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CROMATOGRAFIA:

CURSO BSICO
Profa. Dra. Glaucia Maria F. Pinto

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PROFA. DRA. GLAUCIA MARIA

Cromatografia Definio
Cromatografia a separao de uma mistura devido a

diferentes afinidades que seus componentes possuem


pela fase estacionria (lquida ou slida) e fase mvel
(lquida ou gasosa) (ocasionando migrao
diferenciada).
Introduo de
uma mistura

Eluio

Separao dos
componentes

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PROFA. DRA. GLAUCIA MARIA

Exemplos de Cromatografia
Cromatografia Lquida
Usada para identificar pigmentos de
plantas
desconhecidos e outros
compostos.

Cromatografia em camada delgada


Usa uma placa fina de plstico ou de
vidro revestidos com FE para
identificar a composio de pigmentos
e substncias qumicas desconhecidas.

Cromatografia Gasosa
Usada para determinar a composio qumica de
substncias desconhecidas, principalmente volteis,
como compostos na gasolina (representados por
cada pico separado na figura ao lado).
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PROFA. DRA. GLAUCIA MARIA

Cromatografia em papel
Pode ser usada para separar os
compostos de tintas, plantas
(clorofila), maquiagem e outras.

TIPOS DE CROMATOGRAFIA

Camada delgada

Papel

HPLC

Gas

PROFA. DRA. GLAUCIA MARIA

Coluna

TIPOS DE CROMATOGRAFIA
Clssica
coluna
HPLC
lquida
Papel
CROMATOGRAFIA

planar
CCD
gasosa

CG

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PROFA. DRA. GLAUCIA MARIA

Cromatografia Breve histrico

M. TSWETT (1906): Separao de misturas de pigmentos vegetais em colunas recheadas com


adsorventes slidos e solventes variados.
ter de
petrleo
mistura de
pigmentos

CaCO3

pigmentos
separados

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PROFA. DRA. GLAUCIA MARIA

Cromatografia Breve histrico

1930

1906

1952

1938

1941

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PROFA. DRA. GLAUCIA MARIA

1983

1959

Anos 80

Anos 90

CROMATOGRAFIA EM COLUNA

(FM)

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PROFA. DRA. GLAUCIA MARIA

Composto
tem a maior afinidade
pela FM, composto
tem a maior
afinidade pela FE

Cromatografia Classificao

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PROFA. DRA. GLAUCIA MARIA

Cromatografia Classificao

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PROFA. DRA. GLAUCIA MARIA

Cromatografia Classificao
A forma fsica do sistema de cromatografia define a tcnica
geral:
Cromatografia em coluna: fase estacionria (FE) colocada
em tubo cilndrico. De acordo com o dimetro da coluna
utilizada temos:
Preparativa (6-50 mm)
Analtica (2-6 mm)
Micro (< 2mm)
Cromatografia planar: FE disposta sobre superfcie plana:
(1) TLC, Thin Layer Chromatography- em portugus conhecida
como CCD, Cromatografia de Camada Delgada
(2) Cromatografia em Papel
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PROFA. DRA. GLAUCIA MARIA

Cromatografia Classificao

A cromatografia em coluna se divide em dois grupos:


Cromatografia Lquida Clssica => coluna de

vidro, presso atmosfrica, fluxo de fase mvel


(FM) devido a gravidade;
Cromatografia

Lquida de Alta Presso =>


colunas metlicas e presses elevadas, com
bomba de alta presso (HPLC ou CLAE).
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Cromatografia Classificao

Nomenclatura - o critrio se baseia na natureza fsica das fases


utilizadas:
Fase mvel (FM) pode ser:
Gasosa => cromatografia gasosa (CG)
Lquida => cromatografia lquida (CL)
Fase estacionria (FE) pode ser:
Lquida (sobre um suporte slido): CGL e CLL
Slida: CGS e CLS
Fase ligada: CGFL e CLFL

Fase reversa => fase estacionria mais apolar do que fase mvel
Fase normal => fase estacionria mais polar do que fase mvel
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Cromatografia Classificao

Srie eluotrpica:
- pentano
- ter de petrleo
- ciclohexano
- benzeno
- clorofrmio
- ter etlico
- acetato de etila
- acetona
- propanol
- etanol
- metanol
- gua

aumento da polaridade

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PROFA. DRA. GLAUCIA MARIA

Cromatografia Classificao
Classificao baseada no mecanismo de separao

Fsico: processos de soro (adsoro ou absoro/ partio) so baseados


principalmente em foras eletrostticas ou dipolares (foras de Van der Waals),
incluindo pontes de hidrognio.

Qumico: bioafinidade e troca inica => grupos funcionais ionizveis, trocadores


aninicos e catinicos, FM geralmente uma soluo tampo.

Mecnico: cromatografia por excluso. FE inerte com partculas de forma, tamanho e


porosidade uniformes. Diferenciao em ter analitos de diferentes tamanhos =>
penetrao seletiva nos poros.
(GPC= cromatografia de permeao em gel ou por excluso de tamanho)

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Cromatografia Classificao

Fase estacionria

a) adsoro

b) partio

c) troca-inica

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PROFA. DRA. GLAUCIA MARIA

d) excluso

Processo Cromatogrfico (1)


Processo fsico - qumico que rege a separao:

Adsoro:
O soluto adsorvido na superfcie
das partculas slidas da fase
estacionria.
um fenmeno superficial,
aumentado com a formao de
pontes de hidrognio.

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PROFA. DRA. GLAUCIA MARIA

Processo Cromatogrfico (2)

Partio:
O soluto se equilibra entre o
lquido da fase estacionria e a
fase mvel, por diferena de
solubilidade (equilbrio)

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PROFA. DRA. GLAUCIA MARIA

Processo Cromatogrfico (3)

Troca Inica:
Os nions e ctions se unem
covalentemente a uma fase
estacionaria slida

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PROFA. DRA. GLAUCIA MARIA

Processo Cromatogrfico (4)

Excluso Molecular, Filtrao


ou Permeao em Gel:
No existem interaes entre a
fase estacionria e o soluto. Se
separa por tamanho de
partcula.

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PROFA. DRA. GLAUCIA MARIA

Cromatografia - classificao
A cromatografia
pode ser utilizada
para uma ampla
variedade de
amostras, sendo
que de acordo
com a massa
molar e a
solubilidade em
gua dos analitos,
diferentes tipos de
cromatografia
devem ser
escolhidas (veja o
quadro).
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PROFA. DRA. GLAUCIA MARIA

Termos e smbolos mais usados


tR= tempo de reteno de cada componente
tM= tempo de reteno de um componente no retido (no tem
afinidade) pela fase estacionria => tempo morto
K= fator de reteno= (tR-tM)/tM
As= assimetria do pico (divide-se o pico ao meio e faz-se a
razo entre os dois segmentos)
T= fator de cauda (tailing factor) substitui a As geralmente
= fator de seletividade=(tR2-tM)/ (tR1 tM)
T= tailing factor= fator de cauda
N= eficincia= nmero de pratos
Rs= resoluo entre os picos
H= altura equivalente (utilizado para comparar eficincia de
colunas de diferentes comprimentos)= L/N
Alargamento de banda
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Cromatograma

tm
(V0)

tR1

tR2

No topo do pico,
aonde as linhas
se encontram,
marque tR usando
o eixo x (tempo)
como escala

PROFA.

Trace 2 linhas
tangente lateral
23 cortando
do pico,
D RaAlinha
. G Lde
A Ubase
CIA MARIA

A largura do pico (w) encontrada


medindo-se a distncia em tempo
(escala do eixo x) da base do pico
entre uma tangente e outra

Frmulas

tR
K=
1,0
Vo

W
T=
2xF

T= fator de cauda
W= largura do pico a 5% da altura
F= tempo do incio da largura do pico a
5% de altura at o tempo de reteno (tR)
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PROFA. DRA. GLAUCIA MARIA

Frmulas

Rs =

2,0 (tR2 tR1)


(W2 + W1)

tR
N = 16

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PROFA. DRA. GLAUCIA MARIA

Rs= resoluo
tR= tempo de reteno
W1 + W2 = soma da
largura da tangente dos
picos
N= nmero de pratos
tR= tempo de reteno
W= largura do pico na
linha
de
base,
determinada
pela
tangente do pico

Avaliao de picos cromatogrficos


Rs ruim
pois picos
so largos

Rs melhor
que (a)
mais tR so
diferentes

Picos adjacentes com


mesmo tempo de
reteno podem no
apresentar resoluo se
forem muito largos
(comparar a e c).
Nesta situao de picos
largos necessrio uma
maior diferena entre tR
para obter resoluo
(observar b)

Boa Rs com
picos finos26
PROFA. DRA. GLAUCIA MARIA

Avaliao de picos cromatogrficos

De acordo com a frmula de Resoluo:

2,0 (tR2 tR1)


Rs =
(W2 + W1)
Para Rs aumentar, a diferena
entre o tR de dois picos
adjacentes deve aumentar ou as
larguras (w) dos picos deve
diminuir.

Avaliao de picos cromatogrficos

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PROFA. DRA. GLAUCIA MARIA

Problemas de assimetria Picos com Caudas

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PROFA. DRA. GLAUCIA MARIA

Cromatografia - Eficincia

A eficincia pode ser afetada por fatores, como:


Comprimento da coluna
Dimetro da coluna
Vida til
Temperatura de eluio
Vazo de FM
Volume de amostra introduzida
Tcnica de injeo
Caractersticas da substncia
Outros

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PROFA. DRA. GLAUCIA MARIA

Cromatografia Anlise qualitativa e quantitativa

? (identificao)
h
A

qualitativa

Integrao
do pico
obtendo
rea (A) e
altura (h)

quantitativa

A cromatografia mais utilizada para anlise quantitativa, mas se acoplada a um detector capaz de fornecer
informaes qualitativas este tipo de anlise ser possvel se acoplarmos o cromatgrafo com:
Infravermelho (IR)
Ressonncia nuclear magntica (RNM ou RMN)
Espectrometria de massas (EM ou MS)

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PROFA. DRA. GLAUCIA MARIA

Cromatografia Anlise quantitativa


O mtodo instrumental mede um sinal instrumental (S) que se relaciona com a
concentrao do analito (C):
S = f(C) analito
A medida do sinal se fundamenta em uma propriedade fsico-qumica que se relaciona
diretamente com a concentrao do analito
As tcnicas cromatogrficas precisam de calibrao: requerem o uso de padres =>
padronizao interna ou externa
Idealmente, a relao sinal X concentrao deve ser linear
A seletividade depende da natureza do sinal e est relacionada com a propriedade do
analito que est sendo medida
A sensibilidade se relaciona com a inclinao da reta de calibrao
O limite de deteco depende do rudo instrumental
Existe uma faixa de concentrao na qual a relao pode ser linear entre o sinal
analtico e a concentrao
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PROFA. DRA. GLAUCIA MARIA

Cromatografia Anlise quantitativa

Curva de calibrao: y= ax+b ou sinal= a. conc. (analito) + b

a= coeficiente
angular (inclinao)

b= coeficiente
linear
(intercepto)

PROFA. DRA. GLAUCIA MARIA

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Cromatografia Anlise quantitativa

Sensibilidade: quanto mais inclinada a curva de calibrao mais


sensvel o mtodo (diferena de sinal maior com menores
diferenas de concentrao)

maior sinal

menor sinal

PROFA. DRA. GLAUCIA MARIA

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Cromatografia Anlise quantitativa

Faixa linear: regio da curva de calibrao na qual o sinal


possui uma relao linear com a concentrao

PROFA. DRA. GLAUCIA MARIA

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Cromatografia Anlise quantitativa

PROFA. DRA. GLAUCIA MARIA

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TIPOS DE CROMATOGRAFIA
Clssica
coluna
HPLC
lquida
Papel
CROMATOGRAFIA

planar
CCD
gasosa

CG

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PROFA. DRA. GLAUCIA MARIA

CROMATOGRAFIA
PLANAR

Aplicao da
amostra na
placa

Colocar placa
em recipiente
com FM

Separao dos componentes


vai ocorrendo enquanto a
FM vai subindo por
capilaridade...

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PROFA. DRA. GLAUCIA MARIA

Parar antes da
FM atingir o
final da placa

Secar a placa e
marcar a altura
de cada mancha
e marcar a
distncia
percorrida pela
FM

CROMATOGRAFIA PLANAR
4= distncia percorrida pela FM (frente de
solvente) - S
3= distncia percorrida pelo componente A
DsA
2= distncia percorrida pelo componente B DsB
1= local de aplicao da amostra (ponto de
partida)

Rf= mede a relao do


deslocamento do composto
em anlise comparado com o
deslocamento da fase mvel

Rf A= DsA / S
Rf B= DsB / S
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PROFA. DRA. GLAUCIA MARIA

Cromatografia de Camada Delgada


Separao de misturas de compostos moleculares atravs da
migrao diferencial dos mesmos entre duas fases: uma fixa (ou
estacionria) e outra mvel, que desliza sobre a primeira.
Ou tambm pode ser expresso como um procedimento de
separao microanaltico no qual os componentes de uma
mistura so transportados para diferentes distncias em uma
placa recoberta com uma fina camada de material poroso. A
espessura da camada pode variar de 100mm a 250mm.
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PROFA. DRA. GLAUCIA MARIA

Cromatografia de Camada Delgada


A placa que serve de suporte em geral de vidro, mas pode ser de
plstico ou de alumnio. A camada que recobre a placa recebe o
nome de fase estacionria e em geral constituda de slica gel.
O mecanismo de transporte um solvente e conhecido como fase
mvel. Primeiro a amostra dissolvida em um solvente adequado,
ento, uma certa alquota desta soluo aplicada na regio de
partida e o conjunto seco.
A placa de TLC/HLTPC ento colocada em uma cmara de
desenvolvimento ou cuba, o qual contm o solvente.
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PROFA. DRA. GLAUCIA MARIA

CROMATOGRAFIA DE
CAMADA DELGADA
Inicia-se o que chamamos de desenvolvimento
cromatogrfico onde os componentes da amostra so
influenciados pela ao de duas foras, opostas entre si:
Capilaridade: a responsvel pelo avano do solvente ou
fase mvel sobre a fase estacionria que contm a
amostra.
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PROFA. DRA. GLAUCIA MARIA

CROMATOGRAFIA DE
CAMADA DELGADA
Interao: to logo se inicia a migrao da fase mvel, a
amostra dissolvida e comea a ser arrastada pela fase
mvel.
Neste momento aparecem foras de interao entre os
componentes da amostra e a fase estacionria.
Estas foras de interao se opem fora de arraste da fase
mvel (capilaridade) retardando o avano dos componentes
da amostra.
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PROFA. DRA. GLAUCIA MARIA

Cromatografia de Camada Delgada


EM FUNO DE TODAS ESTAS INTERAES ENTRE
AMOSTRA/FASE MVEL/FASE ESTACIONRIA, O SISTEMA
TLC/HPTLC DEVE SER OTIMIZADO PARA CADA AMOSTRA

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PROFA. DRA. GLAUCIA MARIA

CROMATOGRAFIA DE CAMADA DELGADA


Muitas substncias, sem nenhuma colorao podem ser visualizadas
quando iluminadas por uma luz UV.
Existem vrios meios de se avaliar o cromatograma. Do ponto de
vista qualitativo (visual) pode-se efetuar a avaliao apenas
dispondo de uma cmara UV, contendo lmpadas capazes de emitir
luz nos comprimentos de onda de 254nm e 366nm. Neste caso as
manchas so visualizadas e suas distncias de migrao calculadas.
A distncia de migrao da amostra comparada distncia de
migrao do padro diz respeito qualidade da amostra.
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PROFA. DRA. GLAUCIA MARIA

CROMATOGRAFIA DE CAMADA DELGADA


Reveladoresso agentes fsicos (ultravioleta, por exemplo) ou
qumicos (vapores de iodo, H2SO4, por exemplo) que tornam
visveis as substncias separadas.
Outros reveladores qumicos: cido sulfrico/metanol, vanilina
sulfrica, tricloreto de antimnio, permanganato de
potssio/cido sulfrico, anisaldedo, etc

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PROFA. DRA. GLAUCIA MARIA

FATOR DE RETENO OU RETARDAMENTO OU RELAO (RF)

Isto calculado atravs do Rf


Rf a relao entre as distncias percorridas pelo composto e pela frente do solvente.
Rf =distncia do centro da mancha linha de partida
distncia da frente do eluente linha de partida
Ou Rf = a/b

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PROFA. DRA. GLAUCIA MARIA

RF

Por exemplo, se uma substncia de uma mistura desconhecida se desloca 2,5 cm e a


frente do solvente se desloca 5,0 cm, o Rf 0,5. Um Rf sempre estar na faixa de 0 a 1:
se a substncia se move totalmente ela pode se deslocar igualmente como a FM se
deslocou mas no mais do que isso; se a substncia no se desloca nada seu Rf ser
zero.
Diferentes caractersticas da FM vo alterar o valor de Rf das substncias e podemos
controlar a migrao dos compostos trocando a FM (principalmente alterando a
polaridade).
O valor de Rf identifica uma substncia pois ele possui um valor nico, para uma dada
FM e FE utilizadas.
Devemos correr em uma mesma placa a amostra desconhecida e o padro que deve
identificar a substncia em anlise. Como a amostra e o padro estaro na mesma
condio, se os Rf da mancha do padro e da substncia desconhecida coincidirem
porque devem se tratar do mesmo composto.
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PROFA. DRA. GLAUCIA MARIA

Rf

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PROFA. DRA. GLAUCIA MARIA

APLICAO DA AMOSTRA

a primeira e mais crtica etapa de um trabalho com


TLC/HPTLC, desconsiderando-se a preparao da
amostra.
A aplicao muito importante porque sua regularidade
e qualidade refletem-se at a ltima etapa da anlise. A
preciso do volume aplicado e o exato posicionamento
so essenciais
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PROFA. DRA. GLAUCIA MARIA

Cromatografia de Camada Delgada


APLICAO DA AMOSTRA

Forma incorreta de aplicao


de aplicao
PROFA. DRA. GLAUCIA MARIA

Forma correta
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APLICAO EM SPOTS, BANDAS OU


RETNGULOS ?

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PROFA. DRA. GLAUCIA MARIA

CROMATOGRAFIA DE CAMADA DELGADA


Para este caso, o solvente Hexano mostrou-se como o melhor, pois o
ponto de aplicao ficou o menor possvel. O ideal evitar o efeito de
anel, como ocorreu com a gua.

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PROFA. DRA. GLAUCIA MARIA

Aplicao da amostra
Assim, os volumes aplicados devem ser limitados. Para
as placas TLC pode-se aplicar 0,5L a 5L e para HPTLC
o mximo indicado de 1L.
Aplicaes em banda resultam em melhor separao
dos componentes, considerando as mesmas condies
de desenvolvimento.
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PROFA. DRA. GLAUCIA MARIA

Cromatografia de Camada Delgada

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PROFA. DRA. GLAUCIA MARIA

PARMETROS PARA A PLACA


Temperatura:
O desenvolvimento do cromatograma deve ocorrer em
temperatura ambiente. Temperaturas entre 20C e 25C no
so crticas para este procedimento. importante evitar
flutuaes de temperatura durante o processo.
Umidade:
Durante a fabricao e logo aps, as placas so secas
temperatura de 120C, de modo a ativar a slica gel. Ao ser
retirada da embalagem a placa adsorve rapidamente umidade,
se equilibrando em alguns minutos. Entre HR de 50 a 60% este
equilbrio ocorrer na placa com cerca de 13% de contedo de
gua.
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PROFA. DRA. GLAUCIA MARIA

POSIO DA CUBA

A cuba deve ser colocada de modo a no receber luz


solar direta, em local com temperatura estvel e
bancada a mais nivelada possvel.
Quando o trabalho estiver sendo feito com substncias
fotossensveis, o cromatograma deve ser corrido no
escuro.
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CROMATOGRAFIA EM PAPEL
Compostos hidrossolveis, cidos orgnicos e ons metlicos
Princpio: partio (solubilidade)
Quantidade de amostra necessria 10-3 a 10-6 g
Tipos: ascendente, descendente, bidimensional, circular
F.M. - Sistema de solventes
F.E. - gua retida na celulose (papel Whatman)
Mtodos de deteco: fsico-qumicos
Anlise qualitativa: Rf (fator de reteno) - problema : reprodutibilidade
Anlise quantitativa: densitmetro, extrao dos solutos
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CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA


Mtodo rpido (20-40 min.)
Uso de diversos agentes cromognicos
Maior sensibilidade que C.P. (10-9 g)
Grande gama de compostos pode ser analisada
Mtodo simples e barato
F.M. - sistema de solventes
F.E - Adsorventes (slica, alumna, celite, amido)
Mtodos de deteco: fsico-qumicos
Princpio: Adsoro (polaridade)
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Adsoro depende:
natureza qumica do adsorvente

Tipos de adsorventes:
G- aglutinantes (gesso amido ou talco)

rea de superfcie/ tamanho da


partcula

P-camada preparativa

porosidade da partcula

F- contm fluorescncia

-atividade --> stios ativos

R- adsorvente sem aditivo

H- sem aglutinante (p/ CL)

Critrios para escolha da fase mvel:


analitos devem ser solveis diferentemente
no deve haver reao entre analitos/FM e FM/FE
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PROFA. DRA. GLAUCIA MARIA

CCD - EXEMPLOS

Requerimento da amostra::
detectvel no cromatograma
solvel na FM
estvel luz, oxignio, solvente, no ser voltil

PROFA. DRA. GLAUCIA MARIA

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CCD - EXEMPLOS

PROFA. DRA. GLAUCIA MARIA

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CCD - exemplos

PROFA. DRA. GLAUCIA MARIA

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CCD - exemplos
Transfira cerca de 3 cm2 de folha
para um almofariz
Macere at que todo o tecido se
quebre
Adicione cerca de 750 l de
propanona
Transfira o sobrenadante para
um recipiente e feche
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EXEMPLO - MTODO

Aplique a soluo de amostra na placa (aqui mostrada uma aplicao em


barra, mas poderia ser em spot )

1.5 cm
1.0 2.0 3.0 4.0
Fase mvel: ciclohexano : propanona : ter de petroleo,
proporo 5 : 3 : 2
PROFA. DRA. GLAUCIA MARIA

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EXEMPLO - MTODO

Coloque a placa com a


amostra aplicada em um
recipiente saturado com a
FM
Espere o solvente subir
na placa, por capilaridade,
e quando estiver prximo
ao topo, retire a placa
Imediatamente marque a
frente do solvente
PROFA. DRA. GLAUCIA MARIA

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RESULTADOS

Pigmento

Cor

RF

caroteno

0,91

feofitina a

amareloalaranjado
cinza

feofitina b

cinza claro

0,63-0,75

clorofila a

verde azulado

0,63

clorofila b

verde

0,58

xantofilas

amarelo

0,53

xantofilas

amarelo

0,47

xantofilas

amarelo

0,32

PROFA. DRA. GLAUCIA MARIA

0,75

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Comparao
CP

CCD

Vantagens:

Vantagens:
maior sensibilidade
mais rpido
> repetibilidade
< difuso
> faixa de aplicao
reveladores reativos
permite aquecimento
Desvantagens
Degradao de compostos lbeis devido
a grande superfcie de exposio
dificuldades na quantificao

tcnica simples
no requer
instrumentao sofisticada
baixo custo
Desvantagens:
uso limitado
alargamento de banda-difusopouca alternativa de reveladores

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TIPOS DE CROMATOGRAFIA
Clssica
coluna
HPLC
lquida
Papel
CROMATOGRAFIA

planar
CCD
gasosa

CG

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PROFA. DRA. GLAUCIA MARIA

Cromatografia Lquida em coluna aberta


(cromatografia lquida clssica)
(FM)

FE
Substncias
separadas,
antes
presentes
como
mistura na
amostra

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PROFA. DRA. GLAUCIA MARIA

Cromatografia Lquida em coluna aberta


(cromatografia lquida clssica)

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PROFA. DRA. GLAUCIA MARIA

Cromatografia Liquida - Esquema

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PROFA. DRA. GLAUCIA MARIA

Esquema da instrumentao

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PROFA. DRA. GLAUCIA MARIA

Esquema da instrumentao

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PROFA. DRA. GLAUCIA MARIA

Esquema da instrumentao

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PROFA. DRA. GLAUCIA MARIA

Esquema da instrumentao

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PROFA. DRA. GLAUCIA MARIA

Esquema da instrumentao

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PROFA. DRA. GLAUCIA MARIA

Colunas FM e FE

coluna
Fator crtico !

FM

FE
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PROFA. DRA. GLAUCIA MARIA

FE, FM

CL :
Fase normal: fase mvel mais apolar do que fase
estacionria
Ex: FM hexano:etanol, FE slica
Fase reversa: fase mvel mais polar do que fase
estacionria
Ex: FM Metanol:gua, FE C-18
quase 99% das aplicaes utilizam fase reversa
slica o suporte mais utilizado devido a resistncia qumica,
fsica e mecnica (partculas de 3 a 100 m)
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PROFA. DRA. GLAUCIA MARIA

FE, FM
FE
Fase reversa

Octadecil (C-18 ou
RP-18)

-(CH2)17CH3

Octil (C-8 ou RP-8)

-(CH2)7CH3

Etil

-CH2CH3

Cicloexil
fenil
Fase normal

FM

amostra

Metanol, gua,
acetonitrila, THF

Comp. no polares,
vitaminas, pesticidas,
esterides,
hidrocarbonetos

Etanol, cicloexano,
hexano, propanol, ter,
clorofrmio

Aminas, lcoois, fenis

-CH2CH2
-CH2CH2CH2

Ciano (CN)

-(CH2)3CN

Amino (NH2)

-(CH2)3NH2

Drogas, alcalides

diol

-(CH2)3OCH2CHCH2

Protenas, peptdeos

OH

slica

OH

-SiOH

cidos carboxlicos,
aminocidos,
flavonides
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Colunas, FE

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PROFA. DRA. GLAUCIA MARIA

Colunas, FE

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Colunas, FE

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Colunas, FE

Poros da slica

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PROFA. DRA. GLAUCIA MARIA

Colunas, FE

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PROFA. DRA. GLAUCIA MARIA

Colunas

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PROFA. DRA. GLAUCIA MARIA

Colunas

Continuao...

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PROFA. DRA. GLAUCIA MARIA

Colunas

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PROFA. DRA. GLAUCIA MARIA

FE

Coluna a base de slica => pH de uso na faixa de 2-8;


Slica hbrida => pH na faixa de 2-12 ou 1-12.
Fluxos altos prejudicam o leito;
Presso de trabalho alta e choques de presso causam degradao do leito
(alm de desgastar os selos da bomba e do injetor).
No inverter coluna normalmente
Limpeza de colunas
Para sais e PIC=> gua 40-50C
FE reversa usar THF
Armazenagem em89solvente apropriado
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Colunas FM e FE

FM causa 50% dos problemas de anlise;


Reagentes grau HPLC => pureza imprescindvel (incluindo
gua);
Sais, PIC, cidos, tampes purificados;
Colunas possuem filtros (ao sinterizado) de 2 m => retm
partculas em suspenso na FM;
Sujeiras maiores que 1/8 do dimetro da partcula podem
entupir os caminhos do leito de recheio.
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Membranas para filtrar FM

Teflon (TFE) apropriado para tudo, mas precisa ser


ativado com metanol ou outro orgnico antes da
passagem de gua ou acetonitrila;
Polipropileno hidrfilo (GHP) adequado para gua e
orgnicos em geral menos TCB e o-DCB;
Membrana de PVDF adequado para orgnicos e gua,
menos DMF, acetona e acetonitrila.
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Volume da amostra

Sobrecarga de amostra na coluna (2 mg/g de fase) resulta em


decrscimo de eficincia, decrscimo de reteno e aumento de
cauda;
Volume mximo de amostra depende: rea superficial do suporte, %
de recobrimento, fator de reteno dos picos, resoluo, volume da
coluna;
Volume mximo de injeo deve ser < 1% do volume interno da
coluna vazia.
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Diluente da amostra

Se a amostra for preparada com solvente mais forte que FM


diminui-se a eficincia e o fator de reteno;
Sempre que possvel preparar a amostra em FM ou em solvente
mais fraco;
Exemplo: FM com 30% de metanol, amostra deve ser dissolvida em
no mximo 30% de metanol. 30% de acetonitrila tambm no
adequado.
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Temperatura

Colunas a base de slica: 60C;


Colunas C18 e C8 a base de slica hbrida: 80C;
Para um aumento de 10C, dobra-se a velocidade de hidrlise
(degradao) da camada orgnica do recheio;
Coluna GPC: entre 80 e 145C;
No deixar a coluna com temperatura elevada sem ter FM passando.
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Colunas

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Cromatografia de Troca Inica

A cromatografia de troca inica, que geralmente chamada de


cromatografia inica, refere-se a mtodos modernos e eficientes de
separao e determinao de ons com base em resinas trocadoras de
ons.
A fase estacionria altamente carregada, sendo que solutos com cargas
de sinais contrrios a esta so seletivamente adsorvidos. Os solutos
adsorvidos podem ser subsequentemente eludos, por deslocamento com
outros ons com mesmo tipo de carga (FM), porm com maior fora de
interao com a FE.
A diferena de afinidade entre os ons da fase mvel e a matriz devido a
diferenas de carga, sendo possvel control-la utilizando fora inica e
pH.
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Cromatografia de Troca Inica

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Cromatografia de Troca Inica

Detector mais usado: eletroqumico => condutividade


Historicamente, a cromatografia de troca inica foi feita em pequenos leitos
porosos formados durante copolomerizao de emulso de estireno e
divinilbenzeno. A presena de divinilbenzeno (usualmente = 8%) resulta em
ligaes cruzadas que conferem estabilidade mecnica aos leitos. Para tornar
o polmero ativo com relao aos ons, grupos funcionais cidos ou bsicos
so quimicamente ligados sua estrutura. Os grupos mais comuns so
cidos sulfnicos e aminas quaternrias.
Os stios ativos mais comuns para as resinas trocadoras de ctions so o
grupo cido sulfnico SO3-H+ , um cido forte, e o grupo cido carboxlico
COO-H+, um cido fraco. Trocadores aninico contm grupos amina tercirias
N(CH3)3+OH- ou grupos de aminas primrias NH3+OH- . O primeiro uma
base forte e o segundo, uma base fraca.
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Cromatografia de Troca Inica

A fase mvel na cromatografia de troca inica deve ter as mesmas


propriedades gerais requerida nos outros tipos de cromatografia. Isto , deve
dissolver a amostra, ter uma fora de solvente que leve a tempos de
reteno razoveis e interagir com solutos de modo a levar seletividade.
Os processos de troca inica esto baseados em equilbrios de troca entre
ons em soluo e ons de mesmo sinal na superfcie de um slido
essencialmente insolvel de alto peso molecular.
A afinidade entre ons da fase mvel e a matriz podem ser controlados
utilizando fatores como pH e a fora inica (concentrao de sal). A
seletividade depende da carga dos ons, concentrao e solvatao.
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Cromatografia de Troca Inica

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Cromatografia de Troca Inica

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Cromatografia de Troca Inica

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Cromatografia de Troca Inica

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Cromatografia de Troca Inica

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Cromatografia de Troca Inica

Trocadores aninicos
Trocadores aninicos podem ser classificados como fortes ou fracos. O
grupo de troca em um trocador aninico fraco uma base fraca, o qual
torna-se desprotonado e perde sua carga em pH elevado. DEAE-celulose
um exemplo, no qual o grupo amino pode ser positivamente carregado
em pH~9 ou menor e gradualmente perde sua carga em pH maiores. Um
trocador aninico forte, contem uma base forte a qual permanece
positivamente carregada na faixa de pH normalmente utilizada (1-14).

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Cromatografia de Troca Inica

Trocadores catinicos
Trocadores catinicos podem ser classificados em fracos e fortes. Um
trocador catinico forte contem um cido fraco (como o grupo sulfnico)
que permanece carregado em pH de 1-14. Um trocador catinico fraco
contem um cido fraco (como grupo carboximetil), o qual perde
gradualmente sua carga em pH abaixo de 4 ou 5.

Resinas catinicas
Resinas aninicas
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Cromatografia de Troca Inica

Aplicaes da Cromatografia de Troca Inica em Sistema Orgnicos e


Bioqumicos
A cromatografia de troca inica tem sido aplicada a vrios sistemas
orgnicos e bioqumicos, incluindo drogas e seus metablitos, soros,
conservantes de alimentos, misturas de vitaminas, aucares e preparados
farmacuticos. A figura a seguir mostra um exemplo dessas aplicaes,
aonde 1.10-8 mol de cada um de 17 aminocidos foram separados por
uma coluna catinica.

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Cromatografia de Troca Inica

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CI FE, FM

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CI FE, FM

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