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UNIDAD TEMTICA 1

FUNDAMENTOS DE
RECOMBINACIN GNICA

LABORATORIO N 1
Cruza gentica de cepas de Neurospora crassa
INTRODUCCIN
Tal como Ud. vio en clases (si no lo recuerda, repase las diapositivas de Recombinacin
gnica) el anlisis gentico ha permitido determinar que los genes se disponen de forma
secuencial a lo largo de los cromosomas (mapas). Todos los genes de un mismo
cromosoma, desde el punto de vista gentico, pasan a constituir los llamados GRUPOS
DE LIGAMIENTO. De esta forma, los genes que pertenecen a un mismo grupo de
ligamiento se denominan genes ligados, los que pueden sufrir recombinaciones entre
ellos en los cromosomas homlogos gracias al proceso de crossing-over. Las
frecuencias con que ocurre esta recombinacin han permitido determinar la distancia
relativa entre genes. Esta ha sido la forma de inferir los mapas genticos antes del
desarrollo de las tcnicas de secuenciacin masiva. An hoy, esta aproximacin sirve de
soporte para el desarrollo de los mapas genticos basados en secuenciacin.
Para el estudio del anlisis gentico en laboratorio, se utilizan modelos. Uno de los ms
conocidos corresponde al hongo Neurospora crassa. Este hongo se manifiesta
normalmente en fase haploide, lo que facilita el anlisis gentico, pues permite la
expresin de la totalidad del genotipo. Asimismo, con el genotipo haploide, los genes
recesivos no son ocultados por genes dominantes. Para resolver problemas de
ligamiento gentico, hay varios procedimientos para su determinacin:
a.
Aislamiento al azar (anlisis de cromtidas).
b.
Aislamiento ordenado de las ascosporas provenientes de un asco (anlisis de
ttradas).
Una variacin simplificada del aislamiento ordenado es la observacin directa de
ascosporas ordenadas en ascas. Para ello, las ascas deben ser fenotpicamente
distinguibles. En este prctico de laboratorio Ud. realizar un procedimiento de anlisis
gentico entre un marcador y su centrmero, observando ttradas ordenadas en
Neurospora.
Las tcnicas de cruzamiento gentico en Neurospora crassa involucran el uso de
medios de cultivo especiales que estimulan la formacin de conidios y protoperitecios.
Dentro de los mtodos de cruzamiento, pueden distinguirse dos formas:
a.
Cruzamiento recproco: Cepas de sexo opuesto se inoculan en tubos separados.
Una vez que se hayan desarrollado protoperitecios se les roca con conidios del sexo
opuesto. Este tipo de cruzamiento permite investigar diferencialmente los factores
hereditarios aportados por las dos cepas que intervienen en el cruzamiento.
b.
Lado a lado: Se incuban simultneamente las cepas de sexo opuesto en un
mismo tubo. Despus de algunos das el micelio desarrolla protoperitecios y conidios
de ambos sexos. Los proteperitecios de un sexo (A) sern fertilizados por los conidios
del sexo opuesto (a), y viceversa. Esta es la tcnica que Ud. usar en el prctico.

Cosas que Ud. debiera estudiar antes de venir a este prctico:


- Diapositivas del curso sobre Recombinancin gnica, especficamente el anlisis
gentico entre un marcador y el centrmero. Puede encontrar, adems, bibliografa
complementaria en cualquier texto de Gentica
- Buscar en la bibliografa fotos de esporas asexuales (conidios), esporas sexuales
(ascosporas) y peritecios de hongos. En lo posible, use fotos que le permitan estimar los
tamaos de dichas estructuras. Adicionalmente, debe familiarizarse con los trminos
peritecio, ascas, ascospora, y otros que se usarn en este prctico.
- Estudiar respecto a los tipos de apareamientos entre organismos inferiores que realizan
cruzas sexuales (por ejemplo Saccharomyces cerevisiae o Neurospora crassa).

PARTE PRCTICA
1) A cada grupo se le entregarn placas Petri con dos cepas distintas de N. crassa. En
trminos generales, estas cepas tienen las sgtes caractersticas:
Cepa nativa: Corresponde a una cepa de Neurospora crassa natural, sin mutaciones. Su
tipo de apareamiento depende del aislado, y puede ser de tipo a o de tipo A. El tipo
de apareamiento es una caracterstica del organismo que equivale al sexo del
individuo. Solo pueden aparearse y reproducirse sexualmente aquellos individuos con
apareamiento contrario (es decir, A con a).
Cepa mutante ws: Corresponde a una cepa de Neurospora crassa mutante. La sigla
ws significa white spore (espora blanca). Esto quiere decir que estos mutantes
tienen afectado un gen (denominado ws-1). En una cepa de Neurospora nativa, la
ascoespora es de color oscuro. Sin embargo, en mutantes ws-1, las ascoesporas no
presentan el color oscuro caracterstico, por lo que se pueden diferenciar muy bien al
microscopio. Al igual que en la caso de las cepas nativas, el tipo de apareamiento puede
ser a o A dependiendo de la cepa.
2) Analice las cepas macro y microscpicamente, y anote todas las caractersticas
fenotpicas de ellas. Para ver las cepas al microscopio, ponga un poco de micelio en un
portaobjetos con 10 ul de agua, y observe a 10x y 40x. Observe al microscopio las
estructuras del hongo, particularmente si ve peritecios (estructuras sexuales), esporas
haploides y/o ascoesporas (esporas sexuales).
3) Una vez que haya analizado en detalle ambos hongos, se le entregarn tubos estriles
conteniendo medio de esporulacin. Este medio es un medio mnimo que induce el
cruzamiento sexual y la formacin de ascosporas. En torno a la llama de un mechero
(para evitar contaminacin) haga la cruza entre las cepas sexualmente compatibles. Para
ello, y DENTRO DEL MISMO TUBO, inocule las dos cepas que quiera cruzar a una
distancia estimada de dos milmetros segn como se le indique.
4) Los tubos se incubarn a 25 C durante unos 10 das, tiempo al cual se analizarn
para observar si el cruzamiento fue positivo. La forma ms evidente de verlo es verificar
la formacin de PERITECIOS.

LABORATORIO N 2
Anlisis fenotpico de cruzas de Neurospora crassa
Tal como se mencion antes, los genes que pertenecen a un mismo grupo de ligamiento
pueden sufrir recombinaciones entre ellos en los cromosomas homlogos gracias al
proceso de crossing-over. Las frecuencias con que ocurre esta recombinacin han
permitido determinar la distancia relativa entre genes. De esta forma, para resolver
problemas de ligamiento gentico, hay dos procedimientos para su determinacin.
a.
Aislamiento al azar (anlisis de cromtidas): Para esto, ud. debe recolectar una a
una las esporas producidas en el cruzamiento. Cada espora se inocula medio completo
de cultivo, luego se activa la germinacin de las esporas y finalmente (unas 48 hrs.
despus) se analizan las proporciones de los fenotipos producidos (vea las diapositivas
de Recombinacin gnica, ttradas desordenadas).
b.
Aislamiento ordenado de las ascosporas provenientes de un asco (anlisis de
ttradas): La disposicin lineal de los productos meiticos de Neurospora crassa nos
permite determinar en cul de las divisiones de las meiosis se realiza la segregacin de
un cierto par de alelos. En Neurospora crassa, cuando tenemos un cruzamiento entre
una cepa silvestre y una mutante, la segregacin de un mutante de la cepa silvestre
ocurrira en la primera divisin de la meiosis si es que ocurre con una ordenacin lineal
de 4 ascosporas mutantes y 4 ascosporas silvestres. Si ocurre crossing-over entre el
gen y el centrmero, la segregacin de los alelos no ocurre en la primera divisin
meitica, sino en la segunda divisin, dando origen a disposiciones de las esporas como
2:4:2 2:2:2:2. Contabilizando la frecuencia con que se producen estas disposiciones,
se puede calcular la distancia del gen respecto al centrmero.
En el caso b), cuando est analizando caractersticas fenotpicas que solo son
distinguibles en un individuo desarrollado, tambin debe recolectar y cultivar una a una
las esporas de un cruzamiento. Sin embargo, puede existir una forma simplificada de
realizar este anlisis mediante la observacin directa de ascosporas ordenadas en las
ascas, sin necesidad de aislarlas una a una. En este caso entonces, el anlisis de ttradas
se ve facilitado por el hecho que los caracteres en juego son observables en la misma
espora, siendo innecesario el aislamiento y germinacin posterior de stas. Para poder
usar este procedimiento, es condicin indispensable que las ascas sean fenotpicamente
distinguibles. En este prctico de laboratorio Ud. realizar este procedimiento,
utilizando las cruzas de su prctico anterior. En dicho laboratorio, Ud. cruz una cepa
parental con sus respectiva mutante, las cual tiene un fenotipo ws-1. La mutacin ws1 es responsable de la incapacidad de Neurospora para sintetizar melanina, impidiendo
el desarrollo de la coloracin negra de las ascosporas. Debido a ello, las esporas de los
mutantes son incoloras, fcilmente distinguibles de la espora nativa que es oscura.
De esta manera los ascos formados en un cruzamiento de una cepa silvestre de
Neurospora con la cepa ws-1, pueden ser examinados directamente a la lupa o
microscopio para determinar si la disposicin de las esporas con respecto al color es 4:4,
2:2:2:2.

Cosas que Ud. debiera estudiar antes de venir a este prctico:


- Toda la materia vista en clases de Recombinacin gnica.
- Ejercicios de clculo de distancia gentica de un gen respecto al centrmero.
PARTE PRCTICA
1) Se le devolver el tubo con su cruza entre las cepas apropiadas. En el medio distinga
los peritecios visualmente.
2) Con mucha destreza y habilidad colecte un peritecio desde el tubo entregado, y
pngalo en un portaobjetos con una gota de agua. Cubra con un cubreobjeto.
3) Observe al microscopio partiendo con el aumento menor, en teora un aumento de
10x es suficiente para observar las ascas. Al momento de observar al microscopio,
pueden darse 3 situaciones, proceda segn se indica en cada caso:
Situacin A: En caso de que el peritecio est en estado ptimo, Ud. observar ascas
intactas. Dentro de ellas, ver ascosporas las cuales deben ser distinguibles por su color
(negras y blancas; OJO, las blancas se vern transparentes al microscopio). En este caso
haga recuento de las ascosporas dentro de por lo menos 25 ascas intactas.
Situacin B: Si distingue solo el peritecio, pero no ascas ni ascosporas, saque la muestra
del microscopio, presione suavemente el cubreobjeto de forma de abrir el peritecio, y
vuelva a mirar. Si no hay indicios de que el peritecio se abra, trate una vez ms con
mayor presin. Si la situacin se mantiene igual, quiere decir que el peritecio an es
inmaduro y por tanto debe volver a tomar una nueva muestra.
Situacin C: Si el peritecio aparece completamente destruido y se observan solo
ascosporas libres en el medio y ninguna asca intacta, quiere decir que el peritecio est
demasiado viejo y ya ha esporulado completamente. En este caso, tambin debe volver
a tomar una nueva muestra.
4) Clasifique estas ascas (N de recombinantes y no recombinantes) y de acuerdo a la
distribucin de esporas blancas y negras, determine la distancia gentica entre el locus
para color de esporas y el centrmero. Para eso, repase sus clases de teora.
Con esos datos, usted completa todo lo necesario para realizar su informe.

UNIDAD TEMTICA 2

TCNICAS BSICAS DE ANLISIS


GENTICO

LABORATORIO N 3
Extraccin rpida de ADN de levaduras
Todas las clulas contienen ADN como parte de su genoma. El ADN es la base del
material gentico, ya que en l estn contenidos los genes, cuya expresin permite la
sntesis las protenas y los ARN estructurales (rARNs, tARNs y mARNs), entre otras
biomolculas estructurales importantes para una clula.
Dependiendo del tipo de organismo, el genoma (incluyendo al ADN) vara de tamao.
Por ejemplo, el genoma de la bacteria Escherichia coli est compuesto por 4.7 x 106
pares de bases y codifica para unos 4.300 genes. En contraste, el genoma de la levadura
Saccharomyces cerevisiae contiene unos 2 x 107 pares de bases y codifica para unos
6.000 genes. A medida que se avanza en complejidad celular, el genoma crece. Por
ejemplo, el genoma de E. coli es 5 veces ms pequeo que el de S. cerevisiae, y 600
veces ms pequeo que el de clulas humanas.
Las levaduras han sido, histricamente, excelentes modelos genticos. Estos son
microorganismos eucariontes, que pueden reproducirse tanto asexual (fisin) como
sexualmente. Este ltimo proceso involucra la cruza gentica de levaduras haploides
para formar un hbrido (diploide), el que a su vez genera productos meiticos (ascas) en
las cuales hubo recombinacin y por tanto, variacin en la descendencia (un ejemplo
similar al que Ud. vio en la unidad 1 de este semestre usando el hongo Neurospora
crassa).
Por otro lado, las levaduras son excelentes modelos para anlisis moleculares. En ese
sentido, para cualquier anlisis gentico a nivel molecular, la obtencin de ADN es un
paso previo necesario. En este laboratorio, y a modo de ejemplo, Ud. realizar un
proceso muy sencillo y rpido de obtencin de ADN de levadura.
Protocolo de extraccin rpida de ADN de levaduras usando el mtodo de Bust`n
Grab (Harju et al. 2004)
Nota: Varios de los elementos y procedimientos indicados ms abajo son
PELIGROSOS, tenga precaucin.
1. Previamente, se crecieron las levaduras en un medio lquido apropiado. Ud. Recibir
un tubo Eppendorf que contiene el total de levaduras de 1,5 ml de ese cultivo.
2. Agregue a las 200 l de Buffer de lisis (2% Triton X-100, 1% SDS, 100 mM NaCl,
10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA, pH 8.0).
3. Sumerja los tubos en un bao de hielo seco - etanol por 2 minutos (o alternativamente
en nitrgeno lquido por 1 minuto). Luego de eso, transfiera inmediatamente los tubos a
agua hirviendo. Repita este shock de temperatura 2 veces. Luego, agite en vortex por
30 segundos. OJO, el bao de hielo seco, y especialmente el nitrgeno lquido, son
muy peligrosos. Tenga precaucin.
4. Agregue 200 l de cloroformo; agite en vortex 2 minutos.
5. Centrifugue 3 minutos a mxima velocidad

6. Transfiera con una pipeta la fase superior a otro tubo Eppendorf limpio. Luego,
agregue 400 l de etanol 100% frio. Mezcle invirtiendo el tubo varias veces.
7. Para precipitar el ADN, incube el tubo a -20C (freezer del refrigerador) por 5
minutos.
8. Centrifugue 5 minutos a mxima velocidad. Elimine el sobrenadante invirtiendo
rpidamente el tubo, y deje el tubo invertido sobre toalla nova o similar durante un par
de minutos.
9. En el pellet que observa, estn los cidos nucleicos totales (incluyendo el ADN
genmico). Lave este pellet 0.5 ml de etanol 70%, vuelva a centrifugar y elimine el
sobrenadante como se le indica en el paso 8.
10. Seque el pellet dejando el tubo abierto sobre el mesn (no debiera tardar ms de 15
minutos).
11. Resuspenda el pellet en 2550 l de buffer TE [10 mM Tris (pH 8.0), 1 mM EDTA
(pH 8.0)] o agua. Guarde el tubo hasta el prximo prctico.

Referencia Bibliogrfica:
Harju S., Fedosyuk H. and Peterson K.R. (2004) Rapid isolation of yeast genomic
DNA: Bust n' Grab. BMC Biotechnology 4:8 (Nota: Esta referencia se puede bajar
de forma gratuita desde Internet, sera bueno que la leyera)
Algunas preguntas que debera hacerse (y contestarse) antes de venir a este
laboratorio:
Son todos los procedimientos de extraccin de ADN iguales? Cmo se extrae ADN
de bacterias, plantas o clulas animales? Para qu sirven las sustancias que contiene
cada buffer? Cul es el objeto de hacer un shock trmico a las levaduras? Cul es
la temperatura del bao etanol-hielo seco y del nitrgeno lquido? Cul es el
rendimiento terico de una extraccin de ADN?

LABORATORIO N 4
Amplificacin de una regin de ADN mediante PCR
La reaccin en cadena de la polimerasa (PCR por sus siglas en ingls) es una tcnica
vital en gentica. Esta tcnica tiene aplicaciones en varias reas de la gentica, tales
como identificacin forense, filiacin (anlisis de paternidad), y anlisis filogenticos y
biogeogrficos basados en marcadores moleculares. Mediante esta tcnica se puede
amplificar exponencialmente segmentos especficos de ADN usando una enzima
polimerasa termoestable, nucletidos en solucin, y primers que delimitan la zona que
se amplifica.
La PCR clsica consiste en la repeticin cclica de tres etapas:
1) Desnaturalizacin del ADN doble hebra de la muestra molde para separar las dos
cadenas, mediante la aplicacin de temperaturas superiores a 90C.
2) La unin especfica de los primers a las cadenas sencillas mediante
complementariedad de bases. La temperatura a la que se realiza esta unin (temperatura
de annealing, Ta) controla la especificidad de la reaccin.
3) Extensin de la cadena de ADN a copiar a partir de los primers, utilizando los
nucletidos presentes en la solucin. Dicha extensin la lleva a cabo una ADN
polimerasa termoestable.
En trminos operacionales, la PCR se realiza en un instrumento denominado
termociclador, el cual puede producir rpidos cambios de temperaturas.
Ud. usar la PCR para amplificar una regin especfica desde el ADN de las levaduras
que extrajo en el prctico anterior.

Protocolo de PCR para la amplificacin de un segmento de ADN de levaduras


1. Descongele su tubo de ADN de levaduras de la semana pasada.
2. Como no sabemos la cantidad de ADN que Ud. obtuvo (por razones de tiempo, eso se
estimar en el siguiente prctico) haga una dilucin 1:20 de su ADN con agua
autoclavada, para as prevenir que una muestra muy concentrada de ADN inhiba la
reaccin.
3. Cada grupo preparar las siguientes mezclas de amplificacin (segn las indicaciones
que se les de) en tubos para PCR en hielo:
MUESTRA 1:
14,5 l de agua
2,5 l de Buffer 10X
1,5 l de MgCl2 50 mM
2,5 l de una mezcla de dNTPs
1 l del primer 1 (forward)
1 l del primer 2 (reverse)
1 l de la dilucin de DNA (1:20)
1 l de Taq DNA polimerasa

MUESTRA 2: Lo mismo que la muestra 1, pero usando 1 l del ADN sin diluir.
4. Si es necesario, agregue a la mezcla una gota de aceite mineral. Si el termociclador
tiene tapa calefactora, omita este paso. Ponga el tubo en el termociclador, y realice la
amplificacin programando los siguientes pasos en el equipo:
Paso 1: 1 min. a 95 C
Paso 2: 30 s a 94 C
Paso 3: 1min. a 54 C
Paso 4: 1 min. a 72 C

35 ciclos

Paso 5: 10 minutos a 72 C
5. Guarde los tubos rotulados hasta el prximo prctico.
Referencia Bibliogrfica sobre PCR: Cualquier libro de Gentica o Biologa
Molecular actualizado, disponibles en la biblioteca.
Algunas preguntas que debera hacerse (y contestarse) antes de venir a este
laboratorio:
Para qu sirven los componentes de la reaccin de PCR? Qu es un primer y cul es
su naturaleza qumica? Cmo se produce la amplificacin exponencial del ADN?
Cul es el objeto de las distintas temperaturas y los distintos tiempos de los ciclos de
temperaturas? Por qu el ADN concentrado inhibe la reaccin de PCR?

LABORATORIO N 5
Electroforesis en gel de agarosa
Algunas molculas biolgicas como los cidos nucleicos (incluidos los fragmentos
producidos por PCR) pueden ser separadas de acuerdo a su tamao a travs de una
electroforesis. La electroforesis es la migracin, forzada por un potencial elctrico, de
molculas a travs de una matriz (agarosa o arcrilamida) que separa las molculas en
funcin de su tamao. En este caso particular, la molcula es ADN y la matriz es
agarosa. Una vez terminada la migracin, el ADN debe ser teido para poder ser
observado. En nuestro caso, se teir con bromuro de etidio, que es el reactivo ms
comn para estos efectos. La visualizacin se har exponiendo el gel teido a la luz
ultravioleta.
La electroforesis que haremos en este laboratorio le permitir determinar 2 cosas:
1- Estimar la calidad y cantidad del ADN que Ud. extrajo de las levaduras.
2- Estimar el tamao de la regin amplificada por PCR, y la cantidad del amplicn
obtenido.
Protocolo de electroforesis de los ADN purificados y los productos de PCR
obtenidos
1. Preparar un gel de agarosa al 1%. Para ello, pese 0,5 gramos de agarosa. Agregue 50
mL de buffer TAE 1X. Disuelva esta suspensin en un bao hirviendo o en horno
microondas (OJO: no deje ebullir).
2. Cuando el lquido est a una temperatura apropiada (soportable a la mano) agregue 1
l de la solucin de bromuro de etidio y mezcle. PRECAUCIN. El bromuro de
etidio es un mutgeno altamente peligroso, maniplelo con cuidado usando
guantes.
3. Agregue el lquido en la cmara de electroforesis y coloque las peinetas de carga
segn las indicaciones que le entreguen. Espere a que la agarosa gelifique.
4. Mientras gelifica la agarosa, descongele los tubos de ADN y los tubos de PCR
guardados de los prcticos anteriores, y prepare las mezclas de carga segn la siguiente
composicin:
1 l de buffer de carga
10 l de la respectiva reaccin de PCR o del respectivo ADN. Mezcle bien usando una
pipeta.
5. Cargue el gel segn las indicaciones que le entreguen. Adems de las muestras,
cargu un estndar de peso molecular.
6. Someta el gel a electroforesis en la cmara de electroforesis, usando buffer TAE 1X
(40 mM Tris-acetato, 1 mM EDTA). Aplique un voltaje de 100 V por 45 minutos.
7. Finalmente visualice el gel en un transiluminador U.V. Fotografe el gel para sus
registros, los cuales usar en el informe.

Referencia Bibliogrfica sobre electroforesis de ADN: Cualquier libro de Gentica o


Biologa Molecular actualizado, disponibles en la biblioteca.

Algunas preguntas que debera hacerse (y contestarse) antes de venir a este


laboratorio:
En que direccin migra el ADN en un potencial elctrico y porqu? Es importante el
pH del buffer en la migracin del ADN y porqu? Las molculas de ADN de mayor
tamao migran ms o menos en el gel, y porqu? Cul es el objeto del estndar de peso
molecular? Cmo debiera verse el ADN genmico en un gel; se podra estimar su
tamao real? Cmo interacciona el bromuro de etidio con el ADN? Cmo funciona la
visualizacin de ADN por bromuro de etidio-luz U.V.?

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