UNIVERSIDAD NACIONAL AUTNOMA DE MXICO

Facultad de Odontologa

ALUMNA: HERNNDEZ CAZARES ELIZABETH

GRUPO: 2011

Prctica 4: Cultivo de microorganismos y tcnicas de

identificacin fenotpica de bacterias y hongos.
Introduccin
El cultivo de microorganismos consiste en proporcionarles las condiciones fsicas,
qumicas y nutritivas adecuadas para que puedan multiplicarse de forma
controlada.
Tcnicas de siembra
Existen distintas tcnicas para la siembra de microorganismos con base en
estras, el objetivo es obtener colonias aisladas.
Estra simple: Depositar la muestra en un extremo de la caja.
Esterilizar el asa bacteriolgica, es decir calentar al rojo vivo, enfriar en una de
las esquinas del agar, y realizar la una estra en el medio slido. Al momento
de realizar la estra se debe tocar de extremo a extremo de la caja de petri, a
manera de zigzag en una sola intencin y sin despegar el asa bacteriolgica
del medio de cultivo.
La identificacin de bacterias y hongos se realiza generalmente con base en sus
caractersticas fenotpicas, aunque cada vez ms tambin se realiza con base en
sus caractersticas genotpicas. La identificacin fenotpica de bacterias y hongos
incluye: la morfologa, el crecimiento, y las propiedades bioqumicas y metablicas
de los microorganismos.
Se entiende por identificacin entonces, al conjunto de tcnicas y procedimientos
que se aplican para establecer la identidad de un microorganismo.
En investigacin bsica donde se asla un microrganismo que debe identificarse
para comprobar si se trata de un microorganismo conocido o de uno nuevo para
poder clasificarlo.
Es importante conocer los mtodos de identificacin, ya que no todos los
microrganismos se identifican por las mismas tcnicas.

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Clasificacin de los mtodos de identificacin:

1.
2.
3.
4.
5.
6.

Mtodos basados en criterios morfolgicos.

Mtodos basados en tincin diferencial.
Mtodos basados en pruebas bioqumicas.
Mtodos basados en tipificacin con fagos.
Mtodos basados en ensayos serolgicos.
Mtodos basados en biologa molecular.

Microorganismos a estudiar:
1. Staphylococcus aureus
Coco inmvil, de 0.8 a 1 micrmetro de dimetro, que se divide en tres planos
para formar racimos de uvas, responde positivamente a la tincin de Gram, es
aerobio y anaerobio facultativo por lo que puede crecer tanto en una atmsfera
con o sin oxgeno, no presenta movilidad ni forma cpsula. Es capaz de crecer
hasta con un 10 % de sal comn. Por esto puede crecer en el agua del mar.
2. Streptococcus mutans
Es una bacteria Gram positiva, esfrica, anaerobia, facultativa, perteneciente al
grupo de las bacterias acido lcticas. Estas bacterias crecen en cadenas o pares,
donde la divisin celular ocurre a lo largo de un eje. No mvil, fermentador de
glucosa, lactosa, rafinosa, manitol,i nulina y salicina. Normalmente no desamina
la arginina para producir amoniaco. Pertenece a la gamma hemoltico.
3. Candida albicans
Suele presentarse como una clula oval levaduriforme de 2 a 4 micras, con
paredes finas; sin embargo, en tejidos infectados tambin se han identificado
formas filamentosas de longitud variable, con extremos redondos de 3 a 5 micras
de dimetro y seudohifas, que son clulas alargadas de levadura que permanecen
unidas entre s.

Hiptesis general
Lo que esperamos de sta prctica es realizar un nuevo cultivo, en donde cada
uno de los microorganismos, staphylococcus aureus, Streptococcus mutans y
Candida albicans, sean sembrados de una manera correcta en una caja petri con
una tcnica de estra simple. Y por tanto, observar el crecimiento de cada una de
las colonias aisladas a las 24 horas del cultivo.

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Hiptesis 1: Staphylococcus aureus: Lo que esperamos es formar colonias donde

se diferencien colonias aisladas en cada una de las tres cajas Petri. Pretendo
observar racimos de cocos de color plido.
Hiptesis 2: Streptococcus mutans: Lo que esperamos es formar colonias donde
se diferencien colonias aisladas en cada una de las tres cajas Petri. Pretendemos
observar cadenas a lo largo de las estras de clulas de cocos esfricos.
Hiptesis 3: Candida albicans: Lo que esperamos es formar colonias donde se
diferencien colonias aisladas en cada una de las tres cajas Petri. Pretendemos
observar levaduras dispersas a lo largo de la estra simple, por lo que ser ms
difcil su visualizacin.

Material y equipo
Materiales de seguridad:

Bata 100% algodn

Lentes de proteccin
Guantes
Gorro
Cubre boca

Para la tcnica de cultivo:

Mechero de alcohol
Asa bacteriolgica,
Cajas de Petri con cultivos bacterianos crecidos: staphylococcus aureus,
Streptococcus mutans y Candida albicans
3 cajas de Petri con agar-agar
Encendedor
Gradilla

Para la prueba catalasa

Solucin de perxido de hidrgeno al 3% (guardar 2-8 C, no exponer a la

luz y preparar la solucin segn las indicaciones:
Al 30% para Neisseria spp.
Al 15% para anaerobios
Al 3% para el resto de bacterias

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Nota: al 30% puede servir para todas las bacterias pero es ms peligroso, por el
riesgo de quemaduras al entrar en contacto con piel y mucosas.

Palillos estriles
Portaobjetos limpios

Procedimiento
Siembra de microorganismos
Los tutores entregarn tres cajas de cultivo con microorganismos para su
identificacin. Realizar las observaciones y las pruebas de identificacin para cada
una de ellas
Notas: Durante todo el procedimiento se deben tomar fotografas y hacer
anotaciones. Se entregarn tres cajas de cultivo con microrganismos no
identificados (cajas 1, 2 y 3)
Se entregarn tres cajas de cultivo con tres divisiones que corresponden a los
medios:
manitol salado (A)
sabouraud (B)
agar sangre (C)
Se entregar una caja con CHROMagar para la identificacin de C. albicans. Esta
parte de la prctica slo se realizar si se cuenta con el medio de cultivo.

Procedimiento:
1. Preparar el rea de trabajo estril.
2. Identificar las cajas de Petri con las tres
divisiones por medio de etiquetas (medio A,
medio B y medio C) Exp 1, Exp 2 y Exp 3.
3. Esterilizar y enfriar el asa bacteriolgica en un
extremo del medio cultivo (evitar quemadura por
contacto). (Fotografa 1)
4. Tomar una colonia de la caja 1 (Fotografa 2) y

Fotografa 1. Esterilizacin del asa

bacteriolgica.

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sembrarla en la caja Exp 1 en la divisin de la caja

etiquetada como medio A. (Fotografa 3)
5. Esterilizar el asa bacteriolgica para evitar
contaminacin cruzada (evitar quemadura por
contacto).
6. Nuevamente se esteriliza el asa bacteriolgica y
se enfra en un extremo del medio cultivo.

Fotografa 2. Muestra de una colonia

7. Se toma otra colonia de la caja 1 y se siembra en

la segunda divisin de la caja Exp1, es decir en el
medio B.
8. Nuevamente se esteriliza el asa bacteriolgica
para evitar contaminacin cruzada (evitar
quemadura por contacto).
9. Se esteriliza otra vez el asa bacteriolgica y se
enfria en un extremo del medio cultivo.

Fotografa 3. Siembra de la muestra

bacteriolgica en la caja Exp1 en una de
las tres divisiones de la caja.

10. Se toma otra colonia de la caja 1 y se siembra

en la tercera divisin de la caja Exp 1, es decir en
el medio C.
11. Esterilizar el asa bacteriolgica para evitar
contaminacin cruzada (evitar quemadura por
contacto).
12. Nuevamente se esteriliza el asa bacteriolgica
y se enfria en un extremo del medio cultivo.
13. Repetir los pasos del 4 al 12 para las cepas de
las cajas 2 y 3 que se sembrarn en las cajas de
Petri Exp 2 y Exp 3.
14. Incubar de 24 a 48 h a 37C

Fotografa 4. Esterilizacin del asa

bacteriolgica

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Prueba de catalasa
Nota: Durante todo el procedimiento se deben tomar fotografas y hacer
anotaciones.
Procedimiento:
1. Depositar una gota de perxido de hidrgeno sobre el portaobjetos (Fotografa
5)
2. Tomar una colonia con un palillo estril.
3. Depositar la colonia en el portaobjetos y esparcirla amanera de crculos (en un
rea restringida, no en toda la laminilla).
4. Obervar si se liberan burbujas de gas.
5. Desechar el palillo y el portaobjetos en el contenedor para los residuos
biolgicos infecciosos.

Fotografa 5. Agregar una gota de perxido de hidrgeno sobre el portaobjetos.

Resultados
A) Actividades previas a la clase
1) Prctica de tcnica de siembra en gelatina
2) Actividades de apoyo pgina Virtual lab

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2.1) tcnica de siembra:

http://learn.chm.msu.edu/vibl/content/streakplate/streak_plate/streak_plate.html

2.2) prueba de catalasa

http://learn.chm.msu.edu/vibl/content/catalase/Catalase_Test/catalase.html

2.3) prueba de oxidasa

http://learn.chm.msu.edu/vibl/content/oxidase/oxidase_test/index.html

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B) Actividades en el laboratorio
1) Siembra de los tres microorganismos
En la siembra de microorganismos
obtuvimos tres cultivos nuevos de cajas
de Petri, gracias a la tcnica de siembra
de estra simple, ya que sta tcnica
nos ayud a diferenciar cada una de las
colonias de bacterias.
Sin embargo, el equipo se percat que
en algunos medios, algunas colonias de
microorganismos no pudieron proliferar.
En la imagen nmero 6 podemos
observar los nuevos cultivos de
staphylococcus aureus, Streptococcus
mutans y Candida albicans, a pocos
minutos de haber terminado su siembra
en nuevos medios de cultivo de lado
derecho, mientras que en el lado
izquierdo se encuentran las colonias de
bacterias originales que nos otorgaron
los tutores.
Fotografa 6. Muestras de colonias de
microorganismos

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Medio de cultivo: Agar sangre

Es una combinacin de un agar base (agar
nutritivo) con el agregado de 5 % de sangre ovina,
tambin puede usarse sangre humana, para
cultivos en una placa de Agar. El agar sangre
aporta muchos factores de enriquecimiento.
Por lo que observamos el crecimiento de
staphylococcus aureus, Streptococcus mutans y
Candida albicans

Medio de cultivo: Sabouraud

Funciona como medio de enriquecimiento para
hongos, sin embargo, no hay un crecimiento de
staphylococcus aureus.
Y sin embargo, hay un crecimiento excesivo de
Candida albicans, de tal manera que difcilmente se
distinguen las colonias.

Medio de cultivo: Manitol salado

Permite el crecimiento de bacterias Gram-positivas
mientras inhibe el crecimiento de Gram-negativas.
Por lo tanto, observamos solamente el crecimiento
de un tipo de bacterias, nos referimos a
streptococcus mutans, debido a que se trata de una
bacteria de cocos Gram positivas, por ende, fue el
nico cultivo que prolifer en ste medio.

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2) Prueba de catalasa

La prueba de catalasa se basa

en las enzimas catalasa que
poseen la mayora de las
bacterias aerobias. Descompone
el perxido de hidrgeno en
agua
y
oxgeno.
El
desprendimiento de burbujas
procedentes del oxgeno indica
que la prueba es positiva.

Se observ una reaccin de catalasa en la muestra de staphylococcus aureus

nicamente.

Discusin de resultados
Desafortunadamente no tuvimos la oportunidad de comparar nuestros resultados
con los de los dems equipos, sin embargo, en nuestro equipo hicimos hincapi
sobre la importancia que tiene cada medio de cultivo para que los
microorganismos proliferen. De eso depende que en algunos medios proliferen
ms que en otros.

Conclusin
Llego a la conclusin que el medio es un factor verdaderamente importante para la
proliferacin de microorganismos o bien, para la inhibicin total de su crecimiento.
Adems que otro factor que influye son las caractersticas fisiolgicas de cada una
de las bacterias, por ejemplo, su sensibilidad a la exposicin al oxgeno.
Tambin concluyo que las medidas de seguridad ocupan un significativo valor
para la realizacin de todas stas pruebas, porque se no ser as, la realizacin de
sta prctica hubiera sido un fracaso, ya que algunos de los organismos son muy
delicados a el medio ambiente en el que son expuestos.

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BIBLIOGRAFA.

1. Elba Ins Cardozo. Profesor Agregado. Jefe de la Ctedrade Farmacologa

y Teraputica Odontolgica, Facultad de odontologa U. C.V. ACTA
ODONTOLGICA
VENEZOLANA.
Artculo
informativo.
[Internet]
Consultado el 05 de noviembre de 2016.
Disponible en:
http://www.actaodontologica.com/ediciones/2002/1/algunas_consideracione
s_candida_albicans.asp