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AGO 1993

NBR 12894

Bacillus cereus em alimentos Determinao da contagem em placas

ABNT-Associao
Brasileira de
Normas Tcnicas
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NORMATCNICA

Mtodo de ensaio

Copyright 1990,
ABNTAssociao Brasileira
de Normas Tcnicas
Printed in Brazil/
Impresso no Brasil
Todos os direitos reservados

Origem: Projeto 13:007.01-009/1990

CB-13 - Comit Brasileiro de Alimentos e Bebidas
CE-13:007.01 - Comisso de Estudo de Mtodos de Anlises Microbiolgicas
NBR 12894 - Bacillus cereus in food - Plate count - Method of test
Descriptor: Food
Vlida a partir de 30.09.1993
Palavra-chave: Alimento

6 pginas

1 Objetivo

d) papel-filtro Whatman n 31;

Esta Norma prescreve o mtodo para a determinao da

contagem de Bacillus cereus em alimentos.

e) soluo de fucsina bsica a 0,5%.

4 Execuo do ensaio
2 Documentos complementares
Na aplicao desta Norma necessrio consultar:
NBR 10203 - Preparo da amostra para exame microbiolgico em alimentos - Procedimento
NBR 12122 - Bactrias coliformes totais, coliformes
fecais e Escherichia coli em alimentos - Determinao do nmero mais provvel (NMP) - Mtodo de ensaio
NBR 12123 - Staphylococcus aureus em alimentos Contagem em placas - Mtodo de ensaio
NBR 12893 - Clostrdios sulfito redutores e Clostridium
perfringens em alimentos - Determinao da contagem em placas - Mtodo de ensaio

4.1 Materiais e reagentes

Os materiais e reagentes so os seguintes:
a) caldo dextrose-vermelho-de-fenol;
b) caldo nitrato;
c) caldo nutriente;
d) caldo nutriente adicionado de lisozima;
e) caldo Voges Proskauer (VP) modificado;
f) gar-gelatina;

3 Aparelhagem

g) gar-infuso de corao ou gar-infuso de crebro e corao;

Para o ensaio so necessrias a aparelhagem usual do laboratrio microbiolgico e em particular a que se segue:

h) gar-infuso de corao ou gar-infuso de crebro e corao adicionados;

a) conjunto para filtrao por membrana;

i) hidrato de cloral;

b) sistema de anaerobiose;

j) gar-manitol-vermelho-de-fenolpolimixina;

c) membrana filtrante com porosidade 0,45 m;

l) gar-motilidade para Bacillus cereus;

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m) gar-nutriente;
n) gar-tirosina;

resfriar a 45C - 50C e adicionar, assepticamente, 2,5 mL

da soluo de polimixina B a 0,1 % e 12,5 mL da emulso
de gema de ovo. Homogeneizar e distribuir pores de
15 mL em placas de Petri.

o) gar-sangue de carneiro;
Deixar solidificar e secar antes de sua utilizao.
p) reagentes para colorao de Gram;
4.2.1.2 gar-gelatina

q) reagentes para o ensaio de reduo do nitrato;

r) reativo de Frazier;
s) cido clordrico concentrado;
t) creatina em p;
u) hidrxido de potssio a 40%;

Triptona ............................................................ 5,0 g

Extrato de levedura .......................................... 3,0 g
Gelatina ............................................................ 5,0 g
gar .................................................................. 15,0 g

v) metanol;

gua destilada q.s.p. ........................................ 1000 mL

x) leo de imerso;

4.2 Ensaio

Dissolver os ingredientes na gua destilada, com agitao e aquecimento at completa dissoluo. Ajustar a
pH 7,1 e esterilizar a 121C por 15 min. Distribuir pores
de 15 mL em placas de Petri esterilizadas; deixar solidificar e secar antes de sua utilizao.

4.2.1 Preparo dos meios de cultura e reagentes

4.2.1.3 gar-infuso de corao

4.2.1.1 gar-manitol-vermelho-de-fenolpolimixina

Infuso de corao ........................................... 500,0 g

4.2.1.1.1 Meio-base

Triptose ............................................................ 10,0 g

Extrato de carne .................................................. 1,0 g

Cloreto de sdio p.a. (NaCl) ............................. 5,0 g

Proteose-peptona ................................................ 10,0 g

gar .................................................................. 15,0 g

D-manitol ............................................................. 10,0 g

gua destilada q.s.p. ........................................ 1000 mL

Cloreto de sdio p.a. (NaCl) ................................ 10,0 g

Suspender os ingredientes na gua destilada e aquecer

em banho-maria at completa dissoluo do gar. Resfriar a 50C - 60C, ajustar a pH 7,4 e esterilizar a 121C por
15 min. Distribuir pores de 15 mL em placas de Petri
esterilizadas.

z) vaselina lquida esterilizada ou leo mineral.

gar ..................................................................... 15,0 g

Vermelho-de-fenol (25 mL de soluo 0,1%) ...... 0,025 g
gua destilada q.s.p. ........................................... 900 mL
Suspender os ingredientes na gua destilada e aquecer
em banho-maria at completa dissoluo do gar. Resfriar a 50C - 60C, ajustar a pH 7,2, distribuir pores de
225 mL em frascos de Erlenmeyer e esterilizar a 121C
por 15 min.
4.2.1.1.2 Soluo de polimixina B a 0,1%

Sulfato de polimixina B ......................... 500000 unidades

gua destilada ...................................... 50 mL

4.2.1.3.1 gar-infuso de corao com 0,25% de hidrato de

cloral

Proceder como em 4.2.1.3, porm, aps a esterilizao,

deixar resfriar a 50C - 60C, juntar 25 mL da soluo de
hidrato de cloral a 10% e distribuir pores de 15 mL em
placas de Petri esterilizadas.
4.2.1.4 gar-nutriente

Extrato de carne ............................................... 3,0 g

Peptona ............................................................ 5,0 g

Dissolver o sulfato de polimixina B na gua destilada esterilizada e guardar no refrigerador.

gar .................................................................. 15,0 g

4.2.1.1.3 Emulso de gema de ovo

gua destilada q.s.p. ........................................ 1000 mL

Proceder de acordo com a NBR 12123.

Dissolver os ingredientes na gua destilada, aquecendo

at a fervura, distribuir pores de 5 mL em tubos e esterilizar a 121C por 15 min. Aps a esterilizao, deixar os
tubos em posio inclinada at completa solidificao do
meio.

4.2.1.1.4 Meio completo

No momento do uso, fundir o meio-base em banho-maria,

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Tripticase-peptona ............................................ 15,0 g

Dissolver a lisozima em 65 mL do cido clordrico 0,01 N

e aquecer at fervura por 20 min. Completar para 100 mL
com o restante do cido.

Fitona-peptona .................................................. 5,0 g

4.2.1.8.2 Soluo de lisozima alternativa

Cloreto de sdio p.a. (NaCl) .............................. 5,0 g

Cloreto de lisozima ............................................... 0,1 g

gar ................................................................... 15,0 g

gua destilada ...................................................... 100 mL

4.2.1.5 gar-sangue de carneiro

gua destilada q.s.p. ......................................... 1000 mL

Dissolver os ingredientes na gua destilada, com agitao e aquecimento at completa dissoluo. Ajustar a
pH (7,3 0,2), distribuir pores de 100 mL em frascos de
Erlenmeyer e esterilizar a 121C por 15 min. Resfriar a 50C
e adicionar 5 mL de sangue de carneiro desfibrinado. Distribuir pores de 15 mL em placas de Petri esterilizadas,
deixar solidificar e secar antes de sua utilizao.
4.2.1.6 gar-tirosina

Preparar o gar-nutriente, distribuir pores de 100 mL

em frascos de Erlenmeyer e esterilizar a 121C por 15 min.
Resfriar a 45C - 50C e adicionar 10 mL de soluo de tirosina a 5% esterilizada. Homogeneizar e distribuir, assepticamente, 5 mL em tubos esterilizados. Inclinar os tubos e resfriar rapidamente.
4.2.1.6.1 Soluo de tirosina

Adicionar o cloreto de lisozima gua destilada e esterilizar em membrana filtrante de porosidade 0,45 m.
4.2.1.9 Caldo nitrato

Extrato de carne ................................................ 3,0 g

Peptona ............................................................. 5,0 g
Nitrato de potssio p.a. (KNO3) ......................... 1,0 g
gua destilada q.s.p. ......................................... 1000 mL
Dissolver os ingredientes na gua destilada, distribuir
pores de 3 mL em tubos e esterilizar a 121C por
15 min. O pH final deve ser (7,0 0,1).
4.2.1.10 Caldo nutriente

Extrato de carne ................................................ 3,0 g

L-tirosina .............................................................. 5,0 g

Peptona ............................................................. 5,0 g
gua destilada q.s.p. ........................................... 100 mL
gua destilada q.s.p. ......................................... 1000 mL
Adicionar a L-tirosina gua destilada e esterilizar a 121C
por 15 min.
4.2.1.7 Caldo dextrose-vermelho-de-fenol

Dissolver os ingredientes na gua destilada, distribuir

pores de 2,5 mL em tubos e esterilizar a 121C por
15 min. O pH final deve ser 6,8.

Proteose-peptona ............................................. 10,0 g

4.2.1.11 Meio de motilidade para Bacillus cereus

Cloreto de sdio p.a. (NaCl) ............................. 5,0 g

Tripticase ........................................................... 10,0 g

Extrato de carne ............................................... 1,0 g

Extrato de levedura ........................................... 2,5 g

Dextrose ........................................................... 5,0 g

Glicose .............................................................. 5,0 g

Vermelho-de-fenol ............................................ 0,018 g

gua destilada q.s.p. ........................................ 1000 mL
Dissolver os ingredientes em gua destilada, distribuir
pores de 3 mL em tubos e esterilizar a 121C por 10 min.
O pH final deve ser 7,4.
4.2.1.8 Caldo lisozima

Preparar o caldo nutriente, distribuir pores de 99 mL em

frascos de Erlenmeyer e esterilizar a 121C por 15 min.
Resfriar temperatura ambiente e adicionar 1,0 mL da soluo de lisozima a 0,1%. Homogeneizar e distribuir, assepticamente, pores de 2,5 mL em tubos esterilizados.

Fosfato dissdico p.a. (Na2HPO4) ..................... 2,5 g

gar ................................................................... 3,0 g
gua destilada q.s.p .......................................... 1000 mL
Suspender os ingredientes na gua destilada, aquecendo
at fervura, para completa dissoluo do gar, e esterilizar
a 121C por 15 min. O pH final deve ser (7,4 0,2). Resfriar
a 50C e distribuir pores de 2 mL em tubos esterilizados.
4.2.1.12 Meio de Voges Proskauer modificado

Proteose-peptona ............................................... 7,0 g

4.2.1.8.1 Soluo de lisozima

Cloreto de sdio p.a. (NaCl) ................................ 5,0 g

Lisozim a ............................................................... 0,1 g

Dextrose .............................................................. 5,0 g

cido clordrico p.a. (H C l) 0,01 N , esterilizado ....... 100 m L

gua destilada q.s.p. ........................................... 1000 mL

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Dissolver os ingredientes na gua destilada, ajustar o

pH se necessrio, distribuir pores de 3 mL em tubos
e este-rilizar a 121C por 10 min. O pH final deve ser
(6,5 0,1).

4.2.2.3 Manter as placas em posio normal durante 15 min

para assegurar a absoro do inculo.

4.2.1.13 Reagentes para o ensaio de reduo do nitrato

4.2.1.13.1 Soluo A

Imediatamente aps o trmino das operaes descritas

em 4.2.2, proceder incubao das placas em posio
invertida, a (30 2)C por 24 h - 48 h.

cido sulfanlico (C6H7NO3S) ............................... 1,0 g

5 Resultados

cido actico 5 N (C2H4O2) ................................. 125 mL

5.1 Leitura das placas

Dissolver o cido sulfanlico no cido actico e filtrar em

papel-filtro. Estocar em frasco mbar a 0C - 5C.

Aps 24 h, selecionar para contagem, de preferncia, as

placas que apresentem no mximo 30 colnias suspeitas
de Bacillus cereus, ou seja: cerosas, com colorao rsea
(indicativo de manitol negativo), circundadas por halo de
precipitao evidenciando a produo de lecitinase. Caso
as reaes no sejam evidentes, reincubar as placas por
mais 24 h. Das placas selecionadas, proceder contagem
presuntiva para Bacillus cereus.

4.2.1.13.2 Soluo B

Alfanaftol (C10H8O) ............................................... 1,0 g

cido actico 5 N (C2H4O2) ................................. 200 mL
Dissolver o alfanaftol no cido actico e estocar em frasco mbar.
4.2.1.13.3 Zinco em p
4.2.1.14 Reativo de Frazier

4.2.3 Incubao das placas inoculadas

5.1.1 Caracterizao para Bacillus cereus

A partir das placas utilizadas para contagem e que contenham at cinco colnias suspeitas, conforme descrito
em 5.1, efetuar a caracterizao de todas. Em placas com
mais de cinco colnias, efetuar a caracterizao de, pelo
menos, cinco colnias.

Cloreto de mercrio p.a. (HgCl) .......................... 15,0 g

5.1.1.1 Colorao de Gram

cido clordrico concentrado p.a. (HCl) .............. 20,0 mL

Dissolver, com agitao, o cloreto de mercrio em 10 mL

de cido clordrico concentrado e adicionar cerca de
50 mL de gua destilada. Acrescentar o cido clordrico
restante, completar o volume com a gua destilada e homogeneizar bem.

Com auxlio de uma ala de platina ou nquel-cromo, transferir as colnias selecionadas para tubos contendo garnutriente inclinado e incubar a (30 2)C por 24 h. Em continuao, transferir o material das culturas para lminas de
microscopia e proceder colorao de Gram, conforme
descrito na NBR 12122. Devem ser consideradas caractersticas as culturas que apresentarem bacilos Gram-positivos, com esporos elipsoidais, centrais ou subterminais.

4.2.1.15 Soluo de fucsina bsica a 0,5%

5.1.1.2 Fermentao da dextrose

Fucsina bsica ..................................................... 0,5 g

A partir da cultura em gar-nutriente inclinado, inocular,

com auxlio de ala de platina ou nquel-cromo, um tubo
contendo caldo dextrose-vermelho-de-fenol previamente
desaerado por 10 min em banho-maria em ebulio e
imediatamente resfriado em gua gelada. Selar o tubo
com 1 mL de vaselina lquida esterilizada, ou leo mineral,
e incubar a 35C por 24 h. O ensaio considerado positivo, se houver turvao e mudana na colorao do meio,
de vermelho para amarelo.

gua destilada q.s.p. .......................................... 100 mL

lcool etlico ........................................................ 20 mL

gua destilada q.s.p. ........................................... 100 mL
Dissolver a fucsina no lcool etlico e diluir com a gua
destilada. Filtrar, se necessrio, em papel Whatman n 31.
4.2.2 Inoculao das placas
4.2.2.1 Inocular 0,1 mL da diluio 10-1, preparada de acor-

do com a NBR 10203, empregando-se pipeta graduada de

1 mL, esterilizada, na superfcie do gar-manitol-vermelho-de-fenolpolimixina, contido em placa Petri previamente seca em estufa a 55C.
4.2.2.2 Espalhar uniformemente o inculo sobre a superfcie do meio, at completa absoro, com ala de
Drigalski, ou basto de vidro em L, esterilizada ou previamente imersa em lcool etlico a 95C e flambada. Em continuao e se necessrio adotando o mesmo procedimento, inocular 0,1 mL das demais diluies decimais sucessivas, na superfcie do meio.

Nota: Opcionalmente, pode ser usado qualquer dos sistemas

para anaerobiose descritos na NBR 12893.
5.1.1.3 Reduo do nitrato

A partir da cultura em gar-nutriente inclinado, inocular,

com auxlio de ala de platina ou nquel-cromo, um tubo
contendo caldo nitrato e incubar a 35C por 24 h. Aps a
incubao, adicionar ao tubo 0,25 mL da soluo A e
0,25 mL da soluo B do reagente para ensaio de reduo
do nitrato. O ensaio considerado positivo para a presena de nitrito se uma colorao rsea avermelhada se
desenvolver em at 10 min. Caso isto no ocorra, adicionar pequena quantidade de zinco em p e deixar em re-

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pouso por 10 min. Se, aps a adio do zinco, houver desenvolvimento da cor rsea avermelhada, o ensaio negativo para a reduo do nitrato.
5.1.1.4 Voges Proskauer modificado

A partir da cultura em gar-nutriente inclinado, inocular,

com auxlio de ala de platina ou nquel-cromo, um tubo
contendo caldo VP modificado para Bacillus cereus e incubar a 35C por 48 h. Aps a incubao transferir, assepticamente, 1 mL do caldo para tubo de ensaio esterilizado e adicionar, na ordem indicada, 0,6 mL da soluo de
alfanaftol, 0,2 mL da soluo de hidrxido de potssio a
40% e alguns cristais de creatina. Agitar vigorosamente e
verificar, em at 30 min, o desenvolvimento de colorao
vermelha, que indica ensaio positivo.

com auxlio de ala de platina ou nquel-cromo, pequena

estria na superfcie do gar-sangue de carneiro a 5%, contido em placa de Petri, e incubar a 30C por 24 h. O ensaio
positivo quando houver evidncia de halo totalmente
transparente ao redor da colnia.
5.1.1.8.3 Crescimento em presena de hidrato de cloral

A partir da cultura em gar-nutriente inclinado, semear,

com auxlio de ala de platina ou nquel-cromo, pequena
estria na superfcie do gar-infuso de corao ou garinfuso de crebro e corao, contido em placa de Petri
(controle de crescimento) e em outra de gar-infuso de
corao ou gar-infuso de crebro e corao, adicionado de 0,25% de hidrato de cloral (placa de prova). Aps
a incubao a 35C por 24 h, considerar o ensaio positivo,
se houver evidncia de crescimento nas duas placas.

5.1.1.5 Motilidade
5.1.1.8.4 Deteco de cristal de protena txica

A partir da cultura em gar-nutriente inclinado, inocular,

com auxlio de agulha de platina ou nquel-cromo, em profundidade de at 1 cm da superfcie, um tubo contendo
gar-motilidade para Bacillus cereus, e incubar a 30C
por 24 h. O crescimento somente ao longo da linha do
inculo indica ensaio de motilidade negativo. O crescimento alm da linha do inculo, com turvao do meio, indica ensaio de motilidade positivo.
5.1.1.6 Hidrlise da tirosina

A partir da cultura em gar-nutriente inclinado, semear,

com auxlio de ala de platina ou nquel-cromo, a superfcie do gar-tirosina inclinado contido em tubo de ensaio e
incubar a 35C por 48 h. Aps a incubao, verificar o
aparecimento de halo transparente ao redor do crescimento
bacteriano, indicativo de ensaio positivo.
Nota: Pode ocorrer o aparecimento de uma colorao castanha
ao longo do crescimento bacteriano.
5.1.1.7 Hidrlise da gelatina

A partir da cultura em gar-nutriente inclinado, semear,

com auxlio de ala de platina ou nquel-cromo, pequena
estria na superfcie do gar-gelatina contido em placa de
Petri e incubar a 30C por 24 h. Aps a incubao, adicionar 1 mL - 2 mL do reativo de Frazier, de modo a cobrir a
superfcie do meio. O aparecimento de halo transparente
indicativo de ensaio positivo.
5.1.1.8 Ensaios opcionais

Opcionalmente podem ser efetuados tambm os ensaios

descritos em 5.1.1.8.1 a 5.1.1.8.4, para caracterizao do
Bacillus cereus.

Transferir o material da cultura em gar-nutriente, previamente envelhecido por trs dias a quatro dias temperatura ambiente, para lminas de microscopia. Preparar um esfregao da cultura e fixar por aquecimento. Cobrir o esfregao com metanol durante 30 s, desprezar o
lcool e secar rapidamente chama. Cobrir o esfregao
com soluo de fucsina bsica a 0,5%, aquecer delicadamente chama, at emisso de vapores, esperar
1 min - 2 min e aquecer novamente at nova emisso de
vapores. Aguardar 30 s e desprezar o corante. Em seguida, lavar a lmina em gua corrente, deixar secar e proceder ao exame microscpico sob imerso. Verificar a presena de cristais tetragonais vermelhos.
5.1.1.9 Caractersticas do Bacillus cereus

So consideradas como sendo de Bacillus cereus as cepas que se apresentarem em forma de bacilos curtos,
Gram-positivos, com extremidades em ngulo reto, formando cadeias longas ou curtas apresentando esporos ovais,
centrais ou subterminais, sem deformar o corpo bacteriano e que, frente s provas de caracterizao, revelaremse:
a) positivas para produo de lecitinase, acetilmetilcarbinol, fermentao da dextrose sem produo
de gs, decomposio da tirosina, hidrlise da gelatina, crescimento em presena de 0,001% de
lisozima, hemolticas em gar-sangue de carneiro,
reduo de nitrato a nitrato-motilidade e crescimento em gar-hidrato de cloral;
b) negativas para fermentao do manitol e presena
de cristais de protena txica.
5.1.1.9.1 Interpretao

5.1.1.8.1 Crescimento em presena de lisozima

A partir da cultura em gar-nutriente inclinado, inocular,

com auxlio de ala de platina ou nquel-cromo, um tubo
contendo caldo nutriente e um tubo contendo caldo nutriente adicionado de 0,001% de lisozima. Aps incubao a
35C por 24 h - 48 h, considerar o ensaio positivo, se houver evidncia de crescimento nos dois tubos.
5.1.1.8.2 Hemlise em sangue de carneiro

A partir da cultura em gar-nutriente inclinado, semear,

Anotar o nmero de culturas com as caractersticas de

Bacillus cereus, conforme descrito em 5.1.1.9, e a seguir
correlacionar estes resultados com as contagens de colnias obtidas em 5.1.1, expressando-se o resultado final em
unidades formadoras de colnias (UFC) por g ou mL da
amostra.
Por exemplo: Foram contadas 15 colnias em uma placa inoculada como 0,1 mL da diluio 10-1; destas, cinco
foram ensaiadas e apenas quatro caracterizadas como
sendo de Bacillus cereus:

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5 colnias ensaiadas - 4 colnias confirmadas para

Bacillus cereus
15 colnias contadas - X colnias confirmadas
X=

15 x 4
5

= 12 colnias confirmadas

Total de colnias de Bacillus cereus na placa = 12

Contagem final: nmero de colnias confirmadas x fator

de diluio x inverso da alquota adicionada.
= 12 x 101 x 10 =
= 12 x 102 ou
1,2 x 103 UFC de Bacillus cereus/g ou mL