de un
microorganismo. Aunque el agar es una mezcla de polisacridos, Araki, en
1937, los dividi en dos grupos:- agarosa, con poco sulfato, libre de cido
pirvico, y- agaropectina, con mucho sulfato y gran cantidad de cenizas. La
proporcin de agarosa a agaropectina en el agar vara segn el alga de
origen. El agar puede utilizarse para diferentes fines, aunque los ms
importantes son: agar comercial para la industria alimenticia, agar
bacteriolgico, agares purificados y agarosa, utilizada para electroforesis en
gel. Aproximadamente la mitad de todo el agar que se produce, se utiliza en
trabajo microbiolgico, por lo que es importante la ausencia de metales
txicos.
3) Medios semislidos: Se preparan a partir de los medios lquidos,
agregando a stos un agente solidificante en una proporcin menor que para
preparar medios slidos. Uno de sus usos es la investigacin de la movilidad
de las bacterias

SEGN SU UTILIZACIN.
1) Medios comunes: Son aquellos que poseen los componentes mnimos para
que pueda producirse el crecimiento de bacterias que no necesiten
requerimientos especiales. El medio ms conocido de este grupo es el agar
nutritivo, que resulta de la adicin de agar al caldo nutritivo. Otros
representantes de este grupo son el agar tripticase de soja, el agar Columbia,
etc.
2) Medios de enriquecimiento: Son aquellos que, adems de las sustancias
nutritivas normales, incorporan una serie de factores indispensables para el
crecimiento de microorganismos exigentes. Este enriquecimiento se hace por
adicin de sangre u otros productos biolgicos (sangre, suero, leche, huevo,
bilis, etc.) que aportan dichos factores. En ocasiones es posible aadir
suplementos artificiales a los medios para producir un enriquecimiento del
mismo (p. ej. Polivitex, Isovitalex, etc)El gonococo, por ejemplo, necesita
cistina y cistena para su crecimiento. Estas sustancias son aportadas por la
sangre calentada adicionada al medio de cultivo (agar chocolate).
3) Medios selectivos: Son medios utilizados para favorecer el crecimiento
de ciertas bacterias contenidas en una poblacin polimicrobiana. El
fundamento de estos medios consiste en facilitar nutricionalmente el
crecimiento de una poblacin microbiana especfica. Un ejemplo de medio
selectivo es el caldo selenito, que se utiliza para favorecer el crecimiento de
salmonellas y frenar el del resto de enterobacterias.
4) Medios inhibidores: Cuando las sustancias aadidas a un medio
selectivo impiden totalmente el crecimiento de una poblacin microbiana, se
denomina inhibidor. Los medios inhibidores podran considerarse como una
variante ms restrictiva de los medios selectivos. Los medios inhibidores se
consiguen habitualmente por adicin de sustancias antimicrobianas o de
cualquier otra que inhiba completamente el desarrollo de una poblacin
determinada. Un medio inhibidor es el MacConkey que permite el crecimiento
de los grmenes Gram negativos e impide el crecimiento de los Gram
positivos.
5) Medios diferenciales: Se utilizan para poner en evidencia caractersticas
bioqumicas que ayuden a diferenciar gneros o especies. La adicin de un
azcar fermentable o un sustrato metabolizable se utilizan para este fin. El
medio MacConkey es un medio diferencial porque permite distinguir los
grmenes que fermentan la lactosa de aquellos que no lo hacen. Tambin lo
son el C.L.E.D. (lactosa +/lactosa -), el agar sangre (tipo de hemlisis), el SS
(que es doblemente diferencial), etc.
6) Medios de identificacin: Son los destinados a comprobar alguna
cualidad especfica que puede servirnos para reconocer la identidad de un
microorganismo. Estos medios han de poseer los elementos necesarios para
asegurar el crecimiento de los microorganismos, el sustrato especfico que
vaya a ser metabolizado y el indicador que nos muestre el resultado. El agar
Kligler, el medio de Simmons y en general, cualquier medio al que se le haya

aadido un elemento diferencial de un microorganismo, son medios utilizados

en identificacin. Actualmente estn apareciendo en el mercado una gran
cantidad de medios especficos de identificacin para ciertos
microorganismos, con lo cual se consigue simultneamente abaratar el costo
y reducir el tiempo de identificacin. Son ejemplos de esto ltimo los medios
CPS ID3 o Uriline ID (Biomerieux), utilizados para identificar los grmenes
urinarios ms importantes a partir de la placa de cultivo gracias a la
utilizacin de sustratos cromognicos especficos.
7) Medios de multiplicacin: Sirven para obtener una gran cantidad de
clulas a partir de un microorganismo ya aislado. Se emplean en la obtencin
de vacunas, en la investigacin y en la industria. Los medios ms adecuados
para la multiplicacin suelen ser lquidos. El caldo-infusin cerebro-corazn
(BHI), es un ejemplo tpico de estos medios.
8) Medios de conservacin: Se utilizan para conservar una cepa que, por
diversas razones nos interese mantener. Fundamentalmente se utilizan como
controles de calidad de las pruebas y reactivos utilizados en el Laboratorio de
Microbiologa.
9) Medios de transporte: Se usan para el transporte de muestras clnicas
que no pueden sembrarse inmediatamente. Su utilizacin debe hacerse
introduciendo la torunda con la que se obtuvo la muestra en el interior del
medio (generalmente en un tubo). Son ejemplos tpicos de este grupo los
medios de Stuart-Amies,Cary-Blair, etc.
ATENDIENDO A SU COMPOSICIN.
Segn las sustancias que entren a formar parte en su composicin, los
medios de cultivo pueden ser clasificados en:
1) Medios complejos: Fueron los primeros utilizados, y los ms empleados
se preparan a partir de tejidos animales, y ms raramente de vegetales. Su
composicin no es exactamente definida, y por consiguiente no es
rigurosamente constante. Esto puede tener ciertos inconvenientes en
condiciones experimentales, donde la reproductibilidad no podr ser exacta.
En la prctica corriente estos medios dan excelentes resultados y son los
ms empleados.
2) Medios sintticos: Son aquellos que contienen en su composicin
exclusivamente sustancias qumicas conocidas y disueltas en agua destilada
en proporciones determinadas, resultando un medio de composicin
perfectamente definida.
3) Medios semisintticos: El gran nmero de factores de crecimiento
exigidos para ciertos grmenes hace que la fabricacin de un medio sinttico
para estos grmenes sea imposible o demasiado cara. En este caso se
aportan los factores de crecimiento bajo la forma de un extracto orgnico
complejo (extracto de levadura, extracto de tejidos, etc.).Ciertos grmenes no
crecen en ningn medio por muy enriquecido que est ste, hacindolo

exclusivamente en clulas vivas con unas caractersticas determinadas.

Ejemplos de este tipo son, aparte de los virus, las Chlamydias, Rickettsias,
etc.
Los medios de cultivo ms empleados se encuentran resumidos en la
siguiente tabla:
Tabla 2. Medios de cultivo
DIFERENTES CLASES DE MEDIOS DE CULTIVO
1. Medio enriquecido
Microorganismo recuperado
Gram
positivos, negativos,
Agar sangre
Anaerobios

algunos

Todos
los
anteriores,
Neisseria,
Haemophilus
Crecimiento
No Crecimiento
Bacterias G+
Bacterias GMycobacterias
Otras Hongos
Neisserias
Otras Levaduras
Caractersticas diferenciales
Colonia rosada +
Lactosa
Colonia translucida Hidrlisis esculina
Colonias negras +
Colonia amarilla +
Manitol
Colonia rosada -

Agar chocolate
2. Medio selectivo
Agar Braid Parker
Agar Lowenstein Jensen
Agar Thayer Martin
3. Medio Diferencial
Agar Mc Conckey
Agar bilis esculina
Agar salino manitol

PARTE II
SIEMBRAS EN MEDIOS DE CULTIVO
Para poder estudiar los microorganismos en el laboratorio es necesario
reproducirlos en ambientes artificiales (in vitro) semejantes a su medio
natural (in vivo), mediante la siembra en los medios de cultivo, que incluyan
los nutrientes apropiados y presenten las condiciones ambientales favorables
de pH, presin osmtica, gases, humedad, entre otros para que puedan vivir
y desarrollarse.
Este mtodo permite observar macroscpicamente las caractersticas
morfolgicas de las colonias bacterianas formadas despus de 24 a 48 horas
de incubacin, en cuanto a forma, tamao, borde, color, elevacin, lo que
permite estudiar independientemente cada especie bacteriana.
TCNICAS DE INOCULACIN
El material se recolecta con las asas en punta (medio slido) o asas curvas
(medio lquido). Se utilizan diferentes tcnicas como: siembra por
agotamiento y en estra, para obtener cultivos puros y colonias aisladas;
siembra masiva para obtener altas densidades celulares.

SIEMBRA POR AGOTAMIENTO

SIEMBRA MASIVA (Antibiograma)

SIEMBRA EN ESTRIA

Algunos cultivos de preenriquecimiento y pruebas bioqumicas para

identificacin de especies se realizan en siembra en medios lquidos,
semislidos y slidos en tubo de ensayo con taparosca.

MATERIALES Y REACTIVOS
Microscopio
Laminas porta y cubreobjetos
Asas bacteriolgicas
Aplicadores estriles
Mecheros
Papel para limpiar los lentes
Cinta de enmascarar
Tijeras
Fsforos
Guantes, tapabocas
Toallas de papel
Recipientes estriles para muestras de tierra y agua
Cajas de petri con: agar nutritivo, agar MacConkey, agar manitol salino
y agar sangre.
Colorantes de Gram: cristal violeta, lugol, alcohol acetona, fucsina bsica
Colorantes de Zielh Neelsen: fucsina fenicada, alcohol acido, azul de
Metileno
Aceite de
inmersin
Hipoclorito
PROCEDIMIENTO
a. Marcar las cajas de petri con cinta de enmascarar en el borde de la
base de la caja para que no interfiera con la observacin posterior del
crecimiento bacteriano.
b. Tomar con un aplicador estril muestras de diferentes partes del
cuerpo: faringe, nariz, lengua, ua, placa dental, odo, conjuntiva,
parpado.
c. Cerca al mechero abrir la caja de petri con los diferentes medios de
cultivo. Con el aplicador realizar un inoculo inicial sobre el agar,
siguiendo las indicaciones del docente. Descartar el aplicador en el
recipiente de desechos biolgicos.
d. Esterilizar el asa redonda al mechero (si se trata de asa metlica),
enfriarla en un borde del agar. Extender el inoculo puesto sobre el
agar, haciendo con suavidad estras de lado a lado de la superficie.
e. Despus de realizar la primera serie de estras, quemar el asa al
mechero, enfriarla en un borde del agar, rotar la caja de petri y hacer
las estras de nuevo de un lado al otro del agar.
f. Llevar las cajas a la incubadora a 37 C. Durante 24 horas para permitir
el desarrollo bacteriano.

NOTA: Las cajas deben ponerse en la incubadora con el medio hacia arriba,
para que el agua de condensacin que se libera durante la incubacin caiga
sobre la tapa de la caja de petri y no perjudique el cultivo.

CUESTIONARIO
1. Cul es la utilidad del asa recta y curva?
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2. Por qu la esterilizacin en horno requiere ms tiempo que en el
autoclave, siendo la temperatura del horno mayor?
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3. Qu utilidad tiene la esterilizacin en fro?
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4. Por qu la radiacin ionizante es ms efectiva que la radiacin
ultravioleta para la esterilizacin de productos alimenticios?
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5. Por qu no se usan habitualmente para esterilizar los filtros de
membrana?
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6. Distinga entre un desinfectante y un antisptico.
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Consulte qu desinfectantes utilizan en las salas de ciruga?

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