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A Era Molecular Biology de surfactante

Jeffrey A. Whitsett, MD
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resumo
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INTRODUO
Os rpidos avanos na fisiologia e bioqumica feitas nas percepes meados de sculo 20
fornecida sobre os mecanismos subjacentes ao problema anteriormente desconcertante
de sndrome da angstia respiratria (RDS) em prematuros. Antes de 1970, RDS era
uma desordem pulmonar comum, causando muitas vezes letal insuficincia respiratria
em recm-nascidos prematuros, independentemente do grau de prematuridade.Anlise
dos tecidos pulmonares dos recm-nascidos prematuros que morrem de RDS revelaram
uma escassez de material lipdico rico superfcie activa necessria para reduzir a tenso
superficial na interface ar-lquido [1]. A capacidade de medir gases sanguneos
alveolares, ajuste oxigenao e ventilao com presso positiva contnua nas vias areas
(CPAP) e ventilao mecnica trouxe melhorias rpidas na morbidade e mortalidade
associadas com RDS em prematuros na dcada de 1970. Conhecimento que surfactante
pulmonar foi altamente enriquecido em fosfatidilcolina e particularmente em disaturated
fosfatidilcolina palmitoyl deu o impulso necessrio para compreender a sua bioqumica
e estrutura. Estudos fisiolgicos em modelos animais demonstraram a eficcia da
substituio de surfactante pulmonar por administrao intratraqueal de extractos
lipdicos de agentes tensioactivos e de surfactante na reverso atelectasia e as alteraes
patolgicas da fisiologia pulmonar em modelos animais de RDS [2]. Os extratos
orgnicos de bovino e material de surfactante porcino foram desenvolvidos que so
amplamente utilizados para a preveno e tratamento da SDR em recm-nascidos
prematuros [3 - 5]. Estas descobertas transformou o cuidado de recm-nascidos
prematuros, reduzindo a morbidade e mortalidade associadas com RDS [6]. Os extratos
orgnicos de surfactante pulmonar se espalhou rapidamente e mantiveram-se estveis
durante a compresso dinmica repetida de filmes lipdicos. Os comportamentos
biofsicas do surfactante extractos lipdicos foram altamente ricas distintas das misturas
de fosfatidilcolina em lpidos sintticos, indicando que os componentes menores nos
extractos de solvente orgnico contribuiu grandemente para a actividade de superfcie
nica de agentes tensioactivos pulmonares. Estas observaes levaram nosso laboratrio
e outros para identificar as duas protenas surfactantes novela, agora denominados SP-B
e SP-C, que so componentes crticos de preparaes de reposio de
surfactante [7, 8]. Os pequenos, peptdeos hidrofbicos, SP-B e SP-C, foram
encontrados para conferir propriedades de surfactante-como a misturas de fosfolipdios

purificados necessrios para a reverso de atelectasia em surfactantes pulmes com


deficincia [8 - 10].Concomitante com os avanos na aplicao clnica da substituio
de tensioactivo na dcada de 1980 foram os rpidos avanos na biologia molecular
permitiram que a sua purificao, a identificao das suas sequncias de aminocidos, a
preparao de anticorpos e sondas moleculares que foram utilizados para clonar os
cDNAs que codificam surfactante e genes proteins- A, B, C e D [11 -15 para reviso]
para identificar as suas funes. Estas ferramentas moleculares abriu as portas de
investigao para comear a entender questes fundamentais sobre a formao de
pulmo, a maturao pulmonar perinatal, a estrutura e as funes das protenas
surfactantes que tm sido pilares para a aplicao da biologia molecular no estudo da
biologia do pulmo e do diagnstico e tratamento de doenas pulmonares. Este novo kit
de ferramentas foi utilizado para 1) quantificar protenas tensioactivas em tecidos
pulmonares, fluido de lavagem broncoalveolar e de soro, 2) identificar uma doena
mutaes associadas nos genes que codificam ambas as protenas tensioactivas e
aqueles que so crticos para a sntese do agente tensioactivo que uma percepo sobre a
base molecular de insuficincia respiratria "idioptica" em lactentes a termo e outras
doenas intersticiais pulmonares que afetam recm-nascidos e indivduos mais
velhos [16] e 3) produzir protenas recombinantes e peptdeos surfactantes para a
produo de surfactantes sintticos. Esta breve reviso incidir sobre alguns dos
avanos na aplicao da biologia molecular para a patognese, diagnstico e tratamento
de doenas pulmonares.
Mutaes em genes que codificam protenas do surfactante "Associados" causar
insuficincia respiratria e doena pulmonar crnica

As mutaes nos genes que codificam protenas do surfactante desempenham papis


centrais na patognese da insuficincia respiratria em recm-nascidos a termo cujos
cursos clnica no respondem s terapias de cuidados intensivos. Um catlogo sempre
ampliando de mutaes e os alelos em genes crticos para a formao e funo
pulmonar est associada a doenas respiratrias em crianas e pacientes mais velhos [17
e 18] para reviso. Sequenciamento de protenas surfactantes relacionado e genes TTF-1
desde que as ferramentas de diagnstico para identificar a doena de pulmo causando
alelos e as que contribuem para a susceptibilidade doena. Causas genticas de
insuficincia respiratria so agora rotineiramente considerados quando bebs nascidos
a termo apresentam com insuficincia respiratria grave e inexplicvel com sinais e
sintomas de RDS que so normalmente associados com doena pulmonar em recmnascidos prematuros. Essas crianas geralmente necessitam de oxignio, ventilao
mecnica e com a continuao insuficincia respiratria, so frequentemente tratados
com oxigenao por membrana extracorprea (ECMO), mas no respondem
terapia. SFTPB, que codifica o pptido surfactante SP-B, um pequeno peptdeo
amphipathic sintetizado por tipo II alveolar clulas epiteliais [11, 12], foi o primeiro
gene associado com esta desordem [19]. SP-B est presente em preparaes
tensioactivas base animal e quando adicionado a fosfolpidos melhora as suas

propriedades de superfcie. SP-B processada a partir de uma protena precursora,


Prosp-B, que proteoliticamente processado por vrias proteases, incluindo a napsina,
dos pepsinognios e catepsinas vez que transita para corpos lamelares em clulas
epiteliais de tipo II nos alvolos.Estudos em ratinhos transgnicos que carecem SP-B
demonstraram que necessria para a formao de corpos lamelares, mielina tubular e
no abaixamento da tenso superficial pulmonar perifrica, resultando em insuficincia
respiratria no nascimento [20]; Do mesmo modo, a perda de SP-B no rato adulto faz
com insuficincia respiratria [21]. Falta de SP-B perturba a formao de corpo lamelar,
blocos de processamento normal de Prosp-C e prejudica surfactante recaptao
causando insuficincia respiratria. Uma srie de mutaes foram identificadas
em SFTPB que so herdados como genes recessivos
autossmicas [18, 22].Heterozigocidade para os alelos que causam alteraes no
sinnimas no SFTPB tm sido associados com o risco aumentado de RDS em pacientes
com doena pulmonar obstrutiva crnica (DPOC). Recm-nascidos com sinais e
sintomas semelhantes deficincia de SP-B pode sim ter uma deficincia de uma outra
protena, ABCA3 (ATP Binding Cassette-A3) como a causa insuficincia
respiratria [23, 24]. ABCA3 , uma protena transmembranar grande localizado na
superfcie das membranas limitantes de corpos lamelares em clulas epiteliais de tipo
II. ABCA3 medeia a transferncia de fosfatidilcolina em corpos lamelares. Falta de
ABCA3 inibe embalagem surfactante e secreo, causando insuficincia respiratria
aps o nascimento.ABCA3 codificada por uma relativamente grande de genes e
cDNA, nos quais numerosas mutaes foram identificadas que causam a doena
pulmonar grave em recm-nascidos [para reviso 24]. Avaliaes patolgicas do tecido
de bebs com SP-B e doena pulmonar ABCA3 relacionados so consistentes com as
descries patolgicas de transtornos denominados "pneumonite crnica da infncia",
"proteinose alveolar infantil", "doena pulmonar crnica infantil" ou "doena intersticial
pulmonar inespecfica, "a patologia frequentemente influenciada pela idade e terapias
utilizadas para tratar os recm-nascidos [17].
Mutaes no NKX2-1 (Fator de Transcrio-1, TTF-1 tiride) Cerebral-tireide-Lung
sndrome causada

A clonagem dos genes da protena surfactante SFTPA, SFTPB, SFTPC,


SFTPD, e ABCA3 possibilitou a identificao do factor de transcrio TTF-1
(codificada pelo gene NKX2-1, um factor de transcrio contendo homeodomio)
como um regulador crtico da sua expresso em tipo II clulas epiteliais do pulmo em
desenvolvimento e maturidade [25]. TTF-1 expresso na tiride, pulmo e crebro
anterior onde desempenha diversos papis na formao e funo. Estudos subsequentes
demonstraram que foi necessrio TTF-1 para a morfognese do pulmo, que regula a
diferenciao e proliferao das clulas progenitoras epiteliais que formam o epitlio
respiratrio [26]. TTF-1 regula a expresso de vrios genes implicados na diferenciao
de clulas epiteliais de tipo II antes do nascimento, incluindo ABCA3 e os genes que
codificam as protenas do surfactante, sendo a sua actividade necessria para a

adaptao respiratria no nascimento[27]. As mutaes no gene NKX2-1 foram


identificadas em pacientes com insuficincia respiratria ou doena pulmonar crnica
grave que variavelmente associadas a disfuno do SNC (coreia) e
hipotiroidismo[28, 29]. NKX2-1 doena relacionada geralmente associado com
haploinsufficiency ou mutaes emNKX2-1 que agora so passveis de diagnstico
gentico. Um estudo recente identificou uma associao de uma mutao em NKX2-1
com a doena pulmonar denominada hiperplasia neuroendcrina da infncia [30].
Mutaes em FOXF1 causou displasia alveolar capilar

Alveolar displasia capilar (ACD) uma causa rara de insuficincia respiratria em


recm-nascidos [31]. Os bebs geralmente presentes logo aps o nascimento, com
hipertenso pulmonar grave, cianose e insuficincia respiratria que refratria ao
suporte ventilatrio e no se resolve aps ECMO. Estudos histopatolgicos demonstram
formao alveolar anormal, escassez de capilares alveolares e freqentemente
desalinhamento das artrias e veias pulmonares. Haploinsufficiency de FOXM1 em
ratinhos transgnicos causado insuficincia respiratria no nascimento, associado com
impressionante em anormalidades formao da vasculatura pulmonar, com
caractersticas semelhantes s de crianas com DAC [32]. Estudos genticos em
pacientes com DAC identificadas mutaes no gene humano [33]. Mutaes
no FOXF1 so agora reconhecidos como a causa gentica mais comum da doena em
recm-nascidos. Foxf1, expressa em clulas mesenquimais no embrio inicial,
desempenha papis importantes na formao de outros rgos, incluindo o corao e
tracto gastrointestinal. Bebs com ACD e mutaes em Foxf1 freqentemente tm
malformaes em outros rgos [31]. O diagnstico de ACD pode ser feita atravs da
identificao de mutaes emFOXF1, teis para o diagnstico pr-natal e ps-natal da
doena respiratria grave. No rato ps-natal pulmo Foxf1 desempenha um papel na
regulao da inflamao pulmonar apoiar seu potencial papel na patognese da doena
pulmonar alm do perodo neonatal [34].
Mutaes no SFTPC e infantil doenas pulmonares crnicas

Enquanto angstia respiratria neonatal tem sido associado com mutaes de SFTPC
em um pequeno nmero de recm-nascidos, pacientes com doena SFTPC relacionado
normalmente presentes aps o perodo de recm-nascido na infncia [17 e 18 para
reviso]. Tal como SP-B, SP-activa o peptdeo C sintetizada, processada e segregada
por clulas de tipo II alveolares epiteliais [35]. SP-C est presente em corpos lamelares,
mielina tubular e animal com base preparaes reposio de surfactante utilizadas
clinicamente.SP-C desempenha um papel importante no aumento da estabilidade e
rpida propagao de lpidos surfactante no alvolo. Transgenic Sftpc - / - ratos, falta SP-C,
sobreviver aps o nascimento, mas desenvolvem a doena intersticial pulmonar grave
aps o nascimento e aps a leso pulmonar causada por vrus, bactrias patognicas e
endotoxina [36 - 38]. Consistente com estes resultados, as crianas com mutaes
no SFTPC geralmente apresentam-se com doena pulmonar intersticial crnica que

muitas vezes agravada por uma infeco viral. SFTPC associada doena intersticial
pulmonar causada por mutaes predominantemente herdadas que causam misfolding
do domnio "brichos" de Prosp-C [ 39, 40]. Misfolded Prosp-C acumula
intracelularmente causando prejuzo para o tipo II clulas epiteliais [41], que por sua
vez provoca inflamao pulmonar e remodelao. Em algumas mutaes, misfolded
Prosp-C induz a resposta endoplasmtico estresse retculo resultando em citotoxicidade,
a inflamao, a remodelao e a fibrose que est associada com doena intersticial
pulmonar [41, 42] SFTPC doena. Pulmonar relacionada variavelmente
penetrante [43] a ser influenciado por ambos modificadores genticos e outros
ambientais. desordens genticas relacionadas SFTPC podem apresentar no incio do
perodo neonatal, durante a infncia ou na idade adulta, embora seja um caso raro de
doena pulmonar crnica em adultos [17, 44]. Descobertas de pacientes com mutaes
no SFTPC foram os primeiros a destacar o papel da protena / ER resposta misfolded
estresse na patognese da fibrose pulmonar "pneumonite intersticial no-especfica"
(PINE), fibrose pulmonar idioptica (FPI) e outros transtornos amplamente
classificados como a doena pulmonar intersticial (DPI).
SFTPA e telomerase na patognese da ILD em Adultos

SP-A humana codificada por dois genes, SFTPA1 SFTPA e SFTPA2. A SP-A
sintetizada e segregada por clulas epiteliais das vias respiratrias em que necessria
para a formao de mielina tubular. SP-A desempenha diversos papis nas defesas
imunes inatas do pulmo [14, 45]. Em contraste com a SP-B e ABCA3, SP-A no
necessria para a sobrevivncia perinatal do Sftpa - / - ratos [46]. Mutaes
no SFTPAesto associados com ILD em adultos e com a susceptibilidade ao
adenocarcinoma pulmonar [47 para reviso]. SP-A constituda por um domnio de
lectina do terminal C glicosilada e um domnio colagenoso NH2-terminal que forma
complexos trimricos que oligomerizar ainda mais para formar multmeros na via
area. SP-A desempenha um papel crtico na estrutura de partculas lipdicas de agentes
tensioactivos mas no desempenha um papel importante na regulao de tamanhos de
conjunto surfactante. SP-A se liga endotoxina, agentes patognicos virais, bacterianas
e fngicas nos pulmes, aumentando a sua depurao e a
opsonizao. Como SFTPC, algumas mutaes no SFTPA causar reaes de protenas
mal dobradas e leso das clulas epiteliais. Recentes estudos suportam o conceito de que
as mutaes em ratinhos SP-A activar a sinalizao de TGF- que pode estar envolvida
na patognese da doena pulmonar alveolar e cancro do pulmo [47, 48]. O conceito
que a leso epitelial recorrente est envolvido na patognese da ILD apoiada por
estudos que demonstram que mutaes em genes de telomerase associado (TEL,
TELC) esto associados com doena pulmonar crnica em adultos [49 - 51 para
reviso].
Diagnstico Molecular de Doenas Pulmonares

A identificao dos genes e via molecular que regula a homeostase do tensioactivo no


tipo II clulas epiteliais, desde que os reagentes para o desenvolvimento de testes
clnicos por gentica, imunoqumicos ou imunoensaio, que so teis para o diagnstico
e prognstico de doenas pulmonares agudas e crnicas. A purificao das protenas
tensioactivas do tecido do pulmo ou aps expresso de protenas tensioactivas dos
recombinantes ou por sntese de pptidos de protena surfactante permitiu o
desenvolvimento de anticorpos teis para a criao de imuno-histoqumica e
imunoensaios (ELISA) que so agora amplamente utilizados para identificao de
clulas do pulmo para o estudo de pulmo e desenvolvimento da doena. Esses
marcadores tm servido como indicadores teis do curso de vrias doenas
pulmonares [52 - 56]. ELISA de soro para SP-D e SP-A so teis para o prognstico e
tratamento de doentes com vrios distrbios pulmonares intersticiais, incluindo
sarcoidose, fibrose pulmonar idioptica e proteinose alveolar pulmonar[57]. Da mesma
forma, os testes genticos tem sido til para a identificao de "distrbios de surfactante
homeostase" no perodo neonatal. A heterogeneidade considervel allica em genes que
codificam as protenas tensioactivas permitiu a avaliao de risco ou susceptibilidade de
diferentes alelos do gene da protena de surfactante para doena pulmonar. A
identificao molecular de mutaes nos genes da protena de surfactante e de TTF-1
so agora testes teis para o diagnstico pr-natal e ps-natal e prognstico de
desordens de homeostase do surfactante.
Papel do GM-CSF Sinalizao na patognese da Proteinose Alveolar Pulmonar

Estudos em GM-CSF e GM-CSF receptor de ratinhos deficientes identificou o papel


importante da sinalizao de GMCSF na regulao da protena surfactante lipdico e
depurao do pulmo [para reviso 58]. Estudos clnicos posteriores demonstraram que
a forma mais comum de PAP em adultos foi causada por anticorpos anti-GM-CSF que
bloqueiam a sinalizao de GM-CSF em macrfagos alveolares [59] que necessria
para o catabolismo de protenas tensioactivas pulmonares. Recentes estudos genticos
em crianas com PAP incio precoce com caractersticas clnicas semelhantes aos
associados com PAP auto-imune adulto, demonstrou herana autossmica recessiva de
mutaes nos receptores de GM-CSF, CSF2RB eCSF2RA [60 - 62]. A identificao do
papel crtico de sinalizao na regulao de surfactante catabolismo de GM-CSF tem
proporcionado novos ensaios para o diagnstico de ambas as formas de PPA e activada
nova terapia baseada em tratamento com GM-CSF [63] ou de correco de sinalizao
do receptor de GM-CSF defeitos que esto sendo ativamente estudados no
presente [64 - 66].
Sntese de Surfactante sintticos protenas e pptidos

A elucidao dos genes, as sequncias de ADNc e de aminocidos das protenas


tensioactivas fornecida informao til para a engenharia de protenas e pptidos
recombinantes ou tensioactivos sintticos. Os pptidos modeladas a partir das estruturas
de SP-B e SP-C foram produzidos e recombinado com lpidos tensioactivos do tipo para

a produo de misturas de agentes tensioactivos sintticos. Peptdeos foram sintetizados


novos que conferem excelentes propriedades surfactantes-como a misturas lipdicas. SPB e SP-C-like pptido imita esto a ser activamente estudada para o tratamento de
doenas pulmonares [67 - 70].KL4, um pptido anfiptico com caractersticas de SP-B,
foi recentemente aprovado para o tratamento de RDS em os EUA [69]. Da mesma
forma, as misturas de SP-B e SP-C-like pptidos foram testados em modelos animais
que tenham sido eficazes para melhorar a funo pulmonar. Misturas de pptidos em
lpidos sintticos tm excelentes propriedades biofsicas e pode ser til para terapias
futuras para o tratamento ou preveno de RDS e outras doenas pulmonares [71, 72].
Resumo

A era molecular da biologia surfactante forneceu novos insights sobre a homeostase


alveolar til para o diagnstico, prognstico e terapia de doenas pulmonares
previamente denominado "idioptica". O ps-genoma era de sequenciamento genmico
e exomic todo provavelmente desvendar mutaes causar ou contribuir para herdado e
doenas pulmonares adquiridos que iro fornecer o quadro conceptual para a preveno
e tratamento de doenas pulmonares em pacientes de todas as idades no futuro.