FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES EXACTAS Y DE LA EDUCACIN

DEPARTAMENTO DE BIOLOGA

Prcticas de Laboratorio de Biologa

Molecular
UNIVERSIDAD
DEL CAUCA

Gua No. 2

EXTRACCIN DE ADN BACTERIANO

INTRODUCCIN
Cuando los cientficos comprendieron la estructura de la molcula de ADN y
como la informacin que lleva se traduce en funciones y caractersticas,
comenzaron a disear tcnicas de laboratorio para aislarlo, analizarlo,
modificarlo y hasta transferirlo de un organismo a otro.
Actualmente existen numerosos protocolos para extraer ADN a partir de
muestras de diferentes organismos vivos, ya sean vegetales, animales o
microorganismos, siendo el objetivo principal obtener una preparacin de ADN
de buena calidad y en gran cantidad. La calidad se refiere a la posibilidad de
almacenar el ADN por tiempo indefinido, manteniendo su estructura y
propiedades y es la calidad del ADN el factor responsable de la reproducibilidad
en experimentos posteriores.
La cantidad es un concepto relativo que
depende, del nmero y estado de las clulas propias del tejido a estudiar. Por
lo tanto, como regla general, un buen mtodo de extraccin debe mantener la
integridad fsica y bioqumica del ADN e incrementar sus rangos de pureza y
concentracin (Sambrook et al. 2001).
Los protocolos de extraccin de ADN emplean mtodos fsicos, qumicos y
mecnicos que involucran bsicamente tres pasos: 1. Lisis celular 2.
Eliminacin de protenas 3. Precipitacin y limpieza del ADN.
Es muy importante tener en cuenta que el trabajo de biologa molecular
requiere de una serie de precauciones para no contaminar las muestras con
cidos nucleicos extraos. Es necesario limpiar las reas de trabajo con
solventes como el cido clorhdrico (10%), sosa (NaOH, 0.5 N) y/o etanol (70%).
Tambin hay que utilizar guantes para proteccin personal y para evitar
contaminar las muestras, as como trabajar con materiales y soluciones
estriles. Se recomienda trabajar en una campana de flujo laminar y si es
posible, someter el material a radiacin ultravioleta de 5 a 10 minutos para
degradar cualquier cido nucleico presente.
OBJETIVO

Comprender los procedimientos necesarios para extraer ADN de buena calidad

y cantidad.

MATERIALES

Juego de micropipetas (2-20uL, de

20-200uL y de 100-1000ul )
Bao de Mara
Agitador
Recipiente para hielo
Centrifuga para tubos de 1,5 ml, que
alcance 14000 rpm
Congelador (-20C)
Tubos ependorff de 1,5ml
Guantes de ltex
Toallas de papel

Cantidad
1
1
1
1
1
1
5
1

REACTIVOS
Tris-HCL 1M pH8,0
EDTA 0,5M pH8,0
SDS 10 %
NaCl 5M
Acetato de sodio 3M pH 5,2
Etanol grado biologa molecular
Buffer TE
RNasa
Proteinasa K

Cantidad
100 mL
50 mL
50 mL
50 mL
100 mL
50 mL
50 mL

PROCEDIMIENTO
1. Obtener un cultivo de bacterias Escherichia coli de 18 horas de incubacin
en caldo nutritivo.
2. En un microtubo agregar 1.5 ml del cultivo bacteriano con ayuda de una
micropipeta.
3. Centrifugar a 12000 rpm por 3 minutos
4. Eliminar el sobrenadante perfectamente escurriendo las muestras en papel
secante.
5. Resuspender en 200 l de buffer de lisis (40 mM de Tris-HCl pH 7,8, 20 mM
de acetato de sodio, 1mM de EDTA y 1 % de SDS).
6. Pipetear vigorosamente.
7. Opcional: para inactivar protenas adicionar 5% v/v de -mercaptoetanol
50100 g/mL de Proteinasa K.
8. Para remover protenas y desechos celulares, adicionar 66 l de NaCl 5 M y
mezclar.

9. Centrifugar a 12000 rpm por 10 min a 4 C.

10.Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo y adicionar un volumen igual de
cloroformo.
11.Invertir manualmente 50 veces, hasta que se forme una solucin lechosa.
12.Centrifugar a 12000 rpm durante 3 min.
13.Repetir la extraccin con cloroformo
14.Recuperar el sobrenadante (aprox. 250 l), sin tocar el botn y transferir a
un tubo nuevo.
15.Adicionar 300 l de etanol absoluto fro (a -20 C).
16.Incubar a -20 C durante 30 min.
17.Centrifugar a 12000 rpm durante 3 min.
18.Eliminar perfectamente el sobrenadante.
19.Limpiar el botn con 300 l de etanol al 70% agitando brevemente en
vrtex.
20.Centrifugar a 12000 rpm por 3 min.
21.Eliminar perfectamente el sobrenadante.
22.Secar perfectamente el botn a 65 C por 5 min.
23.Resuspender en 50 a 100l de agua pura, desionizada y estril buffer TE
(Tris 10 mM EDTA 1 mM).
El ADN que ha sido extrado de un tejido debe ser cuantificado y su calidad
verificada. El mtodo ms empleado para la determinacin simultnea de estas
caractersticas es la electroforesis en gel de agarosa. La cuantificacin tambin
se puede realizar empleando un espectrofotmetro, el cual detecta la radiacin
emitida por las bases nitrogenadas presentes en el ADN luego de ser excitadas
con luz de 260 nm. De igual manera se puede emplear un fluormetro, el cual
cuantifica la emisin de energa de los compuestos qumicos (fluorocromos)
que se intercalan dentro del ADN.
BIBLIOGRAFA
Rocha-Salavarrieta P. (2002). Teora y prctica para la extraccin y
purificacin del ADN de palma de aceite. Palmas Vol. 23(3): 9-17.
Sambrook, J. and D. Russell. 2001. "Molecular Cloning: A Laboratory Manual",
3rd edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY.