Laboratorio prctico: Deteccin y anlisis de la expresin de genes en

plantas transgnicas utilizando el gen reportero GUS

Introduccin:
Algunos tipos de genes reporteros codifican para una enzima que cataliza una
reaccin facilmente detectable que permite determinar la actividad transcripcional
de un gen de inters. Utilizando tecnologa de DNA recombinante, el promotor
original del gen reportero es eliminado y re-emplazado por el promotor del gen en
estudio. Se genera as un gen quimrico el cual es introducido en un organismo,
permitiendo analizar la expresion del gen de inters a travs de la deteccin del
producto de la reaccin enzimtica catalizada por el gen reportero.
Uno de los genes reporteros mas utilizados en plantas, descrito por Jefferson y
colaboradores en 1987, es el gen uidA o gusA, este gen codifica para la enzima glucuronidasa (GUS). Esta enzima puede cortar un enlace en el sustrato
cromognico X-gluc (5-bromo-4-chloro-3-indolyl -D-glucuronide), generando as
un producto insoluble de color azul, el cual se acumula en todas aquellas clulas
que presenten actividad GUS (Fig. 1).

Figura 1: X-Gluc es sustrato de la enzima glucuronidasa (GUS), la reaccin

enzimtica en este sutrato produce cido glucurnico y cloro-bromoindigo.
Posteriormente la oxidacin y dimerizacin del cloro-bromoindigo genera un
precipitado insoluble de color azul llamado dicloro-dibromoindigo.

La generacin de un precipitado azul en los tejidos en presencia del sustrato Xgluc es un indicador de la actividad del promotor que controla el gen quimrico
(promotor del gen de inters + GUS) en esas clulas en particular (Fig. 2). Las
ventajas de este ensayo son su facilidad de realizar, es sensible, no require
equipamiento especializado y el hecho de que las clulas vegetales no presentan
actividad GUS propia.

Plntulas

Hojas

Flores

Raz

Figura 2: Tejidos de plantas transgnicas de Arabidopsis, muestran la actividad

transcripcional de diversas construcciones quimricas (promotor gen de inters +
GUS) una vez finalizado el proceso de tincin.
Las plantas transgnicas que expresan GUS crecen normalmente y son frtiles. La
actividad GUS es muy estable, y los extractos de los tejidos continuan mostrando
elevados niveles de actividad GUS luego de un prolongado tiempo de
almacenamiento.
Objetivo:

Determinar en que tejidos se expresan dos construcciones quimricas en

plantas transgnicas de arabidopsis utilizando el gen reportero GUS

Materiales:

Plntulas (10-14 das) de Arabidopsis thaliana wild type (C-) y plntulas

transgnicas.
Tipos de construcciones evaluadas: Se analizaran dos tipos de
construcciones quimricas. DR5-GUS contiene la secuencia promotora de
genes de respuesta a la hormona auxina y una segunda construccin
GRXC9-GUS que contiene la secuencia promotora de una glutaredoxina
que induce su expresin en respuesta a la hormona salicilato y a estrs
biticos como por ejemplo heridas causadas por insectos.
Soluciones: Buffer NaPO4 50 mM pH 7,2; Tritn X-100 0,1%; X-gluc 1mM;
etanol 70%, agua destilada.

Micropipetas, tubos plsticos 1,5 ml Eppendorf, gradillas, microscopio o

lupa ptica, estufa o bao termorregulado, marcadores, portaobjetos,
cubreobjetos.

Preparacin solucin GUS

Preparar una solucin:

- 13,5 ml Na2HPO4 0,5 M (3,54 g Na2HPO4 + 50 ml H2O)
- 6,32 ml NaH2PO4 0,5 M (3,9 g NaH2PO4*2H2O + 50 ml
H2O)
- 200l Tritn X-100
Llevar a un volumen final de 200 ml con agua destilada y
proteger de la luz.
Preparar una solucin Stock del sustrato X-Gluc 100 mM
(0,04446 g en 1 ml N,N dimetilformamida).
Antes de cada reaccin se agregan 10l de X-Gluc 100mM por
cada 1ml de solucin (para una concentracin final de 1mM).

Ensayo GUS
1. Suavemente con una pinza remueva desde la placa o desde la maceta
(segn sea el caso) un mnimo de tres plntulas por muestra a analizar.
Considere un tubo independiente para cada una de las construcciones
quimricas analizadas. Tenga cuidado de no romper las raices de las
plntulas y lave suavemente las plantas en agua destilada (utilice un tubo
Eppendorf)
2. Deje las plntulas en tubos plsticos de 1,5 ml (tubo Eppendorf) que
contienen 1 ml de solucin de tincin GUS incubando a 37 C hasta que
sea visible la coloracin azul (Toda la noche o 16 horas). Incluya un tubo
control negativo (C-) con plntulas wild type (NO-transgnicas).
3. Elimine la solucin de tincin GUS y lave las plntulas con etanol al 70%
tantas veces como sea necesario para eliminar la clorofila.
4. Prepare sus muestras, dejando las plantas sobre un portaobjeto, agregue
100 microlitros de agua a las muestras (para evitar que se deshidraten),
coloque cuidadosamente un cubreobjeto y observe los distintos tejidos bajo
la lupa o microscopio ptico. Determine en que tipo de tejido se estan
expresando cada una de sus construcciones, compare con el C- en cada
caso.

Bibliografa
Jefferson et al., (1987). GUS fusions: B-glucuronidaseas a sensitive and versatile gene fusion
marker in higher plants. EMBO Journal. Vol 6. 3901-3907.